FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA...

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

AVALIAÇÃO DE UM PRÉ-TRATAMENTO BIOLÓGICO COM CEPAS DE

PANUS TIGRINUS NO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR QUE ANTECEDE A

POLPAÇÃO Q~ÍMICA

Sirlene Maria da Costa

Tranferido da Biblioteca do DEBIQ para a Bilblioteca

Universitária em Junho/2004 Proc. nº 202/04

Lorena -SP- Brasil 1999



AVALIAÇÃO DE UM PRÉ-TRATAMENTO BIOLÓGICO COM CEPAS DE

.PANUS TIGRINUS NO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR QUE ANTECEDE A

POLPAÇÃO QUÍMICA

Dissertação de mestrado apresentada como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Biotecnologia Industrial

Banca examinadora: Dr. Adilson Roberto Gonçalves (presidente) Ora Elisa Esposito Ora Angela Elena Machuca Herrera

Estudante: Sirlene Maria da Costa




AVALIAÇÃO DE UM PRÉ-TRATAMENTO BIOLÓGICO COM CEPAS

DE PANUS TIGRINUS NO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR QUE

ANTECEDE A POLPAÇÃO QUÍMICA

Este exemplar corresponde à versão final da dissertação de mestrado aprovada pela banca examinadora.

Dr. Adilson Robe cfonçalves Orientador e Presidente da banca examinadora


Dedico este trabalho aos meus pais, José Carlos da Costa in memoriam, Maria de Lourdes Costa e irmãos (Silgia, Jeane, Renato, Vilson, Celso e Anilson)

- ---

íí

AGRADECIMENTOS

Ao Dr. Adilson Roberto Gonçalves pelo apoio, incentivo, dedicação e

. orientação desde a iniciação cientifica até a realização desta tese.

À Ora. Elisa Esposito , pelo incentivo, pelas sugestões e orientação durante a

etapa biológica do trabalho.

Ao Dr. Pedro Edson Fardim e a empresa Suzano, pela realização dos testes

físicos das polpas Acetosolv.

À Ora Anqela Machuca e Priscila Bernar pelas sugestões durante este trabalho.

Aos amigos Andersen e Régis pela paciência e sugestões e principalmente

pela _atenção.

À todos os professores da Pós-Graduação do DEBIQ (Departamento de

Biotecnologia) da Faculdade de Engenharia Química de Lorena.

Aos colegas de curso Carla, Luciane, Water , Luciano, Hellen, Mareia e Luane

e companheiros do laboratório José Moreira,. José Carlos e Jussara, pela

amizade e alegria do convívio diário.

Aos demais funcionários e colegas do DEBIQ que não foram citados, mas que

de alguma forma contribuíram para realização deste trabalho.

Aos meus familiares, pelo carinho e grande incentivo.

À CAPES e FAPESP, pelo apoio financeiro.

iii

CONTEÚDO Páginas

· Lista de tabelas vi

Lista de figuras vii

Resumo xi

Astract. xii

Lista de abreviações, acrônimos e símbolos utilizados xiii

1- INTRODUÇÃ0 , 1

1.1 Composição química 1 1.2 Bagaço de cana-de-açúcar 3 1.3 Estrutura e Ultraestrutura da parede da célula vegetal 5 1.4 Processos de separação dos constituintes do bagaço 7

1.4.1 Processo de polpação Kraft 7 1.4.1.1 Terminologias empreqadas no processo de polpação kraft. 9

1.4.2 Polpação Acetosolv 11 1.4.3 Separação alternativa 11

1.5 Aplicação da biotecnologia na indústria de polpa 12 1.6 Fungos de decomposição branca. 13 1.7 Enzimas Ligninolíticas e Hidrolíticas 14 1.8 Utilização de PGA na seleção de cepas com capacidade ligninolítica e

hidrolítica : 20

2. OBJETIVOS ; 21

3. PARTE EXPERIMENTAL 22 3.1 Fungos 22 3.2 Bagaço de cana-de-açúcar 22 3.3 Condições de cultura 22 3.4 lnóculo 25 3.5 Avaliação das atividades enzimáticas 25

