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FABIANA DE SOUZA GOUVEIA ANÁLISE DA ESTRUTURA E MAPEAMENTO DE SÍTIOS DE DNA BENT EM PROMOTORES DE GENES DE SECREÇÃO EM INSETOS MARINGÁ PARANÁ - BRASIL DEZEMBRO - 2006
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FABIANA DE SOUZA GOUVEIA
ANÁLISE DA ESTRUTURA E MAPEAMENTO DE SÍTIOS DE DNA BENT EM PROMOTORES DE GENES
DE SECREÇÃO EM INSETOS
MARINGÁ PARANÁ - BRASIL DEZEMBRO - 2006
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FABIANA DE SOUZA GOUVEIA
ANÁLISE DA ESTRUTURA E MAPEAMENTO DE SÍTIOS DE DNA BENT EM PROMOTORES DE GENES
DE SECREÇÃO EM INSETOS
Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Maringá, como parte das exigências do Programa de Pós-graduação em Genética e Melhoramento, para obtenção do título de Mestre.
MARINGÁ PARANÁ - BRASIL DEZEMBRO - 2006
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
(Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)
Gouveia, Fabiana de Souza
G719 Análise da estrutura e mapeamento de sítios de DNA
bent em promotores de genes de secreção em insetos /
Fabiana de Souza Gouveia. -- Maringá : [s.n.], 2006.
46 f. : il. color., figs.
Orientador : Profª. Drª. Maria Aparecida
Fernandez.
Co-Orientador : Profª. Drª. Claudete Aparecida
Mangolim e Profª. Drª. Maria Claudia Colla Ruvolo-
Takasusuki.
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de
Maringá. Programa de Pós-Graduação em Genética e
Melhoramento, 2006.
1. Biologia molecular. 2. DNA - Estrutura. 3.
Sítios de DNA bent. 4. Estrutura de promotores
eucarióticos. 5. Rhynchosciara americana. 6. Gene
C3-22. I. Universidade Estadual de Maringá. Programa
de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento. II.
Título.
CDD 21.ed. 572.8633
sec-pgm
Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte (A autora)
iii
Dedico este trabalho aos meus pais
Maria Aparecida e Carlos José, de quem
recebi incentivo e amor incondicional.
iv
AGRADECIMENTOS
A Deus
Ao Programa de Pós-graduação em Genética e Melhoramento da
Universidade Estadual de Maringá pela oportunidade da realização deste
trabalho.
À minha orientadora, Profa. Dra. Maria Aparecida Fernandez pelo carinho,
pela paciência, compreensão, orientação e confiança na minha capacidade para
realizar este trabalho.
Aos Professores que contribuíram para a realização da minha
dissertação.
Aos Professores da Pós-graduação em Genética e Melhoramento, com
alguns dos quais, por meio das disciplinas cursadas, aprendi muito.
Aos Professores e funcionários do Departamento de Biologia Celular e
Genética que contribuíram para concretização e êxito deste trabalho.
Ao Secretário do Programa de Pós-graduação em Genética e
Melhoramento, Francisco, pela ajuda e trabalho indispensáveis.
Aos amigos Adriana Fiorini, Daniela Zanatta, Fabrícia Gimenes, Juliana
Bravo, Karen Takeda e Valério Balani, pela ajuda inestimável na preparação
desta dissertação.
Ao João Paulo, pela paciência, companheirismo e compreensão.
Em especial à minha mãe, Maria Aparecida, ao Carlos Gouveia e à minha
avó Luíza, pelo carinho, apoio e incentivo.
Ao pessoal do Laboratório de Organização Funcional do Núcleo.
A todas as pessoas que fazem parte da minha vida e, que participaram,
mesmo que indiretamente, para que eu alcançasse meu objetivo.
v
BIOGRAFIA
Fabiana de Souza Gouveia nasceu em 30 de julho de 1981, na cidade de
Maringá, Estado do Paraná.
Formou-se em Ciências Biológicas - habilitação em licenciatura e
bacharelado, pela Universidade Estadual de Maringá em julho de 2003.
Em março de 2005, matriculou-se no Programa de Pós-graduação em
Genética e Melhoramento, em nível de Mestrado, na Universidade Estadual de
Maringá.
No dia 14 de dezembro de 2006, submeteu-se à banca para defesa da
Dissertação.
vi
ÍNDICE
RESUMO vii
ABSTRACT ix
1. INTRODUÇÃO 01
1.1. Objetivos 07
2. REVISÃO DE LITERATURA 08
2.1. Amplificação gênica em insetos 08
2.2. Estruturas alternativas de DNA 10
2.3. Detecção de DNA bent 13
3. MATERIAIS E MÉTODOS 17
3.1. Fragmentos de DNA 17
3.2. Amplificação por PCR 18
3.3. Clonagem do produto de PCR 18
3.4. Análise eletroforética 18
3.5. Análise computacional da curvatura 20
3.6. Reação de seqüenciamento 20
3.7. Seqüenciamento e análise computacional 21
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 22
4.1. O gene C3-22 de Rhynchosciara americana é flanqueado por sítios
de DNA bent intrínsecos 22
4.2. Promotores de genes de secreção em insetos apresentam parâmetros
helicais comuns 29
5. CONCLUSÃO 36
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 37
vii
RESUMO
GOUVEIA, F. de S. M.S. Universidade Estadual de Maringá, dezembro de 2006.
Análise da Estrutura e Mapeamento de Sítios de DNA Bent em Promotores de Genes de Secreção em Insetos. Orientadora: Dra. Maria Aparecida
Fernandez. Professoras Conselheiras: Dra. Claudete Aparecida Mangolim e Dra.
Maria Claudia Colla Ruvolo Takasusuki.
Sciaridae é uma importante família de moscas também conhecidas como
fungus gnat, em sua maioria são pestes de vegetais e fungos. No Brasil, algumas
espécies são mantidas em laboratório e utilizadas para pesquisa, como: Bradysia
hygida, Trichosia pubescens e Rhynchosciara americana. O sciarídeo
Rhynchosciara americana é um importante modelo biológico para estudos de
transcrição e replicação em domínios amplificados. Estudos, na região amplificada
do pufe de DNA C3 da glândula salivar, demonstraram processos de replicação
diferencial e de transcrição no segmento que comporta o gene C3-22. Os objetivos
deste trabalho foram: 1. investigar a presença de sítios de DNA bent intrínsecos em
um segmento de 6132 pares de bases (pb) que contém seqüências à montante e à
jusante do gene C3-22; 2. comparar sítios de DNA bent na região promotora dos
genes de proteínas de secreção: C3-22 e B2 de Rhynchosciara americana; BhC4-1 e
BhB10 de Bradysia hygida; Sgs3 e Sgs5 de Drosophila melanogaster; TpC4 de
Trichosia pubescens; II9-2 de Sciara coprophila e Fib-H de Bombyx mori. O fator
principal da curvatura intrínseca é a presença de trechos de dA/dT, repetidos de 2 a
6 pb, em uma volta da hélice de DNA, ou intervalos múltiplos de 10 pb. Embora a
função desta estrutura não esteja completamente esclarecida, é discutido se a
curvatura intrínseca é necessária para regular a transcrição. Utilizando os programas
computacionais Map15a e 3D15m1, foram calculados parâmetros helicais, ângulos
Roll, ENDS ratio, Twist e Direction e foram obtidas projeções 2D de seqüências de
viii
aproximadamente 600 bp que contém promotores de genes. Os resultados indicaram
a presença de sítios de DNA bent na região promotora (b-3
, b-2
e b-1
) e à jusante (b+1
)
do gene C3-22 de R. americana. Esses sítios apresentaram parâmetros helicais que
confirmaram segmentos curvos e com superenrolamento negativo. A análise de
nove promotores de genes de insetos que produzem proteínas de secreção
demonstrou que essas regiões têm estruturas e parâmetros helicais similares,
indicando que a curvatura intrínseca, dependente da seqüência, pode ser uma
característica conservada de seqüências TATA-box nesses organismos.
Palavras-chave: estrutura de promotores eucarióticos; Rhynchosciara americana;
gene C3-22; sítios de DNA bent.
ix
ABSTRACT
GOUVEIA, F. de S. M.Sc. Universidade Estadual de Maringá, december 2006.
Structural Analysis and Bent DNA Sites Mapping on Promoters from Insect Secretion Genes. Adviser: Dr. Maria Aparecida Fernandez. Co-Advisers: Dr.
Claudete Aparecida Mangolim and Dr. Maria Claudia Colla Ruvolo Takasusuki.
Sciaridae is an important family of flies also knows as fungus gnat, that
mostly are pests of vegetables and fungus. In Brazil, some species are maintained in
laboratories and used for research as, Bradysia hygida, Trichosia pubescens and
Rhynchosciara americana. The sciarid Rhynchosciara americana is an important
biological model for studies of transcription and replication within an amplified
domain. Studies on the salivary gland C3 DNA puff amplified region showed
process of differential replication and of transcription in the C3-22 gene segment.
