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Produção de Proteínas para Estudos Estruturaise Biotecnológicos

Texto que sistematiza o trabalho científico da candidata para a obtenção dotítulo de Livre Docência

Profa. Ora. Ana Paula Ulian de Araújo

Departamento de Física e InformáticaInstituto de Física de São Carlos

Março de 2008.

I F S ( U S P SERViÇO DF- BIB!:IOTECA• !NFORMAC~I'

Sumário

INTRODUÇÃO 1

CAPÍTULO 1 : PULCHELLINA 1-1

1.1 INTRODUÇÃO E RELEV ÃNCIA 1-11.2 PUBLICAÇÕES GERADAS A PARTIR DESSE TRABALHO 1-121.3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1-12

CAPÍTULO 2: SEPTINAS 2-1

2. 1 INTRODUÇÃO E RELEV ÃNCIA 2-12.2 PUBLICAÇÕES GERADAS A PARTIR DESSE TRABALHO 2-42.3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 2-4

CAPÍTULO 3 : PROTEÍNAS LIGANTES DE CÁLCIO 3-1

3.1 INTRODUÇÃO E RELEVÂNCIA 3-13.1 PUBLICAÇÕES GERADAS A PARTIR DESSE TRABALHO 3-53.2 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 3-5

CAPÍTULO 4: OUTROS TRABALHOS RELEVANTES 4-1

4.1 INIBIDORES DE PROTEINASES VEGETAIS 4-1Publicações geradas a partir desse trabalho 4-3

4.2 EXPRESSÃO DE PEPTÍDEOS RECOMBINANTES 4-4Publicações geradas a partir desse trabalho 4-5

4.3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 4-5

I F S ( U C lI) SERViÇO DE BI8~IOTECA• ~r INFORMAÇAO

Dedicatória

I F S (• U S P .:iERVIÇO DE BIB!;.IOTECAINFORMAÇAO

Agradecimentos

Meu infinito obrigada ao Grupo de Biofísica, particularmente à profa. Leila M.Beltramini, aos profs. Otaciro R. Nascimento e Antônio J. da Costa-Filho, pela amizade,apoio e estímulo para que esse trabalho se tomasse real.

Ao prof. Richard C. Garrat pela dedicação, competência e oportunidade detrabalharmos juntos, tomando as reuniões de projeto quase que em família.

Aos técnicos do Grupo de Biofísica: Bel, Andressa, João e Femando que semprefizeram o impossível se tomar possível, caso fosse necessário. E é claro, à Ester, pelaajuda com a burocracia administrativa e principalmente com memorial!

À profa. Heloísa S. S Araújo, pela amizade e por não me deixar desanimar!

A todos os colaboradores, os quais me permitiram "aventuras" em outras áreas;

Aos meus alunos e ex-alunos, com quem eu aprendo mais dia-a-dia;

Aos meus pais, irmãos, aos "Crestana Guardia" e toda minha família, peloincentivo e carinho sempre.

Ao Hélio, Nina e Ian pela compreensão, ajuda e pelo amor incondicional.

I FS(~U SP SERViÇO DE BIB~IOTECAINFORMAÇAO

Introdução

A expressão de proteínas tem sido um dos principais focos desde o advento da

tecnologia do DNA recombinante na década de 1980. Um exemplo disso está na

produção de insulina recombinante para uso clínico, em 1982, a qual até então era

disponível de fontes como pâncreas porcino ou bovino [Villa-Komaroff et al., 1980]. A

produção de insulina humana em Escherichia coli foi um dos principais eventos na

medicina [Falzon et al., 2006]. Poucas proteínas estão disponíveis em abundância

suficiente que permitam seu isolamento direto e purificação a partir dos tecidos nos

quais ocorrem. Assim, a produção heteróloga de proteínas tem possibilitado produzir

importantes fármacos (por ex. hormônio de crescimento), bem como proteínas para a

indústria e para a pesquisa científica. Nesse contexto, a disponibilidade de proteína

purificada é um pré-requisito para sua caracterização bioquímica, biofísica e estrutural.

Escherichia coli é o hospedeiro mais atraente para a produção de proteínas

recombinantes, principalmente devido à facilidade de uso, robustez e baixo custo

[Grãslund et al., 2008]. Porém, existem desvantagens em usar E. coli como hospedeiro

para a expressão. E. coli não é capaz de produzir modificações pós-traducionais

eucarióticas, tais como glicosilação, as quais podem ser críticas para produzir a proteína

de interesse enovelada e ativa. Ainda, algumas proteínas, especialmente aquelas maiores

e proteínas de membrana não são expressas em E. coli ou expressam de forma insolúvel

como corpos de inclusão [Villaverde & Carrio, 2003].

Estudos têm indicado que cerca de 50% de proteínas provenientes de Eubacteria

ou Archaea e somente cerca de 1o{de proteínas de Eukarya podem ser expressas

solúveis em E. coli [Braun & LaBaer, 2003]. Além disso, a probabilidade de sucesso na

expressão de uma proteína solúvel em E. coli diminui consideravelmente para massas

I FS( ..USP SERViÇO De. BJó':,UfECPINFORMAÇAO

Introdução 11

acima de ~60kDa (figura 1.1). Adicionalmente, é bem estabelecido que os níveis de

expressão e o grau de solubilidade de uma proteína recombinante expressa em E. coli

podem ser grandemente influenciados por uma variação sutil nas seqüências de

aminoácidos nas regiões N- and C-terminais [Bjõrnsson et al., 1996; Peti & Page,

2007]. Domínios protéicos isolados muitas vezes têm mais sucesso na expressão que

proteínas relativamente grandes, compostas de vários domínios, sendo por isso alvos de

expressão e purificação preferenciais nesses casos.

0.7

0.2

Do clone solúvel à proteína purificada -pequena escala (1 mL)

0.6

0.5

- ,--,,'-....., --...••. ..., -.•••••-- .•Do clone à proteína purificada

com sucesso em larga escala••••• •••••••••••••••••••

•• •••••••••

oCIlCIlQ)<.J::JCIlQ)

"Oo

'CIlo~LL

0.4

0.3Da proteína purificada à

determinação da estrutura

0.1

Or--'--~--~---r---r---r--.---'---.--.O 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1,000

Tamanho da construção

Figura LI: Solubilidade em função do tamanho da construção (em aminoácidos). Existemrelativamente poucas proteínas alvo com comprimentos maiores que 800 aminoácidos, assim,essas frações foram extrapoladas e são mostradas em cinza [Figura adaptada de StructuralGenomics Consortium et al., 2008].

Outras bactérias tais como Bacillus subtilis, fungos como Saccharomyces

cerevisiae e Pichia pastoris, sistemas de células de insetos usando Baculovírus e células

de mamíferos vêm sendo opções alternativas para contornar problemas que podem

surgir quando se usa E. coli como célula hospedeira [Falzon et al, 2006]. Ainda, para

expressar proteínas tóxicas à célula hospedeira e proteínas de membrana, sistemas livres

de células foram desenvolvidos [Klammt et al., 2006]. Talvez, as maiores limitações da

Introdução III

expressão em E. coli sejam duas: i) a falta de um sistema eficiente de secreção para o

meio de cultura, característica compartilhada com outras bactérias Gram-negativas, mas\ ,; r ,~M

não com as Gram-positivas, o que toma Bacillus [Georgiou & Segatorf e Lactococcus

lactis [Morello et al., 2008] sistemas atraentes se a idéia é secretar o produto

recombinante; ii) em bactérias Gram-negativas, a membrana externa, a qual serve como

um barreira que previne a entrada de moléculas tóxicas, apresenta lipopolissacarídeos

[Nikaido, 2003] que podem contaminar o produto recombinante após a purificação.

Contudo, E. coli é ainda hoje o hospedeiro mais utilizado na produção de proteínas

recombinantes e alguns dos problemas associados podem ser contornados.

De modo geral, os sistemas de expressão mais usados atualmente, visando à

biologia estrutural, são baseados na expressão em Escherichia coli ou células de insetos

infectadas com Baculovírus. Na maioria dos casos, algum desses dois sistemas é

aplicável para a expressão de quase todas as proteínas solúveis, em quantidades

aceitáveis para estudos estruturais [Lundstrom, 2007]. Entretanto, quando se trata de

proteínas de membrana, a situação é bem diferente. Essas proteínas quando produzidas

exibem baixos rendimentos e estabilidade, o que tem levado a um aumento nos esforços

para o desenvolvimento de vetores e sistemas de expressão alternativos.

Dos sistemas de expressão em E. coli comumente utilizados, aqueles baseados

no promotor do bacteriófago T7 (vetores pET) [Studier et al., 1990] são certamente os

mais populares na produção de proteínas recombinantes (os vetores pET participaram

de mais de 90% das preparações protéicas depositadas no PDB até 2003) [Sorensen,

2005]. Mais de 50 diferentes plasmídeos da geração pET estão comercialmente

disponíveis, sendo que o sistema inclui promotores híbridos, múltiplos sítio. de -:

clonagem para a incorporação de diferentes parceiros de fusão e sítios de

reconhecimento de proteases.

A caracterização estrutural de proteínas geralmente requer um produto puro e

altamente homogêneo. Nesse sentido, a engenharia genética tem facilitado imensamente

o processo de purificação pela introdução de vários "tags" de afinidade no N- ou C-

terminais ou mesmo dentro da seqüência codificante do gene de interesse. Os "tags"

mais comuns usados são as caudas de histidinas (peptídeos com 6 ou 10 resíduos

consecutivos de His), as quais permitem a purificação baseada numa cromatografia de

Introdução IV

afinidade por metal imobilizado (lMAC). Outros "tags" comuns são MBP (maltose

binding protein), cuja purificação é baseada na cromatografia de afinidade em coluna de

maltose; GST (glutationa S-transferase), FLAG, entre muitos outros. É claro que,

quando possível, a cromatografia de afinidade é a primeira escolha para purificação.

Outros meios de purificação incluindo etapas de precipitação e gradientes requerem

grandes quantidades de material e não são adequados para proteínas recombinantes

expressas em baixos níveis. Adicionalmente, cromatografias de exclusão molecular,

interação hidrofóbica, troca-iônica e fase-reversa são consideradas na purificação.

Naturalmente, se não há um "tag" (recombinante ou nativo), a purificação seguirá um

caminho "clássico", o qual será proteína-dependente.

Finalizando essa breve introdução, um sistema de expressão ideal só pode ser

selecionado se a produtividade, a atividade, a utilização e as características físico-

químicas da proteína de interesse são levadas em consideração [Yin et ai., 2007]. Em

outras palavras: os sistemas de expressão também são proteína-dependentes.

Esta tese traz uma série de trabalhos publicados ou aceitos que exemplificam o

quanto a expressão heteróloga pode contribuir para os estudos estruturais. Diversas

estratégias para a produção de proteínas, expressas em vetores compatíveis com E. coli

e em geral com alto rendimento permitiram estudos estruturais e/ou funcionais. Além

disso, a purificação das proteínas recombinantes e, em alguns poucos casos, de

proteínas nativas também surgem nos trabalhos como um ponto decisivo para atingir a

qualidade necessária para os estudos estruturais e funcionais. Estes, por sua vez,

complementam grande parte da história apresentada e passaram assim a fazer parte de

minha rotina de trabalho.

No capítulo 1 é feita uma breve revisão sobre proteínas inativadoras de

ribossomos (RIPs) e são apresentados os resultados de minha principal linha de

pesquisa hoje: estudos de biologia molecular, celular, bioquímicos e biofísicos

envolvendo a pulchellina, uma proteína inativadora de ribossomos altamente tóxica.

O segundo capítulo traz uma breve introdução e os resultados da produção

heteróloga e estudos estruturais da septina 4 humana (SEPT4), uma proteína expressa

em certos tecidos neoplásicos, além de estar envolvida em doenças neurodegenerativas.

Introdução v

As mudanças conformacionais Ca2+-induzidas são o foco do capítulo 3, em

trabalhos envolvendo a produção recombinante e os estudos estruturais de proteínas

ligantes de cálcio.

No quarto capítulo, a expressão heteróloga e purificação visando supnr a

demanda da produção de proteínas são mostradas em trabalhos em colaboração com

outros pesquisadores.

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Structural Genomics Consortium, Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques,Berkeley Structural Genomics Center, China Structural Genomics Consortium, IntegratedCenter for Structure and Function Innovation, Israel Structural Proteomics Center, JointCenter for Structural Genomics, Midwest Center for Structural Genomics, New YorkStructural GenomiX Research Center for Structural Genomics, Northeast StructuralGenomics Consortium, Oxford Protein Production Facility, Protein Sample ProductionFacility, Max Delbrück Center for Molecular Medicine, RIKEN Structural

Introdução VI

Genomics/Proteomics Initiative & SPINE2-Complexes (2008). Protein production andpurification. Nature Methods, 5: 135 - 146.

