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Produção de Proteínas para Estudos Estruturaise Biotecnológicos
Texto que sistematiza o trabalho científico da candidata para a obtenção dotítulo de Livre Docência
Profa. Ora. Ana Paula Ulian de Araújo
Departamento de Física e InformáticaInstituto de Física de São Carlos
Março de 2008.
I F S ( U S P SERViÇO DF- BIB!:IOTECA• !NFORMAC~I'
Sumário
INTRODUÇÃO 1
CAPÍTULO 1 : PULCHELLINA 1-1
1.1 INTRODUÇÃO E RELEV ÃNCIA 1-11.2 PUBLICAÇÕES GERADAS A PARTIR DESSE TRABALHO 1-121.3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1-12
CAPÍTULO 2: SEPTINAS 2-1
2. 1 INTRODUÇÃO E RELEV ÃNCIA 2-12.2 PUBLICAÇÕES GERADAS A PARTIR DESSE TRABALHO 2-42.3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 2-4
CAPÍTULO 3 : PROTEÍNAS LIGANTES DE CÁLCIO 3-1
3.1 INTRODUÇÃO E RELEVÂNCIA 3-13.1 PUBLICAÇÕES GERADAS A PARTIR DESSE TRABALHO 3-53.2 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 3-5
CAPÍTULO 4: OUTROS TRABALHOS RELEVANTES 4-1
4.1 INIBIDORES DE PROTEINASES VEGETAIS 4-1Publicações geradas a partir desse trabalho 4-3
4.2 EXPRESSÃO DE PEPTÍDEOS RECOMBINANTES 4-4Publicações geradas a partir desse trabalho 4-5
4.3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 4-5
I F S ( U C lI) SERViÇO DE BI8~IOTECA• ~r INFORMAÇAO
Dedicatória
I F S (• U S P .:iERVIÇO DE BIB!;.IOTECAINFORMAÇAO
Agradecimentos
Meu infinito obrigada ao Grupo de Biofísica, particularmente à profa. Leila M.Beltramini, aos profs. Otaciro R. Nascimento e Antônio J. da Costa-Filho, pela amizade,apoio e estímulo para que esse trabalho se tomasse real.
Ao prof. Richard C. Garrat pela dedicação, competência e oportunidade detrabalharmos juntos, tomando as reuniões de projeto quase que em família.
Aos técnicos do Grupo de Biofísica: Bel, Andressa, João e Femando que semprefizeram o impossível se tomar possível, caso fosse necessário. E é claro, à Ester, pelaajuda com a burocracia administrativa e principalmente com memorial!
À profa. Heloísa S. S Araújo, pela amizade e por não me deixar desanimar!
A todos os colaboradores, os quais me permitiram "aventuras" em outras áreas;
Aos meus alunos e ex-alunos, com quem eu aprendo mais dia-a-dia;
Aos meus pais, irmãos, aos "Crestana Guardia" e toda minha família, peloincentivo e carinho sempre.
Ao Hélio, Nina e Ian pela compreensão, ajuda e pelo amor incondicional.
I FS(~U SP SERViÇO DE BIB~IOTECAINFORMAÇAO
Introdução
A expressão de proteínas tem sido um dos principais focos desde o advento da
tecnologia do DNA recombinante na década de 1980. Um exemplo disso está na
produção de insulina recombinante para uso clínico, em 1982, a qual até então era
disponível de fontes como pâncreas porcino ou bovino [Villa-Komaroff et al., 1980]. A
produção de insulina humana em Escherichia coli foi um dos principais eventos na
medicina [Falzon et al., 2006]. Poucas proteínas estão disponíveis em abundância
suficiente que permitam seu isolamento direto e purificação a partir dos tecidos nos
quais ocorrem. Assim, a produção heteróloga de proteínas tem possibilitado produzir
importantes fármacos (por ex. hormônio de crescimento), bem como proteínas para a
indústria e para a pesquisa científica. Nesse contexto, a disponibilidade de proteína
purificada é um pré-requisito para sua caracterização bioquímica, biofísica e estrutural.
Escherichia coli é o hospedeiro mais atraente para a produção de proteínas
recombinantes, principalmente devido à facilidade de uso, robustez e baixo custo
[Grãslund et al., 2008]. Porém, existem desvantagens em usar E. coli como hospedeiro
para a expressão. E. coli não é capaz de produzir modificações pós-traducionais
eucarióticas, tais como glicosilação, as quais podem ser críticas para produzir a proteína
de interesse enovelada e ativa. Ainda, algumas proteínas, especialmente aquelas maiores
e proteínas de membrana não são expressas em E. coli ou expressam de forma insolúvel
como corpos de inclusão [Villaverde & Carrio, 2003].
Estudos têm indicado que cerca de 50% de proteínas provenientes de Eubacteria
ou Archaea e somente cerca de 1o{de proteínas de Eukarya podem ser expressas
solúveis em E. coli [Braun & LaBaer, 2003]. Além disso, a probabilidade de sucesso na
expressão de uma proteína solúvel em E. coli diminui consideravelmente para massas
I FS( ..USP SERViÇO De. BJó':,UfECPINFORMAÇAO
Introdução 11
acima de ~60kDa (figura 1.1). Adicionalmente, é bem estabelecido que os níveis de
expressão e o grau de solubilidade de uma proteína recombinante expressa em E. coli
podem ser grandemente influenciados por uma variação sutil nas seqüências de
aminoácidos nas regiões N- and C-terminais [Bjõrnsson et al., 1996; Peti & Page,
2007]. Domínios protéicos isolados muitas vezes têm mais sucesso na expressão que
proteínas relativamente grandes, compostas de vários domínios, sendo por isso alvos de
expressão e purificação preferenciais nesses casos.
0.7
0.2
Do clone solúvel à proteína purificada -pequena escala (1 mL)
0.6
0.5
- ,--,,'-....., --...••. ..., -.•••••-- .•Do clone à proteína purificada
com sucesso em larga escala••••• •••••••••••••••••••
•• •••••••••
oCIlCIlQ)<.J::JCIlQ)
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0.4
0.3Da proteína purificada à
determinação da estrutura
0.1
Or--'--~--~---r---r---r--.---'---.--.O 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1,000
Tamanho da construção
Figura LI: Solubilidade em função do tamanho da construção (em aminoácidos). Existemrelativamente poucas proteínas alvo com comprimentos maiores que 800 aminoácidos, assim,essas frações foram extrapoladas e são mostradas em cinza [Figura adaptada de StructuralGenomics Consortium et al., 2008].
Outras bactérias tais como Bacillus subtilis, fungos como Saccharomyces
cerevisiae e Pichia pastoris, sistemas de células de insetos usando Baculovírus e células
de mamíferos vêm sendo opções alternativas para contornar problemas que podem
surgir quando se usa E. coli como célula hospedeira [Falzon et al, 2006]. Ainda, para
expressar proteínas tóxicas à célula hospedeira e proteínas de membrana, sistemas livres
de células foram desenvolvidos [Klammt et al., 2006]. Talvez, as maiores limitações da
Introdução III
expressão em E. coli sejam duas: i) a falta de um sistema eficiente de secreção para o
meio de cultura, característica compartilhada com outras bactérias Gram-negativas, mas\ ,; r ,~M
não com as Gram-positivas, o que toma Bacillus [Georgiou & Segatorf e Lactococcus
lactis [Morello et al., 2008] sistemas atraentes se a idéia é secretar o produto
recombinante; ii) em bactérias Gram-negativas, a membrana externa, a qual serve como
um barreira que previne a entrada de moléculas tóxicas, apresenta lipopolissacarídeos
[Nikaido, 2003] que podem contaminar o produto recombinante após a purificação.
Contudo, E. coli é ainda hoje o hospedeiro mais utilizado na produção de proteínas
recombinantes e alguns dos problemas associados podem ser contornados.
De modo geral, os sistemas de expressão mais usados atualmente, visando à
biologia estrutural, são baseados na expressão em Escherichia coli ou células de insetos
infectadas com Baculovírus. Na maioria dos casos, algum desses dois sistemas é
aplicável para a expressão de quase todas as proteínas solúveis, em quantidades
aceitáveis para estudos estruturais [Lundstrom, 2007]. Entretanto, quando se trata de
proteínas de membrana, a situação é bem diferente. Essas proteínas quando produzidas
exibem baixos rendimentos e estabilidade, o que tem levado a um aumento nos esforços
para o desenvolvimento de vetores e sistemas de expressão alternativos.
Dos sistemas de expressão em E. coli comumente utilizados, aqueles baseados
no promotor do bacteriófago T7 (vetores pET) [Studier et al., 1990] são certamente os
mais populares na produção de proteínas recombinantes (os vetores pET participaram
de mais de 90% das preparações protéicas depositadas no PDB até 2003) [Sorensen,
2005]. Mais de 50 diferentes plasmídeos da geração pET estão comercialmente
disponíveis, sendo que o sistema inclui promotores híbridos, múltiplos sítio. de -:
clonagem para a incorporação de diferentes parceiros de fusão e sítios de
reconhecimento de proteases.
A caracterização estrutural de proteínas geralmente requer um produto puro e
altamente homogêneo. Nesse sentido, a engenharia genética tem facilitado imensamente
o processo de purificação pela introdução de vários "tags" de afinidade no N- ou C-
terminais ou mesmo dentro da seqüência codificante do gene de interesse. Os "tags"
mais comuns usados são as caudas de histidinas (peptídeos com 6 ou 10 resíduos
consecutivos de His), as quais permitem a purificação baseada numa cromatografia de
Introdução IV
afinidade por metal imobilizado (lMAC). Outros "tags" comuns são MBP (maltose
binding protein), cuja purificação é baseada na cromatografia de afinidade em coluna de
maltose; GST (glutationa S-transferase), FLAG, entre muitos outros. É claro que,
quando possível, a cromatografia de afinidade é a primeira escolha para purificação.
Outros meios de purificação incluindo etapas de precipitação e gradientes requerem
grandes quantidades de material e não são adequados para proteínas recombinantes
expressas em baixos níveis. Adicionalmente, cromatografias de exclusão molecular,
interação hidrofóbica, troca-iônica e fase-reversa são consideradas na purificação.
Naturalmente, se não há um "tag" (recombinante ou nativo), a purificação seguirá um
caminho "clássico", o qual será proteína-dependente.
Finalizando essa breve introdução, um sistema de expressão ideal só pode ser
selecionado se a produtividade, a atividade, a utilização e as características físico-
químicas da proteína de interesse são levadas em consideração [Yin et ai., 2007]. Em
outras palavras: os sistemas de expressão também são proteína-dependentes.
Esta tese traz uma série de trabalhos publicados ou aceitos que exemplificam o
quanto a expressão heteróloga pode contribuir para os estudos estruturais. Diversas
estratégias para a produção de proteínas, expressas em vetores compatíveis com E. coli
e em geral com alto rendimento permitiram estudos estruturais e/ou funcionais. Além
disso, a purificação das proteínas recombinantes e, em alguns poucos casos, de
proteínas nativas também surgem nos trabalhos como um ponto decisivo para atingir a
qualidade necessária para os estudos estruturais e funcionais. Estes, por sua vez,
complementam grande parte da história apresentada e passaram assim a fazer parte de
minha rotina de trabalho.
No capítulo 1 é feita uma breve revisão sobre proteínas inativadoras de
ribossomos (RIPs) e são apresentados os resultados de minha principal linha de
pesquisa hoje: estudos de biologia molecular, celular, bioquímicos e biofísicos
envolvendo a pulchellina, uma proteína inativadora de ribossomos altamente tóxica.
O segundo capítulo traz uma breve introdução e os resultados da produção
heteróloga e estudos estruturais da septina 4 humana (SEPT4), uma proteína expressa
em certos tecidos neoplásicos, além de estar envolvida em doenças neurodegenerativas.
Introdução v
As mudanças conformacionais Ca2+-induzidas são o foco do capítulo 3, em
trabalhos envolvendo a produção recombinante e os estudos estruturais de proteínas
ligantes de cálcio.
No quarto capítulo, a expressão heteróloga e purificação visando supnr a
demanda da produção de proteínas são mostradas em trabalhos em colaboração com
outros pesquisadores.
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Introdução VI
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Capítulo 1 . Pulchellina
1.1 Introdução e relevância
Até o fim do século XIX, acreditava-se que a atividade tóxica do extrato bruto
de sementes maduras de Abrus precatorius era devido à contaminação por toxinas
bacterianas. Nesta época, os estudos com sementes tóxicas tinham enfoque médico. Em
1884, Warden & Waddel mostraram que a toxicidade de sementes de Abrus precatorius
era devido a uma fração protéica que podia ser precipitada com álcool a partir de um
extrato aquoso, excluindo a possibilidade da toxicidade ser creditada à contaminação
bacteriana. A seguir, Stillmark (1888) baseado em dados experimentais de uma proteína
isolada de sementes de Ricinus communis, atribuía a toxicidade à capacidade da
proteína aglutinar eritrócitos in vitro. Somente no início da década de 70, estudos
mostraram que as preparações daquela época eram referentes a uma Proteína
[nativadora de Ribossomos (RIP), formada por uma citotoxina e uma hemaglutinina
[Olsnes & Pihl, 1973].
