EXTRAÇÃO E ANÁLISE DE RNA

Ma. Lorena SerenoAntonio Figueira

2008

INTRODUÇÃO

• RNA = ácido ribonucléico: Polímero de Ribonucleosídeos fosfatados

•Açúcar = Ribose

•Bases nitrogenadas:•Adenina, Guanina, Citosina, Uracila

• Timina, Pseudouridina, Citosina/Guanina metiladas

• Tipos variáveis• Funções celulares diversas

• Tipos variáveis• Funções celulares diversas

TIPOS / FUNÇÕES do RNA

• “Populares”• RNA mensageiro (mRNA) = cópia temporária de genes para síntese de proteínas• RNA de transferência (tRNA) = adaptador para decodificação do código genético• RNA ribossômico (rRNA) = catálise da síntese de proteínas

•Atividade transcricional do genoma humano

•Funções = regulação e catálise de ácidos nucléicos (auto-processamento)

Hipótese do início da vida (“RNA world”)Único polímero biológico capaz de realizar catálise (~proteína) e

armazenar informação (~DNA)

Hipótese do início da vida (“RNA world”)Único polímero biológico capaz de realizar catálise (~proteína) e

armazenar informação (~DNA)

Genomic loci

mRNA, transp, virus, heterocromatin

ESTRUTURA dos RNAs• Difração de Raios X• Ressonância Magnética Nuclear• Modelagem Teórica Computacional (base experimental)

• SEQUENCIAMENTO• Probabilidade de dobramento• Pareamento de bases• Viabilidade energética

ESTRUTURA - FUNÇÃO

Estrutura dos RNAs

• Exemplos (3D):

mRNA viral associado a proteína

mRNA viral indutor de tumor

Estrutura dos RNAs

• Exemplos:

tRNA – Phe de levedura rRNA 5S

Estrutura dos RNAs

• Exemplos:

RNA dupla hélice snRNA Okazaki

Extração de RNA: Teoria da Prática • Células Procarióticas/Eucarióticas

• complexidade química• integridade das moléculas de RNA (instável ex vivo)

• Objetivos • separar os ácidos nucléicos dos demais componentes celulares• separar RNA do DNA contaminante (pureza)• manter a integridade molecular do RNA (informação)

• Tecidos Vegetais• polissacarídeos• compostos fenólicos e oxidativos• nucleases (RNAses) todos os organismos!

Extração de RNA - MétodosLise Celular

Separação dos Componentes

Celulares

Precipitação de RNA

Lavagem de RNA

Ressuspensão

SDS, CTAB, Trizol, Tris, EDTA, PVP, Mercaptoetanol,

Guanidina-tiocianato

TRIZOL, Fenol, Guanidina tiocianato, Clorofórmio,

Álcool Isoamílico

Isopropanol , Etanol, LiCl

Etanol 75%

ddH2O-DEPC

DEPC

Preparo de material livre de RNAse

• Luvas de látex descartáveis

• Materiais plásticos descartáveis (tubos e ponteiras)• Pipetadores automáticos exclusivos

Cadinhos e pistilos :

• solução de 0,01 % SDS (p/v),

• água destilada, água ultrapura (milliQ)

• incubados com água 0,01% de dietilpirocarbonato (DEPC)

ativo (2h)

• autoclavados (120C) /20 min - estufa (80C)•Soluções de trabalho: preparadas com água 0,01% DEPC autoclavada. • Cubas de eletroforese e pentes: lavar com 0,01% SDS e enxaguar água livre de RNAse (água DEPC)• Vidraria idem - autoclave•Alternativa/: 150ºC por 4 h ou Peróxido de hidrogênio 3%-15 min ou 10 min. 0,5 M NaOH

Extração de RNA - Análise

• Integridade

• Eletroforese em gel de agarose 1,0-1,4 % (2-3

V/cm)

• Gel desnaturante (pre trat RNA) / não-

desnaturante

• Bandas de rRNA visíveis e com intensidade

proporcional (brometo de etídeo ou SYBR green)

• “smear” de mRNA (?)

28S

18S

5S

• Rendimento e Pureza (métodos)•massa de RNA / massa da amostra

• Quantificação: leitura da absorbância a 260 nm (espectrofotômetro)

1,0 unidade A260 ssRNA = 40 g/ml

• A260 /A280 ~ 1,8 (sem contaminação por proteínas e

fenóis)

•A280 = proteínas; A260 =DNA

• A230 = polissacarídeos; contaminantes orgánicos

• A320 = background (impurezas) ... Prática!