3.5.1 Lacase (Lac) 26 3.5.2 Lignina peroxidase (LiP) 26

3.5.3 Manganês-peroxidase (MnP) 26

iv

3.5.4 Xilanase (Xyl) 27

3.6 Diálise 27

3.7 Análise química da composição do bagaço 28 3.8 Análise do bagaço autoclavado 30 3.9 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) 31 3.1 O Espectros no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) e

análise por componentes principais (PCA) 31 3.11 Determinação da composição do licor de polpação kraft pelo teste

ABC 32 3.11.1 Polpação kraft 33

3.12 Polpação Acetosolv do bagaço 33 3.13 Determinação do número kappa ." 35 3.14 Viscosidade 36 3.15 Propriedades óptico-mecânicas das folhas obtidas a partir das polpas

Acetosolv 37

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .40 4.1 Crescimento fúngico ~ .40 4.2 Atividades enzimáticas : .42

4.3 Composição Química do bagaço original e pré-tratado 46 4.4 Morfologia das floras 56 4.5 FTIR- PCA 58 4.6 Polpação 63

4.6.1 Polpação kraft 63 4.6.2 Polpação Acetosolv 69

4.6.2.1 Propriedades óptico-mecânicas das folhas obtidas das polpas Acetosolv feitas em escala ampliada , 73

4. 7 FTIR das polpas kraft e Acetosolv 75

5. CONCLUSÕES 80

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 81

V

LISTA DE TABELAS Páginas

Tabela 1. Atividades enzimáticas produzidas pelo P. tigrinus no bagaço de

cana-de-açúcar, determinadas após 1 O dias de incubação .43

Tabela 2.Atividades enzimáticas para as três cepas do Panus tigrinus

(FTPT-4741, FTPT-4742 e FTPT-4745) produzida durante a

degradação do bagaço de cana-de-açúcar nas bolsas, determinadas

antes e após diálise ." 45

Tabela 3. Comparação dos resultados encontrados na análise química do

bagaço in natura com os da literatura .47

Tabela 4. Composicão química do bagaço degradado e não degradado

(controle) em dez dias de incubação com agitação (série 1) 48

Tabela 5. Composição química do bagaço tratado e controle durante dez dias

sob agitação (série 2) 50

Tabela 6. Composicão química do bagaço tratado e controle durante dez dias

em regime estacionário (frascos), série 2 51

Tabela 7. Composição química do bagaço tratado e controle durante trinta dias

em bolsas em regime estacionário 52

Tabela 8. Perda de massa e de componentes do bagaço biodegradado durante

1 O dias por Panus tigrinus nos frascos sob agitação ( série 2) 53

Tabela 9. Perda de massa e de componentes do bagaço biodegradado durante

1 O dias por Panus tigrinus nos frascos em regime estacionário 54

vi

Tabela 10. Perda de massa e de componentes do bagaço biodegradado

durante 30 dias por Panus tigrinus em bolsas 55

Tabela 11. Resultados da polpação kraft com o bagaço in natura em vários

tempos de reação 64

Tabela 12. Resultados da polpação kraft do bagaço tratado e controle utilizando

bolsas, em vários tempos de reação 66

Tabela 13. Resultados da polpação kraft obtidas a partir do bagaço tratado e

controle nos frascos Erlenmeyer com e sem agitação, com 20 min

de reação 68

Tabela 14. Resultados da polpação Acetosolv do bagaço de cana-de-açúcar

in natura degradado pelas três cepas do Panus tigrinus

(FTPT-4741, FTPT-4742 e FTPT-4745) e do controle nos sistemas

com agitação, estacionário e bolsas 70

Tabela 15. Resultados da polpação Acetosolv com a ampliação de escala para

o bagaço de cana-de-açúcar in natura., controle e inoculado nas

bolsas pelas três cepas do Panus tigrinus (FTPT-4741, FTPT-4742

e FTPT-4745) 72

Tabela 16. Propriedades óptico-mecânicas das folhas obtidas das polpas

Acetosolv 7 4

vii

LISTA DE FIGURAS Páginas

Figura 1- Estrutura de um fragmento de celulose de madeira 1

Figura 2- Modelo de uma estrutura de lignina de faia (Fagus sylvatica) proposta

por Nimz (1974) 3

Figura 3- Estrututa da parede celular vegetal em célula do tipo traqueídeos (Ft).