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Villa-Komaroff L, Broome S, Naber SP, Efstratiadis A, Lomedico P,Tizard R, Chick WL,Gilbert W (1980). The synthesis of insulin in bacteria: a model for the production ofmedically useful proteins in prokaryotic cells. Birth Defects Orig Artic Ser 16:53-68.

Villaverde A. and Carrio, M.M. (2003). Protein aggregation in recombinant bacteria: biologicalrole of inc\usion bodies. Biotechnol. Lett. 25: 1385-1395.

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Capítulo 1 . Pulchellina

1.1 Introdução e relevância

Até o fim do século XIX, acreditava-se que a atividade tóxica do extrato bruto

de sementes maduras de Abrus precatorius era devido à contaminação por toxinas

bacterianas. Nesta época, os estudos com sementes tóxicas tinham enfoque médico. Em

1884, Warden & Waddel mostraram que a toxicidade de sementes de Abrus precatorius

era devido a uma fração protéica que podia ser precipitada com álcool a partir de um

extrato aquoso, excluindo a possibilidade da toxicidade ser creditada à contaminação

bacteriana. A seguir, Stillmark (1888) baseado em dados experimentais de uma proteína

isolada de sementes de Ricinus communis, atribuía a toxicidade à capacidade da

proteína aglutinar eritrócitos in vitro. Somente no início da década de 70, estudos

mostraram que as preparações daquela época eram referentes a uma Proteína

[nativadora de Ribossomos (RIP), formada por uma citotoxina e uma hemaglutinina

[Olsnes & Pihl, 1973].

As proteínas inativadoras de ribossomos (RIPs) são uma classe de enzimas (EC

3.2.2.22) que catalisam especificamente a clivagem da ligação N-glicosídica entre a

ribose e a adenina numa seqüência conservada da subunidade 28S dos rRNAs

eucarióticos [Endo & Tsurugi, 1987]. Endo et aI. (1987) verificaram que todos os

resíduos de adenina clivados estavam localizados em um loop de uma seqüência

específica do RNA ribossomal (A4324, em ribossomos de fígado de ratos). Esta

seqüência "GAGA" conservada foi nomeada de loop sarcinalricina. O efeito direto das

Capítulo 1-Pulchellina 1-2

RIPs na célula promove um dano irreversível no ribossomo, o qual impossibilita a

ligação dos fatores de elongação EF-l e EF-2, impedindo o passo de elongação na

tradução e, conseqüentemente, bloqueando a síntese protéica.

Após a atividade enzimática das RIPs ter sido reconhecida [Endo et al., 1987;

Endo & Tsurugi, 1987], a atividade rRNA N-glicosilase tomou-se sua principal marca e

ainda é usada para identificar essas proteínas tóxicas. Porém, existem trabalhos

relatando que a maioria das RIPs possui também uma atividade polinucleotídica

adenosina glicosilase (APG). Algumas RIPs liberam mais de um resíduo de adenina dos

ribossomos, outras ainda agem nas espécies de RNA a parte do RNA ribossomal e em

regiões poli A [Barbieri et al., 1997]. No entanto, a eficiência dessa atividade APG é

consideravelmente menor que a atividade RNA N-glicosilase nos ribossomos e, dessa

forma, a ação citotóxica não pode ser atribuída a essa atividade. De qualquer forma, a

observação das RIPs depurinarem também DNA e outros ácidos nucléicos [Peumans et

ai, 2001] abriu novas perspectivas sobre o mecanismo de como essas toxinas matam a

célula.

Classificação das RIPs

Segundo Mundy et ai (1994), as RIPs estão classificadas de acordo com suas

propriedades físicas e estruturais em três grupos :

RIP tipo 1: são enzimas monoméricas que possuem um único domínio RNA N-

glicosilase, sendo que a maioria possui tamanho aproximado de 30 kDa

[Barbieri et al., 1993], como a saporina (de Saponaria officinalis) e a PAP, uma

proteína antiviral de Phytolacca americana. Apesar das RIPs tipo 1 serem

distintas na sua seqüência primária como um todo e nas modificações pós-

traducionais, elas compartilham uma estrutura terciária altamente conservada

[Lord et al., 1994].

RIP tipo 2: são proteínas heterodiméricas, na sua maioria altamente tóxicas, com

propriedades lectínicas e enzimáticas em subunidades polipeptídicas separadas,

porém expressas como prepro-proteínas. Cada subunidade tem cerca de 30 kDa,

sendo um polipeptídeo com atividade RIP (cadeia A), ligado por meio de uma

ligação dissulfeto a uma lectina (cadeia B) [Stirpe et al., 1978]. A cadeia B pode

Capítulo I -Pulchellina 1-3

se ligar a glicoproteínas ou glicolipídeos da superfície de células eucarióticas e

mediar o transporte da cadeia A para o citosol [Beaumelle et al., 1993]. Uma vez

no citosol, a RIP tem acesso a maquinaria de tradução e rapidamente interrompe

a síntese protéica. Alguns exemplos pertencentes a esta classe são a abrina, de

Abrus precatorius, a ricina, de Ricinus communis e a pulchellina, de Abrus

pulchellus.

Van Damme et al., 2001 incluíram as RIPs tipo 2 clássicas como uma

categoria de quimero-RIPs, a qual possui tanto os dímeros ligados como não

ligados covalentemente (por exemplo, as aglutininas de sementes de R. comunis

e A. precatorius), além das RIPs tetraméricas de Polygonatum multiflorum (na

qual os monômeros são não covalentemente associados) e de Sambucus nigra

(SNAl), que os monômeros são unidos por meio de ligações dissulfeto entre as

cadeias B.

RIP tipo 3: são sintetizadas como precursores inativos (pro-RIPs) que requerem

um processamento proteolítico entre os aminoácidos envolvidos na formação do

sítio ativo [Mundy et al., 1994]. Essas RIPs são bem menos prevalentes que os

outros dois tipos. Até o momento, foram caracterizada RIP tipo 3 somente em

milho e cevada [Bass et al., 1992].

Apesar de elementos da estrutura do domínio das RIP tipo 1 serem encontrados

em outras proteínas ligantes de RNA, como a RNase H de Escherichia coli e da

transcriptase reversa retroviral [Ready et ai, 1988], nenhum domínio parecido com o de

N-glicosilase tem sido encontrado em outras proteínas.

Diferente do domínio N-glicosilase da cadeia A, a estrutura {J-treefoil dos

domínios individuais da cadeia B é amplamente distribuído e extremamente antigo. A

cadeia B das RIPs tipo 2 e lectinas relacionadas consistem de cópias duplicadas de um

peptídeo ligante a galactose tripartido, denominado subdomínios a, p e y, sendo cada

subdomínio composto por 40 resíduos de aminoácidos. Os sítios de ligação a açúcares

são formados por meio de uma dobra acentuada no esqueleto da estrutura formada pelas

seqüências Asp, VaI e Arg, mais um resíduo aromático variável, o qual promove a

plataforma de ligação ao açúcar [Rutenber & Robertus, 1991]. Acredita-se que estes

sítios são derivados de uma lectina ancestral de 40 resíduos de aminoácidos por meio de


dois eventos de inserção de duplicação em tandem, o qual ocorreu antes de sua fusão

com o domínio ancestral N-glicosilase [Rutenber et ai, 1987]. Ou seja, acredita-se que

as RIPs tipo 2 tenham surgido por meio da fusão de um ancestral da RIP tipo 1 com

uma lectina, originando as cadeias A e B respectivamente.

Atividade das RIPs

As RIPs podem ter grande potencial terapêutico como toxinas quiméricas,

obtidas por meio de manipulações genéticas [Lappi et ai, 1994] ou bioquímicas, como

as imunotoxinas (RIPs ligadas a anticorpos capazes de direcioná-las seletivamente

contra alvos celulares específicos) [Falini et ai, 1992] ou toxinas conjugadas (RIPs

ligadas a moléculas carreadoras específicas )[Casscells et ai, 1992; Cavallaro et ai,

1993] tomando-as seletivamente tóxicas para um dado tipo de célula alvo. As toxinas

usadas são muito potentes e por causa de sua função catalítica, mesmo que poucas

moléculas alcancem o citosol da célula alvo já será letal. Diferente dos agentes

quimioterápicos, as toxinas levam a morte tanto células quiescentes quanto

proliferativas [Fracasso et al., 2004]. Dessa forma, podem ser úteis no tratamento de

câncer [Pryme et al., 2006], além do uso no combate de doenças auto-imunes e também

contra a infecção por HIV [Wang, 2002].

As diferenças observadas na citotoxicidade de diferentes RIPs são maiores que

as descritas para a atividade enzimática, possivelmente devido a diferenças estruturais

que a proteína deve sofrer para atingir o alvo intracelular para exibir sua ação tóxica

[Battelli, 2004]. A ausência da cadeia B com propriedades lectínicas nas RIPs tipo 1 é

apontada como a responsável pela diferença na citotoxicidade entre RIPs tipo 1 e 2

[Barbieri et al., 1993]. A presença da cadeia B asseguraria a ligação à superfície celular,

facilitando o processo de endocitose [Olsnes &Pihl, 1973]. De fato, vem sendo

mostrado que a cadeia B da RIP tipo 2 media a entrada da cadeia A para dentro da

célula através de uma interação do receptor lectínico glicosilado. Porém, a presença de

um sítio ligante de RIP na superfície da célula não garante que a toxina será

intemalizada e que a síntese protéica seja abolida [Refsnes et al., 1974]. Além disso, a

citotoxicidade das RIPs não é proporcional ao número de receptores de membrana. Por


exemplo, modecina é tão tóxica a células como a ricina e a abrina [Stirpe et al., 1985] e,

como essas toxinas, ela pode ligar-se às moléculas contendo resíduos de galactose

terminais na membrana, contudo, liga-se à receptores diferentes dos receptores de

abrina e presentes em número bem menor.

Comparações entre a estrutura das RIPs e a citotoxicidade tomaram-se ainda

menos lineares quando uma nova classe de RIP tipo 2 emergiu. Apesar da presença da

cadeia lectínica, essa classe possui citotoxicidade similar as RIP tipo 1. O destino da

RIP após a intemalização parece ser de grande relevância para a sua toxicidade

[Sandvig & van Deurs, 1996]. A falta da toxicidade das RIP tipo 2 não tóxicas pode ser

atribuída às características da cadeia B, influenciando a distribuição subcelular e então

o destino da cadeia A após a intemalização. Por exemplo, a baixa toxicidade de nigrina

b comparado com a ricina tem sido pelo menos em parte explicado pela alta degradação

da nigrina b pelas células, resultando em uma baixa concentração remanescente no

interior das células e pelo diferente caminho intracelular seguido pelas duas lectinas

[Battelli et al., 1997]. Portanto, as RIPs tipo 2 também possuem uma toxicidade

altamente variável, que pode ser ocasionada principalmente pelas diferenças no seu

destino intracelular.

A atividade enzimática das diferentes RIPs pode vanar dependendo das

diferenças estruturais no sítio ativo e em outros domínios relacionados à atividade que

determinam a especificidade a substratos, por meio da influência da interação de cada

RIP com diferentes alvos subcelulares [Battelli, 2004]. A atividade adenina

polinucleotídeo glicosilase (APG) não está distribuída uniformemente nas diferentes

RIPs e nem está corre1acionada a ação no rRNA [Battelli, 2004].

Ainda, uma atividade lipolítica foi associada à ricina [Lombard et al., 2001],

atividade esta que pode estar envolvida no processo de envenenamento pela toxina. A

etapa de interação lipídeo-proteína parece ser devido principalmente à presença de uma

atividade não lectínica na cadeia B, no caso da ricina [Moulin et al., 1994]. Mutações e

estudos estruturais sugerem que a presença ou a ausência dessa atividade pode justificar

a diferente toxicidade entre as RIP tipo 2 tóxicas e não tóxicas. Os diferentes efeitos e

lesões observados in vivo após a administração de várias RIP tipo 2 tóxicas pode

também ser devido a diversidade das cadeias B, que pode afetar: (i) a penetração dentro


da célula, (ii) o caminho e o destino intrace1ular, e (iii) a distribuição dentre os diversos

tipos celulares, e conseqüentemente entre os órgãos diferentes.

A síntese das RIPs

Grande parte do que se sabe a respeito da síntese e processamento das RIPs tipo

2 baseia-se em estudos com a ricina. A ricina é sintetizada como uma molécula

precursora única (preproricina), na qual as cadeias A e B da toxina madura estão unidas

por um peptídeo de ligação de 12 aminoácidos. A porção N-terminal da cadeia A

madura é precedida por 35 resíduos na sua "pré-seqüência" e os primeiros 26 resíduos

mediam a translocação co-traducional do precursor nascente para o lúmen do retículo

endoplasmático (RE). A seqüência sinal é c1ivada durante esta etapa. A pro-ricina é

glicosilada e as pontes dissulfeto estabilizadas. No RE a pro-ricina é transportada via

vesículas do Complexo de Golgi para os vacúolos de estocagem protéica, onde é

processada por uma proteinase para atingir sua forma madura [Lord et al., 1994].

