ESTUDOS FISIOLÓGICOS, BIOQUÍMICOS E MOLECULARES DE ... · À Embrapa Cenargen por ter dado todo o...

LEONARDO DO NASCIMENTO ROLIM

ESTUDOS FISIOLÓGICOS, BIOQUÍMICOS E MOLECULARES DE ISOLADOS

DE Ganoderma lucidum (Fr.) Karst. CULTIVADOS PELA TÉCNICA “JUN-CAO”

Recife – 2009

II

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE MICOLOGIA

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE FUNGOS




Tese apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Biologia de

Fungos da Universidade Federal de

Pernambuco, como requisito para

obtenção do título de Doutor em

Biologia de Fungos.

Orientadora: Dra. Maria Auxiliadora de Queiroz Cavalcanti (UFPE)

Coorientadora: Dra. Arailde Fontes Urben (Embrapa – Cenargen)

Recife – 2009

III

Rolim, Leonardo do Nascimento

Estudos fisiológicos, bioquímicos e molecular es de isolados de Ganoderma lucidum (Fr.) karst. cultivados pela técnica “Jun-C ao” / Leonardo do Nascimento Rolim. – Recife: O Autor, 2009. 114 folhas: il., fig., tab. Orientadores: Maria Auxiliadora de Queiroz Cav alcanti e Arailde Fontes Urben.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. Centro de

Ciências Biológicas. 2009.

Inclui bibliografia e anexo.

1. Cultivo de cogumelos 2. Cogumelo Rei 3. Ganoderma lucidum 4.

Jun-Cao I Título.

635.8 CDD (22.ed.) UFPE

CCB – 2009- 097

IV




Tese apresentada em: ___ / ___ / ___

Banca Examinadora da Tese:

_____________________________________ Dra. Maria Auxiliadora de Queiroz Cavalcanti

(Dept. Micologia / UFPE)

_____________________________________ Dr. José Luiz Bezerra


_____________________________________ Dra. Laíse de Holanda Cavalcanti Andrade


_____________________________________ Dr. Bartolomeu Acioli dos Santos

(CPqAM / Fiocruz)

_____________________________________ Dr. José Ferreira dos Santos

(Dept. Genética / UFPE)

_____________________________________ Dra. Uided Maaze Tiburcio Cavalcante

(Dept. Micologia / UFPE) (Suplente)

_____________________________________ Dra. Kátia Cavalcanti Pôrto

(Dept. Botânica / UFPE) (Suplente)

VI

"Influenciar uma pessoa é emprestar-lhe a nossa alma. Essa pessoa deixa de ter idéias próprias, de vibrar com as suas paixões naturais. As suas qualidades não são verdadeiras. Os seus pecados, se é que existe o que se pode chamar de pecado, vêm-lhe de outrem. Essa pessoa se torna o eco da música de outra pessoa, intérprete de um papel que não foi escrito para ela. A finalidade da vida é, para cada um de nós, o aperfeiçoamento, a realização plena da nossa personalidade. Hoje, porém, cada qual tem medo de sí próprio; esquece o maior dos deveres: o dever que tem consigo mesmo."

(Oscar Wilde, 'O Retrato de Dorian Gray')

VII

Dedico este trabalho

à minha família.

VIII

Agradecimentos

A Deus, o Grande Arquiteto do Universo, por todos os momentos bons de minha

vida e também pelos momentos ruins, que me fizeram mais forte.

À minha família, por sempre estar ao meu lado, ajudando direta ou indiretamente a

prosseguir na caminhada.

À Cíntia, minha eterna menininha linda, por estar ao meu lado e por me fazer

entender alguns aspectos da vida.

À Universidade Federal de Pernambuco pela oportunidade da realização do Curso

de Pós-Graduação em Biologia de Fungos e pelo suporte financeiro na concessão da bolsa.

À Embrapa Cenargen por ter dado todo o suporte para a realização deste trabalho.

À minha orientadora, Dra. Maria Auxiliadora de Queiroz Cavalcanti e à minha co-

orientadora, Dra. Arailde Fontes Urben, pelo convívio e por todos os ensinamentos teóricos

e práticos dos quais certamente jamais esquecerei.

À Dra. Erna Bach, da Universidade Nove de Julho, por ter ajudado na realização das

análises bioquímicas.

À minha colega Walkíria pelo auxílio nas análises estatísticas, me fazendo entender

os “comos” e os “por quês” de todos aqueles números.

Aos colegas da Embrapa, em especial Vicentina, Brunno, Fernanda, Vanessa Alves,

Vanessa Wetzel, Giselle, Lydia e Arlysson, pela ajuda e pelos momentos divertidos que me

proporcionam tantas boas lembranças.

IX

À dona Vera e seu filho Marcos Rui, pela acolhida e por terem me ajudado tanto

quando estive em Brasília.

À Giovanna Guterres, pela ajuda que me deu lá no Departamento de Micologia.

Ao pessoal de Lineage II, pelos divertidos momentos que me ajudaram a aliviar o

estresse.

A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho,

pelas muitas alegrias, companheirismo, solidariedade e por todos os ótimos momentos que

passamos juntos e que deixarão saudades.

Sumário

RESUMO ........................................................................................................................................................ 11

ABSTRACT .................................................................................................................................................... 12

INTRODUÇÃO .............................................................................................................................................. 13

REVISÃO DA LITERATURA...................................................................................................................... 15

1. OS COGUMELOS ..................................................................................................................................... 15

2. O CULTIVO DE COGUMELOS ............................................................................................................. 17

3. O COGUMELO REI ( GANODERMA LUCIDUM)................................................................................. 20

4. TAXONOMIA E CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS DE G. LUCIDUM ...................................... 23

5. MORFOLOGIA DE GANODERMA ........................................................................................................ 25

6. BIOQUÍMICA E FARMACOLOGIA DO G. LUCIDUM ...................................................................... 27

6.1. ESTUDOS CLÍNICOS .............................................................................................................................. 30

7. CULTIVO DE GANODERMA LUCIDUM .............................................................................................. 32

7.1. SUBSTRATO........................................................................................................................................... 33 7.1.1. Necessidades nutricionais............................................................................................................. 34 7.1.1.1. Carbono ..................................................................................................................................... 35 7.1.1.2. Nitrogênio .................................................................................................................................. 36 7.1.1.3. Vitaminas e sais minerais .......................................................................................................... 37 7.1.1.4. Substrato residual ...................................................................................................................... 37

7.2. FATORES FÍSICOS E BIOLÓGICOS QUE INFLUENCIAM O CRESC IMENTO E PRODUÇÃO DE GANODERMA LUCIDUM ..................................................................................................................................................... 38

7.2.1. Fatores físicos............................................................................................................................... 38 7.2.1.1 Temperatura e umidade relativa................................................................................................. 39 7.2.1.2. Granulometria do substrato....................................................................................................... 39 7.2.1.3. Troca gasosa.............................................................................................................................. 40 7.2.1.4. Luz.............................................................................................................................................. 41 7.2.1.5 Potencial hidrogeniônico............................................................................................................ 41 7.2.2. Fatores biológicos ........................................................................................................................ 42

8. MARCADORES MOLECULARES......................................................................................................... 43

8.1. A TÉCNICA RAPD ................................................................................................................................ 46

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................................................... 50

PRODUÇÃO DE LINHAGENS BRASILEIRAS DE GANODERMA LUCIDUM PELA TÉCNICA CHINESA JUN-CAO..................................................................................................................................... 67

ANÁLISE BIOQUÍMICA DE LINHAGENS BRASILEIRAS E CHINE SAS DE GANODERMA LUCIDUM CULTIVADAS PELA TÉCNICA CHINESA JUN-CAO........... ............................................ 79

USO DE MARCADORES MOLECULARES RAPD NA DIFERENCIAÇÃO DE LINHAGENS BRASILEIRAS E CHINESAS DE GANODERMA LUCIDUM ................................................................ 88

CONCLUSÕES .............................................................................................................................................. 98

ANEXO 1: A TÉCNICA JUN-CAO ............................................................................................................. 99

ANEXO 2: GÉIS OBTIDOS NA ANÁLISE GENÉTICA DAS LINHA GENS ...................................... 109

11

Resumo

Ganoderma lucidum é um basidiomiceto muito popular na medicina tradicional

chinesa, sendo chamado de “Lingzhi” ou “cogumelo da imortalidade”. Estudos revelaram

diversas propriedades farmacológicas benéficas deste fungo, sugerindo sua utilização como

auxiliar em diversos tratamentos contra doenças humanas. Por não ser muito comum na

natureza, o cultivo é a melhor maneira de suprir um mercado cada vez mais amplo. Dentre

os vários métodos de cultivo existentes para a fungicultura, a técnica Jun-Cao é considerada

a mais promissora para a produção de cogumelos em escala que atenda à demanda

crescente. Sabendo que a bioquímica de um organismo pode variar entre diferentes

linhagens, e entendendo a necessidade de descobrir novas variedades de G. lucidum, para

ampliar as opções de cultivo deste fungo, este trabalho buscou comparar linhagens

comerciais chinesas com linhagens brasileiras inexploradas de G. lucidum, para avaliar o

valor bioquimico destas. Os resultados mostram que o cultivo combinado de madeira com

gramínea, na técnica Jun-Cao, foi mais promissor no desenvolvimento das linhagens tanto

em redução no tempo de cultivo quanto na qualidade e quantidade dos cogumelos. A

linhagem brasileira (CC-144) destacou-se tanto na velocidade de crescimento, quanto na

produtividade de basidiomas e na concentração bioquímica de proteínas, carboidratos, β-

glucanas e fenóis, superando as chinesas e se mostrando uma opção para a fungicultura. A

análise RAPD mostrou distinção genética entre as linhagens, descartando a possibilidade de

ocorrência de clones.

Palavras-chave: Cogumelos, Ganoderma lucidum, Jun-Cao, análises bioquímicas, RAPD.

12

Abstract

The basidiomycete Ganoderma lucidum is a very popular mushroom in traditional

Chinese medicine, called "Lingzhi" or "mushroom of immortality". Studies have shown

several beneficial pharmacological properties of this fungus, suggesting its use as an aid in

treatments against various human diseases. It is not very common in nature. Thus,

cultivation is the best way to address an increasingly wide market. Among the several

existing methods of cultivation for fungiculture, the Jun-Cao technique is considered the

most promising for the production of mushrooms in scale that meets the growing demand.

Knowing that the biochemistry of an organism can vary between different strains and

understand the need to find new varieties of G. lucidum, to expand the options for growing

the fungi, this study sought to compare Chinese strains and unexplored Brazilian strains of

G. lucidum, to assess the value of these biochemical. The results show that the cultivation

of wood combined with grass was more promising in the development of strains in both

reduction in duration of cultivation on the quality and quantity of mushrooms. The

Brazilian strain (CC-144) is highlighted in both the speed of growth, as productivity and the

concentration of basidiomes biochemistry of proteins, carbohydrates, phenols and β-

glucans, surpassing the Chinese and showing an option for fungiculture. The RAPD

analysis showed genetic distinction between the lines, discarding the possibility of clones.

Key-words: Mushrooms, Ganoderma lucidum, Jun-Cao, biochemical analysis, RAPD.

13

INTRODUÇÃO

Os cogumelos sempre foram apreciados e temidos desde o inicio da civilização

humana. A maior importância está no seu valor gastronômico, nutricional e medicinal. Ao

longo dos anos, esta importância vem crescendo em função do mercado e de avanços

tecnológicos, melhorando a qualidade, a produtividade e diminuindo o custo de produção

(Eira, 2003; Urben et al., 2004).

Dentre os diferentes tipos de cogumelos comercializados nos dias de hoje, o

Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst. (Ganodermataceae) é um basidiomiceto comumente

utilizado na medicina tradicional chinesa por mais de 2000 anos, sendo chamado de

“Lingzhi” ou “cogumelo da imortalidade”, mas sendo conhecido no Brasil pelo nome

Cogumelo Rei (Mau et al., 2001).

Estudos feitos com linhagens de G. lucidum revelaram propriedades farmacológicas

cujos efeitos têm sido verificados no combate a diversos tipos de doenças humanas, tais

como hepatite, hipertensão, distúrbios cardíacos, artrite, bronquite, tumores e diabetes,

dentre outras (Russell & Paterson, 2006).

Os cogumelos de interesse comercial, como o G. lucidum, podem ser uma

alternativa para produtores dispostos a realizar cultivos recicláveis, para os quais a matéria-

prima para uso de substrato pode ser obtida de materiais mais facilmente encontrados como

capim, bagaço de cana, borra de café, gesso e açúcar, entre outros. Além disso, o substrato

esgotado pode ser aproveitado como ração para animais ou fertilizante (Urben et al., 2004).

Em vista do crescente aumento no comércio de cogumelos, surge também a preocupação

com as linhagens que são disponíveis no mercado, pois a eficiência nutricional e medicinal

varia conforme o isolado em uso (Ro et al., 2007).

14

Embora os métodos clássicos de taxonomia sejam viáveis para separação de grupos,

não são eficientes para análise e distinção entre linhagens de uma mesma espécie (Hseu et

al., 1996). Em vista disso, a utilização de ferramentas para análise genética têm-se

mostrado uma poderosa ajuda na diferenciação de níveis taxonômicos específicos. Colauto

et al (2002) sugeriram que, dentre as várias ferramentas genéticas atualmente disponíveis, a

técnica RAPD possui a vantagem de detectar polimorfismos de forma rápida, simples,

direta e de baixo custo.

Devido ao fato de existir uma considerável variação nutricional entre diferentes

linhagens de uma mesma espécie de cogumelo como, por exemplo, a concentração de

moléculas bioativas (Wang e Ng, 2001, 2004; Choi et al., 2005) e enzimas de interesse

industrial (Ruiz-Duenas et al., 2001) torna-se extremamente importante, principalmente do

ponto de vista comercial, que isolados possam ser diferenciados facilmente, sem a

necessidade de exames bioquímicos. Embora as linhagens chinesas de Ganoderma lucidum

sejam as mais conhecidas e comercializadas, existem muitas linhagens deste cogumelo

espalhadas pelo mundo, com potencial inexplorado e características bioquímicas e

genéticas desconhecidas.

Este trabalho teve como objetivo estudar aspectos fisiológicos, bioquímicos e

moleculares de isolados do Cogumelo Rei (Ganoderma lucidum) coletados no Brasil,

comparando-as com linhagens comerciais chinesas aplicando variações da técnica chinesa

“Jun-Cao” visando o estabelecimento de protocolo para produção em larga escala.

15

REVISÃO DA LITERATURA

1. Os cogumelos

Cogumelos são fungos da Divisão Basidiomycota (Kirk et al., 2001), conhecidos

pela civilização desde os primórdios da sua história, devido às suas características tóxicas

(gerando acidentes por vezes fatais) ou por suas características nutritivas e medicinais, que

os tornaram importante fonte de estudos por parte de pesquisadores no mundo inteiro.

Como exemplo disso, podemos citar que os astecas ingeriam cogumelos como alimento ou

como alucinógenos em rituais religiosos. Outro exemplo são estátuas com formato de

cogumelo que teriam sido esculpidas no século 15 A.C. encontradas na Guatemala. Na

natureza, a maioria destes fungos é constituída de espécies saprófitas, sendo muitas delas

benéficas às plantas. Eles constituem um grupo de organismos amplo e heterogêneo, que

pode ser encontrado praticamente em qualquer nicho ecológico (Urben et al., 2004).

Durante muitos anos, esses macromicetos foram descritos como pertencente ao

Reino Vegetal. Posteriormente, com os avanços da ciência, os métodos de análise

microscópica foram se aperfeiçoando de modo a contribuírem nos estudos referentes à

morfologia e reprodução desses organismos. Tais contribuições levaram os pesquisadores a

enquadrá-los no Reino Fungi. Acredita-se que existem cerca de 250.000 espécies diferentes

de fungos na natureza e, até onde se sabe, cerca de 2000 espécies de cogumelos são

potencialmente comestíveis. Destas, cerca de 22 são intensivamente cultivadas. O cultivo

dos cogumelos geralmente é feito no solo ou em troncos de madeira ou em substrato de

serragem, e sempre são utilizadas condições ambientais e nutricionais específicas. O

micélio (fase vegetativa) do cogumelo é importante constituinte do ecossistema por

16

degradar o substrato de folhas e troncos mortos, sendo o corpo de frutificação (basidioma)

apreciado pelo seu aroma, sabor e princípios medicinais (Manzi et al., 2001).

Estudos revelam que as propriedades farmacológicas destes fungos podem retardar

o envelhecimento e combater doenças tais como hipertensão, colesterol e câncer, dentre

outras (Bobek et al., 1995; Bobek e Gabovy, 1999; Zhang et al., 2001; Chen et al., 2004;

Cheung e Cheung, 2005) (Tabela 1). Os principais agentes destes efeitos farmacológicos

são polissacarídeos existentes em sua parede celular, vários beta-glucanos, diversos ácidos

orgânicos e compostos protéicos (Kalac e Svoboda, 2000; Manzi e Pizzoferatto, 2000; Kim

et al., 2004; Agrahar-Murugkar e Subbulakshmi, 2005).

Tabela 1 - Utilização de cogumelos na medicina popular

Espécies Utilização

Claviceps purpurea Alivia as dores nos partos

Polyporus suaveolena Tuberculose, sudorese noturna

P. coccineus Hemorragia, distúrbios uterinos

Fomes officinalis Purgante, tuberculose, sudorese noturna, diurético

F. fomentarius Hemorragia

Pycnoporus sanguineus Hemoptise, verrugas

Geastrum saccatum Hemorragia, distúrbios uterinos

Trametes cupreorosea Doenças próprias do sexo feminino

Ustilago maydis Espinhas, escorioses, queimaduras, ajuda em partos

Calvatia cyathiformis Cicatrizante, coagulante

C. gigantea Inflamação, sangramentos, limpeza dos pulmões e garganta

Citocybe gibba Febre

Fomitopsis pinicola Hemorragia

Auricularia fuscosuccinea Fortificante da circulação sangüínea

Ganoderma lucidum Tônico, inflamações, diurético, combate o câncer

G. applanatum Câncer esofágico

Lentinula edodes Evita doenças causadas pela falta de vitamina D

Coprinus comatus Hemorróidas

FONTE: Bononi et al., 1995.

17

Alguns basidiomicetos, como já foi dito, são altamente tóxicos, causando distúrbios

mentais, alucinações, diarréias e até mesmo morte quando ingeridos. Neste último caso

estão várias espécies do gênero Amanita, como A. muscaria, e do gênero Psilocybe (P.

mexicana) (Menezes e Oliveira, 1993).

Morfologicamente, o basidioma (também conhecido como corpo de frutificação) é

composto pelo estipe (talo) e píleo (chapéu), sendo este último conhecido por possuir uma

ampla variedade de formas e colorações, conforme a espécie de cogumelo. A parte fértil do

cogumelo (himênio) localiza-se no himenóforo (parte inferior do píleo), podendo este ter

disposição variável entre as espécies, indo do lamelar (composto por lamelas) até o tubular

(superfície poróide). No himênio são produzidos os basídios e basidiósporos (estruturas

férteis), bem como as estruturas estéreis (Alexopoulos et al., 1996).

A reprodução dos basidiomicetos pode ocorrer assexuadamente e sexuadamente. O

primeiro caso se dá na fase vegetativa, pela fragmentação do micélio (artrósporos),

produção de conídios, oídios e clamidósporos. Na reprodução sexuada, denominada

somatogamia, é onde ocorrem plasmogamia, dicariofase, cariogamia e meiose, culminando

com a formação dos basídios e basidiósporos haplóides (Alexopoulos et al., 1996).

2. O cultivo de cogumelos

A indústria dos cogumelos comestíveis produz atualmente cerca de dois milhões de

toneladas por ano. As três variedades mais cultivadas são o champignon de Paris (Agaricus

bisporus), o cogumelo ostra (Pleurotus ostreatus) e o Shiitake (Lentinus edodes), sendo

produzidos amplamente no leste asiático (Chang e Miles, 1991). Os cogumelos comestíveis

são conhecidos por terem curto período de vida (Geralmente 1 – 3 dias em temperatura

ambiente), vindo a se decompor rapidamente. Este fato se deve à alta atividade de enzimas

18

proteases e polifenol oxidases, responsáveis pelo decréscimo dos níveis protéicos e de

carboidratos, além de promover escurecimento da superfície do cogumelo (Czapski e

Szudyga, 2000). Para evitar perda do produto existem atualmente várias técnicas de

desidratação, conservação e refrigeração, que mantêm as propriedades nutritivas destes

fungos (Manzi et al, 2004).

Nos séculos passados, os japoneses cultivavam os cogumelos sob troncos em

decomposição; os chineses, em madeira e palhas decompostas; os europeus, em bosques, ao

ar livre ou em cavernas. Entretanto, esses processos eram lentos, pois era necessário muito

tempo para o desenvolvimento do fungo e frutificação. Atualmente, a pesquisa científica

modificou todo o contexto de cultivo, tornando a produção comercial destes fungos cada

vez maior (Urben et al., 2004). Principalmente na China a produção e o ensino das técnicas

de cultivo de fungos têm se desenvolvido extensivamente, de modo que por 10 anos (1985

– 1995) a produção destes fungos foi listada como o item mais importante no programa de

desenvolvimento daquele país (Zhanxi e Zhanhua, 1997).

Embora seja o mais cultivado no mundo, o champignon (Agaricus bisporus) tem

perdido espaço para as outras variedades devido ao seu complicado processo de cultivo e

baixa eficiência biológica, enquanto os outros cogumelos possuem maior facilidade de

crescimento (Banik e Nandi, 2004). Por sua facilidade no cultivo e baixo custo de

produção, o cogumelo ostra (Pleurotus ostreatus) ocupa o segundo lugar em produção

mundial. Por sua capacidade em desenvolver-se com sucesso à temperatura ambiente, P.

ostreatus dispensa o rigoroso controle climático e de umidade que o champignon necessita.

A produção anual do cogumelo ostra aumenta a cada ano, de 880 toneladas no ano de 1996

a 1.940 toneladas em 2002, sendo a China o maior produtor (Royse et al, 2004). O Shiitake

(Lentinula edodes) ocupa a terceira posição de mercado quando comparado ao champignon

19

e ostra, mas sua demanda vem crescendo significativamente (207 toneladas em 1993 e

1.573 toneladas em 1999), sendo a China novamente seu maior produtor e consumidor

(Chang, 1999).

Em 1983 uma técnica de cultivo utilizando gramíneas como substrato para o maior

desenvolvimento de corpos de frutificação foi elaborada na China pelo professor Dr. Lin

Zhanxi e Dr. Lin Zhanhua. Batizada de “Jun-Cao” (Jun= cogumelo; Cao= gramíneas) essa

técnica revolucionou o sistema de produção de cogumelos, elevando a quantidade destes

fungos e diminuindo substancialmente o tempo de frutificação. O Shittake, por exemplo,

teve sua produção aumentada de 1200 toneladas (no ano 1977) para 40000 toneladas (em

1993) (Zhanxi e Zhanhua, 1997). Esta técnica dispensa completamente o uso de toras e

serragem, utilizando gramíneas e outros compostos para gerar o substrato. O refinamento

do método levou à seleção de várias espécies de gramíneas adequadas ao processo. Entre

elas estão a cana-do-reino (Arundo donax), campim-cidró (Cymbopogon citratus), capim-

elefante (Pennisetum purpureum), sorgo (Sorghum vulgare) e milho (Zea mays) entre

outras (Urben et al., 2004).

A produtividade na fungicultura em geral depende das propriedades genéticas da

espécie fúngica, qualidade e estrutura do substrato, e das condições de cultivo, sendo

expressa em Produtividade (embora Urben et al., 2004, usem o termo Eficiência Biológica),

dada pela fórmula P= (peso fresco de cogumelos/ peso seco do substrato inicial) X 100

(Zhanxi e Zhanhua, 1997). Em Pleurotus ostreatus a técnica “Jun-Cao” gerou significantes

resultados, que variavam conforme o substrato utilizado. Substrato contendo Cana-de-

açúcar moída na hora gerou P= 35,17, ao passo que palha de arroz gerou P= 81,25, resíduo

algodão (75%) com palha (23%) e cal (2%) obteve P= 104,90. A palha de melão-são-

20

caetano utilizada no substrato resultou em P= 139,66 e a polpa de café fresca produziu P=

159,68 (Urben et al., 2004).

A qualidade nutritiva dos cogumelos cultivados em Jun-Cao supera o valor

nutricional de cogumelos cultivados em toras e serragens, conforme pode ser visto na

Tabela 2, onde se compara a composição nutritiva de Shiitake (Lentinus edodes) nos três

tipos de cultivo (Urben et al., 2004).

Tabela 2 – Comparação nutricional de Shiitake (Lentinus edodes) entre três métodos de cultivo

(%) Jun-Cao Serragem Tora

Proteína 32,836 28,787 19,65

Fibra 20,4 17,12 29,81

Gordura 2,31 2,61 1,71

Cinza 9,42 8,02 9,55

N 5,254 4,606 3,145

P 0,965 0,855 0,378

K 1,944 1,447 1,372

Ca 0,013 0,033 0,023

Mg 0,143 0,132 0,137

Cu (ppm) 15,79 7,1 9,45

Zn (ppm) 119,57 74,66 133,2

Mn (ppm) 26,88 13,45 16,25

Fe (ppm) 101,95 75,12 78,6

Fonte: Urben et al., 2004

3. O Cogumelo Rei (Ganoderma lucidum)

Ganoderma lucidum (Fr.) Karst (Ganodermataceae) é um basidiomiceto comumente

utilizado na medicina tradicional chinesa há mais de 2000 anos. O nome “Ganoderma” tem

sua origem no grego (ganos = brilho; derma = pele), devido ao fato de que os

21

representantes típicos desse gênero apresentam superfície brilhante, com aspecto

envernizado. Tradicionalmente, são produzidos e consumidos nos países asiáticos

(principalmente na China, Japão e Coréia), mas atualmente diversos países da Europa e

América já os produzem e consomem em escalas cada vez maiores (Urben et al., 2004).

