Expressão da proteína ligadora de cálcio S100A7 em...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

Expressão da proteína ligadora de cálcio

S100A7 em carcinoma espinocelular de laringe

e sua correlação com a clínica: análise por

imuno-histoquímica

ROGÉRIO COSTA TIVERON

Ribeirão Preto

2008

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ROGÉRIO COSTA TIVERON

Expressão da proteína ligadora de cálcio

S100A7 em carcinoma espinocelular de laringe

e sua correlação com a clínica: análise por

imuno-histoquímica

Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, para a obtenção do título de Doutor em Ciências Médicas. Área de Concentração: Morfofisiologia de Estruturas Faciais.

Orientador: Prof. Dr. Rui Celso Martins Mamede

Ribeirão Preto

2008

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRÁFICA

Tiveron, Rogério Costa Expressão da proteína ligadora de cálcio S100A7 em carcinoma espinocelular de laringe e sua correlação com a clínica: análise por imuno-histoquímica. Ribeirão Preto, 2008. 144p.: il.; 30cm Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP – Programa: Oftalmologia, Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço - Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço. Orientador: Mamede, Rui Celso Martins

1. psoriasin1; 2. carcinoma espinocelular; 3. carcinoma de laringe; 4. imuno-histoquímica; 5. marcadores tumorais; 6. S100 A7

FOLHA DE APROVAÇÃO

Rogério Costa Tiveron

Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, para a obtenção do título de Doutorado em Ciências Médicas. Área de Concentração: Morfofisiologia de Estruturas Faciais.

Aprovado em:

Banca Examinadora

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Dedicatória Dedico aos meus pais (Nelma e Djalma), pelo exemplo de caráter, dedicação e amor incondicional. Aos meus irmãos, pela amizade e companheirismo. À Luciana: minha inspiração.

Agradecimentos

A Deus, pelo milagre da vida e por me conceder mais esta realização, que não seria alcançada sem o envolvimento de tantas pessoas. Por isso quero compartilhá-la com todos. Gostaria de enfatizar que este trabalho não seria possível sem a colaboração dos pacientes, que em momento difícil de suas vidas se dispuseram a contribuir, sem o que, esta tese não existiria. Ao Prof. Dr. Rui Mamede, pela orientação neste trabalho e pela amizade e confiança estabelecidos em anos de convivência na residência médica e, posteriormente, na pós-graduação. Ao Prof. Dr. Marco Antônio Zago, co-orientador desta tese, minha gratidão por disponibilizar o anticorpo usado no trabalho junto ao Ludwig Institute for Cancer Research (NY) e, principalmente, por propiciar que o Serviço de Cirurgia de Cabeça e Pescoço se envolvesse em pesquisas genômicas por meio do Projeto Temático da FAPESP: “Busca de marcadores de Agressividade em Tumores de Cabeça e Pescoço”. Agradeço ao Prof. Dr. Luciano Nedder e demais funcionários da patologia pela realização do estudo histológico. Sou grato também às secretárias Vilma, Lílian e Cecília (Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço) e Márcia (Departamento de Cirurgia) por terem sido sempre tão prestativas ao longo destes anos. Ao David, colega de residência, grande amigo, parceiro e tutor deste projeto. Muito obrigado por abrir caminho nos trabalhos genômicos em câncer de cabeça e pescoço nesta instituição. Também aos colegas de projeto, José Raphael Montoro e Daniel Hardy, pela amizade, desde a residência médica. Meu reconhecimento especial à Emmanuelle, minha grande amiga de todas as horas, que nos momentos mais difíceis da redação deste trabalho esteve a meu lado, noites a fio, ajudando-me na digitação até sua conclusão.

Ao amigo João Batista Ribeiro, pelas oportunas dicas e por me fazer confiar que seria possível concluir esta etapa em momentos que nem mesmo eu acreditava. Aos meus pais e à Luciana pelo incentivo, apoio constantes e tolerância nos momentos mais difíceis, não tenho palavras para agradecer. A tantos outros que de várias formas me incentivaram a abraçar e concluir este desafio, meu muito obrigado!

Epígrafe:

“Bom mesmo é ir à luta com determinação Abraçar a vida e viver com paixão Perder com classe e vencer com ousadia. Porque o mundo pertence a quem se atreve E a vida é muito para ser insignificante”. Charles Spencer Chaplin Jr. (1889 – 1977).

LISTA DE ABREVIATURAS

Lista de Abreviaturas

APCN- Antígeno de Proliferação Celular Nuclear BD- bem diferenciados CECCP- Carcinomas Espinocelulares da cabeça e pescoço CECL- Carcinoma Espinocelular de Laringe CTAs- genes de antígenos tumorais específicos EGFR- Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico FCVE- fator de crescimento vascular endotelial FHIT- Tríade frágil da histidina H&E- hematoxilina e eosina HCFMRP-USP- Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo HPV- papiloma vírus humano MD- moderadamente diferenciados MIB I- proteína Ki-67 PD- pouco diferenciados PET-CT- Tomografia por Emissão de Positrons TGFα- Transformador de Crescimento-α α-FGF- Fator de Crescimento Fibroblástico

LISTA DE FIGURAS

Lista de Figuras

Figura 1: Distribuição dos tumores de laringe por sítios segundo o estadiamento clínico (valores expressos em número de pacientes) ..... 77 Figura 2- Classificação histológica em diferentes sítios do tumor, expressa em número de pacientes. BD: bem diferenciados, MD: moderadamente diferenciados, PD: pouco diferenciados ................... 80 Figura 3- Espécime de Carcinoma Espinocelular de Laringe após reação de imuno-histoquímica com expressão do S100 A7. Escore 0+ no Carcinoma e 4+ em área de carcinoma in situ (setas) (Aumento de 100x) ..................................................................................... 81 Figura 4- Espécime de Carcinoma Espinocelular de Laringe após reação de imuno-histoquímica com expressão do psoriasin 1 (S100 A7). Escore 1+ (Aumento de 100x). ............................................... 82 Figura 5- Espécime de Carcinoma Espinocelular de Laringe após reação de imuno-histoquímica com expressão da proteína S100 A7. Escore 2+ (Aumento de 100x). ...................................................... 82 Figura 6- Espécime de Carcinoma Espinocelular de Laringe após reação de imuno-histoquímica com expressão do psoriasin 1 (S100 A7). Escore 3+ (Aumento de 100x). ............................................... 83 Figura 7- Espécime de Carcinoma Espinocelular de Laringe após reação de imuno-histoquímica com expressão do S100 A7. Escore 4+ (Aumento de 100x). ..................................................................... 83 Figura 8- Distribuição dos diferentes escores das reações de imuno-histoquímica em relação aos diferentes sítios tumorais na laringe (valores expressos em número de pacientes). ................................. 84 Figura 9- Distribuição do escore nos diferentes graus de diferenciação. (valores expressos em número de pacientes). ............. 87 Figura 10- Curva de sobrevida para os diferentes escores ................ 93 Figura 11- Curva de sobrevida para escores agrupados (grupo de ausência ou de baixa positividade – escores zero, 1+ e 2+; grupo de alta positividade – escores 3+ e 4+)............................................... 95

LISTA DE TABELAS

Lista de Gráficos

Tabela 1- Seguimento clínico dos pacientes segundo o sítio do tumor (valor expresso em número de pacientes). ...................................... 78 Tabela 2- Relação de óbitos e seus motivos de acordo com o sítio do tumor. (valores expressos em número de pacientes). ............................. 79 Tabela 3- Distribuição dos tumores em etilistas e não etilistas quanto ao grau de diferenciação (valores expressos em número de pacientes) ................................................................................... 80 Tabela 4- Relação dos pacientes estudados com seus respectivos escores, grau de diferenciação, sítio primário e estadiamento clínico. B.D. (bem diferenciado), M.D. (moderadamente diferenciado), P.D. (pouco diferenciado). ................................................................................ 85 Tabela 5- Análise do escore de acordo com os diferentes graus de diferenciação.. ............................................................................... 87 Tabela 6: Distribuição dos escores de acordo com os diferentes estadiamentos para os tumores MD. ................................................... 88 Tabela 7- Análise do escore em relação ao sitio do tumor ....................... 89 Tabela 8- Análise do escore em relação ao estadiamento clínico ............... 89 Tabela 9- Distribuição do escore em pacientes etilistas e não etilistas (valores expressos em número de pacientes). ....................................... 90 Tabela 10- Análise do escore em relação à presença de recidiva local. ....... 91 Tabela 11- Análise do escore em relação à recidiva regional. ................... 91 Tabela 12- Relação do escore com a presença de falhas do tratamento (recidiva local ou regional, metástases e segundo tumor primário). ............ 92 Tabela 13- Relação da sobrevida média (em meses) e os diferentes escores.. ...................................................................................... 94 Tabela 14- Relação da sobrevida média (em meses) em relação aos dois grupos de escore (grupo 1 – escores 0,1+,2+ e grupo 2 – escores 3+ e 4+).. ........................................................................................... 95

RESUMO

Resumo

TIVERON, R.C. Expressão da proteína ligadora de cálcio S100A7 em carcinoma espinocelular de laringe e sua correlação com a clínica: análise por imuno-histoquímica 144f. Tese (Doutorado em Ciências Médicas) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2008. O Câncer de Laringe, com 8.000 casos por ano, corresponde a 2% dos do Brasil e é o segundo mais freqüente do sistema respiratório, perdendo apenas para o de pulmão. O Carcinoma Espinocelular de Laringe (CECL), responsável por 94% dos casos, se caracteriza por ser heterogêneo, com evoluções indefinidas. Nos últimos anos, o estudo das alterações celulares e moleculares tem buscado marcadores capazes de identificar os tumores mais agressivos. As proteínas ligadoras de Cálcio S100, com atuação em uma série de processos celulares como progressão e diferenciação do ciclo celular, têm sido estudadas em muitos tipos de cânceres, excetuando os de laringe. Objetivos: Em CECL pretendeu-se identificar a expressão imuno-histoquímica da proteína ligadora de cálcio S100 A7 e a sua correlação com características clínicas e histopatológicas do tumor. Casuística e Métodos: Avaliados 63 pacientes com diagnóstico histopatológico de CECL, tratados cirurgicamente no período de 2001 a 2005. Seus respectivos espécimes foram submetidos a reações de imuno-histoquímica com o anticorpo S100 A7 (Psoriasin) – liquid mouse monoclonal antibody NCL-L-S100 A7 – Novocastra Laboratories®. As reações foram classificadas quanto à extensão da imunomarcação em: Zero; 1+: 5 – 25% das células neoplásicas marcadas; 2+: 25 – 50%; 3+: 50 – 75%; 4+: > 75% (nível de significância p ≤ 0,05). Resultados: A amostra de 63 pacientes, 58 homens e cinco mulheres, com idade variando de 27 a 78 anos (média de 57,46) constituiu-se de 36 casos de tumores pertencentes à supraglote, 24 à glote e apenas três à subglote, sendo 13 BD, 37 MD e 13 PD. A análise das falhas do tratamento revelou dez recidivas locais, sete recidivas regionais, uma metástase e cinco 2º tumores primários. Os escores foram correlacionados com diversas variáveis. Observou-se tendência dos tumores glóticos a terem escores altos (15 de 24 com escore 3+ e 4+) e os supraglóticos, escore baixo (20 em 26 abaixo de 3+). O grupo BD apresentou escores significantemente superiores aos MD e aos PD; e o grupo MD superior ao PD (p< 0,01*). No grupo MD notou-se predomínio de escores altos nos estadios I e II (7 casos com escore 3+ e 4+ de 10) , ao passo que nos estadios avançados (III e IV), a distribuição do escore foi mais homogênea (13/27 escores 0 a 2+ e 14/27 escores 3+ e 4+). Com relação às falhas do tratamento, houve diferença estatisticamente significante do grupo escore 0 (3/4 complicações:

Resumo

75%) com os demais escores (13/59: 22%) (p= 0,02*). Discussão: O gene proteína ligadora de cálcio S100 A7 pertence à família S100 e é amplamente expresso em epitélio de doenças que cursam com hiperplasias da epiderme, como a psoríase. Recentemente, tem sido relatada alta expressão em lesões neoplásicas (carcinoma ductal de mama, carcinoma espinocelular de bexiga e carcinoma espinocelular de cavidade oral). À semelhança desses estudos, observou-se alta expressão em tumores BD, ao passo que em tumores indiferenciados esse gene parece não atuar. À medida que a massa tumoral aumenta os escores tendem a diminuir (isto foi observado nos tumores MD), o que reforça a hipótese da sua ação se concentrar nas fases iniciais da carcinogênese. Conclusões: O marcador Psoriasin 1 (S100A7) foi expresso em 93,7% dos casos de CECL com maior positividade em tumores mais diferenciados e com menor índice de falhas de tratamento (estatisticamente significante). Há tendência dos tumores glóticos terem maior escore na expressão (sem significância). O escore obtido não representou impacto na sobrevida dos pacientes estudados. Palavras-chave: psoriasin; carcinoma espinocelular; carcinoma de laringe; imuno-histoquímica; marcadores tumorais, S100A7.

SUMMARY

Summary

TIVERON, R.C. Expression of calcium binding protein S100A7 in Larynx Squamous Cell Carcinomas and its correlation to the clinic: immunohistochemical analysis. 144f. Thesis (Doctoral) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2008.

Larynx cancer, with 8,000 cases annually, is the second most common respiratory cancer after lung cancer and it represents 2% of all cases of cancer in Brazil. The Laryngeal Squamous Cell Carcinoma (LSCC), responsible for 94% of all larynx cancer cases, has heterogenic features and presents indefinite evolutions. In the last years, the study of molecular and cellular alterations has focused in detecting markers to identify more aggressive tumors. The S100 Calcium biding proteins are involved in a variety of cellular processes such as cell-cycle progression and differentiation. They are actually reported in many kinds of cancer, except larynx cancer. Objectives: In LSCC it was intended to identify the imunohistochemistry expression of calcium binding protein S100 A7 and its correlation with clinic and histological features. Casuistic and Methods: 63 patients with histological LSCC diagnostic, treated by surgery between 2001 and 2005, were evaluated. The respective samples were submmited to imunohistochemical reactions with the S100 A7 antibody (NCL-L-S100 A7 – Novocastra Laboratories®). The reactions were classified by two independent pathologists according to their extension: Zero, 1+: 5 to 25% of neoplasic cells marked, 2+: 25 to 50%, 3+: 50 to 75% and 4+:>75% (significance level: p<0,05). Results: 63 patients, 58 men and 5 women aged from 27 to 78 years – average: 57.46 years – had a distribution of 36 supraglottic, 24 glottic and only 3 subglottic tumors. 13 cases of LSCC were well differentiated, 37 moderately differentiated and 13 poorly differentiated. There was 17 obits, 12 caused by the disease (5 by the treatment and 7 by the neoplasia) and 5 by other causes. Analyzing the treatment failures there was 10 local recurrences, 7 regional recurrences, 1 distant metastasis an 5 2nd primary tumors. The obtained scores were correlated to the different variables. The study showed a tendency of the glottic tumors to have high scores (15 in 24 scored 3+ and 4+) and also the supraglottic have lower (20 in 26 < 3+). The moderately differentiated group had significantly higher scores than the moderately and poorly and the moderately had higher scores than poorly (p<0,01*). In the moderately group it is possible to note a higher score prevalence at I and II stages (7 cases in 10 scored 3+ or 4+), and on the other hand at advanced stages (III and IV) the score distribution were similar (13/27 scored 0 to 2+ and 14/27 scored 3+

Summary

and 4+). The treatment failures were significant higher in zero score group (3/4 complications: 75%) than in positive score group (13/59: 22%) (p= 0,02*). Discussion: The calcium binding protein S100 A7 is a gene from S100 family and is highly expressed hyperplasic epidermal diseases, such as psoriasis. Recently it was reported in same neoplasic diseases (such as breast ductal cancer, bladder epidermoid carcinoma, skin tumors and oral epidermoid cancer). Similarly to these studies it was observed high expression in well differentiated tumors but in poorly differentiated it seems to loose its function. When the tumor mass is growing the score levels seems to reduce and this fact showed a tendency to its action concentrate in beginning carcinogenic phases. Conclusions: The psoriasin S100 A7 was expressed in 93.7% of tha LSCC, with highest expression in the more differentiated (statistically significant). There is a tendency to glottic tumors to have higher scores (no significance). The obtained score didn’t represent impact in the overall survival curves. Key-words: psoriasin, larynx cancer, squamous cell carcinoma, tumors markers, S100A7.

ÍNDICE

1. INTRODUÇÃO ....................................................................... 22 2. REVISÃO DE LITERATURA .................................................... 30

2.1. Incidência ............................................................................... 31 2.2. Fatores de Risco ...................................................................... 33

2.2.1. Tabaco e Álcool .............................................................. 33 2.2.2. Outros Fatores ............................................................... 34

2.3. Mortalidade, Sobrevida e Prognóstico ........................................ 36 2.4. Fatores Prognósticos ................................................................ 39

2.4.1. Idade ............................................................................ 39 2.4.2. Estado Geral do Paciente ................................................. 39 2.4.3. Estadiamento do Tumor .................................................. 40

2.4.3.1 Estadio T ............................................................ 40 2.4.3.2. Metástase Linfonodal .......................................... 41

2.4.4. Grau Histológico do Tumor .............................................. 42 2.4.5. Sítio Anatômico do Tumor ............................................... 43 2.4.6. Neoangiogênese ............................................................. 44

2.5. Avanços Genéticos .................................................................. 45 2.5.1. Marcadores Pré-neoplásicos ............................................. 45 2.5.2. TP53 ............................................................................. 46 2.5.3. CDKNZA ........................................................................ 49 2.5.4. Ciclina D1 ...................................................................... 50 2.5.5. Marcadores de Proliferação .............................................. 51 2.5.6. Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico ................... 52 2.5.7. CD 44 ........................................................................... 53 2.5.8. Bcl-2 ............................................................................ 54 2.5.9. Ploidia .......................................................................... 55 2.5.10. Região cromossômica 3p14 ........................................... 56 2.5.11. Cromossomo 8 ............................................................. 56

2.6. Proteína ligadora de cálcio S100 A7, psoriasin 1 .......................... 58 2.6.1. O S100A7 e o Câncer de Mama ....................................... 60

3. HIPÓTESE ............................................................................. 63 4. OBJETIVOS ........................................................................... 65 5. CASUÍSTICA E MÉTODOS ...................................................... 67

5.1. Casuística ............................................................................... 68 5.1.1. Critérios de Inclusão ....................................................... 70 5.1.2. Critérios de Exclusão ...................................................... 71

5.2. Método ................................................................................... 71 5.2.1. Estudo Histopatológico ..................................................... 71 5.2.2. Análise Estatística ........................................................... 74

6. RESULTADOS ........................................................................ 75

6.1. Características da amostra........................................................ 76 6.2. Evolução ................................................................................ 77 6.3. Avaliação do Escore ................................................................. 84 6.4. Comparação das curvas de sobrevida entre os diferentes escores

(considerando os escores 0,1,2,3 e 4) ........................................ 92 6.5. Comparação das curvas de sobrevida entre grupos de escores ...... 94

7. DISCUSSÃO .......................................................................... 96

7.1. O gene S100 A7 ...................................................................... 97 7.2. Expressão da proteína S100 A7 .............................................. 101 7.3. Falhas do tratamento ............................................................ 103 7.4. Função do Gene .................................................................... 108

8. CONCLUSÕES ...................................................................... 110 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................ 112 10. ANEXOS ............................................................................ 136 ANEXO DE PUBLICAÇÃO

1. INTRODUÇÃO

Introdução

23

O Câncer de Laringe é o segundo mais comum do sistema

respiratório, perdendo apenas para o de pulmão (CATTARUZZA;

MAISONNEUVE; BOYLE, 1996). Compreende cerca de 2% dos casos

de câncer do Brasil, o que corresponde a 8.000 por ano, sendo

responsável por 3,8% nos homens e 0,6% nas mulheres das mortes

por câncer, num total de 3.000 mortes por ano (MINISTÉRIO DA

SAÚDE - INCA, 2002 e 2003). Seu pico de incidência nos dois sexos

se dá nas sexta e sétima décadas de vida, embora alguns casos

tenham sido relatados na infância (BENHAMOU et al., 1992, VAN

CAUWENBERGE; DHOGE; INGELS, 1994; OHLMS; McGRILL; HEAL,

1994).

Existe marcante diferença na ocorrência do câncer de laringe

entre sexos, sendo ele mais comum nos homens (YANG et al., 1989),

com proporção homem/mulher, quanto à incidência, de 7/1, muito

maior que em outras partes da cabeça e pescoço (BOSCH et al.,

2004).

Com relação ao tipo histológico, o mais comum é o

carcinoma espinocelular (ou carcinoma de células escamosas), em

seus vários graus de diferenciação. O carcinoma espinocelular

corresponde à cerca de 96% dos casos de câncer da laringe (SHAH;

Introdução

24

KERNELL; HOFFMAN, 1997), o restante dos casos é representado

pelo carcinoma verrucoso (que corresponde à uma variação

histológica do carcinoma espinocelular), carcinoma epidermóide tipo

sarcomatóide (outra variação do carcinoma epidermóide),

adenocarcinoma, neoplasias de glândulas salivares (adenoma

pleomórfico, tumor mucoepidermóide, carcinoma adenóide-cístico,

tumor de células acinosas), tumores neuroendócrinos (paraganglioma

e tumores carcinóides), carcinoma anaplásico de pequenas células e

outras neoplasias mais raras como: melanoma, rabdomiossarcoma,

sarcoma de kaposi, histiocitoma, condrossarcoma, osteossarcoma,

lipossarcoma, linfoma e tumores metastáticos (NORONHA; DIAS,

1997).

O tabagismo é o maior fator de risco para o carcinoma

espinocelular de laringe (CECL) (CUMMINGS et al, 1998). As sub-

regiões da laringe devem ser distintas no que diz respeito à etiologia.