Internalização das RIPs

o mecanismo de entrada das RIPs nas células ainda é alvo de especulação.

Atualmente muitas evidências sugerem que elas entram e distribuem-se por vias

específicas. A primeira etapa de intemalização das RIPs é a interação RIP-célula, que

consiste na ligação dessas proteínas aos sítios receptores presentes na superfície da

membrana celular [Battelli, 2004]. O número de sítios de ligação nas células varia

bastante para as diferentes RIPs tipo 2 [van Deurs et ai, 1985]. Essas proteínas podem

ser captadas por um maior número de células devido à presença de glicoconjugados na

superfície celular [Peumans & Van Damme, 1995]. Outro processo de reconhecimento é

a interação de receptores com as cadeias laterais de carboidratos presentes nas proteínas

[Frigerio et al., 1998]. Esta também é a hipótese considerada para as RIPs tipo l, além

daquela delas entrarem nas células por meio da fase fluídica da endocitose, sendo então

tóxicas para macrófagos e trofoblastos [Hartley et al., 1996].

------------------_. -


Para alcançar os substratos citosólicos, várias toxinas são transportadas não

somente para endossomos, mas fazem um transporte retrógrado para o retículo

endoplasmático (RE) antes de serem translocadas através da membrana do RE. A cadeia

B da ricina é uma lectina galactose específica que é responsável pela ligação da ricina

nos galactosídios da superfície da célula [Olsnes et ai., 1974]. Uma porção da ricina

migra dos endossomos recentes para o sistema trans-Golgi e de lá para o RE [Lord &

Roberts, 1998; Sandvig et ai., 2004; Lord et aI. 2005]. No lúmem do RE, as cadeias A e

B se separam, possivelmente pela ação da enzima dissulfeto isomerase. A cadeia A

liberada pode interagir com lipídeos negativamente carregados na membrana do RE e,

quando parcialmente enovelada, será apresentada como um substrato ERAD (proteínas

associadas à degradação no RE), levando-a a ser transportada através da membrana do

RE para o cito sol. Estudos espectroscópicos com a cadeia A da ricina demonstraram

mudanças significativas na estrutura secundária da proteína como um resultado de sua

interação com lipossomos contendo fosfolipídeos negativamente carregados. Essa

mudança, induzida pela ligação ao lipídeo, acarreta em perda da atividade da cadeia A

de se ligar à adenina. Desta forma, Day et ai (2002) especularam que o

desenovelamento parcial da cadeia A induzido pela interação com a membrana da célula

durante o processo de internalização pode facilitar seu reconhecimento como um

substrato ERAD. A cadeia A nativa é extremamente resistente à degradação

proteolítica, porém parcialmente enovelada é bem mais sensível. A cadeia A

parcialmente enovelada no citosol será susceptível a degradação proteossomal. Foi

calculado que aproximadamente 5 % da quantidade total de ricina dentro das células

podem alcançar o compartimento subcelular que permitirá a translocação para o citosol

[van Deurs et ai., 1988]. Porém, uma porção da cadeia A é resistente a esta degradação

por meio do seu renovelamento, que se torna possível pela sua interação com o

ribossomo, ficando a molécula cataliticamente ativa e capaz de depurinar sua

subunidade 28S [Argent et ai., 2000]. Desta forma, o ribossomo exerce o papel de

molécula chaperona e, conseqüentemente, age de maneira suicida.


A Pulchellina

Uma nova RIP foi isolada de sementes de Abrus pulchellus, em 1998, por

Ramos e colaboradores. Tratava-se de uma RIP tipo 2 heterodimérica, composta de uma

cadeia enzimática com atividade RNA N-glicosilase (~ 29 kDa, designada cadeia A)

ligada, através de uma ponte dissulfeto, a uma cadeia lectínica galactose-ligante (~31

kDa, a cadeia B). Esta nova RIP tipo 2 apresentou uma toxicidade alta para mamíferos

(DLso= 30llg/Kg de peso corpóreo), comparável a ricina e a abrina. A partir desses

dados e do incentivo do prof. Renato de Azevedo Moreira, iniciamos um projeto nesta

linha de pesquisa.

O primeiro resultado deste trabalho conjunto está apresentado no artigo

publicado na revista Toxicon [Silva et al., 2003]. Neste, batizada de pulchellina, a

toxina foi isolada de uma cultura de calos, estabelecida a partir de explantes imaturos de

cotilédones de Abrus pulchellus (figura 1.1). A idéia inicial era obter uma fonte

alternativa para a produção da toxina, independente das sementes, uma vez que não

tínhamos acesso à planta mãe. Havia dúvidas se a expressão da pulchellina seria

mantida em tecidos indiferenciados, pois já sabíamos que a toxina no vegetal estava

presente somente nas sementes. Para excluir a possibilidade de que a pulchellina

extraída dos calos fosse ainda remanescente das células iniciais dos explantes,

monitoramos a expressão da cadeia A da pulchellina nas culturas por RT-PCR, além da

atividade tóxica. Os resultados indicaram que a pulchellina estava sendo sintetizada nos

calos, o que permitiu sua purificação a partir destes, abrindo uma nova frente para a

produção da toxina a partir da cultura de tecidos.

Entretanto, a idéia de ter uma fonte ilimitada da toxina, objetivando tanto os

estudos estruturais quanto suas aplicações como imunotoxinas, levou-nos a clonagem e

expressão da pulchellina. Na época, clones para várias RIP tipo 2, como ricinas e abrina

já haviam sido descritos em diversos laboratórios [Evensen et ai. 1991; Wood et ai.

1991; Hung et ai. 1994] e revelavam que essas proteínas pertenciam a uma família

multigênica que não possuía íntrons. Baseada nesta informação, nossa estratégia de

clonagem pressupôs que uma situação similar ocorreria para a pulchellina, dada à

proximidade filo genética dessa com abrina (mesmo gênero) e na alta identidade entre as

Capítulo 1 -Pulchellina 1-9

seqüências primárias já descritas para abrina e ricina [Wood et al. 1991]. Assim, usamos

oligonucleotídeos degenerados, baseados nas seqüências publicadas das cadeias A e B

de isoformas de abrina, para amplificar a seqüência genômica específica desejada.

Figura 1.1: Abrus pulchellus ternuijlorus: a espécie é uma trepadeira perene, com ramosgeralmente finos, pouco lenhosos, possuindo folhas compostas, cujo comprimento pode variar de 5 a 10cm. O fruto é um legume de 3 a 5 em de comprimento, deiscente, contendo de 3 a 6 sementes marrom

claras por fruto. Detalhes da flor ampliada (à esquerda) e parte da planta (à direita).

Deste trabalho foram publicados dois artigos, sumarizados a seguir. O primeiro

englobou a clonagem, expressão e renovelamento da cadeia B (lectínica) [Goto et al.,

2003]. A cadeia B da pu1chellina foi expressa em E. coli em altos níveis, porém em

corpos de inclusão. Após inúmeras tentativas frustradas para reverter esse quadro, a

proteína recombinante foi submetida à desnaturação química e renovelamento. Os

passos de renovelamento foram baseados na lenta diálise do desnaturante em presença

do ligante D-Gal. Desta forma, a interação da proteína com o ligante serviu como

catalisador do enovelamento protéico. A formação de núcleos de condensação da

proteína na conformação de menor energia foi possível apenas na presença do ligante

em solução. A verificação da atividade biológica da proteína renovelada e de sua

interação com a matriz da cromatografia de exclusão molecular puderam confirmar a

renaturação. O sucesso do processo também foi verificado por espectroscopia de


dicroísmo circular, o qual mostrou uma estrutura secundária com predominância de

folhas 13, em concordância com a estrutura da cadeia B de abrina. Ao final do

renovelamento, a proteína apresentava-se monomérica. Havia, portanto, um resíduo de

cisteína livre e reativo, para o acoplamento de outras moléculas (fármacos ou sondas)

visando à internalização destes no citosol de células alvo. Esse trabalho foi o primeiro

desafio em termos de expressão solúvel e seu insucesso levou a um grande aprendizado

com relação ao uso de linhagens alternativas para expressão visando à solubilização,

bem como aos métodos de renovelamento. A cadeia B, em especial, tem ~ 30 kDa e

conta com 9 cisteínas, sendo oito dessas participantes de ligações dissulfeto intracadeia.

o outro artigo foi focado na produção da cadeia A da pulchellina ativa, visando

a possibilidade de seu uso em imunotoxinas [Silva et al., 2005]. Um fragmento de DNA

genômico contendo a seqüência que codifica a cadeia A foi inserido num vetor de

expressão bacteriano para produzir a cadeia A, fusionada a GST, em Escherichia coli.

Após a expressão e purificação, a atividade da proteína recombinante foi determinada

pela sua capacidade de depurinação de rRNA in vitro. Também in vitro, a cadeia A foi

associada a cadeia B, ambas recombinantes, para produzir um heterodímero ativo in

vivo, com toxicidade comparável a pulchellina nativa. Esses resultados abriram espaço

para a utilização da cadeia A recombinante em preparações de imunoconjugados com

potencial terapêutico, numa parceria com a empresa Nanocore (Campinas, SP).

Ainda decorrente da produção heteróloga da cadeia B da pulchellina (rPBC),

surge uma nova questão: a proteína recombinante era capaz de ligar-se a determinadas

células, mas ainda retinha a capacidade de ser endocitada? Para responder tal dúvida,

teve início um projeto em colaboração coma profa. Heloías S. Selistre-Araújo (UFSCar)

para determinar células de mamíferos que tinham sua adesão promovida pela rPBC. A

partir daí, microscopia> de fluorescência e confocal foram usadas para determinar a x

localização intracelular 'da pulchellina nativa (controle) e da rPBC. Os resultados

suportam a hipótese que internalização via endossomos e o transporte retrógrado

através do Complexo de Golgi são usados por ambas proteínas [Goto et al., 2007].

Voltando um pouco no tempo, durante o processo de clonagem genômica,

informações sobre as porções N e C-terminais da pulchellina haviam sido perdidas. Para

resgatar essas informações, utilizamos a técnica de RACE (Rapid Amplification of


cDNA Ends) e, a partir das seqüências obtidas novas clonagem foram feitas por RT-

PCR. Analisando os diversos cDNAs amplificados vimos que existiam diferenças entre

eles, as quais poderiam ser referentes a isoformas. Paralelamente, estávamos isolando a

pulchellina nativa para caracterizar melhor sua atividade e haviam também indícios de

isoformas. Várias isoformas de abrina já tinham sido descritas, de modo que não era

surpreendente o que estávamos encontrando. Porém, será que nossa escolha na

clonagem havia sido acertada? As toxicidades das isoformas diferiam entre si. Teríamos

escolhido a melhor (mais tóxica)? Em que elas diferiam? A busca das respostas para tais

questões nos levou a um estudo bioquímico mais profundo da pulchellina nativa, o qual

está em parte contido na publicação recente da revista FEBS Journal [Castilho et al.,

2008]. Neste trabalho, foi possível o isolamento de 4 isoformas da pulchellina (P I, P Il,

P III e P IV) utilizando cromatografias diversas. Havíamos isolado sete cDNA distintos

e purificado quatro isoformas da pulchellina nativa, sendo a relação entre cDNAs e

isoformas o nosso desafio. As proteínas foram então submetidas à digestão tripsínica e

analisadas por espectrometria de massas. As seqüências geradas foram correlacionadas

às isoformas usando um banco de dados composto das seqüências dos cDNA dos 7

clones. Os valores de ICso e LDso indicaram que P I e P II são mais tóxicas que P III e P

IV. Os resultados suportam a hipótese que as diferenças na toxidade podem ser

relacionadas às diferenças na cadeia B (ligante) que media as interações com a

superfície celular.

Este trabalho mais recente com a pulchellina (em parte ainda não publicado)

contou com uma nova colaboradora: a profa. Lynne M. Roberts (University ofWarwick,

Coventry, UK). O grupo da Profa. Roberts possui uma linha de pesquisa bastante

consolidada com RIPs [Lord et al., 2005a; Lord et al., 2005b; Smith et al., 2006;

Spooner et al., 2006], contribuindo para a elucidação dos mecanismos de transporte da

ricina no interior da célula [Roberts & Smith, 2004; Di Cola et aI., 2005]. Assim, o

estabelecimento dessa colaboração tem nos permitido aprender e produzir contribuições

significativas no tema, culminando no convite do prof. Mike Lord (University of

Warwick, UK), para redigir um capítulo sobre a pulchellina no livro da série Plant Cell

Monographs publicado pela Springer, que trará revisões sobre proteínas vegetais

tóxicas, previsto para 2009.