The aim of this work were: 1. to investigate intrinsic bent DNA sites in a 6132 base
pair (bp), that contains the C3-22 gene and upstream and downstream sequences; 2.
to compare bent DNA sites in the promoter region of the secreted genes:
Rhynchosciara Americana C3-22 and B2; Bradysia hygida BhC4-1 and BhB10;
Drosophila melanogaster Sgs3 and Sgs5; Trichosia pubescens TpC4; Sciara
coprophila II9-2 and Bombyx mori Fib-H. The main factor of intrinsic curvature is
the presence of dA/dT tracts, repeated from 2 to 6 bp, in a helical turn phase DNA
with or multiple intervals of 10 bp. Although the function of this structure is not
completely known, is discussible if the intrinsic curvature is necessary to regulate
the transcription. Using Map15a and 3D15m1 software were calculated the helical
parameters: Roll angle, ENDS ratio, Twist and Direction and were obtained 2D
projections from sequences with approximately 600 bp that contains the gene
promoter. The results indicated bent DNA sites in the region promoter (b-3
, b-2
e b-1
)
and downstream (b+1
) of the R. americana C3-22 gene. These sites showed helical
parameters that confirms curved and negative supercoil segments. The analysis of
x
nine more insects genes promoters that produces secreted proteins, demonstrated
that these regions have similar structures and helical parameters, indicating that the
intrinsic curvature, sequence dependent, may be a conserved characteristic of
TATA-box regions in insects secretion protein genes.
Key-words: eukaryotic promoters structures; Rhynchosciara americana; C3-22
gene; bent DNA sites.
1
1. INTRODUÇÃO
Sciaridae é uma família mosca bastante numerosa, geralmente conhecida
como moscas de fungo ou fungus gnats. São ainda pouco estudadas dentro dos
dípteros, provavelmente em virtude do pequeno tamanho desses insetos e da
dificuldade na identificação específica, pois apresentam grande homogeneidade
superficial. Atualmente, cerca de 100 gêneros são conhecidos com 1.700 espécies
descritas, mas são estimadas aproximadamente 20.000 espécies, principalmente nos
trópicos (Amorim, 1992). Sciarídeos são razoavelmente comuns nos depósitos de
âmbar, e os fósseis mais antigos datam do período Cretáceo (Whalley, 1981).
Os sciarídeos são amplamente distribuídos por todos os continentes. Nos
Estados Unidos, as espécies são geralmente encontradas nos Estados do norte e
ocidentais, sendo que alguns exemplares de Bradysia ssp. foram coletados por toda
a Flórida. Em estufas na área de Apopka, Orange County, foram identificados
sciarídeos, como sendo da espécie Bradysia coprophila (Lintner) e Bradydia
impatiens (Johannsen) (Papavero, 1968). Também, foi identificada a espécie B.
coprophila em Punta Gorda, Charlotte Country, e em Gainesville, Alachua Country.
Novas espécies foram catalogadas na Costa Rica e outras 11 são indicadas em áreas
próximas (Steffan, 1966).
Entre os sciarídeos, o ciclo de vida de apenas algumas espécies foi estudado
com detalhes, principalmente daquelas que são pestes de cogumelos comerciais. Os
adultos de sciarídeos são pequenos, com moscas delicadas, e apresentam duas asas
preto/cinzentas, olhos grandes compostos e antenas filiformes longas e escuras. As
fêmeas são, geralmente, maiores que os machos e seus abdomes são freqüentemente
expandidos por causa do acúmulo de ovos (William, 2006).
Em média, uma fêmea pode colocar 150 a 170 ovos brancos ou amarelados,
minúsculos, de ovas únicas, ou em grupos dentro de casca de árvores (carapaças de
crescimento), em espaços apertados, e nas paredes de casas onde as larvas estão se
2
desenvolvendo, que podem funcionar também como “abrigos” para as moscas
adultas (Agri-Food Bioscience Instituinte).
O desenvolvimento larval é dependente da temperatura, mas geralmente
após 12-25 dias, transformam-se em crisálidas. As larvas dos fungus gnats têm
cápsulas pretas brilhantes e os corpos com coloração variada; o último segmento do
corpo é lobado. Na fase larval, elas têm aproximadamente 1/4 de polegada de
comprimento e na natureza constroem seus casulos com restos de matérias em
decomposição e secreção produzida pela própria larva, que ao secar, assume aspecto
semelhante a uma teia. Quando o adulto emerge do solo no fim do período pupal e
recomeça o ciclo, sendo que muitas gerações se sobrepõem durante todo o ano
(Dreistadt, 2006).
As larvas e os adultos habitam áreas úmidas e sombreadas. Os estádios
imaturos podem ser encontrados sob cascas de árvores caídas, em órgãos de plantas,
em matéria orgânica em decomposição ou, como no caso da espécie Austrosciara
termitophila em ninhos de cupim.
A alimentação dos sciarídeos é composta de fungos, fezes de animais e
tecidos vivos de plantas. Esses insetos podem causar danos economicamente
importantes, pois atacam o tecido saudável de plantas cultivadas como: a batata, o
trigo, o trevo vermelho, a alfafa, as mudas de pinho, e as várias plantas ornamentais,
incluindo os bulbos de tulipas, as samambaias, as begônias, os gerânios, os cactos,
as orquídeas e as dracenas (Hale, 2003). Além disso, são descritos sciarídeos que
atacam plantações de fungos comerciais e que causam danos ao eucalipto, às várias
espécies de solanáceas e às plantações de rosas (Amorim, 1997). As larvas podem
ser pestes importantes em algumas estufas e em depósitos de cogumelo. Além do
fator do incômodo do adulto, as populações larvais podem danificar raízes e entrar
em hastes macias ao nível do solo. Nas estufas, são geralmente mais abundantes no
inverno e primavera, mas o adulto pode estar presente em locais da produção de
cogumelo durante todo o ano (Price, 2006).
Na região de Arujá – SP , no final de 1998, plantas de Lisianthus
apresentaram subdesenvolvimento, amarelecimento de folhas e atraso na floração,
causados por uma alta incidência de adultos de sciarídeos. As raízes dessas plantas
3
apresentavam escurecimento e/ou apodrecimento das radicelas, com elevado
número de larvas, provavelmente intensificado pelas condições favoráveis para o
desenvolvimento desses insetos. Nos cultivos, em vasos de Lisianthus, observou-se
que as larvas se alimentavam das raízes mais externas da planta (Hojo et al., 2000).
Alguns sciarídeos causam problemas nas estufas da Flórida, e em sua
maioria geram injúrias nas plantas: outro problema é o grande número de vôos das
moscas que ocasionam incômodo aos trabalhadores (Raymond, 2003).
Plantas ornamentais de flores como Eustoma grandiflora, Gérbera spp. e
Ciclamen persicum, introduzidas de regiões temperadas para as nossas condições e
cultivadas em vaso, têm demonstrado sensibilidade às condições adversas do
ambiente. Desse modo, o cultivo em ambiente protegido assegura padrão de
qualidade e sincroniza o estágio das plantas para a comercialização em
determinadas épocas do ano. Entretanto, esse microclima também é adequado para
o desenvolvimento de agentes fitopatogênicos e pragas.
Em folhas de plantas do morangueiro cultivado em sacolas plásticas, foram
visualizados sintomas do ataque por fungus gnat, mesmo em ambiente protegido.
Esses sintomas consistiram no aparecimento de folhas com bordas necrosadas o
que, a princípio, indicava a possibilidade de ocorrência de uma doença. Em algumas
dessas plantas ocorria necrose total, conduzindo à morte das mesmas. O
crescimento do número de plantas atacadas por larvas de sciarídeos coincidiu com a
verificação de ocorrência da antracnose do rizoma (Colletotrichum fragariae) e,
também, com sintomas do mofo cinzento (Botrytis cinerea).
Pode-se evidenciar com isso, que as larvas de sciarídeos, além de causar
danos diretos na raiz das mudas, ainda pré-dispõe a planta ao ataque de doenças
uma vez que a mosca adulta atua na disseminação de fungos fitopatogênicos, em
virtude da sua capacidade em levar os esporos desses organismos aderidos ao corpo.
A alimentação larval causa também danos indiretos, criando feridas que permitem a
entrada de patógenos na planta (Gardiner et al., 1990; Jarvis et al., 1993). Larvas e
adultos de fungus gnats podem transmitir doenças a plantas saudáveis, tais como: o
Botrytis, o Pythium, e o Verticillium (Kalb e Millar, 1986; Gardiner et al., 1990;
4
James et al., 1995). Esses insetos têm preferência por ambientes ricos em matéria
orgânica e com elevada umidade (Radin et al., 2006).
Vários pesquisadores observaram que a Bradysia sp. é uma importante
praga nos cultivos em estufa e em viveiros de mudas de plantas com grande
importância econômica como as ornamentais, os citros, o tabaco e outras (Kennedy,
1973), pois, nesses ambientes, as condições de cultivo são favoráveis para o
desenvolvimento do inseto. Suas larvas abrem galerias no mesófilo foliar e nas
cascas das estacas, na casa de vegetação, que reduz a brotação. As larvas se
desenvolvem, atacam o sistema radicular, e podem causar danos severos ao vegetal
em fase de germinação (Tsukushi e Kiplinger, 1968). Em pupunheiras, as larvas
penetram nas plântulas e mudas, atingem a região do palmito e atuam de maneira
semelhante ao Fusarium (Moro, 1996).