Na China, G. lucidum é conhecido como “Lingzhi”, ou “Cogumelo da

Imortalidade” e no Japão ele é conhecido por “Mannentake” ou "Reishi”, sendo tratados

como “ervas da longevidade e da boa fortuna”. No Brasil esse fungo é conhecido como

“Cogumelo Rei”, “Cogumelo Brilhante” ou “Cogumelo do Imperador” (Mau et al., 2001).

A produção de G. lucidum vem crescendo ao longo dos anos. O Japão, por exemplo,

teve uma produção estimada de 500 toneladas de matéria seca em 1995, comercializando-o

principalmente como suplemento alimentar. Em outros países como China, Taiwan, Coréia,

Tailândia e Vietnã, o comércio deste fungo também segue uma curva ascendente. Para se

ter uma idéia, em 1997 a produção mundial de Ganoderma foi de aproximadamente 4.300

toneladas, sendo que a China contribuiu com 3.000 toneladas. Acompanhando esse

próspero negócio, as pesquisas em G. lucidum se intensificaram, na busca por condições

ideais para o seu cultivo tanto in natura quanto in vitro (Wasser, 2002).

As diversas variedades deste cogumelo são identificadas pelas características

morfológicas do corpo de frutificação, sendo que os antigos textos chineses já descreviam o

processo de diferenciação desse cogumelo por meio de sua coloração. Segundo crenças

antigas, difundidas entre chineses, cada cor confere uma qualidade única ao tipo de

Ganoderma observado. O “Lingzhi” vermelho é o mais conhecido, apresentando haste de

sustentação, píleo reniforme e coloração marrom-avermelhada com aspecto lacado, como

se realmente tivesse sido pintado com verniz. Outras variações envolvem coloração branca,

22

violeta, amarela e preta, sendo esta última associada às espécies G. neo-japonicum ou G.

formosanum (Seo e Kirk, 2000).

O cogumelo rei contém uma série de substâncias químicas, sendo os polissacarídeos

sua maior fonte de atividades biológicas e uso terapêutico (Kim et al., 2004; Cao e Lin,

2006). A presença dessas substâncias confere ao fungo propriedades biológicas, como

atividade antitumoral (Ooi et al., 2002), anti-inflamatória (Ukai et al., 1983), antiviral (anti-

HIV) (El-Mekkawy et al., 1998), antibacteriana (Smania et al., 1999) e antiparasítica (Kim,

1987). Seus efeitos farmacêuticos sugerem aplicações no combate a diversos tipos de

problemas de saúde, tais como alergias (Nogami, 1987), hepatite (Lakshmi et al., 2006),

debilitação do sistema imune (Ji et al., 2007; Zhu et al., 2007), hipertensão (Eo et al.,

1999), distúrbios cardíacos (Kim et al., 1995), inflamações em geral (Wasser & Weis,

1999), tumores (Lakshmi et al., 2006; Tang et al., 2006), diabetes (Zhang & Lin, 2002),

insônia (Chu et al., 2007), dentre outras (Russell & Paterson, 2006; Li et al., 2007).

Compostos de alto poder farmacológico isolados de G. lucidum incluem

triterpenóides, proteínas, esteróides, alcalóides, enzimas, ácidos orgânicos, lactonas, sais

minerais e ácidos graxos (Urben et al., 2004). Polissacarídeos (especialmente β–D-

glucanos) são reconhecidamente agentes anticancerígenos (Kim et al., 1999; Mizushina et

al., 1999; Vetter, 2003; Mdachi et al., 2004; Stanley et al., 2005; Muller et al., 2006; Sliva,

2006; Wu et al., 2006; Xie et al., 2006; Liu et al., 2007).

Na culinária oriental, o micélio do G. lucidum é usado como ingrediente em

diversas receitas, ditas como saudáveis e terapêuticas. O recente aumento no consumo

humano de G. lucidum é devido ao fato deste fungo possuir baixas calorias e ser rico em

proteínas, quitina, vitaminas e sais minerais (Urben et al., 2004). Segundo Ha (2003), o

23

Cogumelo Rei é um excelente suplemento alimentar, muito utilizado na Ásia para melhorar

o sistema imune e promover longevidade.

Como G. lucidum encontrado na natureza não é suficiente para atender ao crescente

mercado de consumo, o cultivo é a melhor forma de obter esse fungo. Assim, é importante

que novos e mais eficientes métodos de cultivo sejam desenvolvidos com intuito de elevar a

produção e estimular maior síntese de seus compostos terapêuticos. Com esse foco em

mente, diversos pesquisadores vêm estudando o comportamento fisiológico de G. lucidum

em diversos tipos de substratos sólidos e líquidos, para que este cogumelo possa ser obtido

em escala que atenda ao mercado (Straatsma et al., 2000; Bao et al., 2002; Berovic et al.,

2003, Tang e Zhong, 2003; Hsieh et al., 2005).

Em geral os métodos de cultivo deste cogumelo medicinal são semelhantes aos

utilizados para produção clássica de Shiitake (Lentinus edodes), utilizando toras de madeira

ou substratos contendo serragem (Mau et al., 2001). Entretanto, tais procedimentos fazem

com que o Cogumelo Rei leve geralmente vários meses para completar seu ciclo,

dificultando o controle de qualidade do produto final, que deve possuir altos índices de

componentes medicinais, baixos índices de fenóis e ausência de contaminantes (Lee et al.,

2003).

4. Taxonomia e características fenotípicas de G. lucidum

Ganoderma é um dos maiores gêneros dentre os fungos poliporóides e foi

estabelecido em 1881 por Peter Adolf Karsten, um renomado micologista finlandês. Na

época, ele incluiu apenas uma espécie Polyporus lucidus, que havia sido descrita no século

XVI pelo botânico inglês William Curtis (Karsten, 1881). Após essas primeiras descrições,

dezenas de espécies pertencentes a esse gênero foram apresentadas por diversos

24

taxonomistas. Na época, a identificação de Ganoderma se dava principalmente por sua

especificidade com o hospedeiro, pela sua distribuição geográfica e por características

morfológicas do basidioma, tais como a cor, forma da margem do píleo e a presença do

estipe, além de características dos esporos e morfologia das hifas (Seo e Kirk, 2000).

A classificação de espécies deste gênero é confusa, gerando a inclusão de centenas

de espécies inadequadamente nesse taxon (Buchanan, 2001). Com a evolução das pesquisas

e do interesse comercial que esta espécie vem despertando, há uma tentativa de identificá-lo

mais acuradamente, principalmente com o propósito de proteção de patentes. A família

Ganodermataceae foi criada por Donk em 1933 para agrupar fungos poliporóides

caracterizados por basidiósporos com dupla parede. Mais tarde, Julich (1981) introduziu o

nome ordinal Ganodermatales. Embora características fenotípicas sejam fundamentais para

a triagem inicial de espécies desta família, uma classificação biológica baseada unicamente

em dados morfológicos e fisiológicos gera dúvidas em muitos casos.

Classificar Ganoderma diante de critérios taxonômicos cuja abordagem varia de

pesquisador para pesquisador levanta problemas na interpretação da literatura. Moncalvo e

Ryvarden (1997), por exemplo, relacionam 387 espécies fazendo parte da família

Ganodermataceae, sugerindo que G. lucidum, na verdade, tornou-se um complexo onde

estão incluidos G. tsugae Murr., G. valesiacum Boud., G. oregonense Murr., G. resinaceum

Boud., G. pfeifferi Bres., G. oerstedii (Fr.) Torr. G. ahmadii Stey.

A distribuição geográfica de G. lucidum também é assunto para discussão, visto que

autores como Moncalvo et al. (1995) defendem que esta espécie é restrita à Europa, mas

outros autores, como Herrera & Ulloa (1998), afirmam que a distribuição deste fungo é

bem mais ampla, abrangendo diversas regiões do planeta. Estudos mostram que G. lucidum

pode ser encontrado tanto na Europa (Ryvarden e Gilbertson, 1993), como na África

25

(Ryvarden e Johansen, 1980), América do Norte (Gilbertson e Ryvarden, 1986) e Ásia

(Nunez e Ryvarden, 2000). Hobbs (1995) e Hseu et al (1996), também afirmam que G.

lucidum pode ser encontrado na América do Norte, Europa, Índia, América do Sul e Ásia,

enquanto Gottlieg & Wright (1999) apontam sua presença na América do Sul,

particularmente na Argentina e no Brasil. Reforçando a opinião destes autores, Loguercio-

Leite (2005) detalha a descrição de G. lucidum encontrado no Brasil, sugerindo que a

distribuição geográfica deste fungo ainda carece de consenso.

5. Morfologia de Ganoderma

Segundo Urben et al. (2004) o basidiocarpo de G. lucidum se desenvolve

lentamente, permitindo apenas colheitas anuais. Embora possa existir diferença de

crescimento em relação à linhagem utilizada, o tempo médio de crescimento fica em torno

de seis meses. Shin et al. (1986) relatam amplas variações no basidiocarpo, que pode ser

sustentado por um estipe ou não cujo comprimento também pode oscilar bastante.

Ryvarden (1991) descreve que o píleo pode se apresentar diferenciado em relação à

sua inserção no estipe. O mais comum é encontrá-lo inserido lateralmente, embora sejam

encontradas ligações do tipo excêntrica, central e séssil. Segundo o autor, o tipo de ligação

do píleo, diâmetro e comprimento podem ser utilizados para realizar diferenciações entre

espécies do gênero.

Outra característica morfológica que tem sido empregada na taxonomia de

Ganoderma é o aspecto lacado do píleo e do estipe, sendo esta a principal observação que o

diferencia do gênero Amauroderma. Apesar disso, existem exceções à regra, como no caso

de A. austrofujianense e A. leptopus, que possuem aspecto lacado, e de G. mongolicum, que

não apresenta laca. Mesmo assim, os taxonomistas preferem manter a característica lacada

26

em suas chaves de classificação, afirmando ser um auxílio viável na identificação da

família Ganodermataceae (Seo e Kirk, 2000). Zhao (1989) informa que o tamanho e o

formato dos poros são características complementares muito úteis para se definir as

espécies de Ganoderma.

Urben et al. (2004) descreve as hifas do gênero como sendo geralmente hialinas,

com paredes finas, ramificadas, podendo ser septadas ou não, formando alças entrelaçadas,

enquanto que as hifas esqueléticas sempre se apresentam pigmentadas, ramificadas e

possuindo paredes grossas em sua estrutura. O basídio apresenta formato em forma de clava

a piriforme, com quatro esterigmas e um a dois vacúolos. Os basidiósporos possuem dupla

parede, sendo ovóide-elipsóides, e ocasionalmente ovóide-cilíndricos sempre truncados no

ápice, de coloração acastanhada, apresentando vacúolos. A espessura da parede não

apresenta uniformidade, pois a região do ápice é mais espessa que a base. A dupla parede é

muito distinta, com a parte externa hialina e mais fina e a interna usualmente avermelhada e

grossa. Além disso, os basidiósporos têm um apêndice “hilar” excêntrico sobre uma base

circular, a superfície é lisa ou enrugada, sendo que na grande maioria ocorrem pequenas

depressões superficiais. Os basidiósporos, de espécimes crescidos naturalmente no Japão,

medem 8,5-11x 6,5 x 8,5 µm (média 10,1 x 7,5 µm).

Em relação ao crescimento, diversos são os fatores ambientais que podem

influenciar o desenvolvimento de Ganoderma em cultivo. Como exemplo, pode-se citar

luminosidade, temperatura, umidade e aeração, entre outros. A luminosidade é importante

para a diferenciação do píleo, afetando-o de forma positiva, enquanto o micélio, ao

contrário, tem seu crescimento inibido pela presença de luz. A temperatura ótima para

crescimento de Ganoderma é em torno de 28 ºC, com umidade relativa (UR) de 80%

(Urben et al., 2004).

27

6. Bioquímica e Farmacologia do G. lucidum

As concentrações de substâncias bioquímicas de G. lucidum podem variar entres as

linhagens da espécie. Além disso, a nutrição fornecida e nas condições ambientais de uma

forma geral podem promover uma oscilação nutricional por parte do fungo (Wasser e Weis,

1999; Zhu et al., 2007). Dentre as várias biomoléculas existentes, os polissacarídeos são

aqueles que mais despertam interesse por parte de pesquisadores, porém existem diversos

outros componentes de interesse biotecnológico em G. lucidum, tais como proteínas,

triterpenóides, oligossacarídeos, ácidos orgânicos, lipídios, alcalóides e

proteopolissacarídeos, dentre outros (Mizushina et al., 1999; Wasser, 2002; Chang &

Buswell, 2003; Packer et al., 2003; Paterson, 2006; Akihisa et al., 2007). Existe ainda um

alto teor de fibras em G. lucidum, que possuem em sua composição principalmente

heteropolissacarídeos como hemicelulose, pectinas e quitina. Alguns pesquisadores

atribuem a estas fibras a capacidade de reduzir a absorção de substâncias tóxicas pelo trato

digestivo, o que confere ao fungo atividade anticarcinogênica (Kim et al., 1999b; Sliva,

2002).

A glicose e a manose são os principais componentes dos carboidratos presentes em

G. lucidum, havendo outros açúcares (fucose, N-acetilglucosamina e xilose) em menores

concentrações. Em relação à concentração de lipídeos, G. lucidum contém em média de 4 a

4,5%, dependendo do substrato disponível. Os ácidos graxos insaturados são os principais

componentes lipídicos encontrados, chegando a 80% do total. A quantidade de cinzas pode

variar entre 1 e 5% do peso seco (Gao et al., 2000; Paterson, 2006).

Em relação aos sais minerais contidos em G. lucidum, o potássio é o que pode ser

encontrado em maior quantidade, representando cerca de 83% do total de sais, seguido por

28

cálcio (9%), magnésio (4%) e sódio (1%). Sais como zinco, ferro, manganês, níquel, cobre,

entre outros, não chegam ao somatório de 3% do total. Alguns estudos revelaram a

presença de metais pesados, como chumbo, cobalto, berílio, bismuto e cromo, mas as

concentrações, quando presentes, são mínimas, dependendo do substrato utilizado. Não há

registros de alumínio fazendo parte da composição mineral de G. lucidum (Chiu et al.,

2000).

Quanto às glucanas (polissacarídeos), nos últimos 30 anos, pesquisas

farmacológicas demonstraram sua atividade antitumoral e imunoreguladora, promovendo a

imunidade humoral e celular (Lin, 2005; Paterson, 2006) demonstrando potente ação contra

o sarcoma 180 (Willard, 1990). Em outros trabalhos há informações de como essas

glucanas colaboram na indução da produção de citocina e na diferenciação de linfócitos

(Wang et al., 1997; Hsu et al., 2004). Segundo Wasser (2002) as glucanas presentes em G.

lucidum apresentam variados tipos de ligações glicosídicas, tais como β-glucanas (1→3),

(1→6) e as α-glucanas (1→3). Sua estrutura é composta por uma unidade central contendo

moléculas de glicose, de onde partem ramificações, podendo ser estas formadas por ácido

glucurônico, xilose, galactose, manose, arabinose ou ribose. É importante mencionar que a

atividade antitumoral se deve em maior parte às glucanas que apresentam ligações β-(1→3)

na cadeia principal e pontos de ramificação β-(1→6). As glucanas agem sobre o sistema

imunológico do hospedeiro induzindo a maturação, diferenciação e proliferação de células

imunocompetentes, através do incremento na produção de citocinas (Wasser, 2002).

Alguns experimentos, entretanto, evidenciam a perda do efeito antitumoral de

polissacarídeos administrados em camundongos timectomizados ou após a administração

de soro antilinfócito, sugerindo um mecanismo de ação timo-dependente (Ooi e Liu, 1999).

Vale ressaltar que produtos de consumo que contenham β-D-glucanas são considerados

29

seguros pela Food and Drug Administration (FDA) nos Estados Unidos, sendo

comercializados em forma de pó, cápsulas ou tabletes (Bobek et al., 1997).

Os esteróis encontrados em G. lucidum atuam como precursores hormonais,

promovendo inibição da agregação plaquetátia, enquanto ácidos específicos deste cogumelo

(chamados ácidos ganodéricos) e glicanas reduzem significativamente a concentração de

açúcar no plasma sanguíneo de ratos acometidos por hiperglicemia (Tomoda et al, 1986,

Hobbs, 1995). Os ácidos ganodéricos são também descritos como eficientes anti-

hipertensivos e anti-alérgicos, além de demonstrarem atividade antitumoral especificamente

contra hepatomas (Hobbs, 1995). Um resumo das principais propriedades de G. lucidum,

estudadas em animais, pode ser visto na Tabela 3.

30

Tabela 3 – Principais atividades farmacológicas de G. lucidum

Componente Tipo Ação

Desconhecido Alcalóide Cardiotônico

Desconhecido Glicoproteina Inibidor tumoral

Adenosina Nucleotídeo Inibe a agregação plaquetária, relaxante

muscular, analgésico.

Ganoderans A,B,C Polissacarídeos Hipoglicemia

Desconhecido Polissacarídeos Cardiotônico

Desconhecido Polissacarídeos Antitumor, imunoestimulante

Beta-D-glucan Polissacarídeos Antitumor, imunoestimulante

GL-1 Polissacarídeos Antitumor, imunoestimulante

FA,FI,FI-1a Polissacarídeos Antitumor, imunoestimulante

D-6 Polissacarídeos Aumenta síntese protéica e metabolismo do

acido nucléico

Ling Zhi 8 Proteína Anti-alérgico de largo espectro,

imunomodulador

Ganodesterona Esteróide Anti-hepatóxico

Ácido ganodérico A, B,

C, D.

Triterpeno Inibe liberação histamínica

Ácido ganodérico R, S Triterpeno Anti-hepatotóxico

Ácido ganodérico B, D,

F, H, K, S, Y

Triterpeno Anti-hipertensivo.

Ácido ganodérico B Triterpeno Inibe síntese de colesterol

Ácido ganodérico Mf Triterpeno Inibe síntese de colesterol

Ácido ganodérico T, Z Triterpeno Antitumor

Ganodermadiol Triterpeno Anti-hipertensivo.

Acido Óleico Acido lipídio Insaturado Inibe liberação de histamina

Fonte: Hobbs, 1995

6.1. Estudos Clínicos

Nos últimos 20 anos, G. lucidum tem sido relatado em numerosos estudos clínicos,

como benéfico contra uma variedade de doenças, incluindo neurastenias, insônia, alergias e

31

úlceras, anorexia, leucopenia, distrofia muscular, distúrbios nervosos, hiperplasia

osteogênica, estresse, doença de Alzheimer, hiperlipidemia e diabetes, entre outras, sendo

utilizado em clínicas médicas e testado extensivamente na Ásia e em outras partes do

mundo (Hobbs, 1995). G. lucidum também tem mostrado resultados favoráveis em

tratamentos contra hepatites. Yan et al. (1987) descrevem o estudo de 355 casos de hepatite

B tratados com o extrato de G. lucidum, onde em 92,4% deles a melhora foi mais rápida.

Na China, na década de 70, estudos clínicos avaliaram a resposta do consumo de G.

lucidum nos tratamentos de bronquite crônica. Cerca de 2000 pacientes foram tratados com

o extrato do cogumelo, ingerindo-o em forma de tablete e com duas semanas cerca de 90%

dos pacientes mostraram melhora, incluindo aumento no apetite. Tratamento de asma em

pacientes idosos também mostrou excelentes resultados. A ação de G. lucidum no

tratamento de problemas cardíacos também já foi registrada, onde sua administração

beneficiou pacientes com doença coronariana, hipertensão e palpitações, entre outros

(Chang e But, 1986).

Outros estudos, realizados em pacientes HIV positivos, demonstraram como este

cogumelo estimula o sistema imune, mesmo quando este se encontra altamente debilitado

(El-Mekkawy et al., 1998). Seu uso também resulta em melhora quando adicionado à dieta

de pacientes com mononucleose (Dharmananda, 1988).

O governo japonês lista G. lucidum como um tratamento adjunto efetivo contra o

câncer (Willard, 1990) e pesquisadores do Moscow Cancer Research Center afirmaram

encontrar resultados positivos e estimulantes quando o extrato deste cogumelo foi utilizado

no tratamento de pacientes com câncer (Chilton, 1994).

32

7. Cultivo de Ganoderma lucidum

A produção de matriz ou micélio para cultivo de G. lucidum em alguns pontos se

assemelha ao cultivo de Agaricus, Pleurotus, Lentinus e Auricularia, mas algumas

particularidades devem ser levadas em consideração para o correto desenvolvimento deste

cogumelo (Zhanxi e Zhanhua, 1997).

O meio de cultura mais indicado para multiplicação de Ganoderma, em condições

de laboratório, é batata-dextrose-ágar (BDA) ou malte-dextrose-ágar (MEA). Estes meios

respondem satisfatoriamente também para outros gêneros de fungos como, por exemplo,

Pleurotus e Lentinula (Chang, 1999).

De acordo com Zhanxi e Zhanhua (1997), a “semente” ou “spawn” é o veículo de

dispersão do micélio no substrato, sendo que sua preparação é a fase mais crítica do cultivo

e deve ser realizada sob rigorosa assepsia. Esta semente constitui-se, na maioria dos casos,

de grãos de cereais cozidos (trigo, arroz, sorgo, cevada, entre outros) que após esterilização

são inoculados. Após a colonização total, os grãos servirão de inóculo para a colonização

do substrato, composto por uma gramínea (Arundo donax, Cymbopogon citratus,

Pennisetum purpureum, Sorghum vulgare, Zea mays entre outros) associada à outras fontes

de nutrientes (farelo de trigo, açúcar, carbonato de cálcio, entre outros). Os grãos são os

mais utilizados porque proporcionam excelente superfície semeada, quando comparados

com a de outros substratos, tais como palhas e serragens.

Urben et al (2004), explicam que geralmente os grãos de cereais apresentam

conteúdo de umidade em torno de 11%, sendo a umidade ótima para a produção do

“Spawn” entre 49 e 54%. Para umedecer o grão, recomenda-se ferver em água durante 15

minutos ou conforme recomendam Madan et al. (1987), umedecer em água na proporção

3:1 durante 12 horas. Segundo Bononi e Trufem (1986), após drenagem do excesso de água

33

são incorporados carbonato de cálcio e sulfato de cálcio na proporção de 1 a 3% do peso da

matéria seca do grão, mantendo a relação de 4 partes de carbonato de cálcio para uma parte

de sulfato de cálcio. Em seguida, os grãos são acondicionados em frascos de vidro ou sacos

de polipropileno, ocupando aproximadamente 75% do espaço do recipiente para facilitar as

trocas gasosas. Zadrazil e Grabbe (1983) e Elliott (1985), acreditam que o carbonato de

cálcio e o sulfato de cálcio, além de alterar o pH evitam que os grãos se unam uns aos

outros, facilitando o manuseio das “sementes”. O pH deve ser neutro ou ligeiramente

alcalino (Molena, 1986) ou entre 6,5 e 7,5 (Zadrazil e Grabbe, 1983).

Após semivedados, os frascos ou sacos de polipropileno contendo os grãos são

esterilizados em autoclave a 121 ºC por 2 horas. Depois de esterilizado e resfriado à

temperatura ambiente, os grãos contidos em cada frasco são inoculados em 1 cm2 do meio

de cultura colonizado pelo micélio, em câmara de fluxo laminar. Os frascos inoculados são

incubados a 25 ºC durante 11 a 14 dias, tempo necessário para que o micélio possa

colonizar toda a superfície dos grãos (Stamets e Chilton, 1983).

7.1. Substrato

Para o desenvolvimento do micélio e produção do basidioma, é indispensável um

meio ou substrato com condições físicas e químicas adequadas (Lajolo, 1970). Os

produtores de substratos para cultivo de cogumelos no Brasil ainda são escassos em nossas

condições, o que ocasiona preços exorbitantes do produto final. Desta forma, recomenda-se

buscar substitutos para os substratos tradicionais e nesse ponto a técnica Jun-Cao tem

destaque, pois a partir dela é possível utilizar praticamente quaisquer matérias-primas como

substrato para crescimento dos cogumelos, desde que sejam respeitadas algumas condições

nutricionais e a relação carbono-nitrogênio (Zhanxi e Zhanhua, 1997).

34

De acordo com Chang e Quimio (1984), antes da inoculação o substrato deve ser

fragmentado em partículas de aproximadamente 5 cm e umedecido com água para

apresentar umidade inicial próxima de 70%. Segundo os autores, o excesso de água no

substrato dificulta as trocas gasosas, além de afetar a degradação de lignina e causar o

aumento da contaminação por bactérias e fungos oportunistas. Bizaria et al. (1987)

descrevem o modo como diferentes resíduos misturados promovem um suprimento mais

balanceado de nutrientes do que resíduos utilizados separadamente ou utilizados em

conjunto, mas não misturados. Isto confere maior consistência e aglutinação, melhorando o

contato entre o substrato e o micélio. Estes autores estudaram a eficiência biológica do

cultivo de Pleurotus sajor-caju em diferentes resíduos agrícolas. Os resultados da técnica

foram adaptados por Urben et al (2004) e utilizados com extrema eficiência para G.

lucidum.

7.1.1. Necessidades nutricionais

Ganoderma são decompositores primários, degradadores de madeira e degradam

tanto a lignina quanto a celulose presentes no substrato (Urben et al., 2004). A madeira

apresenta aproximadamente 50 a 60% de celulose, 10% a 30% de hemicelulose e 20 a 30%

de lignina. A celulose é constituída de moléculas de glicose, enquanto as hemiceluloses são

constituídas de moléculas de arabinose, galactose, manose, xilose e ácidos urônicos. A

lignina, por sua vez, possui estrutura mais complexa, constituída basicamente de unidades

de fenil-propano com um anel de benzeno ligado a um grupo hidroxila e um ou dois grupos

metoxílicos. Poucos são os microrganismos que conseguem utilizar essa substância para a

sua nutrição, devido ao fato dessas ligações presentes nesta molécula serem altamente

resistentes à degradação química. O ataque inicial da lignina é feito pelos fungos,

35

geralmente através da enzima lacase (p-difenil-oxigênio-oxido-redutase) resultando na

perda de grupos metoxílicos e ruptura de ligações éter causando uma degradação parcial

das substâncias mais solúveis (Mason, 1980).