1.2 Publicações geradas a partir desse trabalho

• Silva, A L C, Horta, A C G, Moreira, R A, Beltraminil, L M, Araújo, A P U. Productionof Abrus pulchellus ribosome-inactivating protein from seed callus culture. Toxicon,41(7): 841 - 849, 2003.

• Goto, L S, Beltramini, L M, Moraes, D I, Moreira, R A, Araújo, A P U. Abruspulchellus type 2 RIP: Cloning, Recombinant Expression and Refolding of the Sugar-binding Chain. Protein Expression and Purification. 31: 12 - 18,2003.

• Silva A L C, Goto, L S, Dinarte, A R, Hansen, D, Moreira, R A, Beltramini, L M,Araujo, A P U. Pulchellin, a highly toxic type 2 RIP from Abrus pulchellus: cloning,heterologous expression of A-chain and structural studies. FEBS Journal, 272: 1201 -1210,2005.

• Goto, L. S, Castilho, P. V, Cominetti, M.R, Selistre-Araújo, H. S, Ulian Araújo, A P.Endocytosis of Pulchellin and its recombinant B-chain into K-562 cells: binding anduptake studies. Biochimica et Biophysica Acta (General Subjects), 1770, 1660 - 1666,2007.

• Castilho, P V, Goto, L S, Roberts, LM, Araújo, A P U. Isolation and characterization offour type 2 ribosome inactivating pulchellin isoforms from Abrus pulchellus seeds.FEBS Journal275, 948-959,2008.

1.3 Referências bibliográficas

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Capítulo 2 . Septinas

2. 1 Introdução e relevância

Septinas constituem uma família de proteínas de ligação ao nucleotídeo de

guanina que foram inicialmente identificadas em Saccharomyces cerevisiae,

participando da formação do septo no processo de brotamento. As septinas são

evolutivamente conservadas, estando presentes em outros eucariotos [Frazier et al.,

1998; Field et al., 1996], mas estão ausentes em plantas, as quais utilizam um meio de

citocinese distinto (formação do fragmoplasto) daquele visto nos demais eucariotos.

Septinas purificadas de leveduras reúnem-se em filamentos de comprimento

variável e diâmetro de 7-9 nm, que auxiliam na separação dos componentes das

membranas das células mãe e filha [Field et al., 1996]. Filamentos similares também

foram observados em Drosophila e cérebro de mamíferos, porém o mecanismo pelo

qual acorre a formação destes filamentos ainda não é muito bem compreendido [Field et

al., 1996; Hsu et ai., 1998].

Atualmente as septinas humanas identificadas estão classificadas em quatro

grupos (figura 2.1), segundo similaridades de suas seqüências primárias. Várias funções

são atribuídas as septinas como participação na citocinese, determinação e manutenção

da polaridade celular, associação às membranas, movimento celular, tráfego de

vesículas, exocitose e apoptose [Russell & Hall, 2005]. Em humanos há várias

evidências da importância das septinas em processos celulares, além disso, tem sido

observada a presença dessas proteínas em corpos de inclusões citoplasmáticas

relacionados a doenças neurodegenerativas (mal de Parkinson e mal de Alzheimer) e

também estão relacionadas a alguns tipos de câncer [Hall & Russell, 2004].

Capítulo 2 - Septinas 2-2

Domínio N-terminalvariável

Domínio de ligação aGTP

Domíniocoiled-coil

Group ISEPT3

SEPT9fiM-

Ulif 4-i '%-./L-"Q

Group 11

SEPT6

SEPT8

SEPT10

____~a[[BBBBBBBBBBBBBB.~~1W~..@Z?~;:

Group 11I

SEPT1

SEPT2

SEPT4

SEPT5

,~. j

Mii --1

....... ' J

Group IVSEPT7 UIM

Figura 2.1: Classificação das septinas de mamíferos. A seqüência primária das septinasmostra uma estrutura de domínios de regiões N- e C-terminais distintas e um domínio centralconservado (ligação a GTP). Este último é altamente conservado entre as septinas da mesmaespécie. A classificação nos 4 diferentes grupos é baseada na similaridade seqüencial de suaregião C-terminal (50 a 60% de identidade dentro de cada grupo). As linhas representamseqüências sem similaridade. [Martinez et ai., 2004].

Uma considerável expansão do número de genes que codificam septinas é vista

em vertebrados e 14 septinas são conhecidas hoje em humanos [Hall et aI., 2005;

Peterson et al, 2007]. As septinas possuem um domínio conservado de ligação em GTP

e são encaixadas dentro da superclasse das P-loop GTPases [Leipe et al., 2002]. Todas

as septinas têm um 'P'-loop que é definido pelo motivo Walker A (GxxGxGKST),

Walker B (DxxG), e o motivo de especificidade ao GTP (xKxD) [Saraste et al., 1990].

Se por um lado as septinas têm em comum um domínio de ligação em GTP, outros

domínios e motivos são pobremente definidos e há uma grande variação em termos de

comprimento e composição dos domínios N e C-terminais [Hall & Hussell, 2004]. É

possível observar, em muitos membros da família, a presença de domínio coiled-coil C-

terminal, relacionado a um domínio de interação proteína-proteína [Casamayor 2003].

Ainda, vale lembrar que as septinas são conhecidas por polimerizar, formando

estruturas homo e hetero-oligoméricas, as quais podem formar filamentos in vitro e in


vivo [Frazier et al., 1998]. Porém, como essas estruturas são formadas e qual seu papel

ainda são questões que permanecem em aberto. Muitos trabalhos têm investigado

possíveis organizações para os complexos de septinas. Porém, só recentemente foi

publicada a estrutura de um complexo contendo as septinas 2, 6 e 7 [Sirajuddin et al.,

2007], frustrando a expectativa de nosso grupo de trabalho de conseguir a primeira

estrutura de uma septina.

A partir de uma colaboração iniciada há alguns anos com o prof. Richard C.

Garratt, a tendência das septinas produzidas in vitro se agregarem vem sendo

extensivamente estudada em nosso Grupo. Recentemente, propusemos uma hipótese

que os homofilamentos de septinas formados in vitro sejam, na verdade, amilóides

[Garcia et al., 2007]. Estudos de desnaturação da SEPT4 induzida por temperatura têm

demonstrado a formação de um intermediário estável que tende a agregar na forma de

fibras. Esse comportamento também tem sido observado para outras septinas humanas

estudadas em nosso grupo. Portanto, uma melhor caracterização do intermediário

gerado e sua possível relevância para os processos de desnaturação e renaturação em

condições fisiológicas e patológicas poderá contribuir para o entendimento do papel

dessas moléculas.

Nossos esforços têm se concentrado na produção e estudo da estabilidade das

septinas 2, 3, 4 e 5 (SEPT2, SEPT3, SEPT4 e SEPT5), em particular. O primeiro

desafio deste projeto veio com a necessidade de expressar uma proteína humana em E.

coli. Optamos por um sistema de fusão utilizando a proteína carreadora GST, de

Schistosoma japonicum, uma proteína estável e bem expressa em E. coli. A expressão,t c-.

.as SEPT4 foi alcançada, porém o rendimento não era alto e a proteína integral

apresentava-se pouco estável. Partimos, então, para uma abordagem de expressão dos

domínios protéicos da SEPT4 isoladamente. As regiões correspondentes aos domínios

N-terminal, GTPase e C-terminal foram definidos e expressos em E. coli como

proteínas solúveis. Após purificados, esses polipeptídeos foram analisados por

espectroscopias de Dicroísmo circular e fluorescência intrínseca, além de SAXS e

espalhamento dinâmico de luz, permitindo sua caracterização estrutural [Garcia et ai.

2006].

A produção de uma proteína recombinante pode ser validada de várias formas,

mas a detecção de atividade biológica no produto recombinante é sempre a mais


desejada. Desta forma, um extenso trabalho foi feito, em conjunto com o prof. Emanuel

Carrilho (IQSC), no sentido de encontrar métodos mais ágeis e "limpos" para

determinar a atividade GTPásica da SEPT4 em relação ao ensaio radioativo. Esse

trabalho gerou uma publicação na revista Analytical and Bioanalytical Chemistry, em

2005.


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Capítulo 3 . Proteínas ligantes de cálcio

3.1 Introdução e relevância

Como um íon de sinalização intracellular, o Ca2+ está envolvido em muitas

funções celulares, desde a fertilização, contração, diferenciação celular e proliferação

até apoptose e, em casos de falta de regulação, o câncer. Em resposta a estímulos tais

como despolarização da membrana, moléculas sinalizadoras extracelulares, ou

mensageiros intracelulares, as concentrações citosólicas deste íon aumentam de ~ 10-7 M

até ~1O-5 M [Gifford et al., 2007]. Este aumento é o resultado de um influxo de Ca2+

extracelular ou de sua liberação de estoques internos como o retículo

endoplasmático/sarcoplasmático [Berridge, 2000]. O cálcio que flui pelo citoplasma

durante a reação de sinalização não fica livre, mas sim se associa a uma variedade de

proteínas ligantes de cálcio (CaBPs, Ca2+ -binding proteins). Muitas dessas proteínas

pertencem a uma família que liga este cátion usando um motivo estrutural característico

hélice-loop-hélice, chamado EF-hand (figura 3.1).

Em termos funcionais, as proteínas ligantes de cálcio são grosseiramente

divididas em duas classes: os sensores de Ca2+ (Ca2+ sensors) e as Ca2+ tamponantes

(Ca2+ buffers). As Ca2+ sensors traduzem sinais químicos (aumento na concentração de

Ca2+) em respostas bioquímicas, comumente refletidas numa mudança conformacional

Ca2+-induzida. O exemplo mais conhecido dessa classe é o da calmodulina. As Ca2+

buffers ajudam a modular o sinal de Ca2+ temporal e espacialmente no citoplasma e

podem ser exemplificadas pela parvalbumina.

Capítulo 3 - Proteínas Ligantes de Cálcio 3-2

Figura 3.1: (A) Um EF-hand único do domínio N-terminal de calmodulina. Estendendo-sepor 29 resíduos de aminoácidos consecutivos, o EF-hand consiste de uma hélice de noveresíduos de início, um loop de nove resíduos e uma hélice de onze resíduos de saída. (B) Umpar de EF-hands do domínio N-terminal da calmodulina. Um elemento estrutural adicional éobservado no par como uma pequena folha-beta antiparalela formada (Gifford et al., 2007).

o EF-Hand: a unidade de ligação de Ca2+

o termo EF-hand foi criado por R. H. Kretsinger há cerca de 30 anos para

designar um motivo do tipo hélice-loop-hélice que apresentava afinidade pelo íon

cálcio, descoberto na estrutura da parvalbumina, uma pequena proteína ligante de cálcio

isolada do músculo de carpa [Kretsinger, 1973]. O clássico motivo EF-hand é

geralmente formado por uma alça, ladeada por duas a-hélices, em uma região contínua

da proteína. Este sítio pode ser representado como: XeYeZe-Ye-X •• -Z, onde X, Y, Z,

-X, -Y e -Z são os ligantes que participam na coordenação do metal e os pontos (e)

representam os resíduos entre eles [Lewit-Bentley & Réty, 2000]. A seqüência dos

resíduos que compõem o EF-hand forma um loop que pode acomodar os ligantes cálcio

ou magnésio, diferindo apenas na formação geométrica, que é dependente do íon

presente. O magnésio normalmente é compelido por seis ligantes em um octaedro,

enquanto sete ligantes nos vértices de uma bipirâmide pentagonal coordenam o cálcio.

Usualmente, os motivos EF-hands de muitas proteínas ocorrem aos pares,

intimamente associados na forma de um domínio, com as alças dos dois sítios


interagindo em uma pequena folha-B antiparalela (figura 3.1 B). O menor membro desta

família é a calbindina D9K,uma proteína de 9 kDa que contém um único par EF-hand.

Embora outros membros da subfamília SI 00 também contenham um único par de EF-

hands, esses ocorrem como parte de homo ou heterodímeros, dando quatro EF-hand a

cada proteína SI 00. Entretanto, a maioria das proteínas da família contém dois pares,

somando quatro motivos EF-hand [Gifford et al., 2007]. Pelo fato dos motivos EF-hand

terem uma forte tendência a fazer parte de um par, exemplos de proteínas cornúmero ímpar de EF-hand são raros.

Conseqüências da ligação do cálcio

o papel da ligação do Ca2+ tem sido estudado com foco nas mudanças

conformacionais Ca2+-induzidas. Embora esta conseqüência da ligação do Ca2+ seja

importante, o Ca2+ também pode desempenhar um papel estrutural e, em muitos casos, a

ligação deste íon é fundamental para a integridade estrutural da proteína [Christova,

2000]. Mudanças conformacionais Ca2+-induzidas foram consideradas inicialmente em

termos de transição de domínios fechados/abertos medidos pela mudança no ângulo

inter-hélice de vetores definidos pelas hélices que ligam Ca2+ [Gifford et al., 2007].

