ESTUDOS ULTRAESTRUTURAIS DE LINFÓCITOS,

POLIMORFONUCLEARES E FAGÓCITOS DE

PACIENTES COM DOENÇA DE DUCHENNE

GUILBERTO MINGUETTI * — MARA A. D. PIANOVSKI KATO **

ROBIN M. HOFMEISTER ***

R E S U M O — Os autores es tudaram p o r m i c r o s c o p i a e le t rônica células mononuc lea res e gra-¬

nu lóc i tos o b t i d o s d o sangue de 10 pac ientes c o m dis t rof ia muscula r de Duchenne . E m b o r a

vár ios es tudos tenham demons t r ado a l te rações b ioqu ímicas e imuno lóg icas nessas células d o

sangue, não fo ram encontradas a l terações ul traestruturais neste es tudo.

Ultrastructure of lymphocytes, polymorphonuclears and phagocytes of patients with muscular

dystrophy.

S U M M A R Y — T h e authors have car r ied ou t an elect ron m i c r o s c o p y s tudy of mononuc lea r

cel ls and g ranu locy te s ob ta ined f rom 10 patients w i th D u c h e n n e muscu la r d y s t r o p h y . A l t h o u g h

several s tudies have demons t ra ted b iochemica l and immuno log i ca l defec ts in these b lood cel ls ,

n o ul trastructural abnormal i t ies w e r e found in the present w o r k .

A distrofia muscular progressiva de Duchenne tem sido alvo de profundas inves­tigações desde os primeiros casos descritos por esse autor em 1861: inicialmente, por biópsias para avaliação das fibras musculares esqueléticas; depois, por outras análises, como enzimáticas, eletroneuromiográficas e bioquímicas. Nos últimos anos, grande ênfase tem sido dada ao estudo dos vasos sanguíneos, nervos periféricos i S - 1 7 e, prin­cipalmente, das membranas celulares 8,14, com conseqüente avaliação da atuação do sódio, potássio e cálcio em relação a elas. Com a atenção dos investigadores voltada para as membranas de maneira geral, observa-se serem as plaquetas 1 7 , hemá-cias 3,6,9,11,13,16,19 e leucócitos 1 2 excelentes meios de estudo e avaliação das alterações das membranas celulares, dada a possibilidade de se manipular laboratorialmente estas células.

Estimulados por estes estudos e, principalmente, pelas alterações observadas no fenômeno do "capping" (termo utilizado em estudos de imunofluorescência para indicar o agrupamento polarizado de complexos antígeno-anticorpo que ocorre na superfície de linfócitos tipo B e T sob certas condições estabelecidas laboratorialmente) presentes na doença de Duchenne 1 2 , os autores se propuseram a realizar o presente trabalho, na expectativa de que alterações ultraestruturais leucocitárias pudessem acompanhar as alterações bioquímicas e imunológicas mencionadas. Não obstante isso, Minguetti e Mair !0 , apontam a existência de fagocitos em intensa atividade fagocitica envol­vendo miotubos (Fig. 9) de um feto de 9 semanas de vida intra-uterina, provavelmente acometido pela doença de Duchenne. Os fagocitos observados naquele caso apresen­tavam pares de grandes inclusões citoplasmáticas (Fig. 8 ) , sendo uma clara e, a outra, escura. A presença do material destas inclusões fazia-se dentro dos próprios

Traba lho real izado na Disc ip l ina d e N e u r o l o g i a d o Depar tamento de Clínica M é d i c a e

Centro de M i c r o s c o p i a E le t rôn ica da Univers idade Federa l d o Pa raná ( U F P R ) : * P ro fesso r

A d j u n t o d e N e u r o l o g i a ; ** Responsáve l pe lo Serv iço de Hematoped ia t r i a d o Hospi ta l de

Clínicas d a U F P R ; *** P ro fe s so r Ad jun to , Centro de Mic rocosp i a Ele t rônica .