As proteínas inativadoras de ribossomos (RIPs) são uma classe de enzimas (EC
3.2.2.22) que catalisam especificamente a clivagem da ligação N-glicosídica entre a
ribose e a adenina numa seqüência conservada da subunidade 28S dos rRNAs
eucarióticos [Endo & Tsurugi, 1987]. Endo et aI. (1987) verificaram que todos os
resíduos de adenina clivados estavam localizados em um loop de uma seqüência
específica do RNA ribossomal (A4324, em ribossomos de fígado de ratos). Esta
seqüência "GAGA" conservada foi nomeada de loop sarcinalricina. O efeito direto das
Capítulo 1-Pulchellina 1-2
RIPs na célula promove um dano irreversível no ribossomo, o qual impossibilita a
ligação dos fatores de elongação EF-l e EF-2, impedindo o passo de elongação na
tradução e, conseqüentemente, bloqueando a síntese protéica.
Após a atividade enzimática das RIPs ter sido reconhecida [Endo et al., 1987;
Endo & Tsurugi, 1987], a atividade rRNA N-glicosilase tomou-se sua principal marca e
ainda é usada para identificar essas proteínas tóxicas. Porém, existem trabalhos
relatando que a maioria das RIPs possui também uma atividade polinucleotídica
adenosina glicosilase (APG). Algumas RIPs liberam mais de um resíduo de adenina dos
ribossomos, outras ainda agem nas espécies de RNA a parte do RNA ribossomal e em
regiões poli A [Barbieri et al., 1997]. No entanto, a eficiência dessa atividade APG é
consideravelmente menor que a atividade RNA N-glicosilase nos ribossomos e, dessa
forma, a ação citotóxica não pode ser atribuída a essa atividade. De qualquer forma, a
observação das RIPs depurinarem também DNA e outros ácidos nucléicos [Peumans et
ai, 2001] abriu novas perspectivas sobre o mecanismo de como essas toxinas matam a
célula.
Classificação das RIPs
Segundo Mundy et ai (1994), as RIPs estão classificadas de acordo com suas
propriedades físicas e estruturais em três grupos :
RIP tipo 1: são enzimas monoméricas que possuem um único domínio RNA N-
glicosilase, sendo que a maioria possui tamanho aproximado de 30 kDa
[Barbieri et al., 1993], como a saporina (de Saponaria officinalis) e a PAP, uma
proteína antiviral de Phytolacca americana. Apesar das RIPs tipo 1 serem
distintas na sua seqüência primária como um todo e nas modificações pós-
traducionais, elas compartilham uma estrutura terciária altamente conservada
[Lord et al., 1994].
RIP tipo 2: são proteínas heterodiméricas, na sua maioria altamente tóxicas, com
propriedades lectínicas e enzimáticas em subunidades polipeptídicas separadas,
porém expressas como prepro-proteínas. Cada subunidade tem cerca de 30 kDa,
sendo um polipeptídeo com atividade RIP (cadeia A), ligado por meio de uma
ligação dissulfeto a uma lectina (cadeia B) [Stirpe et al., 1978]. A cadeia B pode
Capítulo I -Pulchellina 1-3
se ligar a glicoproteínas ou glicolipídeos da superfície de células eucarióticas e
mediar o transporte da cadeia A para o citosol [Beaumelle et al., 1993]. Uma vez
no citosol, a RIP tem acesso a maquinaria de tradução e rapidamente interrompe
a síntese protéica. Alguns exemplos pertencentes a esta classe são a abrina, de
Abrus precatorius, a ricina, de Ricinus communis e a pulchellina, de Abrus
pulchellus.
Van Damme et al., 2001 incluíram as RIPs tipo 2 clássicas como uma
categoria de quimero-RIPs, a qual possui tanto os dímeros ligados como não
ligados covalentemente (por exemplo, as aglutininas de sementes de R. comunis
e A. precatorius), além das RIPs tetraméricas de Polygonatum multiflorum (na
qual os monômeros são não covalentemente associados) e de Sambucus nigra
(SNAl), que os monômeros são unidos por meio de ligações dissulfeto entre as
cadeias B.
RIP tipo 3: são sintetizadas como precursores inativos (pro-RIPs) que requerem
um processamento proteolítico entre os aminoácidos envolvidos na formação do
sítio ativo [Mundy et al., 1994]. Essas RIPs são bem menos prevalentes que os
outros dois tipos. Até o momento, foram caracterizada RIP tipo 3 somente em
milho e cevada [Bass et al., 1992].
Apesar de elementos da estrutura do domínio das RIP tipo 1 serem encontrados
em outras proteínas ligantes de RNA, como a RNase H de Escherichia coli e da
transcriptase reversa retroviral [Ready et ai, 1988], nenhum domínio parecido com o de
N-glicosilase tem sido encontrado em outras proteínas.
Diferente do domínio N-glicosilase da cadeia A, a estrutura {J-treefoil dos
domínios individuais da cadeia B é amplamente distribuído e extremamente antigo. A
cadeia B das RIPs tipo 2 e lectinas relacionadas consistem de cópias duplicadas de um
peptídeo ligante a galactose tripartido, denominado subdomínios a, p e y, sendo cada
subdomínio composto por 40 resíduos de aminoácidos. Os sítios de ligação a açúcares
são formados por meio de uma dobra acentuada no esqueleto da estrutura formada pelas
seqüências Asp, VaI e Arg, mais um resíduo aromático variável, o qual promove a
plataforma de ligação ao açúcar [Rutenber & Robertus, 1991]. Acredita-se que estes
sítios são derivados de uma lectina ancestral de 40 resíduos de aminoácidos por meio de
Capítulo I -Pulchellina 1-4
dois eventos de inserção de duplicação em tandem, o qual ocorreu antes de sua fusão
com o domínio ancestral N-glicosilase [Rutenber et ai, 1987]. Ou seja, acredita-se que
as RIPs tipo 2 tenham surgido por meio da fusão de um ancestral da RIP tipo 1 com
uma lectina, originando as cadeias A e B respectivamente.
Atividade das RIPs
As RIPs podem ter grande potencial terapêutico como toxinas quiméricas,
obtidas por meio de manipulações genéticas [Lappi et ai, 1994] ou bioquímicas, como
as imunotoxinas (RIPs ligadas a anticorpos capazes de direcioná-las seletivamente
contra alvos celulares específicos) [Falini et ai, 1992] ou toxinas conjugadas (RIPs
ligadas a moléculas carreadoras específicas )[Casscells et ai, 1992; Cavallaro et ai,
1993] tomando-as seletivamente tóxicas para um dado tipo de célula alvo. As toxinas
usadas são muito potentes e por causa de sua função catalítica, mesmo que poucas
moléculas alcancem o citosol da célula alvo já será letal. Diferente dos agentes
quimioterápicos, as toxinas levam a morte tanto células quiescentes quanto
proliferativas [Fracasso et al., 2004]. Dessa forma, podem ser úteis no tratamento de
câncer [Pryme et al., 2006], além do uso no combate de doenças auto-imunes e também
contra a infecção por HIV [Wang, 2002].
As diferenças observadas na citotoxicidade de diferentes RIPs são maiores que
as descritas para a atividade enzimática, possivelmente devido a diferenças estruturais
que a proteína deve sofrer para atingir o alvo intracelular para exibir sua ação tóxica
[Battelli, 2004]. A ausência da cadeia B com propriedades lectínicas nas RIPs tipo 1 é
apontada como a responsável pela diferença na citotoxicidade entre RIPs tipo 1 e 2
[Barbieri et al., 1993]. A presença da cadeia B asseguraria a ligação à superfície celular,
facilitando o processo de endocitose [Olsnes &Pihl, 1973]. De fato, vem sendo
mostrado que a cadeia B da RIP tipo 2 media a entrada da cadeia A para dentro da
célula através de uma interação do receptor lectínico glicosilado. Porém, a presença de
um sítio ligante de RIP na superfície da célula não garante que a toxina será
intemalizada e que a síntese protéica seja abolida [Refsnes et al., 1974]. Além disso, a
citotoxicidade das RIPs não é proporcional ao número de receptores de membrana. Por
Capítulo I -Pulchellina 1-5
exemplo, modecina é tão tóxica a células como a ricina e a abrina [Stirpe et al., 1985] e,
como essas toxinas, ela pode ligar-se às moléculas contendo resíduos de galactose
terminais na membrana, contudo, liga-se à receptores diferentes dos receptores de
abrina e presentes em número bem menor.
Comparações entre a estrutura das RIPs e a citotoxicidade tomaram-se ainda
menos lineares quando uma nova classe de RIP tipo 2 emergiu. Apesar da presença da
cadeia lectínica, essa classe possui citotoxicidade similar as RIP tipo 1. O destino da
RIP após a intemalização parece ser de grande relevância para a sua toxicidade
[Sandvig & van Deurs, 1996]. A falta da toxicidade das RIP tipo 2 não tóxicas pode ser
atribuída às características da cadeia B, influenciando a distribuição subcelular e então
o destino da cadeia A após a intemalização. Por exemplo, a baixa toxicidade de nigrina
b comparado com a ricina tem sido pelo menos em parte explicado pela alta degradação
da nigrina b pelas células, resultando em uma baixa concentração remanescente no
interior das células e pelo diferente caminho intracelular seguido pelas duas lectinas
[Battelli et al., 1997]. Portanto, as RIPs tipo 2 também possuem uma toxicidade
altamente variável, que pode ser ocasionada principalmente pelas diferenças no seu
destino intracelular.
A atividade enzimática das diferentes RIPs pode vanar dependendo das
diferenças estruturais no sítio ativo e em outros domínios relacionados à atividade que
determinam a especificidade a substratos, por meio da influência da interação de cada
RIP com diferentes alvos subcelulares [Battelli, 2004]. A atividade adenina
polinucleotídeo glicosilase (APG) não está distribuída uniformemente nas diferentes
RIPs e nem está corre1acionada a ação no rRNA [Battelli, 2004].
Ainda, uma atividade lipolítica foi associada à ricina [Lombard et al., 2001],
atividade esta que pode estar envolvida no processo de envenenamento pela toxina. A
etapa de interação lipídeo-proteína parece ser devido principalmente à presença de uma
atividade não lectínica na cadeia B, no caso da ricina [Moulin et al., 1994]. Mutações e
estudos estruturais sugerem que a presença ou a ausência dessa atividade pode justificar
a diferente toxicidade entre as RIP tipo 2 tóxicas e não tóxicas. Os diferentes efeitos e
lesões observados in vivo após a administração de várias RIP tipo 2 tóxicas pode
também ser devido a diversidade das cadeias B, que pode afetar: (i) a penetração dentro
Capítulo 1-Pulchellina 1-6
da célula, (ii) o caminho e o destino intrace1ular, e (iii) a distribuição dentre os diversos
tipos celulares, e conseqüentemente entre os órgãos diferentes.
A síntese das RIPs
Grande parte do que se sabe a respeito da síntese e processamento das RIPs tipo
2 baseia-se em estudos com a ricina. A ricina é sintetizada como uma molécula
precursora única (preproricina), na qual as cadeias A e B da toxina madura estão unidas
por um peptídeo de ligação de 12 aminoácidos. A porção N-terminal da cadeia A
madura é precedida por 35 resíduos na sua "pré-seqüência" e os primeiros 26 resíduos
mediam a translocação co-traducional do precursor nascente para o lúmen do retículo
endoplasmático (RE). A seqüência sinal é c1ivada durante esta etapa. A pro-ricina é
glicosilada e as pontes dissulfeto estabilizadas. No RE a pro-ricina é transportada via
vesículas do Complexo de Golgi para os vacúolos de estocagem protéica, onde é
processada por uma proteinase para atingir sua forma madura [Lord et al., 1994].
Internalização das RIPs
o mecanismo de entrada das RIPs nas células ainda é alvo de especulação.
Atualmente muitas evidências sugerem que elas entram e distribuem-se por vias
específicas. A primeira etapa de intemalização das RIPs é a interação RIP-célula, que
consiste na ligação dessas proteínas aos sítios receptores presentes na superfície da
membrana celular [Battelli, 2004]. O número de sítios de ligação nas células varia
bastante para as diferentes RIPs tipo 2 [van Deurs et ai, 1985]. Essas proteínas podem
ser captadas por um maior número de células devido à presença de glicoconjugados na
superfície celular [Peumans & Van Damme, 1995]. Outro processo de reconhecimento é
a interação de receptores com as cadeias laterais de carboidratos presentes nas proteínas
[Frigerio et al., 1998]. Esta também é a hipótese considerada para as RIPs tipo l, além
daquela delas entrarem nas células por meio da fase fluídica da endocitose, sendo então
tóxicas para macrófagos e trofoblastos [Hartley et al., 1996].
------------------_. -
Capítulo 1-Pulchellina 1-7
Para alcançar os substratos citosólicos, várias toxinas são transportadas não
somente para endossomos, mas fazem um transporte retrógrado para o retículo
endoplasmático (RE) antes de serem translocadas através da membrana do RE. A cadeia
B da ricina é uma lectina galactose específica que é responsável pela ligação da ricina
nos galactosídios da superfície da célula [Olsnes et ai., 1974]. Uma porção da ricina
migra dos endossomos recentes para o sistema trans-Golgi e de lá para o RE [Lord &
Roberts, 1998; Sandvig et ai., 2004; Lord et aI. 2005]. No lúmem do RE, as cadeias A e
B se separam, possivelmente pela ação da enzima dissulfeto isomerase. A cadeia A
liberada pode interagir com lipídeos negativamente carregados na membrana do RE e,
quando parcialmente enovelada, será apresentada como um substrato ERAD (proteínas
associadas à degradação no RE), levando-a a ser transportada através da membrana do
RE para o cito sol. Estudos espectroscópicos com a cadeia A da ricina demonstraram
mudanças significativas na estrutura secundária da proteína como um resultado de sua
interação com lipossomos contendo fosfolipídeos negativamente carregados. Essa
mudança, induzida pela ligação ao lipídeo, acarreta em perda da atividade da cadeia A
de se ligar à adenina. Desta forma, Day et ai (2002) especularam que o
desenovelamento parcial da cadeia A induzido pela interação com a membrana da célula
durante o processo de internalização pode facilitar seu reconhecimento como um
substrato ERAD. A cadeia A nativa é extremamente resistente à degradação
proteolítica, porém parcialmente enovelada é bem mais sensível. A cadeia A
parcialmente enovelada no citosol será susceptível a degradação proteossomal. Foi
calculado que aproximadamente 5 % da quantidade total de ricina dentro das células
podem alcançar o compartimento subcelular que permitirá a translocação para o citosol
[van Deurs et ai., 1988]. Porém, uma porção da cadeia A é resistente a esta degradação
por meio do seu renovelamento, que se torna possível pela sua interação com o
ribossomo, ficando a molécula cataliticamente ativa e capaz de depurinar sua
subunidade 28S [Argent et ai., 2000]. Desta forma, o ribossomo exerce o papel de
molécula chaperona e, conseqüentemente, age de maneira suicida.