Essa mudança expõe cadeias laterais hidrofóbicas e cria um extenso sítio de interação

proteína-molécula alvo.

Uma interação iniciada com o prof. Ariel M. Silber (Parasitologia-USP) nos

colocou em contato com a calflagina de Trypanosoma cruzi, uma proteína ligante de

cálcio presente no flagelo de vários protozoários. Até aquela época, haviam apenas

trabalhos estudando a FCaBP [Engman, 1989], uma proteína homóloga à calflagina,

além de evidências do papel regulatório do Ca2+ na mobilidade flagelar do parasita.

Motivados por isso, iniciamos um projeto para expressão heteróloga e estudos

estruturais da calflagina. Esta foi produzida em E. coli como uma proteína de fusão,

associada à inteína. A inteína é uma proteína relativamente grande, porém capaz de

sofrer uma auto-clivagem específica e induzi da (por um agente tiol), facilitando a sua

separação da proteína de fusão. A purificação é garantida pela presença de um domínio

de ligação em quitina ligado ao C-terminal da inteína. A proteína produzida de forma

recombinante foi usada em experimentos de Dicroísmo Circular e fluorescência para


monitorar as mudanças conformacionais induzi das pela ligação do Ca2+. Ainda,

experimentos de fluorescência extrínseca usando ANS como uma sonda hidrofóbica

mostraram que a calflagina comporta-se como uma proteína Ca2+ sensor [Pinto et al.,

2003].

Em função da publicação dos resultados com a calflagina, surgiu uma parceria

com o prof. David Engman (Northwestern University, Illinois), que já trabalhava com a

FCaBP. Recebemos os clones recombinantes, produzimos e purificamos as proteínas

selvagem e mutante para determinar as constantes de afinidade de ligação ao cálcio

usando a técnica de fluorescência intrínseca. Além disso, inserimos uma etapa

cromatográfica na purificação para melhorar o grau de pureza, produzindo depois

grandes quantidades de proteína que foi enviada para experimentos complementares ao

Dr. Engman. Esses resultados fazem parte de um artigo, publicado na lBC em 2005.

Ainda, motivados pela profa. Dra. Maria Cristina Nonato (FFCL-RPIUSP)

iniciamos um novo projeto envolvendo uma nova proteína ligante de cálcio: a S100A12.

Esta proteína sofre mudanças conformacionais pela ligação de cálcio dando suporte ao

seu potencial envolvimento em eventos de transdução de sinal dependentes de Ca2+

[Dell' Angelica et al., 1994]. As dificuldades na obtenção de grandes quantidades de

proteína nativa, extraída de granulócitos de porco, levou-nos a construir um gene

sintético com códons otimizados para expressão em E. coli. O fato de a proteína ser

relativamente pequena, sem modificações pós-traducionais ou outro processamento

tornaram a produção heteróloga em E. coli uma alternativa atraente para obtenção de

alto rendimento, maior controle de pureza e facilidade de purificação. O rendimento do

sistema de expressão obtido foi elevado (160 mg de proteína! litro de meio de cultura) e

permitiu que estudos espectroscópicos de desnaturação térmica e química envolvendo a

S100A12 fossem realizados. Ainda, observamos que na presença de seus ligantes, os

íons Ca2+ e Zn2

+, há um aumento a estabilidade da proteína. Este trabalho foi aceito para

publicação na revista Biophysical Chemistry (fev/2008). Vale dizer ainda que a

disponibilização da S100A12 recombinante permitiu sua cristalização pelo grupo da

profa. M. Cristina Nonato e sua resolução estrutural está em curso.



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* Revised Manuscript

Structural stability and reversible unfolding of recombinant

porcine SlOOA12

Garcia, A. F.*; Garcia, W.*; Nonato, M. C.# and Araújo, A. P. U.*,f

* Instituto de Física de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos, SP, Brazil.

# Laboratório de Cristalografia de Proteínas, Departamento de Física e Química, Faculdade

de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto-USP, Brazil.

f Corresponding author: anapa}Ila(àjifsç.usp.Qr

Ana Paula Ulian Araújo

Grupo de Biofísica Molecular "Sérgio Mascarenhas", Centro de Biotecnologia Molecular

Estrutural, Instituto de Física de São Carlos, CP 369, 13560-970 Universidade de São

Paulo, São Carlos, SP, Brazil.

Running title: Structural stability ofrSlOOAl2.

Abstract

Porcine S100A12 is a member of the S100 proteins, family of small acidic ca1cium-

binding proteins characterized by the presence of two EF-hand motifs. These proteins are

involved in many cellular events such as the regulation of protein phosphorylation,

enzymatic activity, protein-protein interaction, Ca2+ homeostasis, inflammatory processes

and intermediate filament polymerization. In addition, members of this family bind Zn2+ or

Ca2+ with cooperative effect on binding. In this study, the gene sequence encoding porcine

S100A12 was obtained by the synthetic gene approach using E. coli codon bias.

Additionally, we report a thermodynamic study ofthe recombinant SlOOA12using circular

dichroism, fluorescence and isothermal titration calorimetry. The results of urea and

temperature induced unfolding and refolding processes indicated a reversible two-state

processo Also, the ANS fluorescence studies showed that in presence of divalent ions the

protein exposes hydrophobic sites which could facilitate the interaction with other proteins

and trigger the physiological responses.

Keywords: S100A12; ca1cium-binding protein; S100 family, Circular dichroism (CD);

Fluorescence spectroscopy; protein unfolding.

2

1. Introduction

Calcium binding proteins (CaBPs) are involved in the regulation of several

biological processes. The basic structural and functional unit of CaBPs family is the EF-

hand motif which are the targets of intracelIular calcium [1,2]. SI 00 proteins constitute the

largest subfamily of EF-hand proteins. There are at least 25 members of low-molecular-

weight (9-14 kDa) acidic calcium-binding proteins [3,4]. They interact in a Ca2+-dependent

or independent way with proteins involved in cell proliferation and differentiation, celIular

architecture, signal transduction, and intracelIular metabolism [4,5].

Most SlOO proteins occur as non-covalent homodimers [6] and are characterized by

the presence of two EF-hand motifs per monomer, which are ordered in N-terminal EF-

hand (helix l-loop l-helix 11)with a flexible linker region that connects helix 11to helix 11I

of the C-terminal EF-hand (helix Ill-looplf-helixfV). The linker region and C-terminal

extension show the least amount of sequence conservation among SI 00 proteins [7,8].

Different conformational changes are triggered by calcium binding to SI 00 proteins in the

two EF-hands, and they exhibit distinctive affinities for calcium [9]. The C-terminal EF-

hand contains the canonical Ca2+-binding loop common to all CaBPs. The N-terminal EF-

hand of S100 proteins is distinguished from all other CaBPs [3,9]. Also, it undergoes a

relatively small change in conformation, whereas the change in the C-terminal EF-hand is

much larger. These large differences in the Ca2+ affinities indicate that SI 00 proteins are

hetero-bi- functional [10,11]. Furthermore, another characteristic of SI 00 proteins is their

binding of additional divalent metal ions such as Zn2+ and Cu2+. Binding of these metals

can affect the affinity to Ca2+, further contributing to their variable cation binding

properties and their diversified functions [9,12,13].

3

S100 proteins cou1d act as a calcium mediated intracellu1ar signa1 transducers

through significant structura1 changes upon calcium binding exposing two hydrophobic

target-binding surfaces per dimer [14,15). This behavior suggests that S100 proteins might

have a role in the fine regu1ation of effectors' proteins, specific steps of signa1ing pathways,

or cellu1ar functions ranging from calcium buffering, cell growth and differentiation,

modu1ation of enzyme activities, energy metabo1ism, moti1ity, secretion, transcription,

apoptosis, neurite extension and chemotaxis [10,16,17). Lack of regu1ation of specific SI 00

proteins is corre1ated with severa1 human diseases, inc1uding cancer, neurodegenerative and

cardiovascu1ar disorders [16]. The mechanism by which human SI OOA12 modu1ates the

course of the inflammatory processes was 1inked to its interaction with the receptor for

advanced glycated products (RAGE) [18). A1so, in a recent study, Xie et aI. showed that

the binding to this receptor occurs through a hexameric Ca2-S 100A 12 C.

Porcine S100A12 (a1so known as ca1granu1in C) is a member of S100 proteins

subfami1y. This protein consists of 91 amino acids (approximate1y 10.7 kDa and an acid pI

of 5.8) and is characterized by the presence of two EF-hands motifs and an additiona1

binding site (His-X-X-X-His), with high affinity for Zn2+ on the C-terminal region [20].

The porcine S100A12 has a lower affinity to bind Ca2+than Zn2+ and the abi1ity for binding

ca1cium is remarkab1y increased by the zinc binding [6,20). Interesting1y, Zn2+ binding to

other S100 proteins 1ike S100B [21] increases their affinity for Ca2+(as occurs in S100A12)

[22] whereas in SI 00A2 Zn2+ binding decreases its Ca2+affinity.

Most SI 00 proteins are described by their three-dimensiona1 structures, but 1ittle is

known about the pathway ofprotein fo1ding/unfo1ding states [23]. In a previous study [20],

spectroscopy too1s were used to characterize the binding properties (of Ca2+ and Zn2+) of

native porcine S100A12 [20). In the present work, we report a thermodynamic study

4

focused on the structural stability and the folding/unfolding processes of the porcine

S100Al2 using far-UV circular dichroism (CD). The Ca2+ affinities in the presence of Zn2+

were also obtained using isothermal titration calorimetry (ITC). In addition, we show novel

data for recombinant S100A12 (rSlOOA12) conformational changes induced by Ca2+ and

Zn2+ binding resulting in the exposure ofhydrophobic regions.

2. Materiais and methods

2.1 Synthetic gene assembly and cloning. The gene sequence encoding porcine

S100A12 was synthesized with E. coli codon preferences based on the protein amino-acid

sequence [20], according to the E. coli codon bias [24]. The DNA coding sequence was

formed by the overlap of the 3' end using 10 pmol of the following primers (5' GCT TCA

GTT CAC GTT TGA TCA GGG TGT CGT AGT GAC CCA GAC GAA CAG AGT ACT

GGT GGA AGA TG 3', 5' CAA ACG TGA ACT GAA GCA GCT GAT CAC CAA AGA

ACT GCC GAA CAC CCT GAA GAA CAC CAA AGA CC 3', 5' CAT CTT GGT TAG

CGT CCA GGT TCT GGA AGA TTT TGT CGA TGG TAC CCT GGT CTT TGG TGT

TCT TC 3', and 5' GGA CGC TAA CCA AGA TGA ACA GGT TTC TTT CAA AGA

ATT CGT AGT TCT GGT TAC TGA CGT ACT G 3'). This product, extended by the Taq

DNA Polymerase (Invitrogen), was used as template in a PCR to assemble the whole

fragment. In this amplification reaction 100 pmol of each primer was used (5' GGA ATT

CCA TAT GAC CAA GCT GGA GGA CCA CCT GGA AGG TAT TAT CAA CAT CTT

CCA CCA GTA CTC 3', and 5' GCC GCT CGA GTT CTT TGT GGA TGT TGT CGT

GAG CGG TGA TCA GTA CGT CAG TAA CCA G 3') for synthesis of the rSl00A12

coding sequence. The PCR product was purified using the QIAquick PCR purification kit

5

(QIAGEN, Hilden, Germany) and cloned into pGEM-T easy (Promega). The SlOOA12

coding sequence was c1eaved with NdeI and BamHI restriction enzymes (New England

Biolabs, Inc., MA, USA) and subcloned into pET-28a(+) and pET-29a(+) expression

vectors (Novagen, Inc., WI, USA), to produce pSlOOA12-His and pSlOOA12 plasmids,

respectively. The fide1ity of the constructs was checked by sequencing the dideoxy chain

termination method [25] using an ABI Prism 377 automated DNA sequencer (Perkin

Elmer, CA, USA) following the manufacturer's protocol.

2.2 Recombinant SlOOA12 expression. The recombinant expression vectors were

used to overproduce rSlOOA12 with or without histidine tail. Five hundred mL of LB

medium, containing 30 ug/ml. of kanamycin, was inoculated with 5 mL of a fresh

ovemight culture of E. coli BL2l(DE3) (Novagen) harboring pSlOOA12 or S100A12-His

(250 rpm at 37°C). The cultures were induced by the addition 0.1 mM IPTG at OD600of

0.8. Subsequently, the incubation temperature was decreased to 22°C for around 12 hours.

Finally, the cells were harvested by centrifugation at 7,000xg for 15min at 4°C.