Segundo Lin e Lin (1998), a produção de lacase e conseqüente degradação de

lignina é maior durante a fase de colonização do substrato pelo micélio, sendo que durante

a produção dos corpos de frutificação este processo diminui, chegando a ser praticamente

nula.

7.1.1.1. Carbono

A principal fonte de carbono e, consequentemente, de energia de um substrato

vegetal são os polissacarídeos e a lignina, constituintes da parede celular, embora existam

outros componentes poliméricos como lipídeos e proteínas que também podem ser

utilizados como fonte de energia pelo Ganoderma. Urben et al. (2004) afirmam que este

fungo inicia seu crescimento imediatamente após a inoculação, utilizando primeiro os

açúcares disponíveis do substrato, que geralmente compreendem de 1 a 2% do peso de

matéria seca, e depois passam a utilizar o carbono dos polissacarídeos.

Kaiben (2000) verificou que durante o crescimento do micélio há aumento do

conteúdo de monossacarídeos redutores e após a frutificação há redução destes índices. A

perda destes açúcares redutores provavelmente está associada à necessidade de energia para

a formação dos corpos de frutificação. Outras fontes de carbono, como os óleos, ceras e

ácidos orgânicos também presentes no substrato poderiam ser utilizadas por Ganoderma.

Mas de acordo com resultados obtidos por Kaiben (2000), os óleos são estimulantes em

concentrações baixas. Para os autores, muitos ácidos orgânicos reduzem o crescimento do

micélio.

36

7.1.1.2. Nitrogênio

Teoricamente, a necessidade do nitrogênio por parte do Ganoderma não deveria ser

muito grande já que a madeira, que é o substrato natural deste fungo, não possui teor alto de

nitrogênio. Trabalhos de diversos autores foram discutidos por Miles e Chang (1997) tendo

os autores concluído que não existe consenso entre os pesquisadores sobre a influência do

nitrogênio no crescimento e frutificação do Ganoderma.

Segundo Zhanxi e Zhanhua (1997), quando se utilizam sais de amônia, nitratos e

uréia, há liberação do íon que integrava a molécula, que se não for metabolizado na mesma

taxa que o nitrogênio, esta pode mudar o pH do meio devido ao acúmulo deste íon.

Consideram ainda os autores a peptona como a melhor fonte de nitrogênio orgânico,

proporcionando melhor crescimento, sendo os aminoácidos asparagina, serina, ácido

aspártico e alanina os que proporcionam crescimento melhor que os demais aminoácidos

testados.

Outro fator que influencia o crescimento do micélio é a relação carbono-nitrogênio

(C:N) que deve ser alta. Urben et al. (2004) verificaram a potencialidade de diversos

resíduos agrícolas e concluíram que a baixa produtividade de alguns substratos estava

relacionada à relação C:N menor ou igual a 29:1. Isto se explica pelo fato de que a presença

de quantidades elevadas de nitrogênio reprime a degradação de lignina e conseqüentemente

retarda ou até mesmo interrompe o crescimento do micélio. Recomenda-se uma relação

C:N próxima a 50:1.

37

7.1.1.3. Vitaminas e sais minerais

Lin e Lin (1999) verificaram que todas as vitaminas testadas (ácido ascórbico,

biotina, ácido fólico, inositol, niacina, piridoxina, riboflavina e tiamina) proporcionam um

maior crescimento do micélio no substrato de cultivo, mas a tiamina foi a que apresentou o

melhor resultado.

Em relação aos sais minerais, o sulfato de magnésio e o fosfato de potássio

desidrogenado foram os que apresentaram maior efeito no crescimento de linhagens de

Ganoderma. Além do crescimento do micélio, estes e outros sais minerais, como o cloreto

de sódio, de magnésio e de cálcio também estimulam o início da formação dos corpos de

frutificação. Os autores ainda mencionam que sulfato de magnésio, sulfato de zinco e

cloreto férrico são necessários para máxima produção de proteína bruta nos corpos de

frutificação.

7.1.1.4. Substrato residual

Durante o cultivo de Ganoderma, o substrato sofre modificações na composição,

resultando em um substrato residual diferente do inicial. O grau de degradação varia de

acordo com as espécies de Ganoderma e com fatores físico-ambientais, químicos e

biológicos.

De acordo com Britto (2000) o substrato sofre diminuição na matéria orgânica

devido a dois processos: a conversão de seus componentes em CO2 e H2O durante o

metabolismo do fungo e também devido à remoção dos materiais do substrato para a

construção dos corpos de frutificação. Estas perdas em geral são maiores durante a

frutificação do que durante o desenvolvimento do micélio. Ainda de acordo com o autor, há

uma tendência de aumento no teor de nitrogênio no substrato residual devido à atividade de

38

proteases, causada pela conversão progressiva de CO2. O pH, de um modo geral, diminui

durante a degradação devido à secreção de ácido oxálico pelo Ganoderma.

A diminuição do teor de lignina do substrato pode ser de 40 a 50% durante a fase de

crescimento micelial. A quebra de lignina permite a liberação de celulose, facilitando o

acesso para a degradação enzimática da mesma. O substrato residual, de forma geral

apresenta-se mais solúvel, possuindo altas quantidades de açúcares, aminoácidos livres e

cinzas, tendo progressivamente menor quantidade de lignina e celulose. Dependendo do

substrato utilizado, das condições de cultivo e da produtividade, o substrato residual pode

ter diversas aplicações como, por exemplo, alimento para animais ruminantes, fertilizante

para solo, geração de biogás e composto para cultivo de outros cogumelos, como o

Agaricus (Urben et al., 2004).

7.2. Fatores físicos e biológicos que influenciam o crescimento e produção de

Ganoderma lucidum

No cultivo de Ganoderma, vários fatores devem ser levados em consideração para

atingir uma boa produtividade, tais como físicos (temperatura, umidade, granulometria do

substrato, trocas gasosas, luz e potencial hidrogeniônico) e biológicos (Zhanxi e Zhanhua,

1997).

7.2.1. Fatores físicos

Os fatores físicos têm influência direta no crescimento do micélio e na formação dos

corpos de frutificação. É importante manter as condições favoráveis para o cultivo de

determinada espécie, no intuito de aproveitar o máximo do potencial que ela pode expressar


39

7.2.1.1 Temperatura e umidade relativa

Ganoderma geralmente é cultivado em temperaturas entre 20 e 30 ºC. O espectro

entre 24 e 28 ºC, contudo, é apontado como o mais favorável ao crescimento micelial e

frutificação. Em temperaturas abaixo de 20 ºC o crescimento ocorre, mas torna-se

progressivamente mais lento à medida que a temperatura diminui. Entre 20 e 24 ºC o

desenvolvimento é um pouco maior e acima de 30 ºC parece haver um efeito nocivo sobre

o crescimento do micélio. Temperaturas superiores a 40 ºC podem ser letais para este fungo

(Hobbs, 1995).

A umidade relativa (UR) necessária durante o período de crescimento micelial é de

80%, mas na frutificação esse valor pode ser diminuído levemente, para algo não inferior a

60%. Enquanto outros cogumelos são constituídos de água em quase 90% de sua estrutura,

Ganoderma é uma exceção, atingindo algo em torno de 50% de água em sua estrutura.

Prova disso são seus corpos de frutificação, muito mais rígidos e coriáceos do que os de

outros cogumelos (Lin e Lin, 1998).

7.2.1.2. Granulometria do substrato

Apesar do habitat natural do Ganoderma ser a madeira e o fungo crescer por entre

as fibras em ambiente compactado, o tamanho das partículas do material usado como

substrato tem sido analisado por alguns pesquisadores, principalmente quanto ao teor de

umidade e trocas gasosas. Substratos de cultivo para cogumelos, na técnica Jun-Cao, são

compostos basicamente de uma ou mais gramíneas trituradas e de insumos (farelos,

açúcares e/ou gesso, por exemplo). O sucesso da colonização micelial dependerá

unicamente da granulometria da gramínea, uma vez que os insumos geralmente são

40

adicionados em pó, no substrato. Em termos simples, se a granulometria da gramínea for

inferior a 1 cm, a compactação tornará o desenvolvimento mais lento, ao passo que se for

maior que 3 cm o substrato não terá consistência e se tornará muito frágil para

manipulação, além de favorecer a desidratação e a entrada de bactérias competidoras. O

ideal é que a granulação esteja em torno de 2 a 3 cm (Zhanxi e Zhanhua, 1997).

7.2.1.3. Troca gasosa

Observando o habitat natural desse fungo podemos deduzir que durante a fase de

crescimento do micélio no interior de troncos, possivelmente altas taxas de CO2 estão

presentes e não causam danos ao crescimento. Miles e Chang (1997) verificaram o efeito

do CO2 no crescimento do micélio de Ganoderma lucidum e notaram que este se

desenvolve mais rapidamente em concentrações mais altas de CO2, apresentando como

limite 22% do volume de ar. Para os autores, a alta taxa de CO2 significa vantagem

competitiva, principalmente quando o substrato não é esterilizado, em relação aos

microrganismos que não resistem às condições semi-anaeróbicas.

A importância de O2 e CO2 no ar durante o cultivo de cogumelos varia conforme o

estágio do cultivo. Segundo Kaiben (2000), ao contrário das condições semi-aeróbicas que

favorecem o crescimento do micélio, a fase de produção dos primórdios necessita de

condições definitivamente aeróbicas. Na fase de frutificação, uma alta taxa de CO2 leva à

formação de basidiomas deformados. O autor sugere que 28.000 ppm de CO2 estimula o

crescimento micelial e recomenda até 600 ppm para a formação dos primórdios.

As trocas gasosas podem ser afetadas pela espessura dos sacos de polipropileno

utilizados. Urben et al. (2004), recomendam sacos de polipropileno de 50 µm de espessura

para o cultivo. Quando foram usados sacos com espessura maior que 50 µm, houve

41

fermentação seguida de ramificação pobre de micélio na parte central do substrato. Afirma

ainda que na fase de formação dos primórdios, orifícios de 1 cm de diâmetro em intervalos

de 7 cm em ambos os lados apresentam ótimos resultados.

7.2.1.4. Luz

O efeito da luz no crescimento dos basiomas de Ganoderma é controverso, onde os

valores sugeridos variam de 40 a 2000 lux. Esse fungo desenvolve-se bem em escuridão,

em sombra ou em iluminação difusa, sendo a escuridão o ponto indicado para germinação

do esporo e desenvolvimento do micélio. Para a produção do corpo de frutificação,

entretanto, a luz é indispensável para garantir a qualidade do produto. A luz direta em

momento algum é recomendada, pois causa aborto dos primórdios. O ideal para a

frutificação é que a luz ambiente esteja em 30%, com 70% de sombra (Willard, 1990).

7.2.1.5 Potencial hidrogeniônico

O valor do pH da madeira, habitat natural do Ganoderma, está por volta de 5,0 a 6,0

e espera-se que este seja o ideal para o fungo. Para Lin e Lin (1998), o intervalo

aparentemente melhor é 4,0 a 6,0. Este fungo apresenta tendência para acidificar o substrato

que está colonizando, mesmo que esta mudança, em um primeiro momento, não seja a ideal

para o seu rápido crescimento, pois pH ácido tende a reduzir a velocidade de colonização

do micélio nos primeiros momentos de estabelecimento por parte do fungo. Mas uma vez

que o fungo tenha se estabelecido no substrato a acidificação deixa de ser um problema. No

final da colonização, há um equilíbrio e o pH permanece constante. Essa acidificação,

segundo os autores, se dá pela liberação do ácido oxálico, que serve para eliminar alguns

contaminantes naturais. Na natureza o fungo tende a se proteger antes de crescer, de modo

42

que a acidificação torna-se uma estratégia viável para evitar competidores. No cultivo,

contudo, essa característica natural é desnecessária e deve ser contornada para evitar

retardo no desenvolvimento e colonização do micélio. O carbonato de cálcio pode ser

utilizado para corrigir o pH em casos necessários.

7.2.2. Fatores biológicos

O efeito dos microrganismos competidores sobre o cultivo de Ganoderma é visto

como um fator biológico capaz de provocar perdas na produtividade. Os contaminantes

mais comuns, segundo Lin e Lin (1999), que aparecem nos substratos são os relacionados a

seguir:

• Sclerotium rolfsii: é um competidor de coloração marrom bastante conhecido em palha

de arroz, que tem a habilidade de produzir grandes quantidades de ácidos orgânicos

que acidificam o substrato. Pode reduzir a produtividade em até 60% dependendo do

período em que aparece e intensidade da contaminação. O tratamento térmico, com

imersão do substrato em água quente, pode controlar esse microrganismo, mas em

casos onde são utilizadas grandes quantidades de substrato é recomendável a adição de

solução de amônia (1000 ppm) antes da inoculação.

• Coprinus fimetarius: freqüentemente observado nas áreas mais secas e não colonizadas

do substrato, é um dos mais destrutivos. Seu controle resulta de cuidado intensivo

durante o manuseio do substrato. A ameaça cessa no momento em que Ganoderma

coloniza totalmente o substrato de cultivo.

• Penicillium digitatum: pode aparecer em qualquer momento do cultivo,

independentemente do substrato estar ou não colonizado. Este fungo compete

43

diretamente com Ganoderma e chega a crescer por cima do cogumelo (em particular,

no himenóforo), comprometendo totalmente a qualidade do produto. Pode-se utilizar

fungicida benomyl na concentração de 25 ppm em água onde a palha do substrato deve

ser imersa por 18 horas. Concentrações maiores do que a citada não são recomendáveis

por provocarem anormalidades nos corpos de frutificação.

• Trichoderma spp.: Não apresentam muito destaque, mas podem comprometer a

produção se houver total disseminação no substrato. Seu controle se dá por adição de

carbonato de sódio no substrato, mas deve ser utilizado de forma controlada, pois eleva

o valor do pH.

Segundo Bononi e Trufem (1986), a higienização antes e depois de exaurida a

produção é obrigatória. A desinfestação pode ser feita por vapor d’água por um período de

3 a 4 horas e depois, pelo emprego de melchol, formol, lysoforme ou outros produtos

similares. É importante que o ambiente seja adequadamente telado para evitar a entrada de

insetos e ratos.

8. Marcadores moleculares

Nos últimos anos, a filogenética e a taxonomia molecular têm mostrado grandes

avanços devido ao desenvolvimento de novos métodos de análise feitos com uso de

marcadores moleculares. Esses métodos permitem estimar a variabilidade genética de uma

biota, e, quando somados, levar a uma estimativa muito próxima da realidade na

biodiversidade de um ecossistema, bem como na relação entre os taxons (Grechko, 2002).

A taxonomia molecular pode ser definida como um conjunto de técnicas baseadas

na análise de DNA, que permite, de maneira precisa e rápida, distinguir espécies, por meio

das variações que podem ser observadas no material genético. Esse sistema possui várias

44

vantagens, como por exemplo, o fato dos dados necessários para a tomada de decisões

serem obtidos com um mínimo de material do organismo em estudo. Além disso, com a

taxonomia molecular, é possível separar taxons morfologicamente indistinguíveis, bem

como agrupar indivíduos que aparentem divergências morfológicas por se tratar de estágios

diferentes em um mesmo ciclo de vida (Blaxter e Floyd, 2003).

O diagnóstico utilizando marcadores moleculares foi inicialmente elaborado para

complementar informações sobre taxonomia de microrganismos, mas logo foi intensamente

aplicado em programas de melhoramento genético (Marques et al., 2002).

Em meio aos estudos que se desenvolviam sobre o assunto, foi o surgimento da

técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) na década de 80, elaborada por Mullis e

Faloona (1987), que provocou uma verdadeira revolução nas técnicas de biologia

molecular, facilitando em muito o trabalho de laboratório. A técnica de PCR consiste na

síntese enzimática de milhões de cópias de um segmento de DNA, por meio de uma

polimerase termoestável. Nesse procedimento utiliza primers (seqüências curtas de DNA)

que pareiam com o DNA-molde, servindo como iniciadores para a síntese de uma nova fita.

As reações ocorrem em ciclos alternados de temperatura, e cada ciclo se repete várias

vezes, amplificando em proporção geométrica a seqüência de interesse (Ferreira e

Grattapaglia, 1996). Por ser uma técnica simples, pouco tempo após sua descrição, diversos

pesquisadores começaram a desenvolver experimentos utilizando-se variações do princípio

original, de modo a expandir consideravelmente a aplicação da PCR (Foster et al., 1993).

Diversos trabalhos científicos que utilizam essa técnica (ou que dela derivaram) têm

sido publicados desde sua descrição. Estes trabalhos têm permitido avanços significativos

tanto em áreas básicas (como aquelas que buscam entender processos biológicos

fundamentais), como em áreas avançadas, dentre as quais a identificação de genótipos, o

45

diagnóstico de doenças, estudos filogenéticos e no melhoramento genético de plantas,

animais e microrganismos (Anderson e Stasovski, 1992; Ouellet e Seifert, 1993; Ferreira e

Grattapaglia, 1996).

Atualmente, existem diversas técnicas moleculares que detectam polimorfismos de

DNA, tais como RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism), RAPD (Random

Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorfism), ARDRA

(Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis), DGGE (Denaturing Gradient Gel

Electrophoresis), seqüências de subunidades de rDNA, SSR (Simple Sequence Repeats) e

RISA (Ribosomal Intergenic Spacer Analysis) (Litt e Luty, 1989; McDonald, 1997; Taylor

et al., 2001; Fagbola e Abang, 2004).

No estudo e comércio de cogumelos, a utilização de marcadores moleculares têm se

mostrado uma importante ferramenta na distinção de grupos taxonômicos, principalmente à

nível de linhagem (Gonzalez e Labarere, 2000; Joh et al., 2004; Park et al., 2004; Miyazaki

et al., 2005; Maruyama et al., 2006; Larsson, 2007; Phosri et al., 2007; Ro et al., 2007). A

razão para a necessidade de distinguir grupos taxonômicos, principalmente infra-

específicos, está no fato de que existe considerável variação nutricional entre diferentes

linhagens de uma mesma espécie de cogumelo, como na concentração de moléculas

bioativas (Wang e Ng, 2001, 2004; Choi et al., 2005) e de enzimas de interesse (Ruiz-

Duenas et al., 2001).

Desta forma, é de interesse industrial e comercial que linhagens comercializadas que

possuam alta qualidade nutricional e princípios medicinais possam ser identificadas de

forma rápida, sem a necessidade de longas análises bioquímicas. Neste contexto, os

marcadores moleculares podem fornecer o auxilio tão desejado ao comparar geneticamente

linhagens em uso com matrizes já conhecidas por seu potencial bioquímico (Ro et al.,

46

2007). Dentre as diversas técnicas atualmente conhecidas, a RAPD possui vantagens em

detectar polimorfismos de forma rápida, simples, direta e de baixo custo (Colauto et al.,

2002; Largeteau et al., 2006).

8.1. A técnica RAPD

Dentre os vários tipos de marcadores moleculares disponíveis atualmente, o RAPD

(Williams et al., 1990; Welsh e McClelland, 1990) destaca-se pelas vantagens que

apresenta em termos de simplicidade, pelo fato de ser aplicável a qualquer espécie e por

permitir a análise do genoma como um todo (Michelmore et al., 1991; Lopes et al., 2002).

Além disso, o marcador RAPD possui outras qualidades, tais como não utilizar

radioatividade, não requerer o conhecimento prévio da seqüência alvo a ser amplificada e

necessitar de pequenas quantidades de DNA (Ferreira e Grattapaglia, 1996).

A técnica tem como base a amplificação simultânea de vários locos anônimos

dispersos no genoma, utilizando um único primer de seqüência arbitrária de bases, que se

anelam em vários pontos do DNA genômico. Considerando-se um determinado primer, os

produtos de amplificação por RAPD podem ser classificados em dois grupos: variáveis

(polimórficos) e constantes (não-polimorficos) (Ferreira e Grattapaglia, 1996).

Perfis de RAPD podem conter bandas que são exclusivas para indivíduos,

linhagens, espécies ou mesmo gêneros. Da mesma forma, outras bandas podem ser

compartilhadas, de modo a se repetirem entre os grupos taxonômicos, estabelecendo

ligações em vários graus. Se, por exemplo, várias espécies forem analisadas e um grupo de

bandas estiver presente em todas as amostras de um mesmo gênero, pode-se concluir que

estas bandas são marcadores específicos para gênero. Por meio de observações nas bandas

geradas pela técnica, é possível separar grupos taxonômicos, pois até populações diferentes

47

de uma mesma espécie podem conter bandas exclusivas, que as separa dos demais

indivíduos daquela espécie (Ferreira e Grattapaglia, 1996; Fungaro e Vieira, 1998).

Pelo exposto, os marcadores moleculares RAPD têm sido empregados em diversos

estudos, como na avaliação da variabilidade genética entre espécies (Molnar et al., 1996;

Lacava et al., 2001; Iram e Ahmad, 2005; Shnyreva e Shtaer, 2006), nos estudos de

populações (Uijthof et al., 1994; Jamil et al., 2000; Ro et al., 2007), na taxonomia

(Strongman e Mackay, 1993; Guzman et al., 1999), caracterização de isolados fúngicos

(Fungaro, 2000; Zervaki et al., 2001; Colauto et al., 2002; Almeida et al., 2003) e produção

de fingerprints genômicos para muitas espécies de microrganismos (Welsh e McClelland,

1990; Murtagh et al., 1999; Boucias et al., 2000).

Entretanto, RAPD também tem limitações significantes quando comparada com

marcadores dominantes. A dominância limita as inferências feitas com RAPD, em estudos

com organismos diplóides, e pode fornecer algum conflito nos parâmetros genéticos

quando comparados com marcadores multialélicos (Lynch e Milligan, 1994). Estudos com

tecidos diplóides resultam em superestimativas de diferenciação entre populações, quando

comparadas com outros marcadores (Isabel et al., 1995). Além disso, a técnica às vezes

apresenta problemas de reprodutibilidade (Penner et al., 1993; Wang et al., 1993; Karp et

al., 1996). Por outro lado, Carvalho e Vieira (2001) afirmam que a técnica pode ser

empregada com bons resultados desde que sejam utilizados muitos primers e que sejam

seguidos critérios mais rígidos, como repetições múltiplas até o estabelecimento de um

padrão, no momento da interpretação dos resultados.

Diferente de outras técnicas, RAPD não cai em desuso, sendo aplicada aos mais

diversos organismos e nas mais diferentes condições, podendo ser empregada sem o auxílio

de outra técnica de identificação (Brault et al., 2007; Cai et al., 2007; Callanan et al., 2007;

48

Devrim et al., 2007; Ercisli et al., 2007; Li et al., 2007b; Tang et al., 2007; Cabanas et al.,

2008; Felix et al., 2008; Gomes et al., 2008; Hadian et al., 2008; Jones et al., 2008; Kiane

et al., 2008; Kim et al., 2008; Li et al., 2008; Rajwara et al., 2008; Solouki et al., 2008), ou

tendo outras técnicas para complementação das observações obtidas (Chen et al., 2007;

Chaves et al., 2008; Das et al., 2008; Lai et al., 2008; Ruiz et al., 2008; Venkatachalam et

al., 2008).

49

Objetivo Geral:

Neste trabalho, buscou-se avaliar o potencial de cultivo de linhagens brasileiras de

Ganoderma lucidum, comparando-as com linhagens comerciais chinesas, aplicando-se

variações da técnica “Jun-Cao” para desenvolver um protocolo cujos resultados reflitam em

maior produção de basidiomas, além de mensurar a concentração de proteínas, β-glucanas,

carboidratos e fenóis existentes entre as linhagens.

Objetivos específicos:

1. Utilizar a técnica “Jun-Cao” em diferentes linhagens de G. lucidum para determinar qual

isolado responde melhor à tecnica;

2. Avaliar qual formulação de substrato obterá melhor rendimento dentre as linhagens

estudadas;

3. Monitorar prováveis variações na composição bioquímica das linhagens estudadas,

dando-se ênfase a compostos já conhecidos na literatura como, por exemplo, os β-glucanas,

a fim de verificar qual possui melhor potencial bioquímico;

4. Avaliar o tempo de produção do cogumelo rei utilizando-se a técnica Jun-Cao, para que

sua utilização seja incrementada no país;

5. Obter uma variação de técnica Jun-Cao que possibilite produção de G. lucidum a baixo

custo sem que suas qualidades farmacológicas sejam prejudicadas.

6. Aplicar a análise genética RAPD para comprovar diferenças genotípicas em relação às

linhagens brasileiras e chinesas observadas no presente estudo.

50

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AGRAHAR-MURUGKAR, D.; SUBBULAKSHMI, G. Nutritional value of edible wild

mushrooms collected from the Khasi hills of Meghalaya. Food Chem., v. 89, p. 599 –603,

2005.

AKIHISA, T. et al. Anti-inflammatory and anti-tumor-promoting effects of triterpene acids

and sterols from the fungus Ganoderma lucidum. Chem. Biodiv., v. 4, p. 224–231. 2007.

ALEXOPOULOS, C. J.; MIMS, C. W.; BLACKWELL, M. Introductory mycology. 4th ed.

New York: John Wiley and Sons, 1996. 874p.

ALMEIDA, A. M. R. et al. Genotypic diversity among Brazilian isolates of Macrophomina

phaseolina revealed by RAPD. Fitopatol. Bras., v. 28, p. 279-285, 2003.

ANDERSON, J. B.; STASOVSKI, E. Molecular phylogeny of northern hemisphere species of

Armillaria. Mycologia, v. 84, n. 4, p. 505-516, 1992.

