EXTRAÇÃO, SEPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO ENZIMÁTICA Grad/EQB483_aula9.pdf · EQB4383 –Enzimologia...
Transcript of EXTRAÇÃO, SEPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO ENZIMÁTICA Grad/EQB483_aula9.pdf · EQB4383 –Enzimologia...
__________________________________________
EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
__________________________________________
_
EQB4383 – Enzimologia Industrial
M.A.Z. Coelho
EXTRAÇÃO, SEPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO ENZIMÁTICA
__________________________________________
EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
Etapas de Extração, Separação e Purificação Enzimáticas
remoção de material insolúvel
separação dos produtos
purificação e polimento (geralmente associado a cristalização)
Remoção de material insolúvel, separação do sólido e líquido - a filtração e a centrifugação
Separação de produtos - a adsorção e a extração por solvente.
A obtenção de enzimas intracelulares a partir de microrganismos necessita de técnicas de lise celular, que abrangem métodos físicos, químicos e enzimáticos.
__________________________________________
EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
Métodos enzimáticos: baseiam-se na digestão da parede microbiana catalisada por enzimas, tais como: lisozima (bactérias), glucanase, tripsina e protease (leveduras). -pouco aplicados em escala industrial em função dos altos custos das preparações enzimáticas e das enzimas terem que ser removidas depois.
Métodos químicos: tratamento com bases (NaOH): tem aplicações limitadas -valores elevados de
pH; choque osmótico: variação da concentração de soluto presente no tampão -
não pode ser usado em bactérias Gram positivas, pois estas tem elevada pressão osmótica interna;
tratamento com detergentes: laurilsulfato de sódio, triton, - dissolvendo membrana .
tratamento com solventes orgânicos: álcool isopropílico, etanol.
Métodos mecânicos Congelamento / descongelamento: formação de cristais de gelo
intracelulares, enzimas susceptíveis ao congelamento podem ser inativadas; moagem com abrasivos: é feita em moinhos vibratórios com esferas de vidro,
necessitando de sistema de resfriamento para absorver o calor gerado no processo;
cisalhamento líquido sob alta pressão: passagem por pequenos orifícios sob alta pressão - múltiplas etapas e com cuidados para não elevar a temperatura;
sonificação: realizado em aparelhos de ultrassom é muito empregada em laboratório.
__________________________________________
EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
Concentração
Tamanho, carga, hidrofobicidade, solubilidade e atividade biológica são as principais características proteicas utilizadas na etapa de purificação das proteínas.
__________________________________________
EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
• Precipitação Isoelétrica:
Solubilidade das proteínas em relação
ao pH
__________________________________________
EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
- Precipitação com sais inorgânicos (Salting-out) -
__________________________________________
EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
A concentração ótima de sal requerida para precipitação deve ser determinada
experimentalmente e geralmente varia entre 20 e 80% da saturação
0
2
4
6
8
10
12
14
25-40 40-55 55-70 70-85 85-95
% Saturação
% P
rote
ína P
recip
itad
a
Distribuição típica das proteínas
frente a precipitação com
(NH4)2SO4
__________________________________________
EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
Precipitação com solventes orgânicos
Precipitação com polímeros
__________________________________________
EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
UltrafiltraçãoUma membrana semi-permeável permite a separação das
moléculas de solvente das moléculas enzimáticas grandes porque apenas as moléculas pequenas podem penetrar na membrana quando a pressão osmótica é
excedida.
As principais vantagens da ultrafiltração como etapa de concentração são:
utiliza baixas pressões hidrostáticas;não ocorre mudança de fase;não utiliza reagentes químicos;mantém força iônica e pH da solução concentrada;evita desnaturação e inativação das enzimas.
As dificuldades advém da concentração por polarização , formação de camadas de géis na membrana ou por fouling (deposição) na membrana.
__________________________________________
EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
Liofilização
Resulta na concentração dos sais presentes na solução inicial, obtida a enzima na forma ativa em forma de
pó, esta é muito mais estável do que em solução aquosa.
O uso de tampão fosfato não é recomendado e aplicação de aditivos como lactose, trealose e manitol (1-5%) é
de grande utilidade.
__________________________________________
EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
ETAPA DE PURIFICAÇÃO
Cromatografia de Gel-filtração
Também conhecida como permeação em gel, exclusão por tamanho ou peneira molecular. Este é um
método utilizado para o fracionamento e purificação de proteínas sendo, também, aplicável à
determinação de seus pesos moleculares.
O processo de gel-filtração pode ser definido como a partição difusional das moléculas de soluto entre a
fase móvel, constituída pelo solvente, e a fase estacionária formada pelos poros do gel.
__________________________________________
EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
Troca-iônica
__________________________________________
EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
Cromatoenfoque
__________________________________________
EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
Adsorção
Na adsorção, os componentes da amostra serão retidos ou não sobre a superfície da fase estacionária que é constituída por substâncias que apresentam campos de forças não neutralizados ou valências livres, permitindo a atração e a retenção das partículas sobre sua superfície por forças do tipo Van der Waals, ligações hidrogênio ou interações eletrostáticas.
Afinidade
__________________________________________
EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
Interação hidrofóbica
__________________________________________
EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
EletroforeseBaseia-se na existência de grupos ionizáveis nas moléculas biológicas (proteínas,
ácidos nucleicos, peptídeos, aminoácidos, etc.) e, portanto, quando em solução podem existir como espécies eletricamente carregadas – separação pela
mobilidade das proteínas ocasionada por um campo elétrico.
A eletroforese em papel é o meio mais simples e mais usado na separação de uma vasta gama de produtos carregados. Em alguns casos, não se obtém uma boa separação.
Na eletroforese em gel, o uso de géis, como amido, agarose e poliacrilamida, como meio de suporte permitiu um aumento na resolução das amostras. A relevação do gel de proteína
pode ser feito empregando-se substâncias específicas como Comassie Brilliant Blue, Bromofenol – ZnSO4 – ácido acético ou Nitrato de prata.
__________________________________________
EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
Custos associados a purificação da enzima
__________________________________________
EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
ETAPA DE FORMULAÇÃO
- As preparações enzimáticas podem ser comercializadas sob a forma sólida ou líquida, sendo para isso necessário que esta permaneça totalmente ativa pelo tempo em que esteja estocada e transportada.
- Os estabilizantes tem como exemplos NaCl, (NH4)2SO4, albumina, scarose, glicerol, PVA (polivinilalcool), PVP (polivinilpirrolidona), PEG (polietilenoglicol) e CMC (carboximetilcelulose).
- O preparado enzimático sob a forma sólida é obtido por secagem a vácuo ou por atomização (spray-dryer).