2.3 Protein purification. The cell pellets were suspended in 10 mL of buffer 20

mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 300 mM NaCl, lysed by sonication at 4°C and the

insoluble debris were separated by centrifugation at 14,000xg for 25 minoThe purification

of rSlOOA12 and rSlOOA12 with His-tag were performed by size exclusion and metal

affinity chromatography, respectively.

The supematant containing rSlOOA12 was loaded onto a Superdex-75 column (GE

Healthcare) pre-equilibrated and eluted with 20 mM Tris-HCl pH 8.0 buffer containing 300

6

mM NaCl. Eluted fractions corresponding to rSlOOA12 (~11 kDa) were pooled and

dialyzed against 20 mM Tris-HCl (pH 8.0). After dialysis, the sample was loaded onto a

Mono Q HR 5/5 column (GE Healthcare), previously equilibrated with 20 mM Tris-HCl

pH 8.0 (buffer A). The chromatography was performed on an ÃKTA Purifier (GE

Healthcare) with a combination oftwo linear gradients ofNaCl concentration (0-0.14 M in

20 min followed by 0.14-0.35 M in 15 min) in buffer A. The flow rate was 1 mLlmin.

SlOOA12 eluted at approximately 0.15 M NaCl and the protein purity was checked by

Comassie stained 15% SDS-PAGE [21].

The supematant containing the rSl00A12 with His-tag was loaded onto a Ni-NTA

superflow column (4 mL, QIAGEN) pre-equilibrated with the same buffer used for cell

suspension. The column was washed with 10 colurnn volumes of sonication buffer and the

target protein was eluted with five colurnn volumes of the same buffer containing 250 mM

imidazole. Samples from each step were analyzed on 15% SDS-PAGE. The protein

samples were dialyzed against a 20 mM Tris-HCl buffer pH 8.0, containing 10 mM NaCl,

before the assays.

Due to the high yield of protein containing His-tag most experiments were carried

out with this protein. The rSl00A12 without His-tag was used only in the metals binding

assays to eliminate the possibility of unspecific ion interactions.

2.4 Protein concentration. The concentration of recombinant proteins was

determined by UV absorbance at "A = 280 nm (spectrophotometer V-2001 Hitachi) using a

theoretical extinction coefficient based on the amino acid composition [27]. The theoretical

extinction coefficient employed was C280 = 2980 M-1.cm-1.

7

2.5 Buffers and solutions. All chemicals and reagents, used in this study, were of

the highest purity grade. To cover a pH range between 3 and 12, Glycine-HCI (pH 3.0),

sodium acetate-HCI (PH 4.0), MES-HCI (pH 6.0), Tris-HCI (pH 7.5-8.0), Bicin-NaOH (pH

8.5), Glycine-NaOH (pHlO-10,5), were chosen as buffers and prepared at a final

concentration of 20 mM containing 10 mM NaCl. The 8 M urea stock solution was

prepared in 20 mM Tris-HCI pH 8.0 buffer containing 10mM NaCl.

2.6 Oligomerization state. Chemical cross-linking was used to verify the

oligomeric state of apo-rS 100A12 by incubating the protein (1O~) in presence of 20 mM

HEPES pH 8.0 10 mM NaCI and DSS (50 mM) in a final reaction volume of 100 IlL at

22°C for 1 hour. The reaction was quenched by the addition of 50 mM Tris-HCI, pH 7.5

and subsequent1y analyzed on SDS-PAGE. Size exclusion chromatography (SEC) was

performed on an ÃKTA HPLC system using a Superdex-75 analytical size exclusion

colurnn equilibrated in 20 mM Tris-HCI pH 8.0 buffer containing 10 mM NaCl. Pre-

equilibrated samples of apo-rS 1OOA12 at concentrations between 1O~ and 25 !lM were

injected, and the relative elution volume was compared to that ofmolecular mass standards.

The relative elution volume was calculated as: Kav = (V, - Vo)/(Vc - Vo), where Ve is

elution volume, Vc is the void volume, and Vg is the geometric colurnn volume. A standard

curve was plotted of Kav versus 10g(M). The molecular weight of apo-rS100A12 was

estimated from the calibration curve.

2.7 Chemical unfolding/refolding of apo-rSlOOA12. The denaturation curves

were taken in 20 mM Tris-HCI (pH 8.0), 10 mM NaCI and increasing concentration of urea

8

from o to 7 M. Refolding of rS100A12 was done by quick protein dilution (1:50 fold)

against the same buffer with decreasing concentration of urea from 6 to O M and under

gentle agitation [28]. The experiments were carried out in triplicate. The temperature of all

experiments was maintained at 22°C unless otherwise indicated.

2.8 Far-UV circular dichroism (CD). Thermal and chemical unfolding of

rSl00A12, were monitored by far-UV CD spectroscopy using a JASCO J-7l5 instrument

(JASCO Corporation, Japan) equipped with a Peltier temperature control unit. Far-UV

circular dichroism (CD) measurements were performed using a cylindrical 0.1 em path

quartz curvet and the solvents spectra were subtracted in all experiments to eliminate

background effects. CD spectra were the average of 16 accumulations, using a scanning

speed of 100 nm.min", spectral bandwidth of 1 nrn, and a response time of 0.5 s. The

rS100A12 concentrations were 15,25 and 50 ~. Thermal denaturation ofrSlOOA12 was

characterized by measuring the elIipticity changes at 220 nrn induced by a temperature

increase from 20°C to 94°C at a heating rate of 10°C h-I. Reversibility of rSl00A12

denaturated was assessed, acquiring the CD spectra of the sample at the same initial

condition after heating to 95°C at 10°C h-I. Similar1y, far-UV CD denaturation plots for the

S100A12 folding/unfolding were obtained by measuring the elIipticity changes value at 220

nrn induced by urea concentration.

2.9 Analysis of chemical denaturation. The elIipticity data obtained from the study

of chemical denaturation of rS 100A12 were analyzed assuming that this is a reversible two-

state processo The fraction of denatured protein.jji, is calculated from the relationship:

9

and (1)

in which Bobs is the ellipticity of the sample at a particular condition; Bd and Bn are the

values of ellipticity characteristic of the denatured and native states.

Chemical unfolding data were fit using a two-state homodimer model according

Mallan et ai. [29], in which two populations of protein exist at equilibrium, namely, folded

homodimers (D) and unfolded monomers (M).

2.10 Fluorescence experiments (ANS assay). Fluorescence ermssion

measurements were performed on a spectrofluorimeter (ISS, IL, USA), model ISS K2,

equipped with a refrigerated circulator (Neslab RTE-21O). The excitation and emission

monochromators were set at 2 and 1 nm slit widths, respectively. Fluorescent dye binding

experiments with l-anilino-8-naphthalenesulfonic acid (ANS) were performed in order to

probe dynamic changes and the exposure of hydrophobic regions of the protein [30]. A

fixed concentration of ANS (250 J.tM)was mixed to the protein solution (10 J.tM,in 20 mM

Tris-HCl pH 8.0 10 mM NaCI) in the presence or absence of Ca2+ or/and Zn2+ (1 mM final

concentration). The excitation wavelength was set at 360 nm and the emission spectrum

was monitored from 400 nm to 650 nm wavelength.

2.11 Isothermal titration calorimetry (ITC). Isothermal titration calorimetry was

carried out using a VP-ITC instrument from MicroCal (Northhampton, MA) at 25°C in 20

mM Tris-HCI pH 8.0 buffer, containing 1 mM ZnS04. To investigate the binding of Ca2+ to

rS100A12 in the presence of Zn2+, 1 mM Ca2+ was titrated into 150 J.tM Zn2+-S100AI2

bound formo The experiment was repeated three times. The titration was performed by 45

10

injections of 10 I1L each into the sample cell. The mixture was allowed to react for 120 s

between injections. The injections were carried out over a 20 s period between each

injection, which was sufficient for the baseline to be reestablished. The data obtained from

isothermal titration were analyzed using the Origin software package for ITC analysis from

Microcal (Microcal, Inc.). The data was fit using the sequential binding site model [31].

3. Results

3.1 Synthetic gene assembly, expression and purification of porcine rS100A12.

The DNA coding sequence of the S100A12 protein was successfully obtained by the

synthetic gene assembly and inserted into pET expression vectors. The target gene was

expressed by the addition ofO.1 mM IPTG to the culture of E. coli BL21(DE3) harboring

pSlOOA12 or pSlOOA12-His (Figure 1).

The rSlOOA12 was purified by a two-step chromatographic protocol using size

exc1usion (SEC) followed by ion-exchange column. The rS100A12 with His-tag was

purified using the Ni-NTA affinity chromatography (Figure 1). The rSlOOA12 with and

without His-tag yie1ds were typically 160 and 60 mg of pure protein/liter of induced

bacterial culture, respectively.

3.2 Determination of the oligomeric state of rS100A12. The oligomeric state of

apo-rS100A12 was examined using SEC and cross-linking experiment at different protein

concentrations. The apo-rSlOOA12 elutes from SEC as a single peak corresponding to an

apparent molecular mass of approximately 29 kDa (Figure 2). This indicated that apo-

rS100A12 would be compatible with a homodimer in solution. The existence of a

11

homodimer was confirmed by a cross-linking assay using DSS (inset, Figure 2). The

addition of divalent ions (Ca2+ or/and Zn2+) did not change the oligomeric state of

rS100A12 (data not shown).

3.3 Influence of pH on protein stability. Influence of pH on the secondary

structure of the rSl00A12 was studied using CD spectroscopy. Figure 3A (solid line)

shows the CD spectra of apo-rSl00Al2 at pH 8 and 20°C, characterized by two negative

bands at 222 nm and 208 nm. These bands are characteristic of protein containing a-helical

elements in the secondary structure. The far-UV CD spectra of the protein at 20°C under

different pH (4,5,6, 7.5, 8.5,9.5 and 10.5) was very similar to pH 8. Similar behavior was

also observed with the tyrosine emission fluorescence at the above mentioned pH (data not

shown).

3.4 Chemical stability studies. The apo-rS100Al2 was denatured in O M to 7 M

urea range at pH 8.0 and 20°C in different protein concentrations (15, 25 and 50 11M).

Figure 3A shows the far-UV CD spectra and the negative ellipticities exhibited around 222

nm in the absence and presence of different urea concentrations. When the urea

concentration was increased in the protein solution, a concomitant decrease in the ellipticity

at 222 nm was observed, suggesting a cooperative loss of the a-helix content in apo-

rS100A12. At 7.0 M urea a complete denaturation was observed, and the far-UV CD

spectra was typical of a protein lacking secondary structure. On the other hand, the

refolding ofrS100A12 revealed that chemical denaturation by urea was a reversible process

(Figure 3B). Unfolded and subsequently refolded apo-rS100Al2 retains approximately

90% of its native far-UV CD signal in the conditions described here.

12

Two-state homodimer denaturation model in which native homodimer (D) is in

equilibrium with unfolded monomer (M) was used in this study. The far UV-CD data were

treated and curves for each concentration of protein were fit individually using a two-state

homodimer model according Mallan et ai [29] (supplementary material). Table 1 shows

that for the far-UV CD data, mN2 •..•2D and !1G;~;;2D remains similar for all protein

concentrations used. !1G;~;;2D is the free energy difference between 1 mol of dimer and 2

mol of unfolded monomer in the absence of denaturant.

3.5 Apo-rSlOOA12 thermal unfolding study by CD. The nature of the thermal

unfolding/refolding transition, in different protein concentrations, was studied by circular

dichroism spectroscopy. Figure 4 shows the family of temperature curves obtained at 15

11M of protein, pH 8.0. The well-defined isodichroic point can be observed at 204 nm

(Figure 4). The thermal unfolding/refolding of apo-rSlOOA12 was monitored following

changes in the CD ellipticity at 222 nm as a function of the temperature and exhibited a

cooperative sigmoidal behavior (Figure 5). When the temperature was increased from 20°C

up to 94°C the far-UV CD spectra of apo-rSlOOA12 showed a decrease in the overall

ellipticity. Apo-rSlOOA12 after unfolded and subsequently refolded (cooling back to 20°C)

retains approximately 80% ofinitial far-UV CD signal (data not show).

3.6 Metal binding influence on rSlOOA12 stability. We performed thermal

unfolding studies by far-UV CD (Figure 5) in the presence of Zn2+ and Ca2+ in order to

investigate the conformational states induced by these ions on apo-rSlOOA12. The melting

temperature value for apo-rSlOOA12 was calculated and resulted in Tm = 68.4°C. However,

13

the addition of 1 mM Zn2+ to the apo-rS100Al2 great1y increased its stability, where Tm

was 84°C. The same effect was verified if the thermal unfolding was carried out in the

presence of Ca2+ (1 mM), showing a Tmfor the Ca2+-bound rS1OOA12 of 79°C (Figure 5).

The addition of 1 mM Ca2+ to Zn2+-bound rS100A12 induced a higher increase in the

protein thermal stability, preventing the complete unfolding of the rSl00A12 in the

conditions described here (Figure 5).