Capítulo I -Pulchellina 1-8
A Pulchellina
Uma nova RIP foi isolada de sementes de Abrus pulchellus, em 1998, por
Ramos e colaboradores. Tratava-se de uma RIP tipo 2 heterodimérica, composta de uma
cadeia enzimática com atividade RNA N-glicosilase (~ 29 kDa, designada cadeia A)
ligada, através de uma ponte dissulfeto, a uma cadeia lectínica galactose-ligante (~31
kDa, a cadeia B). Esta nova RIP tipo 2 apresentou uma toxicidade alta para mamíferos
(DLso= 30llg/Kg de peso corpóreo), comparável a ricina e a abrina. A partir desses
dados e do incentivo do prof. Renato de Azevedo Moreira, iniciamos um projeto nesta
linha de pesquisa.
O primeiro resultado deste trabalho conjunto está apresentado no artigo
publicado na revista Toxicon [Silva et al., 2003]. Neste, batizada de pulchellina, a
toxina foi isolada de uma cultura de calos, estabelecida a partir de explantes imaturos de
cotilédones de Abrus pulchellus (figura 1.1). A idéia inicial era obter uma fonte
alternativa para a produção da toxina, independente das sementes, uma vez que não
tínhamos acesso à planta mãe. Havia dúvidas se a expressão da pulchellina seria
mantida em tecidos indiferenciados, pois já sabíamos que a toxina no vegetal estava
presente somente nas sementes. Para excluir a possibilidade de que a pulchellina
extraída dos calos fosse ainda remanescente das células iniciais dos explantes,
monitoramos a expressão da cadeia A da pulchellina nas culturas por RT-PCR, além da
atividade tóxica. Os resultados indicaram que a pulchellina estava sendo sintetizada nos
calos, o que permitiu sua purificação a partir destes, abrindo uma nova frente para a
produção da toxina a partir da cultura de tecidos.
Entretanto, a idéia de ter uma fonte ilimitada da toxina, objetivando tanto os
estudos estruturais quanto suas aplicações como imunotoxinas, levou-nos a clonagem e
expressão da pulchellina. Na época, clones para várias RIP tipo 2, como ricinas e abrina
já haviam sido descritos em diversos laboratórios [Evensen et ai. 1991; Wood et ai.
1991; Hung et ai. 1994] e revelavam que essas proteínas pertenciam a uma família
multigênica que não possuía íntrons. Baseada nesta informação, nossa estratégia de
clonagem pressupôs que uma situação similar ocorreria para a pulchellina, dada à
proximidade filo genética dessa com abrina (mesmo gênero) e na alta identidade entre as
Capítulo 1 -Pulchellina 1-9
seqüências primárias já descritas para abrina e ricina [Wood et al. 1991]. Assim, usamos
oligonucleotídeos degenerados, baseados nas seqüências publicadas das cadeias A e B
de isoformas de abrina, para amplificar a seqüência genômica específica desejada.
Figura 1.1: Abrus pulchellus ternuijlorus: a espécie é uma trepadeira perene, com ramosgeralmente finos, pouco lenhosos, possuindo folhas compostas, cujo comprimento pode variar de 5 a 10cm. O fruto é um legume de 3 a 5 em de comprimento, deiscente, contendo de 3 a 6 sementes marrom
claras por fruto. Detalhes da flor ampliada (à esquerda) e parte da planta (à direita).
Deste trabalho foram publicados dois artigos, sumarizados a seguir. O primeiro
englobou a clonagem, expressão e renovelamento da cadeia B (lectínica) [Goto et al.,
2003]. A cadeia B da pu1chellina foi expressa em E. coli em altos níveis, porém em
corpos de inclusão. Após inúmeras tentativas frustradas para reverter esse quadro, a
proteína recombinante foi submetida à desnaturação química e renovelamento. Os
passos de renovelamento foram baseados na lenta diálise do desnaturante em presença
do ligante D-Gal. Desta forma, a interação da proteína com o ligante serviu como
catalisador do enovelamento protéico. A formação de núcleos de condensação da
proteína na conformação de menor energia foi possível apenas na presença do ligante
em solução. A verificação da atividade biológica da proteína renovelada e de sua
interação com a matriz da cromatografia de exclusão molecular puderam confirmar a
renaturação. O sucesso do processo também foi verificado por espectroscopia de
Capítulo I -Pulchellina 1-10
dicroísmo circular, o qual mostrou uma estrutura secundária com predominância de
folhas 13, em concordância com a estrutura da cadeia B de abrina. Ao final do
renovelamento, a proteína apresentava-se monomérica. Havia, portanto, um resíduo de
cisteína livre e reativo, para o acoplamento de outras moléculas (fármacos ou sondas)
visando à internalização destes no citosol de células alvo. Esse trabalho foi o primeiro
desafio em termos de expressão solúvel e seu insucesso levou a um grande aprendizado
com relação ao uso de linhagens alternativas para expressão visando à solubilização,
bem como aos métodos de renovelamento. A cadeia B, em especial, tem ~ 30 kDa e
conta com 9 cisteínas, sendo oito dessas participantes de ligações dissulfeto intracadeia.
o outro artigo foi focado na produção da cadeia A da pulchellina ativa, visando
a possibilidade de seu uso em imunotoxinas [Silva et al., 2005]. Um fragmento de DNA
genômico contendo a seqüência que codifica a cadeia A foi inserido num vetor de
expressão bacteriano para produzir a cadeia A, fusionada a GST, em Escherichia coli.
Após a expressão e purificação, a atividade da proteína recombinante foi determinada
pela sua capacidade de depurinação de rRNA in vitro. Também in vitro, a cadeia A foi
associada a cadeia B, ambas recombinantes, para produzir um heterodímero ativo in
vivo, com toxicidade comparável a pulchellina nativa. Esses resultados abriram espaço
para a utilização da cadeia A recombinante em preparações de imunoconjugados com
potencial terapêutico, numa parceria com a empresa Nanocore (Campinas, SP).
Ainda decorrente da produção heteróloga da cadeia B da pulchellina (rPBC),
surge uma nova questão: a proteína recombinante era capaz de ligar-se a determinadas
células, mas ainda retinha a capacidade de ser endocitada? Para responder tal dúvida,
teve início um projeto em colaboração coma profa. Heloías S. Selistre-Araújo (UFSCar)
para determinar células de mamíferos que tinham sua adesão promovida pela rPBC. A
partir daí, microscopia> de fluorescência e confocal foram usadas para determinar a x
localização intracelular 'da pulchellina nativa (controle) e da rPBC. Os resultados
suportam a hipótese que internalização via endossomos e o transporte retrógrado
através do Complexo de Golgi são usados por ambas proteínas [Goto et al., 2007].
Voltando um pouco no tempo, durante o processo de clonagem genômica,
informações sobre as porções N e C-terminais da pulchellina haviam sido perdidas. Para
resgatar essas informações, utilizamos a técnica de RACE (Rapid Amplification of
Capítulo I -Pulchellina 1-11
cDNA Ends) e, a partir das seqüências obtidas novas clonagem foram feitas por RT-
PCR. Analisando os diversos cDNAs amplificados vimos que existiam diferenças entre
eles, as quais poderiam ser referentes a isoformas. Paralelamente, estávamos isolando a
pulchellina nativa para caracterizar melhor sua atividade e haviam também indícios de
isoformas. Várias isoformas de abrina já tinham sido descritas, de modo que não era
surpreendente o que estávamos encontrando. Porém, será que nossa escolha na
clonagem havia sido acertada? As toxicidades das isoformas diferiam entre si. Teríamos
escolhido a melhor (mais tóxica)? Em que elas diferiam? A busca das respostas para tais
questões nos levou a um estudo bioquímico mais profundo da pulchellina nativa, o qual
está em parte contido na publicação recente da revista FEBS Journal [Castilho et al.,
2008]. Neste trabalho, foi possível o isolamento de 4 isoformas da pulchellina (P I, P Il,
P III e P IV) utilizando cromatografias diversas. Havíamos isolado sete cDNA distintos
e purificado quatro isoformas da pulchellina nativa, sendo a relação entre cDNAs e
isoformas o nosso desafio. As proteínas foram então submetidas à digestão tripsínica e
analisadas por espectrometria de massas. As seqüências geradas foram correlacionadas
às isoformas usando um banco de dados composto das seqüências dos cDNA dos 7
clones. Os valores de ICso e LDso indicaram que P I e P II são mais tóxicas que P III e P
IV. Os resultados suportam a hipótese que as diferenças na toxidade podem ser
relacionadas às diferenças na cadeia B (ligante) que media as interações com a
superfície celular.
Este trabalho mais recente com a pulchellina (em parte ainda não publicado)
contou com uma nova colaboradora: a profa. Lynne M. Roberts (University ofWarwick,
Coventry, UK). O grupo da Profa. Roberts possui uma linha de pesquisa bastante
consolidada com RIPs [Lord et al., 2005a; Lord et al., 2005b; Smith et al., 2006;
Spooner et al., 2006], contribuindo para a elucidação dos mecanismos de transporte da
ricina no interior da célula [Roberts & Smith, 2004; Di Cola et aI., 2005]. Assim, o
estabelecimento dessa colaboração tem nos permitido aprender e produzir contribuições
significativas no tema, culminando no convite do prof. Mike Lord (University of
Warwick, UK), para redigir um capítulo sobre a pulchellina no livro da série Plant Cell
Monographs publicado pela Springer, que trará revisões sobre proteínas vegetais
tóxicas, previsto para 2009.
Capítulo 1-Pulchellina 1-12
1.2 Publicações geradas a partir desse trabalho
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• Silva A L C, Goto, L S, Dinarte, A R, Hansen, D, Moreira, R A, Beltramini, L M,Araujo, A P U. Pulchellin, a highly toxic type 2 RIP from Abrus pulchellus: cloning,heterologous expression of A-chain and structural studies. FEBS Journal, 272: 1201 -1210,2005.
• Goto, L. S, Castilho, P. V, Cominetti, M.R, Selistre-Araújo, H. S, Ulian Araújo, A P.Endocytosis of Pulchellin and its recombinant B-chain into K-562 cells: binding anduptake studies. Biochimica et Biophysica Acta (General Subjects), 1770, 1660 - 1666,2007.
• Castilho, P V, Goto, L S, Roberts, LM, Araújo, A P U. Isolation and characterization offour type 2 ribosome inactivating pulchellin isoforms from Abrus pulchellus seeds.FEBS Journal275, 948-959,2008.
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Capítulo 2 . Septinas
2. 1 Introdução e relevância
Septinas constituem uma família de proteínas de ligação ao nucleotídeo de
guanina que foram inicialmente identificadas em Saccharomyces cerevisiae,
participando da formação do septo no processo de brotamento. As septinas são
evolutivamente conservadas, estando presentes em outros eucariotos [Frazier et al.,
1998; Field et al., 1996], mas estão ausentes em plantas, as quais utilizam um meio de
citocinese distinto (formação do fragmoplasto) daquele visto nos demais eucariotos.
Septinas purificadas de leveduras reúnem-se em filamentos de comprimento
variável e diâmetro de 7-9 nm, que auxiliam na separação dos componentes das
membranas das células mãe e filha [Field et al., 1996]. Filamentos similares também
foram observados em Drosophila e cérebro de mamíferos, porém o mecanismo pelo
qual acorre a formação destes filamentos ainda não é muito bem compreendido [Field et
al., 1996; Hsu et ai., 1998].
Atualmente as septinas humanas identificadas estão classificadas em quatro
grupos (figura 2.1), segundo similaridades de suas seqüências primárias. Várias funções
são atribuídas as septinas como participação na citocinese, determinação e manutenção
da polaridade celular, associação às membranas, movimento celular, tráfego de
vesículas, exocitose e apoptose [Russell & Hall, 2005]. Em humanos há várias
evidências da importância das septinas em processos celulares, além disso, tem sido
observada a presença dessas proteínas em corpos de inclusões citoplasmáticas
relacionados a doenças neurodegenerativas (mal de Parkinson e mal de Alzheimer) e
também estão relacionadas a alguns tipos de câncer [Hall & Russell, 2004].