No Brasil, segundo Gallo (2002), as lavras aparecem como praga de
cogumelo, sendo conhecidas como “moscas-do-cogumelo”, ocasionam sérios
prejuízos ao se alimentarem das radicelas e tecidos tenros, provocando o secamento.
Embora ainda não se tenham registros de serem praga, a mosca Trichosia
pubescens (Morgante), comum à fauna brasileira, apresenta hábitos de vida
semelhantes aos de Bradysia hygida (Sauaia e Alves, 1968). O ciclo de vida dessa
espécie, em condições laboratoriais, tem duração de aproximadamente 30 dias a
21oC. Sua fase larval consiste de quatro estádios, separados por três mudas. Por
volta do 22o dia, após a eclosão do ovo, ocorre a muda pupal no interior de um
casulo individual, constituído de terra e de secreção produzida pela própria larva.
Quatro dias após a muda pupal, emerge o adulto que tem um período de vida
aproximadamente de dez dias (Morgante, 1969).
O sciarídeo Rhynchosciara americana comum em regiões de Mata
Atlântica, principalmente no litoral paulista, também não é descrito como praga. As
larvas dessa mosca nascem gêmeas e constroem em conjunto um casulo comunal,
com secreção das próprias larvas e materiais em decomposição. Quando em cópula,
a fêmea voa e leva como bagagem o macho (Nonato e Pavan, 1951).
A fauna brasileira apresenta grande diversidade de sciarídeos, e,
atualmente, são descritos cerca de 60 espécies entre Bradysia sp., Trichosia sp., e
5
outros gêneros encontrados no Brasil. Nesse trabalho, será discutido sobre as
espécies Rhynchosciara americana, Bradysia hygida e Trichosia pubescens.
Recentemente, por meio do método de Feulgen foram determinados os
tamanhos dos genomas de alguns sciarídeos: Bradysia hygida (3x108 pb),
Rhynchosciara americana (3,6x108 pb) e Trichosia pubescens (1x10
9 pb) (Saccuti
et al., 2005). Em comparações de seqüências de R. americana com outros
organismos, 29,8% dos Expressed Sequence Tags (ESTs) analisados apresentaram
semelhança com seqüências já depositadas no GenBank. Conforme esperado, o
organismo que apresentou maior similaridade com R. americana foi Drosophila
melanogaster, seguido por Anopheles gambiae. Quando os ESTs foram comparados
com o banco de dados BLASTX, foi identificado um grande número de proteínas
que apresentavam similaridade com seqüências já depositadas. Nessa análise,
Drosophila (34,19%) e Anopheles (32,05%) foram os organismos que apresentaram
maior similaridade com Rhynchosciara americana, sugerindo proximidade
filogenética entre esses organismos (Siviero et al., 2006).
Um grande desafio à manipulação e controle de pestes é a resistência dos
insetos a xenobióticos, que incluem aleloquímicos naturais de plantas e inseticidas
sintéticos. Durante décadas, foi realizado um grande esforço para identificação de
genes associados à resistência a xenobióticos e de mudanças estruturais em suas
funções, em condições de laboratório. Foram identificados como mecanismos de
resistência: alterações genômicas espontâneas conduzindo à amplificação gênica,
indução e ao aumento transcricional e mutações nos genes que codificam esterases,
citocromo P450 e monooxigenases (P450s), e as Glutationas-S-transferases (GSTs)
(Xianchun et al., 2006).
A amplificação gênica, segundo Hoy (1994), pode ser importante
mecanismo de resistência a inseticidas, como observado para Myzus persicae. O
efeito de “choque” dos piretróides tem sido um outro mecanismo importante na
resistência de Drosophila sp. e alguns insetos-praga, porém sua base molecular
ainda não foi bem estabelecida. Entretanto, nos dípteros que apresentaram tal
mecanismo, tem-se verificada a redução de 40% na densidade dos canais de sódio,
6
podendo, esta causa bioquímica, estar envolvida na resistência (Crampton e
Eggleston, 1952).
Mutações também podem resultar em resistência de um inseto a pesticidas.
Após o processo de amplificação gênica, ao invés de existir apenas uma cópia do
gene, várias cópias estão presentes no genoma do inseto, e gerar aumento na
quantidade de produto do gene. Se esse gene codificar uma enzima detoxificante,
então o inseto poderá metabolizar muito mais inseticida. Há mutações que alteram a
regulação da expressão gênica, levando à produção de mais (ou menos) proteína
codificada pelo gene. A alteração estrutural na proteína codificada por um gene é
outro tipo de mutação que pode resultar em resistência.
Por exemplo, a troca de um nucleotídeo, na região codificadora do gene,
pode gerar uma mudança na codificação de um aminoácido, e conseqüentemente,
uma alteração tri-dimensional na proteína, resultando ou não em resistência. Essa
mutação pode levar a uma alteração estrutural no sítio de ação do inseticida,
reduzindo ou bloqueando a habilidade do inseticida em se ligar, ou
aumentando/diminuindo a habilidade da proteína em metabolizar o inseticida. Uma
mudança estrutural não altera a quantidade de produto, mas sim a qualidade do
produto codificado pelo gene. Em última análise, essas mutações estão associadas a
três tipos de mecanismos de resistência: metabólica (citocromo P450
monooxigenases, esterases e S-transferases), insensibilidade do sítio de ação
(acetilcolinesterase, GABA, canal de sódio) e outros como a redução de penetração
do pesticida e mudança comportamental.
Rhynchosciara americana é um importante modelo biológico para estudos
de politênia e amplificação gênica, e como a região amplificada do pufe de DNA C3
de Rhynchosciara americana apresenta processos de replicação diferencial e
transcrição bem descrita (Santelli et al., 1991; Yokosawa et al., 1999; Soares et al.,
2003), o objetivo desse trabalho foi investigar a presença de sítios de DNA bent na
região de 6132 pb a montante e a jusante do gene C3-22.
7
1.1. OBJETIVOS
� identificar a presença de sítios de DNA bent intrínsecos na região promotora
e 3’ do gene C3-22 do pufe de DNA C3 do sciarídeo Rhynchosciara
americana, por meio de análise eletroforética de segmentos dessas regiões;
� comparar a estrutura bidimensional e identificar os possíveis sítios de DNA
bent na região do TATA-box de genes de secreção: B2 e C3-22 de
Rhynchosciara americana, Sgs3 e Sgs5 de Drosophila melanogaster, BhB10
e BhC4-1 de Bradysia higida, TpC4 de Trichosia pubescens, Fib-H de
Bombyx mori e II9-2 de Sciara coprophila.
Os resultados desse trabalho certamente adicionarão dados para o
mapeamento das características estruturais encontradas em regiões promotoras, que
possibilitará o estudo da relação entre estrutura e função nos processos biológicos
das células.
8
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Amplificação gênica em insetos
Em experimentos com Xenopus laevis, foi demonstrado que o processo de
amplificação gênica pode acarretar a síntese adicional de RNAr (Hyrien et al.,
1995). O aumento de cópias gênicas por exposição a drogas específicas proporciona
a sobrevivência de uma determinada célula e/ou organismo pelo aumento de
produtos protéicos responsáveis pela sua manutenção em um ambiente desfavorável
(Kellems, 1993).
A amplificação gênica, que ocorre durante o desenvolvimento e codifica
proteínas, é facilmente verificada pela replicação diferencial de segmentos no
genoma. Os dois domínios, que contêm genes coriônicos de Drosophila
melanogaster, estão localizados nos cromossomos 3 e X, além de serem sítios de
intensa atividade transcricional, e são amplificados durante o final da oogênese
(Spradling et al., 1980; Griffin-Shea et al., 1982). Nesses domínios amplificados
cromossômicos, foi verificado que o amplicom estende-se por cerca de 100 Kb em
ambas as direções das regiões flanqueadoras apresentando gradiente de
amplificação, uma vez que o número de cópias extras de DNA é mais alto na região
gênica que nas extremidades 5’ e 3’ (Spradling, 1981).
Esses dados sugerem que esteja ocorrendo reiniciações de origens de
replicação nesta região amplificada, e essa seria reativada várias vezes, fazendo com
que as múltiplas forquilhas de replicação progridam bi-direcionalmente, resultando
em uma estrutura denominada onion skin. Esse modelo foi confirmado por meio de
experimentos com os mutantes ocelliless (Spradling, 1980), por microscopia
eletrônica em DNA de células foliculares (Osheim e Miller, 1983) e por géis de
eletroforese bi e tri-dimensionais (Claycomb e Orr-Weaver, 2005).
9
Outro sistema de amplificação gênica regulada no desenvolvimento são os
de proteínas cujos genes estão localizados nos pufes de DNA de cromossomos
politênicos de sciarídeos (Gerbi e Urnov, 1996).