BANIK, S.; NANDI, R. Effect of supplementation of rice straw with biogas residual slurry

manure on the yield, protein and mineral contents of oyster mushroom. Ind. Crops Prod,

v. 20, p. 311–319, 2004.

BAO, X. F. et al. Structural features of immunological active polysaccharides from

Ganoderma lucidum. Phytochemistry, v. 59, p. 175-181, 2002.

BEROVIC, M. et al. Submerged cultivation of Ganoderma lucidum biomass and immuno-

stimulatory effects of fungal polysaccharides. J. Biotechnol., v. 103, p. 77-86, 2003.

BIZARIA, R. MADAN, M. BIZARIA, V. S. Biological efficiency and nutritive value of

Pleurotus sajor-caju cultivated on different agro wastes. Biological Wastes, v. 19, n. 4, p.

55-239, 1987.

51

BLAXTER, M.; FLOYD, R. Molecular taxonomics for biodiversity surveys: already and

reality. Trends Ecol. Evol., v. 18, n. 6, p. 268-269, 2003.

BOBEK, P.; OZDYN, L.; KUNIAK, L. The effect of oyster mushroom (Pleurotus ostreatus)

its ethanolic extract and extraction residues on cholesterol levels in serum lipoproteins and

liver of rat. Nahrung., v. 39, p. 98-99, 1995.

BOBEK, P.; OZDIN, L.; KUNIAK, L. Effect of oyster mushroom and isolated ß-glucan on

lipid peroxidation and on the activities of antioxidative enzymes in rats fed the cholesterol

diet. Nutr. Biochem., v. 8, p. 469-471, 1997.

BOBEK, P.; GABOVY, S. Hypocholesterolemic and antiatherogenic effect of oyster

mushroom (Pleurotus ostreatus) in rabbit. Nahrung., v. 43, p. 339-342, 1999.

BONONI, V. L. R.; TRUFEN, S. F. B. Cogumelos Comestíveis. São Paulo, 83p, 1986.

BONONI, V.L.R., et al. Cultivo de cogumelos comestíveis. São Paulo. Icone, 206p, 1995.

BOUCIAS, D. G. et al. Genotipic properties of the entomopathogenic fungus Nomuraea rileyi.

Biol. Control. , v. 19, p. 124-138, 2000.

BRAULT, M.; et al. Variability of Orobanche ramosa populations in France as revealed by

cross infestations and molecular markers. Env. Exp. Botany, v. 61, p. 272–280, 2007.

BUCHANAN, P. K. A taxonomic overview of the genus Ganoderma with special reference to

species of medicinal and nutriceutical importance. Proc. Int. Symposium Ganoderma Sci,

Auchland, 27-29 April, 2001. Disponível em: http://www.ganopoly.com.

CABANAS, R. et al. Occurrence of Penicillium verrucosum in retail wheat flours from the

Spanish market. Food Microbiol., v. 25, p. 642– 647, 2008.

CAI, Y. L.; CAO, D. W.; ZHAO, G. F. Studies on genetic variation in cherry germplasm using

RAPD analysis. Scientia Horticulturae, v. 111 p. 248–254, 2007.

52

CALLANAN, M. J.; ROSS, R. P.; BERESFORD, T. P. Insertion sequence elements as

mediators of strain diversity in Lactobacillus helveticus. Int. J. Food Microbiol. , v. 120, p.

120–123, 2007.

CAO, Q. Z. e LIN, Z. B. Ganoderma lucidum polysaccharides peptide inhibits the growth of

vascular endothelial cell and the induction of VEGF in human lung cancer cell. Life Sci., v.

78, p. 1457 -1463, 2006.

CARVALHO, A. O. R.; VIEIRA, L. G. E. Determinação das Condições Ótimas para Análises

de PCR-RAPD em Atta sexdens rubropilosa Forel (Hymenoptera: Formicidae). Neotrop.

Entomol., v. 30, n. 4, p. 593-600, 2001.

CHANG, S. T. Production of cultivated edible mushrooms in China with emphasis on

Lentinula edodes. ISMS Newslett, v. 78, p. 3-6, 1999.

CHANG, S. T., BUSWELL, J.A. Medicinal mushrooms — A prominent source of

nutriceuticals for the 21st century. Curr. Top. Nutr. Res. 1, 257–280. 2003.

CHANG, H.M.; P. BUT, P. P. Pharmacology and Applications of Chinese Materia Medica.

Vol. 2. Singapore: World Scientific. 1987.

CHANG S. T.; MILES, P. G. Recent trends in world production of cultivated mushrooms.

Mush. J., v. 503, p. 15-18, 1991.

CHANG, S. T.; QUIMIO, T. H. Tropical Mushrooms. New York: Academic Press, 493p.

1984.

CHAVES, J. Q. et al. Phenotypic and genotypic features of new autoagglutinating Bacillus

thuringiensis strains. J. Invert. Pathol., v. 98, p. 85–92, 2008.

CHEN, H. et al. Studies on the immuno-modulating and anti-tumor activities of Ganoderma

lucidum (Reishi) polysaccharides. Bioorg. Med. Chem., v. 12, p. 5595 –5601, 2004.

53

CHEN, H.; YANG, B.; CHEN, X. Identification and characterization of four strains of

Acidithiobacillus ferrooxidans isolated from different sites in China, Microbiol. Res.,

doi:10.1016/j.micres.2007.09.002

CHEN, K.; ZHANG, W. Advances on anti-aging herbal medicinals in China. Abstracts of

Chinese Medicines v. 1, p. 309 – 330, 1987

CHEUNG, L. M.; CHEUNG, P. C. K. Mushroom extracts with antioxidant activity against

lipid peroxidation. Food Chem., v. 89, p. 403 – 409, 2005.

CHILTON, J.S. The first international conference on mushroom biology and mushroom

products. Herbalgram, v. 31, p. 57, 1994.

CHIU, S.W.; WANG, Z.M.; LEUNG, T.M.; MOORE, D. Nutritional value of Ganoderma

extract and assessment of its genotoxicity and antigenotoxicity using comet assays of

mouse lymphocytes. Food Chem. Toxicol., v. 38, p.173-178, 2000.

CHOI, D. et al. Exopolysaccharide production in liquid culture of Pleurotus ferulae. J.

Microbiol. Biotechnol., v. 15, p. 368-375, 2005.

CHU, Q. P. et al. Extract of Ganoderma lucidum potentiates pentobarbital-induced sleep via a

GABAergic mechanism. Pharmacol. Biochem. Behav., v. 86, p. 693 - 698, 2007.

COLAUTO, N. B.; DIAS, E. S.; GIMENES, M. A.; EIRA, A. F. Genetic characterization of

isolates of the basidiomycetes Agaricus blazei by RAPD. Braz. J. Microbiol., v. 33, p.

131-133, 2002.

CZAPSKI, J.; SZUDYGA, K. Frozen mushorroms quality as affected by strain, flush,

treatment before freezing and time of storage. J. Food Sci., v. 65, p. 722-725, 2000.

DAS, I. K. et al. RAPD cluster analysis and chlorate sensitivity of some Indian isolates of

Macrophomina phaseolina from sorghum and their relationships with pathogenicity.

Microbiol. Res., v. 163, p. 215-224, 2008.

54

DEVRIM, A. K. et al. A study of genomic polymorphism and diversity in sheep breeds in

northeastern Anatolia. Small Ruminant Research, v. 73, p. 291–295, 2007.

DHARMANANDA, S. Chinese Herbal Therapies for Immune Disorders, Portland,

Institute of Traditional Medicine, 1988.

EIRA, A. F. Cultivo do cogumelo medicinal Agaricus blazei (Murrill) ss. Heinemann ou

Agaricus brasiliensis (Wasser et al.). Viçosa: Editora Aprenda Fácil, 2003.

EL-MEKKAWY, S. et al. Anti-HIV-1 and anti-HIV-1-protease substances from Ganoderma

lucidum, Phytochemistry, v. 49, p. 1651 - 1657, 1998.

EO, S.K.; KIM, Y. S.; LEE, C. K.; HAN, S. S. Antiherpect activities of various protein bound

polysaccarides isolated from Ganoderma lucidum. J. Ethnopharmacol., v. 68, p. 129–136,

1999.

ERCISLI, S. et al. Interspecific variability of RAPD and fatty acid composition of some

pomegranate cultivars (Punica granatum L.) growing in Southern Anatolia Region in

Turkey. Biochem. System Ecol., v. 35, p. 764-769, 2007.

FAGBOLA, O.; ABANG, M. M. Colletotrichum circinans and Colletotrichum coccodes can

be distinguished by DGGE analysis of PCR – amplified 18s rDNA fragments. Afr. J.

Biotechnol., v. 3, p. 195-198, 2004.

FELIX, P. C. et al. Genetic relationships among Mexican white pines (Pinus, Pinaceae) based

on RAPD markers. Biochem. System Ecol., v. 36, p. 523–530, 2008.

FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao Uso de Marcadores Moleculares

em Análise Genética. Brasília: Embrapa Cenargen, 220p, 1996.

FOSTER, L. M. et al. The polymerase chain reaction and ITS application to filamentous fungi.

Mycol. Res., v. 97, n. 7, p. 769-781, 1993.

55

FUNGARO, M. H. P.; VIEIRA, M. L. C. Aplicações da PCR em ecologia molecular. In:

MELO, I. S.; AZEVEDO, J. L. Ecologia Microbiana. Embrapa – CNPMA, 205-227,

1998.

FUNGARO, M. H. P. PCR na micologia. Biotecnol. Cienc. Desenv., v. 14, p. 12-16, 2000.

GAO, Y.; LAN, J.; GAO, H.; LIU, Z. Extraction and determination of Ganoderma

polysaccharides. Int. J. Med. Complement. Med., v. 1, n. 1, 2000.

GILBERTSON, R. L.; RYVARDEN, L. North American Polypores. Fungiflora: Oslo,

Norway, 1986.

GOMES, B. C. et al. Prevalence and characterization of Enterococcus spp. isolated from

Brazilian foods. Food Microbiol., v. 25, p. 668– 675, 2008.

GONZALEZ, P.; LABARERE, J. Phylogenetic relationships of Pleurotus species according to

the sequence and secondary structure of the mitochondrial small-subunit rRNA V4, V6, and

V9 domains. Microbiology , v. 146, p. 209-221, 2000.

GOTTLIEB, A. M. e WRIGHT, J. E. Taxonomy of Ganoderma from southern South America:

subgenus Ganoderma. Mycol. Res. v. 103, n. 6, p. 661 – 673, 1999.

GRECHKO, V. V. Molecular DNA markers in phylogeny and systematics. Russ. J. Genet., v.

38, n. 8, p. 851-868, 2002.

GUZMAN, P. et al. Detection and differentiation of Phaeoisariopsis griseola isolates with the

polymerase chain reaction and group-specific primers. Plant Dis., v. 83, p. 37-42, 1999.

HA, C. The inhibitory effect of the Chinese herb Ganoderma lucidum mycelium on gut

immunoglobulin a responses to cholera toxin in mice. Nutr. Res., v. 23, p. 691–701, 2003.

HADIAN, J. et al. Genetic diversity of Iranian accessions of Satureja hortensis L. based on

horticultural traits and RAPD markers. Scientia Horticulturae, v. 115 p. 196–202, 2008.

56

HERRERA, T.; ULLOA, M. El Reino de los Hongos: Micologia Básica e Aplicada.

Universidad Nacional Autônoma de México, Ciudad Universitária, México. 552 p, 1998.

HOBBS, C. Medicinal Mushrooms: An Exploration of Tradition, H ealing and Culture.

CA: Botanic press, 251p, 1995.

HSEU, R. S.; WANG, H. H.; WANG, H. F.; MONCALVO, J. M. Differentiation and grouping

of isolates of the Ganoderma lucidum complex by Random Amplified Polymorphic DNA-

PCR compared with grouping on the basis of internal transcribed spacer sequences. Appl.

Environ. Microbiol. , v. 62, n. 4, p. 1354-1363, 1996.

HSIEH, C.; HSU, T.; YANG, F. Production of polysaccharides of Ganoderma lucidum

(CCRC36021) by reusing thin stillage. Process Biochem., v. 40, p. 909–916, 2005.

HSU, H. Y. et al. Chromatographic and electrophoretic methods for Lingzhi pharmacologically

active components. J. Chromatogr., v. 812, p. 241-257, 2004.

IRAM, S.; AHMAD, I. Analysis of variation in Alternaria alternata by pathogenicity and

RAPD study. Pol. J. Microbiol., v. 54, p. 13-19, 2005.

ISABEL, N.; BEAULIEU, J.; BOUSQUET, J. Complete congruence between gene diversity

estimatives derived from genotypic data at enzyme and random amplified polymorphic

DNA loci in black spruce. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 92, p. 6369-6373, 1995.

JAMIL, F. F. et al. Genetic and pathogenic diversity with in Ascochyta rabiei (Pass.) Lab.

populations in Pakistan causing blight of chickpea (Cicer arientinum L.). Physiol. Mol.

Plant Pathol., v. 57, p. 243-254, 2000.

JI, Z. et al. Immunomodulation of RAW264.7 macrophages by GLIS, a proteopolysaccharide

from Ganoderma lucidum. J. Ethnopharmacol., v. 112, p. 445 - 450, 2007.

57

JOH, J. H. et al. Cloning and developmental expression of a metzincin family metalloprotease

cDNA from oyster mushroom Pleurotus ostreatus. FEMS Microbiol. Lett. , v. 239, p. 57-

62, 2004.

JONES, T. C. et al. Genetic variability of New Zealand seagrass (Zostera muelleri) assessed at

multiple spatial scales. Aquatic Botany, v. 88, p. 39–46, 2008.

KAIBEN, L. Cultivation and process of medicinal fungus Ganoderma lucidum. In: WANG, Z.

S.; WANG, H. C. Progress in Cultivation Techniques for Agaricus bisporus in China.

China: Asia Pacific Edible Mushroom Training Center, 2000.

KALAC, P.; SVOBODA, L. A review of trace element concentrations in edible mushrooms.

Food Chem., v. 69, p. 273-281, 2000.

KARP, A.; SEBERG, O.; BUIATTI, M. Molecular techniques in the assessment of botanical

diversity. Annu. Bot., v. 78, n. 2, p. 143-149, 1996.

KARSTEN, P. A. Enumeration Boletinearum et Polyporearum Fennicarum, Systemate novo

Dispositarum. Revue Mycol., Toulouse, 3: 16-19, 1881.

KIANE, M. et al. Wide genetic diversity of Rosa damascena Mill. germplasm in Iran as

revealed by RAPD analysis. Scientia Horticulturae, v. 115, p. 386–392, 2008.

KIM, B. K. Pharmacological efficacy of G. lucidum. Korean J. Pharmacogn., 18: 58-60,

1987.

KIM, S. W.; KIM, E. S.; KIM, Y. S. Studies on the polysaccaride extract from G. lucidum. J.

Korean Soc. Food Nutr., v. 24, p. 147-153, 1995.

KIM, H. S.; KACEW, S.; LEE, M. B. In vitro chemo preventive effect of plant polysaccharides

Aloe barbadensis Miller, Lentinus edodes, Ganoderma lucidum and Coriolus versicolor.

Carcinogenesis, v. 20, p. 1637-1640, 1999.

58

KIM, D.H.; SHIM, S.B.; KIM, N.J.; JANG, I.S. Beta-glucoronidase-inhibitory activity and

hepatoprotective effect of Ganoderma lucidum. Biol. Pharm. Bull., v. 22, n. 2, p. 162-164,

1999b.

KIM, J. H. et al. Effect of Ganoderma lucidum on the quality and functionality of Korean

traditional rice wine, Yakju. J. Biosci. Bioeng., v. 97, p. 24–28, 2004.

KIM, C. et al. Genetic diversity and population structure of endangered Isoetes coreana in

South Korea based on RAPD analysis. Aquatic Botany, v. 89, p. 43–49, 2008.

KIRK, P. M., P. F. CANNON, J. C. DAVID, AND J. A. STALPERS. Ainsworth & Bisby’s

dictionary of the fungi. Cabi Publishing, Wallingford, United Kingdom. 2001.

LACAVA, P. T.; ARAUJO, W. L.; MACCHERONI Jr, W.; AZEVEDO, J. L. RAPD profile

and antibiotic susceptibility of Xylella fastidiosa, causal agent of citrus variegated

chlorosis. Lett. Appl. Microbiol. , v. 33, p. 302-306, 2001.

LAI, D. et al. Molecular genetics profiles among individual Clonorchis sinensis adults

collected from cats in two geographic regions of China revealed by RAPD and MGE-PCR

methods. Acta Tropica, doi:10.1016/j.actatropica.2008.05.003

LAJOLO, F. Fungos como alimento. In: LACAZ, C. S. et al. O Grande Mundo dos Fungos.

São Paulo: Polígono, 248p, 1970.

LAKSHMI, B.; AJITH, T. A.; NAYANA, J.; JANARDHANAN, K. K. Antimutagenic activity

of methanolic extract of Ganoderma lucidum and its effect on hepatic damage caused by

benzo[a]pyrene. J. Ethnopharmacol., v. 107, p. 297 - 303, 2006.

LARGETEAU, M. L.; BAARS, J. P. P.O.; REGNAULT-ROGER, C.O.; SAVOIE, J. M.

Molecular and physiological diversity among Verticillum fungicola var. fungicola. Mycol.

Res., v. 110, p. 431-440, 2006.

59

LARSSON, K. H. Re-thinking the classification of corticoid fungi. Mycol. Res., v. 111, p.

1040-1063, 2007.

LEE, H.; SONG, M.; YU, Y.; HWANG, S. Production of Ganoderma lucidum mycelium using

cheese whey as an alternative substrate: response surface analysis and biokinetics.

Biochem. Eng. J., v. 15, p. 93–99, 2003.

LI, X. L.; ZHOU, A. G.; LI, X. M. Inhibition of Lycium barbarum polysaccharides and

Ganoderma lucidum polysaccharides against oxidative injury induced by c-irradiation in rat

liver mitochondria. Carbohydr. Polym., v. 69, p. 172 - 178, 2007.

LI, D.; YE, Q.; ZHU, G. Analysis of the germ plasm resources and genetic relationships among

hybrid Cymbidium cultivars and native species with RAPD markers. Agricultural Sciences

in China, v. 6, n. 8, p. 922-929, 2007b.

LI, F. et al. RAPD and morphological diversity among four populations of the tropical tree

species Paramichelia baillonii (Pierre) Hu in China. Forest Ecol. Manag., v. 255, p. 1793–

1801, 2008.

LIN, Z. B. Cellular and molecular mechanisms of immuno-modulation by Ganoderma

lucidum. J. Pharmacol. Sci., v. 99, p. 144 – 153, 2003.

LIN, Z.; LIN, Z. Jun-Cao Technology. Fujian: Institute of Jun-Cao: Fujian Agricultural

University, 142p, 1998.

LIN, Z.; LIN, Z. Fungi Cultivation with Jun-Cao. Fujian: Institute of Jun-Cao: Fujian

Agricultural University, 110p, 1999.

LITT, M.; LUTY, J. A. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a

dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. Am. J. Hum. Genet., v. 44, p.

398-401, 1989.

60

LIU, J. et al. The anti-androgen effect of ganoderol B isolated from the fruiting body of

Ganoderma lucidum. Bioorg. Med. Chem., v. 15, p. 4966 - 4972, 2007.

LOGUERCIO-LEITE, C.; GROPOSO, C.; HALMENSCHLAGER, M. A. Species of Ganoderma

Karsten in a subtropical area (Santa Catarina State, Southern Brazil). Iheringia , v. 60, n. 2, p. 135-

139, 2005.

LOPES, R. et al. Marcadores moleculares dominantes (RAPD e AFLP). Biotecnol. Cienc.

Desenv., v. 29, p. 56-60, 2002.

LYNCH, M.; MILLIGAN, B. G. Analysis of population genetic structure with RAPD markers.

Mol. Ecol., v. 3, p. 91-99, 1994.

MA, C. et al. Differential protein expression in mouse splenic mononuclear cells treated with

polysaccharides from spores of Ganoderma lucidum. Phytomedicine, doi:

10.1016/j.phymed.2007.11.015. 2008.

MADAN, M.; VASUDEVAN, P.; SHARMA, S. Cultivation of Pleurotus sajor-caju on

different wastes. Biological Wastes, v. 22, n. 4, p. 241-250, 1987.

MANZI, P.; PIZZOFERRATO, L. Beta glucans in edible mushrooms. Food Chem., v. 68, p.

315-318, 2000.

MANZI, P.; AGUZZI, A., PIZZOFERRATO, L. Nutritional value of mushrooms widely

consumed in Italy. Food Chem., v. 73, p. 321-325, 2001.

MANZI, P.; MARCONI, S.; AGUZZI, A.; PIZZOFERRATO, L. Commercial

mushrooms:nutritional quality and cooking. Food Chem., v. 84, p. 201 - 206, 2004.

MARQUES, E. K.; IKUTA, N.; LUNGE, V. R.; FONSECA, A. S. K. Diagnóstico molecular e

biotecnologia. In: SERAFINI, A. M.; BARROS, N. M.; AZEVEDO, J. L. Biotecnologia:

Avanços na Agricultura e na Agropecuária. EDUCS. p. 101-130, 2002.

61

MARUYAMA, T. et al. Phylogenetic relationship of psychoactive fungi based on rRNA gene

for a large subunit and their identification using the TaqMan assay (II). Forensic Sci. Int.,

v. 163, p. 51-58, 2006.

MASON, C. F. Decomposição. São Paulo: EPU/EDUSP, 63p, 1980.

MAU, J.; LIN, H.; CHEN, C. Non-volatile components of several medicinal mushrooms. Food

Res. Int., v. 34, p. 521 –526, 2001.

McDONALD, B. A. The population genetics of fungi: tools and techniques. Phytopathology,

v. 87, p. 448-453, 1997.

MDACHI, S. J. M.; NKUNYA, M. H. H.; NYIGO, V. A.; URASA, I. T. Amino acid

composition of some Tanzanian wild mushrooms. Food Chem., v. 86, p. 179 –182, 2004.

MENEZES, M.; OLIVEIRA, S. M. Fungos Fitopatogênicos. Recife: UFRPE, 1993. 277p.

MICHELMORE, R. W.; PARAN, I.; KESSELI, R. V. Identification of markers linked to

disease-resistence genes by bulked segregant analysis: a rapid method to detect markers in

specific genomic regions by using segreganting populations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

v. 88, p. 828-982, 1991.

MILLES, P. G.; CHANG, S. T. Mushorrom Biology. Singapore: World Scientific Publishing,

194p, 1997.

MIYAZAKI, Y.; NAKAMURA, M.; BABASAKI, K. Molecular cloning of developmentally

specific genes by representational difference analysis during the fruiting body formation in

the basidiomycete Lentinula edodes. Fungal Genet. Biol., v. 42, p. 493-505, 2005.

MIZUNO, T. Development of antitumor polysaccharides from mushroom fungi. Food Ingred.

J. Jpn. v. 167, p. 69-85, 1996.

62

MIZUSHINA, Y. et al. Lucidenic acid O and lactone, new terpentene inhibitors of eukaryotic

DNA polymerases from basidiomycete Ganoderma lucidum, Bioorg. Med. Chem., v. 7, p.

2047-2052, 1999.

MOLNAR, O. et al. Analysis of Coenzyme Q systems, monosaccharide patters of purified cell

walls, and RAPD-PCR patterns in the genus Kluyveromyces. Antonie Leeuwenhoek, v.

70, n. 1, p. 67-78, 1996.

MONCALVO, J. M. & RYVARDEN, L. A nomenclatural study of the Ganodermataceae

Donk. Synopsis Fungorum 11. Fungiflora : Oslo, Norway. 1997.

MONCALVO, J. M.; WANG, H. F.; HSEU, R. S. Gene phylogeny of the Ganoderma lucidum

complex. Comparison with traditional taxonomic characters. Mycol. Res., v. 99, p. 1489-

1499, 1995.

MULLER, C. I. et al. Ganoderma lucidum causes apoptosis in leukemia, lymphoma and

multiple myeloma cells. Leuk. Res., v. 30, p. 841 - 848, 2006.

MULLIS, K.; FALOONA, F. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalysed

chain reaction. Methods Enzymol., v. 55, p. 335-350, 1987.

MURTAGH, G. I.; DYER, P. S.; MCCLURE, P. C.; CRITTENDEN P. D. Use of Randomly

Amplified Polymorpfic DNA markers as a tool to study variation in lichen-forming fungi.

Lichenologist, v. 31, n. 3, p. 257-267, 1999.

NOGAMI, M. Anti-allergy activity of Ganoderma lucidum. Korean J. Pharmacogn., v. 18, p.

56-58, 1987.

NUNEZ, M.; RYVARDEN, L. East Asian Polypores, volume 1: Ganodermataceae e

Hymenochaetaceae. Synopsis Fungorum 13. Fungiflora:Oslo, Norway, 2000.

OOI, V.; LIU, F. A review of pharmacological activities of mushroom polysaccharides. Int. J.

Med. Mushrooms, v.1, p. 195-206, 1999.

63

OUELLET, T.; SEIFERT, K. A. Genetic characterization of Fusarium graminearum strais

using RAPD and PCR amplification. Phytopathology, v. 83, n. 9, p. 1003-1007, 1993.

PACKER, L., HALLIWELL, B., ONG, C.N. Lingzhi (Ganoderma lucidum). Herbal

Medicines, Marcel Dekker, New York. 2003.

PARK, H. G.; KO, H. G.; KIM, S. H.; PARK, W. O. Molecular identification of asian isolates

by nuclear ITS rDNA. J. Microbiol. Biotechnol., v. 14, p. 816-821, 2004.

PATERSON, R. R. Ganoderma – a therapeutic fungal biofactory. Phytochemistry, v. 67, p.

1985 – 2001, 2006.