Capítulo 2 - Septinas 2-2
Domínio N-terminalvariável
Domínio de ligação aGTP
Domíniocoiled-coil
Group ISEPT3
SEPT9fiM-
Ulif 4-i '%-./L-"Q
Group 11
SEPT6
SEPT8
SEPT10
____~a[[BBBBBBBBBBBBBB.~~1W~..@Z?~;:
Group 11I
SEPT1
SEPT2
SEPT4
SEPT5
,~. j
Mii --1
....... ' J
Group IVSEPT7 UIM
Figura 2.1: Classificação das septinas de mamíferos. A seqüência primária das septinasmostra uma estrutura de domínios de regiões N- e C-terminais distintas e um domínio centralconservado (ligação a GTP). Este último é altamente conservado entre as septinas da mesmaespécie. A classificação nos 4 diferentes grupos é baseada na similaridade seqüencial de suaregião C-terminal (50 a 60% de identidade dentro de cada grupo). As linhas representamseqüências sem similaridade. [Martinez et ai., 2004].
Uma considerável expansão do número de genes que codificam septinas é vista
em vertebrados e 14 septinas são conhecidas hoje em humanos [Hall et aI., 2005;
Peterson et al, 2007]. As septinas possuem um domínio conservado de ligação em GTP
e são encaixadas dentro da superclasse das P-loop GTPases [Leipe et al., 2002]. Todas
as septinas têm um 'P'-loop que é definido pelo motivo Walker A (GxxGxGKST),
Walker B (DxxG), e o motivo de especificidade ao GTP (xKxD) [Saraste et al., 1990].
Se por um lado as septinas têm em comum um domínio de ligação em GTP, outros
domínios e motivos são pobremente definidos e há uma grande variação em termos de
comprimento e composição dos domínios N e C-terminais [Hall & Hussell, 2004]. É
possível observar, em muitos membros da família, a presença de domínio coiled-coil C-
terminal, relacionado a um domínio de interação proteína-proteína [Casamayor 2003].
Ainda, vale lembrar que as septinas são conhecidas por polimerizar, formando
estruturas homo e hetero-oligoméricas, as quais podem formar filamentos in vitro e in
Capítulo 2 - Septinas 2-3
vivo [Frazier et al., 1998]. Porém, como essas estruturas são formadas e qual seu papel
ainda são questões que permanecem em aberto. Muitos trabalhos têm investigado
possíveis organizações para os complexos de septinas. Porém, só recentemente foi
publicada a estrutura de um complexo contendo as septinas 2, 6 e 7 [Sirajuddin et al.,
2007], frustrando a expectativa de nosso grupo de trabalho de conseguir a primeira
estrutura de uma septina.
A partir de uma colaboração iniciada há alguns anos com o prof. Richard C.
Garratt, a tendência das septinas produzidas in vitro se agregarem vem sendo
extensivamente estudada em nosso Grupo. Recentemente, propusemos uma hipótese
que os homofilamentos de septinas formados in vitro sejam, na verdade, amilóides
[Garcia et al., 2007]. Estudos de desnaturação da SEPT4 induzida por temperatura têm
demonstrado a formação de um intermediário estável que tende a agregar na forma de
fibras. Esse comportamento também tem sido observado para outras septinas humanas
estudadas em nosso grupo. Portanto, uma melhor caracterização do intermediário
gerado e sua possível relevância para os processos de desnaturação e renaturação em
condições fisiológicas e patológicas poderá contribuir para o entendimento do papel
dessas moléculas.
Nossos esforços têm se concentrado na produção e estudo da estabilidade das
septinas 2, 3, 4 e 5 (SEPT2, SEPT3, SEPT4 e SEPT5), em particular. O primeiro
desafio deste projeto veio com a necessidade de expressar uma proteína humana em E.
coli. Optamos por um sistema de fusão utilizando a proteína carreadora GST, de
Schistosoma japonicum, uma proteína estável e bem expressa em E. coli. A expressão,t c-.
.as SEPT4 foi alcançada, porém o rendimento não era alto e a proteína integral
apresentava-se pouco estável. Partimos, então, para uma abordagem de expressão dos
domínios protéicos da SEPT4 isoladamente. As regiões correspondentes aos domínios
N-terminal, GTPase e C-terminal foram definidos e expressos em E. coli como
proteínas solúveis. Após purificados, esses polipeptídeos foram analisados por
espectroscopias de Dicroísmo circular e fluorescência intrínseca, além de SAXS e
espalhamento dinâmico de luz, permitindo sua caracterização estrutural [Garcia et ai.
2006].
A produção de uma proteína recombinante pode ser validada de várias formas,
mas a detecção de atividade biológica no produto recombinante é sempre a mais
Capítulo 2 - Septinas 2-4
desejada. Desta forma, um extenso trabalho foi feito, em conjunto com o prof. Emanuel
Carrilho (IQSC), no sentido de encontrar métodos mais ágeis e "limpos" para
determinar a atividade GTPásica da SEPT4 em relação ao ensaio radioativo. Esse
trabalho gerou uma publicação na revista Analytical and Bioanalytical Chemistry, em
2005.
2.2 Publicações geradas a partir desse trabalho
• Garcia, W ; Araújo, A PU; Lara, F ; Foguel, D ; Tanaka, M ; Tanaka, T ; Garratt, R C .An intermediate structure in the thermal unfolding of the GTPase domain of humanseptin 4 (SEPT4/Bradeion-beta) forms amyloid-like filaments in vitro. Biochemistry 46:11101-11109,2007.
• Garcia, W, Araújo, A P U, Oliveira-Neto M, Ballestero, M. R. M., Polikarpov, I,Tanaka, M, Tanaka, T, Garratt, R C. Dissection of a Human Septin: Definition andCharacterization ofDistinct Domains within Human SEPT4. Biochemistry, 45:13918-13931,2006.
• Hillebrand S, Garcia, W, Cantu, M D, Araújo, A P U, Tanaka, M, Tanaka, T, Garratt, RC, Carrilho, E. In vitro monitoring of GTPase activity and enzyme kinetics studiesusing capillary electrophoresis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 383: 92 - 97,2005.
2.3 Referências bibliográficas
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Hall, P. and Russell, S. (2004). The pathobiology ofthe septin gene family. J. Pathol. 204, 489-505.
Hsu, S.C., Hazuka, C.D., Roth, R., Foletti, D.L., Heuser, J. and Scheller, R.H. (1998). SubunitComposition, Protein Interactions, and Structures of the Mammalian Brain sec6/8Complex and Septin Filaments. Neuron 20, 1111-1122.
Kartmann, B. and Roth, D. (2001). Novel roles for mammalian septins: from vesicle traffickingto oncogenesis. Journal ofCell Science 114, 839-844.
Leipe DD, Wolf VI, Koonin EV, Aravind L. (2002) Classification and evolution of P-IoopGTPases and related ATPases. J Moi Biol. 317,41-72.
Capítulo 2 - Septinas 2-5
Martínez C, Sanjuan MA, Dent JA, Karlsson L, Ware J. (2004). Human septin-septininteractions as a prerequisite for targeting septin complexes in the cytosol. Bioehem J.382(Pt 3):783-91.
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Russell SE, Hall PA. Do septins have a role in cancer? (2005) Br J Caneer 93, 499-503.Saraste M, Sibbald PR, Wittinghofer A. (1990) The P-loop - a common motif in ATP- and
GTP-binding proteins. Trends Bioehem Sei; 15, 430-434.Sirajuddin M, Farkasovsky M, Hauer F, Kühlmann D, Macara IG, Weyand M, Stark H,
Wittinghofer A. (2007) Structural insight into filament formation by mammalianseptins. Nature, 449(7160), 311-5.
De acordo com as políticas editoriais, estes artigos não podem ser depositados
em repositório de acesso aberto. Para acesso aos artigos completos entre em
contato com o(a) autor(a) ou com o Serviço de Biblioteca e Informação IFSC -
USP ([email protected]).
GARCIA, W.; ARAÚJO, A. P. U.; LARA, F.; FOGUEL, D.; TANAKA, M.; TANAKA, T.;
GARRATT, R. C. An intermediate structure in the thermal unfolding of the GTPase
domain of human septin 4 (SEPT4/Bradeion-'beta') forms amyloid-like filaments in
vitro. Biochemistry, Washington, v. 46, n. 39, p. 11101-11109, Oct. 2007
GARCIA, W.; OLIVEIRA NETO, M.; BALLESTERO, M. R. M.; POLIKARPOV, I. ;TANAKA, M.;
TANAKA, T.; GARRATT, R. C. Dissection of a human septin : definition and
characterization of distinct domains within human SEPT4. Biochemistry, Washington,
v. 45, n. 46, p. 13918-13931, Nov. 2006.
HILLEBRAND, S.; GARCIA, W.; CANTÚ, M. D.; ARAÚJO, A. P. U.; TANAKA, M.; TANAKA,
T.; GARRATT, R. C.; CARRILHO, E. In vitro monitoring of GTPase activity and enzyme
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Heidelberg, v. 383, n. 1, p. 92-97, Sep. 2005.
Capítulo 3 . Proteínas ligantes de cálcio
3.1 Introdução e relevância
Como um íon de sinalização intracellular, o Ca2+ está envolvido em muitas
funções celulares, desde a fertilização, contração, diferenciação celular e proliferação
até apoptose e, em casos de falta de regulação, o câncer. Em resposta a estímulos tais
como despolarização da membrana, moléculas sinalizadoras extracelulares, ou
mensageiros intracelulares, as concentrações citosólicas deste íon aumentam de ~ 10-7 M
até ~1O-5 M [Gifford et al., 2007]. Este aumento é o resultado de um influxo de Ca2+
extracelular ou de sua liberação de estoques internos como o retículo
endoplasmático/sarcoplasmático [Berridge, 2000]. O cálcio que flui pelo citoplasma
durante a reação de sinalização não fica livre, mas sim se associa a uma variedade de
proteínas ligantes de cálcio (CaBPs, Ca2+ -binding proteins). Muitas dessas proteínas
pertencem a uma família que liga este cátion usando um motivo estrutural característico
hélice-loop-hélice, chamado EF-hand (figura 3.1).
Em termos funcionais, as proteínas ligantes de cálcio são grosseiramente
divididas em duas classes: os sensores de Ca2+ (Ca2+ sensors) e as Ca2+ tamponantes
(Ca2+ buffers). As Ca2+ sensors traduzem sinais químicos (aumento na concentração de
Ca2+) em respostas bioquímicas, comumente refletidas numa mudança conformacional
Ca2+-induzida. O exemplo mais conhecido dessa classe é o da calmodulina. As Ca2+
buffers ajudam a modular o sinal de Ca2+ temporal e espacialmente no citoplasma e
podem ser exemplificadas pela parvalbumina.
Capítulo 3 - Proteínas Ligantes de Cálcio 3-2
Figura 3.1: (A) Um EF-hand único do domínio N-terminal de calmodulina. Estendendo-sepor 29 resíduos de aminoácidos consecutivos, o EF-hand consiste de uma hélice de noveresíduos de início, um loop de nove resíduos e uma hélice de onze resíduos de saída. (B) Umpar de EF-hands do domínio N-terminal da calmodulina. Um elemento estrutural adicional éobservado no par como uma pequena folha-beta antiparalela formada (Gifford et al., 2007).
o EF-Hand: a unidade de ligação de Ca2+
o termo EF-hand foi criado por R. H. Kretsinger há cerca de 30 anos para
designar um motivo do tipo hélice-loop-hélice que apresentava afinidade pelo íon
cálcio, descoberto na estrutura da parvalbumina, uma pequena proteína ligante de cálcio
isolada do músculo de carpa [Kretsinger, 1973]. O clássico motivo EF-hand é
geralmente formado por uma alça, ladeada por duas a-hélices, em uma região contínua
da proteína. Este sítio pode ser representado como: XeYeZe-Ye-X •• -Z, onde X, Y, Z,
-X, -Y e -Z são os ligantes que participam na coordenação do metal e os pontos (e)
representam os resíduos entre eles [Lewit-Bentley & Réty, 2000]. A seqüência dos
resíduos que compõem o EF-hand forma um loop que pode acomodar os ligantes cálcio
ou magnésio, diferindo apenas na formação geométrica, que é dependente do íon
presente. O magnésio normalmente é compelido por seis ligantes em um octaedro,
enquanto sete ligantes nos vértices de uma bipirâmide pentagonal coordenam o cálcio.
Usualmente, os motivos EF-hands de muitas proteínas ocorrem aos pares,
intimamente associados na forma de um domínio, com as alças dos dois sítios
Capítulo 3 - Proteínas Ligantes de Cálcio 3-3
interagindo em uma pequena folha-B antiparalela (figura 3.1 B). O menor membro desta
família é a calbindina D9K,uma proteína de 9 kDa que contém um único par EF-hand.
Embora outros membros da subfamília SI 00 também contenham um único par de EF-
hands, esses ocorrem como parte de homo ou heterodímeros, dando quatro EF-hand a
cada proteína SI 00. Entretanto, a maioria das proteínas da família contém dois pares,
somando quatro motivos EF-hand [Gifford et al., 2007]. Pelo fato dos motivos EF-hand
terem uma forte tendência a fazer parte de um par, exemplos de proteínas cornúmero ímpar de EF-hand são raros.
Conseqüências da ligação do cálcio
o papel da ligação do Ca2+ tem sido estudado com foco nas mudanças
conformacionais Ca2+-induzidas. Embora esta conseqüência da ligação do Ca2+ seja
importante, o Ca2+ também pode desempenhar um papel estrutural e, em muitos casos, a
ligação deste íon é fundamental para a integridade estrutural da proteína [Christova,
2000]. Mudanças conformacionais Ca2+-induzidas foram consideradas inicialmente em
termos de transição de domínios fechados/abertos medidos pela mudança no ângulo
inter-hélice de vetores definidos pelas hélices que ligam Ca2+ [Gifford et al., 2007].