Rua Brigadeiro Franco 122 — 80410 Curitiba PR — Brasil.

miotubos em fagocitose. Desta forma, parte da presente investigação foi dedicada ao estudo dos fagocitos na expectativa da identificação de alterações ultraestruturais não mencionadas pela literatura que trata do assunto i> 4-5.

M A T E R I A L E M É T O D O S

O material é p roven ien te de 10 pacientes d o Hospi ta l de Clínicas da U F P R , c o m doença

de Duchenne . Suas idades var iavam de 5 a 10 a n o s e o d iagnós t i co de cer teza baseou-se

na his tór ia familiar, achados enzimát icos , e l e t romiográ f i cos e h i s topa to log ia muscular . Pa ra

aval iação d o s leucóc i tos , fo ram re t i rados d e cada pac ien te ce rca de 20ml de sangue e levados

imedia tamente para separação d o s t ipos espec í f icos .

Os pol imorf©nucleares ( P M N ) fo ram o b t i d o s s e g u n d o a técnica descr i ta por B o y u m (2)

cons t i tu indo-se na separação inicial d o s mononuc lea re s po r grad ien te d e dens idade c o m

f ico l l -hypaque ( d = 1 0 7 7 ) e, pos te r iormente , na separação d o s P M N p o r sed imentação e m

so lução de dex t rana ; a suspensão final d e células foi a justada a uma concent ração de 2,5

x 107 P M N / m l em so lução tampão-fosfa to . Pa r a o b t e n ç ã o dos fagoc i tos , par t ículas de z y m o s a n

(Saccaromyces cerevisae) f o r a m opsonizada-s mediante incubação de 0,5mg c o m 0,5ml de p o o l

de s o r o f resco humano durante 30 minu tos a 37°C; em seguida, elas fo ram lavadas e

ressuspensas e m lOml de so lução fosfa to t amponada ( P B S ) ; 100 micro l i t ros d a suspensão' d e

P M N foram, então, ad i c ionados a 50^1 d a suspensão d e part ículas d e z y m o s a n ; o vo lume fo i

c o m p l e t a d o para 0,5ml c o m P B S e levado a incubação durante vinte minutos , a 37°C; a

seguir , o p rocesso fo i in t e r rompido p o r cen t r i fugação à tempera tura ambien te (300g) p o r

10 minutos . Os sed imen tos de todas as células b rancas ob t idas fo ram f ixados c o m gluta-

ra lde ído fr io a 4% t ampon ad o c o m cacod i l a to a 0,15M; após duas horas de f ixação , o mater ial

foi lavado em so lução de t ampão cacodi la to 0.15M 4- 0,2g NaCl durante 15 m i n u t o s ; pós - f i xa -

ção foi real izada em t e t róx ido de ó s m i o a 2% em tampão cacod i l a to 0,30M durante 30

minu tos ; em seguida , foi fei ta l avagem c o m s o l u ç ã o t ampão cacod i l a to 0,15M -f- 0,2M NaCl

durante 15 minu tos após o q u e foi con t ras tado c o m acetato d e urani la a 2 % p o r 24

horas ; o material foi novamen te lavado em água des t i lada durante 5 minu tos e des id ra tado

em graus ascenden tes d e á l c o o l ; em seguida , foi c o l o c a d o e m acetona a 100% e e m b e b i d o

em P o l y l i t e ; s e c ç õ e s ul t raf inas fo ram obt idas c o m u l t r amic ró tomo Sorvai M T 2 B , cole tadas em

grades d e c o b r e , co radas c o m citrato de c h u m b o e examinadas em m i c r o s c ó p i o e le t rônico

Phi l ips E M 300.

R E S U L T A D O S

Lin fóc i tos — Os l infóci tos são células sanguíneas gera lmente de pequeno tamanho

( F i g s . 1, 2 e 3) se comparadas às demais células b rancas ; à u l t ramicroscopia , con tudo ,

pode- se obse rva r l in fóc i tos de d imensões var iadas . D e qualquer forma, os l infóci tos apresen­

tam re lação núc leo -c i top lasma bastante alta, o que se d e v e às g randes d imensões d o núc leo .