The thermal and chemical unfolding results showed a significant increase on

rS 100A12 stability in the presence of both ions. The urea concentration in which 50% of

rS100A12 molecules are in the denatured state(s) was 1 M higher than the observed for the

apo-rS100Al2 (data not shown). Taken together, the results indicate that the chemical

unfolding results match the thermal unfolding experiments and suggest that the final

conformational stability of rS1OOA12 is dependent of the metal ions and the nature of the

!On.

3.7 Influence of pH 00 apo-rS100A12 stability. Temperature unfolding of apo-

rS100A12 was characterized at different pH values. At 20°C, the results showed that the

CD spectra in the pH range (4.0 - 10.5) were agreeing, considering the experimental error,

with those observed in Figure 4. These results exc1ude any effect of pH on the secondary

structure of apo-rSl00Al2 at 20°C. Nevertheless, the apo-rS100Al2 thermal stability was

found to be pH-dependent. The melting temperature remains almost constant between pH

7.0 and 9.0, but the thermal stability was reduced in pH lower than 6.0 and higher than 8.0

(see Figure 6).

14

3.8 ANS binding studies. The dye ANS, an extrinsic fluorescence probe, was used

to investigate the affinity of ions binding to rS 1OOA12. ANS has been successfully used to

detect solvent-accessible hydrophobic surface in proteins [30]. The ANS fluorescence

emission was monitored in the presence of Zn2+, Ca2+or the combination of Zn2+ and Ca2+.

Figure 7 (solid line) shows ANS spectra with apo-rS100A12 at 20°C. The Ca+2 addition

resulted in an increase of the ANS maximum intensity emission and a blue-shift (Figure 7).

Similar results were observed in the presence of Zn2+, but with a higher emission intensity.

On the other hand, the addition of both ions showed similar emission spectra to that of the

apo-form, The results above indicated that the Ca2+ or Zn2+ in Zn-rS 100A12 lead to an

exposition of hydrophobic regions on the protein surface. When similar experiments were

done with refolded protein (in the presence or absence of divalent ions) similar results were

obtained, indicating that the refolded protein was able to bind ions and suggesting that it

was biologically active.

3.9 Isothermal titration calorimetry (ITe). The interaction of Ca2+ with Zn2+_

S100A12 was studied using high sensitivity ITC. Figure 8 shows the isothermal titration

curve obtained by the interaction between Zn2+-rS100A12 and Ca2+. Best-fit ofthe binding

isotherm yie1ds apparent binding constant values in the order of 107 M-1 and 104 M-1. That

was consistent with what was described by DeU' Angellica et al. for the native porcine

S 100A12 using emission fluorescence spectroscopy [20].

15

4. Discussion

Studies involving heterologous expression proteins in E. co/i revealed that when the

protein is relatively small, the final yield of production is improved [33]. Thus, the

production ofporcine S100A12 by heterologous expression strategy was successful and an

interesting approach, resulting in large amount of fully active protein.

Particular attention has recent1y been given to S 100 proteins, since several members

of this family were reported to bind Ca2+ and some transition metals like Cu2+ and Zn2+

[10]. But little is known about the mechanism and function induced by the binding of these

intracellular transition metals to the S100 proteins. In this study, we have used far-U'V CD

and fluorescence spectroscopy to demonstrate that rS100A12 can specifically bind Ca2+

or/and Zn2+, and in doing so, these metal ions induced conformational changes in the

protein leading to an increased structural stability (chemical and thermal).

The native S100A12 was described as a homodimer in solution [20]. Size exclusion

chromatography (SEC) and cross-linking experiments were used to confirm the oligomeric

state of recombinant apo-S100A12 in solution (Figure 2) over a range of protein

concentrations (10-50 11M). Results of both techniques were consistent with a stable

homodimer. The addition ofmetals (Ca2+ or/and Zn2+) did not affect the oligomeric state of

rS100A12. In contrast, human S100A12, which shares 70% sequence identity with porcine

S100A12, forms a trimer of dimers in high-calcium concentration [32,34]. The hexamer

observed for human protein possesses additional calcium ions coordinated by the side chain

oxygens of residues from two adjacent dimers (Gln58, Gln64 and Glu55) and are

considered necessary for hexamer formation [6]. The porcine rS100A12 exhibited a Lys55

16

instead of Glu55, which could hinder the additional ca1cium coordination requested for

hexamerization. Similarly, bovine S100A12 shows two Lys residues instead of Glu55 and

Gln64 and, as porcine SlOOA12, is unab1e to assemble in a hexamer.

The structural stability of apo-rS100A12 was analyzed, usmg far-UV CD

spectroscopy, by urea denaturation, over a large range ofprotein concentrations. The curves

suggest that no intermediates are present in detectable amounts during unfolding transition.

Also, we show that chemical unfolding transition was very near1y completely reversible

(~90%) upon removal of the denaturing condition (Figure 3A and )B). The data were

analyzed using a two-state model in which two protein populations exist at equilibrium,

namely, folded homodimers (D) and unfolded monomers (M). The protein concentration-

dependence of equilibrium unfolding curves in homodimer systems is expected, and can be

rationalized from the way the equilibrium constant Ki, is defined: Ki)= [M]2/[D]. At a given

denaturant concentration, Ku and L1G remain constant for all protein concentrations, and

only the fraction of each equilibrium species present change with PI• In a homodimeric

system, [U] 1/2 is defined as the concentration of denaturant where the fraction of unfolded

monomers is equal to the fraction of monomers present as dimers. This is also where Ku =

Pt, therefore, the concentration of denaturant where [U]1I2 occurs will depend of Pt, and a

change in [U] 1/2 with the total protein concentration is expected. ,1.G;2;;2D remains the2

same with changing Pt and [U]1/2. The m value is a constant for each protein and should not

be affected by protein concentration. When apo-rS100A12 unfolding data were analyzed

according to a two-state denaturation mo dei, mN2•..•2D and ,1.G;:;;2D values remain similar

(Table 1 and supplementary material) for all concentrations of the protein used (within

experimental error of 10%).

17

Thus, a two-state homodimeric model described the experimental results

adequately. However, the dimeric form of S100A12 probably can dissociate producing

monomers before reaching the denatured state. It is interesting that these forms could not be

detected by the methods used in the present work. Analysis using intrinsic fluorescence also

suggested that SI OOA12 unfolding occurs via a two-state transition without intermediate

species (data not shown).

The thermal unfolding/refolding of apo-rSlOOAl2 was monitored using far-UV CD

spectroscopy. When the temperature was increased from 20°C to 94°C, the shape of the far-

UV CD spectra of apo-rSlOOAl2 revealed a decrease in the overall ellipticity and the

presence of an isodichroic point at 204 nm (Figure 4). These results point to a cooperative

loss of the u-helix structure of apo-rSlOOAl2 and to a two-state homodimer transition (as

expected for a system in which only two conformations are present). The content of u-helix

is maximal at temperature below the transition and decreases to zero at temperatures above

the transition region. The apo-rSl00Al2 denaturation was near1y completely reversible in

the conditions used, since samples that were heated above 90°C retum to approximately

80% their original state when allowed to cool slowly to 20°C.

Our results show that there are no structural changes in apo-rSlOOAl2 within the

pH range of 4.0-10.5 at 20°C. However, a thermal pH dependence of apo-rSlOOAl2 was

observed. The stability of apo-rSl00Al2 decreases at pH values below 6.0 and above 9.0,

remaining constant at pH values comprised between 7 and 9. The kinetic unfolding in

several pHs allowed us to calculate the melting temperature Tm of apo-rSlOOAl2 for each

pH value (Figure 6). The maximum stability of apo-rSl00Al2 is wider than the narrow

physiological pH range.

18

Thermodynamic analysis of the interactions of Zn2+, Ca2+ or Zn2+ and Ca2+ with

apo-rS100A12 indicated that these metals enhance the structural stability of the protein

(Figure 5). The melting temperature of apo-rSlOOAl2 occurs at 68.4°C. The thermal

stability of apo-rS 100AI2 showed significant increases after Zn2+ or Ca2+ addition (84°C

and 79°C, respectively), Interestingly, the binding of zinc raised the thermal stability of

Ca2+-loaded rS100A12. The binding of these metals may be essential to induce

conformational changes exposing hydrophobic patches, thus facilitating the interaction with

a hydrophobic region ofthe secondary effectors protein [10,16,33].

The ANS fluorescence results suggested the apo-S 1OOA12 has a low amount of

exposed hydrophobic surface area (Figure 7). The addition of Ca2+ resu1ts in an increase in

the emission intensity of the ANS suggesting a conformational change. This result is

consistent with that observed in other S 100 proteins, were the Ca2+-binding results in an

increase in the solvent accessibility of non-polar residues [33]. Ca2+-bound states of SIOO

proteins recognize and bind to their target proteins through the solvent-exposed

hydrophobic surfaces [4,33]. Our results suggest that rS100A12's mechanism of activation

and recognition of target protein may be the same from other members of the S 100 protein

family, ANS binds more strongly in the Zn2+-rSI00A12 which leads to a large

conformational change (Figure 7). The increase in emission intensity is accompanied by a

great blue shift in the ANS emission from 508 nrn to 478 nrn, indicating a hydrophobic

surface exposition. The exposure of solvent-accessible hydrophobic patches was higher in

the Zn2+-bound state than that observed in the apo-rS100A12, Ca2+-rSlOOA12 or Zn2+Ca2+_

rSlOOAI2. These findings possibly mean that structural changes influenced by Zn2+ and

Ca2+have an potential role in modulating the protein function.

19

Structural stability and biological activity correlations can be used to establish the

mechanism of refolding. ANS binding experiments performed with refolded rS100A12

resulted in a similar profile that was exhibited by the native protein, which indicated that

both thermal and chemical rS100A12 denaturations were reversible in the conditions

assayed.

Since the binding of Zn2+ to SlOOA12 triggers a drastic conformational change and

increases Ca2+ binding affinity to the protein, we performed ITC experiments to examine

whether or not the rS100A12 retains such binding affinity to Ca2+ and Zn2+ (Figure 8). The

binding between Zn2+-rS100A12 and Ca2+ is an exothermic process and the reaction

proceeds with a negative change in enthalpy. Binding isotherm representing the Ca2+

titration shows that these ions interacted with the Zn2+-rS 100A 12 loaded form with the

same stoichiometric binding constants (107 M-1 and 104 M-1) as those observed previously

for the native S100A12 using fluorescence spectroscopy [20].

5. Conclusions

Our results show that equilibrium unfolding/refolding of recombinant S100A12

induced by urea or temperature proceeds by a reversible c1assical two-state homodimeric

mechanism without the accumulation of intermediates. ANS experiments showing that the

refolded rS100A12 regained the binding affinity to Zn2+ and Ca2+ lead us to propose that

the biological activity was recovered. The structural stability was significant1y increased in

the presence of Zn2+ and Ca2+. The metal influence on the structure ofrS100A12 was also

observed by ANS fluorescence indicating a large conformational change. The exact role for

SlOOA12 has not yet been defined. In this sense, our studies provide a direction to

20

understand the relation between structure stability, ions binding and the influence of these

aspects on the biological function of SI OOA12. The interaction with different ions could be

consistent with their physiological role in modulating the functional properties of SI OOA12

as the recognition of target proteins.

Acknowledgments

We would like to thank Prof. Leila Maria Beltramini for helpful discussions. We

wish to thank the Fapesp, CNPq and Capes for financial support.

21

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25

Legend to Table

Table 1: Thermodynamics parameters (chemical unfolding) for the fit of apo-

S100A12 equilibrium unfolding data to a two-state dimer denaturation model.

Legends to Figures

Figure 1: Recombinant S100AI2 expression and purification. Tricine/SDS-PAGE:

(I and 6) Low mass standard; (2-3 and 7) rS100Al2 with His-tag; (4-5 and 8) rS100A12;

(2 and 4) total proteins before induction; (3 and 5) after induction with 0.01 mM IPTG; (7)

rS100AI2 with His-tag purified on a Ni-NTA affinity colurnn and (8) rSI00AI2 purified

by an anion exchange colurnn (mono-Q).

Figure 2: Determination of the oligomeric state of rS100A12 by size exc1usion

chromatography (SEC). Conditions: room temperature in 20 mM Tris-HCl pH 8.0 buffer

containing 10 mM NaCl. The two insets in the figure show the cross-linking reaction

analyzed by tricine/SDS-PAGE and the calibration curve.

Figure 3: Urea induced unfolding/folding of rS100A12 monitored by far-UV CD.

(A) Urea concentrations were from top to bottom as follows: 7.0, 6.0, 5.5, 5, 4.75 and OM.

(B) CD of rS100A12 as a function of urea concentration at pH 8. Urea-unfolding (8) and

26

refolding (!) plots at 222 nm. The data have been normalized for ease of comparison. The

conditions are described in material and methods.