Essa mudança expõe cadeias laterais hidrofóbicas e cria um extenso sítio de interação
proteína-molécula alvo.
Uma interação iniciada com o prof. Ariel M. Silber (Parasitologia-USP) nos
colocou em contato com a calflagina de Trypanosoma cruzi, uma proteína ligante de
cálcio presente no flagelo de vários protozoários. Até aquela época, haviam apenas
trabalhos estudando a FCaBP [Engman, 1989], uma proteína homóloga à calflagina,
além de evidências do papel regulatório do Ca2+ na mobilidade flagelar do parasita.
Motivados por isso, iniciamos um projeto para expressão heteróloga e estudos
estruturais da calflagina. Esta foi produzida em E. coli como uma proteína de fusão,
associada à inteína. A inteína é uma proteína relativamente grande, porém capaz de
sofrer uma auto-clivagem específica e induzi da (por um agente tiol), facilitando a sua
separação da proteína de fusão. A purificação é garantida pela presença de um domínio
de ligação em quitina ligado ao C-terminal da inteína. A proteína produzida de forma
recombinante foi usada em experimentos de Dicroísmo Circular e fluorescência para
Capítulo 3 - Proteínas Ligantes de Cálcio 3-4
monitorar as mudanças conformacionais induzi das pela ligação do Ca2+. Ainda,
experimentos de fluorescência extrínseca usando ANS como uma sonda hidrofóbica
mostraram que a calflagina comporta-se como uma proteína Ca2+ sensor [Pinto et al.,
2003].
Em função da publicação dos resultados com a calflagina, surgiu uma parceria
com o prof. David Engman (Northwestern University, Illinois), que já trabalhava com a
FCaBP. Recebemos os clones recombinantes, produzimos e purificamos as proteínas
selvagem e mutante para determinar as constantes de afinidade de ligação ao cálcio
usando a técnica de fluorescência intrínseca. Além disso, inserimos uma etapa
cromatográfica na purificação para melhorar o grau de pureza, produzindo depois
grandes quantidades de proteína que foi enviada para experimentos complementares ao
Dr. Engman. Esses resultados fazem parte de um artigo, publicado na lBC em 2005.
Ainda, motivados pela profa. Dra. Maria Cristina Nonato (FFCL-RPIUSP)
iniciamos um novo projeto envolvendo uma nova proteína ligante de cálcio: a S100A12.
Esta proteína sofre mudanças conformacionais pela ligação de cálcio dando suporte ao
seu potencial envolvimento em eventos de transdução de sinal dependentes de Ca2+
[Dell' Angelica et al., 1994]. As dificuldades na obtenção de grandes quantidades de
proteína nativa, extraída de granulócitos de porco, levou-nos a construir um gene
sintético com códons otimizados para expressão em E. coli. O fato de a proteína ser
relativamente pequena, sem modificações pós-traducionais ou outro processamento
tornaram a produção heteróloga em E. coli uma alternativa atraente para obtenção de
alto rendimento, maior controle de pureza e facilidade de purificação. O rendimento do
sistema de expressão obtido foi elevado (160 mg de proteína! litro de meio de cultura) e
permitiu que estudos espectroscópicos de desnaturação térmica e química envolvendo a
S100A12 fossem realizados. Ainda, observamos que na presença de seus ligantes, os
íons Ca2+ e Zn2
+, há um aumento a estabilidade da proteína. Este trabalho foi aceito para
publicação na revista Biophysical Chemistry (fev/2008). Vale dizer ainda que a
disponibilização da S100A12 recombinante permitiu sua cristalização pelo grupo da
profa. M. Cristina Nonato e sua resolução estrutural está em curso.
Capítulo 3 - Proteínas Ligantes de Cálcio 3-5
3.1 Publicações geradas a partir desse trabalho
• Pinto, A P A, Campana, P T, Beltramini, L M, Silber, A M, Araújo, A P U. Structuralcharacterization of a recombinant flagellar calcium binding protein from Trypanosomacruzy. Biochimica and Biophysica Acta, 107: 114, 2003.
• Buchanan, K T, Ames, J B, Asfaw, S H, Wingard, J N, Olson, C L, Campana, P T,Araujo, A P U, Engman, D M. A flagellum-specific calcium sensor. Journal ofBiological Chemistry, 280:40104 - 40111, 2005.
• Garcia, A.F, Garcia, W, Nonato, M C, Araújo, A P U. Structural stability and reversibleunfolding of recombinant porcine SI OOA12. Accepted in Biophysical Chemistry, 2008.
3.2 Referências bibliográficas
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Engman D., Krause K., Blumin H., Kim K. (1989). A novel flagellar Ca2+-binding proteinin trypanosomes.J Biol. Chem. 264:18627-18631.
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Lewit-Bentley, A. & Réty, S. EF-hand calcium-binding proteins (2000). Curr Opin StructBiollO:637-643.
De acordo com as políticas editoriais, estes artigos não podem ser depositados
em repositório de acesso aberto. Para acesso aos artigos completos entre em
contato com o(a) autor(a) ou com o Serviço de Biblioteca e Informação IFSC -
USP ([email protected]).
PINTO, A. P. A.; CAMPANA, P. T.; BELTRAMINI, L. M.; SILBER, A. M.; ARAÚJO, A. P. U.
Structural characterization of a recombinant flagellar calcium-binding protein from
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BUCHANAN, K. T.; AMES, J. B.;. ASFAW, S. H.;. WINGARD, J. N.; OLSON, C. L.;
CAMPANA, P. T., ARAÚJO, A. P. U.; ENGMAN, D. M. A flagellum-specific calcium sensor.
Journal of Biological Chemistry, Bethesda, v. 280, n. 48, p. 40104-40111, Dec. 2005.
* Revised Manuscript
Structural stability and reversible unfolding of recombinant
porcine SlOOA12
Garcia, A. F.*; Garcia, W.*; Nonato, M. C.# and Araújo, A. P. U.*,f
* Instituto de Física de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos, SP, Brazil.
# Laboratório de Cristalografia de Proteínas, Departamento de Física e Química, Faculdade
de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto-USP, Brazil.
f Corresponding author: anapa}Ila(àjifsç.usp.Qr
Ana Paula Ulian Araújo
Grupo de Biofísica Molecular "Sérgio Mascarenhas", Centro de Biotecnologia Molecular
Estrutural, Instituto de Física de São Carlos, CP 369, 13560-970 Universidade de São
Paulo, São Carlos, SP, Brazil.
Running title: Structural stability ofrSlOOAl2.
Abstract
Porcine S100A12 is a member of the S100 proteins, family of small acidic ca1cium-
binding proteins characterized by the presence of two EF-hand motifs. These proteins are
involved in many cellular events such as the regulation of protein phosphorylation,
enzymatic activity, protein-protein interaction, Ca2+ homeostasis, inflammatory processes
and intermediate filament polymerization. In addition, members of this family bind Zn2+ or
Ca2+ with cooperative effect on binding. In this study, the gene sequence encoding porcine
S100A12 was obtained by the synthetic gene approach using E. coli codon bias.
Additionally, we report a thermodynamic study ofthe recombinant SlOOA12using circular
dichroism, fluorescence and isothermal titration calorimetry. The results of urea and
temperature induced unfolding and refolding processes indicated a reversible two-state
processo Also, the ANS fluorescence studies showed that in presence of divalent ions the
protein exposes hydrophobic sites which could facilitate the interaction with other proteins
and trigger the physiological responses.
Keywords: S100A12; ca1cium-binding protein; S100 family, Circular dichroism (CD);
Fluorescence spectroscopy; protein unfolding.
2
1. Introduction
Calcium binding proteins (CaBPs) are involved in the regulation of several
biological processes. The basic structural and functional unit of CaBPs family is the EF-
hand motif which are the targets of intracelIular calcium [1,2]. SI 00 proteins constitute the
largest subfamily of EF-hand proteins. There are at least 25 members of low-molecular-
weight (9-14 kDa) acidic calcium-binding proteins [3,4]. They interact in a Ca2+-dependent
or independent way with proteins involved in cell proliferation and differentiation, celIular
architecture, signal transduction, and intracelIular metabolism [4,5].
Most SlOO proteins occur as non-covalent homodimers [6] and are characterized by
the presence of two EF-hand motifs per monomer, which are ordered in N-terminal EF-
hand (helix l-loop l-helix 11)with a flexible linker region that connects helix 11to helix 11I
of the C-terminal EF-hand (helix Ill-looplf-helixfV). The linker region and C-terminal
extension show the least amount of sequence conservation among SI 00 proteins [7,8].
Different conformational changes are triggered by calcium binding to SI 00 proteins in the
two EF-hands, and they exhibit distinctive affinities for calcium [9]. The C-terminal EF-
hand contains the canonical Ca2+-binding loop common to all CaBPs. The N-terminal EF-
hand of S100 proteins is distinguished from all other CaBPs [3,9]. Also, it undergoes a
relatively small change in conformation, whereas the change in the C-terminal EF-hand is
much larger. These large differences in the Ca2+ affinities indicate that SI 00 proteins are
hetero-bi- functional [10,11]. Furthermore, another characteristic of SI 00 proteins is their
binding of additional divalent metal ions such as Zn2+ and Cu2+. Binding of these metals
can affect the affinity to Ca2+, further contributing to their variable cation binding
properties and their diversified functions [9,12,13].
3
S100 proteins cou1d act as a calcium mediated intracellu1ar signa1 transducers
through significant structura1 changes upon calcium binding exposing two hydrophobic
target-binding surfaces per dimer [14,15). This behavior suggests that S100 proteins might
have a role in the fine regu1ation of effectors' proteins, specific steps of signa1ing pathways,
or cellu1ar functions ranging from calcium buffering, cell growth and differentiation,
modu1ation of enzyme activities, energy metabo1ism, moti1ity, secretion, transcription,
apoptosis, neurite extension and chemotaxis [10,16,17). Lack of regu1ation of specific SI 00
proteins is corre1ated with severa1 human diseases, inc1uding cancer, neurodegenerative and
cardiovascu1ar disorders [16]. The mechanism by which human SI OOA12 modu1ates the
course of the inflammatory processes was 1inked to its interaction with the receptor for
advanced glycated products (RAGE) [18). A1so, in a recent study, Xie et aI. showed that
the binding to this receptor occurs through a hexameric Ca2-S 100A 12 C.
Porcine S100A12 (a1so known as ca1granu1in C) is a member of S100 proteins
subfami1y. This protein consists of 91 amino acids (approximate1y 10.7 kDa and an acid pI
of 5.8) and is characterized by the presence of two EF-hands motifs and an additiona1
binding site (His-X-X-X-His), with high affinity for Zn2+ on the C-terminal region [20].
The porcine S100A12 has a lower affinity to bind Ca2+than Zn2+ and the abi1ity for binding
ca1cium is remarkab1y increased by the zinc binding [6,20). Interesting1y, Zn2+ binding to
other S100 proteins 1ike S100B [21] increases their affinity for Ca2+(as occurs in S100A12)
[22] whereas in SI 00A2 Zn2+ binding decreases its Ca2+affinity.
Most SI 00 proteins are described by their three-dimensiona1 structures, but 1ittle is
known about the pathway ofprotein fo1ding/unfo1ding states [23]. In a previous study [20],
spectroscopy too1s were used to characterize the binding properties (of Ca2+ and Zn2+) of
native porcine S100A12 [20). In the present work, we report a thermodynamic study
4
focused on the structural stability and the folding/unfolding processes of the porcine
S100Al2 using far-UV circular dichroism (CD). The Ca2+ affinities in the presence of Zn2+
were also obtained using isothermal titration calorimetry (ITC). In addition, we show novel
data for recombinant S100A12 (rSlOOA12) conformational changes induced by Ca2+ and
Zn2+ binding resulting in the exposure ofhydrophobic regions.
2. Materiais and methods
2.1 Synthetic gene assembly and cloning. The gene sequence encoding porcine
S100A12 was synthesized with E. coli codon preferences based on the protein amino-acid
sequence [20], according to the E. coli codon bias [24]. The DNA coding sequence was
formed by the overlap of the 3' end using 10 pmol of the following primers (5' GCT TCA
GTT CAC GTT TGA TCA GGG TGT CGT AGT GAC CCA GAC GAA CAG AGT ACT
GGT GGA AGA TG 3', 5' CAA ACG TGA ACT GAA GCA GCT GAT CAC CAA AGA
ACT GCC GAA CAC CCT GAA GAA CAC CAA AGA CC 3', 5' CAT CTT GGT TAG
CGT CCA GGT TCT GGA AGA TTT TGT CGA TGG TAC CCT GGT CTT TGG TGT
TCT TC 3', and 5' GGA CGC TAA CCA AGA TGA ACA GGT TTC TTT CAA AGA
ATT CGT AGT TCT GGT TAC TGA CGT ACT G 3'). This product, extended by the Taq
DNA Polymerase (Invitrogen), was used as template in a PCR to assemble the whole
fragment. In this amplification reaction 100 pmol of each primer was used (5' GGA ATT
CCA TAT GAC CAA GCT GGA GGA CCA CCT GGA AGG TAT TAT CAA CAT CTT
CCA CCA GTA CTC 3', and 5' GCC GCT CGA GTT CTT TGT GGA TGT TGT CGT
GAG CGG TGA TCA GTA CGT CAG TAA CCA G 3') for synthesis of the rSl00A12
coding sequence. The PCR product was purified using the QIAquick PCR purification kit
5
(QIAGEN, Hilden, Germany) and cloned into pGEM-T easy (Promega). The SlOOA12
coding sequence was c1eaved with NdeI and BamHI restriction enzymes (New England
Biolabs, Inc., MA, USA) and subcloned into pET-28a(+) and pET-29a(+) expression
vectors (Novagen, Inc., WI, USA), to produce pSlOOA12-His and pSlOOA12 plasmids,
respectively. The fide1ity of the constructs was checked by sequencing the dideoxy chain
termination method [25] using an ABI Prism 377 automated DNA sequencer (Perkin
Elmer, CA, USA) following the manufacturer's protocol.