• Bandas ribossômicas: 28S:18S = 2,0• 0,5-2µg e pouco sensíveis degradação•RIN

A260 /A280 = A260 /A230 > 1,8

BMC Molecular Biology 2006, 7:3 doi:10.1186/1471-2199-7-3

Eletroforese capilarAgilent 2100 bioanalyzer

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

www.agilent.com/chem/labonachip

Publication Nº 5989-1165EN, 2004

Agilent 2100 bioanalyzer

200pg

Ratio: 2,0 Ratio: 1,0

Eletroforese capilarAgilent 2100 bioanalyzer

Ratio: 1,5DNA contamination

www.agilent.com/chem/labonachip

Publication Nº 5989-1165EN, 2004

RNA Integrity Number (RIN)Considera o Resultado do eletroferograma completo e não só a relação 28S:18S

www.agilent.com/chem/labonachip

Publication Nº 5989-1165EN, 2004

RNA Integrity Number (RIN)

• Picos anômalos

• Críticos ou não

• Aumentar Threshold

www.agilent.com/chem/labonachip

Publication Nº 5989-1165EN, 2004

RNA Integrity Number (RIN)

www.agilent.com/chem/labonachip

Publication Nº 5989-1165EN, 2004

RNA Integrity Number (RIN)

Amostras idênticas

RNA Integrity Number (RIN)

Aplicações com RNA • Expressão Gênica• Transcriptoma• Estratégias• Northern Blot

• Macroarray• Microarray• Subtração• ESTs

• RT-PCR semi- quantitative• RT-qPCR•cDNA-AFLP• SAGE• etc.

RT: Reverse Transcriptase

3

5 PCR

RNAse HTTTTTTTT4

AA

AcDNA

2 • Enzima Transcritase Reversa• dNTPs• Primer

• Cl2Mg• Inibidor de ribonuclease,

• anelamento: 25 ºC-5 min• extensão : 42ºC – 60 min• inativação: 70ºC – 15 min

mRNA1 < 1 ng

MT I 5’UTR MT I 3’UTR MT II 5’UTR

M 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 M

MT I 5’– 3’UTR GAPDHMT III 5’UTR

M 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 M B

123246

984

pb

123246

984

pb

GANGGGNNNGNNCCNNNNCCTTTGAAANCCTTTANGCTGGTACGCCTGCAGGTACCGGTCCGGAATTCCCGGGTCGACCCACGCGTCCGCGAAGACGACTTTGTAAGACGCCCTTTGGTAGATATTTGTTCTTGAGCTTCTTCGTTCTTGCACCACAAAACAAGCAGGATGTCTTGCAGCTGCGGATCAAGCTGCAACTGCGGCTCAAGCTGCAAGTGCGGCAAGAAGTACCCTGACCTGGAGGAGAAGAGCACCGCCGCGCAGGCCACCGTCGTCCTGGGCGTCGCCCCGGAGAAGACAGCTGCTGCCGAGTTCGAGGCCGCGGCGGAGTCCGGCGAGACCTCCCACGGCTGCAGCTGCGGTGACAGCTGCAAGTGCAACCCCTGCAACTGATGATCGACCGACCATGGGGAACGAAGACCGATGATATGCATGCTGCTGCTTATTGATGATATCGATCTTGTGCCGGCGACGTACGGTACTAGCTACATCTGCTTTACAATTGTGTCGTGTGTGACGTATGTAACTGGTGGTTGAACAATAAGGACGAGCTAGCCATCGTGTTTTTATTATATATGTACATCGATCTGCTGGCTCGCCAGCATGCATATGCGGTCACTCTCTGCCCTTGTACGTTGTGTCGTGTGANGTTTAATTTGCTANCACTCTGGTTGGCCTTGGCGTTCAGTACGTCTTGTGCTCATGCATGTTTGTGGGG

CA287650

www.jyi.org/.../issue1/articles/bakllamaja.html

RT-PCR: Reverse Transcriptase - Polimerase Chain ReactionAmidohydrolase gene

(sILR1) Arabidopsis

suecica

(ILR1) Arabidopsis

thaliana

SEMI QUANTITATIVA

Northern blot 5-10µg

1

2

3

Otimização no Carregamento do Gel

Gel não desnaturante

0 5 10 50 100Doses de Pi ( M)

SCEQRT1028B07.gSCEQRT1028B07.g

0 5 10 50 100 250Doses de Pi (M)

SCEPRZ3089D05.gSCEPRZ3089D05.g

A

B

A

B

Cana-de-açúcarrRNA

Northern blot Transportador de Fosfato

28S

18S

5S

Northern blot: Metalotioneína II

MT II /5.8 S

11 days

33 days

MT II

5.8 S

0 100 250 500 0 100 250 500

Cd (M)

Sereno et al., 2007

Obrigada pela Atenção