Estudos Estruturais de Proteínas - UFU 2014

Estudos Estruturais de protenasMe. Lino Fernando Gomes de Lima

Agosto - 2014UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JLIO DE MESQUITA FILHOInstituto de Biocincias de BotucatuDepartamento de Fsica e BiofsicaLaboratrio de Biologia Molecular Estrutural

Tpicos a serem abordados Cristalografia de protenas

Dicrosmo Circular (CD)

Espalhamento Dinmico da luz (DLS)

Espalhamento de Raios-X a baixo ngulo (SAXS)

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Cristalografia de protenas

Por que estudar cristalografia de protenas??Principais componentes estruturais e catalisadores dos seres vivos;Funo relacionada a estrutura;Conhecer o mecanismo de ao;Identificar stios de inibio;Desenvolvimento de frmacos (Drug Design).

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Principal tcnica utilizada para a resoluo de estrutura de protenas (90 % das estruturas de protenas depositadas no Protein Data Bank [PDB]);

www.pdb.org;

Fazer figuras bonitas pro Lehninger!

Alto grau de pureza (>95%)Diretamente da sua origemExpresso de protenas recombinantesObteno de material a ser cristalizado

Metodos de cristalografiaComo uma protena cristaliza?

Cristal: Fase slida de uma protena e formada quando sua solubilidade em uma dada soluo excedida.Solues supersaturadas (10-12 mg/mL)

O sistema caminha ao equilbrio e a protena fica entre uma fase slida e uma fase solvel. Estas condies favorecem novas ligaes qumicas e estveis.

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Etapas para o crescimento de cristais: Nucleao, Crescimento e Cessao do crescimento.

Protenas cristalizam porque sua energia livre diminui com o aumento de interaes favorveis.

Cristais apresentam ordem em sua estrutura interna e possuem arranjo peridico (retculo e empacotamento cristalino).

Mtodo de difuso de vapor

Parmetros que influenciam o processo de cristalizao:1) Amostra protica:

- Pureza - Concentrao- Presena de ligantes

2)Soluo de cristalizao:

- Tipo de precipitante;- Concentrao do precipitante;- Fora inica;- pH;- Aditivos e outros.

3) Parmetros do ambiente:

- Temperatura;- Presso;- Gravidade.

4) Mtodo de cristalizao:

- Razo do equilbrio;- Volumes da gota e do reservatrio.

Avaliao dos experimentos de cristalizao

Coleta de dados

Coleta de dados de difrao de Raios-X

Processamento dos dados de difrao: Resoluo do problema da fase

Rede de Bravais ndice de Miller

Eixos e ngulos interaxiais ngulo entre b e c ngulo entre a e c ngulo entre a e b

Escolher melhor modelo para substituio molecular

Substiuio Molecular

Refinar a estrutura- encaixar resduos na densidade eletrnica

Analisar Modelo Final- estereoqumica

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Substituio isomrfica mltipla (MIR)Fator R (work e free)