2.2 Recombinant SlOOA12 expression. The recombinant expression vectors were
used to overproduce rSlOOA12 with or without histidine tail. Five hundred mL of LB
medium, containing 30 ug/ml. of kanamycin, was inoculated with 5 mL of a fresh
ovemight culture of E. coli BL2l(DE3) (Novagen) harboring pSlOOA12 or S100A12-His
(250 rpm at 37°C). The cultures were induced by the addition 0.1 mM IPTG at OD600of
0.8. Subsequently, the incubation temperature was decreased to 22°C for around 12 hours.
Finally, the cells were harvested by centrifugation at 7,000xg for 15min at 4°C.
2.3 Protein purification. The cell pellets were suspended in 10 mL of buffer 20
mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 300 mM NaCl, lysed by sonication at 4°C and the
insoluble debris were separated by centrifugation at 14,000xg for 25 minoThe purification
of rSlOOA12 and rSlOOA12 with His-tag were performed by size exclusion and metal
affinity chromatography, respectively.
The supematant containing rSlOOA12 was loaded onto a Superdex-75 column (GE
Healthcare) pre-equilibrated and eluted with 20 mM Tris-HCl pH 8.0 buffer containing 300
6
mM NaCl. Eluted fractions corresponding to rSlOOA12 (~11 kDa) were pooled and
dialyzed against 20 mM Tris-HCl (pH 8.0). After dialysis, the sample was loaded onto a
Mono Q HR 5/5 column (GE Healthcare), previously equilibrated with 20 mM Tris-HCl
pH 8.0 (buffer A). The chromatography was performed on an ÃKTA Purifier (GE
Healthcare) with a combination oftwo linear gradients ofNaCl concentration (0-0.14 M in
20 min followed by 0.14-0.35 M in 15 min) in buffer A. The flow rate was 1 mLlmin.
SlOOA12 eluted at approximately 0.15 M NaCl and the protein purity was checked by
Comassie stained 15% SDS-PAGE [21].
The supematant containing the rSl00A12 with His-tag was loaded onto a Ni-NTA
superflow column (4 mL, QIAGEN) pre-equilibrated with the same buffer used for cell
suspension. The column was washed with 10 colurnn volumes of sonication buffer and the
target protein was eluted with five colurnn volumes of the same buffer containing 250 mM
imidazole. Samples from each step were analyzed on 15% SDS-PAGE. The protein
samples were dialyzed against a 20 mM Tris-HCl buffer pH 8.0, containing 10 mM NaCl,
before the assays.
Due to the high yield of protein containing His-tag most experiments were carried
out with this protein. The rSl00A12 without His-tag was used only in the metals binding
assays to eliminate the possibility of unspecific ion interactions.
2.4 Protein concentration. The concentration of recombinant proteins was
determined by UV absorbance at "A = 280 nm (spectrophotometer V-2001 Hitachi) using a
theoretical extinction coefficient based on the amino acid composition [27]. The theoretical
extinction coefficient employed was C280 = 2980 M-1.cm-1.
7
2.5 Buffers and solutions. All chemicals and reagents, used in this study, were of
the highest purity grade. To cover a pH range between 3 and 12, Glycine-HCI (pH 3.0),
sodium acetate-HCI (PH 4.0), MES-HCI (pH 6.0), Tris-HCI (pH 7.5-8.0), Bicin-NaOH (pH
8.5), Glycine-NaOH (pHlO-10,5), were chosen as buffers and prepared at a final
concentration of 20 mM containing 10 mM NaCl. The 8 M urea stock solution was
prepared in 20 mM Tris-HCI pH 8.0 buffer containing 10mM NaCl.
2.6 Oligomerization state. Chemical cross-linking was used to verify the
oligomeric state of apo-rS 100A12 by incubating the protein (1O~) in presence of 20 mM
HEPES pH 8.0 10 mM NaCI and DSS (50 mM) in a final reaction volume of 100 IlL at
22°C for 1 hour. The reaction was quenched by the addition of 50 mM Tris-HCI, pH 7.5
and subsequent1y analyzed on SDS-PAGE. Size exclusion chromatography (SEC) was
performed on an ÃKTA HPLC system using a Superdex-75 analytical size exclusion
colurnn equilibrated in 20 mM Tris-HCI pH 8.0 buffer containing 10 mM NaCl. Pre-
equilibrated samples of apo-rS 1OOA12 at concentrations between 1O~ and 25 !lM were
injected, and the relative elution volume was compared to that ofmolecular mass standards.
The relative elution volume was calculated as: Kav = (V, - Vo)/(Vc - Vo), where Ve is
elution volume, Vc is the void volume, and Vg is the geometric colurnn volume. A standard
curve was plotted of Kav versus 10g(M). The molecular weight of apo-rS100A12 was
estimated from the calibration curve.
2.7 Chemical unfolding/refolding of apo-rSlOOA12. The denaturation curves
were taken in 20 mM Tris-HCI (pH 8.0), 10 mM NaCI and increasing concentration of urea
8
from o to 7 M. Refolding of rS100A12 was done by quick protein dilution (1:50 fold)
against the same buffer with decreasing concentration of urea from 6 to O M and under
gentle agitation [28]. The experiments were carried out in triplicate. The temperature of all
experiments was maintained at 22°C unless otherwise indicated.
2.8 Far-UV circular dichroism (CD). Thermal and chemical unfolding of
rSl00A12, were monitored by far-UV CD spectroscopy using a JASCO J-7l5 instrument
(JASCO Corporation, Japan) equipped with a Peltier temperature control unit. Far-UV
circular dichroism (CD) measurements were performed using a cylindrical 0.1 em path
quartz curvet and the solvents spectra were subtracted in all experiments to eliminate
background effects. CD spectra were the average of 16 accumulations, using a scanning
speed of 100 nm.min", spectral bandwidth of 1 nrn, and a response time of 0.5 s. The
rS100A12 concentrations were 15,25 and 50 ~. Thermal denaturation ofrSlOOA12 was
characterized by measuring the elIipticity changes at 220 nrn induced by a temperature
increase from 20°C to 94°C at a heating rate of 10°C h-I. Reversibility of rSl00A12
denaturated was assessed, acquiring the CD spectra of the sample at the same initial
condition after heating to 95°C at 10°C h-I. Similar1y, far-UV CD denaturation plots for the
S100A12 folding/unfolding were obtained by measuring the elIipticity changes value at 220
nrn induced by urea concentration.
2.9 Analysis of chemical denaturation. The elIipticity data obtained from the study
of chemical denaturation of rS 100A12 were analyzed assuming that this is a reversible two-
state processo The fraction of denatured protein.jji, is calculated from the relationship:
9
and (1)
in which Bobs is the ellipticity of the sample at a particular condition; Bd and Bn are the
values of ellipticity characteristic of the denatured and native states.
Chemical unfolding data were fit using a two-state homodimer model according
Mallan et ai. [29], in which two populations of protein exist at equilibrium, namely, folded
homodimers (D) and unfolded monomers (M).
2.10 Fluorescence experiments (ANS assay). Fluorescence ermssion
measurements were performed on a spectrofluorimeter (ISS, IL, USA), model ISS K2,
equipped with a refrigerated circulator (Neslab RTE-21O). The excitation and emission
monochromators were set at 2 and 1 nm slit widths, respectively. Fluorescent dye binding
experiments with l-anilino-8-naphthalenesulfonic acid (ANS) were performed in order to
probe dynamic changes and the exposure of hydrophobic regions of the protein [30]. A
fixed concentration of ANS (250 J.tM)was mixed to the protein solution (10 J.tM,in 20 mM
Tris-HCl pH 8.0 10 mM NaCI) in the presence or absence of Ca2+ or/and Zn2+ (1 mM final
concentration). The excitation wavelength was set at 360 nm and the emission spectrum
was monitored from 400 nm to 650 nm wavelength.
2.11 Isothermal titration calorimetry (ITC). Isothermal titration calorimetry was
carried out using a VP-ITC instrument from MicroCal (Northhampton, MA) at 25°C in 20
mM Tris-HCI pH 8.0 buffer, containing 1 mM ZnS04. To investigate the binding of Ca2+ to
rS100A12 in the presence of Zn2+, 1 mM Ca2+ was titrated into 150 J.tM Zn2+-S100AI2
bound formo The experiment was repeated three times. The titration was performed by 45
10
injections of 10 I1L each into the sample cell. The mixture was allowed to react for 120 s
between injections. The injections were carried out over a 20 s period between each
injection, which was sufficient for the baseline to be reestablished. The data obtained from
isothermal titration were analyzed using the Origin software package for ITC analysis from
Microcal (Microcal, Inc.). The data was fit using the sequential binding site model [31].
3. Results
3.1 Synthetic gene assembly, expression and purification of porcine rS100A12.
The DNA coding sequence of the S100A12 protein was successfully obtained by the
synthetic gene assembly and inserted into pET expression vectors. The target gene was
expressed by the addition ofO.1 mM IPTG to the culture of E. coli BL21(DE3) harboring
pSlOOA12 or pSlOOA12-His (Figure 1).
The rSlOOA12 was purified by a two-step chromatographic protocol using size
exc1usion (SEC) followed by ion-exchange column. The rS100A12 with His-tag was
purified using the Ni-NTA affinity chromatography (Figure 1). The rSlOOA12 with and
without His-tag yie1ds were typically 160 and 60 mg of pure protein/liter of induced
bacterial culture, respectively.
3.2 Determination of the oligomeric state of rS100A12. The oligomeric state of
apo-rS100A12 was examined using SEC and cross-linking experiment at different protein
concentrations. The apo-rSlOOA12 elutes from SEC as a single peak corresponding to an
apparent molecular mass of approximately 29 kDa (Figure 2). This indicated that apo-
rS100A12 would be compatible with a homodimer in solution. The existence of a
11
homodimer was confirmed by a cross-linking assay using DSS (inset, Figure 2). The
addition of divalent ions (Ca2+ or/and Zn2+) did not change the oligomeric state of
rS100A12 (data not shown).
3.3 Influence of pH on protein stability. Influence of pH on the secondary
structure of the rSl00A12 was studied using CD spectroscopy. Figure 3A (solid line)
shows the CD spectra of apo-rSl00Al2 at pH 8 and 20°C, characterized by two negative
bands at 222 nm and 208 nm. These bands are characteristic of protein containing a-helical
elements in the secondary structure. The far-UV CD spectra of the protein at 20°C under
different pH (4,5,6, 7.5, 8.5,9.5 and 10.5) was very similar to pH 8. Similar behavior was
also observed with the tyrosine emission fluorescence at the above mentioned pH (data not
shown).
3.4 Chemical stability studies. The apo-rS100Al2 was denatured in O M to 7 M
urea range at pH 8.0 and 20°C in different protein concentrations (15, 25 and 50 11M).
Figure 3A shows the far-UV CD spectra and the negative ellipticities exhibited around 222
nm in the absence and presence of different urea concentrations. When the urea
concentration was increased in the protein solution, a concomitant decrease in the ellipticity
at 222 nm was observed, suggesting a cooperative loss of the a-helix content in apo-
rS100A12. At 7.0 M urea a complete denaturation was observed, and the far-UV CD
spectra was typical of a protein lacking secondary structure. On the other hand, the
refolding ofrS100A12 revealed that chemical denaturation by urea was a reversible process
(Figure 3B). Unfolded and subsequently refolded apo-rS100Al2 retains approximately
90% of its native far-UV CD signal in the conditions described here.
12
Two-state homodimer denaturation model in which native homodimer (D) is in
equilibrium with unfolded monomer (M) was used in this study. The far UV-CD data were
treated and curves for each concentration of protein were fit individually using a two-state
homodimer model according Mallan et ai [29] (supplementary material). Table 1 shows
that for the far-UV CD data, mN2 •..•2D and !1G;~;;2D remains similar for all protein
concentrations used. !1G;~;;2D is the free energy difference between 1 mol of dimer and 2
mol of unfolded monomer in the absence of denaturant.
3.5 Apo-rSlOOA12 thermal unfolding study by CD. The nature of the thermal
unfolding/refolding transition, in different protein concentrations, was studied by circular
dichroism spectroscopy. Figure 4 shows the family of temperature curves obtained at 15
11M of protein, pH 8.0. The well-defined isodichroic point can be observed at 204 nm
(Figure 4). The thermal unfolding/refolding of apo-rSlOOA12 was monitored following
changes in the CD ellipticity at 222 nm as a function of the temperature and exhibited a
cooperative sigmoidal behavior (Figure 5). When the temperature was increased from 20°C
up to 94°C the far-UV CD spectra of apo-rSlOOA12 showed a decrease in the overall
ellipticity. Apo-rSlOOA12 after unfolded and subsequently refolded (cooling back to 20°C)
retains approximately 80% ofinitial far-UV CD signal (data not show).
