Expressão gênica através de ensaios com PCR Quantitativo em Tempo Real Fernando Colbari do...
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Expressão gênica através de ensaios com Expressão gênica através de ensaios com PCR Quantitativo em Tempo RealPCR Quantitativo em Tempo Real
Fernando Colbari do Amaral
Expressão
Expressão gênica
Estudos de Expressão GênicaEstudos de Expressão Gênica
Comparação de diferentes sistemas gênicosCélula normal vs tumor
Comparação da expressão gênica em diferentes tecidos
Função gênica específica
Comparação da expressão gênica em diferentes populações (cultura de células)(cultura de células)
Controle vs tratado
IsolamentoIsolamento
Extração de RNA total
mRNA´smRNA´s
Genes diferentes
Quantificação da expressão gênicaQuantificação da expressão gênica
Reação em Cadeia da Polimerase
RT-PCR semi-quantitativa
PCR em Tempo Real
Métodos de quantificação da Métodos de quantificação da expressão gênicaexpressão gênica
Primers/Sondas3´5´
DNA dupla fita
5´3´
dNTP
Taq DNA Polimerase
PCRPCR
Síntese de cDNASíntese de cDNA
5´ 3´
3´ 5´
5´ 3´
3´ 5´
5´ 3´
3´ 5´
Desnaturação
Anelamento
Extensão
PCR – 1° cicloPCR – 1° ciclo
AmplificaçãoAmplificação
Diluição seriada do cDNA
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 etc...
RT-PCR semi-quantitativaRT-PCR semi-quantitativa
cDNA em concentrações decrescentescDNA em concentrações decrescentes
1:8 1:16 1:32 1:64 1:1281:8 1:16 1:32 1:64 1:128
Amplificação na maior diluição corresponde a umamaior quantidade de cópias do gene na amostra
1:8 1:16 1:32 1:64 1:1281:8 1:16 1:32 1:64 1:128
PCR-quantitativoPCR-quantitativo
Método usado para medir a quantidade inicialinicial de ácidos nucléicos (DNA-RNA) que será amplificada por PCR – Sistema FluorescenteSistema Fluorescente
Validação da expressão gênica globalValidação da expressão gênica global
Microarray
SAGE
PCR-quantitativo - EficiênciaPCR-quantitativo - Eficiência
Preparo da reação (pipetas calibradas)
Qualidade do template (molde)
Desenho dos primers (dimers)
Condições de termociclagem
Concentração dos reagentes (MgCl2)
Tamanho do amplicon (50-150 bp)
CaracterísticasCaracterísticas
Fonte de excitação: Lâmpada de Tungstênio
“Sistema aberto” que permite uso de outros fluoróforos, desde que tenham compatível com os filtros disponíveis
Metodologia de aquecimento e resfriamento de bloco (desnaturação, anelamento e extensão)
Filtros
Sistema de detecçãoSistema de detecção
SYBRSYBR®® Green Green
Intercalante de DNA dupla fita
Fluoróforo em suspensão
Inespecífico
Curva de dissociação ou melting
Não permite multiplex
Curva de dissociação Curva de dissociação
• Obrigatória a realização quando utilizar o SYBR® Green – Inespecífico• Permite verificar se há um ou mais produtos de PCR presentes em cada reação• Realizada ao término da termociclagem
Sistema TaqManSistema TaqMan®®
Baseia-se na atividade 5’- 3’ exonuclease
Trabalha com sondas que contém fluoróforos
Específico
Permite Multiplex
Não necessita curva de dissociação
Sonda:
Quencher e Reporter na mesma molécula: transferência de energia
R Q5’ 3’
R Q5’ 3’
R
Q
Q
Q
R
R
Características da sondaCaracterísticas da sonda
Localiza-se de 1 a 5 pb do primer
Tm deve ser ~10°C maior Tm dos primers
A primeira base não pode ser G (Quencher)
Não pode ter mais G do que C e não deve ter 4 bases consecutivas iguais
Pode ter Quencher fluorescente (TAMRA) ou não fluorescente (Minor Groove Binder)
Condições de AmplificaçãoCondições de Amplificação
Condições Universais para desenho dos oligos:- Amplicon de 50 a 100 pb- Conteúdo de GC- Primers com Tm= 60°C e Sonda com Tm= 70°C
Condições Universais de Termociclagem:
Anelamentoe
Extensão
Desnaturação
Ativação da AmpliTaq GoldUracil-N-Glicosilase
TerminologiaTerminologia
Fase onde a intensidade de sinal de produtoamplificado ainda não ultrapassa a intensidadeda fluorescência encontrada no meio.