Genes amplificados foram descritos para loci específicos localizados nos
pufes de DNA dos cromossomos politênicos das glândulas salivares de sciarídeos,
os quais são considerados sítios de expressão gênica regulada. Análises do padrão
de atividade desses genes mostraram que sua expressão é regulada no
desenvolvimento, acompanhando a formação dos respectivos pufes de DNA
(Santelli et al., 1991; Paçó-Larson et al., 1992; Wu et al., 1993; Monesi et al., 1995;
Fontes et al., 1999).
Pufes de DNA se formam em certos segmentos dos cromossomos
politênicos das glândulas salivares no final do 4o estádio larval e são sítios de
intensa síntese de DNA e RNA, que resultam na produção de elevadas quantidades
de proteínas específicas. Dentre os pufes de DNA observados em células politênicas
de glândulas salivares de sciarídeos, o pufe C3 é um dos maiores observados em
Rhynchosciara americana (Penalva et al., 1997). E em sua região de localização é
codificada uma proteína de secreção salivar, que provavelmente se encontra
envolvida na formação do casulo pupal (Penalva et al., 1997). Resultados
mostraram que a replicação do DNA, nessa região, inicia-se em múltiplos sítios, a
pelo menos 6 Kb a montantedo promotor do gene C3-22 localizado nesse pufe
(Yokasawa et al.,1999). Medidas do número de cópias extras ao longo do amplicom
do pufe C3 mostraram que dentro dessa zona de iniciação da replicação ocorre o
maior grau de amplificação, juntamente com a região de localização do gene C3-22,
reforçando a tese de que esse seria o local de reiniciação da replicação (Yokasawa
et al., 1999). E que, provavelmente, segue o mesmo mecanismo de amplificação
gênica tipo onion skin descrito para os genes coriônicos de Drosophila (Gerbi e
Urnov, 1996) e para o gene BhC4-1 de Bradysia hygida (Monesi et al., 1995).
10
2.2. Estruturas alternativas de DNA
Seqüências de DNA, de relevância regulatória, são capazes de assumir
conformações tridimensionais no núcleo. A formação de estruturas específicas
induzidas por proteínas foi observada em nucleossomos, mas o DNA pode assumir
uma conformação curva sem interação com outras moléculas (Chalberg e Englund,
1980).
Sítios de DNA bent estão envolvidos em uma grande variedade de
processos biológicos e regiões específicas do genoma onde ocorre a interação do
DNA e proteínas, como recombinação gênica (Milot et al., 1992), replicação (Linial
e Shlomai, 1988; Cadle et al., 1990; Altmann e Fanning, 2004; Fiorini et al.,
2006a), transcrição (Wada-Kiyama e Kiyama, 1994; Delabre et al., 1995; Mariley e
Pasero, 1996; Perez-Martin e de Lorenzo, 1997; de Souza e Ornstein, 1998; Nair,
1998; Bash et al., 2001; Fiorini et al., 2001), formação de nucleossomos (Wada-
Kiyama et al., 1999; Virstedt et al., 2004), sítios frágeis (Palin et al., 1998), regiões
de associação à matriz nuclear-MARs (Homberg, 1989; Boulikas, 1993; Fukuda,
1999; Fukuda, 2000; Fiorini et al., 2006b), levando à proposta da importância
funcional da curvatura.
Mutações, breakpoints e recombinações podem estar relacionadas a
estruturas diferenciais de DNA. Análises de 128 breakpoints e deleções de mtDNA
de humanos revelaram que essas alterações, em larga escala, freqüentemente
ocorrem em regiões preferenciais, onde foram observados sítios de DNA bent.
Essas modificações estruturais podem facilitar o reconhecimento pela maquinaria de
recombinação que está envolvida em um grande número de mutações no mtDNA
humano (Hou e Wei, 1996; 1998). DNA bent foi observado em rearranjos
genômicos entre o gene c-myc e os loci gênicos da imunoglobulina de cadeia pesada
(Ohki et al., 1998) e em locais de recombinação. No genoma de ratos, é responsável
pela curvatura na região codificante para a proteína KIN17 (Mazin et al., 1994). As
recombinações cromossômicas, em mamíferos, podem ser fortemente associadas à
presença de DNA bent ou anti-bent, visto que o DNA bent intrínseco foi associado
11
também com a recombinação específica em procariotos e em eucariotos inferiores
(Fiorini et al., 2006a).
Uma forte curvatura na seqüência que compreende 30 pb do início da
transcrição foi identificada por meio da análise computacional da curvatura
dependente da seqüência e do comportamento eletroforético em géis de
poliacrilamida, de uma região promotora do gene AaH1 da toxina do escorpião
Antroctonus australis. Esse resultado evidenciava a proposição de que estruturas de
DNA bent estão associadas com processos transcricionais em células eucarióticas
(Delabre et al., 1995).
Em sciarídeos, foi reportada a presença de sítios bent intrínsecos em
fragmentos de regiões amplificadas do pufe DNA C4 de Bradysia hygida, cujo
segmento inicial de 1847 pb (posição –3697 até –1850) apresentou múltiplos sítios
de bent (Fiorini et al., 2001), cuja região está localizada na zona preferencial de
replicação identificada para o segmento amplificado do pufe C4 de Bradysia
hygida, por análise em géis bidimensionais neutro-alcalino e neutro-neutro (Coelho,
1997). Outra região que apresenta sítio de DNA bent no pufe C4, com início na
posição –957, é colocalizada com o promotor putativo do gene BhC4-1, cujos
resultados sugerem que esses sítios bent devem estar envolvidos com os processos
de replicação diferencial e transcrição desse segmento genômico (Fiorini et al.,
2001).
O principal fator determinante da curvatura intrínseca é a presença de
trechos ricos em adeninas e timinas (A/T trechos) repetidos de 2 a 6 pb,
aproximadamente a cada intervalo de 10 pares de bases, uma volta da hélice de
DNA, ou intervalos múltiplos de 10 pb (Trifonov e Sussman, 1980; Anderson,
1986; Koo et al., 1986; Haran e Crothers, 1989). Uma provável explicação para a
formação dessa curvatura consiste na interação dos pares de bases A/T em
seqüência, permitindo a formação de uma ligação cruzada entre um átomo de
oxigênio da T e um de nitrogênio (N-H) da A na reentrância maior da hélice de
DNA, e também em um pequeno contato entre um átomo de oxigênio da T e um
átomo de carbono da A na reentrância menor. Estas duas ligações cruzadas
12
permitem que os pares de bases AA/TT permaneçam próximos (Calladine e Drew,
2004) e promovam uma curvatura natural da hélice (Figura 01).
Há três modelos principais para explicar o efeito de cada nucleotídeo sobre
a curvatura total do DNA: o modelo junction (Levene e Crothers, 1983), o modelo
wedge (Trifonov e Sussman, 1980) e o mixed sequence model (Young e Beveridge,
1998). O modelo junction é o mais simples e descreve a curvatura global como
resultado de uma deflexão em cada junção entre os eixos do DNA normal (B-DNA)
e o DNA com trechos de poli A/T. Acredita-se que essas deflexões sejam causadas
pelas diferenças nas inclinações dos pares de bases nestas duas formas da hélice
(Bolshoy et al., 1991). O modelo wedge é um modelo mais geral, estabelecendo que
cada nucleotídeo esteja associado com alguma deflexão do eixo do DNA e é
geometricamente independente (Figura 2). O modelo denominado mixed sequence
model propõe que o bent é causado por uma série de pequenos bends entre as bases
adjacentes fora dos trechos de adeninas.
Os três modelos são úteis para predizer a conformação do DNA, embora o
modelo wedge seja o mais aceito (Yamamura et al., 2001). Utilizando-se um
Figura 1. Dois pares de base A/T mostrando uma possível ligação de hidrogênio adicional entre
eles na reentrância maior. A-adenina, T-timina. (Adaptado de Calladine e Drew, 2004).
B
CH3O
N
O
T N
H
N
H
NN H
N
C1
C1
H
H
N
H
CH3O
N
O
TN
H
N
H
NN H
N
C1
C1
H
H
A
AN
13
programa baseado no modelo wedge (Shpigelman et al., 1993), pesquisas
predizeram DNA curvo em muitas regiões cromossômicas (Boulikas, 1994; Schatz
e Langowshi, 1997; Nair, 1998; Rodley et al., 1998; Bechert, 1999; Wada-Kiyama
et al., 1999).
2.3. Detecção de DNA bent
A presença de curvaturas locais em um fragmento de DNA, produzidas pela
presença de trechos de dA repetidas periodicamente, pode contribuir para que as
distâncias entre as extremidades de um fragmento sejam menores que a distância
em pares de bases do fragmento linear. Além disso, sítios de DNA curvo
contribuem para a curvatura macroscópica, cujo comportamento pode ser verificado
por meio de análise eletroforética em gel de poliacrilamida, pois a migração desses
fragmentos é mais lenta que a de uma molécula de DNA linear do mesmo tamanho
molecular (Crothers et al., 1990; Hagerman, 1990; Harrington, 1993). Géis de
poliacrilamida dificultam a passagem de fragmentos com conformações alternativas
(A)
(B)
(A)
(B)
Figura 2. A) Modelo junction. B) Modelo wedge.