PENNER, G. A. et al. Reproducibility of random amplified polymorphic DNA (RAPD)

analysis among laboratories. PCR: Methods and Applications. Cold Spring Harbor

Laboratory Press, 341-345, 1993.

PHOSRI, C. et al. Molecular study of the genus Astraeus. Mycol. Res., v. 111, p. 275-286,

2007.

RAJWANA, I. A. et al. Assessment of genetic diversity among mango (Mangifera indica L.)

genotypes using RAPD markers. Scientia Horticulturae, v. 117, p. 297–301, 2008.

RO, H. et al. Comparative studies on the diversity of the edible mushroom Pleurotus eringii:

ITS sequence analysis, RAPD fingerprinting, and physiological characteristics. Mycol.

Res., v. 111, p. 710-715, 2007.

ROYSE, D. J.; RHODES, T. W.; OHGA, S.; SANCHEZ, J. E. Yield, mushroom size and time

to production of Pleurotus cornucopiae (oyster mushroom) grown on switch grass substrate

spawned and supplemented at various rates. Biores. Technol., v. 91, p. 85 - 91, 2004.

RUIZ, P. et al. Intraspecific genetic diversity of lactic acid bacteria from malolactic

fermentation of Cencibel wines as derived from combined analysis of RAPD-PCR and

PFGE patterns. Food Microbiol., doi:10.1016/j.fm.2008.06.007

64

RUIZ-DUENAS, F. J. et al. A new versatile peroxidase from Pleurotus. Biochem. Soc.

Trans., v. 29, p. 116-122, 2001.

RUSSELL, R.; PATERSON, M. Ganoderma – a therapeutic fungal biofactory.

Phytochemistry, v. 67, p. 1985 - 2001, 2006.

RYVARDEN, L. Genera of polypores, nomenclature and taxonomy. Synopsis fungorum 5.

Fungiflora: Oslo, Norway, 1991.

RYVARDEN, L. GILBERTSON,R. L. European Polypores. Synopsis Fungorum 6.

Fungiflora: Oslo, Norway, 1993.

RYVARDEN, L.; JOHANSEN, I. A preliminary polypore flora of east Africa . Fungiflora:

Oslo, Norway, 1980.

SEO, G. S.; KIRK, P. M. Ganoderma: nomenclature and classification. In: Ganoderma

diseases of perennial crops. Royal Garden Academy: CABI Bioscience, 2000.

SHIN, G.C.; PARK, Y.H.; SEO, G.S.; CHA, D.Y. Morphological characters of Ganoderma

lucidum (Fr) Karsten grown naturally in Korea. Res. Rep. Inst. Agric. Sci. Technol., v. 13,

p. 44-51, 1986.

SHNYREVA, A. V.; SHTAER, O. V. Differentiation of closely related Oyster fungi Pleurotus

pulmonarius and P. ostreatus by mating and molecular markers. Russ. J. Genet., v. 42, n.

5, p. 539-545, 2006.

SLIVA, D. et al. Ganoderma lucidum suppresses motility of highly invasive breast and

prostate cancer cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 298, p. 603-612, 2002.

SLIVA, D. Ganoderma lucidum in cancer research. Leuk. Res., v. 30, p. 767 - 768, 2006.

SMANIA, A.J. et al. Antibacterial activity of steroidal compounds isolated from Ganoderma

(aphyllophoromycetideae) fruit body. Int. J. Med. Mush. v. 1, p. 325–330, 1999.

65

SOLOUKI, M. et al. Study of genetic diversity in Chamomile (Matricaria chamomilla) based

on morphological traits and molecular markers. Scientia Horticulturae, v. 117, p. 281–

287, 2008.

STAMETS, P. CHILTON, J. S. The Mushroom Cultivator . Washington: Agarikon press,

415p, 1983.

STANLEY, G. et al. Ganoderma lucidum suppresses angiogenesis through the inhibition of

secretion of VEGF and TGF-ß1 from prostate cancer cells. Biochem. Biophys. Res.

Commun., v. 330, p. 46 - 52, 2005.

STRAATSMA, G. et al. Adjustment of the composting process for mushroom cultivation

based on initial substrate composition. Bioresour. Technol., v. 72, p. 67-74, 2000.

STRONGMAN, D. B.; MACKAY, R. M. Discrimination between Hirsutella longicolla var.

Longicolla and Hirsutella longicolla var. cornuta using random amplified polymorphic

DNA fingerprinting. Mycologia, v. 85, p. 65-70, 1993.

TANG, Y.; ZHONG, J. Role of oxygen supply in submerged fermentation of Ganoderma

lucidum for production of Ganoderma polysaccharide and ganoderic acid. Enzyme

Microb. Technol., v. 32, p. 478–484, 2003.

TANG, W. et al. Ganoderic acid T from Ganoderma lucidum mycelia induces mitochondria

mediated apoptosis in lung cancer cells. Life Sci., v. 80, p. 205 - 211, 2006.

TANG, S. et al. Clonal and spatial genetic structure in natural populations of Luohanguo

(Siraitia grosvenorii), an economic species endemic to South China, as revealed by RAPD

markers. Biochem. System Ecol., v. 35, p. 557-565, 2007.

TAYLOR, E. et al. Modern molecular methods for characterization and diagnosis of seed-

borne fungal pathogens. J. Plant Pathol., v. 83, p. 75-81, 2001.

66

TOMODA, M.; GONDA, R.; KASAHARA, Y.; HIKINO, H. Glycan structures of ganoderans

B and C, hypoglycemic glycans of Ganoderma lucidum fruit bodies. Phytochemistry, v.

25, n. 12, p. 2817-2820, 1986.

UIJTHOF, J. M. J. et al. Patogenicity of strains of the black yeast Exophiala (Wangiella)

dermatitidis: an evolution based on polymerase chain reaction. Mycoses, v. 37, p. 235-242,

1994.

UKAI, S. et al. Polysaccharides in fungi. XIV. Anti-inflammatory effect of the polysaccharides

from the fruit bodies of several fungi. J. Pharmacobiodyn. v. 6, p. 983–990, 1983.

URBEN, A. F. et al. Produção de cogumelos por meio de tecnologia chinesa modificada.

Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e Desenvolvimento, 2004.

VENKATACHALAM, L. et al. The use of genetic markers for detecting DNA polymorphism,

genotype identification and phylogenetic relationships among banana cultivars. Mol. Phyl.

Evol., v. 47, p. 974–985, 2008.

VETTER, J. Data on sodium content of common edible mushrooms. Food Chem., v. 81, p.

589–593, 2003.

WAGNER, R.; MITCHELL, D. A.; SASSAKI, G. L.; AMAZONAS, M. A. L. A. Links

between morphology and physiology of Ganoderma lucidum in submerged culture for the

production of exopolysaccharide. J. Biotechnol., v. 114, p. 153–164, 2004.

WANG, H.; QI, M. Q.; CUTLER, A. J. A simple method of preparing plant samples for PCR.

Nucleic Acids Res., v. 21, p. 4153-4154, 1993.

WANG, S. Y. et al. The anti-tumor effect of Ganoderma lucidum is mediated by cytokines

released from activated macrophages and T lymphocytes. Int. J. Cancer, v. 70, p. 699 –

705, 1997.

67

WANG, H.; NG, T. B. Pleueryn, a novel protease from fresh fruiting bodies of the edible

mushroom Pleurotus eryngii. Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 289, p. 750-755,

2001.

WANG, H.; NG, T. B. Eryngin, a novel antifungal peptide from fruiting bodies of edible

mushroom Pleurotus eryngii. Peptides, v. 25, p. 1-5, 2004.

WASSER, S. P.; WEIS, A. L. Therapeutic effects of substances occurring in higher

Basidiomycetes mushrooms: a modern perspective. Crit. Rev. Immunol., v. 19, p. 65-96,

1999.

WASSER S. P. Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating

polysaccharides. Appl. Microbiol. Biotechnol., v. 60, p. 258-274, 2002.

WELSH, J.; McCLELLAND, M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers.

Nucleic Acids Res., v. 18, p. 7213-7218, 1990.

WILLARD, T. Reishi Mushroom: Herb of Spiritual Potency and Medicinal Wonder.

Washington: sylan press, 167p, 1990.

WILLIAMS, J. G. K. et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are usefull as

genetic markers. Nucleic Acids Res., v. 18, p. 6531-6535, 1990.

WU, Q. P. et al. Tumour cell adhesion and integrin expression affected by Ganoderma

lucidum. Enzyme Microb. Technol., v. 40, p. 32 - 41, 2006.

XIE, Y. Z. et al. Ganoderma lucidum inhibits tumour cell proliferation and induces tumour cell

death. Enzyme Microb. Technol., v. 40, p. 177 - 185, 2006.

YAN, R. et al. Treatment of chronic hepatitis B with Wulingdan Pill. Chinese Medicine v. 2,

p. 188, 1987.

ZADRAZIL, F. GRABBE, K. Edible Mushrooms. Biotechnology, v. 3, p. 145-187, 1983.

68

ZERVAKIS, G. I.; VENTURELLA, G.; PAPADOPOULOU, K. Genetic polymorphism and

taxonomic infrastructure of the Pleurotus eryngii species-complex as determined by RAPD

analysis, isozyme profiles and ecomorphological characters. Microbiology , v. 147, p.

3183-3194, 2001.

ZHAO, J. D. The Ganodermataceae in China. Bibliotheca Mycologica, v. 132, p. 1-176, 1989.

ZHANG, M.; CHEUNG, P. C. K.; ZHANG, L. Evaluation of mushroom dietary fibre

(nonstarch polysaccharides) from sclerotia of Pleurotus tuber-regium (Fries) singer as a

potental antitumor agent. J. Agric. Food Chem., v. 49, p. 5059-5062, 2001.

ZHANG, H.; LIN, Z. Hypoglycemic effect of Ganoderma lucidum polysaccharides. Acta

Pharmacol. Sin., v. 25, p. 191-195, 2004.

ZHANXI, L.; ZHANHUA, L. Jun-Cao Technology. Fuzhou: Asia-Pacific Fungi Cultivation

training Center. 1997.

ZHU, X. L.; CHEN, A. F.; LIN, Z. B. Ganoderma lucidum polysaccharides enhance the

function of immunological effector cells in immunosuppressed mice. J. Ethnopharmacol.,

v. 111, p. 219 - 226, 2007.

ARTIGO 1

(A ser encaminhado para a revista Journal of the Science of Food and Agriculture,

classificada como Qualis A pela CAPES e cujo fator de impacto é de 1,026)

67

Produção de linhagens brasileiras de Ganoderma lucidum pela

técnica chinesa Jun-Cao

Leonardo Rolim a,*, Arailde Urben b, Maria Auxiliadora Cavalcanti a a Universidade Federal de Pernambuco, Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Micologia, Cidade Universitária, Recife, Pernambuco, Brasil. CEP: 50670-420. b Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Prédio de Quarentena e Germoplasma, Parque Estação Biológica, W5 Norte Final, Brasília, Distrito Federal, Brasil. CEP: 70770-900. * contato: [email protected]

Resumo

Ganoderma lucidum é um cogumelo medicinal tradicionalmente usado na China no

combate e prevenção a diversos tipos de enfermidades, dentre as quais pode ser citado o

câncer. O interesse mundial neste basidiomiceto vem crescendo tanto no comércio como na

pesquisa, de modo que se torna necessário o desenvolvimento de métodos de cultivo cada

vez mais eficientes. A técnica Jun-Cao foi desenvolvida na China e revolucionou a

fungicultura do país. Neste trabalho, linhagens comerciais chinesas de G. lucidum foram

comparadas com linhagens brasileiras não exploradas a fim de determinar o potencial de

cultivo utilizando Jun-Cao. Seis formulações foram testadas e a linhagem brasileira CC-144

apresentou melhor resultado ao método aplicado.

Palavras-chave: cogumelos, Ganoderma lucidum, Técnica Jun-Cao.

INTRODUÇÃO

Ganoderma lucidum (Fr.) Karst

(Ganodermataceae), é um cogumelo

medicinal chamado de “Lingzhi” na

China, sendo amplamente utilizado na

medicina tradicional do país. O basidioma

é usado popularmente na prevenção e

tratamento de diversas doenças tais como

câncer, problemas hepáticos, cardiopatias,

inflamações, hipertensão e alguns

problemas neuronais, entre outros (Lee &

Rhee, 1990; Gao & Zhou, 2004; Lin &

Zhang, 2004; Tang & Zhong, 2004;

Petrova et al., 2005; Yuen, 2005; Xie et

al., 2006). Ganoderma lucidum é muito

raro na natureza, de forma que a coleta de

cogumelos selvagens não seria suficiente

para atender a exploração comercial. A

68

fim de equilibrar a oferta com o mercado

internacional crescente, estudos sobre o

cultivo deste basidiomiceto vêm sendo

realizados (Triratana et al., 1991;

Pokorny & Musar, 1995; Berovic et al.,

2003).

Os métodos de cultivo desse fungo

têm sido desenvolvidos tanto para

substratos sólidos, utilizando toras de

madeira ou serragem, como para culturas

líquidas, sendo estas últimas significantes

apenas para desenvolvimento de micélio

livre. A qualidade e concentração dos

princípios ativos de G. lucidum, que lhe

conferem o status de “cogumelo da

imortalidade” variam com a linhagem e

também depende do ambiente e substrato

onde o cogumelo é produzido (Mizuno et

al., 1995; Bojana et al., 2000).

Dentre os vários métodos de

cultivo que vêem sendo desenvolvidos,

destaca-se a técnica chinesa Jun-Cao

(Jun= cogumelo; Cao= gramíneas).

Desenvolvida na década de 1980 por

pesquisadores chineses, a técnica

revolucionou o sistema de produção de

cogumelos, elevando a quantidade destes

fungos e diminuindo substancialmente o

tempo de frutificação (Zhanxi &

Zhanhua, 1997). A principal característica

de Jun-Cao é a substituição das

tradicionais toras de madeira ou substrato

de serragem por gramíneas e resíduos

agrícolas. A qualidade nutritiva dos

cogumelos cultivados em Jun-Cao supera

o valor nutricional de cogumelos

cultivados com os métodos clássicos


Assim como outros cogumelos de

interesse comercial, o cultivo de G.

lucidum por Jun-Cao pode ser uma

alternativa para produtores dispostos a

realizar cultivos recicláveis, para os quais

a matéria-prima pode ser obtida de

materiais mais facilmente encontrados

como capim, bagaço de cana, borra de

café, gesso e açúcar, entre outros. Além

disso, após a utilização pelo cogumelo, o

substrato esgotado pode ser aproveitado

como ração para animais ou como

fertilizante (Urben et al., 2004).

Nesse contexto, a técnica Jun-Cao

surge como uma importante ferramenta

também em pesquisas científicas, onde

novas e inexploradas linhagens podem ter

seu potencial fisiológico avaliado. Assim,

este trabalho buscou comparar o

desenvolvimento de linhagens brasileiras

e chinesas de G. lucidum, avaliando o

melhor substrato e as melhores condições

abióticas para seu cultivo, buscando

determinar qual linhagem obterá melhor

69

resposta às diferentes condições de

crescimento.

MATERIAIS E MÉTODO

Linhagens de Ganoderma lucidum

Foram utilizadas quatro linhagens de

G. lucidum: duas de origem brasileira (CC-

144 e CC-157) e duas chinesas (CC-22 e CC-

63) (Tabela 1), que se encontram depositadas

no Banco de Germoplasma de Cogumelos

para Uso Humano, da Embrapa Recursos

Genéticos e Biotecnologia (Brasília, DF,

Brasil, 15º46'47"S 47º55'47"W).

Tabela 1: Procedência das linhagens de

Ganoderma lucidum utilizadas

Isolado Local Data da coleta

CC-22 China 19/02/2004

CC-63 China 10/02/2006

CC-144 Brasília, Brasil 10/02/2006

CC-157 São Paulo, Brasil 25/01/2006

Cultivo das linhagens

As amostras foram semeadas em

placas de Petri contendo meio BDA (Batata-

Dextrose-Agar) e incubadas entre 28° a 30°C

até o crescimento micelial recobrir a

superfície do ágar, aproximadamente de sete

a dez dias. Nesse período, o desenvolvimento

das linhagens foi avaliado em diferentes

condições de temperatura (20 ºC – 35 ºC), pH

(4 – 8) e luminosidade (claro e escuro).

Em seguida, as linhagens foram

transferidas para sacos de polipropileno

de alta densidade contendo 300 gramas de

grão de sorgo (Sorghum bicolor)

esterilizados onde permaneceram no

escuro a 28 ºC e UR 80% por 15 dias, até

completa colonização pelas linhagens.

Essa etapa é importante para

multiplicação e obtenção de micélio das

linhagens a serem inoculadas no substrato

de Jun-Cao.

Foram utilizadas seis formulações

diferentes de substrato:

Formulação 1:

Capim-elefante (Pennisetum purpureum)

70%, farelo de trigo 17%, farelo de arroz

10%, gesso agrícola 2% e açúcar mascavo

1%.

Formulação 2:


25%, bagaço de cana-de-açúcar 53%,

farelo de trigo 20%, gesso agrícola 2%.

Formulação 3:


73%, farelo de trigo 15%, farelo de arroz

10%, gesso agrícola 1% e açúcar mascavo

1%.

Formulação 4:


77,6%, farelo de trigo 20%, gesso

agrícola 1%, superfosfato de cálcio 0,1%,

açúcar mascavo 0,2% e uréia 0,1%.

70

Formulação 5:


39%, serragem 39%, farelo de trigo 10%,

bagaço de cana-de-açúcar 10% e gesso

agrícola 2%.

Formulação 6:

Serragem 78%, farelo de trigo 20% e

gesso agrícola 2%.

As gramíneas e/ou resíduos

orgânicos vegetais foram triturados com o

auxílio de um triturador de gramíneas.

Em seguida adicionou-se ao triturado de

cada formulação os respectivos insumos.

O substrato foi umedecido e colocado em

sacos de polipropileno, resistentes a altas

temperaturas. Cada saco recebeu 700

gramas de substrato.

Os substratos ensacados foram

autoclavados a 121 ºC por 90 min e

resfriados (temperatura ambiente) quando

foram inoculados com os grãos de sorgo

miceliados.

O substrato miceliado foi mantido

no escuro a 28 ºC, UR 80%, até ser

totalmente colonizado. Após isso, os

substratos foram levados para casa de

vegetação (26±4 ºC e UR 80%) onde,

após remoção dos sacos, foram cobertos

com solo esterilizado. Essa etapa é vital

para que o micélio não receba luz ou água

diretamente. A luz deve ser utilizada

apenas no momento do crescimento do

basidioma. O contato direto da água de

irrigação provoca atrofia dos basidiomas.

Para garantir a umidade necessária sem

comprometer a produtividade, o solo deve

permanecer apenas úmido, pois é essa

umidade que garantirá o satisfatório

desenvolvimento do cogumelo.

A Produtividade do cultivo foi

calculada pela fórmula P = (peso fresco

do cogumelo) x 100 / (peso seco do

substrato).

O experimento foi conduzido em

delineamento inteiramente casualisado

em arranjo fatorial de 4 x 6 sendo 4

linhagens de cogumelos e 6 formulações

como substrato e 5 repetições.

Ao final do processo, foi avaliado

o sustrato que gerou maior quantidade de

cogumelos e a linhagem que apresentou

desenvolvimento mais rápido. Os dados

foram analisados estatísticamente usando

o ANOVA de Medidas Repetidas.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Condições abióticas

A variação de pH não afetou as

linhagens desenvolvidas em placas

contendo o meio BDA. A ausência de luz,

contudo, foi importante para o rápido

71

crescimento micelial. A melhor

temperatura registrada foi 28 ºC,

conforme proposto por Urben et al.

(2004). Abaixo de 20 ºC e acima de 35 ºC

o desenvolvimento do fungo se torna

comprometido. A linhagem comercial

chinesa CC-22 e a brasileira CC-144

apresentaram melhor desenvolvimento ao

longo dessa etapa, exibindo rápido

crescimento e amplo espectro de

tolerância às variações de temperatura.

Cultivo

No cultivo em sementes de sorgo,

novamente foi possível observar o rápido

desenvolvimento de CC-22 e CC-144,

enquanto CC-63 e CC-157 tiveram

crescimento lento.

Em relação aos diferentes

substratos empregados, a linhagem CC-22

desenvolveu bem suas frutificações nas

formulações 2, 3, 4, 5 e 6, sem resultado

na formulação 1. A CC-63 mostrou

crescimento nos substratos 1, 2 e 5, com

resultado tardio na formulação 3 e sem

resultado nas 4 e 6. CC-144 respondeu

bem a todas as formulações, com

destaque para as formulações 5 e 6. Já a

linhagem CC-157 produziu cogumelos

apenas nos substratos 5 e 6 (Figuras 1 a

4).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Inicio 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150

Tempo (dias)

Des

envo

lvim

ento

da

frut

ifica

ção

(%)

Formulação 1

Formulação 2

Formulação 3

Formulação 4

Formulação 5

Formulação 6

Figura 1 – Percentual de desenvolvimento médio da fase reprodutiva (cogumelo) de G.

lucidum (linhagem CC-22) em diferentes formulações de substrato, ao longo de 150 dias,

onde 100% de desenvolvimento significa ponto propício para colher o cogumelo.

72

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Inicio 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150

Tempo (dias)

Des

envo

lvim

ento

da

Fru

tific

ação

(%

)

Formulação 1

Formulação 2

Formulação 3

Formulação 4

Formulação 5

Formulação 6




0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Inicio 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150

Tempo (dias)

Des

envo

lvim

ento

da

frut

ifica

ção

(%)

Formulação 1

Formulação 2

Formulação 3

Formulação 4

Formulação 5

Formulação 6




73

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Inicio 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150

Tempo (dias)

Des

envo

lvim

ento

da

frut

ifica

ção

(%)

Formulação 1

Formulação 2

Formulação 3

Formulação 4

Formulação 5

Formulação 6




A formulação 5 foi a que

apresentou melhores resultados. A

linhagem brasileira CC-144 foi a que

produziu a maioria das frutificações em

menor tempo. A linhagem CC-63 cresceu

bem na formulação 5, mas levou mais de

100 dias para o desenvolvimento

completo nas demais. A linhagem chinesa

CC-22 produziu cogumelos em todos os

substratos (exceção a formulação 1), mas

levou mais tempo que as outras linhagens.

A CC-157 foi pouco eficiente de uma

forma geral, com pouca resposta às

formulações e crescimento na formulação

5 quase tão lento quanto a CC-22 (Tabela

1).

Tabela 1: Média de peso fresco de cogumelos

obtida pelas linhagens de G. lucidum dentre as

seis diferentes formulações. Resultados medidos

em g/kg de substrato (“F” designa a formulação

empregada)

F1 F2 F3 F4 F5 F6

CC-22 0 180 98 108 320 200

CC-63 60 130 90 110 204 0

CC-144 102 200 115 150 360 212

CC-157 0 0 0 0 160 122

A análise estatística mostrou que

houve diferença significativa entre as

linhagens no tempo de desenvolvimento

(F= 27/180, p= 0,044178). A Produti-

vidade do cultivo pode ser observada na

Tabela 2.

74

Tabela 2: Produtividade das linhagens de G.

lucidum crescidas em seis diferentes substratos.

Resultados medidos em % (“F” designa a

formulação empregada)

F1 F2 F3 F4 F5 F6

CC-22 0 36 19,6 21,6 64 40

CC-63 12 26 18 22 40,8 0

CC-144 20,4 40 23 30 72 42,4

CC-157 0 0 0 0 32 24,4

Nos tratamentos com adição de

farelo de arroz (formulações 1 e 3), houve

redução de produção, quando comparados

aos sem adição deste farelo. Isso ocorreu

porque a adição do farelo de arroz pode

ter elevado a concentração de Nitrogênio

(N), como no caso do farelo de soja, que

contém até 7,38% de N (Eira & Minhoni,

1997). O excesso de N tende a reprimir a

degradação da lignina, retardando ou até

inibindo o aparecimento do micélio e,

consequentemente, reduzindo a produção

dos basidiomas (Zanetti & Ranal, 1997;

Urben et al., 2004). De acordo com

Regina (2001), em alguns casos, as fontes

de N mais simples aumentam a

concentração de proteínas das culturas,

diminuem o crescimento miceliano e a

degradação da lignina. Este também pode

ter sido o problema da formulação 4, que

continha uréia na composição.

O farelo de trigo aparentemente

foi bem aceito por G. lucidum. Aveia

poderia ter sido testada, mas Soto-Cruz et

al. (1999), ao avaliar diferentes substratos

no cultivo de Pleurotus ostreatus,

verificaram que a utilização de

concentrações altas de farelo de aveia

proporcionou maior perda de matéria seca

e redução indesejável da taxa de

crescimento do cogumelo.

No cultivo de Lentinula edodes,

Rossi et al. (2003) observaram que a

miceliação diminuiu significativamente

com a utilização de proporções crescentes

de farelo de arroz. A adição desse

suplemento promoveu declínio gradual na

relação C:N do substrato. Ainda segundo

os autores, no tratamento com adição de

20% de farelo de trigo, foram obtidas as

maiores médias de velocidade de

crescimento, comparado aos demais

farelos (arroz, milho, aveia e soja), na

mesma concentração. Dias et al. (2003),

entretanto, verificaram efeito negativo,

quando o farelo de trigo foi adicionado à

palha de feijão, no cultivo de Pleurotus

sajor-caju. Neste caso, o farelo dificultou

a colonização do substrato, porém a

adição do mesmo farelo à palha de milho

não afetou o crescimento do micélio,

possibilitando aumento da eficiência

biológica. Provavelmente o motivo esteja

75

na palha do feijão (alto N) e não no farelo

de trigo propriamente dito.