O tabaco predomina no risco do câncer da glote, ao passo que a

associação alcoolismo e tabagismo é mais proeminente nos casos da

supraglote (WORLD CÂNCER RESEARCH FUND AND AMERICAN

INSTITUTE FOR CÂNCER, 1997). A relação do asbesto com o câncer

de laringe é controversa, apesar de sua pronunciada relação com o

câncer de pulmão (SMITH; HANDLEY; WOOD, 1990). Algumas

estatísticas também revelam aumento na incidência do CECL em

Introdução

25

indivíduos expostos a substâncias irritantes (níquel, gás mostarda

nitrogenada, pó de óxido de ferro, vapores de ácido, etc.) (BARKLEY

et al., 1972; MERLETTI et al., 1984).

Apesar dos inúmeros avanços no diagnóstico, bem como no

tratamento do câncer de cabeça e pescoço, a sobrevida aumentou

pouco mais de 10% nos últimos 30 anos (JERNAL et al., 2002; CHEN;

SANKARANARAYANAN; SHEN, 1998). Esse aumento está entre os

mais baixos obtidos para os carcinomas de todo o corpo, mantendo

os índices de cura num platô desde 1975 (LANDIS et al., 1999).

É marcante a heterogeneidade de fatores envolvidos na

evolução do carcinoma epidermóide. Muitas características clínicas e

histopatológicas já foram extensamente estudadas e são

consideradas úteis como fatores prognósticos, sendo usadas na

indicação terapêutica dessa neoplasia. Dentre elas, o estadiamento

da lesão (TNM), o sítio anatômico da lesão, grau de diferenciação

tumoral e influência de fatores etiológicos (cigarro, álcool e HPV).

A classificação e estadiamento da neoplasia, segundo o

sistema TNM de classificação de tumores malignos (SOLBIN;

WITTEKIND, 2004) (Anexo 1), representa impacto importante na

sobrevida dos pacientes com CECL. O estadio T dá mais informação

de prognóstico no que diz respeito à recorrência no sítio primário. Em

termos de sobrevida, os fatores prognósticos mais importantes são a

Introdução

26

presença de metástases linfonodais (estadio N) e a detecção de

extravasamento capsular (PINSOLLE; PINSOLLE; MAYOUFRE, 1997).

Com relação à diferenciação histológica, sabe-se que

tumores bem diferenciados (com predomínio de células diferenciadas)

tendem a uma evolução mais favorável que os pouco diferenciados.

Uma divisão cirúrgica da laringe em supraglote, glote e

subglote tem correlação embriológica e anatômica e valor em prever

padrões de invasão e comportamento tumoral. A região glótica tem

uma drenagem linfática pobre, levando à baixa capacidade de

disseminação do tumor para os linfonodos cervicais, e em geral, é

sede de carcinomas espinocelulares bem diferenciados. Esses fatores,

associados à precocidade de seus sintomas, fazem com que o

prognóstico do tratamento dos tumores da glote tenha melhor

perspectiva (NORONHA; DIAS, 1997). A supraglote, pelo contrário,

com sua rica rede linfática, tem grande poder de disseminação

tumoral para os linfonodos cervicais. Devido ainda ao fato de sua

origem embrionária ser o primórdio bucofaríngeo (3º ou 4º arco), que

não é dividido pela linha média, essa disseminação pode ser bilateral.

A sintomatologia dos tumores dessa região é escassa e, geralmente,

os tumores manifestam sinais e sintomas em um estágio mais

avançado. Esses dados concorrem para o fato de que tumores da

supraglote apresentem pior prognóstico (CUMMINGS et al., 1998)

Introdução

27

Esses aspectos, porém, não são suficientes em todos os casos

observados e, com isso, não é raro observar tumores com

características clínicas e histopatológicas favoráveis apresentarem

evoluções agressivas e, ao contrário, tumores com aspectos de mau

prognóstico apresentar evolução mais branda.

Nos últimos anos, o estudo das alterações celulares e

moleculares tem se desenvolvido no sentido de detectar marcadores

moleculares. A análise da expressão dos marcadores tumorais auxilia

na localização de tumores primários ocultos e a presença de

neoplasia nas margens cirúrgicas, mas principalmente, auxilia na

identificação de indivíduos mais suscetíveis a desenvolverem o CECL,

bem como aqueles portadores de neoplasia de maior agressividade e

com maior propensão para metástases locorregionais e à distância e

com isso orientar o melhor tratamento.

As bases genéticas do câncer de cabeça e pescoço são

complexas. Entretanto, após cuidadosos estudos cromossômicos e

genéticos, tem havido melhor compreensão dos eventos moleculares

envolvidos na sua origem e progressão (SHIN; LIPPMAN; HONG,

1999). Diferenças no padrão cromossômico e na progressão

carcinogênica entre os CECL e outros carcinomas espinocelulares da

cabeça e pescoço (CECCP) têm sido demonstradas por estudos

genômicos comparativos (HUANG et al., 2002), em particular o TP53,

Introdução

28

que é normalmente expresso nos CECL mais freqüentemente que nos

outros CECCP (BOSCH et al., 2004). Outros marcadores moleculares

e alterações cromossômicas diversas têm sido descritos

recentemente nos CECL, dentre eles, o CDK2NA (conhecido também

como p16), a ciclina D1, os marcadores de proliferação, o receptor do

fator de crescimento epidérmico, o Bcl-2, o gene da tríade frágil da

histidina, as alterações do cromossomo 8.

Figueiredo et al. (2006), em análise da expressão de RNAm

dos genes codificantes de antígenos tumorais (CT Antigens) – MAGE -

1,4,10,12,BAGE, GAGE, LAGE, NYESO1 e PRAME – observaram a

expressão desses genes, em proporções variáveis (de 6,1 a 48%),

em CECCP. Concluíram ainda, que no caso de tumores avançados,

pelo menos um desses antígenos encontra-se expresso em 66,6%

dos casos.

A família de genes S100 compreende, pelo menos, 13

membros localizados na região cromossômica 1q21. As proteínas

ligadoras de cálcio S100 se localizam no citoplasma e/ou no núcleo de

uma variedade de células (SMITH; SHAW, 1998) e estão envolvidas

em uma série de processos celulares, como a progressão e a

diferenciação do ciclo celular (ZIMMER et al. 1995). Recentemente,

tem se observado o envolvimento de algumas proteínas da família

S100 com muitos tipos de câncer (OHUCHIDA et al., 2005;

Introdução

29

ARUMUGAM; RAMACHANDRAN; LOGSDON, 2006; JASSEM et al.,

2006).

A proteína ligadora de cálcio S100 A7, também conhecida

por psoriasin 1 ou S100 A7 é um novo gene, localizado na região

cromossômica 1q21 e compartilha os domínios dos ligantes de cálcio

que define a família de genes S100 (WATSON; LEYGUE; MURPHY,

1998). Ele codifica pequenas proteínas citoplasmáticas ligantes do

cálcio (SCHAFER; HEIZMAN, 1996), responsáveis pelo crescimento

celular, diferenciação e determinação do formato celular (WATSON;

LEYGUE; MURPHY, 1998).

Evidências recentes afirmam seu papel na patogênese de

inflamações de pele como fator quimiotático para células

hematopoéticas, bem como papel em estágios precoces da

progressão do tumor de mama em associação com o surgimento do

fenótipo invasivo (WATSON; LEYGUE; MURPHY, 1998).

Ainda não se encontra na literatura relação das proteínas

S100 com o CECL, em especial o psoriasin 1 (S100 A7) (LIANG et al.,

2007).

Por tudo isso, acredita que o estudo do gene S100 poderá

fornecer informações sobre os CECL indicando aqueles que terão

evolução mais agressiva para que, através de terapêutica apropriada,

possam ser controlados.

2. REVISÃO DE LITERATURA

Revisão de Literatura

31

2.1. Incidência

A incidência do câncer de laringe é muito baixa, com notáveis

exceções (LEVI et al., 1993; MUIR et al., 1998), como em várias

áreas da Europa central (Espanha, França, Itália, Portugal), sul do

Brasil, Uruguai, Índia e partes do sudeste Asiático (PARKIN et al.,

1992; PINHEIRO et al., 2003).

Corresponde à décima primeira neoplasia mais freqüente. É

mais comum nos homens e em negros em áreas urbanas. A relação

mundial homem/mulher, em torno de 7/1, é a maior que em

qualquer outra neoplasia, o que demonstra a sua raridade nas

mulheres (PARKIN; PISANI; FERLAY, 1999). Entretanto, essa relação

tem decrescido com o tempo em muitos países (Bélgica e Estados

Unidos), à custa do aumento de incidência nas mulheres. Uma

relação similar (em torno de 6:1) foi encontrada na região

metropolitana de São Paulo de 1999 a 2001 (SARTOR, 2003). No

Brasil, as taxas de incidência para os homens são em torno de 7 a 15

casos/100.000 habitantes e nas mulheres entre 1,5 a 1,8

casos/100.000 habitantes (WUNSCH, 2004).

Das dez regiões mundiais de maior freqüência do câncer da

laringe nos homens, cinco delas estão localizadas na Espanha (País


32

Basco, Navarra, Zaragoza, Granada e Murcia). Altas taxas de

incidência também são encontradas na Itália, na Polônia e no Brasil.

Nas mulheres, a incidência é notadamente mais alta na população

negra dos Estados Unidos, sendo a maior taxa de incidência nas

negras de Nova Orleans (3,8 casos/100.000 habitantes)

(RAFFERERTY; FENTON; JONES, 2001).

A incidência do câncer de laringe cresce com a idade, sendo

grande parte deles diagnosticados em indivíduos acima de 65 anos

(45% dos casos), tendo o pico de incidência nas 6ª e 7ª décadas de

vida (FERLAY et al., 2001).

Variações na distribuição dos tumores nos diferentes sítios da

laringe são observadas. Tumores glóticos estão mais presentes nas

populações Anglo-saxônicas; na França, na Índia e, na população

negra dos Estados Unidos, o número de tumores de glote e de

supraglote é aproximadamente igual (RAFFERERTY; FENTON; JONES,

2001), enquanto que no sul da Europa, os tumores de supraglote são

mais freqüentes (EUROPEAN NETWORK OF CÂNCER REGISTRIES,

1997). No Brasil, os tumores de glote são os mais freqüentes (65%

dos casos), seguidos pelos de supraglote (30 a 35% dos casos) e de

subglote (5% dos casos) (NORONHA; DIAS, 1997).


33

2.2. Fatores de Risco

O câncer de laringe é uma doença multifatorial influenciada pelo

ambiente e pelo estilo de vida. A forte relação do tabaco com o

câncer de laringe já foi demonstrada em uma grande variedade de

estudos epidemiológicos, onde se observa seu efeito, independente

do consumo do álcool (INTERNATIONAL AGENCY FOR RESEARCH ON

CANCER, 1986, 1988). O consumo excessivo de bebidas alcoólicas e

a exposição ocupacional a algumas substâncias químicas (asbestos,

gás mostarda e ácido sulfúrico) também são fatores de risco. Além

desses, baixo nível sócio econômico, infecção pelo papiloma vírus

humano (HPV) e refluxo gastroesofágico têm sido sugeridos como co-

fatores do câncer de laringe por alguns estudos epidemiológicos.

2.2.1. Tabaco e Álcool

O câncer de laringe é causado, principalmente, pelo tabagismo

e o consumo de bebidas alcoólicas, independentemente do tipo de

bebida (LICITRA et al., 2003). O consumo crônico de cigarro e de

bebidas alcoólicas, isolados ou não, aumenta o risco de câncer de

laringe em uma relação dose dependente (WUNSCH, 2004).

O risco relativo é maior para o tabagismo que para o alcoolismo

(WUNSCH, 2004). Tuyns et al. (1988) avaliaram o resultado do

tabagismo e do alcoolismo em um estudo multicêntrico de caso


34

controle, comparando 1.147 casos de homens com diagnóstico de

câncer de laringe e de hipofaringe com 3.957 homens sem neoplasia

(caso controle). O risco associado ao tabagismo foi de 10 para todos

os sítios da laringe e da hipofaringe. Por outro lado, o risco associado

ao consumo de álcool variou de acordo com o sítio da neoplasia,

sendo maior na hipofaringe e na supraglote (OR: 4,3) e, menor na

glote (OR: 2,1) para a mesma dose. Os autores também concluíram

que a associação de tabagismo com etilismo tem um efeito

multiplicativo. Para Wunsch (2004), as diferentes regiões anatômicas

da laringe devem ser consideradas separadamente, com relação aos

fatores de risco. Assim, segundo eles, o tabaco domina o risco nos

tumores da glote, ao passo que o álcool, nos tumores da supraglote.

De acordo com estudo caso-controle no sudeste da Europa,

mais de 90% da presente incidência de CECL poderia ser prevenida

abolindo o tabagismo e o consumo de bebidas alcoólicas. Maior parte

do risco é atribuída ao tabagismo, mas a redução do consumo de

bebidas alcoólicas, isoladamente, poderia, ainda, prevenir 25% dos

casos (TUYNS et al. 1998). O cigarro e o álcool parecem ter ação

sinérgica. (LICITRA et al., 2003).

2.2.2. Outros Fatores

Desde os anos 70, a exposição a asbestos tem sido referida


35

como fator de risco para o câncer de laringe (STELL; Mc GILL , 1973;

NEWHOUSE; BERRY, 1973). Em um estudo caso controle, Shettigara

e Morgan (1975) descobriram que o asbesto estava fortemente

associado ao câncer de laringe, tanto quanto o cigarro e o álcool.

Desde então, outros estudos têm mostrado a incidência elevada em

trabalhadores expostos a asbestos. (BURCH et al., 1981; BERRINO et

al., 2003).

Em 1992, baseados no resultado de uma variedade de estudos

a IARC (International Association on Research on Cancer) concluiu

que há suficientes evidências para classificar o ácido sulfúrico e

outros ácidos inorgânicos como carcinógenos humanos incluindo o

risco para surgimento de câncer laríngeo, pulmonar e nasosinusal.

(IARC, 1992). Estudos também demonstram risco elevado em

trabalhadores da construção (devido à exposição ao cimento)

(BOFFETA et al., 2003), bem como indivíduos expostos à madeira

(madeireiras e marcenarias) (WYNDER; COVEY; MABUCHI, 1976;

POLLÁN; LÓPEZ-ABENTE, 1995; BERRINO et al., 2003).

Estudos caso controle no Uruguai demonstraram que dieta rica

em carne salgada e gordura de origem animal estão relacionadas com

o câncer de laringe (De STEFANI et al., 1995; OREGGIA et al., 2001).

Entretanto, evidências de vários estudos epidemiológicos sugerem

que uma dieta rica em frutas e vegetais parece ter efeito protetor.


36

Vitaminas como carotenóides, retinol e vitamina C devem produzir

decréscimo no risco de desenvolver o câncer de laringe. (ESTÈVE et

al., 1966; BOSETTI et al., 2002).

Tem se postulado também a relação entre a infecção pelo

papilomavírus humano (HPV) (Tipos 16, 18 e 33) e o câncer da

laringe (SUGAR; VERECZKEY; TÓTH, 1996). A positividade do HPV é

muito maior no câncer de cavidade oral e de faringe (HERRERO,

2003), enquanto no de laringe é evidente apenas em um grupo

restrito de pacientes (TORRENT; OJEDA, 2007).

O refluxo gastroesofágico tem chamado a atenção como um

possível fator etiológico, devido à sua alta prevalência em pacientes

com CECL. A associação do refluxo gastroesofágico com o câncer da

laringe foi sugerida, primeiramente, por Olson, em 1983, ao

identificá-lo em uma série de pacientes com refluxo gastroesofágico.

Desde então, sua alta prevalência em pacientes com CECL tem sido

amplamente relatada (KOUFMAN, 1991; QADEER; COLABIANCHI;

VAEZI, 2005). Entretanto, são encontrados resultados conflitantes a

respeito da comprovação do refluxo como fator de risco para câncer

de laringe, uma vez que sua prevalência é alta na população.

2.3. Mortalidade, Sobrevida e Prognóstico

Com relação à mortalidade, estima-se que ocorre 90.000


37

mortes ao ano devido ao câncer de laringe nos homens e cerca de

12.000 nas mulheres (FERLAY et al., 2001). A mortalidade, devido a

esse tipo de câncer, é particularmente alta em homens do leste e

sudeste asiático (taxas de 6,5 a 7,5/100.000), seguidos pela América

do Sul (sul de Brasil, Uruguai e Argentina). Ela é muito rara nas

mulheres (0,4% de todas as mortes por câncer no mundo) (PISANI et

al., 1999). No Brasil, as taxas de mortalidade mais altas para homens

(6,2 casos/100.000) e para mulheres (0,2 casos/100.000) são

encontradas em São Paulo e as mais baixas no estado do Maranhão

para os homens (0,6/100.000) e no Acre e no Amapá para as

mulheres (menor que 0.01/100.000) (INCA - INSTITUTO NACIONAL

DO CÂNCER, 2002).

Variações na incidência e na mortalidade do câncer de laringe

estão associadas à tendência de outros tipos de câncer relacionados

com tabagismo e etilismo. Tendência ascendente é observada na

Europa central, Leste Europeu e na maioria dos países em

desenvolvimento, ao passo que na América do Norte e no oeste da

Europa se observa estabilização nessas taxas ou mesmo tendência

para declínio (COLEMAN et al., 1993). Incidências crescentes nas

mulheres são reportadas no Canadá, na Itália, na Dinamarca, noa

Estados Unidos e na Austrália (LICITRA et al. 2003). Na América

Latina, diferentes tendências são encontradas, a saber: em Cuba (em


38

crescimento), em Porto Rico (estável) e em Cali, na Colômbia

(declínio). Na cidade de São Paulo ocorre declínio nos homens e

estabilidade nas mulheres (MIRRA; FRANCO, 1985; MIRRA;

LATORRE; VENEZIANO, 2004).

Com relação à mortalidade, encontra-se crescimento na Costa

Rica, no Uruguai e declínio no Chile e na Venezuela (COLEMAN et al.,

1993). No Brasil, as taxas de mortalidade para os homens foram de

2,5/100.000 em 1979 para 3,0/100.000 em 1999 e para as mulheres

se manteve estável (em torno de 0,4/100.000), ao longo desse

período (INCA, 2002). Em São Paulo, as taxas de mortalidade se

mantiveram estáveis de 1969 a 1998 para homens e mulheres, com

taxas menores que 1/100.000 para as mulheres e de 6 a 8/100.000

para os homens (MIRRA; LATORRE; VENEZIANO, 2004).

De acordo com os dados de países em desenvolvimento, o

prognóstico para todos os pacientes com câncer de laringe

permanece inalterado desde os anos 70 (AUSTIN; REYNOLDS, 1997).

Por outro lado, na Europa, houve um aumento significativo no

prognóstico de 1978 a 1989, pois a sobrevida em cinco anos subiu de

58% para 63% (BERRINO et al., 1995; BERRINO; CAPOCACCIA;

ESTEVE, 1999). Idade avançada, doença regional ou metastática e

tumores da supraglote estão associados à pior sobrevida (PICCIRILLO

et al, 1994; AUSTIN; REYNOLDS, 1997; SASAKI; JASSIN, 2001). Os


39

tumores da glote têm sobrevida mais favorável que os da supraglote

ou da subglote, que têm sobrevida pobre, semelhante aos da faringe

(PERA; MORENO; GALINDO, 1986; STELL, 1990). Dentre as principais

causas, destaca-se a precocidade de sintomas e baixo grau de

metastatização regional e a distância nos tumores glóticos.

2.4. Fatores Prognósticos

2.4.1. Idade

A idade como fator prognóstico é controversa. A opinião de

consenso é que pacientes de idade avançada têm sobrevida menor,

mas é necessária a correlação com outros fatores prognósticos

(JANOT; KLIJANIENKO; RUSSO, 1996; JONES et al., 1998).

2.4.2. Estado Geral do Paciente

Singh et al. (1998) demonstraram que a comorbidade medida

pelo Índice de Comorbidade de Kaplan Feinstein, analisada como

fator independente, tem um efeito negativo na sobrevida específica

do tumor e na taxa loco regional de recorrência. Usando análise

multivariada, Magnanno et al. (1995) demonstraram que pacientes

com doença em vias aéreas baixas ou hepáticas têm maior chance de

recorrência locorregional. Entretanto, Jones et al. (1998), estudando

3442 pacientes, não comprovaram que o estado geral do paciente


40

possa ser um fator prognóstico independente.

O estado imune do paciente é considerado um fator prognóstico

importante, porém o seu mecanismo ainda é incerto. O número

absoluto de células T (KATZ, 1983), o grau de infiltração linfocitária

(WOLF et al., 1986) e a presença de eosinofilia tecidual

(GOLDSMITH; CRESSON; ASKIN, 1987; THOMPSON; BRADLEY;

GRIFFIN, 1994) estão associados a prognóstico favorável. Em

contraste, outros trabalhos não conseguiram comprovar tal relação

(ESTEBAN et al., 1996). O estado nutricional afeta marcantemente a

função imune do paciente e indivíduos com balanço nitrogenado

negativo apresentam pior resposta ao tratamento (BROOKES;

CLIFFORD, 1981; LOPEZ et al., 1994).

2.4.3. Estadiamento do Tumor

O estadiamento dos tumores de laringe, definido pela

classificação de tumores malignos TNM, UICC (SOLBIN; WITEKIND,

2004), constitui um fator prognóstico independente para recorrência

locorregional e/ou sobrevida específica do tumor (CEREZO et al.,

1992; MAGNANNO et al., 1995).

2.4.3.1 Estadio T

O estadio T dá mais informação de prognóstico no que diz


41

respeito à recorrência no sítio primário que recorrência em linfonodos

(CEREZO et al., 1992) e tem um peso menor na sobrevida em relação

ao estadio N. A mobilidade de pregas vocais (que influencia o

estadiamento T) é considerada um fator prognóstico independente no

controle regional (PRADIER et al., 1996; SAKATA et al., 1994).

2.4.3.2. Metástase Linfonodal

É consenso que, em termos de sobrevida, os fatores

prognósticos de maior impacto são a presença de metástase

linfonodal e a detecção de extravasamento capsular, sendo mais

importantes que outros, como: número de linfonodos, estadio N,

localização do linfonodo no pescoço ou fixação do linfonodo. (ALVI;

JOHNSON, 1996; BARZAN; TALAMINI, 1996; NICOLAI et al., 1997;

De CARVALHO, 1998; JONES et al., 1998). O status clínico (ao

contrário do patológico) dos nódulos cervicais também é um

marcador independente de prognóstico para sobrevida e recorrência

locorregional (ZATTERSTROM et al., 1991; CEREZO et al., 1992;

KOWALSKI et al., 1996). Entretanto, devem-se ressaltar as

discrepâncias entre a avaliação clínica e a patológica dos linfonodos,

isto é, 40% dos casos de pescoço N0 são falso negativos e 50% dos

casos de pescoço, clinicamente positivos para nódulos cervicais, são

falso positivos (ALI; TIWARI; SNOW 1985; MADSEN et al. 1991).