14
por seus poros regulares, o que permite a análise do tamanho e da forma dos
fragmentos. A molécula de DNA bent necessita de poros relativamente largos, por
meio dos quais ela migra, comportando-se, durante a eletroforese, como se o seu
tamanho molecular fosse maior (Stellwagen, 2000). Por outro lado, géis de agarose,
que apresentam uma malha irregular, permitem apenas a análise do tamanho dos
fragmentos e não são sensíveis a pequenas diferenças conformacionais de moléculas
de DNA (Holmes e Stellwagen, 1991). O padrão de mobilidade no gel depende
tanto da seqüência do DNA quanto da localização da curvatura no fragmento de
DNA (Figura 3) (Wu e Crothers, 1984).
Se a curvatura estiver localizada no centro, o fragmento de DNA terá uma
distância menor entre suas extremidades, tendo, portanto, maior dificuldade em
passar pelos poros do gel de poliacrilamida, e, conseqüentemente, apresenta
mobilidade eletroforética reduzida. Quando a molécula de DNA apresentar sítios
bent em uma das suas extremidades ou em ambas, terá maior mobilidade, ou seja,
maior do que a normal (Wu e Crothers, 1984). Fragmentos que apresentam sítios de
DNA bent em direções opostas, em que um cancela o outro, característica
denominada de anti-bent, migram normalmente em géis de poliacrilamida.
Outras mudanças conformacionais do DNA como formações cruciformes,
loops e gaps, ou outros elementos de estruturas secundárias, podem resultar na
redução da mobilidade. Sob algumas condições, quando a migração eletroforética é
submetida a altas temperaturas ou quando há a presença de um agente intercalante
do DNA (como, por exemplo, a distamicina ou brometo de etídio), moléculas
curvas podem apresentar mobilidade condizente ao seu tamanho molecular em géis
de poliacrilamida. Sendo assim, é possível distinguir DNA bent de outras alterações
conformacionais do DNA (Diekman e Lilley, 1987).
15
Goodsel e Dickerson (1994) propuseram distinção entre DNA bent e DNA
curvo: DNA bent é a tendência de sucessivos pares de bases tornarem-se não-
paralelos de uma maneira aditiva, ou seja, pequenas curvaturas de aproximadamente
dois ou três pares de bases em seqüência; e DNA curvo representa a tendência do
eixo da hélice em seguir uma via não-linear ao longo de uma apreciável extensão,
cuja curvatura é provocada pelo efeito cumulativo de pequenas deflexões associadas
com cada par de bases de DNA bent com regiões não bent intercaladas (Figura 4).
Figura 3. Esquematização do comportamento eletroforético dos fragmentos de DNA com e
sem curvatura em géis de agarose e poliacrilamida. Os segmentos em vermelho na barra no
topo da figura indicam regiões de DNA bent e os números diferentes sítios de restrição. A
mobilidade poderá ser normal, reduzida ou acelerada, dependendo da posição dos sítios bent,
estrutura do fragmento e do suporte utilizado na eletroforese. EthBR, Brometo de Etídio.
acelerada
Clivagem com enzimas de restrição
enzima 1
enzima 2
Eletroforese sem agentes intercalantes
Agarose
Poliacrilamida
Eletroforese com EthBr
enzima 3+1
normal
Poliacrilamida normal
2 2 1 1 3
a b
b
reduzida
a
normal
normal
normal
normal
normal
Mob
ilid
ade
16
Figura 4. Este diagrama mostra dois fragmentos de DNA. Cada segmento representa cinco
pares de bases ou metade de uma volta da hélice do DNA. A) Regiões bent de cinco pares
de bases em seqüência, mas em direções opostas, produzem curvaturas locais na molécula,
sem ocasionar uma curvatura global; B) Substituição dos segmentos de cinco pares de
bases bent por segmentos não bent induz curvatura da molécula de DNA. (Adaptado de
Goodsell & Dickerson, 1994).
A
B
17
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Fragmentos de DNA
Para a realização desse trabalho, foram utilizados fragmentos de DNA que
contêm o gene C3-22 e regiões flanqueadoras do pufe de DNA C3 de
Rhynchosciara americana, clones pHN2,0; pHN3,5 pHH4,0 e pRR5,5, subclonados
em vetor pBluescript II (Stratagene), gentilmente cedidos por Maria Albertina M.
Soares, Ann J. Stocker e Francisco J. S. Lara, da USP, e o clone pRa400 obtido, a
partir de fragmento de PCR, subclonado em vetor pDrive (Qiagen) (Figura 5).
Figura. 5. Diagrama representando o mapa de restrição do amplicom do pufe C3 de
Rhynchosciara americana contendo a unidade de transcrição do gene do pufe C3 e regiões
flanqueadoras. O sítio de início e a direção da transcrição são indicados pela seta preta, a
barra preta indica a unidade de transcrição. Os fragmentos que foram analisados nesse
trabalho estão representados abaixo do diagrama. H, HindIII; Sc, SacI; E, EcoRI. Os
números acima do sítio de restrição indicam, em pares de bases, a extensão do fragmento
amplificado analisado.
Os plasmídeos recombinantes pHN2,0; pHN3,5 pHH4,0 e pRR5,5 foram
introduzidos em bactérias competentes por meio de transformação por choque
elétrico (Sambrook et al, 2001). Os subclones com os fragmentos selecionados
foram submetidos ao método de preparação de DNA plasmidial por CTAB (Del Sal
et al., 1989) e os plasmídeos isolados foram clivados com enzimas de restrição
apropriadas para a retirada dos fragmentos, de acordo com as instruções do
fabricante.
pRR5,5
pHN 3,5
-9961 H
-7578 Sc
-5093 H
+137 H
-3598 H
+3706 H
-1078 Sc
-4731 E
+1395 E
pRa400 pHN 2,0
pHH 4,0
18
3.2. Amplificação por PCR
Foi utilizado o software FAST_PCR (versão 3.5.30 de Ruslan Kalendar)
para a construção dos primers e foram utilizados os primers
5’CGGTTCGGTTTGTACCG3’ e 5’GTACCATGATCCGACCAGG3’ para
amplificação do fragmento de 400 pb (Figura 5).
A PCR foi realizada segundo as recomendações do fabricante da enzima
Taq Polimerase: tampão 1 X da enzima, 2,5mM de cada dNTPs, 0,6mM de MgCl2,
25mMol de cada primer; 150ng de DNA de 400 pb do clone pHN3,5 e 1U de Taq
DNA polimerase (Invitrogen), em um volume final de 15µl.
A amplificação por PCR foi realizada em termociclador Mastercycler
gradiente (Eppendorf) com 35 ciclos de denaturação inicial a 95oC por 10 minutos,
94oC por 1 min, anelamento a 65
oC por 2 min e extensão a 72
oC por 1 min, com
extensão final de 72ºC por 10 min.
Após a amplificação, os produtos obtidos foram submetidos à eletroforese
em gel de agarose 1% para verificação da qualidade do produto. O gel foi
fotografado em sistema de captura de imagem UVP Biolmaging System e, a banda
de interesse foi purificada e utilizada para clonagem molecular.
3.3. Clonagem do produto de PCR
O fragmento de DNA, derivado do método de PCR, foi subclonado em vetor
pDrive, utilizando o kit de amplificação PCR Cloning kit (Qiagen). O plasmídeo
recombinante pRa400 foi introduzido em bactérias competentes por meio do
método de transformação por choque térmico (Sambrook et al., 2001). Para o
isolamento dos plasmídeos, foi utilizado o método de preparação de DNA
plasmidial CTAB (Del Sal et al., 1989) e após o isolamento, os plasmídeos foram
clivados com enzima de restrição EcoRI para a retirada do fragmento.
3.4. Análise eletroforética
Uma seqüência de DNA bent pode ser identificada comparando-se as
mobilidades eletroforéticas de fragmentos de DNA entre géis de poliacrilamida
19
(Danna e Nathans 1971; Marini et al., 1982). Análises das propriedades
eletroforéticas de fragmentos de DNA linear podem representar um método geral
para o estudo de parâmetros estruturais dependentes da seqüência.
Fragmentos obtidos por clivagem com enzimas de restrição foram analisados
em três sistemas de separação eletroforética: géis de poliacrilamida 6% a 4oC e géis
de poliacrilamida 6% à temperatura ambiente com 1µg/ml de brometo de etídio no
tampão de amostra e de corrida. Tanto a baixa temperatura quanto a matriz do gel
de poliacrilamida contribuem para a alteração na mobilidade de fragmentos curvos.