Segundo Donini et al. (2006), a

adição de farelos de soja e arroz ocasiona

redução da velocidade de crescimento de

Agaricus brasiliensis. Para eles, o meio

de cultura que proporcionou maior

velocidade de crescimento foi o

suplementado com 20% de farelo de

trigo. Moda et al. (2005), com o cultivo

de P. sajor-caju em bagaço de cana-de-

açúcar suplementado com farelo de milho

e solução mineral, observaram menor

eficiência biológica. Neste trabalho,

contudo, o bagaço-de-cana possibilitou

aumento de produção para G. lucidum

(Formulações 2 e 5). A Formulação 5

apresentou melhor resposta ainda

provavelmente pelo acréscimo de

serragem ao substrato. A hipótese para

isso é de que G. lucidum consome

rapidamente os nutrientes dos compostos

mais leves (farelos) e do capim. A

serragem poderia atuar como uma reserva

tardia de nutrientes, que poderia ser

utilizada pelo cogumelo após seu

estabelecimento no substrato.

Apesar do exposto, a escolha de

substratos para o cultivo de cogumelos,

não depende somente da composição e

relação C/N, mas também do grau de

compactação e hidratação, já que

substratos que se compactam com

facilidade ou excessivamente

higroscópicos dificultam a aeração.

Também é necessário observar a natureza

do substrato utilizado na correção da

relação C/N, pois este pode “cimentar” o

substrato, resultando também na perda de

eficiência da aeração. Neste estudo a

aeração demonstrou ser determinante no

desenvolvimento do micélio, visto que,

sem a devida aeração, o desenvolvimento

cessa no meio do substrato. Isso também

foi observado por Dias et al. (2003)

quando trabalhou com Pleurotus usando

casca de café, pois esta se compactava,

impedindo a aeração do substrato.

Os resultados permitem concluir

que CC-144 responde melhor ao cultivo e

que a CC-63 pode ser bem empregada

desde que apenas quando desenvolvida

em substratos cuja elaboração seja similar

à formulação 5. De uma forma geral, a

mistura entre gramínea e madeira foi bem

aceita pelas linhagens, contribuindo para

a elaboração de substratos que gerem

melhor resultado na técnica Jun-Cao.

REFERÊNCIAS

Berovic, M. et al. Submerged cultivation of

Ganoderma lucidum biomass and

76

immunostimulatory effects of fungal

polysaccharides. J. Biotechnol. 103, 77-

86, 2003.

Bojana, B. et al. Triterpenoid Acids from

Ganoderma, Food Technol. Biotechnol.

38, 11-18, 2000.

Dias, E.S.; et al. Cultivo do cogumelo

Pleurotus sajor-caju em diferentes

resíduos agrícolas. Cienc. Agrotec., 27,

1363-1369. 2003.

Donini, L. P. et al. Desenvolvimento in vitro

de Agaricus brasiliensis em meios

suplementados com diferentes farelos.

Pesq. Agropec. Bras., 41, 995-999,

2006.

Eira, A.F.; Minhoni, M.T.A. Manual teórico-

prático do cultivo de cogumelos

comestíveis. 2.ed. Botucatu: Fundação de

Estudos e Pesquisas Agrícolas e

Florestais, 115p. 1997.

Gao YH et al. Chemopreventive and

tumoricidal properties of Ling Zhi

mushroom Ganoderma lucidum (Fr.)

Lioyd (Aphyllophoromycetideae). Part II.

Mechanism considerations. Int. J. Med.

Mushr. 6, 219-230, 2004.

Lee, S.Y.; Rhee, H.M. Cardiovascular effects

of mycelium extract of Ganoderma

lucidum: inhibition of sympathetic

outflow as a mechanism of its

hypotensive action. Chem. Pharm. Bull.

38, 1359-1364, 1990.

Lin, Z.B.; Zhang, H.N. Anti-tumor and

immunoregulatory activities of

Ganoderma lucidum and its possible

mechanisms Acta Pharmacol. Sin. 25,

1387-1395, 2004.

Mizuno, T. et al. Reishi, Ganoderma lucidum

and Ganoderma tsugae: bioactive

substances and medicinal effects. Food

Rev. Int. 11,151-166, 1995.

Moda, E.M.; et al. Edible mushroom

Pleurotus sajor-caju production on

washed and supplemented sugarcane

bagasse. Scientia Agricola, 62, 127-132,

2005.

Petrova, R.D. et al. Potential role of

medicinal mushrooms in breast cancer

treatment: current knowledge and future

perspectives. Int. J. Med. Mushr . 7, 141-

155, 2005.

Pokorny, J.; Musar, A. in: A. Kjøller (Ed.),

Abstracts of the 10th International

Conference on Global Impacts of Applied

Microbiology Biotechnology, University

of Copenhagen, Copenhagen, p. 141,

1995.

Regina, M. Cinética do crescimento

miceliano de Lentinula edodes (Berk.)

Pegler em bagaço de cana-de-açúcar e

serragem de eucalipto. Dissertação -

77

Universidade Estadual Paulista, Botucatu.

87p. 2001.

Rossi, I.H. et al. Supplementation of

sugarcane bagasse with rice bran and

sugarcane molasses for Shiitke (Lentinula

edodes) spawn production. Braz. J.

Microbiol. , 34, 61-65, 2003.

Soto-Cruz, O. et al. Effect of substrate

composition on the mycelial growth of

Pleurotus ostreatus. An analysis by

mixture and response surface

methodologies. Proc. Biochem., 35, 127-

133, 1999.

Tang, Y.J.; Zhong, J.J. Modeling the kinetics

of cell growth and ganoderic acid

production in liquid static cultures of the

medicinal mushroom Ganoderma

lucidum Biochem. Eng. J. 21, 259-264,

2004.

Triratana, S. et al. in: M.J. Maher (Ed.),

Proceedings of the 13th International

Congress on the Science Cultivation of

Edible Fungi, A.A. Balkema, Rotterdam,

p. 567. 1991.

Urben, A. F. Produção de cogumelos por

meio de tecnologia chinesa modificada.

Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e

Desenvolvimento, 2004.

Xie, J.T. et al. Ganoderma lucidum extract

inhibits proliferation of SW 480 human

colorectal cancer cells. Exp. Oncol. 28,

25-29, 2006.

Yuen, J.W.M.; Gohel, M.D.I. Anticancer

effects of Ganoderma lucidum: a review

of scientific evidence. Nutr. Cancer 53,

11-17, 2005.

Zanetti, A.L.; Ranal, M.A. Suplementação da

cana-de-açúcar com guandu no cultivo de

Pleurotus sp. ‘Florida’. Pesq. Agropec.

Bras., 32, 959-964, 1997.

Zhanxi, L.; Zhanhua, L. Jun-Cao

Technology. Fuzhou: Asia-Pacific Fungi

Cultivation training Center. 1997.

ARTIGO 2

(A ser encaminhado para a revista Food Chemistry, classificada como Qualis A pela

CAPES e cujo fator de impacto é de 2,433)

79

Análise bioquímica de linhagens brasileiras e chinesas de

Ganoderma lucidum cultivadas pela técnica chinesa Jun-Cao

Leonardo Rolim a,*, Erna Bach b, Arailde Urben c, Maria Auxiliadora Cavalcanti a a Universidade Federal de Pernambuco, Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Micologia, Cidade Universitária, Recife, Pernambuco, Brasil. CEP: 50670-420. b. Faculdade Nove de Julho, rua Doutor Adolfo Pinto, 109, Barra Funda, São Paulo, Brasil, CEP: 01156-050. c Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Prédio de Quarentena e Germoplasma, Parque Estação Biológica, W5 Norte Final, Brasília, Distrito Federal, Brasil. CEP: 70770-900. * contato: [email protected]

RESUMO

Ganoderma lucidum é um cogumelo utilizado na medicina tradicional chinesa há

milhares de anos para prevenção de diversas doenças, tais como inflamações, problemas

cardíacos, diabetes e, em pesquisas recentes, câncer. Assim como outros organismos, a

concentração nutricional e medicinal de G. lucidum varia entre linhagens. Com a finalidade

de determinar o potencial de linhagens não exploradas deste fungo, duas linhagens

brasileiras tiveram suas proteínas, açúcares totais, fenóis e β-glucanas comparadas com

duas linhagens comerciais chinesas. Os resultados mostram que a linhagem brasileira CC-

144 possui um potencial bioquímico maior do que as chinesas, podendo ser estudada e

utilizada com eficiência por fungicultores.

Palavras-chave: cogumelos, Ganoderma lucidum, bioquímica.

INTRODUÇÃO

Ganoderma lucidum (Fr.) Karst. é um

basidiomiceto pertecente à Família

Ganodermataceae, da Ordem Aphyllophorales

(Kirk et al., 2001). Seu corpo de frutificação

é chamado de “Lingzhi” na China e “Reishi”

no Japão. Por milhares de anos esse fungo tem

sido utilizado na medicina tradicional chinesa,

atraindo a atenção de pesquisadores curiosos

por entender suas propriedades

farmacológicas. O “Lingzhi” tem sido

utilizado tradicionalmente como um

revitalizador (Lu et al., 2004) e sendo

utilizado na prevenção e tratamento de

diversas doenças humanas, tanto na China

como em outros países do mundo. Há registros

de sua utilização no tratamento de asma,

diabetes, problemas cardíacos, colesterol,

inflamações, AIDS e câncer (Wasser & Weis,

1999; Lin, 2001; Shiao, 2003). Sengundo Eo

80

et al. (1999a, 1999b), G. lucidum é

administrado por via oral, sendo seguro e não

demonstrando nenhum tipo de toxicidade.

Análises bioquímicas identificaram

importantes componentes como parte da

estrutura deste fungo. Estes componentes de

alto poder farmacológico incluem

triterpenóides, proteínas, esteróides,

alcalóides, enzimas, ácidos orgânicos,

lactonas, sais minerais e ácidos graxos.

Polissacarídeos (especialmente β–D-glucanos)

são reconhecidamente agentes

anticancerígenos (Kim et al., 1999; Mizushina

et al., 1999; Vetter, 2003; Mdachi et al., 2004;

Stanley et al., 2005; Muller et al., 2006; Sliva,

2006; Wu et al., 2006; Xie et al., 2006; Liu et

al., 2007).

A qualidade e quantidade destes

princípios farmacológicos de G. lucidum

podem variar dependendo da linhagem, do

substrato ou da localização geográfica. Os

motivos para isso podem estar na nutrição

fornecida e nas condições ambientais de uma

forma geral (Wasser e Weis, 1999; Zhu et al.,

2007). Embora seja muito consumido e

cultivado na China, G. lucidum é encontrado

em praticamente todo o planeta. No Brasil,

este fungo é pouco conhecido, não fazendo

parte da cultura alimentar nacional. Apesar

disso, o constante crecimento do mercado

mundial para G. lucidum está atraindo cada

vez mais a atenção de fungicultores que estão

dispostos a investir em linhagens nativas, que

possuam potencial farmacológico tão rico

quanto às conhecidas linhagens chinesas


A técnica de cultivo Jun-Cao (Jun=

cogumelo; Cao= gramíneas) surgiu na década

de 1980, na China, e revolucionou o sistema

de produção de cogumelos desse país,

aumentando a quantidade destes fungos e

diminuindo substancialmente seu tempo de

frutificação. Essa técnica utiliza gramíneas

como base para o substrato, tornando o cultivo

mais simples e barato do que os métodos

tradicionais, que utilizam toras de madeira e

serragem. Ainda pouco conhecida no ocidente,

Jun-Cao vem despertando cada vez mais o

interesse de fungicultores, dispostos a investir

em novas tecnologias que atendam ao mercado

com mais rapidez e produtividade (Zhanxi &

Zhanhua, 1997; Urben et al., 2004). O

objetivo deste estudo foi comparar a

concentração dos principais componentes

bioquímicos (açúcares, proteínas, b-glucanas e

fenóis) de linhagens brasileiras não exploradas

com linhagens comerciais chinesas de G.

lucidum desenvolvidos pela técnica de cultivo

Jun-Cao.

MATERIAIS E MÉTODOS


Foram utilizadas quatro linhagens de

G. lucidum: duas de origem brasileira (CC-144

e CC-157) e duas chinesas (CC-22 e CC-63)

(Tabela 1), que se encontram depositadas no

Banco de Germoplasma de Cogumelos para

Uso Humano, da Embrapa Recursos Genéticos

81

e Biotecnologia (Brasília, DF, Brasil,

15º46'47"S 47º55'47"W).

Tabela 1: Procedência das linhagens de

Ganoderma lucidum utilizadas

Isolado Local Data da coleta

CC-22 China 19/02/2004

CC-63 China 10/02/2006

CC-144 Brasília, Brasil 10/02/2006

CC-157 São Paulo, Brasil 25/01/2006

O cultivo por Jun-Cao

As culturas foram semeadas em placas

de Petri contendo meio BDA (Batata-

Dextrose-Agar) e incubadas entre 28° e 30°C

até o crescimento micelial recobrir a superfície

do meio de cultivo, em aproximadamente sete

a dez dias. Em seguida, o micélio de cada

linhagem foi transferido para substrato

contendo gramínea na seguinte proporção:

capim-elefante (Pennisetum purpureum) 39%,

serragem de mangueira (Mangifera indica)

39%, farelo de arroz (Oryza sativa) 10%,

bagaço de cana-de-açúcar (Saccharum

officinarum) 10% e gesso agrícola 2%. Após

três meses de cultivo, os cogumelos

produzidos foram colhidos, desidratados,

macerados e encaminhados para análise

bioquímica.

Açúcares totais

Os açúcares foram extraídos e

analisados segundo descrito por Ajlouni et al

(1995). O pó triturado seco de G. lucidum (300

mg) foi misturado a 50ml de etanol 80% e a

suspensão foi agitada em shaker por 45

minutos na temperatura ambiente e filtrada em

papel filtro Whatman no 4. O resíduo foi

lavado cinco vezes com 5ml etanol 80% e

filtrado novamente, sendo colocado para secar

e depois redissolvido em água deionizada para

um volume final de 10ml. O extrato aquoso foi

agitado e filtrado usando um filtro Acrodisc-

CR 0.45µm para ser utilizado em

cromatografia HPLC (High performance

liquid chromatography).

Proteínas solúveis

A análise das proteínas foi feita

utilizando o teste de Lowry (Lowry et al.,

1951). Inicialmente, 10g do pó triturado de G.

lucidum foram misturados a 400ml de água

aquecida a 100ºC por 10 minutos. A mistura

foi filtrada e 1ml do sobrenadante foi

misturado com 5ml do Reagente C. Este

reagente é obtido misturando-se 0,5ml de

solução B1 com 0,5ml de solução B2 e 49ml

de solução A. A solução A é obtida diluindo-

se 20g de Na2CO3 em 1 L de NaOH 0,1 N. A

solução B1 utiliza 10g CuSO4 . 5H2O diluídos

em 1 L de água. Para a solução B2 são

necessários 20g de tartarato de sódio (ou

potássio) em 1 L de água.

A mistura de 1ml do sobrenadante

com o Reagente C foi agitada e em seguida

deixada em repouso por 10 minutos.

Adicionou-se 0,5ml de Folin Ciocalteau

(diluído 1:2 em água) e agitou-se novamente.

82

Após 30 minutos, a solução foi levada para

espectrofotômetro para leitura em 500 nm.

Fenol

O fenol foi medido pelo teste do Fenol

(Swain & Hillis, 1959). Assim como na

anaílse das proteínas, 10g do pó triturado de

G. lucidum foram misturados a 400ml de água

aquecida a 100ºC por 10 minutos. Em seguida,

1ml do sobrenadante foi misturado em 0,5ml

de Folin Ciocalteau (diluído 1:2 em água) e

agitado. Após 30 minutos de repouso

adicionou-se 1ml carbonato de sódio saturado,

completando o volume de 10ml com água. A

solução é deixada em descanso por uma hora e

avaliada em espectrofotômetro a 500 nm.

β-Glucanas

Para avaliar as β–glucanas foi adotado

o método de Mizuno et al (1999), onde o pó

do cogumelo seco foi aquecido em etanol 80%

e o resíduo foi reextraído com água, tratado

com oxalato de amônia e depois com

hidróxido de sódio 5%. O sobrenadante final

foi precipitado novamente com etanol, sendo

submetido à análise cromatográfica à 500 nm

de comprimento de onda.

Análise estatística

O experimento foi conduzido em

delineamento inteiramente casualizado com

quatro tratamentos e cinco repetições. Os

dados foram submetidos à análise de variância

(ANOVA) e as médias comparadas pelo

Tukey (α = 0,05) utilizando o programa

Statistica versão 5.1. A referência para todas

as análises será CC-22, por se tratar de uma

linhagem comercial já conhecida e utilizada na

China.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Em relação aos açúcares totais, as

linhagens chinesas mostraram maior

concentração do que as brasileiras. A CC-22

apresentou maior concentração de açúcares do

que as demais (média de 583,6 mg/g). A

linhagem CC-63 apresentou valor médio de

421,74mg/g, enquanto CC-144 e CC-157

revelaram teor médio de açúcares totais de

290,16 mg/g e 304,62 mg/g, respectivamente

(Figura 1).

0

100

200

300

400

500

600

700

CC22 CC63 CC144 CC157

Linhagens de G. lucidum

Con

cent

raçã

o to

tal d

e aç

úcar

(m

g)

Figura 1. Concentração total de açúcar entre as

linhagens chinesas (CC-22 e CC-63) e brasileiras

(CC-144 e CC-157) de Ganoderma lucidum.

Foram observadas diferenças entre

CC-22 e as linhagens brasileiras (CC-144 e

CC-157). A linhagem CC-63 revelou um

caráter intermediário, não apresentando

83

diferença significativa quando comparada às

demais linhagens.

As quatro linhagens de G. lucidum

apresentaram concentração de açúcares totais

similar a de outros cogumelos comestíveis

(Longvah & Deosthale, 1998; Diez & Alvarez,

2001; Manzi et al., 2001; Manzi et al., 2004;

Agahar-Murugkar & Subbulakshmi, 2005).

Kim et al. (2009) tentam estabelecer uma

relação entre o conteúdo total de carboidratos

entre cogumelos comestíveis e cogumelos

medicinais, comentando que cogumelos

medicinais tendem a ter metade da

concentração de carboidratos em comparação

aos comestíveis, que não foi observado nas

linhagens de G. lucidum analisadas neste

trabalho. Deste total de carboidratos há uma

pequena parte (10 – 15%) que compõe os

açúcares solúveis e a outra está dividida em

carboidratos estruturais (quitina, por exemplo),

glicogênio e outros polissacarídeos, como as

β–glucanas.

Em relação à concentração de β-

glucanas, a linhagem brasileira CC-144 se

destacou das demais, apresentando

concentração de 93,16mg/g. As linhagens

chinesas CC-22 e CC-63, e a brasileira CC-

157 apresentaram, respectiva-mente, 48,12

mg/g, 40,52mg/g e 56,54 mg/g, não havendo

diferença estatística significativa (Figura 2).

0

20

40

60

80

100

120

CC-22 CC-63 CC-144 CC-157


Con

cent

raçã

o de

b-g

luca

nas

(mg

/ g

cogu

mel

o)

Figura 2. Concentração de β-glucanas totais nas

linhagens chinesas (CC-22, CC-63) e brasileiras (CC-

144, CC-157) de Ganoderma lucidum.

Em CC-22 é possível observar que, do

total de carboidratos, 8,24% são compostos

por β–glucanas. CC-63 possui 9,6% de β–

glucanas, enquanto CC-144 contém 32,1% e

CC-157, 18,56% (Tabela 2).

Tabela 2: Concentração de carboidratos totais e β–

glucanas (mg/g de cogumelo) nos isolados de G.

lucidum

Isolado Carboidratos β-Glucanas

CC-22 583,6 48,12

CC-63 421,74 40,52

CC-144 290,16 93,16

CC-157 304,62 56,54

A concentração de proteínas solúveis

foi mais elevada em CC-144 (média 1,86

mg/g), enquanto CC-63 apresentou o resultado

mais baixo (1,28 mg/g). CC-22 e CC-157

apresentaram, respecti-vamente, 1,64 mg/g e

1,70 mg/g de proteínas. (Figura 3).

84

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

CC-22 CC-63 CC-144 CC-157


Pro

teín

as to

tais

(m

g /

g de

cog

umel

o)

Figura 3. Concentração de proteínas totais nas

linhagens chinesas (CC-22, CC-63) e brasileiras

(CC-144, CC-157) de Ganoderma lucidum, obtidas

pelo Teste de Lowry.

Geralmente cogumelos comestíveis

possuem altos teores de proteínas, em torno de

19 a 35% do peso seco, mas Ganoderma

lucidum possui teores menores, entre 7 e 8%

(Crisan & Sands, 1978). Cogumelos

medicinais, contudo, geralmente possuem

baixas concentrações protéicas, não sendo boa

fonte protéica (Mau et al, 2001). Carboidratos,

pelo contrário, estão presentes em níveis

elevados nos cogumelos medicinais, bem

como fibras e sais minerais (Kalac, 2009).

CC-157 foi a linhagem que apresentou

maior concentração média de fenóis (0,513

mg/g), sendo seguida de CC-22 (0,473 mg/g),

CC-157 (0,457 mg/g) e CC-144 (0,451 mg/g).

(Figura 4).

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

CC-22 CC-63 CC-144 CC-157


Con

cent

raçã

o de

Fen

ol (

mg

/ g

de c

ogum

elo)

Figura 4. Concentração de Fenol nas linhagens

chinesas (CC-22, CC-63) e brasileiras (CC-144,

CC-157) de Ganoderma lucidum, obtidas pelo teste

de Swain e Hillis (1959).

Tsai et al (2007) mencionam que a

concentração total de fenóis encontradas em

cogumelos comestíveis é em torno de 5 mg/g.

Os resultados obtidos correspondem a uma

quantidade cem vezes menor nas linhagens de

G. lucidum desenvolvidas com a técnica Jun-

Cao.

Os resultados apontam a linhagem

CC-144 como uma boa escolha para a

fungicultura mesmo não sendo uma linhagem

conhecida comercialmente. Além disso, estas

análises contribuem de uma maneira geral para

se ter uma idéia do perfil das linhagens

brasileiras deste basidiomiceto, servindo de

estímulo para estudos posteriores.

REFERÊNCIAS

Agahar-Murugkar, D., & Subbulakshmi, G.

Nutritional value of edible wild

mushrooms collected from the Khasi hills

85

of Meghalaya. Food Chem, 89, 599–603,

2005.

Crisan, E. V., & Sands, A. Nutritional value.

In: S. T. Chang, & W. A. Hayes, The

biology and cultivation of edible

mushrooms (pp. 137–165). New York:

Academic Press. 1978.

Diez, V. A., & Alvarez, A. Compositional and

nutritional studies on two wild edible

mushrooms from northwest Spain. Food

Chem, 75, 417–422, 2001.

Eo, S. K. et al. Antiviral activities of various

water and methanol soluble substances

isolated from Ganoderma lucidum. J

Ethnopharmacol, 68, 129–136. 1999a.

Eo, S. K. et al. Antiherpetic activities of

various protein bound polysaccharides

isolated from Ganoderma lucidum. J

Ethnopharmacol, 68, 175–181. 1999b.

Kalac, P. Chemical composition and

nutritional value of European species of

wild growing mushrooms: A review. Food

Chem. 113, 9–16, 2009.

Kim, H. S.; Kacew, S.; Lee, M. B. In vitro

chemo preventive effect of plant

polysaccharides Aloe barbadensis Miller,

Lentinus edodes, Ganoderma lucidum and

Coriolus versicolor. Carcinogenesis, 20,

1637-1640, 1999.

Kim et al. Comparison of free amino acid,

carbohydrates concentrations in Korean

edible and medicinal mushrooms. Food

Chem, 113, 386–393, 2009.

Kirk, P. M., P. F. Cannon, J. C. David, and J.

A. Stalpers. Ainsworth & Bisby’s

dictionary of the fungi. Cabi Publishing,

Wallingford, United Kingdom. 2001.

Liu, J. et al. The anti-androgen effect of

ganoderol B isolated from the fruiting

body of Ganoderma lucidum. Bioorg Med

Chem, 15, 4966 - 4972, 2007.

Longvah, T., & Deosthale, Y. G..

Compositional and nutritional studies on

edible wild mushroom from northeast

India. Food Chem, 63, 331–334, 1998.

Lu, Q. Y. et al. Ganoderma lucidum extracts

inhibit growth and induce actin

polymerization in bladder cancer cells in

vitro. Cancer Lett, 216, 9–20. 2004.

Manzi, P., Aguzzi, A. & Pizzoferrato, L.

Nutritional value of mushrooms widely

consumed in Italy. Food Chem, 73, 321–

325, 2001.

Manzi, P., Marconi, S., Aguzzi, A., &

Pizzoferrato, L. Commercial mushrooms:

Nutritional quality and effect of cooking.

Food Chem, 84, 201–206, 2004.

Mau, J. L. et al. Non-volatile components of

several medicinal mushrooms. Food Res

Int . 34 521–526, 2001.

Mdachi, S. J. M. et al. Amino acid

composition of some Tanzanian wild

mushrooms. Food Chem, 86, 179 –182,

2004.

Mizushina, Y. et al. Lucidenic acid O and

lactone, new terpentene inhibitors of

eukaryotic DNA polymerases from

86

basidiomycete Ganoderma lucidum,

Bioorg Med Chem, 7, 2047-2052, 1999.

Muller, C. I. et al. Ganoderma lucidum causes

apoptosis in leukemia, lymphoma and

multiple myeloma cells. Leuk Res, 30,

841 - 848, 2006.

Shiao, M. S. Natural products of the medicinal

fungus Ganoderma lucidum: Occurrence,

biological activities, and pharmacological

functions. The Chemical Record, 3, 172–

180. 2003.

Sliva, D. Ganoderma lucidum in cancer

research. Leuk Res, 30, 767 - 768, 2006.

Stanley, G. et al. Ganoderma lucidum

suppresses angiogenesis through the

inhibition of secretion of VEGF and TGF-

ß1 from prostate cancer cells. Biochem

Biophys Res Commun, 330, 46 - 52,

2005.