O enve lope nuclear é b e m evidente , dando a o núc leo c o n t o r n o suave, c o m poucas reentrâncias .

O nuc leop lasma c o n t é m c romat ina b e m ní t ida e d i s t r ibu ída na perifer ia . A ma io r parte d o s

l infóci tos não con tém em seu c i top lasma granu lações específ icas , g ranulações estas caracte­

r ís t icas d o s granulóc i tos . O re t ículo endop lasmát ico r u g o s o é p o u c o desenvo lv ido e pequenas

quant idades de g l i c o g ê n i o e r i b o s s o m o s s ã o obse rvadas . Apare lhos de Golg i s ão p o u c o desen­

volv idos , mas mi tocôndr i a s são b e m evidentes em quase todos l infóci tos . Var iados t ipos

de pequenas inc lusões c i toplasmát icas foram visual izados den t ro d o c i top lasma d o s l infóci tos

e x a m i n a d o s ; po rém, em nenhuma delas fo ram obse rvadas inclusões g igantes c o m caracter ís t icas

especí f icas quan to à e le t rodens idade . F ina lmente , o envol tór io celular é n í t ido e acompanha

pequenas expansões c i top lasmát icas caracter ís t icas d o s l infóci tos (F ig . 3) que parecem não

apresentar m e m b r a n a basal, mas, apenas, m e m b r a n a plasmát ica .

Po l imor fonuc l ea r e s — A anál ise ultraestrutural d o s po l imor fonuc lea res mos t r a c o m ni t idez

a caracter ís t ica mais impor tan te na respect iva ident i f icação, as g ranu lações c i toplasmát icas

(F ig . 5 ) . Estas, p o r si só , pe rmi t em a fácil d i fe renc iação d o s P M N de out ras células

brancas . A s o rgane la s c i toplasmát icas n ã o são b e m desenvo lv idas : mi tocôndr i a s o c o r r e m

em p e q u e n o n ú m e r o ; r i b o s s o m o s , re t ículo endop lasmát i co r u g o s o e aparelho d e Golg i são

p o u c o desenvo lv idos . O p o l i m o r f i s m o nuclear, tal qual as granulações c i toplasmát icas , cons t i ­

tui-se em outra caracter ís t ica d o s P M N . N a ul t ramicroscopia , a lobu lação d o núc leo é

ind icada pe la p resença de massas nucleares separadas , cada uma das quais apresenta c r o m a ­

t ina densa de loca l ização per i fé r ica ( F i g s . 4 e 5 ) . Os envol tó r ios nuc lear e c i top lasmát ico

são b e m evidentes e, a e x e m p l o d o s l infóci tos , t a m b é m o s P M N não apresentam membrana

basal ao r edo r da m e m b r a n a plasmática. A p e s a r d a presença d e granulações c i toplasmát icas

caracter ís t icas d o s P M N , n ã o fo ram observadas , n o presen te es tudo, estruturas q u e suger i ssem

a l g u m t i po p a t o l ó g i c o d e inc lusões c i toplasmát icas .

F a g o c i t o s — F a g o c i t o s apresentam-se à ultramicro3copia c o m o células d e g randes d imen­

sões e núc leos mu l t i l obu lados cu ja c romat ina densa se d is t r ibui de f o r m a h o m o g ê n e a na sua

per i fer ia ( F i g . 6 ) . A m e m b r a n a p lasmát ica é b e m evidente e g r a n d e n ú m e r o d e expansões

c i toplasmát icas são observadas . Organe las c i toplasmát icas ( c o m o apare lho de Go lg i , m i t o -

côndr ias e retículo' endop la smá t i co ) não são p roeminen tes , e m b o r a granulações se jam ident i f i ­

cadas . E m b o r a par t ículas d e z y m o s a n o u m e s m o p laque tas f o s s e m cons tan temente obse rvadas

so f rendo p r o c e s s o d e f agoc i t o se ( F i g . 7 ) , t a m b é m n o s f agoc i tos n ã o fo ram ident i f icadas

inc lusões g igan tes p rocu radas nas demais células es tudadas n o presente t rabalho.