A curvatura intrínseca pode ser diferenciada de outras estruturas alternativas de
DNA na eletroforese por meio da utilização de drogas que se intercalam ao DNA,
como brometo de etídio. Essa molécula se intercala entre as bases nucleotídicas do
DNA, anulando os sítios de curvaturas. A incorporação de brometo de etídio no gel
de poliacrilamida ocorre pela passagem desse agente intercalante no tampão de
corrida, durante uma pré-corrida overnight. Em todos os sistemas foram utilizados,
como marcadores de tamanho molecular, 1 Kb ladder e 1 Kb ladder plus
(Invitrogen). Em ambos os sistemas, o tampão utilizado foi o TBE 1X (45mM Tris-
borato, 1mM EDTA, pH 8,0). Os géis foram corados com brometo de etídio
1µg/ml, fotografados sobre luz UV e documentados utilizando-se o sistema de
fotodocumentação UVP Biolmaging System. A concentração dos géis, o tempo de
corrida e a voltagem empregada foram ajustados de acordo com o tamanho dos
fragmentos a serem analisados.
Após a corrida eletroforética, foi calculado um valor R para cada
fragmento, com base na análise do padrão de mobilidade nos géis. Este valor foi
obtido por meio da razão dos índices (tamanho molecular real/migrado) em cada
sistema. Valores R entre 0,90 e 1,10 indicam fragmentos com mobilidade de acordo
com seu tamanho molecular, enquanto que valores R > 1,11 indicam redução na
mobilidade, e valores R < 0,90 indicam rápida mobilidade em fragmentos de DNA
com sítios de DNA bent em uma ou ambas as extremidades (Fiorini et al., 2001).
20
3.5. Análise computacional da curvatura
As seqüências dos fragmentos foram analisadas quanto à curvatura ao
utilizar o algoritmo de Eckdahl e Anderson (1987) por meio dos programas
computacionais Map15a e 3D15m1, gentilmente cedidos por Philippe Pasero
(Institute of Molecular Genetics, Montpellier, France) e Monique Marilley
(Universite de la Mediterranee, Faculte de Medecine, Marseille, France). O
programa Map15a permite o cálculo dos parâmetros helicais: ENDS ratio (razão
entre o tamanho total do fragmento e a distância entre suas extremidades em
conformação curva; valores ≥ 1,10 serão considerados como significativos nesse
estudo); variações no ângulo Roll (rotação vertical entre dois pares de bases
consecutivos, ou seja, se ocorrer angulação entre eles e formar um sulco menor mais
estreito, ele é considerado negativo e indica curvatura), Twist (rotação horizontal
entre dois pares de bases consecutivos com ângulo fixo entre cada par de bases
consecutivas em torno de 34º), e Direction (representa alteração na direção espacial
da molécula) (Bolshoy et al., 1991; Pasero et al., 1993; Marilley e Pasero, 1996). O
programa 3D15m1 foi utilizado para a obtenção da modelagem bidimensional da
estrutura tridimensional dos fragmentos e do parâmetro de variação de energia livre,
∆G.
3.6. Reação de seqüenciamento
A reação de seqüenciamento foi realizada a partir de DNA dos clones pHN2,0
e pHH4,0 em plasmídeo pBluescript II. As amostras foram amplificadas com
DyEnamic ET Dye Terminator Kit (Amersham Bioscience). A reação segue as
instruções do fabricante usando 150ng de DNA, 10pMol dos primers universal e
reverso, 4µl de ET Dye Terminator e água ultrapura para completar 10µl.
Os ciclos foram realizados em termociclador Eppendorf Gradient, com
temperatura de denaturação de 95oC por 30 segundos, anelamento de 50
oC por 15
segundos, e extensão de 60oC por 150 segundos, sendo repetido esse ciclo por 30
vezes. O produto resultante desta amplificação foi precipitado com acetato de amônio
21
7,0M e etanol (dois volumes) e centrifugado a 14.000 rpm por 15 min. O precipitado
foi ressuspendido em 10µl de água ultrapura.
3.7. Seqüenciamento e análise computacional
O seqüenciamento dos fragmentos amplificados foi realizado em
seqüenciador automático MegaBACE 1000, seguindo o protocolo do fabricante. As
seqüências obtidas foram analisadas nos programas computacionais Phred, Phrap,
Consed (www.phrap.org/phredphrapconsed.html). PHRED (versão: 0.020425.c, de
Phil Green e Brent Ewing), PHRAP e CROSS_MATCH (versão: 0.990319, de Phil
Green), CONSED (versão 14.0, Gordon, 2004 http://bozeman.mbt.washington), e o
alinhamento no programa Bioedit (Hall, 1999). O programa BLASTN versão 2.0.8
(Altschul et al., 1990) foi utilizado para verificar a similaridade entre as seqüências
obtidas e as pertencentes ao banco de dados.
22
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. O gene C3-22 de Rhynchosciara americana é flanqueado por sítios de DNA
bent intrínsecos
Para a identificação de sítios de DNA bent, na região amplificada do gene
C3-22, foi analisado, por meio do estudo do comportamento eletroforético, o
segmento de 6132 pb (posição –4737 a +1395 pb) compreendendo a região
promotora, a unidade de transcrição e seqüências a jusante e a montante do gene
(Figura 6, mapa).
Os fragmentos de restrição analisados, obtidos da clonagem em plasmídeo
pBluescriptII SK+ (Stratagene), denominados pHN3,5 de 3735 pb (posição –3598 a
+137 pb) e pRR5,5 de 6126 pb (posição –4731 a +1395 pb), estão mostrados na
Figura 6. Os subfragmentos do clone pRR5,5, que compreende o gene C3-22 e
seqüências flanqueadoras, apresentam subfragmentos com tamanho molecular de
1100 pb (posição +295 a +1395), raia 1; 1600 pb (posição –205 a +1395 pb), raia 2;
1019pb (posição –205 a +814pb), e 581pb (posição +814 a +1395 pb), raia 3, com
redução na mobilidade eletroforética, comprovada pelos valores R 1,62; 1,32; 1,29 e
1,12, respectivamente (barras e setas em amarelo, Figura 6). Esses resultados
indicam a existência de sítios de DNA bent nesses segmentos.
A análise do subfragmento de 1390 pb (posição –4737 a –3347 pb), à
esquerda no mapa de restrição, previamente reportados por Fiorini et al., 2006a,
mostrou que esse fragmento tem discreta redução na mobilidade, valor R 1,12,
evidenciando a presença de curvatura nessa região (raias 2 e 3, barras e setas em
verde, Figura 6). Os demais subfragmentos analisados não apresentaram valores R
significativos, indicando que não existem sítios de DNA bent, ou que não estão
centralizados (linhas em preto, Figura 6).
Entre os fragmentos analisados quanto ao comportamento eletroforético, os
subfragmentos com 1600 pb (posição –205 a +1395 pb) com valor R de 1,32 e o
23
517-
3054 -
2036-
1018-
1636-
506-
M 1 2 3 4 5 M
PA+EthBr
517-
3054 -
2036-
1018-
1636-
506-
M 1 2 3 4 5 M
PA
Figura 6. Análise do comportamento eletroforético dos subfragmentos de restrição dos clones pHN 3,5 e pRR
5,5. 1) pRR5,5 E+H; 2) pRR5,5 E+Pv; 3) pRR5,5 E+Pv+Sca; 4) pRR5,5 E+D e 5) pHN3,5 H+Not+D. O mapa
de restrição é mostrado no diagrama ao topo da figura, sendo que a seta e a barra em azul indicam a direção e a
unidade de transcrição do gene C3-22. Os números acima de cada fragmento de restrição são os valores R.
Barras e setas em amarelo representam fragmentos com redução na mobilidade, valor R ≥ 1,11, sendo que os
fragmentos de valor R 1,12, à esquerda do mapa, estão indicados por barras e setas em verde. A utilização de
brometo de etídio no gel de poliacrilamida comprova a presença de sítios de DNA bent, observado pelo retorno
ao seu tamanho molecular real. M, marcador de tamanho molecular 1 kb ladder (Invitrogen). E, EcoRI; H,
HindIII; D, DraI; Pv, PvuII; Sca, ScaI. (PA) e (PA + EthBr) gel de poliacrilamida 6% sem e com brometo de
etídio, respectivamente.
C3-22
H H E E H 5' 3'
D D D D D D Pv
Pv
Pv
Sca Sca
D
+814 -4737 +295 +1395
0,96 0,98 1,62
1,12 0,96 1,32
1,12 0,90 0,93 1,29 1,12
0,98 1,02 0,94 0,90
1,04 0,94
-205 -3347
200pb
3
2
4
5
1
24
subfragmento de 1100 pb (posição +295 a +1395) com valor R de 1,62, que está
contido no fragmento anterior, foram analisados quanto aos seus parâmetros helicais
ENDS ratio, ângulo Roll e Twist (Figura 7). Foram determinados dois sítios
principais de DNA bent (b-1
e b+1
) no segmento de 1600 pb (posição -45, e +1015,
ENDS ratio 1,17 e 1,15, respectivamente), sendo que somente o segundo sítio é
presente no fragmento de 1100 pb. As medidas de ângulo Roll foram determinadas
para esses sítios de DNA bent e ambas são negativas com valores de -1,36 e - 0,97,
os valores de Twist são maiores que 34° (34,46° e 34,29°). Os resultados obtidos
com esses parâmetros apontam para sítios de DNA bent (ângulo Roll negativo) com
superenrolamento negativo (valores de Twist acima de 34°) que flanqueiam o gene
C3-22 de R. americana.