A- Componente da parede celular, P1: parede primária; P2: parede

8- secundária e as camadas S1, S2 e S3, ML: lamela média. 8

Disposição dos componentes químicos· da parede celular, Cm:

microfibrilas de celulose, Hc: hemicelulose (polioses), MLHc: matriz de

lignina e polioses. Os elementos fibrilares das microfibrilas estão

formadas de celulose que apresentam regiões cristalinas: ZC e

amorfas: ZA. Adaptado de Cowling e Kirk, (1976) e Goring, (1975) ..... 6

Figura 4- Representação de uma reação típica catalisada por lacase

R1 = cadeia propànica R2 e R3 = H ou OCH3 15

Figura 5- Ciclo Catalítico da Enzima Lignina Peroxidase. A• substrato na

forma radicalar; AH representa um substrato aromático; o qual age

como doador de elétrons para o grupamento heme; O(P.+) enzima

com átomo de oxigênio na forma de radical cátion 16

Figura 6- Ciclo Catalítico da Enzima Manganês-Peroxidase. AH substrato

doador de elétrons; A• radical do substrato; O(P.+) enzima com

átomo de oxigênio na forma de radical cátion 17

Figura 7- (A) enzimas xilanolíticas envolvidas na degradação da xilana.

(8) Hidrólise de xilooligossacarídeos pela f3-xilosidase. Ac: grupo

acetil; a-4-0-Me-GlcA: Ácido a-4-0 metil glucurônico e a-araf:

arabinofuranose 19

viii

Figura 8- Fluxograma de todo procedimento experimental (série 1 ) 23

Figura 9- Fluxograma de todo procedimento experimental (série 2) 24

Figura1 O- Cultivo de Panus tigrinus no bagaço de cana-de-açúcar em

Erlenmeyer sob agitação após 1 O dias de tratamento 40

Figura 11- Cultivo do Panus tigrinus no bagaço de cana-de-açúcar em bolsas

plásticas após 30 dias de tratamento .41

Figura 12- MEV do bagaço de cana-de-acúcar, após 1 O dias de tratamento com

Panus tigrinus sob agitação (série 1 ). (a) controle, (b) P. tigrinus

FTPT-4741, (c) P. tigrinus FTPT-4742, (d) P. tigrinus FTPT-4745 (1

mm= 3,6 um). 57

Figura 13- Espectros FTIR das amostras do bagaço degradado e não

degradado (controle) 58

Figura 14- Correlação entre os scores de CP1 e CP2 dos espectros FTIR das

amostras de bagaço de cana-de-açúcar degradado pelas diferentes

cepas de P. tigrinus e controle sob condições agitadas ( série 1)

durante 1 O dias 60



cepas de P. tigrinus e controle sob condições agitadas ( série 2)

durante 1 O dias 60



cepas de P. tigrinus e controle em regime estacionário ( série 2)

durante 1 O dias , 61

ix



cepas de P. tigrinus e controle em regime estacionário em bolsas

durante 30 dias 62

Figura 18- Gráfico dos resultados da polpação kraft do bagaço in natura,

obtidos da tabela 11 [rendimento (r), número kappa (k), lignina

residual (Ir), viscosidade(v)] 64


polpas Acetosolv obtidas a partir das amostras de bagaço de

cana- de-açúcar degradado e não degradado para os três sistemas .. 75


amostras de polpas kraft obtidas a partir do bagaço de cana-de-

açúcar degradado e não degradado para os três sistemas com 20

min de reação 77

Figura 21- Loadings CP1 e CP2 referente a região 1400 a 1800 cml.a)

Gráficos dos loadings dos dois primeiros componentes principais das

amostras kraft. b) Gráficos dos loadings dos dois primeiros

componentes principais das amostras Acetosolv 79

X

RESUMO

Avaliação de um pré-tratamento biológico com cepas de Panus tigrinus no bagaço de cana-de-açúcar que antecede a polpação química. Sirlene M. Costa. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Industrial, Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Dr. Adilson Roberto Gonçalves (departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, CP 116, 12600-000, Lorena, SP, Brasil). Banca examinadora: Ora. Elisa Esposito e Ora. Angela Machuca Herrera, Setembro de 1999.