Baseline
TerminologiaTerminologia
ThresholdNível de fluorescência onde a reação édetectada durante a fase exponencial; linha decomparação entre as amostras
TerminologiaTerminologia
Cycle Threshold (CT)Ciclo (ponto no tempo) onde a reação cruzao limiar de detecção (Threshold)
TerminologiaTerminologia
Rn
Sinal do Reporter dividido pelo sinal de referência passiva(sinal do ROX). Normalização empregada para corrigirerros de pipetagem
Tipos de QuantificaçãoTipos de Quantificação
Expressão variável em diferentes tecidos ou diferentes fases do desenvolvimento
Músculo Pele Neurônio
+ + + + +
+ + +
+ + + +
Tipos de quantificaçãoTipos de quantificação
Quantificação AbsolutaDeterminação do número exato de moléculas.
Obtêm-se valores numéricos com alguma unidade, como número de cópias ou nanogramas de DNA.
Quantificação RelativaAnálise comparativa do ácido nucléico alvo com o do controle interno ou do calibrador
São comparados os Cts de cada amostra e os resultados representam ordensde grandeza (p.e: 5x mais ou menos expressão de um determinado gene).
Controle endógenoControle endógeno
Expressão constitutiva (GAPDH, β-actina, 18S)
Corrigir variações de eficiência da transcrição reversa
Corrigir a presença de inibidores
Corrigir diferenças na quantificação de RNA
Corrigir degradação de material (RNA)
Normalização dos resultados
Controle Endógeno ideal
Um bom normalizador é aquele cuja expressão gênica não tenha variação entre os tecidos submetidos a análise
Expressão em A = Expressão em B
Expressão no Tratado
Expressão no Controle= ~1
Quantificação absolutaQuantificação absoluta
Necessita de uma curva padrão
Quantificação absolutaQuantificação absoluta
Cálculos com curva Standard
C-myc GAPDH C-mycN C-mycN
Tissue ng Total RNA ng Total RNA Normalização
GAPDH
Relação cérebro
Cérebro 0.039 ± 0.004 0.54 ± 0.034 0.07 ± 0.008 1.0 ± 0.12
Rim 0.41 ± 0.016 1.02 ± 0.052 0.40 ± 0.025 5.5 ± 0.35
Fígado 0.70 ± 0.036 0.28 ± 0.013 2.49 ± 0.173 34.2 ± 2.37
Pulmão 0.93 ± 0.044 0.81 ± 0.041 1.15 ± 0.079 15.7 ± 1.09
C-mycGAPDH C-mycN
_______________________________________________
C-myc Calibrador
Quantificação relativaQuantificação relativa
Cálculos sem curva StandardC-myc GAPDH Ct Ct 2^-Ct
Tissue Average Ct Average Ct C-myc-GAPDH
Ct-Ct Brain
Rel. to Brain
Cérebro 30.49 ± 0.15 23.63 ± 0.09 6.86 ± 0.17 0.00 ± 0.17 1.0 ± 0.11
Rim 27.03 ± 0.06 22.66 ± 0.08 4.37 ± 0.10 -2.50 ± 0.10 5.6 ± 0.32
Fígado 26.25 ± 0.07 24.60 ± 0.07 1.65 ± 0.10 -5.21 ± 0.10 37.0 ± 2.52
Pulmão 25.83 ± 0.07 23.01 ± 0.07 2.81 ± 0.10 -4.05 ± 0.10 16.5 ± 1.10
Ct= Ct (alvo)- Ct (controle endógeno)
Ct= Ct (sample)- Ct (calibrador)
Quantidade Relativa = 2 -Ct
Ensaios customizadosEnsaios customizados
Primers e sondas no mesmo tubo. Elimina o passo de balancear as concentrações.
Foco em resultados: elimina tarefas manuais de desenho de primers/sondas
Elimina a necessidade de testar e otimizar ensaios no laboratório
Já vem nas condições universais de construção de primers e termociclagem
Custom TaqMan® Gene Expression
- Pesquisador envia a sequência e a empresa padroniza o ensaio, dispensando todas as validações o gasto de tempo e reagentes com padronizações.
TaqMan® Gene Expression Assays
- Kit pronto disponível (genes conhecidos)
TaqMan® Endogenous Control
- Kit pronto disponível
Considerações finaisConsiderações finais
Custo-benefício
Conhecimentos específicos
Validação de resultados
Interpretação estatística