42

Melhorias nas tecnologias de imagem, como por exemplo, o PET-CT

(Tomografia por Emissão de Positrons), devem aumentar a

sensibilidade e a especificidade na avaliação de doença linfonodal e

dar mais informações prognósticas antes de iniciar o tratamento

(WONG et al. 1997).

2.4.4. Grau Histológico do Tumor

Os CECL são classificados de acordo com a diferenciação celular

de seus elementos celulares. Essa classificação é expressa com base

na porcentagem de células diferenciadas em relação ao total de

elementos celulares. Com isso, os tumores são classificados em

tumores bem diferenciados (BD), moderadamente diferenciados (MD)

e pouco diferenciados (PD). Os tumores BD consistem naqueles que

possuem de 100 a 75% de células diferenciadas; os MD são aqueles

que possuem de 75 a 50% e os PD possuem menos que 50% de

células diferenciadas em relação à população celular total do tumor

(BACCHI; ALMEIDA; FRANCO, 1999).

O grau de diferenciação histológica do tumor tem demonstrado

conter informação prognóstica independente em termos de sobrevida

(De CARVALHO, 1998; WIERNICK et al. 1991). Alguns autores,

entretanto, defendem a tese de que uma graduação histológica

composta, baseada em vários fatores como polimorfismo nuclear,


43

taxa de mitose, estrutura histológica, modo de invasão, invasão

vascular e resposta celular do indivíduo poderia oferecer informações

mais úteis da sobrevida (JAKOBSON, 1976; BRYNE; JENSSEN;

BAYSEN. 1995).

2.4.5. Sítio Anatômico do Tumor

É consenso que para um mesmo estadio T, tumores de

orofaringe e hipofaringe têm pior prognóstico que os de laringe e

tumores de supraglote têm pior prognóstico que os da região glótica

(MAGNANO et al., 1997; WEBER; JONHSON; MEYERS, 1993;

BATAINI, 1993). Entretanto, não há nenhuma evidência que confirme

que tumores desses diferentes sítios têm diferenças biológicas,

exceto nos tumores da supraglote, que em comparação com os

tumores da glote, tendem a ser menos diferenciados (STELL, 1990).

Tumores da glote têm melhor prognóstico que tumores da supraglote

ou da subglote devido a uma série de fatores, dentre eles, o seu

menor potencial de metastatização e o melhor grau de diferenciação.

Para os tumores da glote, aqueles que atingem a comissura anterior

carregam pior prognóstico em termo de controle local e sobrevida

(SCHVERO et al. 1994; RUCCI; GAMMAROTA; GALLO, 1996).


44

2.4.6. Neoangiogênese

A angiogênese ocorre em resposta a um balanço entre fatores

regulatórios positivos e negativos que se interagem de uma forma

complexa e pouco conhecida (GREENMAN; HOMMER; STAFFORD,

2000). O fator de crescimento vascular endotelial (EGFR) é,

provavelmente, a citocina mais importante na angiogênese devido a

uma série de razões: funções pró-angiogênicas múltiplas, receptores

específicos para célula endotelial e também porque, tanto o

crescimento do tumor quanto a angiogênese são bloqueados quando

a sua ação é inibida (FOLKMAN, 1990). A indução da angiogênese é

um fator crítico no desenvolvimento tumoral, crescimento, invasão e

metástase (FOLKMAN, 1990). Existe correlação bem estabelecida

entre a angiogênese, medida pela densidade dos microvasos e pela

agressividade tumoral em muitos tumores sólidos (POTGENS et al.,

1995), mas a evidência desse fato nos CECCP é controversa, pois

alguns estudos comprovam tal associação (GASPARINI et al., 1993;

KILIJANIENKO et al., 1995; SHPITIZER et al., 1996; MURRAY et al.,

1997; EISMA; SPIRO; KREUTZER, 1999) e outros reportam a

ausência de associação com variáveis clínicas importantes (CARRAU

et al., 1995; DRAY; HARDIN; SOFFERMAN, 1995; MORYAMA et al.,

1997; HEDGE et al., 1998).


45

2.5. Avanços Genéticos

Atualmente, os únicos fatores prognósticos rotineiramente

considerados no momento da decisão do tratamento são o tamanho

da lesão, a localização do tumor e a presença de metástases

linfonodais e/ou à distância.

Com a rápida expansão de informações a respeito dos avanços

na medicina molecular e imuno-histoquímica, uma quantidade

crescente de fatores está sendo responsabilizada por prover

informações prognósticas para o CECCP. O carcinoma espinocelular

do trato aerodigestivo, no qual os tumores da laringe representam o

seu maior grupo, é caracterizado por uma marcante heterogeneidade

em seu comportamento biológico. Em comparação com tumores

sólidos de comportamento biológico mais simples, como o carcinoma

de cólon, de pulmão e de mama, poucos trabalhos foram feitos para

esclarecer a importância das novas moléculas, no que diz respeito à

significância no prognóstico. Além do que, a maioria desses estudos

foi feita em pequenos grupos de tumores, tornando difícil a avaliação

do seu valor no prognóstico.

2.5.1. Marcadores Pré-neoplásicos

São moléculas expressas antes do surgimento tumoral. Uhlman

et al. (1996) compararam a expressão dos marcadores TP 53, EGFR e


46

a ciclina D1 em pacientes com displasia em mucosa laríngea, que

subseqüentemente, desenvolveram o carcinoma in situ ou carcinoma

invasivo de laringe, durante, pelo menos, quatro anos. Esse estudo

revelou a expressão do TP 53 em dois terços ou mais do epitélio e

forte expressão da ciclina D1; todas elas fortemente relacionadas

com a progressão da displasia para neoplasia invasiva e demonstrou

que a imuno-histoquímica pode ser útil para identificar indivíduos de

risco para desenvolver tumor invasivo.

2.5.2. TP 53

A p53 é uma proteína supressora tumoral, cuja função é

promover a morte de células anormais, por apoptose. A mutação no

gene TP 53, presente em mais de 50% dos tumores humanos, faz

esse gene atuar na carcinogênese. Imagina-se que a mutação do

gene TP 53 produz uma proteína inativa, porém mais estável

metabolicamente. A expressão oncogênica da proteína supressora

tumoral p53 pode ser detectada por imuno-histoquímica (GREENMAN;

HOMMER; STAFFORD, 2000).

As mutações do gene TP 53 e sua incidência aumentam com a

progressão da doença (BOYLE et al., 1993). Mudanças simples na

base do TP 53 são as mutações mais comuns. Brennan et al. (1995)

demonstraram que a análise das mutações individuais da proteína


47

pode ser um método de alta sensibilidade para o acompanhamento

do crescimento tumoral em mucosa histologicamente normal. Em seu

estudo, foram analisados 25 pacientes com tumores de cabeça e

pescoço (20 da região da laringe e faringe) e em 13 foi detectada,

pela técnica de RT-PCR, a presença de margens positivas, e desses

observaram-se cinco casos de recorrência local. Dos 12 pacientes

restantes, cujo estudo molecular revelou negatividade das margens,

não houve recidiva. No mesmo estudo, 21% dos linfonodos,

histologicamente negativos, revelaram células anormais além de

expressão anormal do TP 53 e quatro de cada cinco pacientes

deveriam ter seu estadiamento aumentado se fosse levado em conta

os resultados dessa análise molecular.

Estudos posteriores do gene TP 53 indicam que diferentes tipos

de mutação na molécula promovem diferentes efeitos biológicos e

diferente comportamento biológico do tumor (ERBER et al., 1998).

Rowley et al (1998), demonstraram que a expressão anormal do TP

53 pode ser responsável por diferentes taxas de sobrevida para os

tumores de laringe (em torno de 60% em 5 anos) e faringe (menor

que 30% em 5 anos). Para explicar essa diferença, os autores

sugerem que diferentes mutações acontecem nesses dois sítios

distintos e são responsáveis por diferenças no comportamento

biológico e nas taxas de sobrevida. As mutações de regiões de


48

contato, presentes em 36% dos CECCP estão associadas ao aumento

no estadiamento do tumor e na incidência de metástases em

linfonodos, diminuição da sobrevida livre da doença e piora da

sobrevida. (ERBER et al., 1998).

Shin et al. (1996) demonstraram que pacientes com alta

expressão da p53 tiveram pior sobrevida. Nesse estudo foi usada

uma definição muito rígida da expressão do gene TP 53, sendo

considerada positiva qualquer mínima alteração da proteína

supressora tumoral p53 acima do nível basal. Usando esse critério, foi

comprovado que tumores com alta expressão de p53 estão

associados com significante pior prognóstico. Em estudo de revisão,

Oh e Mao (1997) concluíram que tumores com alta expressão da p53

tendem a ser mais agressivos, mas a maioria dos estudos não

conseguiu comprovar correlação estatisticamente significante com a

progressão da doença.

Um estudo muito importante envolvendo o gene TP 53 está

sendo realizado por Clayman et al. (1998), em que foi usado como

vetor o Adenovírus para introduzir cópias normais e funcionantes em

pacientes com CECCP. A razão para tal experimento é que levando

gene TP 53 não mutante ao tumor haveria regeneração da função da

proteína supressora tumoral p53 o que induziria à apoptose da célula

tumoral. Vetores de Adenovírus são os sistemas de vetores mais


49

usados por poderem “infectar” um largo espectro de células em

repouso e em fase de divisão celular. A fase I/II do estudo já

demonstrou ausência de toxicidade ou limite da dose.

A medida da expressão anormal da p53, como um marcador

prognóstico, tem sido estudada por muitos grupos, com conclusões

conflitantes, provavelmente devido a avaliações subjetivas dos

protocolos de imuno-histoquímica, no que diz respeito à interpretação

da expressão anormal. Além disso, apesar da análise molecular da

p53 ter se mostrado um método de grande importância, esse estudo

requer profissionais altamente treinados associado a um investimento

significante de tempo e dinheiro. É, pois, necessária uma automação

do processo para que ele possa se tornar um método clínico de

rotina.

2.5.3. CDKN2A

O CDKN2A, também conhecido como p16 consiste em outro

gene de supressão tumoral envolvido no controle do ciclo celular

(GREENMAN; HOMMER; STAFFORD, 2000). Está localizado na região

cromossômica 9p21, região freqüentemente inativada pela deleção

homozigótica. Estudos realizados por análise imuno-histoquímica

demonstram que a perda do produto do gene CDKN2A pode ser

detectada em aproximadamente 83% dos casos de CECCP (OH; MAO,


50

1997). Estudo retrospectivo em lesões pré-cancerosas demonstrou

que a expressão acentuada da p53 associada à perda ou redução da

expressão da p16 está correlacionada com a progressão para doença

maligna. (GALLO; SANTUCCI; FRANCHI, 1997). Uma combinação de

mutações no CDKN2A e TP 53 foi descrita por possuir valor

prognóstico em predizer a progressão de lesões pré-cancerosas para

tumor invasivo de laringe (GALLO; SANTUCCI; FRANCHI, 1997).

2.5.4. Ciclina D1

A ciclina D1 é uma das muitas moléculas envolvidas no controle

do ciclo celular, agindo especificamente como reguladora da transição

da fase G1 para a S (GREENMAN; HOMMER; STAFFORD, 2000). A

amplificação da região cromossômica 11q13, onde o gene ciclina D1

(também conhecido por CCND1) está localizado está fortemente

correlacionada com o aumento da expressão de sua proteína em

vários estudos de CECCP (SYDRANSKY, 1995).

Kyomoto et al. (1997) compararam o valor prognóstico da

expressão e da amplificação do gene ciclina D1. A sobrevida em cinco

anos dos pacientes, com a amplificação do gene aumentada (22%)

ou com aumento da expressão da sua proteína (53%) foi

significativamente mais baixa que daqueles que não apresentavam tal

alteração genética. Entretanto, usando análise multivariada, apenas


51

os casos de amplificação do gene ciclina D1 obtiveram valor

prognóstico independente (p = 0,0018).

A associação da amplificação do gene da ciclina com a infecção

pelo HPV também já foi relatada (CATTANI et al., 1998). O DNA do

HPV foi encontrado em 29% dos tumores e o gene amplificado da

ciclina D1 foi encontrado em 20% dos casos e estava

significativamente associado com a infecção pelo papilomavirus

humano (HPV), sugerindo a hipótese de que a amplificação do gene

ciclina D1 seja provocada, pelo menos em parte, pelas instabilidades

genômicas causadas pelas oncoproteínas virais E6 e E7.

Anormalidades na região 11q13 têm sido observadas nos

CECCP e sua presença é um indicador de baixo prognóstico

(AKERVALL et al., 1995).

2.5.5. Marcadores de Proliferação

A proliferação celular tem se mostrado aumentada em quase

todos os tumores e é usualmente medida pela proteína Ki-67, um

antígeno nuclear presente apenas nas fases G1, S e G2 do ciclo

celular. Esse antígeno é hoje conhecido com MIB I, o mesmo nome

que a maioria dos anticorpos usados contra essa proteína. Grande

parte dos estudos com os CECL afirma que a Ki-67 não tem valor

prognóstico (GREENMAN; HOMMER; STAFFORD, 2000).


52

Entretanto, Franchi et al. (1996) relataram que o aumento nos

níveis de MIB I estava significativamente associado a metástases

linfonodais ocultas. Esse estudo identificou, ainda, dois outros

fatores: antígeno de proliferação celular nuclear (APCN) e E-caderina

que estavam significativamente associados a esses casos de nódulos

falso negativos. O APCN, detectável apenas na fase S do ciclo celular

estava com sua expressão aumentada nos linfonodos com metástases

ocultas. A perda da E-caderina, molécula de adesão celular, também

foi observada. Esse estudo novamente sugere que uma combinação

de marcadores é capaz de fornecer informações úteis na detecção de

metástases ocultas.

2.5.6. Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico

Um aumento da expressão do receptor do fator de crescimento

epidérmico (EGFR) tem sido relatado em quase todos os casos de

CECCP e as alterações na sua expressão são encontradas nas fases

iniciais da carcinogênese (UHLMAN et al., 1996).

O EGFR é uma glicoproteína de superfície celular que se liga a

uma variedade de moléculas homólogas incluindo o fator de

crescimento epidérmico, transformador de crescimento-α (TGFα) e

fator de crescimento fibroblástico (α-FGF).

Grandis et al, (1998) demonstraram que a expressão do


53

receptor do fator de crescimento epidérmico e do TGFα em 91

pacientes com CECCP estavam associados com a diminuição da

sobrevida livre da doença.

Outra análise do receptor do fator de crescimento epidérmico

foi realizada por Maurizi et al. (1996) em 140 carcinomas

espinocelulares primários de laringe. A taxa de sobrevida em cinco

anos foi de 81% e 25% para os casos EGFR negativos e positivos,

respectivamente. A acurácia em sua quantificação parece prover

informações prognósticas importantes.

2.5.7. CD 44

A CD44 é uma molécula expressa na superfície celular,

encontrada em muitas células de origem hematopoéticas, endoteliais

e mesoteliais (BARCLAY et al., 1998). Dentre as várias funções do

CD44, molécula encontrada em várias isoformas, uma é fazer

interações célula-célula e célula-substrato. O epitélio laríngeo normal

expressa grandes quantidades de CD44H, uma forma da molécula

que se liga muito bem à matriz glicana extracelular e CD44v6, uma

forma variante com menor capacidade de ligação (SPADDFORD et al.,

1996).

Spafford et al. (1996) demonstraram que para pacientes com

CECL - Estadio IV, a diminuição na expressão de CD44H está


54

relacionada com a alta taxa de metástase e baixa sobrevida. Baixa

expressão do CD44v6 também se correlaciona com baixa sobrevida.

Acredita-se que uma redução da expressão do CD44 evita a

sinalização intercelular através de seus receptores ou reduz a adesão

à matriz extracelular favorecendo a formação de massas tumorais e

aumentando o potencial de metástases (SPADDFORD et al., 1996).

2.5.8. Bcl-2

A família de genes Bcl-2 é essencial para a sobrevivência das

células por inibir a ação de adaptadores necessários para a ativação

do sistema de Caspase (série de enzimas mediadoras da apoptose)

(ADAMS; CORY, 1998) . São moléculas, portanto, anti-apoptóticas.

Nas células dos mamíferos existem pelo menos 15 membros da

família Bcl-2 interagindo entre si e com outras classes de moléculas

(ADAMS; CORY, 1998). Uma produção aberrante ou uma mutação

pode contribuir para a carcinogênese. O papel da Bcl-2 foi descrito

primeiramente no linfoma folicular (SITE SOURCE).

Com relação aos CECCP, dois estudos foram relatados, porém

com conclusões completamente distintas. Friedman et al. (1997)

analisaram 33 pacientes com diagnóstico de carcinoma espinocelular

de cavidade oral, faringe e laringe, todos T1 – T2 e N0 demonstrando

associação estatisticamente significante entre aumento da expressão


55

do Bcl-2 e mau prognóstico. Jin et al. (1998) analisaram 83 casos de

CECL e não encontraram relação entre a expressão do Bcl-2 e o

seguimento. As razões prováveis para esse conflito não são muito

claras, mas no primeiro estudo foram analisadas amostras de vários

sítios e o número de amostras foi pequeno.

2.5.9. Ploidia

A ploidia do DNA, material genético contido no núcleo celular, é

o mais estudado de todos os marcadores de câncer em humanos,

visto que células tumorais se apresentam com instabilidades

genômicas resultando em variação do estado normal diplóide. Em

tecidos normais, a maioria das células está na fase de repouso (fase

G0) e na fase diplóide (2N). Após o comprometimento com a divisão

celular e o recrutamento no ciclo celular, as células alcançam as fases

G1, S e G2, se preparando para realizar a mitose. (GREENMAN;

HOMMER; STAFFORD, 2000). Tumores contendo maior pico de

células com menos que o conteúdo diplóide (2N) de DNA são

chamados de hipoplóide ou euplóide; se o conteúdo for 2N são

chamados de diplóide, se 4N tetraplóide e finalmente aneuplóide para

qualquer outro valor.

Uma revisão no valor da medida do DNA dos CECCP concluiu

que existe associação de pior prognóstico e tumores não-diplóides


56

(MILROY et al., 1997). No entanto, Janot et al. (1996), ao contrário,

em estudo com 108 pacientes (84 casos de câncer de laringe e os

demais de faringe) não encontraram significância estatística

associando a ploidia do DNA com recorrência locorregional ou

sobrevida em dois anos. Ambos os estudos são concordantes na tese

de que a proporção de células na fase S não tem valor prognóstico.

Um dos problemas da avaliação do DNA como indicador de

prognóstico é o alto nível de heterogeneidade intratumoral,

observada em muitos tumores.

2.5.10. Região cromossômica 3p14

O gene supressor do tumor FHIT (gene da tríade frágil da

histidina) tem sido identificado como um gene freqüentemente

perdido nos CECCP. Ele se encontra na região 3p14.2, que demonstra

alta freqüência de heterozigosidade (VIRGILIO et al., 1996).

Aproximadamente 80% dos CECCP possuem anormalidade em, pelo

menos, um alelo do FHIT, e esse é um evento precoce na

carcinogênese (GREENMAN; HOMMER; STAFFORD, 2000).

2.5.11. Cromossomo 8

Conforme já visto, células normais diplóides processam duas

cópias de cada gene. Freqüentemente, em conseqüência das


57

instabilidades genéticas dos tumores, regiões cromossômicas variam

em tamanho, desde um simples alelo até uma pequena região,

causando uma pequena perda de genes. Isso é chamado de perda da

heterozigosidade.

Scholnick et al. (1996) identificaram três regiões marcadas:

D8S264 (8P23), D8S552 (8p23-22) e D8S133 (8p21) que contêm

genes supressores tumorais dos CECCP. A investigação dessas

regiões como marcadores tumorais demonstrou apenas o D8S264 de

relevância para o seguimento.

O oncogene MYC (também conhecido por c-myc) localizado na

região cromossômica 8q24 tem sua expressão elevada em muitos

tumores, inclusive nos de cabeça e pescoço. Ele codifica um fator de

ativação de grande número de genes promotores do crescimento. O

nível da amplificação do MYC parece não ter relação com o

seguimento em longo prazo, mas está associado à baixa resposta ao

tratamento (GREENMAN; HOMMER; STAFFORD, 2000).

Riva et al. (1995) demonstraram que o MYC estava expresso

em 89% dos tumores e baixos níveis de amplificação desses genes

estavam associados à ausência de resposta ao tratamento neo-

adjuvante com a quimioterapia.


58

2.6. Proteína ligadora de cálcio S 100A7 (psoriasin 1)

O gene proteína ligadora de cálcio S100 A7 (também conhecido

por psoriasin 1 ou simplesmente S100 A7) é um membro da família

de genes S100, identificado por Madsen et al., em 1991, por codificar

uma proteína de 11,4 KDa, presente em células escamosas epiteliais

da epiderme e isoladas de pele contendo psoríase.

Esse gene é mapeado na região cromossômica 1q21-2q22, que

contem pelo menos 12 genes da família S100 e vários outros genes

da diferenciação epidérmica (SCHAFER et al., 1995; BOGLUM et al.,

1995). Compartilha proximidade cromossômica com outros membros

da família S100, o que justifica sua classificação de S100 A7. Os

genes S100 codificam pequenas proteínas citoplasmáticas com função

de proteínas ligadoras de cálcio (SCHAFER; HEIZMANN, 1996).

Sua expressão é restrita aos queratinócitos e células epiteliais,

diferentemente do padrão dos genes S100 A8, A9 e A12 que são

também expressos em células hematopoéticas da linhagem mielóide

(WATSON; LEYGUE; MURPHY, 1998).

Apesar de ainda não ter sido seqüenciado, acredita-se que

possui a mesma organização estrutural dos genes S100 adjacentes

(HITOMI et al, 1996).