Arquivo PDB (Protein Data Bank)REMARK Sun Feb 25 14:05:51 1996CRYST1 72.307 73.069 54.284 90.00 90.00 90.00ORIGX1 1.000000 0.000000 0.000000 0.00000ORIGX2 0.000000 1.000000 0.000000 0.00000ORIGX3 0.000000 0.000000 1.000000 0.00000SCALE1 0.013830 0.000000 0.000000 0.00000SCALE2 0.000000 0.013686 0.000000 0.00000SCALE3 0.000000 0.000000 0.018422 0.00000ATOM 1 CB MET 1 103.933 112.272 94.785 1.00 50.37 6ATOM 2 CG MET 1 104.548 112.540 96.126 1.00 55.72 6ATOM 3 SD MET 1 106.336 112.671 95.934 1.00 62.79 16ATOM 4 CE MET 1 106.542 114.250 95.159 1.00 54.71 6ATOM 5 C MET 1 103.199 114.420 93.762 1.00 47.20 6ATOM 6 O MET 1 102.995 114.577 92.561 1.00 51.55 8ATOM 7 HT1 MET 1 102.092 112.026 92.841 1.00 0.00 1ATOM 8 HT2 MET 1 100.857 112.905 93.606 1.00 0.00 1ATOM 9 N MET 1 101.710 112.330 93.759 1.00 48.54 7ATOM 10 HT3 MET 1 101.467 111.494 94.328 1.00 0.00 1ATOM 11 CA MET 1 102.732 113.140 94.479 1.00 47.79 6ATOM 12 N GLU 2 103.906 115.275 94.503 1.00 44.44 7ATOM 13 H GLU 2 104.333 114.933 95.316 1.00 0.00 1ATOM 14 CA GLU 2 104.085 116.695 94.178 1.00 40.49 6ATOM 15 CB GLU 2 104.531 117.459 95.428 1.00 43.49 6ATOM 16 CG GLU 2 103.464 117.597 96.515 1.00 52.62 6ATOM 17 CD GLU 2 103.286 116.347 97.374 1.00 53.08 6ATOM 18 OE1 GLU 2 102.216 115.703 97.266 1.00 57.29 8ATOM 19 OE2 GLU 2 104.183 116.042 98.197 1.00 54.12 8ATOM 20 C GLU 2 105.065 117.015 93.046 1.00 35.47 6ATOM 21 O GLU 2 104.918 118.030 92.386 1.00 35.53 8...........ATOM 2807 CD1 LEU 298 103.557 107.255 68.955 1.00 61.06 6ATOM 2808 CD2 LEU 298 101.503 106.167 69.904 1.00 59.28 6ATOM 2809 C LEU 298 99.298 109.657 67.984 1.00 66.73 6ATOM 2810 O LEU 298 99.829 110.678 67.550 1.00 67.00 8

Unidades =10 m-10

Refinamento cristalogrficoREMARK Written by O version 5.10.2REMARK Sun Feb 25 14:05:51 1996REMARK Walter F. de Azevedo Jr.CRYST1 72.307 73.069 54.284 90.00 90.00 90.00ORIGX1 1.000000 0.000000 0.000000 0.00000ORIGX2 0.000000 1.000000 0.000000 0.00000ORIGX3 0.000000 0.000000 1.000000 0.00000SCALE1 0.013830 0.000000 0.000000 0.00000SCALE2 0.000000 0.013686 0.000000 0.00000SCALE3 0.000000 0.000000 0.018422 0.00000ATOM 1 CB MET 1 103.933 112.272 94.785 1.00 50.37 6ATOM 2 CG MET 1 104.548 112.540 96.126 1.00 55.72 6ATOM 3 SD MET 1 106.336 112.671 95.934 1.00 62.79 16ATOM 4 CE MET 1 106.542 114.250 95.159 1.00 54.71 6ATOM 5 C MET 1 103.199 114.420 93.762 1.00 47.20 6ATOM 6 O MET 1 102.995 114.577 92.561 1.00 51.55 8ATOM 7 HT1 MET 1 102.092 112.026 92.841 1.00 0.00 1ATOM 8 HT2 MET 1 100.857 112.905 93.606 1.00 0.00 1ATOM 9 N MET 1 101.710 112.330 93.759 1.00 48.54 7ATOM 10 HT3 MET 1 101.467 111.494 94.328 1.00 0.00 1ATOM 11 CA MET 1 102.732 113.140 94.479 1.00 47.79 6ATOM 12 N GLU 2 103.906 115.275 94.503 1.00 44.44 7ATOM 13 H GLU 2 104.333 114.933 95.316 1.00 0.00 1ATOM 14 CA GLU 2 104.085 116.695 94.178 1.00 40.49 6ATOM 15 CB GLU 2 104.531 117.459 95.428 1.00 43.49 6ATOM 16 CG GLU 2 103.464 117.597 96.515 1.00 52.62 6

Mtodos DiretosMAD2 a 3 comprimentos de ondaMetionina mutada para selnio-metionina

MIRUso de 2 tomos pesados nico comprimento de onda

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E se os cristais no querem crescer...

Dicrosmo Circular (CD)Diferena de absoro da luz circularmente polarizada esquerda e direita:CD = AE AD

til para o estudo de molculas quirais Unidades opticamente ativas Alterao na luz circularmente polarizada incidente.

A tcnica de CD detecta exatamente a alterao atravs da medida da diferena da absoro da luz circularmente polarizada esquerda e direita, aps a luz passar pela amostra.