C O M E N T A R I O S

Teorias recentes apregoam que defeitos das membranas celulares seriam respon­sáveis pelas alterações observadas nas fibras musculares de pacientes com distrofia muscular tipo Duchenne. Acredita-se que esses defeitos seriam consequências do erro genético presente nesses pacientes e que as alterações de membrana seriam transmi­tidas também a outros tipos de células do organismo doente, além das fibras muscu­lares. Para caracterização desses defeitos, os autores têm utilizado as células do sangue por se tratarem de células de fácil aquisição e manuseio. Vários estudos apontam que as membranas de eritrocitos obtidos tanto de paciente com distrofia miotônica como daqueles com Duchenne são diferentes das membranas eritrocitárias normais. Tais alterações incluem variações quanto a forma do eritrocito, fragilidade osmótica, transporte do sódio e potássio através da membrana plasmática, alterações da absorção do cálcio, fosforilação das proteínas e fluidez da membrana, anormalidades relativas à ATPase Na+ e K+ e outras 3,6,9,11,13,16,19. Com relação às células brancas, são de particular interesse os estudos relacionados aos linfócitos e, destes, o mais significativo dos últimos anos diz respeito ao trabalho de Pickard e col. 1 2 . Estes autores estudaram o "capping" em 61 pacientes com os vários tipos de distrofia mus­cular. Os resultados mostraram diminuição importante da percentagem de células que apresentavam "capping", quando comparado com grupo controle de indivíduos normais. Foi observado, ainda, que os portadores (mães) heterozigotos de Duchenne apresen­tavam diminuição do número de células linfocitárias com o fenômeno de "capping" proporcionalmente igual ao número observado nos próprios doentes ocorrendo isto mesmo quando os níveis séricos das enzimas (CPK, LDH, SGOT e SGPT) estão normais. Os autores acreditam que tal fato seja decorrente de alteração da fluidez das membranas plasmáticas dos linfócitos de pacientes com distrofia muscular, pois a técnica do "capping" permite a observação da mobilidade lateral normal das pro­teínas das membranas no plano da superfície celular, refletindo defeito sistêmico das membranas celulares. Curiosamente, até a época da publicação do artigo de Pickard e col., a única doença que apresentava diminuição da percentagem do "capping" linfo-citário era a leucemia linfocítica crônica.

O presente estudo da ultraestrutura dos linfócitos de pacientes com Duchenne, contudo, não apresentou evidências de alterações da microestrutura das membranas plasmáticas destas células, sugerindo que os defeitos encontrados por outros autores devem estar relacionados exclusivamente aos aspectos bioquímicos e ou imunológicos cujas causas básicas são ainda de especulação científica.

Como foi mencionado anteriormente, outro fato que levou os autores à reali­zação do presente trabalho foi a observação em estudo anterior 10 de grandes inclusões — uma clara e outro escura — no citoplasma de fagocitos de um feto de 9 semanas de vida intra-uterina, provavelmente com distrofia de Duchenne. Tais inclusões não foram identificadas pelo seu tamanho e cor em outras condições patológicas nas quais participam as células brancas 1.4,5. Daí porque tentou-se, no presente trabalho, por estímulos apropriados com partículas de zymosan obter-se fagocitos de pacientes com Duchenne para serem analisados. A expectativa era de que pela microcospia eletrô­nica tais inclusões pudessem ser normalmente identificadas no citoplasma destes fago­citos. Elas, contudo, não foram visualizadas no material examinado e, possivelmente, representam circunstância específica da fagocitose de células musculares. Apesar de tudo, os autores acreditam que estas inclusões, as quais devem ser ricas em enzimas digestivas, e as células que as albergam deveriam ser alvo de investigações mais refi­nadas por parte dos investigadores das doenças musculares, pois evidências delas são detectadas pela microscopia eletrônica nas células musculares sob fagocitose em qual­quer fase da vida de pacientes distróficos 7.

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