3.6 Metal binding influence on rSlOOA12 stability. We performed thermal
unfolding studies by far-UV CD (Figure 5) in the presence of Zn2+ and Ca2+ in order to
investigate the conformational states induced by these ions on apo-rSlOOA12. The melting
temperature value for apo-rSlOOA12 was calculated and resulted in Tm = 68.4°C. However,
13
the addition of 1 mM Zn2+ to the apo-rS100Al2 great1y increased its stability, where Tm
was 84°C. The same effect was verified if the thermal unfolding was carried out in the
presence of Ca2+ (1 mM), showing a Tmfor the Ca2+-bound rS1OOA12 of 79°C (Figure 5).
The addition of 1 mM Ca2+ to Zn2+-bound rS100A12 induced a higher increase in the
protein thermal stability, preventing the complete unfolding of the rSl00A12 in the
conditions described here (Figure 5).
The thermal and chemical unfolding results showed a significant increase on
rS 100A12 stability in the presence of both ions. The urea concentration in which 50% of
rS100A12 molecules are in the denatured state(s) was 1 M higher than the observed for the
apo-rS100Al2 (data not shown). Taken together, the results indicate that the chemical
unfolding results match the thermal unfolding experiments and suggest that the final
conformational stability of rS1OOA12 is dependent of the metal ions and the nature of the
!On.
3.7 Influence of pH 00 apo-rS100A12 stability. Temperature unfolding of apo-
rS100A12 was characterized at different pH values. At 20°C, the results showed that the
CD spectra in the pH range (4.0 - 10.5) were agreeing, considering the experimental error,
with those observed in Figure 4. These results exc1ude any effect of pH on the secondary
structure of apo-rSl00Al2 at 20°C. Nevertheless, the apo-rS100Al2 thermal stability was
found to be pH-dependent. The melting temperature remains almost constant between pH
7.0 and 9.0, but the thermal stability was reduced in pH lower than 6.0 and higher than 8.0
(see Figure 6).
14
3.8 ANS binding studies. The dye ANS, an extrinsic fluorescence probe, was used
to investigate the affinity of ions binding to rS 1OOA12. ANS has been successfully used to
detect solvent-accessible hydrophobic surface in proteins [30]. The ANS fluorescence
emission was monitored in the presence of Zn2+, Ca2+or the combination of Zn2+ and Ca2+.
Figure 7 (solid line) shows ANS spectra with apo-rS100A12 at 20°C. The Ca+2 addition
resulted in an increase of the ANS maximum intensity emission and a blue-shift (Figure 7).
Similar results were observed in the presence of Zn2+, but with a higher emission intensity.
On the other hand, the addition of both ions showed similar emission spectra to that of the
apo-form, The results above indicated that the Ca2+ or Zn2+ in Zn-rS 100A12 lead to an
exposition of hydrophobic regions on the protein surface. When similar experiments were
done with refolded protein (in the presence or absence of divalent ions) similar results were
obtained, indicating that the refolded protein was able to bind ions and suggesting that it
was biologically active.
3.9 Isothermal titration calorimetry (ITe). The interaction of Ca2+ with Zn2+_
S100A12 was studied using high sensitivity ITC. Figure 8 shows the isothermal titration
curve obtained by the interaction between Zn2+-rS100A12 and Ca2+. Best-fit ofthe binding
isotherm yie1ds apparent binding constant values in the order of 107 M-1 and 104 M-1. That
was consistent with what was described by DeU' Angellica et al. for the native porcine
S 100A12 using emission fluorescence spectroscopy [20].
15
4. Discussion
Studies involving heterologous expression proteins in E. co/i revealed that when the
protein is relatively small, the final yield of production is improved [33]. Thus, the
production ofporcine S100A12 by heterologous expression strategy was successful and an
interesting approach, resulting in large amount of fully active protein.
Particular attention has recent1y been given to S 100 proteins, since several members
of this family were reported to bind Ca2+ and some transition metals like Cu2+ and Zn2+
[10]. But little is known about the mechanism and function induced by the binding of these
intracellular transition metals to the S100 proteins. In this study, we have used far-U'V CD
and fluorescence spectroscopy to demonstrate that rS100A12 can specifically bind Ca2+
or/and Zn2+, and in doing so, these metal ions induced conformational changes in the
protein leading to an increased structural stability (chemical and thermal).
The native S100A12 was described as a homodimer in solution [20]. Size exclusion
chromatography (SEC) and cross-linking experiments were used to confirm the oligomeric
state of recombinant apo-S100A12 in solution (Figure 2) over a range of protein
concentrations (10-50 11M). Results of both techniques were consistent with a stable
homodimer. The addition ofmetals (Ca2+ or/and Zn2+) did not affect the oligomeric state of
rS100A12. In contrast, human S100A12, which shares 70% sequence identity with porcine
S100A12, forms a trimer of dimers in high-calcium concentration [32,34]. The hexamer
observed for human protein possesses additional calcium ions coordinated by the side chain
oxygens of residues from two adjacent dimers (Gln58, Gln64 and Glu55) and are
considered necessary for hexamer formation [6]. The porcine rS100A12 exhibited a Lys55
16
instead of Glu55, which could hinder the additional ca1cium coordination requested for
hexamerization. Similarly, bovine S100A12 shows two Lys residues instead of Glu55 and
Gln64 and, as porcine SlOOA12, is unab1e to assemble in a hexamer.
The structural stability of apo-rS100A12 was analyzed, usmg far-UV CD
spectroscopy, by urea denaturation, over a large range ofprotein concentrations. The curves
suggest that no intermediates are present in detectable amounts during unfolding transition.
Also, we show that chemical unfolding transition was very near1y completely reversible
(~90%) upon removal of the denaturing condition (Figure 3A and )B). The data were
analyzed using a two-state model in which two protein populations exist at equilibrium,
namely, folded homodimers (D) and unfolded monomers (M). The protein concentration-
dependence of equilibrium unfolding curves in homodimer systems is expected, and can be
rationalized from the way the equilibrium constant Ki, is defined: Ki)= [M]2/[D]. At a given
denaturant concentration, Ku and L1G remain constant for all protein concentrations, and
only the fraction of each equilibrium species present change with PI• In a homodimeric
system, [U] 1/2 is defined as the concentration of denaturant where the fraction of unfolded
monomers is equal to the fraction of monomers present as dimers. This is also where Ku =
Pt, therefore, the concentration of denaturant where [U]1I2 occurs will depend of Pt, and a
change in [U] 1/2 with the total protein concentration is expected. ,1.G;2;;2D remains the2
same with changing Pt and [U]1/2. The m value is a constant for each protein and should not
be affected by protein concentration. When apo-rS100A12 unfolding data were analyzed
according to a two-state denaturation mo dei, mN2•..•2D and ,1.G;:;;2D values remain similar
(Table 1 and supplementary material) for all concentrations of the protein used (within
experimental error of 10%).
17
Thus, a two-state homodimeric model described the experimental results
adequately. However, the dimeric form of S100A12 probably can dissociate producing
monomers before reaching the denatured state. It is interesting that these forms could not be
detected by the methods used in the present work. Analysis using intrinsic fluorescence also
suggested that SI OOA12 unfolding occurs via a two-state transition without intermediate
species (data not shown).
The thermal unfolding/refolding of apo-rSlOOAl2 was monitored using far-UV CD
spectroscopy. When the temperature was increased from 20°C to 94°C, the shape of the far-
UV CD spectra of apo-rSlOOAl2 revealed a decrease in the overall ellipticity and the
presence of an isodichroic point at 204 nm (Figure 4). These results point to a cooperative
loss of the u-helix structure of apo-rSlOOAl2 and to a two-state homodimer transition (as
expected for a system in which only two conformations are present). The content of u-helix
is maximal at temperature below the transition and decreases to zero at temperatures above
the transition region. The apo-rSl00Al2 denaturation was near1y completely reversible in
the conditions used, since samples that were heated above 90°C retum to approximately
80% their original state when allowed to cool slowly to 20°C.
Our results show that there are no structural changes in apo-rSlOOAl2 within the
pH range of 4.0-10.5 at 20°C. However, a thermal pH dependence of apo-rSlOOAl2 was
observed. The stability of apo-rSl00Al2 decreases at pH values below 6.0 and above 9.0,
remaining constant at pH values comprised between 7 and 9. The kinetic unfolding in
several pHs allowed us to calculate the melting temperature Tm of apo-rSlOOAl2 for each
pH value (Figure 6). The maximum stability of apo-rSl00Al2 is wider than the narrow
physiological pH range.
18
Thermodynamic analysis of the interactions of Zn2+, Ca2+ or Zn2+ and Ca2+ with
apo-rS100A12 indicated that these metals enhance the structural stability of the protein
(Figure 5). The melting temperature of apo-rSlOOAl2 occurs at 68.4°C. The thermal
stability of apo-rS 100AI2 showed significant increases after Zn2+ or Ca2+ addition (84°C
and 79°C, respectively), Interestingly, the binding of zinc raised the thermal stability of
Ca2+-loaded rS100A12. The binding of these metals may be essential to induce
conformational changes exposing hydrophobic patches, thus facilitating the interaction with
a hydrophobic region ofthe secondary effectors protein [10,16,33].
The ANS fluorescence results suggested the apo-S 1OOA12 has a low amount of
exposed hydrophobic surface area (Figure 7). The addition of Ca2+ resu1ts in an increase in
the emission intensity of the ANS suggesting a conformational change. This result is
consistent with that observed in other S 100 proteins, were the Ca2+-binding results in an
increase in the solvent accessibility of non-polar residues [33]. Ca2+-bound states of SIOO
proteins recognize and bind to their target proteins through the solvent-exposed
hydrophobic surfaces [4,33]. Our results suggest that rS100A12's mechanism of activation
and recognition of target protein may be the same from other members of the S 100 protein
family, ANS binds more strongly in the Zn2+-rSI00A12 which leads to a large
conformational change (Figure 7). The increase in emission intensity is accompanied by a
great blue shift in the ANS emission from 508 nrn to 478 nrn, indicating a hydrophobic
surface exposition. The exposure of solvent-accessible hydrophobic patches was higher in
the Zn2+-bound state than that observed in the apo-rS100A12, Ca2+-rSlOOA12 or Zn2+Ca2+_
rSlOOAI2. These findings possibly mean that structural changes influenced by Zn2+ and
Ca2+have an potential role in modulating the protein function.
19
Structural stability and biological activity correlations can be used to establish the
mechanism of refolding. ANS binding experiments performed with refolded rS100A12
resulted in a similar profile that was exhibited by the native protein, which indicated that
both thermal and chemical rS100A12 denaturations were reversible in the conditions
assayed.
Since the binding of Zn2+ to SlOOA12 triggers a drastic conformational change and
increases Ca2+ binding affinity to the protein, we performed ITC experiments to examine
whether or not the rS100A12 retains such binding affinity to Ca2+ and Zn2+ (Figure 8). The
binding between Zn2+-rS100A12 and Ca2+ is an exothermic process and the reaction
proceeds with a negative change in enthalpy. Binding isotherm representing the Ca2+
titration shows that these ions interacted with the Zn2+-rS 100A 12 loaded form with the
same stoichiometric binding constants (107 M-1 and 104 M-1) as those observed previously
for the native S100A12 using fluorescence spectroscopy [20].
5. Conclusions
Our results show that equilibrium unfolding/refolding of recombinant S100A12
induced by urea or temperature proceeds by a reversible c1assical two-state homodimeric
mechanism without the accumulation of intermediates. ANS experiments showing that the
refolded rS100A12 regained the binding affinity to Zn2+ and Ca2+ lead us to propose that
the biological activity was recovered. The structural stability was significant1y increased in
the presence of Zn2+ and Ca2+. The metal influence on the structure ofrS100A12 was also
observed by ANS fluorescence indicating a large conformational change. The exact role for
SlOOA12 has not yet been defined. In this sense, our studies provide a direction to
20
understand the relation between structure stability, ions binding and the influence of these
aspects on the biological function of SI OOA12. The interaction with different ions could be
consistent with their physiological role in modulating the functional properties of SI OOA12
as the recognition of target proteins.
Acknowledgments
We would like to thank Prof. Leila Maria Beltramini for helpful discussions. We
wish to thank the Fapesp, CNPq and Capes for financial support.
21
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25
Legend to Table
Table 1: Thermodynamics parameters (chemical unfolding) for the fit of apo-
S100A12 equilibrium unfolding data to a two-state dimer denaturation model.
Legends to Figures
Figure 1: Recombinant S100AI2 expression and purification. Tricine/SDS-PAGE:
(I and 6) Low mass standard; (2-3 and 7) rS100Al2 with His-tag; (4-5 and 8) rS100A12;
(2 and 4) total proteins before induction; (3 and 5) after induction with 0.01 mM IPTG; (7)
rS100AI2 with His-tag purified on a Ni-NTA affinity colurnn and (8) rSI00AI2 purified
by an anion exchange colurnn (mono-Q).
Figure 2: Determination of the oligomeric state of rS100A12 by size exc1usion
chromatography (SEC). Conditions: room temperature in 20 mM Tris-HCl pH 8.0 buffer
containing 10 mM NaCl. The two insets in the figure show the cross-linking reaction
analyzed by tricine/SDS-PAGE and the calibration curve.
Figure 3: Urea induced unfolding/folding of rS100A12 monitored by far-UV CD.
(A) Urea concentrations were from top to bottom as follows: 7.0, 6.0, 5.5, 5, 4.75 and OM.
(B) CD of rS100A12 as a function of urea concentration at pH 8. Urea-unfolding (8) and
26
refolding (!) plots at 222 nm. The data have been normalized for ease of comparison. The
conditions are described in material and methods.
Figure 4: Recombinant S100A12 thermally unfolding monitored by far-UV CD.