Tsai, S. Y. et al. Antioxidant properties of

Agaricus blazei, Agrocybe cylindracea and

Boletus edulis. LWT - Food Sci Technol,

40, 1392–1402, 2007.

Urben, A. F. Produção de cogumelos por

meio de tecnologia chinesa modificada.

Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e

Desenvolvimento, 2004.

Vetter, J. Data on sodium content of common

edible mushrooms. Food Chem, 81, 589–

593, 2003.

Wasser, S. P., & Weis, A. L. Medicinal

properties of substances occurring in

higher basidiomycetes mushrooms. Int J

Med Mush, 1, 31–62. 1999.

Wu, Q. P. et al. Tumour cell adhesion and

integrin expression affected by

Ganoderma lucidum. Enzyme Microb

Technol, 40, 32 - 41, 2006.

Xie, Y. Z. et al. Ganoderma lucidum inhibits

tumour cell proliferation and induces

tumour cell death. Enzyme Microb

Technol, 40, 177 - 185, 2006.

Zhanxi, L.; Zhanhua, L. Jun-Cao

Technology. Fuzhou: Asia-Pacific

Fungi Cultivation training Center.

1997.

Zhu, X. L.; Chen, A. F.; Lin, Z. B.

Ganoderma lucidum polysaccharides

enhance the function of immunological

effector cells in immunosuppressed

mice. J Ethnopharmacol, 111, 219 -

226, 2007.

ARTIGO 3

(A ser encaminhado para a revista Microbiological Research, classificada como Qualis A

pela CAPES e cujo fator de impacto é de 0,798)

* Autor para correspondência: [email protected] 88

Uso de Marcadores Moleculares RAPD na Diferenciação de

Linhagens Brasileiras e Chinesas de Ganoderma lucidum Leonardo do Nascimento Rolim 1,*, Maria Auxiliadora de Queiroz Cavalcante 1, Arailde Fontes Urben 2, Glaucia Salles Cortopassi Buso 2. 1 Universidade Federal de Pernambuco, Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Micologia, Cidade Universitária, Recife, Pernambuco, Brasil. CEP: 50670-420. 2 Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Prédio de Quarentena e Germoplasma, Parque Estação Biológica, W5 Norte Final, Brasília, Distrito Federal, Brasil. CEP: 70770-900. RESUMO Ganoderma lucidum é um cogumelo medicinal que tem sido utilizado no combate a diversas doenças humanas, como câncer e outras. Várias técnicas moleculares têm sido utilizadas para analisar a diversidade genética em Ganoderma, sendo o RAPD ainda uma das opções mais baratas e rápidas, especialmente em análises intraespecíficas. Com o objetivo de selecionar marcadores moleculares RAPD para Ganoderma lucidum, linhagens brasileiras e comerciais chinesas foram analisadas. Uma matriz de similaridade foi elaborada e os perfis RAPD das linhagens G. lucidum também foram comparados com outras duas espécies de Ganoderma: G. applanatum e G. lipsiense para estabelecer a similaridade genética entre as espécies. Com base nos primers utilizados foi possível determinar que as linhagens brasileiras CC-144 e CC-157 assemelham-se à chinesa CC-22. O método e a seleção de primers mostraram-se pertinentes para a identificação genética entre linhagens de G. lucidum, podendo ser aperfeiçoada e utilizada em pesquisas e comércio. Palavras-chave: Ganoderma lucidum, diversidade genética, RAPD

INTRODUÇÃO Ganoderma lucidum (Fr.) Karst. (Ganodermataceae) é um basidiomiceto popular na medicina tradicional chinesa, também utilizado em outros países, como Japão e Estados Unidos, como suplemento alimentar. No Brasil, embora pouco explorado, este fungo é conhecido como Cogumelo Rei, sendo consumido como suplemento alimentar (Mau et al., 2001). Estudos feitos em G. lucidum revelaram diversas propriedades biológicas como atividade antitumoral, antiinflamatória, antiviral (anti-HIV) e antibacteriana. Seus efeitos farmacêuticos têm sido estudados

no combate a diversos tipos de doenças humanas tais como hepatite, hipertensão, distúrbios cardíacos, artrite, bronquite, tumores, diabetes e insônia, dentre outras (Kim, 1987; Nogami, 1987; Kim et al., 1995; El-Mekkawy et al., 1998; Eo et al., 1999; Wasser e Weis, 1999; Hsieh et al., 2005; Lakshmi et al., 2006; Tang et al., 2006; Chu et al., 2007; Li et al., 2007; Zhu et al., 2007). Tradicionalmente, a taxonomia do gênero Ganoderma é baseada em características morfológicas. Embora sejam úteis na diferenciação entre espécies, existem dificuldades para distinguir grupos muito próximos, tais como populações ou linhagens de uma espécie. Segundo Zheng

89

et al. (2007), fatores ambientais, variabilidade, inter-hibridização e propensões morfológicas individuais dificultam identificações precisas para espécies de Ganoderma. Contudo o surgimento de técnicas utilizando marcadores moleculares facilitou a identificação não apenas de espécies de Ganoderma como dos demais organismos, cuja taxonomia encontrava-se nas mesmas dificuldades. Atualmente, a utilização do DNA como uma ferramenta de identificação permitiu diferenciar subgrupos, tais como as diversas linhagens de G. lucidum, facilitando a distinção principalmente entre linhagens comerciais e de interesse industrial (Zheng et al., 2007). Várias técnicas de estudos moleculares têm sido utilizadas para analisar a diversidade genética em basidiomicetos, como isoenzimas (Lan et al., 1998), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorfism, Qi et al., 2003), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism, Park et al., 1996), ITS (Internal Transcribed Spacers, Kindermann et al., 1998) e RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA, Wang et al., 2003). Dentre essas técnicas, o RAPD é ainda uma das opções mais baratas e rápidas para acessar a variabilidade no nível do DNA, sendo especialmente útil em análises intraespecíficas. Estes marcadores têm a vantagem de amplificar tanto regiões do genoma que podem ser transcritas e/ou traduzidas, como regiões não codificantes. Isto é importante quando o objetivo é avaliar a variação ao longo da maior parte do genoma da espécie (Williams et al., 1990; Ferreira & Grattapaglia, 1996; Ro et al., 2007). Por outro lado, o RAPD é criticado pela baixa repetibilidade experimental, embora esse problema possa ser contornado com a utilização de muitos primers e de critérios mais rígidos (repetições múltiplas em busca de um padrão, por exemplo) no momento da interpretação dos resultados (Carvalho e Vieira, 2001). Este trabalho teve como objetivo selecionar marcadores moleculares do tipo

RAPD para Ganoderma lucidum, avaliando o padrão de similaridade genética entre linhagens brasileiras e linhagens comerciais chinesas. MATERIAIS E MÉTODOS Linhagens de Ganoderma lucidum Foram utilizadas quatro linhagens de G. lucidum: duas de origem brasileira (identificadas como CC-144 e CC-157) e duas chinesas (CC-22 e CC-63) (Tabela 1), que se encontram depositadas no Banco de Germoplasma de Cogumelos para Uso Humano, da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Brasília – DF, Brasil, 15º46'47"S 47º55'47"W). Além destas foram utilizadas amostras de duas outras espécies de Ganoderma: G. applanatum e G. lipsiense (procedentes da China) para se estabelecer comparações genéticas à nível de espécie. Tabela 1: Procedência das linhagens de Ganoderma lucidum utilizadas Isolado Local Data da

coleta CC-22 China 19/02/2004 CC-63 China 10/02/2006

CC-144 Brasília, Brasil 10/02/2006 CC-157 São Paulo, Brasil 25/01/2006

Extração do DNA

Os fungos foram retirados dos tubos-matriz e crescidos em placas de Petri contendo BDA (20% Batata, 2% Dextrose, 1,5% Agar), por um período de sete dias, em plena escuridão, com temperatura média 28 ºC e UR 82%. Cada isolado foi transferido para meio liquido BD a 28 ºC por duas semanas. O micélio foi centrifugado a 3.000 rpm por 10 minutos, lavado com água esterilizada e levemente pressionados em filtro de papel. As linhagens foram transferidas para tubos Eppendorf (1,5ml) onde foram maceradas em nitrogênio liquido e tratadas com 1ml de tampão de extração (1M Tris-HCl pH 8, 0,5M EDTA pH 8, 10% SDS, 5M NaCl) (Raeder e Broda, 1985) e incubadas por 1 hora a 65 ºC. Em seguida, foi adicionado um volume de

90

solução fenol, misturando suavemente as fases e centrifugando logo em seguida a 10.000 rpm por 15 minutos. A fase aquosa foi recuperada e transferida para novos tubos, sendo adicionado um volume de solução clorofórmio e álcool isoamílico v/v 24:1. Em seguida houve nova mistura de fases e nova centrifugação a 10.000 rpm por 15 minutos, no qual o sobrenadante foi recuperado e transferido para novos tubos, nos quais foram adicionados um volume de NaCl 1M e dois volumes de etanol resfriado a -20 ºC. Após nova centrifugação a 14.000 rpm por 15 minutos, o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi lavado com etanol 70%. Os microtubos foram secos e o material foi ressuspendido em 20 µl de tampão TE (1M Tris-HCl pH 8, 0,5M EDTA pH 8). As amostras tiveram a concentração de DNA avaliada em gel de agarose 1,5% e estocadas a -80 ºC. Análise RAPD O DNA das linhagens foi amplificado por RAPD conforme Williams et al. (1990), utilizando 48 primers de seqüência arbitrária da Operon Technologies Inc. (Alameda, CA, EUA), com tamanho médio de 10 bases: OPAB-02, OPAB-14, OPAB-18, OPAB-19, OPA-02, OPA-05, OPA-07, OPA-11, OPA-12, OPA-17, OPA-18, OPB-02, OPB-05, OPB-06, OPB-09, OPB-10, OPB-11, OPC-02, OPC-18, OPC-19, OPD-02, OPD-04, OPD-07, OPD-20, OPE-04, OPE-06, OPE-08, OPF-01, OPF-02, OPF-06, OPF-08, OPF-12, OPG-04, OPG-15, OPH-12, OPO-15, OPO-19, OPR-02, OPR-08, OPR-09, OPR-10, OPR-12, OPR-19, OPR-20, OPU-01, OPV-08, OPW-18 e OPX-20. As reações foram conduzidas em termociclador PTC-100 (MJ Research Thermal cycler) utilizando-se um programa com os seguintes passos: (1º) desnaturação do DNA a 96ºC por 3 minutos e (2º) a 92ºC por 1 minuto; (3º) anelamento do primer a 35ºC por 1 minuto; (4º) extensão da molécula pela enzima Taq polimerase (Amersham Pharmacia Biotech) a 72ºC por 2 minutos; (5º) 40 ciclos seguindo do 2º ao 4º passos; (6º) passo final de extensão de 5 minutos a 72ºC para finalizar os produtos

amplificados. Para a amplificação das amostras foram utilizados os seguintes componentes, em um volume final de 13 µl: 3,0 µl de DNA genômico a 3,00 ng/µl; 4,92 µl de água milli-Q autoclavada; 1,30 µl Tampão 10X para Taq DNA Polimerase; 1,04 µl de dNTP 2,5 mM; 1,04 µl de BSA 2,5 mM; 1,5 µl de primer 10ng/µl e 0,2 µl de enzima Taq DNA Polimerase. As amostras de DNA amplificado foram separadas em gel agarose 1,5% (120 volts por 4 horas), em tampão TAE 1x, utilizando-se o marcador de peso molecular o 1 kb DNA ladder (Life Technologies, Cergy-Pontoise, France) como referência. O gel foi corado com brometo de etídio, observado em transluminador sob luz UV e fotografado em foto-documentador modelo Eagle Eye II (Stratagene). Foram feitas três repetições da RAPD, sendo uma apenas com as linhagens de G. lucidum, outra idêntica à primeira com a adição da espécie G. applanatum, e ainda uma terceira, onde se usou G. lipsienses. Análise pós-RAPD

Os primers selecionados que apresentaram um melhor padrão de bandas foram utilizados para a construção de uma matriz de similaridade entre os pares de isolados, com base no cálculo do coeficiente de similaridade de Jaccard (Si,j) (Dias, 1998), codificando a presença da banda no gel como 1 e a sua ausência como 0. O coeficiente de Jaccard (Sij) entre pares de linhagens é dado por Sij = a / (a +b + c), onde “a” é o número de marcas positivas concordantes entre isolados i e j, enquanto que “b” e “c” são os números de loci presentes apenas em cada um dos isolados. Valores de Sij próximos a 1,0 indicam elevada semelhança genética entre as linhagens. A fim de representar graficamente o padrão de divergência genética, a matriz de similaridade foi submetida a uma análise de agrupamento do tipo UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Using Arithmetic Average), utilizando o programa NTSYS (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System) versão 2.1. Neste método, o

91

critério utilizado para a formação dos grupos é a média das distâncias entre todos os pares de itens que formam cada grupo primer. A distância intergrupo é a média das distâncias pareadas dos membros dos dois grupos (Dias, 1998).

Os dados binários gerados a partir da observação em gel foram utilizados em procedimento computacional de reamostragem sobre os loci (bootstrap). Tal procedimento consiste em reamostrar os loci da matriz de dados, com reposição, recalculando as estatísticas desejadas diversas vezes, testando, desta forma, a estabilidade das distâncias genéticas obtidas por RAPD. Para isso, foram realizadas 4.000 replicações a partir do método de permutação Monte Carlo. As permutações pelo método Monte Carlo produzem valores de dissimilaridade simulados, obtidos a partir de matrizes de dados geradas por meio da relocação dos valores originais das amostras (Manly 1997). Apenas quando o índice de similaridade dos dados originais (i.e., sem

simulação) é significativamente mais alto do que o índice obtido depois das permutações, a similaridade genética é considerada significativa (nível de significância adotado, α = 0,05). As permutações foram realizadas com o uso do software RandMat versão 1.0 para Windows. RESULTADOS E DISCUSSÃO Todas as linhagens mostraram resultado positivo na formação de bandas em gel de agarose, segundo a técnica utilizada para a análise RAPD. Dos 48 primers testados, 20 não amplificaram ou não mostraram um bom padrão de amplificação. Os 28 primers restantes mostraram um bom padrão de amplificação e apresentaram um total de 512 loci, sendo 323 polimórficos. O número médio de loci encontrado foi de 18,28, sendo o mínimo de 11 e o máximo de 26 loci por analisado (Tabela 2).

Tabela 2. Relação do número de loci e do número de loci polimórficos por primer eficiente na análise RAPD das linhagens de Ganoderma lucidum

Primers Seqüência 5’ – 3’ No de loci No de loci polimórficos OPAB-14 AAGTGCGACC 17 14 OPA-05 AGGGGTCTTG 17 11 OPA-07 GAAACGGGTG 24 20 OPA-11 CAATCGCCGT 18 10 OPA-12 TCGGCGATAG 24 14 OPB-05 TGCGCCCTTC 26 24 OPB-06 TGCTCTGCCC 16 12 OPC-18 TGAGTGGGTG 21 16 OPC-19 GTTGCCAGCC 16 13 OPD-04 TCTGGTGAGG 11 06 OPD-20 ACCCGGTCAC 19 17 OPE-06 AAGACCCCTC 19 10 OPE-08 TCACCACGGT 16 10 OPF-01 ACGGATCCTG 17 04 OPF-02 GAGGATCCCT 12 05 OPF-08 GGGATATCGG 17 09 OPF-12 ACGGTACCAG 20 09 OPG-15 ACTGGGACTC 22 10 OPH-12 ACGCGCATGT 17 10 OPO-15 TGGCGTCCTT 18 04 OPO-19 GGTGCACGTT 17 10 OPR-08 CCCGTTGCCT 15 08 OPR-09 TGAGCACGAG 19 10 OPR-12 ACAGGTGCGT 16 04 OPR-19 CCTCCTCATC 14 13 OPR-20 ACGGCAAGGA 17 12 OPV-08 GGACGGCGTT 24 17 OPW-18 TTCAGGGCAC 23 21 TOTAL 512 323

92

A presença e ausência de bandas foi registrada em planilha e utilizadas para a montagem de uma matriz de similaridade. Ocorreram eventuais bandas cuja nitidez foi menor que as demais, porém não comprometendo a estrutura do dendrograma gerado, pois apenas as bandas que permaneceram após repetição foram consideradas para o estudo. As primeiras comparações feitas com base nos 28 primers indicaram que as linhagens brasileiras CC-144 e CC-157 são as mais próximas entre si, com valor de similaridade de Jaccard de 0,798. Em comparação com as linhagens chinesas, o grupo formado pelas brasileiras se aproximou mais da linhagem CC-22 (SiJ = 0,721), mantendo uma semelhança genética menor em relação à CC-63 (SiJ = 0,52).

A análise bootstrap, que tem sido utilizada em genética de populações para avaliar a estabilidade dos agrupamentos obtidos a partir de distâncias genéticas e para estabelecer intervalos de confiança em modelos de desdobramento de variância e estrutura populacional (Weir, 1990; Meyer, 1995; Hillis et al., 1996; Manly, 1997), revelou que CC-63 é a única linhagem cuja RAPD mostrou-se imprecisa para a determinação da similaridade genética entre as linhagens estudadas. Pelo dendrograma é possível verificar que a divergência genética de CC-63 com as demais está dentro da área de imprecisão gerada pela análise de reamostragens simuladas (Jaccard 0,43 a 0,6). Tal resultado implica dizer que o ponto de divergência genética de CC-63 com as demais linhagens pode oscilar dentro da área informada. Nas outras linhagens a similaridade genética e os pontos de divergência foram estatisticamente significativos, demonstrando um resultado estável entre CC-22, CC-144 e CC-157.

Esses resultados mostram que as linhagens CC-22, CC-144 e CC-157 de G. lucidum podem ser diferenciadas por RAPD com os primers listados na Tabela 2. Hseu et al. (1996) reforçam a eficácia do processo, submetendo também linhagens

de G. lucidum a RAPD e observando a solidez de seus marcadores. Segundo o autor, a técnica pode ser aplicada na diferenciação de linhagens e populações de uma mesma espécie, mas sendo de pouca precisão quando se trabalha com grandes grupos taxonômicos.

RAPD pode não ser de muita utilidade quando aplicada com objetivo de tentar definir filogenias muito elaboradas, envolvendo grandes grupos taxonômicos, mas seus resultados são reconhecidos quando grupos específicos são estudados (Welsh et al., 1992; Duncan et al., 1993; Hamelin et al., 1993; Kazan et al., 1993; Van der Vlugt-Bergmans et al., 1993; Liew et al., 1994; Manulis et al., 1994; Laroche et al., 1995).

Ro et al. (2007) também encontraram bons resultados quando recorreram a RAPD para diferenciar linhagens de Pleurotus eryngii. A técnica já foi utilizada para estudos com Verticillium fungicola, com excelentes resultados (Del Carmen et al., 2002; Largeteau et al., 2006) e por outros pesquisadores para trabalhos com diversos outros organismos, sempre diferenciando grupos taxonômicos muito próximos (Muok et al., 2007; Tang et al., 2007; Rajwana et al., 2008; Shah et al., 2008; Solouki et al., 2008; Venkatachalam et al., 2008). Os primers usados neste estudo, entretanto, não foram suficientes para dar precisão na distância genética da CC-63 (linhagem chinesa) e neste caso se sugere outro conjunto de primers para analisar ou completar a diferenciação.

Os perfis RAPD das linhagens G. lucidum também foram comparados com G. applanatum e G. lipsiense. A análise, com os 28 primers utilizados, resultou em 590 loci para G. applanatum, dos quais 440 foram polimórficos em relação às linhagens de G. lucidum, enquanto que G. lipsienses revelou 597 loci, onde 446 foram polimórficos quando comparados com os loci das linhagens de Ganoderma lucidum utilizadas. Esses resultados foram confrontados para se estabelecer uma similaridade genética à nível de gênero entre os isolados estudados (Figura 1).

93

Figura 1 – Dendrograma mostrando a similaridade genética entre linhagens chinesas (CC-22 e CC-63), brasileiras (CC-144 e CC-157) de G. lucidum, G. applanatum (G.a.) e G. lipsienses (G.l.) após análise RAPD. A área compreendida entre as colunas A e B determina um espaço de imprecisão na análise genética, informando que a distância genética entre CC-63 e as demais linhagens pode oscilar dentro dos limites observados.

Estes resultados mostram que tanto G. applanatum quanto G. lipsiense mostraram-se mais distantes geneticamente em relação às linhagens de G. lucidum (Jaccard 0,371), como esperado, por se tratarem de espécies diferentes. As demais linhagens de G. lucidum mantiveram-se estáveis, e CC-63 continuou dentro da área de imprecisão. Desta forma é possível observar que as análises RAPD utilizadas mantêm evidente divergência de espécies e pode ser aplicada na diferenciação de linhagens dentro de uma mesma espécie.

Estudos como este, que buscam desenvolver padrões a partir de perfis genéticos obtidos por meio de técnicas RAPD são elaborados com pouca freqüência quando se trata de G. lucidum (Hseu et al., 1996; Hseu et al., 1996b; Tang et al., 2005; Singh et al., 2005; Ro et al., 2007). A maior dificuldade na aplicação da técnica em estudos com sistemática está na extrema sensibilidade e na mecânica da RAPD. Perfis genéticos podem sofrer variações dependendo do modo como a

94

análise é realizada, mas apesar disso é possível obter resultados reprodutíveis por meio de repetições, uma vez que padrões começam a ser desenhados por meio desse processo. Diversos trabalhos estudam as oscilações em RAPD, mas são unânimes no fato de que ela pode ser utilizada desde que o pesquisador encontre um padrão por meio de repetições (Ellsworth et al., 1993; Muralidharan & Wakeland, 1993; Leal et al., 1994; Tommerup et al., 1995; Hseu et al., 1996; Moore et al., 2001; Utomo et al., 2005; Ercisli et al., 2007; Jones et al., 2008; Kim et al., 2008). No caso deste estudo, a análise foi repetida três vezes de modo a obter um padrão no comportamento das bandas. As observações sobre similaridade genética entre linhagens brasileiras e chinesas, realizadas neste estudo, contribuem para o quadro molecular do gênero Ganoderma, sugerindo relações genéticas entre espécies e linhagens, independentemente da distância geográfica e permitindo que a utilização da RAPD por parte de pesquisadores e indústria possa estimar comparações com custos reduzidos. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) e à Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Embrapa – Cenargen) pelo suporte financeiro, aquisição de conhecimento e suporte técnico. ABSTRACT Ganoderma lucidum is a medicinal mushroom that has been used against various types of human diseases such as cancer. Several molecular techniques have been used to analyze genetic diversity in Ganoderma, however, RAPD is still one of the cheapest and quickest options and is particularly useful in intraspecific analyses. To select RAPD markers for G. lucidum, native Brazilian and commercial Chinese strains were analyzed. A similarity matrix

was elaborated and the RAPD profiles of G. lucidum strains were also compared with two other species of Ganoderma: G. applanatum and G. lipsiense, to evaluate genetic similarity among species. Based on the primers used in these studies, was determined that Brazilian CC-144 and CC-157 strains are similar to the Chinese CC-22 strains. The method and selection of primers have proved relevant to the genetic identification between strains of G. lucidum and can be refined and used in research and market. REFERENCIAS Carvalho, A. O. R.; Vieira, L. G. E. (2001),

Determinação das Condições Ótimas para Análises de PCR-RAPD em Atta sexdens rubropilosa Forel (Hymenoptera: Formicidae). Neotrop Entomol., 30(4), 593-600.

Chu, Q. P.; Wang, L. E.; Cui, X. Y.; Fu, H. Z.; Lin, Z. B.; Lin, S. Q.; Zhang, Y. H. (2007), Extract of Ganoderma lucidum Potentiates Pentobarbital-Induced Sleep via a GABAergic Mechanism. Pharmacol Biochem Behav., 86, 693-698.

Colauto, N. B.; Dias, E. S.; Gimenes, M. A.; Eira, A. F. (2002), Genetic Characterization of Isolates of the Basidiomycetes Agaricus blazei by RAPD. Braz J Microbiol., 33, 131-133.

Del Carmen, S. J.; Largeteau-Mamoun, M. L.; Rousseau, T.; Regnault-Roger, C.; Savoie, J. M. (2002), Genetic and physiological variation in isolates of Verticillium fungicola causing dry bubble disease of the cultivated button mushroom, Agaricus bisporus, Mycol Res., 106, 1163-1170.

Dias, L. A. S. (1998), Análises Multidimensionais. In: Alfenas, A. C. Eletroforese de Isoenzimas e Proteínas Afins: Fundamentos e Aplicações em Plantas e Microrganismos. Viçosa, UFV.

Duncan, S., J. E. Barton, and P. O’Brien. (1993), Analysis of variation in isolates of Rhizoctonia solani by random amplified polymorphic DNA assay. Mycol Res., 97, 1075–1082.

95

El-Mekkawy, S.; Meselhy, M. R.; Nakamura, N.; Tezuka, Y.; Hattori, M.; Kakiuchi, N.; Shimotohno, K.; Kawahata, T.; Otake, T. (1998), Anti-HIV-1 and anti-HIV-1-protease Substances from Ganoderma lucidum, Phytochemistry, 49, 1651-1657.

Ellsworth, D. L., K. D. Rittenhouse, and R. L. Honeycutt. (1993), Artifactual variation in randomly amplified polymorphic DNA banding patterns. Bio Techniques, 14, 214–216.

Eo, S.K.; Kim, Y. S.; Lee, C. K.; Han, S. S. (1999), Antiherpect Activities of Various Protein Bound Polysaccarides Isolated from Ganoderma lucidum. J Ethnopharmacol., 68, 129-136.

Ercisli, S.; Agar, G.; Orhan, E.; Yildirim, N.; Hizarci, Y. Interspecific variability of RAPD and fatty acid composition of some pomegranate cultivars (Punica granatum L.) growing in Southern Anatolia Region in Turkey. Biochem System Ecol., 35, 764-769.