Foi realizado um pré-tratamento do bagaço de cana com três cepas do fungo de decomposição branca Panus tigrinus (FTPT-4741, FTPT-4742, FTPT- 4745). A fermentação semi-sólida foi realizada a 28ºC, sem adição de fonte de carbono, em frascos Erlenmeyer com e sem agitação por 1 O dias, utilizando-se 6 g de bagaço, e em bolsas plásticas por 30 dias, utilizando 100 g de bagaço. A ação fúngica foi investigada por medidas de atividade enzimática, análise química, perdas de componentes, microscopia eletrônica de varredura e espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR). Após a fermentação, o extrato líquido foi filtrado em membrana e foram medidas as atividades enzimáticas de lignina peroxidase (LiP}, manganês-peroxidase (MnP), lacase (Lac) e xilanase (Xyl). Para a fermentação conduzida em bolsas foram feitas medidas de atividade enzimática com os extratos com 1 O e 30 dias antes e após dialise. Foram realizadas palpações kraft e Acetosolv com o bagaço in natura, biodegradado e com os controles nos três sistemas. Das polpas kraft e Acetosolv foram determinados o rendimento, número kappa e a viscosidade e obtidos espectros por FTI R. As propriedades óptico-mecânicas, índice de tração, rasgo e estouro, comprimento de auto-ruptura e alvura foram determinadas para as polpas Acetosolv. O uso de bolsas plásticas para inoculação do bagaço com Panus tigrinus aumentou a atividade para a MnP e Xyl. A LiP não foi encontrada em nenhum dos três sistemas. A análise por microscopia eletrônica mostrou um crescimento satisfatório para as três cepas, sendo que a cepa FTPT-4745 ocasionou maior rupturanas fibras. Os espectros de FTIR foram obtidos diretamente das amostras de bagaço e tratados por PCA (Análise por Componentes Principais). Uma clara separação foi observada entre a cepa FTPT-4742 e o controle. A análise química foi realizada e foi calculada a seletividade, sendo que a cepa FJPT.,.47: 45 foi a mais seletiva para degradar lignina. Os rendimentos para as polpas kraft foram baixos: de 20 a 45% para as bolsas e de 12 a 38% para os frascos. O valor de número kappa foi de 1 a 18 e os valores de viscosidade variaram de 2,3 a 6,8 cP. Para as polpas Acetosolv o rendimento foi na faixa de 43,5 a66~º2%,-· número kappa de 16,8 a 44,6 e viscosidade de 4 a 13 cf=> .. As propriedades óptico-mecânicas das polpas Acetosolv foram muito semelhantes entre as diferentes cepas. A cepa FTPT-4745 foi a que menos sobreu infuência do sistema utilizado. Os resultados mostraram que o Panus tigrinus é adequado para o pré-tratamento do bagaço de cana e que as três cepas são muito semelhantes entre si. O uso de bolsas plásticas aumentou as atividades MnP e Xyl ao mesmo tempo que representa numa vantagem e/ou facilidade numa eventual aplicação industrial em larga escala.

xi

ABSTRACT

Evaluation of a biological pre-tretament with Panus tigrinus strains on Surgacane bagasse applied before chemical pulping. Sirlene M. Costa. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia

. Industrial, Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Dr. Adilson Roberto Gonçalves ( departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, CP 116, 12600-000, Lorena, SP, Brasil). Banca examinadora: Ora. Elisa Esposito e Ora. Angela Machuca Herrera, Setembro de 1999.