Para o detalhamento da região promotora do gene C3-22, o clone pHN3,5
foi clivado com o objetivo de centralizar os sítios de DNA bent. Os subfragmentos
que apresentaram valores R significativos, barras e setas em azul, foram: 1215 pb (-
1078 a +137, raia 1, valor R 1,28), 1077 pb (-1078 a –1, raia 2, valor R 1,25), 999
pb (-1078 a –79, raia 3, valor R 1,20), 216 pb (-79 a +137, raia 3, valor R 1,11), 879
pb (-1078 a –199, raia 4, valor R 1,16), 336 pb (-199 a +137, raia 4, valor R 1,40) e
396 pb (-851 a –455, raia 5, valor R 1,23) (Figura 8).
Foi realizada análise computacional do subfragmento 1215 pb (-1078 a
+137 pb), pois esse compreende toda a região que apresenta sítios de DNA bent,
barras em azul (Figura 9). Todos os outros subfragmentos com valores R
significativos na Figura 8 foram plotados para análise com relação aos parâmetros
helicais ENDS ratio, ângulo Roll e Twist (Figura 9). Foram determinados dois
novos sítios de DNA bent b-3
e b-2
(posição –685 e -305 pb, respectivamente) no
segmento analisado, com valores de ENDS ratio 1,11 e 1,12. O sítio b-1
, mostrado
na Figura 7, está presente na extremidade direita desse segmento. Os ângulos Roll
determinados para os sítios de DNA bent b-3
e b-2
e são todos negativos com valores
de -0,73 e -0,27, respectivamente. Os valores de Twist encontrados foram superiores
a 34° (34,11° e 34,10°). Os resultados obtidos com esses parâmetros apontam para
sítios de DNA bent com superenrolamento negativo na região promotora do gene
C3-22 de R. americana.
25
1
1,02
1,04
1,06
1,08
1,1
1,12
1,14
1,16
1,18
EN
DS
ra
tio
b-1
b+1
33,7
33,8
33,9
34
34,1
34,2
34,3
34,4
34,5
0 500 1000 1500
Tw
ist
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
Ro
ll
Figura 7. Análise computacional da região de 1600pb (posição -205 a +1395 pb)
que contém o fragmento de 1100pb (posição +295 a +1395 pb). Foram utilizados
os parâmetros helicais ENDS ratio, ângulo Roll e Twist. Os maiores sítios de DNA
bent estão indicados por b-1
e b+1
. Barras em amarelo indicam os fragmentos
analisados, barra e seta em lilás indicam a direção e a unidade de transcrição do
gene C3-22., E, EcoRI; H, HindIII; D, DraI; Pv, PvuII e Sca, ScaI.
C3-22
H 5'
D D
Pv
Sca +814 +295
-205
E
1,62
1,32
3' 200pb
26
M 1 2 3 4 5 M
PA
100
400
300
200
500
650
850
1000 1650
2000
M 1 2 3 4 5 M
PA+EthBr
100
400
300
200
500
650
850 1000 1650 2000
M
+980
D
+137
H -3601
H
-3341
P -2865
D
-1078
Sac
-199
P D
C3-22
200pb
4
3
2
1
5
1,28
1,23
1,16
1,25
1,26
1,11
1,40
Figura 8. Análise do comportamento eletroforético dos subfragmentos de restrição do clone pHN 3,5 e pRa400.
1) pHN3,5 H+N+Sac; 2) pHN3,5 H+N+Sac+D; 3) pHN3,5 H+N+Sac+M; 4) pHN3,5 H+N+Sac+Pv e 5) pRa
EcoRI. O mapa de restrição é mostrado no diagrama ao topo da figura. A seta e a barra em lilás indicam a
direção e a unidade de transcrição do gene C3-22. Os números acima de cada fragmento de restrição são os
valores R. Barras e setas em azul representam fragmentos com redução na mobilidade, valor R ≥ 1,11. A
utilização de brometo de etídio no gel de poliacrilamida comprova a presença de sítios de DNA bent, observado
pelo retorno ao seu tamanho molecular real. M, marcador de tamanho molecular 1 kb ladder plus (Invitrogen).
H, HindIII; D, DraI; E, EcoRI; M, MspI Pv, PvuII; Sac, SacI. (PA) e (PA + EthBr) gel de poliacrilamida 6%
sem e com brometo de etídio, respectivamente.
27
33,8
33,9
34
34,1
34,2
34,3
34,4
34,5
0 500 1000
-1,6
-1,4
-1,2
-1
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
1
1,02
1,04
1,06
1,08
1,1
1,12
1,14
1,16
1,18
1,2
EN
DS
ra
tio
Ro
ll
Tw
ist
b-3
b-2
Figura 09. Análise computacional da região promotora e início do gene C3-22.
Foram utilizados os parâmetros helicais ENDS ratio, ângulo Roll e Twist .Barras
azuis indicam os fragmentos, barras e seta lilás indicam o gene C3-22 e sua
direção, as barras brancas indicam regiões de intron. Os maiores sítios de DNA
bent estão indicados por b-1
, b-2
e b-3
. E, EcoRI; H, HindIII; D, DraI; Pv,
PvuII;.Sca, SacI.
1,23 b-1
1,28
1,20
1,25
1,16
1,08
1,11
1,40
C3-22
3' 5' D Pv M Sac
-79 +137 -199 H
-1078 200pb
28
Em resumo, os resultados mostraram sítios de DNA bent intrínsecos na
região promotora desse gene (b-3
, b-2
e b-1
) e a jusante (b+1
) do gene C3-22 de R.
americana.
Foi descrita a presença de sítios de DNA bent flanqueando o gene para
RNAr de Physarum (Schroth et al., 1992). Para o gene BhC4-1 de Bradysia hygida,
sítios intrínsecos de DNA bent foram detectados na região promotora (Fiorini et al.,
2001) e a jusante desse gene, onde três sítios de DNA bent foram determinados
(Reis et al., 2004), mostrando que o gene BhC4-1 também é flanqueado por sítios
bent. Outra descrição obtida em laboratório, para o gene amplificado AMPD2 em
células de hamster Chinês, colocaliza sítios de DNA bent, que flanqueiam o gene,
com origens de replicação na região (Balani et al., 2006).
Em análise estrutural na região 5’ do gene de quitinase da classe I de
tabaco, CHN50, foi demonstrada a presença de uma seqüência de DNA bent
intrínseco no local da iniciação da transcrição (Fukuda, 1994). Análises
eletroforéticas e de western blotting revelaram que proteínas nucleares ligam-se
especificamente ao DNA bent. Além disso, as proteínas nucleares pareceram
reconhecer a estrutura global do sítio de DNA bent intrínseco, independente de
ligar-se a uma seqüência de DNA específica (Fukuda, 2000).
Curvaturas de DNA em regiões promotoras, formadas por sítios de DNA
bent intrínsecos, são descritas para os genes da β-actina (Kawamoto et al., 1989).
Regiões de DNA bent foram relatadas primeiramente na região promotora do gene
da ε-globin de humanos e subseqüentemente em outras regiões do mesmo locus, no
gene c-myc, para o gene da cadeia pesada da imunoglobina, nos genes do receptor
de estrogênio em humanos e no gene da βmaj-globin em ratos (revisão em Ohki,
1998). A presença de estruturas de DNA bent também foi sugerida para os genes
das Gγ-Aγ-ψβ-globinas de humanos (Wada-Kiyama e Kiyama, 1996; Onishi, 1998;
Wada-Kiyama, 1999). Para o promotor do gene cdc2 em humanos foi reportada a
presença de sítios de DNA bent intrínsecos, sugerindo que esses são necessários
para regulação da transcrição (Nair, 1998).
Estudos revelaram seqüências de DNA bent intrínsecos em regiões
promotoras do gene ribossomal em Xenopus laevis e seqüências de espaçador
29
intergênico (IGS) (Roux-Rouquie e Marilley, 2000). Uma grande quantidade de
sítios de DNA bent tem sido reportada em regiões promotoras de eucariotos
(Ohyama, 2001). Em levedura, foram relatados sítios de DNA bent em promotores
dos genes GAL1–10 e GAL80 (Bash et al., 2001), assim como em outros diferentes
sistemas eucarióticos (Fiorini et al., 2006b). Miyano (2001) identificou em diversos
promotores de eucariotos, sítios de DNA bent intrínsecos e propôs que essas
estruturas bent seriam responsáveis por organizar a conformação local da cromatina
e regular o início da transcrição. Sítios de DNA bent são uma das principais
estruturas que influenciam a transcrição e o posicionamento de nucleossomos em
regiões promotoras (Wanapirak et al., 2003).