Figure 4: Recombinant S100A12 thermally unfolding monitored by far-UV CD.

Spectra were measured in 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 10 mM NaCl. The

isodichroic point can be observed at ~204 nm, Temperatures were from top to bottom as

follows: 94, 74, 72, 70, 60, and 20°C. The data have been normalized for ease of

comparison (the experimental conditions are described in material and methods).

Figure 5: Inf1uence of Zn2+ and Ca2+ on thermal stability of rSl00A12 monitored

by far-UV CD. (e) Apo-SlOOAI2, (\I') Zn2+, ( .• ) Ca2+and (o) Zn2+Ca2+loaded forms. The

data have been normalized for ease of comparison. The conditions are described in material

and methods.

Figure 6: pH dependence of rS100A12 thermal stability. Dependence of Tm as a

function ofpH, values obtained by far-UV CD in the pH range of 4.0-10.5. The inset figure

shows thefD as a function oftemperature in the pHs 4,8.5 and 10.5.

Figure 7: ANS assays ofthe apo-rS100AI2, Zn2+, Ca2+ and Zn2+Ca2+loaded forms.

The figure shows the increasing in f1uorescence intensity of ANS upon metal addition.

27

Figure 8: Isothermograms representing the binding of Ca2+ to Zn2+-SlOOAI2. The

upper panel represents the raw data and the bottom is the best-fit of the raw data. The

binding isotherms have been fit to the two binding sites model. The concentration of

protein used was 150 ~ in 20 mM TrislHCI (pH 8) containing 10 mM NaCl at 25°C.

28

Figure 1

kDa 1 s

1614

rSIOOAI2-His

/10oo

6

Figure 2

0,08

0,07

0,06

"""'0,05d'

d'--"

~ 0,04ri>.o< 0,03

0,02

0,01

0,00Lo

kDa664~

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2012 _ ..., .•··D

-~, • r r-~

Ribonuclease A0,35 •

, .Chymotrypsinogen A0,301-

r,SIOOAI2 ~

D,"

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Ovalbumm ...'

Albwmn _

0,15

0,10

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5 10 15 25 3020

Fraction (mL)35

Figure 3A

40

30

20

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Wavelength (nm)240 250

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400 450 500 550 600 650

,Figure 7

26

24

22

20

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............Zn2+Ca'+

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Wavelength (mn)

Figure 8A

o~ 19,20

~o::1. 19,15

19,40 I I , I , I , I 'I I' I , I I

19,35(A)

19,30

19,25

19,10

19,05

19,00 ' ! !, ! I ! I

0,00 6,33 50,00 56,3316,67 25,00 33,33 41,67

Time (min)

Figure 88

0,0

-0,2

-0,4

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-0,6oQ)

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--- S IOOA12 Fit

o 2 4 6 8 10 12 14 16

Molar Ratio

Supplementary MaterialCtick here to download Supplernentary Material: supplementary rnaterial.pdf

Supplementary material

I

1,0 I-

• 15~tM0,8

L\ 25~lM• 50pIvl

0,6

,Q-,0,4

o 2 3 4[urea]

5 6 7

Figure: Apo-rS 1OOA12 equilibrium denaturation profiles for 15J!M (.), 25 J!M

(.6) and 50J!M (e) protein as measured by far-UV CD signal at 222 nm. The data have

been normalized for ease of comparison, and continuous lines represent the fit to a two-

state dimer denaturation model.

Table 1

Table 1 - Thermodynamics parameters

Pt L1G;\;·2D(kJ.morl) mN2<-,>2D (kJ.mor1.M-1) [U]I/2 (M)2

(JlM)

apo-rS 1OOAl2 15 93.8 ± 5.6 9.9± 0.9 4.7

apo-rSIOOAI2 25 89.2 ± 4.3 9.6± 0.9 4.5

apo-rSlOOAl2 50 83.3 ± 4.0 9.2 ± 0.7 4.2

Capítulo 4 . Outros trabalhos relevantes

4.1 Inibidores de Proteinases Vegetais

Os inibidores de proteinases englobam um variado número de proteínas

encontradas em plantas, microrganismos e animais, as quais têm como propriedade

peculiar a formação de complexos estequiométricos de proteína-proteína reversíveis

com várias enzimas proteolíticas [Richardson, 1977]. Adicionalmente a sua função na

regulação das atividades proteolíticas, eles são importantes na proteção de fluidos e

tecidos contra sua degradação por proteólise.

Inibidores de serinoproteinases vegetais são principalmente proteínas de reserva,

defesa e regulatórias [Birk, 1994; Richardson, 1991] e podem ser classificados em

diferentes famílias, de acordo com suas características inibitórias e estruturais

[Richardson, 1991].

Os inibi dores da família tipo Kunitz, da qual a BbKI (l1auhinia bauhinioides

Kallikrein [nhibitor) e BbCI (l1auhinia bauhinioides Cruzipain [nhibitor) fazem parte,

demonstram homologia na estrutura primária [Ryan, 1990] e podem interagir em

diversos graus de especificidade com tripsina, quimiotripsina, subtilisina, calicreína

plasmática e tissular. Os inibidores vegetais do tipo Kunitz são caracterizados

principalmente pela sua massa molecular de 20.000 Da e presença de duas pontes

dissulfeto em regiões conservadas [Richardson, 1991].

O BbKI é um inibidor de serinoproteases encontrado em sementes de Bauhinia

bauhinioides e apresenta homologia com outros inibidores do tipo Kunitz, exceto pela

ausência de pontes dissulfeto e por apresentar um único resíduo de cisteína na posição

C-terminal (resíduo 154). Esses atributos fazem de BbKI um membro distinto da grande

família de inibi dores Kunitz. Suas características estruturais particulares favorecem a

inibição da calicreína plasmática [Oliva et al., 2001].

Capítulo 4 - Outros Trabalhos Relevantes 4-2

A estrutura primária do BbCI também mostra homologia com inibidores

vegetais da família do tipo Kunitz, entretanto, BbCI não contém nenhum resíduo Cys.

Embora apresente as regiões conservadas características dos inibidores da família do

tipo Kunitz [Sampaio et al., 1996; Oliva et al.,1996; Oliva et al., 1999 a,b], o inibidor de

cruzipaína e elastases caracterizado como BbCI distingue-se dos demais inibidores da

família do tipo Kunitz por não apresentar pontes dissulfeto, e podendo assim constituir

uma nova subfamília de inibidores. A descrição desse inibidor trouxe uma importante

contribuição, pois desvinculou a função inibitória da delimitação de uma região da

proteína pelas pontes dissulfeto.

A potencial aplicação desses inibidores no desenvolvimento de fármacos nos

motivou a começar um projeto de isolamento dos cDNAs que codificam BbCI e BbKI

visando a expressão heteróloga e disponibilização de grandes quantidades desses

inibidores. Esse foi um projeto em colaboração com a profa. Dra. Maria Luisa V. Oliva

(UNIFESP), a qual já havia determinado as seqüências primárias dos inibi dores por

sequenciamento de aminoácidos. Com base nesta informação partimos para a clonagem

dos cDNAs utilizando oligonuc1eotídeos degenerados, o que resultou na amplificação

de seqüências parciais, incompletas na região terminal 5'. Utilizando RACE 5' (Rapid

Amplification of cDNA Ends) foi possível complementar a seqüência da região 5' do

cDNA. Uma vez completas, as análises das seqüências mostraram que os inibidores

eram sintetizados na forma de pró-proteínas, sofrendo processamento tanto na região N-

como C-terminal. A produção heteróloga das proteínas maduras foi muito bem

sucedida em E. coli e conseguimos publicar esta primeira parte do trabalho [Araújo et

al.,2005].

A partir da produção recombinante as proteínas foram cristalizadas [Navarro,

et al., 2005] (figura 4.1), BbCI teve a estrutura cristalográfica resolvida [Hansen et aI.,

2007] e uma nova frente de trabalho foi possível baseada em ensaios para aplicações

desses inibi dores em processos inflamatórios e na inibição da cruzipaína.


Figura 4.1: Morfologia dos diversos cristais de rBbKI. Os números acima das figurasrepresentam a condição da solução do Fatorial I (tabela 1). Concentração da solução derBbKI utilizada na confecção da gota foi de 6,5 mg/mL (Vieira, 2004).

Tabela 1. Soluções de crescimento de cristais de rBbKI.

Solução Sal Tampão Precipitantefatorial

9JO15203749

0,2 M acetato de amõnio0,2 M acetato de amônio0,2 M sulfato de amônio0,2 M sulfato de amônio

0,1 M citrato de sódio pH 5,60,1 M acetato de sódio pH 4,6

0,1 M cacodilato de sódio pH 6,50,1 M acetato de sódio pH 4,60,1 M acetato de sódio pH 4,6

30% PEG 400030%PEG 400030%PEG 800025%PEG 40008%PEG 40002%PEG 8000

50

1 M sulfato de lítiomonohidratado

1 M sulfato de lítiomonohidratado

15%PEG 8000

Publicações geradas a partir desse trabalho

Araújo, A P U, Hansen, D, Vieira, D F, Oliveira, C, Santana, L A, Beltramini, L M,Sampaio, C A M, Sampaio, M U, Oliva, M L V. Kunitz type Bauhiniabauhinioides inhibitors devoid of disulfide bridges: isolation of the cDNAs,heterologous expression and structural studies. Biological Chemistry ,386: 561- 568, 2005.

Navarro, M V A S, Vieira, D F, Nagen, R A P, Araujo, A P U, Oliva, M L V, Garratt, RC. Crystallization and preliminary X-ray analysis of a novel Kunitz-typekallikrein inhibitor from Bauhinia bauhinioides. Acta Crystallographica SectionF, 61:910 - 913,2005.


4.2 Expressão de peptídeos recombinantes

A síntese química é uma abordagem bastante comum para a obtenção de

peptídeos. Porém, a produção recombinante pode ser bastante interessante, pois

contorna problemas encontrados na síntese química como o tamanho limitado do

peptídeo alvo. Além disso, a síntese de um polipeptídeo com mais de 20 resíduos de

aminoácidos encontra dificuldades na purificação da molécula alvo dos subprodutos

produzidos durante a síntese [Kuliopolus & Walsh, 1994]. Outro problema comum

ocorre em seqüências que possuam aminoácidos hidrofóbicos, sendo freqüenteraeste a

formação de agregados, dificultando a incorporação dos aminoácidos subseqüentes na

síntese [Fields & Noble, 1990]. Além disso, a incorporação de alguns resíduos como

Met, Trp e Cys aumenta a complexidade da síntese química.

Nossa idéia era trabalhar com o peptídeo correspondente aos resíduos 171-194

da região C-terminal da proteína p24 do HIV-1, denominada p24-3. Este peptídeo está

compreendido na interface de dimerização da proteína p24, uma região importante para

a estrutura funcional da proteína. Assim partimos para o desafio de expressar e purificar

o peptídeo produzido em E. coli, como uma alternativa à síntese química.

Um dos problemas em se expressar peptídeos em E. coli é sua susceptibilidade à

proteólise, devido a proteases presentes no citoplasma bacteriano [Murby et al., 1996].

Uma estratégia comum para contornar este problema é produzir os peptídeos como uma

proteína de fusão, expressando-os ligados a uma proteína carreadora. Esta proteína pode

potencialmente mascarar as propriedades físicas do peptídeo e, além disso, muitas vezes

pode facilitar a purificação da proteína de fusão [Uhlen & Moks, 1990]. Construímos

então um gene sintético, por PCR, codificando o peptídeo, e este foi inserido num

plasmídeo capaz de produzi-lo como uma fusão com a proteína tiorredoxina. A idéia era

agregar uma proteína bem expressa e bastante solúvel, capaz de carrear o peptídeo

hidrofóbico para a fase solúvel. Obviamente havia a necessidade de retirar a proteína

carreadora após a purificação, o que foi feito por clivagem enzimática e subseqüente

purificação em fase reversa. Uma das grandes dificuldades desse projeto foi purificar e

determinar a pureza do peptídeo recombinante. Sua pequena massa (cerca de 3 kDa)

levou a necessidade de utilizarmos espectrometria de massas, além do perfil em fase

reversa, para uma melhor caracterização. Ao final do processo o peptídeo de interesse

,f S ( ..U S P SERViÇO DE BIBLIOTECAiNFORMAÇÃO


foi obtido com um rendimento satisfatório (5-6 mg/L de cultura) e com a pureza

necessária para a realização de estudos estruturais e funcionais.

Publicações geradas a partir desse trabalho

• Castilho, P V, Campana, P T, Garcia, A F, Beltramini, L M, Araújo, A P U.Heterologous expression, characterization and structural studies of ahydrophobic peptide from the HIV-l capsid protein (p24). Peptides 26:243 -249,2005.


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