Biological pre-treatment of sugarcane bagasse with three strains of the white-rot fungus Panus tigrinus (FTPT-4741, FTPT-4742 and FTPT-4745) was performed. The semi-solid fermentation was carried out at 28°C with no additional carbon source in Erlenmeyer flasks with and without shaking for 1 O days (using 6 g of bagasse) or in plastic bags for 30 days (using 100 g of bagasse). The action of P. tigrinus was evaluated by enzymatic activities, chemical analysis and component lasses, scanning electronic microscopy (SEM) and Fourier-transformed infrared spectroscopy (FTIR) of the decayed and non-decayed (contrai) bagasse samples. After fermentation the liquid extract was filtered in membrane and measured the enzymatic activity, before and after dialysis, of lignin-peroxidase (LiP), manganese-peroxidase (MnP), laccase (Lac) an the hydrolytic enzyme xylanase (Xyl). Kraft and Acetosolv pulping experiments were carried out using in natura bagasse, decayed and contrai samples. Pulp yields, kappa number and viscosity of ali pulps were determined and FTIR spectra from the samples were recorded. Tear, burst and tensile indices and brightness were determined for Acetosolv pulps. The growth of Panus tigrinus strains in plastic bags increased the MnP and Xyl activities. LiP was not detected in the three systems (shaked and non-shaked flasks and plastic bags ). SEM analysis showed a satisfactory growth of the three strains over the bagasse fibers and the FTPT-47 45 was most effective with rupture of the fibers. FTIR spectra was reduced to their Principal Components anda clear separation between FTPT-47 42 and the contrai was observed. The selectivity was calculated from the chemical analysis data of the decayed and contrai bagasse samples. FTPT -47 45 strain was more selective to decay lignin, in the three systems utilized. Yields of kraft pulping were low, ranging from 20 to 45% for the plastic bags samples and from 12 to 38% for the flasks samples. Kappa numbers were 1-18 and viscosity varied from 2.3 to 6.8 cP. For Acetosolv pulps these results were: pulp yield 43.5-66.2%, kappa number 16.8-44.6 and viscosity 4-13 cP. Mechanical properties and brightness of the Acetosolv pulps showed no difference between the samples. The results show that the three strains of P. tigrinus are very similar and the action of FTPT-4 7 45 strain was not modified within the different systems. Thpp use of plastic bags to grow P. tigrinus strains increases the MnP and Xyl activities at sarne time that represents an advantage/easiness in the industrial process. Enzymatic activities related to chemical composition after action of P. tigrinus shows the efficiency of this fungus as a pre-treatment of sugarcane bagasse.

xii

LISTA DE ABREVIAÇÕES, ACRÔNIMOS E SÍMBOLOS UTILIZADOS

AA ABTS AE ASTM AT CAA ·cAE CAR CLAE COPERSUCAR Cv DNS FTIR

FTPT ISO Lac LiP LR K MEV MnP PCA TAPPI uv V Xyl

: Álcali ativo : 2,2 azino-(3 etil benzenotiazolina-6-sulfonato) : Álcali efetivo : Americam Standard T est Methods : Álcali total titulável : Carga de álcali ativo : Carga de álcali efetivo : Comprimento de auto-ruptura : Cromatografia líquida de alta eficiência : Cooperativa de Produtores de Açúcar e Álcool : Constante do viscosímetro · : Ácido 3,5-dinitrossalicílico : Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier

: Fundação Tropical de Pesquisa e Tecnologia : lnternational Standard Office : Lacase : Lignina peroxidase : Lignina residual : Número kappa : Microscopia eletrônica de varredura : Manganês-peroxidase : Análise por componentes principais : Technical Association of the Pulp and Paper lndustry : Ultravioleta : Viscosidade : Xilanase

~ -. -

xiii

1. INTRODUÇÃO 1.1 Composição química

Atualmente existe um grande interesse da indústria e da sociedade em

geral em relação ao uso de recursos . renováveis, principalmente para a

obtenção de combustíveis e de produtos químicos de base, incluindo-se aí a

polpa celulósica. Desta forma, o uso da biomassa vegetal (materiais

lignocelulósicos) é estimulado. Juntamente com o aumento do interesse na

utilização completa e racional de todos os constituintes dos materiais

lignocelulósicos, principalmente daqueles obtidos como resíduos.