Uma variedade de funções tem sido atribuída a esses genes,

no que diz respeito ao crescimento e diferenciação celular e


59

determinação do formato celular (WATSON; LEYGUE; MURPHY,

1998). É conhecido como uma proteína citoplasmática e secretada

que se encontra aumentada nos queratinócitos em resposta ao cálcio

e ao ácido retinóico e também durante etapas anormais da

diferenciação em culturas (HOFFAMN et al., 1994).

Como a função normal dessa proteína ainda é incerta, usa-se

inferir sua função pela dos genes de sua família. Acredita-se que as

proteínas da família S100 influenciam na transdução do sinal mediado

pelo cálcio e em eventos celulares através de interações diretas com

proteínas alvo. Os alvos relacionados às proteínas S100 incluem

filamentos intermediários (no caso do S100 A8) e anexina (no caso

do S100 A10), responsáveis pela modulação da arquitetura e do

formato (citoesqueleto) celular e pela transdução do sinal

intracelular. As proteínas S100 A8 e A9 também têm funções

intracelulares (reguladora do cálcio e/ou inibidora da atividade da

caseína quinase) e várias funções extracelulares complexas (fator de

inibição de migração e fator quimiotático para monócitos e

granulócitos em diferentes circunstâncias) (HESIAN; EDGEWORTH;

HOGG, 1993).

No caso do S100 A7, a sua associação com a hiperplasia

psoriasiforme da pele sugere um papel na diferenciação dos

queratinócitos, entretanto o psoriasin 1 também tem ação


60

quimiotática (JINQUAN et al., 1996) estimulando a infiltração de

neutrófilos e linfócitos T CD4+ na pele, o que caracteriza a psoríase.

(WATSON; LEYGUE; MURPHY, 1998).

A associação do S100 A7 com a psoríase e seus altos níveis de

expressão na hiperplasia psoriasiforme epidérmica já foram bastante

relatados. Entretanto, esse gene também é expresso sob condições

de diferenciação epitelial anormal e é secretado por queratinócitos no

carcinoma de bexiga (CELIS et al., 1996). Mais recentemente, o

psoriasin 1, bem como as proteínas S100 A8 e S100 A9, foram

encontrados em outros epitélios anormais, incluindo o epitélio

neoplásico ductal de mama e o epitélio brônquico de indivíduos com

fibrose cística (WATSON; LEYGUE; MURPHY, 1998).

2.6.1. O S100 A7 e o Câncer de Mama

A ruptura nas etapas sinalizadas pelo cálcio tem sido associada

com o mecanismo central na gênese tumoral e no processo de

invasão e de metástase (KOHN; LIOTTA, 1995). Um componente

importante da sinalização intracelular do cálcio é a família de genes

S100 que são freqüentemente expressos em algumas linhagens de

câncer de mama e em alguns tecidos (SCHAFER; HEIZMANN, 1996),

mas sempre com diferentes padrões de regulação, o que demonstra

que o tipo celular e o estágio específico da regulação da expressão é


61

característica da família S100.

Moog-Lutz, et al. (1995) demonstraram, pela primeira vez, a

expressão do S100 A7 em metástase de tumor de mama. Estudos

posteriores da expressão do RNAm do psoriasin 1 em diferentes

estágios da tumorigênese demonstraram ser baixa ou indetectável a

sua expressão em tecidos normais ou em lesões ductais hiperplásicas

proliferativas, porém era sempre altamente expressa no carcinoma

ductal in situ e baixa ou indetectável em carcinoma invasivo (LEYGUE

et al., 1996). Esse padrão sugere que a expressão da proteína

ligadora de cálcio S100 A7 está associada com alterações na

diferenciação do epitélio glandular dos carcinomas ductais in situ e

devem ter um papel na progressão tumoral precoce. Outro fator

adicional para o envolvimento na progressão do carcinoma ductal é a

sua localização em uma região do cromossomo 1, que,

freqüentemente (> 50% dos casos) apresenta perda da

heterozigosidade nos tumores invasivos. (MUNN; WALKER; VARLEY,

1995).

O S100 A7 tem efeito importante no desenvolvimento do

fenótipo invasivo, que pode ser tanto um efeito indireto nas células

da resposta imune do hospedeiro ou mesmo uma influência mais

direta na motilidade epitelial. (WATSON; LEYGUE; MURPHY, 1998).

Enquanto nenhum efeito quimiotático nas células epteliais tem


62

sido demonstrado, até agora, fica claro que as proteínas S100 A8 e

A9 e suas formas heterodiméricas podem exercer efeitos

quimiotáticos inibitórios ou estimulatórios em diferentes tipos

celulares sob diferentes condições (HESIAN; EDGEWORTH; HOGG,

1993) É sabido também que outras proteínas derivadas do eptélio

podem ser quimiotáticas para macrófagos e queratinócitos (WANG et

al., 1996).

Portanto, o psoriasin 1 pode exercer função inibitória na

migração epitelial dos tumores ductais in situ, cuja perda poderia

contribuir para a invasão tumoral (WATSON; LEYGUE; MURPHY,

1998).

3. HIPÓTESE

Hipótese

64

Considerando que a proteína ligadora de cálcio S100 A7

(psoriasin 1) é expressa no epitélio estratificado escamoso e possui

alta expressão no carcinoma ductal da mama e no carcinoma

espinocelular de pele, de bexiga e de boca, levanta-se a hipótese de

que tal proteína encontra-se altamente expressa em carcinoma

espinocelular de laringe e a sua expressão se correlaciona com

características histopatológicas e com aspectos clínicos da neoplasia.

4. OBJETIVOS

Objetivos

66

O presente estudo em carcinoma espinocelular de laringe visa:

a. identificar a expressão imuno-histoquímica da proteína

S100 A7 (psoriasin 1);

b. identificar a correlação entre a expressão dessa proteína

com variáveis clínicas e características histopatológicas

do tumor;

c. comparar as curvas de sobrevida global entre pacientes

cujos tumores expressam a proteína psoriasin 1 e

aqueles que não a expressam.

5. CASUÍSTICA E MÉTODOS

Casuística e Métodos

68

5.1. Casuística

Foram avaliados 63 casos de pacientes com diagnóstico

histopatológico de CECL tratados cirurgicamente no serviço de

cirurgia de cabeça e pescoço do Hospital das Clínicas da Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (HCFMRP-

USP), no período compreendido entre janeiro de 2001 a dezembro de

2005. Foi obtido consentimento prévio dos mesmos mediante

assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 2).

Este estudo obteve aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa do

HCFMRP-USP (Anexo 3).

Todos os pacientes foram examinados e operados, conforme os

protocolos de tratamento vigentes, sem alterá-los, para a realização

deste estudo. O tratamento para o tumor primário utilizado no

serviço foi laringectomias parciais verticais (fronto-lateral, fronto-

anterior ou hemilaringectomia) para os tumores T1 e T2 glóticos. Os

T3 e T4 foram tratados por laringectomia total. Os pacientes com

tumores T1 e T2 de supraglote foram submetidos a laringectomias

parciais horizontais (supraglóticas). Todos os casos de tumores de

subglote foram tratados por laringectomia total.


69

O tratamento cervical eletivo, ou seja, com pescoço N0, foi indicado

em tumores de supraglote e subglote e também para os T4 de glote,

tendo sido realizado o esvaziamento cervical lateral bilateral (cadeias

cervicais II, III e IV). O tratamento cervical terapêutico (indicado nos

casos N+) era realizado sempre que necessário, sendo ele o

esvaziamento cervical radical (ou suas variantes).

A radioterapia pós-operatória foi realizada nos casos de

margens cirúrgicas acometidas com neoplasia, nos casos de

confirmação histológica de acometimento linfonodal (pN+) em mais

de um linfonodo ou nos casos T4 para qualquer sítio.

Os espécimes colhidos foram encaminhados em formalina

tamponada para exame anatomopatológico de rotina. Alguns casos

foram submetidos a exames per-operatórios, principalmente para se

detectar a presença de metástases. Os blocos utilizados no exame

per-operatório não foram utilizados para a realização das reações

imuno-histoquímicas.

Os dados clínicos, sócio-demográficos, anatomopatológicos e de

acompanhamento dos pacientes estudados foram armazenados no

banco de dados pertencente ao projeto Genoma Clínico (GENCAPO)

financiado pela FAPESP e Ludwig Institute for Cancer Research (NY) -

http://www.compbio.ludwig.org.br/clinicalgenomics/.


70

Todos os casos foram revistos em conjunto por dois

patologistas com experiência na área. Os casos foram analisados de

forma sistemática e minuciosa, sendo que alguns casos foram

reclassificados de acordo com as diretrizes do Manual de

Padronização de Laudos Anátomopatológicos (BACCHI; ALMEIDA;

FRANCO, 1999). A seguir, foram escolhidos os blocos

correspondentes às áreas mais representativas da neoplasia para a

realização das reações imuno-histoquímicas. Para cada caso, foi

escolhido pelo menos 1 bloco representativo do fronte de invasão

tumoral. O anticorpo utilizado foi o S100 A7 (Psoriasin) – liquid

mouse monoclonal antibody NCL-L-S100 A7 – Novocastra

Laboratories® (Anexo 4).

O Anexo 5 relaciona todos os pacientes estudados com suas

respectivas características hitológicas e clínicas, bem como o

seguimento clínico.

5.1.1. Critérios de Inclusão

Os critérios de inclusão foram:

o Diagnóstico histopatológico de CECL obtido por biópsia

incisional (saca-bocado) e confirmado por exame

anatomopatológico;

o Ausência de tratamento prévio para a neoplasia;


71

o Indicação da cirurgia como tratamento;

o Aceite do paciente para participar do estudo (através de

assinatura do Termo de Consentimento – Anexo 2);

o Amostra tecidual representativa para a realização do estudo

imuno-histoquímico.

5.1.2. Critérios de Exclusão

Foram excluídos deste estudo cinco pacientes decorrentes de:

o Ausência de precisão quanto ao local do tumor;

o Perda do seguimento clínico;

o Dados clínicos indisponíveis ou incompletos (data da

cirurgia, estadiamento clínico e patológico dos tumores,

radioterapia pós-operatória, recidiva local, recidiva regional,

metástase à distância, segundo tumor primário e óbito).

o Amostra tecidual não representativa e/ou insuficiente para a

realização das reações de imuno-histoquímicas.

5.2. Método

5.2.1. Estudo Histopatológico

As peças cirúrgicas foram fixadas em formalina tamponada a

10% por um período não superior a 48 horas, clivadas e obtidas

áreas representativas da neoplasia. Os fragmentos escolhidos foram


72

processados a fim de serem emblocados em parafina para obtenção

dos cortes histológicos de 4µm de espessura, que foram corados com

hematoxilina e eosina (H&E).

Para cada caso foi selecionado um bloco representativo para a

realização das reações imuno-histoquímicas, sendo obtidos cortes

seriados de 4µm em lâminas com solução adesiva de 3-amino-

propyltriethoxy-silano (Sigma Chemical Co.®, St. Louis, MO/USA).

O anticorpo utilizado para a reação imuno-histoquímica foi o

S100 A7 (Psoriasin) – liquid mouse monoclonal antibody NCL-L-S100

A7 – Novocastra Laboratories®, UK (Anexo 4).

Para evitar reação endógena, devido à presença de biotina e

avidina, foram utilizados polímero dextran e sistema de amplificação

enzimática NovoLink (Novocastra Laboratories®, UK).

Os cortes teciduais de 4µm foram submetidos à recuperação

antigênica pelo calor por 3 minutos em steammer, com solução de

ácido cítrico 10 mM/pH 6.0. O bloqueio da peroxidase endógena foi

realizado com solução aquosa de peróxido de hidrogênio a 6%. A

incubação com o anticorpo primário foi feita a 37ºC em câmara

úmida a 4ºC por 12 horas (overnight). A incubação com anticorpo

secundário, diluído em PBS, foi realizada por 30 minutos a 37°C.

Após lavagens em PBS, os cortes foram incubados por 30 minutos a

37oC com o sistema amplificador Novolink. Por fim, os cortes


73

histológicos foram lavados em água corrente por 10 minutos,

contracorados com hematoxilina de Harris por 10 segundos,

novamente lavados em água corrente, desidratados em etanol e

diafanizados em xilol. A montagem das lâminas foi realizada em

resina Permount (Fisher Scientific®, Fair Lawn, NJ/USA, cód. S15-

100).

Para cada bateria de reação foram utilizados controles positivos

(pele normal) e negativos. Os controles negativos foram

estabelecidos através da omissão do anticorpo primário, que foi

substituído por tampão PBS (“blank”).

O estudo das reações foi feito em microscópio de múltipla

observação por dois patologistas, simultaneamente, com

desconhecimento da identidade dos casos e a classificação foi

definida mediante consenso. Das amostras escolhidas, inicialmente

fez-se avaliação da extensão da imunomarcação usando objetiva

panorâmica (aumento final de 40x). Para se confirmar o padrão da

expressão, aumentos maiores foram utilizados (100x, 200x e 400x).

As reações foram, então, classificadas subjetivamente quanto à

extensão da imunomarcação em:

• Zero: até 5% das células neoplásicas marcadas;

• 1+: 5 – 25% das células neoplásicas marcadas;



74


• 4+: > 75% das células neoplásicas marcadas.

Para fins de análise estatística, não foram consideradas as

intensidades das reações, e sim, apenas a sua positividade.

5.2.2. Análise Estatística

Após Classificação das Reações, os diferentes escores obtidos

foram comparados com os dados clínicos, histopatológicos e de

acompanhamento dos pacientes.

Para análise estatística utilizamos a metodologia não-

paramétrica, pois a variável escore não apresentou distribuição

normal. Adotamos como nível de significância p ≤ 0,05.

A variável escore foi trabalhada como uma variável numérica, ou

seja, 0+ = 0; 1+ = 1; 2+ = 2; 3+ = 3 e 4+ = 4.

6. RESULTADOS

Resultados

76

6.1. Características da amostra

Foram incluídos neste estudo 63 casos de pacientes com

diagnóstico de CECL tratados cirurgicamente pelo serviço de cirurgia

de cabeça e pescoço do HCFMRP-USP, no período de fevereiro de

2001 a dezembro de 2005.

Desse total, 58 eram homens e cinco mulheres, com idade

variando, nos homens, de 27 a 78 anos (média de 57,46 anos) e 47 a

59 anos nas mulheres.

O tumor primário, na grande maioria, se localizava na

supraglote (36 casos) e na glote (24 casos) com incidência de 57% e

38%, respectivamente. Somente três casos (4,7%) se originavam da

subglote. Com relação ao estadiamento clínico, obtiveram-se oito

casos no estadio I, oito no estadio II, 22 no estadio III e 25 casos no

estadio IV, sendo que três eram IVb. A Figura 1, na seqüência,

demonstra o estadiamento dos tumores de acordo com o sítio

acometido. Entre os tumores glóticos, houve distribuição por todos os

grupos, sendo que oito foram classificados como estadio I; entre os

de supraglote, 15 eram estadio III e 14 eram estadio IV.

Resultados

77

0

8

0

6

2

0

15

6

1

14

7

1 1 1 1

0

2

4

6

8

10

12

14

16

I II III Iva Ivb

supraglote

glote

subglote

Figura 1. Distribuição dos tumores de laringe por sítios segundo o estadiamento clínico (valores expressos em número de pacientes).

Em relação ao tabagismo, apenas dois dos 63 casos não eram

fumantes; 52 eram etilistas e apenas 11 não consumiam bebidas

alcoólicas.

6.2. Evolução

Os pacientes foram acompanhados desde o dia da cirurgia

(estipulado como início do seguimento) até dezembro de 2007, sendo

que o tempo de seguimento variou de 1 mês a 82 meses (média de

45,4 meses. Durante esse período, constatou-se que ocorreram dez

casos de recidiva local, sete de recidiva regional, um de metástase à

Resultados

78

distância e em cinco casos houve o aparecimento de segundo tumor

primário (Tabela 1).

Tabela 1- Seguimento clínico dos pacientes segundo o sítio do tumor (valor expresso em número de pacientes).

Recidiva local

Recidiva regional

Metástase à distância

Segundo tumor primário

Supraglote 5 3 1 3

Glote 5 4 0 2

Subglote 0 0 0 0

Total 10 7 1 5

Dos 63 pacientes estudados, 17 (27%) foram a óbito, sendo

que 12 (19%) pela neoplasia e cinco (8%) faleceram por outras

causas não relacionadas à neoplasia. A Tabela 2 relaciona óbitos e

suas causas ao sítio do tumor.

Resultados

79

Tabela 2- Relação de óbitos e seus motivos de acordo com o sítio do tumor. (valores expressos em número de pacientes). Sito da lesão Óbitos

decorrentes do tratamento

Óbitos por recidiva local/

regional

Óbitos por metástase à distância

Total de Óbitos

Supraglote 3 4 1 8

Glote 1 2 0 3

Subglote 1 0 0 1

Total 5 6 1 12

Todos os tumores foram classificados histologicamente por grau

de diferenciação, obtendo-se 13 (20,6%) BD, 37 (58,7%) MD e 13

(20,6%) PD. Na Figura 2 encontra-se a classificação histológica pelos

diferentes sítios. A maioria dos tumores glóticos (91,7%) era MD

(16/24=66,7%) e BD (6/24=25%) e somente dois eram PD. Os

tumores supraglóticos apresentavam distribuição mais uniforme

quanto à diferenciação, pois sete (19,4%) eram BD, 19 (52,7%) MD

e 10 (27,8%) PD. Entre os da subglote, dois eram MD e um PD.

Resultados

80

76

0

19

16

2

10

21

0

5

10

15

20

BD MD PD

Supraglote

Glote

Subglote

Figura 2- Classificação histológica em diferentes sítios do tumor, expressa em número de pacientes. BD: bem diferenciados, MD: moderadamente diferenciados, PD: pouco diferenciados.

Analisando separadamente as populações de etilistas e não

etilistas (Tabela 3), observa-se uma distribuição muito semelhante

dos tumores quanto ao grau de diferenciação nos etilistas e nos não

etilistas.

Tabela 3- Distribuição dos tumores em etilistas e não etilistas quanto ao grau de diferenciação (valores expressos em número de pacientes). Grau de Diferenciação Não Etilistas (total: 11) Etilistas (total 52)

PD 3 10

MD 7 30

BD 1 12

Resultados

81

Os 63 espécimes tumorais foram submetidos à imuno-

histoquímica para detecção da expressão da proteína ligadora de

cálcio (psoriasin 1). As reações foram classificadas de acordo com a

extensão da imunomarcação em escores, segundo a classificação

estabelecida na metodologia. Obtiveram-se quatro casos com escore

0 (6,3%), 10 casos com escore 1+(15,9%), 15 casos 2+ (23,8%), 10

casos 3+ (15,9%) e 24 casos 4+ (38,1%). As Figuras 3, 4, 5, 6 e 7

demonstram os diferentes resultados de Imunomarcação de 1+ a 4+.

Figura 3- Espécime de Carcinoma Espinocelular de Laringe após reação de imuno-histoquímica com expressão negativa da S100 A7 (psoriasin 1). Escore 0+ no Carcinoma e positiva 4+ em área de Carcinoma in situ (setas) (Aumento de 100x).

Resultados

82

Figura 4- Espécime de Carcinoma Espinocelular de Laringe após reação de imuno-histoquímica com expressão do psoriasin 1 (S100 A7). Escore 1+ (Aumento de 100x).

Figura 5- Espécime de Carcinoma Espinocelular de Laringe após reação de imuno-histoquímica com expressão da proteína S100 A7. Escore 2+ (Aumento de 100x).

Resultados

83

Figura 6- Espécime de Carcinoma Espinocelular de Laringe após reação de imuno-histoquímica com expressão do psoriasin 1 (S100 A7). Escore 3+ (Aumento de 100x).

Figura 7- Espécime de Carcinoma Espinocelular de Laringe após reação de imuno-histoquímica com expressão do S100 A7. Escore 4+ (Aumento de 100x).

Resultados

84

2 2

0

8

2

0

10

5

0

4 4

2

12 11

1

0

2

4

6

8

10

12

Zero 1+ 2+ 3+ 4+

Supraglote

Glote

Subglote

6.3. Avaliação do Escore

Os escores obtidos foram correlacionados com as variáveis

clínicas, sócio-demográficas e histopatológicas dos tumores.

A Figura 8 ilustra a distribuição dos escores de acordo com os

diferentes sítios primários.

Figura 8- Distribuição dos diferentes escores das reações de imuno-histoquímica em relação aos diferentes sítios tumorais na laringe (valores expressos em número de pacientes).

Houve distribuição muito semelhante dos escores pelos vários

sítios anatômicos, com exceção da subglote, devido ao número

escasso de casos. Há tendência maior dos glóticos serem classificados

com 3 e 4 + (15 de 24), enquanto os supraglóticos em se manter

com baixo escore (20 em 36).

Resultados

85

Segue abaixo a relação de todos os pacientes analisados e os

dados correspondentes ao grau de diferenciação tumoral, sítio do

tumor e estadiamento clínico (Tabela 4).

Tabela 4- Relação dos pacientes estudados com seus respectivos escores, grau de diferenciação, sítio primário e estadiamento clínico. B.D. (bem diferenciado), M.D. (moderadamente diferenciado), P.D. (pouco diferenciado).