Composio de estrutura secundria de protenas (-hlice e conformaes )

Preparao da amostra Problema dos tampes

Preparao da amostra Concentrao de protena

AplicaesEnovelamento de Protenas

Comparao de estruturas

- Protenas obtidas de diferentes fontes - Mutantes de uma mesma protena - Controle de qualidade de protenas Estrutura secundria

Estabilidade Trmica e Qumica

- pH - T - Desnaturantes

Mudanas conformacionais e ensaios de interao

- Interaes protena-protena - Interaes protenas-ligantes

Espalhamento Dinmico da luz (DLS)Movimento Browniano:

- Movimento aleatrio de partculas em soluo - A Energia cintica envolvida nos encontros Brownianos entre as partculas dirige a diluio das solues.

Difuso translacional

- Movimento da partcula na soluo

Difuso rotacional

- Movimento da partcula entorno de seu eixo

O DLS investiga a correlao de ftons: Metodologia para determinao do D de partculas homogneas

Molculas em movimento browniano causam flutuaes na luz espalhada devido a interferncias construtivas e destrutivas.

Essas flutuaes ocorrem em escalas de tempo relacionadas com a velocidade de movimento das molculas, e portanto, dependem de seu tamanho e forma.

A coleta dos ftons em janelas de tempo, ou canais e subseqente anlise (auto-correlao) destes dados nos fornece o D.

A partir do D, pode-se calcular o RH usando a equao de Stokes-Einstein:

Como funciona o DLSUm laser minsculo (muito colimado) de estado slido emite uma luz monocromtica que atravessa um porta amostra de quartzo.

A luz espalhada em todas as direes pelas partculas em soluo.

Os ftons espalhados a 90 so coletados por uma pequena lente que a transmite a um fotodiodo por meio de uma fibra tica.

As flutuaes da luz espalhada (espalhamento Raylegh) constante

Observando um pequeno elemento de volume

O nmero de macromolculas neste V flutua com o tempo devido Difuso

Num experimento DLS, os ftons detectados so transformados num sinal eletrnico, basicamente 1 ou 0 dependendo se o fton foi ou no detectado num certo intervalo de tempo gera um grfico de Intensidade [g(t)] versus tempo [t].

O sinal analisado por uma funo de auto-correlao, que a convoluo do sinal da intensidade em funo do tempo com ela mesma.

AplicaesCoeficiente de difuso, D

Raio hidrodinmico, RH

Tamanho e dimenses/forma da partcula

Poli-dispersividade e distribuio de tamanho (sem soluo nica)

Concentrao (Biomassa)

Presena de contaminantes

Mudanas conformacionais, mobilidade

M para uma partcula de mesmo RH

a After two hours of Tris HCl additionOligomerizao MjTX-I

R (nm)MW R (kDa)% Pd% MassWater2,11916,599,60,5 mM2,11919,399,40,5 mMa2,73337,699,82,0 mM1,91517,699,82,0 mMa2,83732,399,310 mM1,91515,899,810 mMa2,83728,699,820 mM3,77125,397,6

O espalhamento de raios X a baixo ngulo um processo de espalhamento elstico que ocorre quando o feixe de raios X atravessa a amostra e interage com os eltrons do material.

A radiao reemitida pelos eltrons de cada tomo espalhada isotropicamente e as ondas espalhadas interferem umas com as outras se cancelando totalmente em algumas direes.

A curva de espalhamento em funo do ngulo decresce suavemente medida que o ngulo aumenta

Supondo que os centros espalhadores (amostra) esto no vcuo, a amplitude de espalhamento proporcional ao nmero de mols de eltrons por unidade de volume, ou seja, densidade eletrnica.

Se os centros espalhadores esto imersos em outro meio, apenas a diferena de densidade eletrnica ser relevante no espalhamento de raios X. Neste caso, os centros espalhadores so vistos como inomogeneidades, ou seja, flutuaes na densidade eletrnica da amostra.

A tcnica de espalhamento de raios X a baixo ngulo fornece informaes estruturais sobre inomogeneidades de densidade eletrnica com dimenses caractersticas de dez a algumas centenas de ngstrm.

Obrigado!!

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