Spectra were measured in 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 10 mM NaCl. The
isodichroic point can be observed at ~204 nm, Temperatures were from top to bottom as
follows: 94, 74, 72, 70, 60, and 20°C. The data have been normalized for ease of
comparison (the experimental conditions are described in material and methods).
Figure 5: Inf1uence of Zn2+ and Ca2+ on thermal stability of rSl00A12 monitored
by far-UV CD. (e) Apo-SlOOAI2, (\I') Zn2+, ( .• ) Ca2+and (o) Zn2+Ca2+loaded forms. The
data have been normalized for ease of comparison. The conditions are described in material
and methods.
Figure 6: pH dependence of rS100A12 thermal stability. Dependence of Tm as a
function ofpH, values obtained by far-UV CD in the pH range of 4.0-10.5. The inset figure
shows thefD as a function oftemperature in the pHs 4,8.5 and 10.5.
Figure 7: ANS assays ofthe apo-rS100AI2, Zn2+, Ca2+ and Zn2+Ca2+loaded forms.
The figure shows the increasing in f1uorescence intensity of ANS upon metal addition.
27
Figure 8: Isothermograms representing the binding of Ca2+ to Zn2+-SlOOAI2. The
upper panel represents the raw data and the bottom is the best-fit of the raw data. The
binding isotherms have been fit to the two binding sites model. The concentration of
protein used was 150 ~ in 20 mM TrislHCI (pH 8) containing 10 mM NaCl at 25°C.
28
Figure 1
kDa 1 s
1614
rSIOOAI2-His
/10oo
6
Figure 2
0,08
0,07
0,06
"""'0,05d'
d'--"
~ 0,04ri>.o< 0,03
0,02
0,01
0,00Lo
kDa664~
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2012 _ ..., .•··D
-~, • r r-~
Ribonuclease A0,35 •
, .Chymotrypsinogen A0,301-
r,SIOOAI2 ~
D,"
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'" D'2D. _
Ovalbumm ...'
Albwmn _
0,15
0,10
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5 10 15 25 3020
Fraction (mL)35
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30
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Wavelength (mn)
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~o::1. 19,15
19,40 I I , I , I , I 'I I' I , I I
19,35(A)
19,30
19,25
19,10
19,05
19,00 ' ! !, ! I ! I
0,00 6,33 50,00 56,3316,67 25,00 33,33 41,67
Time (min)
Figure 88
0,0
-0,2
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(B)r-'--'IIÍ • SlOOA12
--- S IOOA12 Fit
o 2 4 6 8 10 12 14 16
Molar Ratio
Supplementary MaterialCtick here to download Supplernentary Material: supplementary rnaterial.pdf
Supplementary material
I
1,0 I-
• 15~tM0,8
L\ 25~lM• 50pIvl
0,6
,Q-,0,4
o 2 3 4[urea]
5 6 7
Figure: Apo-rS 1OOA12 equilibrium denaturation profiles for 15J!M (.), 25 J!M
(.6) and 50J!M (e) protein as measured by far-UV CD signal at 222 nm. The data have
been normalized for ease of comparison, and continuous lines represent the fit to a two-
state dimer denaturation model.
Table 1
Table 1 - Thermodynamics parameters
Pt L1G;\;·2D(kJ.morl) mN2<-,>2D (kJ.mor1.M-1) [U]I/2 (M)2
(JlM)
apo-rS 1OOAl2 15 93.8 ± 5.6 9.9± 0.9 4.7
apo-rSIOOAI2 25 89.2 ± 4.3 9.6± 0.9 4.5
apo-rSlOOAl2 50 83.3 ± 4.0 9.2 ± 0.7 4.2
Capítulo 4 . Outros trabalhos relevantes
4.1 Inibidores de Proteinases Vegetais
Os inibidores de proteinases englobam um variado número de proteínas
encontradas em plantas, microrganismos e animais, as quais têm como propriedade
peculiar a formação de complexos estequiométricos de proteína-proteína reversíveis
com várias enzimas proteolíticas [Richardson, 1977]. Adicionalmente a sua função na
regulação das atividades proteolíticas, eles são importantes na proteção de fluidos e
tecidos contra sua degradação por proteólise.
Inibidores de serinoproteinases vegetais são principalmente proteínas de reserva,
defesa e regulatórias [Birk, 1994; Richardson, 1991] e podem ser classificados em
diferentes famílias, de acordo com suas características inibitórias e estruturais
[Richardson, 1991].
Os inibi dores da família tipo Kunitz, da qual a BbKI (l1auhinia bauhinioides
Kallikrein [nhibitor) e BbCI (l1auhinia bauhinioides Cruzipain [nhibitor) fazem parte,
demonstram homologia na estrutura primária [Ryan, 1990] e podem interagir em
diversos graus de especificidade com tripsina, quimiotripsina, subtilisina, calicreína
plasmática e tissular. Os inibidores vegetais do tipo Kunitz são caracterizados
principalmente pela sua massa molecular de 20.000 Da e presença de duas pontes
dissulfeto em regiões conservadas [Richardson, 1991].
O BbKI é um inibidor de serinoproteases encontrado em sementes de Bauhinia
bauhinioides e apresenta homologia com outros inibidores do tipo Kunitz, exceto pela
ausência de pontes dissulfeto e por apresentar um único resíduo de cisteína na posição
C-terminal (resíduo 154). Esses atributos fazem de BbKI um membro distinto da grande
família de inibi dores Kunitz. Suas características estruturais particulares favorecem a
inibição da calicreína plasmática [Oliva et al., 2001].
Capítulo 4 - Outros Trabalhos Relevantes 4-2
A estrutura primária do BbCI também mostra homologia com inibidores
vegetais da família do tipo Kunitz, entretanto, BbCI não contém nenhum resíduo Cys.
Embora apresente as regiões conservadas características dos inibidores da família do
tipo Kunitz [Sampaio et al., 1996; Oliva et al.,1996; Oliva et al., 1999 a,b], o inibidor de
cruzipaína e elastases caracterizado como BbCI distingue-se dos demais inibidores da
família do tipo Kunitz por não apresentar pontes dissulfeto, e podendo assim constituir
uma nova subfamília de inibidores. A descrição desse inibidor trouxe uma importante
contribuição, pois desvinculou a função inibitória da delimitação de uma região da
proteína pelas pontes dissulfeto.
A potencial aplicação desses inibidores no desenvolvimento de fármacos nos
motivou a começar um projeto de isolamento dos cDNAs que codificam BbCI e BbKI
visando a expressão heteróloga e disponibilização de grandes quantidades desses
inibidores. Esse foi um projeto em colaboração com a profa. Dra. Maria Luisa V. Oliva
(UNIFESP), a qual já havia determinado as seqüências primárias dos inibi dores por
sequenciamento de aminoácidos. Com base nesta informação partimos para a clonagem
dos cDNAs utilizando oligonuc1eotídeos degenerados, o que resultou na amplificação
de seqüências parciais, incompletas na região terminal 5'. Utilizando RACE 5' (Rapid
Amplification of cDNA Ends) foi possível complementar a seqüência da região 5' do
cDNA. Uma vez completas, as análises das seqüências mostraram que os inibidores
eram sintetizados na forma de pró-proteínas, sofrendo processamento tanto na região N-
como C-terminal. A produção heteróloga das proteínas maduras foi muito bem
sucedida em E. coli e conseguimos publicar esta primeira parte do trabalho [Araújo et
al.,2005].
A partir da produção recombinante as proteínas foram cristalizadas [Navarro,
et al., 2005] (figura 4.1), BbCI teve a estrutura cristalográfica resolvida [Hansen et aI.,
2007] e uma nova frente de trabalho foi possível baseada em ensaios para aplicações
desses inibi dores em processos inflamatórios e na inibição da cruzipaína.
Capítulo 4 - Outros Trabalhos Relevantes 4-3
Figura 4.1: Morfologia dos diversos cristais de rBbKI. Os números acima das figurasrepresentam a condição da solução do Fatorial I (tabela 1). Concentração da solução derBbKI utilizada na confecção da gota foi de 6,5 mg/mL (Vieira, 2004).
Tabela 1. Soluções de crescimento de cristais de rBbKI.
Solução Sal Tampão Precipitantefatorial
9JO15203749
0,2 M acetato de amõnio0,2 M acetato de amônio0,2 M sulfato de amônio0,2 M sulfato de amônio
0,1 M citrato de sódio pH 5,60,1 M acetato de sódio pH 4,6
0,1 M cacodilato de sódio pH 6,50,1 M acetato de sódio pH 4,60,1 M acetato de sódio pH 4,6
30% PEG 400030%PEG 400030%PEG 800025%PEG 40008%PEG 40002%PEG 8000
50
1 M sulfato de lítiomonohidratado
1 M sulfato de lítiomonohidratado
15%PEG 8000
Publicações geradas a partir desse trabalho
Araújo, A P U, Hansen, D, Vieira, D F, Oliveira, C, Santana, L A, Beltramini, L M,Sampaio, C A M, Sampaio, M U, Oliva, M L V. Kunitz type Bauhiniabauhinioides inhibitors devoid of disulfide bridges: isolation of the cDNAs,heterologous expression and structural studies. Biological Chemistry ,386: 561- 568, 2005.
Navarro, M V A S, Vieira, D F, Nagen, R A P, Araujo, A P U, Oliva, M L V, Garratt, RC. Crystallization and preliminary X-ray analysis of a novel Kunitz-typekallikrein inhibitor from Bauhinia bauhinioides. Acta Crystallographica SectionF, 61:910 - 913,2005.
Capítulo 4 - Outros Trabalhos Relevantes 4-4
4.2 Expressão de peptídeos recombinantes
A síntese química é uma abordagem bastante comum para a obtenção de
peptídeos. Porém, a produção recombinante pode ser bastante interessante, pois
contorna problemas encontrados na síntese química como o tamanho limitado do
peptídeo alvo. Além disso, a síntese de um polipeptídeo com mais de 20 resíduos de
aminoácidos encontra dificuldades na purificação da molécula alvo dos subprodutos
produzidos durante a síntese [Kuliopolus & Walsh, 1994]. Outro problema comum
ocorre em seqüências que possuam aminoácidos hidrofóbicos, sendo freqüenteraeste a
formação de agregados, dificultando a incorporação dos aminoácidos subseqüentes na
síntese [Fields & Noble, 1990]. Além disso, a incorporação de alguns resíduos como
Met, Trp e Cys aumenta a complexidade da síntese química.
Nossa idéia era trabalhar com o peptídeo correspondente aos resíduos 171-194
da região C-terminal da proteína p24 do HIV-1, denominada p24-3. Este peptídeo está
compreendido na interface de dimerização da proteína p24, uma região importante para
a estrutura funcional da proteína. Assim partimos para o desafio de expressar e purificar
o peptídeo produzido em E. coli, como uma alternativa à síntese química.
Um dos problemas em se expressar peptídeos em E. coli é sua susceptibilidade à
proteólise, devido a proteases presentes no citoplasma bacteriano [Murby et al., 1996].
Uma estratégia comum para contornar este problema é produzir os peptídeos como uma
proteína de fusão, expressando-os ligados a uma proteína carreadora. Esta proteína pode
potencialmente mascarar as propriedades físicas do peptídeo e, além disso, muitas vezes
pode facilitar a purificação da proteína de fusão [Uhlen & Moks, 1990]. Construímos
então um gene sintético, por PCR, codificando o peptídeo, e este foi inserido num
plasmídeo capaz de produzi-lo como uma fusão com a proteína tiorredoxina. A idéia era
agregar uma proteína bem expressa e bastante solúvel, capaz de carrear o peptídeo
hidrofóbico para a fase solúvel. Obviamente havia a necessidade de retirar a proteína
carreadora após a purificação, o que foi feito por clivagem enzimática e subseqüente
purificação em fase reversa. Uma das grandes dificuldades desse projeto foi purificar e
determinar a pureza do peptídeo recombinante. Sua pequena massa (cerca de 3 kDa)
levou a necessidade de utilizarmos espectrometria de massas, além do perfil em fase
reversa, para uma melhor caracterização. Ao final do processo o peptídeo de interesse
,f S ( ..U S P SERViÇO DE BIBLIOTECAiNFORMAÇÃO
Capítulo 4 - Outros Trabalhos Relevantes 4-5
foi obtido com um rendimento satisfatório (5-6 mg/L de cultura) e com a pureza
necessária para a realização de estudos estruturais e funcionais.
Publicações geradas a partir desse trabalho
• Castilho, P V, Campana, P T, Garcia, A F, Beltramini, L M, Araújo, A P U.Heterologous expression, characterization and structural studies of ahydrophobic peptide from the HIV-l capsid protein (p24). Peptides 26:243 -249,2005.
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Capítulo 4 - Outros Trabalhos Relevantes 4-6
Vieira, D. F. Dissertação de mestrado. Isolamento e caracterização do cDNA, produçãoheteróloga e análise estrutural de BbKI: um inibidor de proteinase de Bauhiniabauhinioides. Instituto de Física de São Carlos, USP, 2004. 103p.
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USP ([email protected]).
ARAÚJO, A. P. U.; HANSEN, D.; VIEIRA, D. F.; OLIVEIRA, C. ; SANTANA, L.A.;
BELTRAMINI, L. M.; SAMPAIO, C. A. M.; SAMPAIO, M. U.; OLIVA, M. L. V. Kunitz-type
Bauhinia bauhinioides inhibitors devoid of disulfide bridges : isolation of the cDNAs,
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NAVARRO, M. V. A. S.; VIERIRA, D. F.; NAGEM, R. A. P.; ARAÚJO, A. P. U.; OLIVA, M. L.
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