Paciente: Escore Grau de

diferenciação Sítio do Tumor

Estadiamento Clínico

1 4+ B.D. Supraglote III 2 2+ M.D. Supraglote IVa 3 4+ M.D. Subglote IVa 4 4+ M.D. Supraglote III 5 4+ M.D. Glote IVa 6 4+ M.D. Glote IVa 7 1+ P.D Supraglote III 8 4+ M.D. Glote I 9 2+ M.D. Supraglote III 10 4+ M.D. Supraglote II 11 1+ P.D Supraglote II 12 2+ M.D. Supraglote IVa 13 3+ M.D. Glote IVa 14 3+ M.D. Supraglote II 15 Zero P.D Supraglote III 16 1+ P.D Supraglote II 17 Zero P.D Glote III 18 4+ M.D. Supraglote IVa 19 4+ M.D. Supraglote IVb 20 3+ M.D. Glote II 21 2+ M.D. Glote I 22 1+ M.D. Supraglote III 23 1+ P.D Supraglote II 24 4+ B.D. Supraglote III 25 2+ P.D Supraglote IVa 26 1+ P.D Supraglote IVa 27 3+ M.D. Glote I 28 4+ B.D. Glote I 29 3+ M.D. Subglote IVa 30 Zero P.D Supraglote III 31 2+ M.D. Supraglote III 32 1+ M.D. Supraglote IVa 33 4+ B.D. Glote I 34 1+ B.D. Supraglote IVa 35 2+ B.D. Supraglote IVa 36 2+ M.D. Supraglote III

continua

Resultados

86

Paciente: Escore Grau de diferenciação

Sítio do Tumor

Estadiamento Clínico

37 2+ M.D. Glote I 38 2+ M.D. Glote III 39 3+ B.D. Subglote III 40 4+ B.D. Supraglote II 41 4+ B.D. Glote III 42 4+ M.D. Glote I 43 4+ B.D. Glote IVa 44 4+ B.D. Supraglote IVa 45 4+ B.D. Supraglote IVa 46 4+ B.D. Supraglote III 47 4+ M.D. Supraglote IVa 48 1+ P.D Glote IVa 49 2+ M.D. Glote III 50 2+ M.D. Glote IVa 51 4+ B.D. Glote I 52 3+ M.D. Glote III 53 3+ M.D. Supraglote III 54 Zero M.D. Glote IVb 55 4+ M.D. Supraglote IVa 56 3+ M.D. Supraglote III 57 4+ B.D. Glote II 58 2+ P.D Supraglote III 59 4+ M.D. Glote IVa 60 2+ M.D. Supraglote IVa 61 3+ M.D. Supraglote III 62 1+ M.D. Glote III 63 2+ M.D. Supraglote IVa

Na relação com o grau de diferenciação celular utilizou-se o

Teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis. Os resultados estão

representados na Tabela 5.

continuação

Resultados

87

3

1 1

7

3

0

3

12

10

9

0 0

12

11

0

2

4

6

8

10

12

0 1+ 2+ 3+ 4+

PD

MD

BD

Tabela 5- Análise do escore de acordo com os diferentes graus de diferenciação (PD, MD, BD) através do método não paramétrico de Kruskal-Wallis.

Grau de Diferenciação

Número de

pacientes Mediana Máximo Mínimo Média

Desvio Padrão

PD 13 1,00 2,00 0,00 1,00 0,71

MD 37 3,00 4,00 0,00 2,76 1,09

BD 13 4,00 4,00 3,00 3,92 0,28

X² = 32,90, p < 0,001*

Houve diferença estatisticamente significativa para o escore

obtido nos diversos grupos. O grupo BD apresentou escores

significativamente superiores aos dos grupos MD e PD e o grupo MD

apresentou escores significativamente superiores aos dos grupos PD

(BD > MD > PD) (Figura 9).

Figura 9- Distribuição do escore nos diferentes graus de diferenciação. (valores expressos em número de pacientes).

Resultados

88

Pela figura 9 observa-se que os tumores PD se postaram nas

faixas de escores inferiores, ou seja, nenhum apresentou-se com

escore 3 ou 4+.

Considerando somente os tumores MD, a análise do escore em

relação ao estadiamento está representada na Tabela 6, onde estão

agrupados os estadios I e II, os estadios III e IV e os escores 0, 1+ e

2+ e 3+ e 4+

Tabela 6: Distribuição dos escores de acordo com os diferentes estadiamentos para os tumores MD. Teste utilizado: Teste exato de Fisher. (Valores expressos em número de pacientes).

Estadiamento Escore 0 / 1+ / 2+ Escore 3+ / 4+

I e II 3 7

III e IV (IVa e IVb) 13 14

P= 0,46

Foi realizado o Teste Exato de Fisher onde não se obteve

diferença estatisticamente significante, porém demonstra uma

tendência de distribuição mais homogênea do escore para estadios

mais avançados.

Usando o Teste não-paramétrico de Mann-Whitney e excluindo-

se o grupo com tumor localizado na subglote que tem n=3, construiu-

se a Tabela 7.

Resultados

89

Tabela 7- Análise do escore em relação ao sitio do tumor excluindo-se o grupo de tumor da subglote, utilizando o Teste não-paramétrico de Mann-Whitney. N- número de pacientes.

Sítio N Mediana Máximo Mínimo Média Desvio

padrão

Glote 24 3,00 4,00 0,00 2,83 1,34

Supra 36 2,00 4,00 0,00 2,44 1,32

Z = 1,18 / p = 0,24

Nessa comparação não foi encontrada diferença

estatisticamente significativa dos escores em relação ao sítio do

tumor. A análise do escore em relação ao estadiamento clínico está

representada na Tabela 8. Agruparam-se os tumores classificados

como IVb (n = 2) com os IVa e os denominou de IV. Foi utilizado

teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis (ANOVA não-paramétrica).

Tabela 8- Análise do escore em relação ao estadiamento clínico utilizando teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis (ANOVA não-paramétrica). N- número de pacientes. Estadiamento

Clínico N Mediana Máximo Mínimo Média D.padrão

I 8 4,00 4,00 2,00 3,38 0,92

II 8 3,00 4,00 1,00 0,92 1,41

III 22 2,00 4,00 0,00 2,63 1,35

IV 25 3,00 4,00 0,00 1,41 1,31

X² = 4,35 p = 0,23

Resultados

90

Não houve diferença estatisticamente significante na presença

dos escores quanto ao estadiamento clínico.

Para a análise do escore por idade dos pacientes do grupo foi

utilizado o coeficiente de correlação não-paramétrico de Spearman:

r=0,13 p=0,30. O resultado encontrado foi uma correlação baixíssima

e não significativa.

Ao se analisar a distribuição dos diferentes escores nos etilistas

e não etilistas construiu-se a Tabela 9.

Tabela 9- Distribuição do escore em pacientes etilistas e não etilistas (valores expressos em número de pacientes) utilizando o Teste não-paramétrico de Mann-Whitney.

Mediana Média Desvio Padrão Não Etilistas 3,00 2,55 1,51

Etilistas 3,00 2,65 1,28

Z= 0,22 p= 0,83

Realizado o Teste não-paramétrico de Mann-Whitney, onde não

se obteve diferença estatisticamente significante dos escores nas

diferentes populações de etilistas e não etilistas.

A presença de recidiva local foi analisada pelo Teste não-

paramétrico de Mann-Whitney e está representado na Tabela 10.

Resultados

91

Tabela 10- Análise do escore em relação à presença de recidiva local. Utilizado teste não-paramétrico de Mann-Whitney. N- número de pacientes. Recidiva Local

N Mediana Máximo Mínimo Média D. padrão

Não 53 3,00 4,00 0,00 2,75 1,21

Sim 10 2,00 4,00 0,00 2,00 1,70

Z = 1,37 / p = 0,17

Não houve diferença significativa na análise acima entre os

grupos.

A relação da recidiva regional com os escores foi analisada pelo

Teste não-paramétrico de Mann-Whitney e está representado na

Tabela 11.

Tabela 11- Análise do escore em relação à recidiva regional. Utilizado teste não-paramétrico de Mann-Whitney. N- número de pacientes. Recidiva Regional

N Mediana Máximo Mínimo Média D.Padrão

Não 56 3,00 4,00 0,00 2,73 1,21

Sim 7 2,00 4,00 0,00 1,86 1,86

Z = 1,30 / p = 0,22

Nessa relação não houve diferença significativa.

A relação de segundo tumor primário e óbitos com escore não

foram significantes.

Resultados

92

Considerando como falhas do tratamento a presença de

recidiva local ou regional, metástases e segundo tumor primário, a

Tabela 12 correlaciona tais eventos com os diferentes escores.

Tabela 12- Relação do escore com a presença de falhas do tratamento (recidiva local ou regional, metástases e segundo tumor primário). Valores expressos em número de pacientes.

Escore Total de pacientes Complicações Oncológicas Zero 4 3

1+ 10 2

2+ 15 4

3+ 10 2

4+ 24 5

Não houve diferença estatisticamente significativa entre os

escores e a presença de falhas do tratamento na comparação entre

escore 0 e 1+ (5/14 = 35,7%) X escores 2+ a 4+ (11/49 = 22,4%)

(Z= 0,94 / p+ 0,35). Porém, na comparação entre o escore zero

(3/4=75%) com os demais (13/59=22%) houve diferença

estatisticamente significativa (Z=2,37, p=0,02)

6.4. Comparação das curvas de sobrevida entre os diferentes escores (considerando os escores 0, 1+, 2+, 3+, e 4+) Foi aplicado o método de construção das curvas de Kaplan-

Meier e o teste do Log rank para a comparação das diferentes curvas.

Resultados

93

Não foi observada diferença estatisticamente significante entre as

sobrevidas e os escores obtidos (Figura 10 e Tabela 13).

Figura 10- Curva de sobrevida para os diferentes escores (zero, 1+, 2+, 3+, 4+).

A Tabela 13 abaixo relaciona a sobrevida média obtida para os

diferentes escores.

Função de Sobrevida

TEMPO (meses)

100 8060 40 20 0

Sob

revi

da a

cum

ulad

a

1,1

1,0

,9

,8

,7

,6

,5

,4

,3

ESCORE

4

4-censurado

3

3-censurado

2

2-censurado

1

1-censurado

0

0-censurado

Resultados

94

Tabela 13- Relação da sobrevida média (em meses) e os diferentes escores. N- número de pacientes. Teste utilizado: Log-Rank. Escore N Sobrevida média Intervalo de confiança de 95%

0 4 57,75 (33,56 – 81,94)

1+ 10 65,62 (56,71 – 74,53)

2+ 15 57,65 (48,95 – 66,36)

3+ 10 58,26 (4367 – 72,84)

4+ 24 62,78 (49,42 – 76,15)

Teste Log Rank = 0,90 / p = 0,92

Não houve diferença significativa entre as sobrevidas nos diversos

escores obtidos.

6.5. Comparação das curvas de sobrevida entre grupos de escores

Para a comparação das curvas de sobrevida entre os grupos de

escore consideraram-se dois grupos: um de ausência ou baixa

positividade – Grupo 1 (considerando os escores Zero, 1+,2+) e

outro de forte positividade – Grupo 2 (considerando os escores 3+ e

4+)

O método de construção das curvas foi de Kaplan-Meier com

teste do Log rank para a comparação das diferentes curvas e não se

observou diferença significante, conforme se verifica na Figura 11 e

na Tabela 14 abaixo.

Resultados

95

Figura 11- Curva de sobrevida para escores agrupados (grupo de ausência ou de baixa positividade – escores zero, 1+ e 2+; grupo de alta positividade – escores 3+ e 4+).

Tabela 14- Relação da sobrevida média (em meses) em relação aos dois grupos de escore (grupo 1 – escores 0,1+,2+ e grupo 2 – escores 3+ e 4+). Teste utilizado: Log-Rank. N- número de pacientes. Grupos de escore

N Sobrevida média Intervalo de confiança de 95%

0+1+2 29 61,01 (54,36 – 67,66)

3+4 34 64,84 (54,01 – 75,68)

Teste Log Rank = 0,05 p = 0,83

Nessa comparação de sobrevida também não foi encontrada

diferença estatisticamente significante entre os grupos.


Tempo (meses)

100806040200

So

bre

vid

a ac

um

ula

da

1,1

1,0

,9

,8

,7

,6

,5

ESCORE

3+4

3+4 censurado

0, 1+, 2+

0, 1+, 2+ censurado

7. DISCUSSÃO

Discussão

97

7.1. O Gene S100 A7

Esforços têm sido aplicados no sentido de identificar a

expressão de novos marcadores tumorais relacionados com os

CECCP. Figueiredo et al. (2006) descreveram que genes de antígenos

tumorais específicos (CTAs) (MAGE-1, -4, -10, -12, BAGE, GAGE,

LAGE, NYESO-1 e PRAME) são expressos em proporções variáveis

(6,1 a 48,5%) em CECCP e essa expressão correlaciona-se com

tumores avançados. Além disso, concluíram que em 63,6% dos casos

ocorre expressão concomitante de dois ou mais genes,

principalmente nos tumores avançados e que há relação da expressão

de MAGE-4 no tumor primário com menor incidência de metástases

linfonodais. Esses autores não observaram associação da expressão

dos CTAs com grau de diferenciação, contradizendo Sarcevic et al.

(2003), que encontraram MAGE-4 em tumores de menor grau de

diferenciação. O padrão de co-expressão observado sugeriu a

Figueiredo et al. (2006) que o desenvolvimento de vacinas

polivalentes, contendo epitopos de vários antígenos codificados por

esses genes, deva ser o caminho para o desenvolvimento de vacinas

clinicamente úteis. O estudo do gene S100 A7 encontra-se em fase

bem precoce, porém sua expressão maior na urina do paciente

Discussão

98

portador de carcinoma espinocelular de bexiga sugere ser um

potencial marcador não invasivo para o seguimento de pacientes com

câncer (CELIS et al., 1996) e, segundo Skliris et al. (2007), esse gene,

por ser regulado pela atividade do receptor de estrógeno, poderia ser

um guia para terapia alvo.

O psoriasin 1 é uma pequena proteína fixadora do cálcio de

11,4 Kda pertencente à família de genes S100 amplamente expressa

em epitélio escamoso cuja exata função é incerta (MADSEN et al.,

1991; HOFMAN et al., 1994). A expressão do gene psoriasin 1 foi

descrita, previamente, em pele psoriática e em outras doenças que

cursam com hiperplasia de epiderme (CELIS et al., 1990; KROP et al.,

2005; ECKERT; LEE, 2006). Estudos por imuno-histoquímica

detectaram que o psoriasin 1 é produzido pelo queratinócito

circundante de ferida e está presente no seu exsudato (LEE; ECKERT,

2007). Segundo Eckert e Lee (2006), o psoriasin 1 (S100 A7) age

como substrato da transglutaminase no sinal da transdução e tem

também função antibacteriana na epiderme. Para Wolk et al. (2006),

além da ação antimicrobiana, o psoriasin 1 inibe a diferenciação

celular e aumenta a sua motilidade, favorecendo a invasão e a

metastatização.

Relatos de sua expressão aumentada em lesões neoplásicas

têm sido freqüentes. Dentre elas ressalta-se o carcinoma ductal de

Discussão

99

mama (LEYGUE et al., 1996; SKLIRIS et al, 2007; MANDAL et al,

2007; PETERSSON et al., 2007), carcinoma espinocelular de bexiga

(CELIS et al., 1996), em tumores de pele (MOUBAYET, et al. 2007) e

carcinoma espinocelular de cavidade oral (ZHOU et al, 2008;

FUKUZAWA et al, 2006).

Neste estudo detectou-se a expressão do marcador S100 A7

(psoriasin 1) em 93,7% dos casos de CECL, com expressão forte nos

tumores diferenciados e fraca nos PD. Isso é também concordante

com trabalho de Leygue et al. (1996), realizado com carcinoma

ductal de mama, onde a expressão do psoriasin 1 é fortemente

positiva no carcinoma in situ, enquanto no carcinoma invasivo essa

expressão é menor. Esses autores avaliaram a expressão do RNAm

do psoriasin 1 em biópsias de congelação de tecidos de mama

representadas por carcinoma in situ, carcinoma ductal invasivo e

tecidos normais e confirmaram altas expressões do psoriasin 1 no

carcinoma ductal in situ.

É sabido que tumores mais diferenciados tendem a ser menos

agressivos com melhor evolução e maior sobrevida, porém esse fato

não se confirmou em nosso estudo, pois não se detectou diferenças

na sobrevida dos diferentes grupos de pacientes estudados.

Watson; Leygue e Murphy (1998) relataram que a expressão do

S100 A7 foi amplamente detectada em tumores in situ, ao passo que

Discussão

100

nos tumores invasivos tal proteína foi expressa em apenas 18% dos

casos. Esse padrão sugere que a expressão do psoriasin 1 está

associada com alterações na diferenciação do epitélio e deve ter

papel na progressão tumoral precoce. Outro fator adicional para o

envolvimento na progressão do carcinoma ductal é a sua localização

em uma região do cromossomo 1 que freqüentemente (> 50% dos

casos) apresenta perda da heterozigosidade nos tumores invasivos.

(MUNN; WALKER; VARLEY, 1995).

Em estudo recente, Moubayet, et al. (2007) avaliaram a

expressão de RNAm do psoriasin 1 através da técnica de RT-PCR, em

biópsias de pele de pacientes com lesões pré-neoplásicas, carcinoma

espinocelular, carcinoma basocelular e controles normais.

Encontraram expressão aumentada em pacientes com lesões pré-

neoplásicas, no carcinoma basocelular e significantemente

aumentada no carcinoma espinocelular. Os autores concluíram que, à

semelhança do carcinoma ductal da mama e do carcinoma

espinocelular de bexiga, o aumento na expressão do psoriasin 1 deve

desempenhar um papel importante na progressão do câncer de pele.

Para Watson; Leygue e Murphy (1998), o S100 A7 tem efeito

importante no desenvolvimento do fenótipo invasivo, que pode ser

tanto um efeito indireto nas células da resposta imune do hospedeiro

ou mesmo uma influência direta que contribui para a invasão

Discussão

101

tumoral. Nessa amostra, pôde-se constatar que entre os tumores MD

a expressão tem tendência a diminuir na medida em que o

estadiamento do tumor aumenta (embora sem diferença

estatisticamente significante). A observação de que 75% dos tumores

com escore zero tiveram complicação oncológica mostra que na falta

do S100 A7 há favorecimento da invasão tumoral.

7.2. Expressão da proteína S100 A7

Houve distribuição dos escores pelos vários sítios anatômicos,

com exceção da subglote devido ao número escasso de casos. Há

tendência maior dos glóticos serem classificados com 3 e 4+

(15/24=62,5%), enquanto os supraglóticos em se manter com

escores menores na imunomarcação (20/36=55,5%) (embora sem

relevância estatística).

Pela figura 9 observou-se que os tumores PD se postaram nas

faixas de escores inferiores, ou seja, nenhum se apresentou com 3 ou

4+. Isso explica a maior tendência dos tumores glóticos terem escore

maior, pois seus tumores são em maior número de bem diferenciados

do que os da supraglote. Entretanto, não houve diferença

estatisticamente significante dos escores em relação ao sítio do

tumor. Outro aspecto que deve ser destacado é que todos os tumores

PD tiveram tendência a terem escores <3+, daí os da supraglote

Discussão

102

terem escores menores, pois lá residem mais tumores PD. Esse fato é

explicado pela provável função desse gene, ou seja, atua enquanto as

células são BD. Como citam também Moubayet et al. (2007) e Leygue

et al. (1996), nos tumores indiferenciados, esse gene parece não

atuar.

Analisando a distribuição dos 37 tumores MD, verifica-se que 19

(19/36=53,7%) estão localizados na supraglote, 16 (16/24=66,6%)

na glote e dois na subglote. A maioria desses tumores, ou seja,

56,7% (21/37) foi classificada com mais de 2+, porém ao analisar a

sua distribuição segundo o estadiamento clínico, verifica-se que

existe uma tendência dos classificados com estadios I ou II de obter

escore > que 3+ (7/10), enquanto que os com estadios III e IV, a

distribuição de escore se encontra mais uniforme (Tabela 6), porém

tal relação não se mostrou estatisticamente significante. Ou seja, na

medida em que a massa tumoral aumenta, os escores diminuem.

Assim, a ação do gene S100 A7 parece se concentrar nas fases

iniciais da carcinogênese.

Não se encontrou relação estatisticamente significante entre o

escore obtido e a idade dos pacientes. Rigopoulou et al. (1994)

detectaram fatores de suscetibilidade para o carcinoma papilífero de

tireóide que variavam conforme as populações investigadas

(espanhóis, americanos e alemães) e que essa suscetibilidade

Discussão

103

dependia de fatores genéticos e ambientais. Neste estudo não foi

possível essa análise porque somente dois pacientes não tinham o

hábito de fumar.

Apesar de o seguimento clínico ter sido menor do que a

literatura preconiza, a comparação das curvas de sobrevida entre os

escores obtidos (analisados individualmente ou agrupados) não

demonstrou diferença estatisticamente significante.

7.3. Falhas do tratamento

Nesta amostra, obtiveram-se 73% (46/63) de sobrevida e 17

(17/63=27%) óbitos, sendo o motivo desses óbitos: falhas do

tratamento em 12,7% (8/63); complicações decorrentes do

procedimento cirúrgico em 6,3% (4/63) e por outras causas em 7,9%

(5/63). Portanto, 70,5% (12/17) dos óbitos foram decorrentes do

tumor ou do seu tratamento.

Entre os 63 casos tratados, 25,4% (16/63) evoluíram com

algum tipo de falha do tratamento (foram dez recidivas locais, sete

recidivas cervicais, uma metástase e cinco 2º tumor primário,

totalizando 22 em 15 pacientes), sendo que sete continuam vivos.

Dentre essas falhas, a recidiva local ou regional (, simplesmente

recidiva) ocorreu em 12 casos, enquanto a metástase à distância e a

presença de segundo tumor primário (doravante, outras) em seis,

Discussão

104

sendo que um paciente teve recidiva local e 2º tumor primário ao

mesmo tempo e seis tiveram recidivas local e regional. Essas

complicações estavam igualmente distribuídas entre a glote (5

recidivas e 2 outras) e a supraglote (5 recidivas e 4 outras), sem que

os da subglote tenham apresentado esse tipo de complicação.

Considerando somente os 15 casos em que houve falhas do

tratamento, verifica-se que ocorreu em 29,1% (7/24) dos tumores

glóticos e em 22,2% (8/36) entre os da supraglote. Uma justificativa

para a maior agressividade observada entre os glóticos é que eles

não são aqueles tratados por radioterapia ou cirurgia endoscópica

(indicados em estágio precoce). Além disto, os tumores transglóticos

foram classificados nessa categoria na subdivisão dos sítios primários

da neoplasia (ou seja, como glóticos avançados). Dessa forma, é

provável que a amostra de tumores glóticos aqui estudados tenha

representação apenas da fração mais agressiva desses tumores.