Ferreira, M. E.; Grattapaglia, D. (1996), Introdução ao Uso de Marcadores Moleculares em Análise Genética. Brasília: Embrapa Cenargen, 220p.

Hamelin, R. C., G. B. Ouellette, and L. Bernier. (1993), Identification of Gremmeniella abietina races with random amplified polymorphic DNA markers. Appl Environ Microbiol., 59, 1752–1755.

Hillis, D. M.; Moritz, C.; Mable, B. K. (1996), Molecular Systematics. Massachusetts: Sinauer Associates.

Hseu, R. S.; Wang, H. H.; Wang, H. F.; Moncalvo, J. M. (1996), Differentiation and Grouping of Isolates of the Ganoderma lucidum Complex by Random Amplified Polymorphic DNA-PCR Compared with Grouping on the Basis of Internal Transcribed Spacer Sequences. Appl Environ Microbiol., 62(4), 1354-1363.

Hse, R. S.; Moncalvo, J. M.; Wang, H. F.; Wang, H. H. (1996), Application of PCR-Amplified DNA differentiate the Ganoderma isolates. J Chin Agric Chem Soc., 34(2), 129-143.

Hsieh, C.; Hsu, T.; Yang, F. (2005), Production of Polysaccharides of Ganoderma lucidum (CCRC36021) by Reusing thin Stillage. Process Biochem., 40, 909-916.

Jones, T. C.; Gemmill, C. E. C.; Pilditch, C. A. (2008), Genetic variability of New Zealand seagrass (Zostera muelleri) assessed at multiple spatial scales. Aquatic Botany, 88, 39–46.

Kazan, K., J. M. Manners, and D. F. Cameron. (1993), Genetic relationships and variation in the Stylosanthes guianensis species complex assessed by random amplified polymorphic DNA. Genome, 36, 43–49.

Kim, B. K. (1987), Pharmacological Efficacy of G. lucidum. Korean J Pharmacogn., 18, 58-60.

Kim, S. W.; Kim, E. S.; Kim, Y. S. (1995), Studies on the Polysaccaride Extract from Ganoderma lucidum. J Korean Soc Food Nutr., 24, 147-153.

Kim, C.; Na, H. R.; Choi, H. (2008), Genetic diversity and population structure of endangered Isoetes coreana in South Korea based on RAPD analysis. Aquatic Botany, 89, 43–49.

Largeteau, M. L.; Baars, J. P. P.; Regnault-Roger, C.; Savoie, J. M. (2006), Molecular and physiological diversity among Verticillium fungicola var. fungicola. Mycol Res., 110, 431-440

Lakshmi, B.; Ajith, T. A.; Nayana, J.; Janardhanan, K. K. (2006), Antimutagenic Activity of Methanolic Extract of Ganoderma lucidum and its Effect on Hepatic Damage caused by Benzo[a]pyrene. J Ethnopharmacol., 107, 297-303.

Lan, J.; Xu, J. T.; Wang, Q. Y. (1998), Electrophoretic Studies on Esterase and Peroxidase Isozymes in Ganoderma sp. Chin Pharm J., 33, 12-14.

Largeteau, M. L.; Baars, J. P. P.; Regnault-Roger, C.; Savoie, J. M. (2006), Molecular and Physiological Diversity among Verticillium fungicola var. fungicola. Mycol Res., 110, 431-440.

Laroche, A., D. A. Gaudet, G. B. Schaalje, R. S. Erickson, and J. Ginns. (1995),

96

Grouping and identification of low temperature basidiomycetes using mating, RAPD and RFLP analyses. Mycol Res., 99, 297–310.

Leal, S. C. M., D. J. Bertioli, T. M. Butt, and J. F. Pederby. (1994), Characterization of isolates of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae by RAPD-PCR. Mycol Res., 98, 1077–1081.

Li, X. L.; Zhou, A. G.; Li, X. M. (2007), Inhibition of Lycium barbarum Polysaccharides and Ganoderma lucidum Polysaccharides against Oxidative Injury Induced by c-irradiation in Rat Liver Mitochondria. Carbohydr Polym., 69, 172-178.

Liew, E. C. Y., and J. A. G. Irwin. (1994), Comparative studies on Phytophthora megasperma isolates from chickpea collected in Australia and in Spain. Mycol Res., 98, 1284–1290.

Manly, B.F.J. (1997), Randomization, bootstrap and Monte Carlo methods in biology. Chapman & Hall, London.

Manulis, S., L. Valinsky, A. Lichter, and D. W. Gabriel. (1994), Sensitive and specific detection of Xanthomonas campestris pv. pelargonii with DNA primers and probes identified by random amplified polymorphic DNA analysis. Appl Environ Microbiol., 60, 4094–4099.

Mau, J.; Lin, H.; Chen, C. (2001), Non-volatile Components of Several Medicinal Mushrooms. Food Res Int., 34, 521-526.

Meyer, D. (1995), Árvores Evolutivas Humanas: Uma Discussão sobre Inferência Filogenética. Série Monografias, v. 3. Ribeirão Preto: Sociedade Brasileira de Genética.

Kindermann, J.; El-Ayouti, Y.; Samuels, G. J. Kubicek, C. P. (1998), Phylogeny of the Genus Trichoderma Based on Sequence Analysis of the Internal Transcribed Spacer Region 1 of the rDNA Cluster. Fungal Genet Biol, 24, 298-309.

Moore, A. J.; Challen, M. P.; Warner, P. J.; Elliott, T. J. RAPD discrimination of

Agaricus bisporus mushroom cultivars. Appl Microbiol Biotechnol., 55, 742–749.

Muok, B. O.; Matsumura, A.; Ishii, T.; Odee, D. W. (2007), Genetic diversity within Sclerocarya birrea populations in Kenya. J Arid Env., 71, 1–11.

Muralidharan, K., and E. K. Wakeland. (1993), Concentration of primer and template qualitatively affects products in random-amplified polymorphic DNA PCR. BioTechniques, 14, 362–363.

Nogami, M. (1987), Anti-allergy Activity of Ganoderma lucidum. Korean J Pharmacogn., 18, 56-58.

Park, D. S.; Ryu, Y. J. (1996), The Genetic Relationship Analysis of Ganoderma spp. Using the PCR-RFLP and RAPD. RDA J Agric Sci Biotechnol., 38, 251-260.

Qi, J. J.; Ma, R. C.; Chen, X. D.; Lan, J. (2003), Analysis of Genetic Variation in Ganoderma lucidum after Space Flight. Adv Space Res., 31, 1617-1622.

Raeder, U.; Broda, P. (1985), Rapid Preparation of DNA from Filamentous Fungi. Lett Appl Microbiol.. 1, 17-20.

Rajwana, I. A,; Tabbasam, N.; Malik, A. U.; Malik, S. A.; Rahman, M.; Zafar, Y. (2008), Assessment of genetic diversity among mango (Mangifera indica L.) genotypes using RAPD markers. Sci Hort., 117, 297–301.

Ro, H.; Kim, S. S.; Ryu, J. S.; Jeon, C.; Lee, T. S.; Lee, H. (2007), Comparative Studies on the Diversity of the Edible Mushroom Pleurotus eringii: ITS Sequence Analysis, RAPD Fingerprinting, and Physiological Characteristics. Mycol Res., 111, 710-715.

Shah, A.; Li, D. Gao, L.; Li, H.; Moller, M. (2008), Genetic diversity within and among populations of the endangered species Taxus fauna (Taxaceae) from Pakistan and implications for its conservation. Biochem System Ecol., 36, 183-193.

Singh, S. K.; Rai, R. D.; Kamal, S. (2005), Molecular Identification of Some Medicinally Important Aphyllophorales Mushrooms Based on ITS rDNA

97

Sequences and RAPD data. Int J Med Mushr., 7(4), 565-572.

Solouki, M.; Mehdikhani, H.; Zeinali, H.; Emamjomeh, A. A. (2008), Study of genetic diversity in Chamomile (Matricaria chamomilla) based on morphological traits and molecular markers. Sci Hort., 117, 281–287.

Tang, C. H.; Zhang, J. S.; Chen, M. J.; Tan, Q.; Cao, H.; Xu, W.; Pan, Y. J. (2005), Preliminary Study on Genetic Diversity among Ten Strains of Ganoderma. J Nanjing Agric Univ., 28(2), 133-136.

Tang, W.; Liu, J. W.; Zhao, W. M.; Wei, D. Z.; Zhong, J. J. (2006), Ganoderic Acid T from Ganoderma lucidum Mycelia Induces Mitochondria Mediated Apoptosis in Lung Cancer Cells. Life Sci., 80, 205-211.

Tang, S.; Li, Y.; Geng, Y.; Zhang, G.; Wang, L.; Zhong, Y. (2007), Clonal and spatial genetic structure in natural populations of Luohanguo (Siraitia grosvenorii), an economic species endemic to South China, as revealed by RAPD markers. Biochem System Ecol., 35, 557-565.

Tommerup, I. C., J. E. Barton, and P. A. O’Brien. (1995), Reliability of RAPD fingerprinting of three basidiomycete fungi, Laccaria, Hydnangium and Rhizoctonia. Mycol Res., 99, 179–186.

Utomo, C.; Werner, S.; Niepold, F.; Deising, H. B. Identification of Ganoderma, the causal agent of basal stem rot disease in oil palm using a molecular method. Mycopathologia, 159, 159–170.

Van der Vlugt-Bergmans, C. J. B., B. F. Brandwagt, J. W. Van’t Klooster, C. A. M. Wagemakers, and J. A. L. Van Kan. (1993), Genetic variation and segregation of DNA polymorphisms in Botrytis cinerea. Mycol Res., 97, 1193–1200.

Venkatachalam, L.; Sreedhar, R. V.; Bhagyalakshmi, N. (2008), The use of genetic markers for detecting DNA polymorphism, genotype identification and phylogenetic relationships among banana cultivars. Mol Phyl Evo., 47, 974–985.

Wang, S. Z.; Bai, C.; Fan, J.; Gao, Y.; Yang, J. F.; Yang, Y. J. (2003), A Study on the RAPD Analysis of Ganoderma lucidum and Pleurotus ostreatus Protoplast Fusant Genome. Acta Edulis Fungi, 10,1-5.

Wasser, S. P.; Weis, A. L. (1999), Therapeutic Effects of Substances Occurring in Higher Basidiomycetes Mushrooms: A Modern Perspective. Crit Rev Immunol., 19, 65-96.

Weir, B. W. (1990), Genetic Data Analysis: Methods for Discrete Population Genetic Data. Sunderland: Sinauer.

Welsh, J., C. Pretzman, D. Postic, I. Saint Girons, G. Baranton, and M. McClelland. (1992), Genomic fingerprinting by arbitrarily primed polymerase chain reaction resolves Borrelia burgdorferi into three distinct phyletic groups. Int J Syst Bacteriol., 42, 370–377.

Williams, J. G. K.; Kubelic, A. R.; Livak, K. J.; Rafalski, J. A.; Tingey, S. V. (1990), DNA Polymorphisms Amplified by Arbitrary Primers are Usefull as Genetic Markers. Nucleic Acids Res., 18, 6531-6535.

Zakaria, L.; Kulaveraasingham, H.; Guan, T. S.; Abdullah, F.; Wan, H. Y. (2005), Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) and Random Amplified Microsatellite (RAMS) of Ganoderma from Infected Oil Palm and Coconut Stumps in Malaysia. Asia Pac J Mol Biol Biotechnol., 13(1), 23-24.

Zheng L, Jia, D.; Fei, X.; Luo, X.; Yang, Z. (2007), An Assessment of the Genetic Diversity within Ganoderma Strains with AFLP and ITS PCR-RFLP. Microbiol Res., doi:10.1016/j.micres.2007.02.002

Zhu, X. L.; Chen, A. F.; Lin, Z. B. (2007), Ganoderma lucidum Polysaccharides Enhance the Function of Immunological Effector Cells in Immunosuppressed Mice. J Ethnopharmacol., 111, 219-226.

98

CONCLUSÕES

1. Jun-Cao é uma eficiente técnica para ser utilizada para estudos e produção de cogumelos

Ganoderma lucidum, por ser flexível e permitir a utilização de diferentes formulações de

substratos;

2. A técnica Jun-Cao reduziu substancialmente o tempo de desenvolvimento dos basidiomas

de G. lucidum;

3. A linhagem brasileira CC-144 de G. lucidum é a mais promissora para desenvolver

estudos relativos à fungicultura no Brasil;

4. A combinação de capim-elefante (Pennisetum purpureum) e serragem promove excelente

balanço nutricional para o desenvolvimento de G. lucidum;

5. Variações leves de pH (de 4 a 8) não afetam o crescimento de linhagens chinesas e

brasileiras de G. lucidum, tolerantes a acidificação e alcalinização que ocorrem

naturalmente em substratos durante o crescimento micelial;

6. As linhagens brasileiras aparentam maior tolerância a variações de temperatura ambiental

do que as chinesas;

7. Os primers utilizados na análise RAPD permitem determinar distância genética segura

entre as diferentes linhagens de G. lucidum.

99

ANEXO 1: A Técnica Jun-Cao

100

Preparo das linhagens

O inóculo de cada linhagem foi obtido de colônias desenvolvidas em placas de Petri

contendo meio de cultivo batata-dextrose-agar (BDA), após 4 a 5 dias de incubação a 28ºC.

Com o auxílio de um furador de rolhas retirou-se discos de micélio com 5 mm de diâmetro,

que foram transferidos para os centros das placas de Petri (9 cm de diâmetro), contendo o

meio de cultivo (Fig. 1).

Preparo da matriz ou “semente”

Foram utilizados grãos de sorgo como substrato. O sorgo foi escolhido, porque é o

grão mais adequado para o crescimento vegetativo das espécies de cogumelos pesquisados

pela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia desde 1996. Os grãos foram lavados em

água corrente e deixados imersos dentro de um recipiente contendo água durante 12 horas (A

imersão é importante para hidratar os grãos, quebrando a resistência da casca, de modo a

favorecer a colonização do fungo a ser testado). Em seguida escorreu-se o excesso de água e

os grãos umedecidos foram transferidos para um saco de polipropileno de alta densidade (15

x 35 x 0,010 cm). O material foi esterilizado a 121 ºC durante 30 minutos em autoclave.

Cada saco contendo 300 gramas de grãos de sorgo recebeu discos de inóculo

colonizados pelo micélio do fungo. Os sacos foram fechados com espuma esterilizada e

arame encapado. Em seguida, os sacos foram incubados sob ausência de luz, a temperatura

de 25 ºC durante 10 dias (Figs. 2 e 3).

Figura 1 – Placa contendo disco miceliado ao centro do meio de cultura no primeiro dia (A) e com três dias de cultivo (B).

B

101

Figura 2 – Preparo da matriz ou “semente” de G. lucidum em laboratório. Transferência de

linhagens das placas para sacos contendo sementes de sorgo.

102

Figura 3 – “Sementes” que serão utilizadas como inóculo para cultivo de G. lucidum.

Finda esta etapa, as sementes estavam prontas para serem transferidas para substratos

contendo diferentes formulações. Foram seis tipos de formulações testados, a saber:

Formulação 1:

Capim-elefante (Pennisetum purpureum) 70%, farelo de trigo 17%, farelo de arroz 10%,

gesso agrícola 2% e açúcar mascavo 1%.

Formulação 2:

Capim-elefante (Pennisetum purpureum) 25%, bagaço de cana-de-açúcar 53%, farelo de

trigo 20%, gesso agrícola 2%.

Formulação 3:

Capim-elefante (Pennisetum purpureum) 73%, farelo de trigo 15%, farelo de arroz 10%,

gesso agrícola 1% e açúcar mascavo 1%.

Formulação 4:

Capim-elefante (Pennisetum purpureum) 77,6%, farelo de trigo 20%, gesso agrícola 2%,

superfosfato de cálcio 0,1%, açúcar mascavo 0,2% e uréia 0,1%.

Formulação 5:

Capim-elefante (Pennisetum purpureum) 39%, Serragem 39%, farelo de arroz 10%, bagaço

de cana-de-açúcar 10% e gesso agrícola 2%.

Formulação 6:

Serragem 78%, farelo de trigo 20% e gesso agrícola 2%.

103

As gramíneas e/ou resíduos orgânicos vegetais foram triturados com o auxílio de um

triturador de gramíneas. Em seguida adicionou-se ao triturado de cada formulação os

respectivos insumos. O substrato então foi umedecido e colocado em sacos de polipropileno,

resistentes a altas temperaturas. Cada saco recebeu 700 gramas de substrato.

Os substratos ensacados foram autoclavados a 121 ºC por 90 min e depois de

voltarem a atingir temperatura ambiente, foram inoculados com os grãos de sorgo

miceliados.

A inoculação se deu da seguinte maneira:

Em uma câmara de fluxo laminar, cada saco de substrato recebeu furos laterais,

realizados com auxílio de um furador de rolhas, por onde foram introduzidas as “sementes”.

Os furos foram então, fechados com fita adesiva para impedir o contato com o ambiente

externo. A extremidade do saco foi aberta para receber “sementes” na sua parte superior.

Finalmente, o saco foi fechado com arame encapado, mantendo-se uma espuma esterilizada

na extremidade deste, com o objetivo de promover aeração no substrato de cultivo (ver

seqüência nas Figs. 4 e 5).

104

Figura 4 – Etapas do processo de inoculação de “sementes” de Ganoderma lucidum em substratos

de cultivo sob condições assépticas (A – F).

B A

D

F E

C

105

Figura 5 – Inoculação de “sementes” de Ganoderma lucidum a partir de extremidade do saco de

polipropileno (A – D).

B A

D C

106

Posteriormente, os sacos contendo os substratos inoculados foram transferidos para

uma sala escura, com temperatura ambiente em torno de 25 – 28 ºC e 70 – 80% UR. Nestas

condições iniciou-se o processo de desenvolvimento vegetativo do fungo (Fig. 6).

Figura 6 – Substratos sendo mantidos em sala escura para o desenvolvimento vegetativo das

linhagens de Ganoderma lucidum.

Após, o completo desenvolvimento dos micélios nos substratos, os sacos foram

levados à casa de vegetação, para a formação da fase reprodutiva. A umidade do local é

mantida por meio de irrigação periódica e o ar é renovado por exaustores. Uma vez que o

contato direto com a água de irrigação inibe a formação do cogumelo, em Ganoderma

lucidum, estes são enterrados em calhas. Este método os mantém abrigados da luz e do

excesso de umidade que possa ocorrer em alguns horários do dia.

O processo de enterrar o substrato colonizado é uma variação da técnica Jun-Cao que

pode ser utilizada tanto no G. lucidum, quanto em outros cogumelos de uso humano, como,

por exemplo, Pleurotus spp., Lentinula edodes, Grifola frondosa, dentre outros. A água,

nesse caso, é espalhada na terra de cobertura, umedecendo-a. Esta umidade é suficiente para

garantir o desenvolvimento das frutificações.

Para cada linhagem foi separada uma calha, sendo que as calhas foram divididas em

compartimentos, os quais foram preenchidos cada um com uma formulação (Fig. 7).

107

Figura 7 – Processo de cobertura dos substratos miceliados com terra em calhas. As calhas vazias (A) recebem

uma camada de terra (B) e, em seguida, o substrato é deitado paralelamente (C, D, E e F) para ser enterrado (G, H

e I ).

A temperatura da casa de vegetação ficou em torno de 25 ºC, com umidade média de

80%. A terra de cobertura foi umedecida sempre que se mostrou ressecada.

A Figura 8 ilustra o crescimento das linhagens de G. lucidum ao longo do período de

desenvolvimento do corpo de frutificação. Após a frutificação, sucederam-se as análises que

culminaram nos artigos presentes neste trabalho.

A C

D E

B

F

H I

G

108

Figura 11 – Diferentes fases de desenvolvimento do cogumelo: A) Local de cultivo; B e C)

Surgimento dos primórdios de frutificação; D) Desenvolvimento dicotômico do

basidiocarpo; E) Píleo em forma semicircular, ou forma de rins com dobras anelares e faixa

branca ao redor das bordas do chapéu. G) Fase adulta do cogumelo: píleo e haste com

coloração marrom-avermelhada.

A B

C D

E F

109

ANEXO 2: Géis obtidos na análise genética das linhagens

110

A análise de variabilidade genética entre as linhagens G. lucidum chinesas (CC-22 e

CC-63) e as brasileiras (CC-144 e CC-157) foi realizada por meio de utilização de

marcadores moleculares RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). A linha 5 de cada

gel possui uma linhagem (CC-229) que foi testada inicialmente, mas descartada ao longo do

tempo devido à contaminação. Os fragmentos de DNA amplificados foram visualizados por

meio de eletroforese em gel de agarose 1,5%, corado com brometo de etídio (Figs. 1 a 4).

Figura 1 – Análise genética das linhagens CC-22 (Linha 1), CC-63 (Linha 2), CC-144 (Linha 3), CC-157

(Linha 4) e CC-229 (Linha 5) de G. lucidum por meio de marcadores moleculares RAPD. Foram utilizados o

peso molecular 1kb DNA Ladder (Linha 0 = modelo padrão) e os primers E 4, E 6, E 8, F 1 e F 2.

1 2 3 4 5

Primer E 4 Primer E 6

0 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4

Primer E 8

1 2 3 4 5

Primer F 2 Primer F 1

5 12.216____

1.018____

506,517____

2.036_____

1.636_____

3.054_____

bp

396_____

111



peso molecular 1kb DNA Ladder (Linha 0 = modelo padrão) e os primers F 6, F 8, F 12, G 4 e G 5.

1 2 4 5

Primer F 6

0 3 1 2 4 5

Primer F 8

3 _____12.216

____1.018

____506,517

_____2.036

_____1.636

_____3.054

bp

1 2 4 5 3

Primer F 12

1 2 4 5 3

Primer G 4

1 2 3

Primer G 5

____396

112



peso molecular 1kb DNA Ladder (Linha 0 = modelo padrão) e os primers G 5, G 15, H 12, O 19, R 12 e R 19.

12.216____

1.018____

506,517____

2.036_____

1.636_____

3.054_____

bp

396_____

1 2 4 5

Primer R 12

3 4 5

Primer G 5

0 1 2 4 5

Primer G 15

3 1 2 4 5

Primer H 12

3 1 2 4 5

Primer O 19

3 1 2

Primer R 19

113


(Linha 4) e CC-229 (Linha 5) de G. lucidum por meio de marcadores moleculares RAPD. Foram utilizados

o peso molecular 1kb DNA Ladder (Linha 0 = modelo padrão) e os primers R 19, R 10, X 20, O 15 e W 18.

Além dos primers já citados, foram utilizados também AB 1, AB 2, AB 10, AB 13,

AB 14, AB 18, AB 19, A 2, A 5, A 6, A 7, A 11, A 12, A 17, A 18, B 1, B 2, B 5, B 6, B 9, B

10, B 11, B 13, B 16, B 18, C 1, C 2, C 3, C 5, C 7, C 8, C 10, C 18, C 19, D 2, D 4, D 6, D

7, D 10, D 18, D 20, J 5, J 7, J 8, J 13, K 12, P 2, R 2, R 8, R 9, R 20, S 5, S 16, U 1, U 20, V

8, W 6, W 13, W 17, X 4, Y 1, Y 17 e Y 20. Todo o material foi fornecido pelo Laboratório

de Genética Vegetal do Prédio de Coleta e Caracterização, da Embrapa Recursos Genéticos e

Biotecnologia.

_____12.216

____1.018

____506,517

_____2.036

_____1.636

_____3.054

bp

____396

3 2 4 5

Primer R 19

1 2 4 5

Primer R 10

3 1 2 4 5

Primer X 20

3 1 2 4 5

Primer O 15

3 1 2 4 5

Primer W 18

3 0

114

Os primers efetivos para distinguir as linhagens de Ganoderma lucidum, bem como

suas respectivas seqüências, estão listados na tabela a seguir (Tabela 1):

Tabela 1. Relação do número de loci e do número de loci polimórficos por primer eficiente na análise RAPD das linhagens de Ganoderma lucidum

Primers Seqüência 5’ – 3’ No de loci No de loci polimórficos OPAB-14 AAGTGCGACC 17 14 OPA-05 AGGGGTCTTG 17 11 OPA-07 GAAACGGGTG 24 20 OPA-11 CAATCGCCGT 18 10 OPA-12 TCGGCGATAG 24 14 OPB-05 TGCGCCCTTC 26 24 OPB-06 TGCTCTGCCC 16 12 OPC-18 TGAGTGGGTG 21 16 OPC-19 GTTGCCAGCC 16 13 OPD-04 TCTGGTGAGG 11 06 OPD-20 ACCCGGTCAC 19 17 OPE-06 AAGACCCCTC 19 10 OPE-08 TCACCACGGT 16 10 OPF-01 ACGGATCCTG 17 04 OPF-02 GAGGATCCCT 12 05 OPF-08 GGGATATCGG 17 09 OPF-12 ACGGTACCAG 20 09 OPG-15 ACTGGGACTC 22 10 OPH-12 ACGCGCATGT 17 10 OPO-15 TGGCGTCCTT 18 04 OPO-19 GGTGCACGTT 17 10 OPR-08 CCCGTTGCCT 15 08 OPR-09 TGAGCACGAG 19 10 OPR-12 ACAGGTGCGT 16 04 OPR-19 CCTCCTCATC 14 13 OPR-20 ACGGCAAGGA 17 12 OPV-08 GGACGGCGTT 24 17 OPW-18 TTCAGGGCAC 23 21 TOTAL 512 323

ESTUDOS FISIOLÓGICOS, BIOQUÍMICOS E MOLECULARES DE ... · À Embrapa Cenargen por ter dado todo o...

Documents

Transcript of ESTUDOS FISIOLÓGICOS, BIOQUÍMICOS E MOLECULARES DE ... · À Embrapa Cenargen por ter dado todo o...