4.2. Promotores de genes de proteínas de secreção em insetos apresentam
parâmetros helicais comuns
Após a identificação de segmentos bent em seqüências que flanqueiam esse
gene e em sua região promotora, foram realizadas análises computacionais dessas
seqüências e das regiões promotoras de outros oito genes de proteínas de secreção
em insetos.
Foi calculada a trajetória bidimensional da via tridimensional com a
variação de ∆G e a direção (Direction) por meio dos programas 3D15m1 e Map15a,
do fragmento da região promotora, incluindo o TATA-box, do gene C3-22 de
Rhynchosciara americana (posição -1078 e +137 pb), que comporta os sítios bent b-
3, b
-2 e b
-1 e do fragmento que corresponde à seqüência final do gene e comporta o
sítio b+1
(posição +295 e +1373 pb). Nos dois fragmentos foram detectados, em
todos os sítios de DNA bent, baixos valores de ∆G (anéis em cinza), colocalizados
com a alteração na direção espacial da molécula de DNA, Figura 10. Embora a
impressão plana da estrutura da molécula torne difícil analisar alterações no espaço,
o cálculo do parâmetro helical Direction evidencia essas mudanças quando
apresenta alternância entre valores positivos e negativos. Os parâmetros helicais de
30
curvatura e a estrutura 2D de regiões promotoras de genes de proteínas de secreção
de outros insetos foram calculados para análise comparativa.
As seqüências de aproximadamente 600 pb da região promotora, incluindo
a seqüência TATA-box, dos genes de proteínas de secreção B2 de Rhynchosciara
americana, BhC4-1 e BhB10 de Bradysia hygida, Sgs3 e Sgs5 de Drosophila
melanogaster, TpC4 de Trichosia pubescens, Fib-H de Bombyx mori e II9-2 de
Sciara coprophila foram analisadas pela trajetória bidimensional da via
tridimensional com variação de ∆G (Figura 11) e parâmetros helicais ENDS ratio,
ângulo Roll e Twist (Figura 12 e 13).
Todas as regiões analisadas apresentaram característica curva, observada
pela trajetória bidimensional nas figuras projetadas, sendo acentuada na seqüência
TATA-box (Figura 11). Os gráficos de ENDS ratio mostraram valores superiores a
1,10, os valores de ângulos de Roll foram negativos e de Twist superiores a 34°,
resultados que confirmam a presença de sítios de DNA bent intrínsecos na região
promotora desses genes (Figuras 12 e 13). Para a região promotora do gene C3-22,
esses mesmos parâmetros podem ser observados nas Figuras 9 e 10. Para efeito de
comparação, somente o sítio de DNA bent b-1
está incluído em um segmento de
aproximadamente 600 pb, como foi realizado para as demais regiões analisadas.
A presença de sítios bent intrínsecos, nas regiões promotoras analisadas,
pressupõe condições necessárias para a ligação de proteínas ao DNA. A proteína
TBP (TATA-box-binding protein) liga-se na região do TATA-box por meio do sulco
menor (Lee et al., 1991; Starr e Hawley, 1991), o que deve ser facilitado pelo
segmento curvo, permitindo a atividade transcricional.
Fig
ura
10.
Mo
del
agem
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-1, b
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30
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1500
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2
12
15
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10
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pb
b+
1
b-1
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-2
b-3
Direction
31
Fig
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11.
Mo
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600pb
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pel
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ver
de
32
Bh
B1
0
Fib
-H
II9
-2
Bh
C4-1
B2
Sgs3
S
gs5
T
pC
4
33
Figura 12. Análise comparativa da região promotora, incluindo a seqüência TATA-box dos
genes A)B2 de R. americana, B)II9-2 de S. coprophila, C)BhB10 e D)BhC4-1 de B. hygida.
Foram utilizados os parâmetros helicais ENDS ratio, ângulo Roll e Twist, obtidos pelo
programa Map15a, com uma janela de 120pb a cada 20pb, com exceção do gene II9-2, cujo
cálculo foi realizado com uma janela de 120pb a cada 10pb. A região do TATA-box é
indicada pelo círculo rosa.
Pares de Bases
33,8
33,9
34
34,1
34,2
34,3
34,4
34,5
34,6
0 100 200 300 400 500 600
-1,6
-1,4
-1,2
-1
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
1,02
1,04
1,06
1,08
1,1
1,12
1,14
B2
EN
DS
ra
tio
Ro
ll
Tw
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A
Pares de Bases
33,8
33,9
34
34,1
34,2
34,3
34,4
34,5
34,6
0 100 200 300 400
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1
1,05
1,1
1,15
1,2
1,25
II9-2
EN
DS
ra
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Tw
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Ro
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B
Pares de Bases
1
1,02
1,04
1,06
1,08
1,1
1,12
1,14
1,16
1,18
BhC4-1
-1,4
-1,2
-1
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0
34,1
34,15
34,2
34,25
34,3
34,35
34,4
34,45
0 100 200 300 400 500 600
EN
DS
ra
tio
Tw
ist
Ro
ll
C
Pares de Bases
1,02
1,04
1,06
1,08
1,1
1,12
1,14
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
33,8
33,9
34
34,1
34,2
34,3
34,4
34,5
34,6
34,7
0 100 200 300 400 500 600
BhB10
EN
DS
ra
tio
Ro
ll
Tw
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D
Pares de Bases Pares de Bases
34
33,8
33,9
34
34,1
34,2
34,3
34,4
34,5
0 100 200 300 400 500 600
Pares de Bases
-1,2
-1
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
1,02
1,04
1,06
1,08
1,1
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Sgs5
EN
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B
1,02
1,04
1,06
1,08
1,1
1,12
1,14
1,16
-1,2
-1
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
33,9
34
34,1
34,2
34,3
34,4
34,5
0 100 200 300 400 500
Sgs3
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Pares de Bases
1
1,02
1,04
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1,12
1,14
1,16
1,18
1,2
0 100 200 300 400 500 600
34,05
34,1
34,15
34,2
34,25
34,3
34,35
34,4
34,45
34,5
0 100 200 300 400 500 600
-1,8
-1,6
-1,4
-1,2
-1
-0,8
-0,6
-0,4
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Pares de Bases
1
1,02
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1,06
1,08
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1,12
1,14
1,16
1,18
1,2
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
33,9
34
34,1
34,2
34,3
34,4
34,5
34,6
0 100 200 300 400 500 600
Fib-H
EN
DS
ra
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Ro
ll
Tw
ist
D
Pares de Bases
Figura 13. Análise comparativa da região promotora, incluindo a seqüência TATA-box dos
genes A)Sgs3 e B)Sgs5 de D. melanogaster, C)Fib-H de B. mori, , e D)TpC4 de T.
pubescens. Foram utilizados os parâmetros helicais ENDS ratio, ângulo Roll e Twist,
obtidos pelo programa Map15a, com uma janela de 120pb a cada 20pb. A região do TATA-
box é indicada pelo círculo rosa.
35
Podem ser observadas similaridades em relação à curvatura do DNA entre
as regiões promotoras, as quais podem ser agrupadas em dois conjuntos. Um
primeiro grupo, que apresenta curvatura composta por um único sítio de DNA bent,
promotores dos genes BhC4-1, C3-22, II9-2, Fib-H, TpC4 e Sgs3. Para o segundo
grupo foram observados sítios de DNA bent em toda a região da curvatura, com
picos principais de valores superiores a 1,12, para os promotores dos genes Sgs5, B2
e BhB10.
Para dois genes do primeiro grupo, BhC4-1 e C3-22 (Monesi et al., 1998;
Soares et al., 2003), e um do segundo grupo, BhB10 (Monesi et al., 2001), foram
obtidas linhagens transgênicas de Drosophila melanogaster. Apesar das regiões
promotoras dos genes BhC4-1 e C3-22 apresentarem parâmetros helicais comuns, a
expressão desses genes se comportou de modo diferente em linhagens transgênicas.
A ocorrência de fatores aleatórios, como efeito de posição, pode ser responsável por
esses resultados.
36
5. CONCLUSÕES
Um segmento do pufe de DNA C3 de Rhynchosciara americana que
contém a unidade de transcrição do gene C3-22 apresenta três sítios de DNA bent,
b-3, b-2 e b-1 na região promotora e um sítio, b+1, a jusante. Desse modo, esse gene se
encontra flanqueado pelos sítios b-1 e b+1. Esses resultados, associados ao
conhecimento de que outros genes localizados em seqüências amplificadas no
genoma se encontram flanqueados por sítios de DNA bent, indicam que novas
questões devem ser respondidas, como: genes localizados em domínios
amplificados podem/devem apresentar sítios de DNA bent flanqueadores? Se sim,
qual seria o motivo da existência dessas seqüências? Somente experimentos
funcionais, com a deleção desses sítios, poderiam evidenciar a importância de sua
localização. Com relação às regiões promotoras de genes de proteínas de secreção
em insetos, similaridades estruturais indicam que a curvatura intrínseca, dependente
da seqüência, pode ser uma característica conservada do TATA-box nesses
organismos.
37
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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