Ainda neste estudo, verificou-se que a maioria (83,3%) dos

tumores supraglóticos foi classificada como estadios III e IV (30 em

36 casos), enquanto os glóticos se dividiram pelos vários

estadiamentos (10 estadios < III e 14 estadios >II), o que nos leva a

concluir que na supraglote os tumores eram de maior dimensão ou,

segundo a classificação TNM (SOLBIN; WITTEKIND, 2004), mais

Discussão

105

agressivos. Esse fato, porém, não se confirmou ao se observar a

evolução dos tumores aqui estudados.

Dikshit et al. (2005) relataram que o consumo de álcool e o

tabagismo, antes do diagnóstico do tumor, influenciaram a sobrevida

e o prognóstico dos pacientes e Zapater et al. (2000), em estudo de

tumores de supraglote, concluíram que o consumo de álcool

representa uma variável importante no prognóstico. No entanto, não

se observaram diferenças nas populações de etilistas e não etilistas

com relação aos diversos fatores estudados, o que demonstra que o

consumo de álcool, que tem um papel comprovado na etiologia do

câncer de laringe, não representou impacto na sobrevida dessa

população.

As falhas de tratamento ocorreram em 25% (2/8) dos

tumores classificados como estadios I, 12,5% (1/8) dos estadios II;

22,7% (5/22) dos estadios III e 28% (7/25) entre os estadios IV. As

falhas ocorridas com o estadio I foram entre os tumores glóticos ao

se tentar o tratamento com cirurgias parciais da laringe. É sabido que

os carcinomas supraglóticos são possuidores de comportamento

biológico diferente dos da laringe, sempre com maior agressividade,

devido à freqüente metastatização para linfonodos, segundo Noronha

e Dias (1997). Porém, acredita-se que outros mecanismos estejam

envolvidos nessa agressividade, como o fato de maior incidência de

Discussão

106

tumores em estadios III e IV, em relação à glote. Esse fato ocorre

porque os tumores da supraglote são diagnosticados mais

tardiamente, com volume maior de células neoplásicas. Por outro

lado, Greenman; Hommer e Stafford (2000) referem que a diferença

no prognóstico dos tumores para os diferentes sítios da laringe se

correlaciona apenas com o potencial de metastatização, que é maior

nos tumores da supraglote. Neste estudo, a maioria dos supraglóticos

foram estadio III e IV, porém essa agressividade não foi detectada.

Quanto ao escore obtido pelo grupo que desenvolveu falhas

no tratamento, 75% (¾) eram zero+, 20% (2/10) 1+; 26,6% (4/15)

2+; 20% (2/10) 3+ e 20,1% (5/24) 4+. Esses números nos levam a

concluir que essas falhas foram mais freqüentes nos pacientes com

escores da proteína S100 A7 zero (estatisticamente significante).

Destaque-se que a recidiva local é fruto do ato cirúrgico, quando

margens de segurança escassas são deixadas no leito operatório,

sendo, portanto, relacionada muito mais à indicação e à realização do

ato operatório do que à agressividade tumoral. O mesmo não ocorre

com a recidiva regional que, embora tenha relação com a indicação e

a realização do esvaziamento cervical, sua presença decorre da maior

agressividade tumoral. Outras complicações em que não há a

participação da indicação errada do tratamento são a metastatização

à distância e a presença de segundo tumor primário. Essas três

Discussão

107

complicações: recidiva regional, metástase e segundo tumor primário

estiveram presentes em 13 casos, sendo em 19,4% dos tumores de

supraglote (7/36) e em seis (6/24=25%) entre os da glote. Elas se

distribuíram por oito casos com escore menor que 3+ (8/29=27,6%)

e em cinco casos com escore maior que 2+ (5/34=14,7%). Pôde-se

comprovar a ocorrência de complicações estatisticamente

significantes nos casos em que o escore da expressão S100 A7 foi

zero+ e também uma tendência em estarem presentes em pacientes

com escore <3+ (embora, sem diferença estatisticamente

significante).

Dos tumores analisados, 20,6% eram BD, 58,7% eram MD e

20,6% eram PD. Na população de pacientes que evoluíram com

falhas do tratamento, a distribuição da diferenciação celular foi muito

semelhante, ou seja, 21,4% (3/14) de BD, 57,1% (8/14) de MD e

21,4% (3/14) de PD. Isso mostra que a diferenciação celular não

teve influência na presença dessas falhas. A distribuição da

diferenciação celular foi a mesma por região anatômica. Não existem

evidências de que os tumores desses diferentes sítios possuam

diferenças biológicas intrínsecas. Entretanto, segundo Stell (1990), os

tumores da supraglote tendem a ser mais indiferenciados que os

glóticos, o que não foi verificado neste estudo.

Discussão

108

7.4. Função do Gene

Segundo Zhou et al. (2008) e Eckert e Lee (2006), a proteína

fixadora de cálcio tem ação na transdução e na carcinogênese do

epitélio, porém sua função ainda não está bem determinada.

Para Petersson et al. (2007), o psoriasin 1 expresso

desenvolve um fenótipo de resistência à apoptose e para Wolk et al.

(2006), a falta de expressão inibe a diferenciação celular e aumenta

sua motilidade, facilitando a invasão. Dessa forma, o S100 A7 é

altamente expresso nos tumores diferenciados na fase pré-invasiva e

é pouco expresso nos menos diferenciados e em estágio invasivo do

tumor (MANDAL et al, 2007; ZHOU et al, 2008). Krop et al. (2005)

acreditam que o S100 A7 age promovendo a angiogênese e

destacando células que comandam a função antiinvasiva, explicando,

assim o porquê da alta expressão em tumores BD ou estrógenos

negativos.

Para Fukuzawa et al. (2006), a proteína ligadora de cálcio

S100 A7 tem ação na transcrição e que o segmento desse gene que

determina essa função no CEC de cavidade oral é o -1513 a 988. Para

Mandal et al. (2007), o S100 A7 modula a resposta imune

favorecendo o crescimento do câncer de mama, nas fases iniciais. No

entanto, Zhou et al. (2008) demonstraram que o psoriasin 1 age

inibindo ou sendo inibido pelo complexo beta catenin. Assim, segundo

Discussão

109

os autores, em situação em que a expressão do S100 A7 é alta,

ocorre diminuição do complexo beta catenin, e o tecido pré-

neoplásico se transforma em carcinoma espinocelular BD, porém com

pouca agressividade. O carcinoma espinocelular será PD e de alta

agressividade quando a expressão do complexo beta catenin for alta

a ponto de inibir a do psoriasin 1.

Parece que esse gene age nas fases iniciais da tumorigênese,

sendo importante na origem dos tumores diferenciados, porém à

medida que sofrem indiferenciação sua influência desaparece ou são

consumidos para que o processo ocorra. Esse deve ter sido a atuação

do gene psoriasin 1 envolvido nos tumores de laringe, ou seja,

participam na sua diferenciação, e à medida que a expressão diminui,

os tumores tornam-se mais agressivos. Este é o primeiro trabalho na

literatura a avaliar a expressão desse marcador em neoplasia de

laringe e novos estudos poderão detectar informações

complementares que possam tornar esse gene expresso em 93,7%

dos casos, um marcador da presença e da agressividade do CECCP.

8. CONCLUSÕES

Conclusões

111

Os dados deste estudo levam a concluir que em carcinoma

espinocelular de laringe:

a) O marcador S100 A7 (psoriasin1) foi expresso em 93,7%

dos casos;

b) Os pacientes com escore zero de imunomarcação para o

S100 A7 (psoriasin1) apresentaram falhas do tratamento

mais freqüentes;

c) A expressão do S100 A7 foi maior em tumores bem

diferenciados:

- com tendência dos MD a diminuírem sua expressão

à medida que o estadiamento aumenta (embora

sem diferença estatística).

d) O escore da expressão do S100 A7 (psoriasin1) não

representou impacto na sobrevida dos pacientes.

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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9. ANEXOS

Anexos

136

ANEXO 1

Estadiamento TNM (SOLBIN; WITEKIND, 2004)

Classificação T – Tumor Primário

Tx O tumor primário não pode ser avaliado T0 Não há evidência de tumor primário Tis Carcinoma in situ

Glote

• T1: Tumor limitado às cordas vocais, com mobilidade das cordas normal: o T1a: Acometimento de uma corda; o T1b: Tumor que envolve ambas as Cordas Vocais;

• T2: Tumor se estende à Supraglote e/ou subglote; e/ou com mobilidade diminuída de corda vocal;

• T3: Tumor limitado à Laringe, com fixação de corda vocal e/ ou que invade espaço paraglótico, e/ ou com erosão mínima da cartilagem tireóide (Ex. Córtex Interno).

Supraglote

• T1: Tumor limitado a uma sub-localização anatômica da supraglote,com mobilidade normal da corda vocal;

• T2: Tumor que invade a mucosa de mais de uma sub-localização anatômica adjacente da supraglote (p.ex., a mucosa da base da língua, a valécula, a parede medial do seio piriforme), sem fixação da laringe;

• T3: Tumor limitado á laringe com fixação da corda vocal e/ou invasão de qualquer uma das seguintes estruturas: área pós-cricóide, tecidos pré-epiglóticos, espaço para-glótico, e/ou com erosão mínima da cartilagem tireóide (p.ex., córtex interna).

Subglote

• T1: Tumor limitado á subglote; • T2: Tumor que se estende à(s) corda(s) vocal(ais),com mobilidade normal ou

reduzida; • T3: Tumor limitado à laringe, com fixação da corda vocal.

Para glote, supraglote e subglote:

• T4a: Tumor que invade toda a cartilagem tireóide e/ou estende-se aos tecidos além da laringe, p.ex., traquéia, partes moles do pescoço, incluindo músculos profundos/extrínsicos da língua (genioglosso, hioglosso, palatoglosso e estiloglosso), alça muscular, tireóide e esôfago;

Anexos

137

• T4b: Tumor que invade o espaço pré-vertebral, estruturas mediastinais ou adjacente à artéria carótida.

Classificação N - Linfonodos Regionais Cervicais:

• Nx: linfonodos regionais não podem ser avaliados • N0: ausência de metástase em linfonodos regionais • N1: metástase em um único linfonodo ipsilateral, até 3cm em sua maior

dimensão; • N2: metástase em um único linfonodo homolateral, com mais de 3 até 6cm em

sua maior dimensão; ou em linfonodos homolaterais múltiplos, nenhum deles com mais de 6cm em sua maior dimensão; ou em linfonodos bilaterais ou contralaterais, nenhum deles com mais de 6cm em sua maior dimensão:

o N2a: metástase em um único linfonodo homolateral, com mais de 3cm até 6cm em sua maior dimensão;

o N2b: metástases em linfonodos homolaterais múltiplos, nenhum deles com mais de 6cm em sua maior dimensão;

o N2c: metástase em linfonodos bilaterais ou contralaterais, nenhum deles com mais de 6cm em sua maior dimensão;

o N3: metástase em linfonodo com mais de 6cm em sua maior dimensão.

Classificação M: Metástase à Distância

• Mx: a presença de metástase à distância não pode ser avaliada; • M0: ausência de metástase à distância; • M1: metástase à distância

Estadiamento Clínico Estádio 0 Tis N0 M0 Estádio I T1 N0 M0 Estádio II T2 N0 M0 Estádio III T1,T2 N1 M0 ;T3 N0,N1 M0 Estádio IVa T1,T2,T3 N2 M0 ;T4a N0,N1,N2 M0 Estádio IVb T4b Qualquer N M0 ;Qualquer T N3 M0 Estádio IVc Qualquer T Qualquer N M1

Anexos

138

ANEXO 2

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

“Marcadores Moleculares no Carcinoma Espinocelular de Cabeça e Pescoço” Eu ____________________________________________________, abaixo-assinado, tendo sido devidamente esclarecido sobre todas as condições que tratam do Projeto de pesquisa intitulado “Marcadores Moleculares no Carcinoma Espinocelular de Cabeça e Pescoço”, especialmente no que diz respeito aos objetivos da pesquisa, aos procedimentos que serei submetido, declaro que tenho pleno conhecimento dos direitos e das condições que me foram assegurados, a seguir relacionados:

1. Após a cirurgia com a retirada do tumor, o mesmo (o tumor) fará parte de uma pesquisa que tem como objetivo procurar alterações nas células dos tumores.

2. A cirurgia será realizada independentemente da sua participação na pesquisa, e a pesquisa não influenciará de modo algum o tipo de tratamento. Após a retirada do tumor nós retiraremos apenas 0,5 cm do tumor para estudar estas alterações. Também serão coletados 5ml (1 colher de sopa) de sangue de sua veia durante a cirurgia. 3. Não haverá riscos nem desconforto para você, pois retiraremos o pedaço do tumor somente após a cirurgia e o sangue será coletado enquanto você estiver anestesiado. 4. Com esta pesquisa esperamos encontrar alterações que possam ajudar no diagnóstico e tratamento dos tumores de cabeça e pescoço. 5. Não haverá despesas para você. 6. Você será acompanhado das maneiras normais no serviço de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do HCFMRP, independentemente da participação ou não na pesquisa. 7. A pesquisa não oferece danos a você e comprometemos que será mantido total sigilo sobre sua identidade e que em qualquer momento poderá desistir que estes dados sejam utilizados na presente pesquisa.

_______________________________ Paciente ou Responsável

Ribeirão Preto,....../....../..........

Anexos

139

CONSENTIMENTO PÓS-INFORMADO

Motivo: Laringectomia Parcial

Estou ciente de que sou portador de câncer da laringe/faringe e fui informado

que a cirurgia é a forma de tratamento recomendada e, se houver necessidade,

posteriormente, a radioterapia.

Estou ciente que a cirurgia será na garganta e que serão retiradas partes da

laringe e, por isso, minha voz será prejudicada, porém poderei me comunicar com voz

rouca. Será confeccionado um orifício no pescoço chamado de traqueotomia para

respirar, nos primeiros dias da cirurgia. Este orifício será fechado assim que possível.

Recebi a orientação de que serei alimentado por sonda até a cicatrização da garganta,

depois disso, me alimentarei normalmente pela boca. Fui informado também que ficarei

internado cerca de uma semana e que terei enfermeira e fonoaudiólogos para orientar a

minha recuperação.

______________________________ ______________________________ Paciente Médico Orientador

____________________________ Testemunha

Ribeirão Preto, ....../....../.............

Anexos

140

CONSENTIMENTO PÓS-INFORMADO

Motivo: Laringectomia Total

Estou ciente de que sou portador de câncer da laringe/faringe e fui informado

que a cirurgia é a forma de tratamento recomendada e, se houver necessidade,

posteriormente, a radioterapia.

Estou ciente que a cirurgia será na garganta e que será retirada a laringe e, por

isso, minha voz será prejudicada. Para respirar será confeccionado um orifício

permanente no pescoço, chamado de traqueotomia, cujo orifício será mantido por uma

cânula metálica. Perderei a voz, porém poderei voltar a me comunicar, aprendendo a

“falar” pelo esôfago, ou colocando uma prótese entre a traquéia e o esôfago. Recebi

orientação de que serei alimentado por sonda até a cicatrização da garganta, depois

disso, me alimentarei pela boca. Fui informado também que ficarei internado cerca de

uma semana e que serei orientado por fonoaudiólogos e enfermeiros.

______________________________ ______________________________ Paciente Médico Orientador

____________________________ Testemunha

Ribeirão Preto, ....../....../.............

Anexos

141

ANEXO 3

Anexos

142

ANEXO 4

Data Sheet

S100A7 (Psoriasin)

liquid mouse monoclonal antibody NCL-L-S100-A7

Intended Use FOR RESEARCH USE ONLY.

Specificity Human S100A7 (Psoriasin).

Clone 3DC

Ig Class IgG2b

Antigen used Recombinant protein corresponding to the entire S100A7 molecule.

for immunisations

Hybridoma partner Mouse myeloma (p3-NS1-Ag4-1).

Preparation Liquid tissue culture supernatant containing 15mM sodium azide. Volume as indicated on vial label.

Effective on frozen tissue Not evaluated.

Effective on paraffin wax Yes (using the high temperature antigen unmasking technique: embedded tissue see overleaf).

Recommendations on use Immunohistochemistry: Typical working dilution 1:50. High temperature antigen unmasking technique. 60 minutes primary antibody incubation at 25oC. Standard ABC technique. Western Blotting: Not recommended.

Positive Controls Immunohistochemistry - Skin.

Staining pattern Cytoplasmic and nuclear.

Storage and stability Store liquid antibody at 4oC. Under these conditions, there is no significant loss in product performance up to the expiry date indicated on the vial label. Prepare working dilutions on the day of use.

General Overview Psoriasin (S100A7) is a 12kD calcium binding protein whose expression is largely, although not entirely, confined to stratified squamous epithelium.

General References Al-Haddad S, Zhang Z, Leygue E, et al.. American Journal of Pathology. 155 (6): 2057-2066 (1999). Celis J E, Rasmussen H H, Vorum H, et al.. Journal of Urology. 155 (6): 2105-2112 (1996). Bürgisser D M, Siegenthaler G, Kuster T, et al.. Biochemical and Biophysical Research Communications. 217 (1): 257-263 (1995). Madsen P, Rasmussen H H, Leffers H, et al.. The Journal of Investigative Dermatology. 97 (4): 701-712 (1991).

Anexos

143

ANEXO 5 Relação de todos os pacientes estudados e seus respectivos dados clínocos, histológicos e de seguimento

Paciente


Score

Sexo

Idade

Tab

Etil

sub-sitio

Classificação TNM

1 BD 4+ M 58 SIM SIM SUPRAGLOTE T3N1Mx 2 MD 2+ M 47 SIM SIM SUPRAGLOTE T1N2MX 3 MD 4+ M 50 SIM SIM SUBGLOTE T2N2BMX 4 MD 4+ M 43 SIM NÃO SUPRAGLOTE T3N0MX 5 MD 4+ F 59 SIM NÃO GLOTE T3N2AMX 6 MD 4+ M 52 SIM SIM GLOTE T4N1MX 7 PD 1+ M 50 SIM SIM SUPRAGLOTE T3N0MX 8 MD 4+ M 75 SIM SIM GLOTE T1N0MX 9 MD 2+ M 49 SIM SIM SUPRAGLOTE T3NOMX 10 MD 4+ F 56 SIM SIM SUPRAGLOTE T2N0MX 11 PD 1+ M 62 NÃO NÃO SUPRAGLOTE T2N0MX 12 MD 2+ M 44 SIM SIM SUPRAGLOTE T4N2cMx 13 MD 3+ M 73 SIM NÃO GLOTE T4N0MX 14 MD 3+ M 78 SIM NÃO SUPRAGLOTE T2N0MX 15 PD 0 M 27 SIM SIM SUPRAGLOTE T3N0M0 16 PD 1+ F 49 SIM NÃO SUPRAGLOTE T2N0M0 17 PD 0 M 34 SIM SIM GLOTE T3N1M0 18 MD 4+ M 65 SIM SIM SUPRAGLOTE T1N2M0 19 MD 4+ M 63 SIM SIM SUPRAGLOTE T2N3M0 20 MD 3+ M 77 SIM SIM GLOTE T2N0MX 21 MD 2+ M 76 SIM SIM GLOTE T1N0Mx 22 MD 1+ F 55 SIM NÃO SUPRAGLOTE T3N0MX 23 PD 1+ M 62 SIM SIM SUPRAGLOTE T2N0MX 24 BD 4+ M 57 SIM SIM SUPRAGLOTE T3N0MX 25 PD 2+ M 44 SIM SIM SUPRAGLOTE T3N2MX 26 PD 1+ M 52 SIM SIM SUPRAGLOTE T4N2CMO 27 MD 3+ M 68 SIM SIM GLOTE T1aN0MX 28 BD 4+ M 67 SIM SIM GLOTE T1ANOMX 29 MD 3+ M 53 NÃO NÃO SUBGLOTE T4N2CM0 30 PD 0 M 70 SIM NÃO SUPRAGLOTE T3N0MX 31 MD 2+ M 58 SIM SIM SUPRAGLOTE T2N1Mx 32 MD 1+ M 71 SIM SIM SUPRAGLOTE T3N2BM0 33 BD 4+ M 52 SIM SIM GLOTE T1N0MX 34 PD 1+ M 58 SIM SIM SUPRAGLOTE T4N2AMX 35 PD 2+ F 47 SIM SIM SUPRAGLOTE T3N2BM0 36 MD 2+ M 63 SIM SIM SUPRAGLOTE T3N0MX 37 MD 2+ M 51 SIM SIM GLOTE T1AN0MX 38 MD 2+ M 75 SIM SIM GLOTE T3N0M0 39 BD 3+ M 56 SIM SIM SUBGLOTE T3NO0M0 40 BD 4+ M 52 SIM NÃO SUPRAGLOTE T2N0MX 41 BD 4+ M 49 SIM SIM GLOTE T3N0M0 42 MD 4+ M 62 SIM NÃO GLOTE T1BN0M0 43 BD 4+ M 50 SIM SIM GLOTE T4N0M0 44 BD 4+ M 60 SIM SIM SUPRAGLOTE T2N2cM0 45 BD 4+ M 57 SIM SIM SUPRAGLOTE T2N2cM0 46 BD 4+ M 64 SIM SIM SUPRAGLOTE T3N0M0 47 MD 4+ M 50 SIM SIM SUPRAGLOTE T3N2AM0 48 PD 1+ M 52 SIM SIM GLOTE T3N2BM0 49 MD 2+ M 53 SIM SIM GLOTE T3N0M0 50 MD 2+ M 52 SIM SIM GLOTE T4N0M0 51 BD 4+ M 61 SIM SIM GLOTE T1AN0MX 52 MD 3+ M 63 SIM SIM GLOTE T3N0M0 53 MD 3+ M 60 SIM SIM SUPRAGLOTE T3N1M0 54 MD 0 M 48 SIM SIM GLOTE T4N3MX 55 MD 4+ M 70 SIM SIM SUPRAGLOTE T4N0M0 56 MD 3+ M 57 SIM SIM SUPRAGLOTE T3N0M0 57 BD 4+ M 56 SIM SIM GLOTE T2N0M0 58 PD 2+ M 71 SIM SIM SUPRAGLOTE T3N1M0 59 MD 4+ M 54 SIM SIM GLOTE T4N1M0 60 MD 2+ M 62 SIM SIM SUPRAGLOTE T4N0MX 61 MD 3+ M 46 SIM SIM SUPRAGLOTE T2N1M0 62 MD 1+ M 73 SIM SIM GLOTE T3N0M0 63 MD 2+ M 52 SIM SIM SUPRAGLOTE T4N0MX

Anexos

144

Continuação: Paciente

Estadio clínico

data cir

RTX PO

Recidiva loc.

Recidiva reg.

Metástase

2a Lesão

Óbito

Data do óbito

1 III 1/2/2001 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO

2 Iva 9/3/2001 SIM SIM NÃO NÃO SIM

(estômago) SIM abril-03 3 Iva 16/030/01s SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 4 III 30/3/2001 SIM SIM NÃO NÃO NÃO SIM outubro-05 5 Iva 29/5/2001 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 6 Iva 15/3/2002 NÃO SIM SIM NÃO NÃO SIM julho-03 7 III 19/2/2002 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 8 I 22/2/2002 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 9 III 25/2/2002 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 10 II 4/3/2002 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 11 II 14/3/2002 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 12 Iva 18/3/2002 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO SIM janeiro-06 13 Iva 5/4/2002 SIM NÃO NÃO NÃO SIM (pulmão) NÃO 14 II 17/5/2002 NÃO SIM SIM NÃO NÃO SIM dezembro-04 15 III 13/6/2002 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 16 II 14/6/2002 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 17 III 28/6/2002 SIM SIM SIM NÃO NÃO SIM setembro-03 18 Iva 21/7/2002 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 19 Ivb 29/7/2002 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 20 II 13/8/2002 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 21 I 16/8/2002 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO SIM o.c. dezembro-03 22 III 20/8/2002 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO SIM o.c. março-05 23 II 17/9/2002 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO

24 III 16/9/2002 SIM NÃO NÃO SIM (seio Cavernoso) NÃO SIM abril-03

25 IVa 4/10/2002 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO SIM fevereiro-07 26 IVa 4/11/2002 SIM NÃO NÃO NÃO SIM (lábio ) NÃO 27 I 29/11/2002 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 28 I 6/12/2002 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 29 IVa 21/2/2003 Sim NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 30 III 7/3/2003 SIM SIM SIM NÃO NÃO NÃO 31 III 22/4/2003 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 32 IVa 6/5/2003 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 33 I 27/5/2003 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 34 IVa 30/5/2003 NÃO SIM NÃO NÃO NÃO SIM outubro-05 35 IVa 6/6/2003 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 36 III 16/6/2003 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 37 I 11/7/2003 NÃO NÃO NÃO NÃO SIM (Lábio) SIM abril-06 38 III 10/2/2004 NÃO SIM SIM NÃO NÃO NÃO 39 III 27/2/2004 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO SIM julho-04 40 II 16/3/2004 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 41 III 19/3/2004 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO SIM o.c. setembro-04 42 I 23/4/2004 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 43 IVa 4/5/2004 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 44 IVa 7/5/2004 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO SIM outubro-04 45 IVa 25/5/2004 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 46 III 8/10/2004 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO SIM o.c. novembro-04 47 IVa 13/8/2004 SIM NÃO SIM NÃO NÃO SIM o.c. junho-05 48 IVa 9/3/2004 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 49 III 25/10/2004 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 50 IVa 22/11/2004 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 51 I 1/6/2005 NÃO SIM NÃO NÃO NÃO NÃO 52 III 1/6/2005 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 53 III 1/7/2005 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 54 IVb 11/1/2006 SIM SIM SIM NÃO NÃO NÃO 55 IVa 6/10/2005 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 56 III 1/11/2005 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 57 II 18/2/2005 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 58 III 5/4/2005 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 59 IVa 19/4/2005 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 60 IVa 29/7/2005 SIM NÃO NÃO NÃO SIM (lingua) NÃO 61 III 11/10/2005 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 62 III 4/11/2005 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO 63 IVa 16/5/2003 SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO

ANEXO DE PUBLICAÇÃO

Anexo de Publicação

Expressão da proteína ligadora de cálcio S100A7 em carcinoma espinocelular de

laringe e sua correlação com a clínica: análise por imuno-histoquímica.

Rogério Costa Tiveron; Rui Celso Martins Mamede; David Livingstome A. Figueiredo;

Daniel Hardy de Melo; José Raphael M. C. Montoro


2

RESUMO

O Carcinoma Espinocelular de Laringe (CECL), responsável por 96% dos casos

de câncer de laringe, se caracteriza pelo comportamento heterogêneo, com evoluções

indefinidas. Estudos têm buscado marcadores para identificar tumores mais agressivos.

As proteínas ligadoras de Cálcio S100, com atuação em uma série de processos

celulares como progressão e diferenciação do ciclo celular, têm sido estudadas em

muitos tipos de cânceres, com exceção os de laringe. Objetivos: Identificar a expressão

imuno-histoquímica da proteína S100A7 em CECL e a correlação com variáveis

clínicas e histológicas do tumor, além de comparar as curvas de sobrevida global de

acordo com a expressão. Casuística e Métodos: 63 pacientes com CECL, tratados

cirurgicamente. Os dados clínicos foram coletados e arquivados e realizadas as reações

de imuno-histoquímica com o anticorpo S100A7 (Psoriasin) NCL-L-S100A7 –

(Novocastra Laboratories®). As reações foram classificadas quanto à extensão da

imunomarcação em: Zero; 1+: 5 – 25% das células neoplásicas marcadas; 2+: 25 –

50%; 3+: 50 – 75%; 4+: > 75% (nível de significância p ≤ 0,05). Resultados: A

amostra de 63 pacientes, 58 homens e cinco mulheres, com idade de 27 a 78 anos

(média de 57,46) constituiu de 36 casos de tumores pertencentes à supraglote, 24 à glote

e apenas três à subglote; 13 casos de CECL BD, 37 MD e 13 PD. Os escores foram

correlacionados com diversas variáveis. Observou-se uma tendência dos tumores

glóticos terem escores altos (15 de 24 com escore 3+ e 4+) e os supraglóticos baixos

escores (20 em 26 abaixo de 3+). O grupo BD apresentou escores significantemente

superiores aos MD e aos PD e o grupo MD superior ao PD (p< 0,01*). No grupo MD

notou-se predomínio de escores altos nos estadios I e II (7 casos com escore 3+ e 4+ de

10), ao passo que nos estadios avançados (III e IV), a distribuição do escore foi mais

homogênea (13/27 escores 0 a 2+ e 14/27 escores 3+ e 4+). Com relação às falhas do

tratamento houve diferença estatisticamente significante do grupo escore 0 (3/4

complicações: 75%) com os demais escores (13/59: 22%) (p= 0,02*). Discussão: O


3

S100A7 (psoriasin 1) é uma proteína liagadora de cálcio da família S100 amplamente

expresso em epitélio de doenças que cursam com hiperplasias da epiderme, como a

psoríase. Recentemente tem sido relatada alta expressão em lesões neoplásicas

(carcinoma ductal de mama, carcinoma espinocelular de bexiga e carcinoma

espinocelular de cavidade oral). À semelhança desses estudos, observou-se alta

expressão em tumores BD, ao passo que em tumores indiferenciados esse gene parece

não atuar. À medida que a massa tumoral aumenta os escores tendem a diminuir (isto

foi observado nos tumores MD), o que reforça a hipótese da sua ação se concentrar nas

fases iniciais da carcinogênese. Conclusões: A proteína S100A7 foi expressa em 93,7%

dos casos de CECL, com maior positividade em tumores mais diferenciados e com

menor índice de falhas de tratamento(estatisticamente significante). Há tendência dos

tumores glóticos terem maior escore na expressão (sem significância). O escore obtido

não representou impacto na sobrevida dos pacientes estudados.

Palavras-chave: psoriasin; carcinoma espinocelular; carcinoma de laringe; imuno-

histoquímica; marcadores tumorais, S100A7.


4

SUMMARY

The Laryngeal Squamous Cell Carcinoma (LSCC), represents around 96% of all larynx

cancer cases and has heterogenic features and presents indefinite evolutions. Studies of

molecular and cellular alterations have focused in detecting markers to identify more

aggressive tumors. The S100 calcium biding proteins are involved in a variety of

cellular processes such as cell-cycle progression and differentiation. They are actually

reported in many kinds of cancer, except larynx cancer. Objectives: Identify the

imunohistochemistry expression of S100A7 protein and its correlation with clinic and

histological features, besides comparing the survival curves of the different score

groups. Casuistic and Methods: 63 LSCC patients, treated by surgery have their

clinical data collected and filed and the imunohistochemical reactions with S100A7

(Psoriasin) NCL-L-S100A7 – (Novocastra Laboratories®). The reactions were classified

according to their extension: Zero, 1+: 5 to 25% of neoplasic cells marked, 2+: 25 to

50%, 3+: 50 to 75% and 4+: > 75% (significance level, p<0,05). Results: 63 patients,

58 men and 5 women aged from 27 to 78 years (average: 57.46 years) had a distribution

of 36 supraglottic, 24 glottic and only 3 subglottic tumors; 13 cases of LSCC were well

differentiated, 37 moderately differentiated and 13 poorly differentiated. There is a

tendency of the glottic tumors to have high scores (15 in 24 scored 3+ and 4+) and also

the supraglottic have lower (20 in 26 < 3+). The moderately differentiated group had

significantly higher scores than the moderately and poorly and the moderately had

higher scores than poorly (p<0,01*). In the moderately group it is possible to note a

higher score prevalence at I and II stages (7 cases in 10 scored 3+ or 4+), and on the

other hand at advanced stages (III and IV) the score distribution were similar (13/27

scored 0 to 2+ and 14/27 scored 3+ and 4+). The treatment failures were significant


5

higher in zero score group (3/4 complications: 75%) than in positive score group (13/59:

22%) (p= 0,02*). Discussion: Psoriasin1 is S100 calcium binding protein family highly

expressed in hyperplasic epidermal diseases, such as psoriasis. Recently it was reported

in same neoplasic diseases (such as breast ductal cancer, bladder epidermoid carcinoma,

skin tumors and oral epidermoid cancer). Similarly to these studies it was observed high

expression in well differentiated tumors but in poorly differentiated it seems to loose its

function. When the tumor mass is growing the score levels seems to reduce and this fact

showed a tendency to its action concentrate in beginning carcinogenic phases.

Conclusions: The S100A7 protein was expressed in 93.7% of the LSCC, with highest

expression in the more differentiated (statistically significant). There is a tendency to

glottic tumors to have higher scores (no significance). The obtained score didn’t

represent impact in the overall survival curves.

key-words: psoriasin, larynx cancer, squamous cell carcinoma, tumors markers,

S100A7.


6

INTRODUÇÃO

O Câncer de Laringe é o segundo mais comum câncer do sistema respiratório

perdendo apenas para o câncer de pulmão1. Compreende cerca de 2% dos casos de

câncer do Brasil, o que corresponde a 8.000 casos por ano2. O carcinoma espinocelular

corresponde à cerca de 94% de todos os tipos histológicos. Apesar dos inúmeros

avanços no diagnóstico bem como no tratamento do câncer de cabeça e pescoço, a

sobrevida aumentou pouco mais de 10% nos últimos 30 anos3,4. É marcante a

heterogeneidade de fatores envolvidos na evolução do carcinoma epidermóide. Muitas

características clínicas e histopatológicas já foram extensamente estudadas. Nos últimos

anos, o estudo das alterações celulares e moleculares tem se desenvolvido no sentido de

detectar marcadores para o reconhecimento de tumores primários ocultos, presença de

neoplasia nas margens cirúrgicas, e principalmente, auxiliar na identificação de

indivíduos mais suscetíveis a desenvolver a neoplasia, bem como aqueles casos de

maior agressividade. Não existem relatos na literatura sobre a avaliação da expressão da

proteína S100A7 em CECL.

OBJETIVOS

O presente estudo visa, em carcinoma espinocelular de laringe:

a) identificar a expressão imuno-histoquímica do da proteína ligadora de

cálcio S100A7;

b) identificar a correlação entre a expressão da proteína com variáveis

clínicas e histológicas do tumor;

c) comparar as curvas de sobrevida global dos diversos grupos de escore.


7

CASUÍSTICA E MÉTODO

Casuística

Foram avaliados 63 casos de pacientes com diagnóstico histopatológico de

CECL tratados cirurgicamente no serviço de cirurgia de cabeça e pescoço do Hospital

das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo

(HCFMRP-USP), entre janeiro de 2001 a dezembro de 2005, com prévio consentimento

para participar, com assinatura de Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.

Todos os pacientes foram examinados e operados, conforme os protocolos de

tratamento vigentes, sem qualquer alteração técnica. Os espécimes foram encaminhados

de maneira usual para o estudo anatomopatológico, sem interferência na rotina do

estudo histopatológico.

Os dados clínicos, sócio-demográficos, anatomopatológicos, e de

acompanhamento destes pacientes foram armazenados em um sistema de controle de

dados pertencente ao projeto Genoma (GENCAPO) financiado pela FAPESP e Ludwug

Institute for Cancer Research (NY) –

(http://www.compbio.ludwig.org.br/clinicalgenomics/).

As respectivas lâminas e blocos foram obtidos do departamento de patologia do

HCFMRP-USP. Todos os casos foram revistos por dois patologistas e foram realizadas

as reações de imuno-histoquímica para avaliar a expressão da proteína ligadora de

cálcio S100A7.

Critérios de Inclusão

Os critérios de inclusão foram:


8

o Diagnóstico histológico de CECL obtido por biópsia incisional (saca-bocado)

e confirmado por exame anatomopatológico;

o Ausência de tratamento prévio para a neoplasia;

o Cirurgia indicada como tratamento inicial

o Aceite do paciente de participar do estudo (através de assinatura do Termo

de Consentimento);

o Amostra tecidual representativa para o estudo imuno-histoquímico.

Critérios de Exclusão

Foram excluídos deste estudo cinco pacientes decorrentes de:

o Ausência de precisão quanto ao sítio primário do tumor;

o Perda do seguimento clínico;

o Dados clínicos indisponíveis ou incompletos (data da cirurgia, estadiamento

clínico e patológico dos tumores, radioterapia pós-operatória, recidiva local,

recidiva regional, metástase à distância, segundo tumor primário, óbito);

o Amostra tecidual não representativa e/ou insuficiente para as reações de

imuno-histoquímica.

Método

Estudo Histológico

As peças cirúrgicas foram fixadas em formalina tamponada a 10% por um

período não superior a 48 horas, clivadas e obtidas áreas representativas da neoplasia.

Os fragmentos escolhidos foram então processados a fim de serem emblocados em

parafina para obtenção dos cortes histológicos de 4 µm de espessura, que foram corados


9

com hematoxilina e eosina (H&E).

Para cada caso foi selecionado um bloco representativo para a realização das

reações imuno-histoquímicas, sendo obtidos cortes seriados de 4 µm em lâminas com

solução adesiva de 3-amino-propyltriethoxy-silano (Sigma Chemical Co.®, St. Louis,

MO/USA).

O anticorpo utilizado para a reação imuno-histoquímica foi o S100A7

(Psoriasin) – liquid mouse monoclonal antibody NCL-L-S100A7 – Novocastra

Laboratories® , UK.

Para evitar reação endógena, devido à presença de biotina e avidina, foram

utilizados polímero dextran e sistema de amplificação enzimática NovoLink (Novocastra

Laboratories®, UK).

Os cortes teciduais de 4 µm foram submetidos à recuperação antigênica pelo

calor por 3 minutos em steammer, com solução de ácido cítrico 10 mM/pH 6.0. O

bloqueio da peroxidase endógena foi realizado com solução aquosa de peróxido de

hidrogênio a 6%. A incubação com o anticorpo primário foi feita a 37ºC em câmara

úmida a 4ºC por 12 horas (overnight). A incubação com anticorpo secundário, diluído

em PBS, foi realizada por 30 minutos a 37°C. Após lavagens em PBS, os cortes foram

incubados por 30 minutos a 37oC com o sistema amplificador Novolink. Por fim, os

cortes histológicos foram lavados em água corrente por 10 minutos, contracorados com

hematoxilina de Harris por 10 segundos, novamente lavados em água corrente,

desidratados em etanol e diafanizados em xilol. A montagem das lâminas foi realizada

em resina Permount (Fisher Scientific®, Fair Lawn, NJ/USA, cód. S15-100).


10

Para cada bateria de reação foram utilizados controles positivos (pele normal) e

negativos. Os controles negativos foram estabelecidos através da omissão do anticorpo

primário, que foi substituído por tampão PBS (“blank”).

O estudo das reações foi feito em microscópio de múltipla observação por dois

patologistas simultaneamente, com desconhecimento da identidade dos casos e

definidas mediante consenso. Das amostras escolhidas, foi inicialmente avaliada, em

objetiva panorâmica (aumento final de 40x), a extensão da imunomarcação, sendo que

aumentos maiores foram utilizados a fim de se confirmar o padrão de expressão (100x,

200x e 400x).

As reações foram então classificadas subjetivamente quanto à extensão da

imunomarcação em:

• Zero: até 5% das células neoplásicas marcadas;




• 4+: > 75% das células neoplásicas marcadas.

Para fins de análise estatística, não foram consideradas as intensidades das

reações, e sim, apenas a sua positividade.

Análise Estatística

Após Classificação das Reações, os diferentes escores obtidos foram

comparados com os dados clínicos, histopatológicos e de acompanhamento dos

pacientes.


11

Para análise estatística utilizamou-se a metodologia não-paramétrica, pois a

variável escore não apresentou distribuição normal. Adotou-se como nível de

significância p ≤ 0,05.

A variável escore foi trabalhada como uma variável numérica, ou seja, 0+ = 0;

1+ = 1; 2+ = 2; 3+ = 3 e 4+ = 4.

RESULTADOS

Características da Amostra

Foram incluídos neste estudo 63 casos de pacientes com diagnóstico de CECL

tratados cirurgicamente pelo serviço de cirurgia de cabeça e pescoço do HCFMRP-USP,

no período de fevereiro de 2001 a dezembro de 2005. Do total de 63 pacientes, eram 58

homens e cinco mulheres com idade variando, nos homens, de 27 a 78 anos (média de

57,46 anos) e 47 a 59 anos nas mulheres. Quanto à localização do tumor primário, a

grande maioria se localizava na supraglote (36 casos) e na glote (24 casos) com

incidência de 57% e 38%, respectivamente. Somente três casos (4,7%) se originavam da

subglote. Obtiveram-se oito casos no estadio I, oito no estadio II, 22 no estadio III e 25

casos no estádio IV, sendo que três eram IVb. Entre os tumores glóticos, houve

distribuição por todos os grupos de escore, sendo que oito foram classificados como

estádio I; entre os de supraglote, 15 eram estadio III e 14, estadio IV.

Em relação ao tabagismo, apenas dois dos 63 casos não eram fumantes; 52 eram

etilistas e apenas 11 não consumiam bebidas alcoólicas.

Os pacientes foram acompanhados desde o dia da cirurgia (estipulado como

início do seguimento) até dezembro de 2007, sendo que o tempo de seguimento variou

de um mês a 82 meses (média de 45,4 meses). Durante o seguimento desses pacientes,


12

constatou-se que ocorreram dez casos de recidiva local, sete casos de recidiva regional,

um caso de metástase à distância e em cinco casos houve o aparecimento de segundo

tumor primário (Tabela 1).

Dos 63 pacientes estudados, 17 (27%) foram a óbito, sendo que 12 (19%) pela

neoplasia e cinco (8%) faleceram por outras causas não relacionadas à neoplasia. A

Tabela 2 relaciona óbitos e suas causas ao sítio do tumor.

Todos os tumores foram classificados histologicamente por grau de

diferenciação, obtendo-se 13 (20,6%) bem diferenciados, 37 (58,7%) moderadamente

diferenciados e 13 (20,6%) pouco diferenciados. No gráfico 1, encontra-se a

classificação histológica pelos diferentes sítios. A maioria dos tumores glóticos (91,7%)

era moderadamente diferenciada (16/24=66,7%), bem diferenciados (6/24=25%) e

somente dois eram pouco diferenciados. Os tumores supraglóticos apresentavam

distribuição mais uniforme quanto à diferenciação, pois sete (19,4%) eram bem

diferenciados, 19 (52,7%) moderadamente diferenciados e 10 (27,8%) eram pouco

diferenciados. Entre os de subglote, dois eram moderadamente e um era pouco

diferenciado.

Avaliação do escore

Os 63 espécimes tumorais foram submetidos à imuno-histoquímica para

detecção da expressão da proteína S100A7. As reações foram classificadas, de acordo

com a extensão da imunomarcação em escores segundo a classificação estabelecida na

metodologia. Obtiveram-se quatro casos com escore 0 (6,3%), 10 casos com escore

1+(15,9%), 15 casos 2+ (23,8%), 10 casos 3+ (15,9%) e 24 casos 4+ (38,1%). Os


13

escores obtidos foram relacionados com as variáveis clínicas dos pacientes e

histopatológicas dos tumores.

O gráfico 1 ilustra a distribuição dos escores de acordo com os diferentes sítios

primários. Houve distribuição muito semelhante dos escores pelos vários sítios

anatômicos, com exceção a subglote devido ao número escasso de casos. Há tendência

maior dos glóticos serem classificados com 3 e 4 + (15 de 24), enquanto os

supraglóticos em se manter com baixo escore (20 em 36).

Na comparação do escore com o grau de diferenciação celular utilizou-se o

Teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis. Os resultados estão representados na Tabela

3.

Há diferença estatisticamente significativa entre os diversos grupos. O grupo BD

apresenta escores significativamente superiores aos dos grupos MD e PD; o grupo MD

apresenta escores significativamente superiores aos dos grupos PD (BD > MD > PD).

Pelo Gráfico 2 observa-se que os tumores pouco diferenciados se postaram nas

faixas de escores inferiores, ou seja nenhum apresentou-se com escore 3 ou 4+.

Considerando somente os tumores moderadamente diferenciados, a análise do

escore em relação ao estadiamento está representada na Tabela 4, onde estão agrupados

os estadios I e II, os estadios III e IV e os escores 0, 1 e 2+ e 3 e 4+.

As relações dos escores com as variáveis sítio do tumor, estadiamento clínico,

idade, presença de recidiva regional e/ ou local, segundo tumor primário e óbitos não

foram significantes.


14

Comparação das curvas de sobrevida

Foi aplicado o método de construção das curvas de Kaplan-Meier e o teste do

Log rank para a comparação das diferentes curvas. Não se notou diferença

estatisticamente significante entre as sobrevidas e os escores obtidos tanto se analisando

os escores separadamente, quanto agrupados (Gráficos 3 e 4 e Tabelas 5 e 6) .

Para a comparação das curvas de sobrevida entre os grupos de escore

consideram-se dois grupos. Um de ausência ou baixa positividade – grupo 1

(considerando os escores Zero, 1+,2+) e outro de forte positividade – grupo 2

(considerando os escores 3+ e 4+).

Análise Estatística

Considerando como falhas do tratamento a presença de recidiva local ou

regional, metástases e segundo tumor primário, a Tabela 7 correlaciona tais

complicações com os diferentes escores.

Não houve diferença estatisticamente significativa entre os escores e a presença

de complicações. Porem na comparação do escore zero (3/4=75%) com os demais

(13/59=22%) houve diferença estatisticamente significativa (Z=2,53, p=0,02)

DISCUSSÃO

Expressão do gene Psoriasin

Houve distribuição dos escores pelos vários sítios anatômicos, com exceção da

subglote devido ao número escasso de casos. Há tendência maior dos glóticos serem

classificados com 3 e 4+ (15/24=62,5%), enquanto os supraglóticos em se manter com

escores menores na imunomarcação (20/36=55,5%). Pelo gráfico 4 observa-se que os


15

tumores pouco diferenciados se postaram nas faixas de escores inferiores, ou seja

nenhum apresentou-se com 3 ou 4+. Isto explica a maior tendência dos tumores glóticos

terem escore maior, pois seus tumores são em maior número de bem diferenciados do

que os da supraglote. Entretanto, não houve diferença estatisticamente significante dos

escores em relação ao sítio do tumor. Outro aspecto que deve ser destacado é que todos

os tumores pouco diferenciados tiveram tendência a terem escores <3+, daí os de

supraglote terem escores menores, pois lá residem mais tumores pouco diferenciados.

Este fato é explicado pela provável função deste gene, ou seja, atua enquanto as células

são bem diferenciadas, nos tumores indiferenciados esse gene parece não ter função5,6,.

Analisando a distribuição dos 37 tumores moderadamente diferenciados,

verifica-se que 19 (19/36=53,7%) estão localizados na supraglote, 16 (16/24=66,6%) na

glote e dois na subglote. A maioria desses tumores, ou seja, 56,7% (21/37) foram

classificados com mais de 2+, porém, ao analisar a sua distribuição segundo o

estadiamento clínico, observa-se que existe uma tendência dos classificados com

estadios I ou II de obterem escore > que 3+ (7/10), enquanto que os com estadios III e

IV, a distribuição de escore se encontra mais uniforme (Tabela 8). Ou seja, na medida

em que a massa tumoral aumenta, os escores diminuem. Assim, a ação do gene

Psoriasin parece se concentrar nas fases iniciais da carcinogênese.

Não se encontrou relação estatisticamente significante entre o escore obtido e

a idade dos pacientes. Foram detectados fatores de suscetibilidade para o carcinoma

papilífero de tireóide que variava conforme as populações investigadas (espanhóis,

americanos e alemães) e que essa suscetibilidade dependia de fatores genéticos e

ambientais7. Neste estudo não foi possível essa análise porque somente dois pacientes

não tinham o hábito de fumar.


16

Apesar de o seguimento clínico ter sido menor do que a literatura preconiza, a

comparação das curvas de sobrevida entre os escores obtidos (analisados

individualmente ou agrupados) não demonstrou diferença estatisticamente significante.

Falhas do tratamento

Nesta amostra, obtiveram-se 73% (46/63) de sobrevida e 17 (17/63=27%)

óbitos, sendo que o motivo desses óbitos foi por falhas do tratamento em 12,7% (8/63);

complicações decorrentes do tratamento em 6,3% (4/63) e por outras causas em 7,9%

(5/63). Portanto, 70,5% (12/17) dos óbitos foram decorrentes do tumor ou do seu

tratamento.

Entre os 63 casos tratados, 22,2% (14/63) evoluíram com algum tipo de falha

do tratamento (foram 10 recidivas locais, 6 recidivas cervicais, 1 metástase e 5 segundo

tumor primário, totalizando 22 em 15 pacientes) sendo que sete continuam vivos.

Dentre as falhas de tratamento, a recidiva local ou regional (doravante simplesmente

recidiva) ocorreu em 10 casos, enquanto a metástase à distância e a presença de segundo

tumor primário (doravante outras) em seis, sendo que um paciente teve recidiva local e

2º tumor primário ao mesmo tempo e seis tiveram recidivas local e regional. Essas

complicações estavam igualmente distribuídas entre a glote (5 recidivas e 2 outras) e a

supraglote (5 recidivas e 4 outras), sem que os de subglote tenham apresentado este tipo

de complicação.

Verificou-se que a falha no tratamento ocorreu em 29,1% (7/24) dos tumores

glóticos e em 22,2% (8/36) entre os da supraglote. Uma justificativa para a maior

agressividade observada entre os glóticos é que eles não são aqueles tratados por

radioterapia ou cirurgia endoscópica (indicados em estágio precoce), além do fato dos


17

tumores transglóticos terem sido incluídos nesta categoria. Dessa forma, é provável que

a amostra de tumores glóticos aqui estudados tenha representação apenas da fração mais

agressiva destes tumores.

Ainda neste estudo, verifica-se que a maioria (83,3%) dos tumores

supraglóticos foi classificada como estadios III e IV (30 em 36 casos), enquanto os

glóticos se dividiram pelos vários estadiamentos (10 estadios < III e 14 estadios >II) o

que nos leva a concluir que na supraglote os tumores eram de maior dimensão ou,

segundo a classificação TNM, mais agressivos. Esse fato, porém, não se confirmou ao

se observar a evolução dos tumores aqui estudados.

Com relação ao consumo de bebidas alcoólicas, não se observaram diferenças

nas populações de etilistas e não etilistas com relação aos diversos fatores estudados, o

que demonstra que o consumo de álcool tem um papel comprovado na etiologia do

câncer de laringe, entretanto não representou impacto na sobrevida desta população. Por

outro lado, Dikshit et al., 20058 relataram que o consumo de álcool e o tabagismo antes

do diagnóstico do tumor influenciaram a sobrevida e o prognóstico dos pacientes e

Zapater et al., 20009, em estudo de tumores de supraglote, concluíram que o consumo

de álcool representa uma variável importante de prognóstico, fato que não foi

comprovado neste estudo.

As falhas de tratamento ocorreram em 25% (2/8) dos tumores classificados

como estadios I, 12,5% (1/8) dos estadios II; 22,7% (5/22) dos estadios III e 28% (7/25)

entre os estadios IV. As falhas ocorridas com o estadio I foram entre os tumores

glóticos ao se tentar o tratamento com cirurgias parciais da laringe. É sabido que os

carcinomas supraglóticos são possuidores de comportamento biológico diferente dos da

laringe, sempre com maior agressividade, devido à freqüente metastatização para


18

linfonodos10. Porém, acredita-se que outros mecanismos estejam envolvidos nessa

agressividade, como o fato da incidência maior de tumores em estadios III e IV, em

relação à glote. Esse fato ocorre porque os tumores de supraglote são diagnosticados

mais tardiamente, com volume maior de células neoplásicas. Por outro lado, Greenman

(2000)11 refere que a diferença no prognóstico dos tumores para os diferentes sítios da

laringe se correlaciona apenas com o potencial de metastatização que é maior nos

tumores de supraglote. Neste estudo, a maioria dos supraglóticos foi estadio III e IV,

porém essa agressividade não foi detectada.

Quanto ao escore obtido pelo grupo que desenvolveu complicações

oncológicas, 75% (¾) eram zero+, 20% (2/10) eram 1+; 26,6% (4/15) eram 2+; 20%

(2/10) eram 3+ e 20,1% (5/24) eram 4+. Esses números nos levam a concluir que as

complicações oncológicas foram mais freqüentes nos pacientes com escores do gene

Psoriasin zero (estatisticamente significante). Destaque-se que a recidiva local é fruto

do ato cirúrgico, quando margens de segurança escassas são deixadas no leito

operatório, sendo, portanto, relacionada muito mais á indicação e a realização do ato

operatório do que à agressividade tumoral. O mesmo não ocorre com a recidiva regional

que, embora tenha relação com a indicação e a realização do esvaziamento cervical, sua

presença decorre da maior agressividade tumoral. Outras complicações em que não há a

participação da indicação errada do tratamento são: a metastatização à distância e a

presença de segundo tumor primário. Estas três complicações: recidiva regional,

metástase e segundo tumor primário estiveram presentes em 13 casos, sendo em 19,4%

dos tumores de supraglote (7/36) e em 6 (6/24=25%) entre os de glote. Elas se

distribuíram por oito casos com escore menor que 3+ (8/29=27,6%) e em cinco casos

com escore maior que 2+ (5/34=14,7%). Pôde-se comprovar a ocorrência de


19

complicações estatisticamente significantes nos casos em que o escore do Psoriasin foi

zero+ e também uma tendência em estarem presentes em pacientes com escore <3+.

Dos tumores analisados, 20,6% eram bem diferenciados, 58,7% eram

moderadamente diferenciados e 20,6% eram pouco diferenciados. Na população de

pacientes que evoluíram com complicações oncológicas a distribuição da diferenciação

celular foi muito semelhante, ou seja: 21,4% (3/14) de bem diferenciados, 57,1% (8/14)

de moderadamente diferenciados e 21,4% (3/14) de pouco diferenciados. Isso mostra

que a diferenciação celular não teve influência na presença de complicações

oncológicas. A distribuição da diferenciação celular foi a mesma por região anatômica.

Não existem evidências de que os tumores desses diferentes sítios possuem diferenças

biológicas intrínsecas. Entretanto, segundo Stell (1990)12, os tumores da supraglote

tendem a ser mais indiferenciados que os glóticos, o que não foi verificado neste estudo.

O Gene Psoriasin 1

Esforços têm sido aplicados no sentido de identificar a expressão de novos

marcadores tumorais relacionados com os CECCP. Figueiredo et al. (2006)13

descreveram que genes de antígenos tumorais específicos (CTAs) (MAGE-1, -4, -10, -

12, BAGE, GAGE, LAGE, NYESO-1 e PRAME) são expressos em proporções variáveis

(6,1 a 48,5%) em CECCP e essa expressão correlaciona-se com tumores avançados.

Além disso, concluíram que em 63,6% dos casos ocorre expressão concomitante de dois

ou mais genes, principalmente nos tumores avançados e que há relação da expressão de

MAGE-4 no tumor primário com menor incidência de metástases linfonodais. Esses

autores não observaram associação da expressão dos CTAs com grau de diferenciação,

contradizendo Sarcevic, 200314 que encontraram MAGE-4 em tumores de menor grau


20

de diferenciação. O padrão de co-expressão observado sugeriu a Figueiredo et al

(2006)13 que o desenvolvimento de vacinas polivalentes, contendo epitopos de vários

antígenos codificados por esses genes, deva ser o caminho para o desenvolvimento de

vacinas clinicamente úteis. O estudo do gene S100A7 encontra-se em fase bem mais

precoce, porém sua expressão maior na urina do paciente sugere ser um potencial

marcador não invasivo para o seguimento de pacientes com câncer15 e, segundo Skliris

et al, 200716, esse gene, por ser regulado pela atividade do receptor de estrógeno,

poderia ser um guia para terapia alvo.

O S100A7 (psoriasin 1) é uma pequena proteína fixadora do Cálcio de 11,4 Kda

pertencente à família de genes S100 amplamente expressa em epitélio escamoso, cuja

exata função é incerta17,18. A expressão do gene S100A7 foi descrita previamente em

pele psoriática e em outras doenças que cursam com hiperplasia de epiderme19,20,21.

Estudos por imuno-histoquímica detectaram que o psoriasin 1 é produzido pelo

queratinócito circundante de ferida e está presente no seu exsudato22. Segundo Eckert e

Lee, 200619, o psoriasin 1 age como substrato da transglutaminase; no sinal da

transdução e tem também função antibacteriana na epiderme. Para Wolk et al, 200623,

além da ação antimicrobiana, o psoriasin 1 inibe a diferenciação celular e aumenta a sua

motilidade, favorecendo a invasão e a metastatização.

Relatos de sua expressão aumentada em lesões neoplásicas têm sido

freqüentes. Dentre elas ressalta-se o carcinoma ductal de mama6,16,24,25,26, carcinoma

espinocelular de bexiga15, em tumores de pele5 e carcinoma espinocelular de cavidade

oral27,28.

Neste estudo detectou-se a expressão do marcador S100A7 (psoriasin 1 ou

preoteína ligadora de cálcio S100A7) em 93,7% dos casos de CECL, com expressão


21

forte nos tumores diferenciados e fraca nos pouco diferenciados. Isso é também

concordante com o trabalho de LEYGUE et al., 19966 realizado com carcinoma ductal

da mama, onde a expressão do psoriasin1 é fortemente positiva no carcinoma in situ,

enquanto no carcinoma invasivo essa expressão é menor. Esses autores avaliaram a

expressão do RNAm do S100A7 em biópsias de congelação de tecidos de mama

representadas por carcinoma in situ, carcinoma ductal invasivo e tecidos normais e

confirmou altas expressões do psoriasin no carcinoma ductal in situ. É sabido que

tumores mais diferenciados tendem a ser menos agressivos com melhor evolução e

maior sobrevida, porém esse fato não se confirmou em nosso estudo, pois não se

detectou diferenças na sobrevida dos diferentes grupos de pacientes estudados.

Watson; Leygue e Murphy, 199829 relatam que a expressão do S100A7 foi

amplamente detectada em tumores in situ, ao passo que nos tumores invasivos tal

proteína foi expressa em apenas 18% dos casos. Esse padrão sugere que a expressão do

psoriasin 1 está associada com alterações na diferenciação do epitélio e deve ter

importância na progressão tumoral precoce. Outro fator adicional para o envolvimento

na progressão do carcinoma ductal é a sua localização em uma região do cromossomo 1

que freqüentemente (> 50% dos casos) apresenta perda da heterozigosidade nos tumores

invasivos30.

Em estudo recente foi avaliada a expressão de RNAm do S100A7 através da

técnica de RT-PCR em biópsias de pele de pacientes com lesões pré-neoplásicas,

carcinoma espinocelular, carcinoma basocelular e controles normais. Encontraram

expressão aumentada em pacientes com lesões pré-neoplásicas, no carcinoma

basocelular e significantemente aumentada no carcinoma espinocelular. Os autores

concluíram que, à semelhança do carcinoma ductal da mama e do carcinoma


22

espinocelular de bexiga o aumento na expressão do psoriasin 1 deve desempenhar um

papel importante na progressão do câncer de pele5.

Para Watson; Leygue e Murphy, 199829, o S100A7 tem efeito importante no

desenvolvimento do fenótipo invasivo, que pode ser tanto um efeito indireto nas células

da resposta imune do hospedeiro ou mesmo uma influência direta que contribuía para a

invasão tumoral. Nessa amostra, pôde-se constatar que entre os tumores moderadamente

diferenciados a expressão tem tendência a diminuir na medida em que o estadiamento

do tumor aumenta. A observação de que 75% dos tumores com escore zero tiveram

complicação oncológica mostra que na falta do S100A7 há favorecimento da invasão

tumoral.

Função do Gene

Segundo Zhou et al, 200827 e Eckert e Lee, 200619 a proteína fixadora de

cálcio tem ação na transdução e dessa forma na carcinogênese do epitélio, porém sua

função ainda não está bem determinada.

Para Petersson et al, 200724, o Psoriasin expresso desenvolve um fenótipo de

resistência à apoptose e para Wolk et al, 200623, a falta de expressão inibe a

diferenciação celular e aumenta sua motilidade, facilitando a invasão. Dessa forma, o

Psoriasin é altamente expresso nos tumores diferenciados, na fase pré-invasiva e é

pouco expresso nos menos diferenciados e em estágio invasivo do tumor25,27. Krop et

al., 200520 acreditam que o Psoriasin age promovendo a angiogênese e destacando

células que comandam a função antiinvasiva, explicando, assim, o porquê da alta

expressão em tumores bem diferenciados ou estrógenos negativos.


23

Para Fukuzawa et al, 200628 o Psoriasin tem ação na transcrição e que o

segmento desse gene que determina esta função no CEC de cavidade oral é o -1513 a

988. Para Mandal et al, 200725 o Psoriasin modula a resposta imune favorecendo o

crescimento do câncer de mama, nas fases iniciais. No entanto, Zhou et al, 200827

demonstram que o Psoriasin age inibindo ou sendo inibido pelo complexo beta catenin.

Assim, segundo os autores, em situação em que a expressão do Psoriasin é alta, ocorre

diminuição do complexo beta catenin, e o tecido pré-neoplásico se transforma em

carcinoma espinocelular bem diferenciado, mas com pouca agressividade. O carcinoma

espinocelular será pouco diferenciado e de alta agressividade quando a expressão do

complexo beta catenin for alta a ponto de inibir a do psoriasin 1.

A nosso ver, esse gene age nas fases iniciais da tumorigênese, sendo

importante na origem dos tumores diferenciados, mas à medida que sofrem

indiferenciação sua influência desaparece ou são consumidos para que o processo

ocorra. Esse deve ter sido o mecanismo do gene Psoriasin envolvido nos tumores de

laringe, ou seja, participam na sua diferenciação, e à medida que a expressão diminui,

os tumores tornam-se mais agressivos. Este é o primeiro trabalho na literatura a avaliar

a expressão desse marcador em neoplasia de laringe e novos estudos poderão detectar

informações complementares que possam tornar esse gene, expresso em 93,7% dos

casos, um marcador da presença e da agressividade do CECCP.

CONCLUSÕES

Os dados deste estudo levam a concluir com relação à expressão da proteína

ligadora de cálcio S100 A7 em carcinoma espinocelular de laringe:

a) Esteve presente em 93,7% dos casos;


24

b) As complicações oncológicas foram mais freqüentes nos pacientes com

escore zero

c) Apresenta maior positividade em tumores bem diferenciados:

- com tendência dos moderadamente diferenciados a diminuírem sua

expressão à medida que o estadiamento aumenta.

d). O escore de imunomarcação não representou impacto na sobrevida dos

pacientes estudados.

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29

LEGENDA DE FIGURAS

Figura 1- Distribuição dos diferentes escores das reações de Iimuno-histoquímica em relação aos diferentes sítios tumorais na laringe (valores expressos em número de pacientes).. Figura 2- Distribuição do Escore em diferentes graus de diferenciação. Valores expressos em número de pacientes..

Figura 3- Curva de sobrevida para os diferentes escores (considerando os escores 0, 1, 2, 3, e 4). Figura 4- Curva de Sobrevida para escores agrupados.


30

2 2

0

8

2

0

10

5

0

4 4

2

12 11

1

0

2

4

6

8

10

12

Zero 1+ 2+ 3+ 4+

Supraglote

Glote

Subglote

Figura 1

Figura 2

3

1 1

7

3

0

3

12

10

9

0 0

12

11

0

2

4

6

8

10

12

0 1+ 2+ 3+ 4+

PD

MD

BD


31

Figura 3

Figura 4


TEMPO (meses)

100806040 20 0

Sob

revi

da a

cum

ulad

a

1,1

1,0

,9

,8

,7

,6

,5

,4

,3

ESCORE

4

4-censurado

3

3-censurado

2

2-censurado

1

1-censurado

0

0-censurado


Tempo (meses)

100806040200

So

bre

vid

a ac

um

ula

da

1,1

1,0

,9

,8

,7

,6

,5

ESCORE

3+4

3+4 censurado

0, 1+, 2+

0, 1+, 2+ censurado


32

Tabela 1- Seguimento Clínico dos pacientes segundo o sítio do tumor (valor expresso em número de pacientes).

Recidiva local Recidiva regional Metástase à

distância Segundo tumor

primário Supraglote 5 3 1 3

Glote 5 4 0 2

Subglote 0 0 0 0

Total 10 7 1 5

Tabela 2- Relação de óbitos e as causas dos mesmos de acordo com o sítio do tumor. (valores expressos em número de pacientes).

Sito da lesão

Total de óbitos

Óbitos por recidiva

local/ regional

Óbitos por segundo tumor

primário

Óbitos por metástase à

distância

Óbitos decorrentes do

tratamento

Supraglote 8 4 0 1 3

Glote 3 2 0 0 1

Subglote 1 0 0 0 1

Total 12 6 0 1 5

Tabela 3- Análise do Escore de acordo com os diferentes graus de diferenciação.


N Mediana Máximo Mínimo Média Desvio Padrão

PD 13 1,00 2,00 0,00 1,00 0,71

MD 37 3,00 4,00 0,00 2,76 1,09

BD 13 4,00 4,00 3,00 3,92 0,28

X² = 32,90, p < 0,001*


33

Tabela 4: Distribuição dos escores de acordo com os diferentes estadiamentos para os tumores MD

Estadiamento Escore 0 / 1+ / 2+ Escore 3+ / 4+

I e II 3 7

III e IV (IVa e IVb) 13 14

Tabela 5- Relação da Sobrevida média (em meses) e os diferentes escores.

Escore N Sobrevida média Intervalo de confiança de 95%

0 4 57,75 (33,56 – 81,94)

1 10 65,62 (56,71 – 74,53)

2 15 57,65 (48,95 – 66,36)

3 10 58,26 (4367 – 72,84)

4 24 62,78 (49,42 – 76,15)

Teste Log Rank = 0,90 / p = 0,92

Tabela 6- Relação da Sobrevida média (em meses) em relação aos dois grupos de escore (grupo 1 – escores 0,1+,2+ e grupo 2 – escores 3+ e 4+).

Grupos de escore

N Sobrevida média Intervalo de confiança de 95%

0+1+2 29 61,01 (54,36 – 67,66)

3+4 34 64,84 (54,01 – 75,68)

Teste Log Rank = 0,05 p = 0,83


34

Tabela 7- Relação do escore com a presença de complicações oncológicas (recidiva local ou regional, metástases e segundo tumor primário).

Escore Total de pacientes Complicações

Zero 4 3

1+ 10 2

2+ 15 4

3+ 10 2

4+ 24 5

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