O bagaço de cana é um desses resíduos agrícolas abundante em várias

regiões. do Brasil como por exemplo nos estados· de São Paulo, Pernambuco,

Rio de Janeiro, Alagoas, Minas Gerais e Paraíba ( Orlando Filho e Zambello, .

1983).

Os materiais lignocelulósicos são constituídos por três principais

componentes macromoleculares: celulose, polioses e lignina.

Celulose: é um polímero linear (parte amorfo e parte cristalino) formado

por moléculas de anidro-glicose unidas através de ligações ~-1,4 glicosídicas,

de fórmula geral (CsH100s). A celulose é composta unicamente por unidades

moméricas de celobiose que se repetem apresentando sempre o oxigênio que

liga os anéis glicosídicos na posição equatorial (Ferraz, 1999), conforme

mostrado na figura 1 .

me ·Aff ~e O #?'OH 'o o o/ o o/ °'20! o K) . °'20! o Figura 1. Estrutura de um fragmento de celulose de madeira.

No bagaço de cana, a celulose é intimamente ligada com ligninas,

pentasanas, gomas, gordura, material colorido e taminos. As diferenças nas

propriedades da celulose são devidas basicamente aos diferentes graus de

polimerização. A celulose de bagaço é um polímero com cadeias com cerca de

2000 a 3000 unidades de glicose (Paturau, 1969).

1

Polioses: (ou hemiceluloses) são compostas pelos açúcares glicose,

manose e galactose (hexoses) e xilose e arabinose (pentases), podendo ainda

apresentar quantidades variáveis de ácidos urônicos e desoxiexoses em alguns

tipos de vegetais. As polioses apresentam-se na forma de polímeros

ramificados de menor massa molar que a celulose e podem ser homopolímeros

(exemplo: xilana, formado por xilose) ou heteropolímeros (exemplo:

glicomanana formado por glicose e manose ). O teor de polioses em diferentes

tipos de vegetal é bastante variável, com um valor médio de 20% (Fengel e

Wegener, 1989).

As pentasanas de bagaço de cana submetidas a hidrólise resultam em

xilose, arabinose e ácido urânico. Com a ação de HCI fervente, as pentasanas

resultam em furfural (Paturau, 1969).

Lignina: depois da celulose, a lignina é o composto orgânico mais

abundante dentre os materiais lignocelulósicos. Ela é composta basicamente

de unidades fenilpropano formando uma macromolécula tridimensional e

amorfa, representando cerca de 20 a 30% do total da madeira. O acoplamento

das unidades fenilpropano não ocorre de forma regular e repetitiva, o que é

atribuído ao mecanismo da biossíntese da lignina, que se processa via

radicalar a partir da reação de três diferentes álcoois cinamílicos precursores.

Os diferentes tipos de acoplamentos entre os precursores dão origem a vários

tipos de ligações entre as unidades fenilpropano. A mais abundantes são: p-0-4

e p-0-4, P-1 e p-5, 5-5 e p-p. A figura 2 mostra um modelo de estrutura de lignina. A lignina possui uma função estrutural no complexo celular da parede

de plantas superiores, agindo como uma cola que confere coesão ao conjunto

de células. A quantidade de lignina varia entre as diferentes espécies de

plantas superiores e também entre plantas da mesma espécie (Fengel e

Wegener, 1989). A lignina de bagaço de cana é do tipo HGS, típica de

gramíneas, segundo a classificação de Faix (1991 ).

2

O.!

-'\·

Figura 2. Modelo de uma estrutura de lignina de faia (Fagus sy/vatica) proposta

por Nimz (1974)

1.2 Bagaço de cana-de-açúcar A cana-de-açúcar, · uma gramínea perene . pertencente ao gênero

Saccharum, é originária da Índia e, com o decorrer do tempo, sua cultura

expandiu-se por várias regiões do mundo, e foi introduzida no Brasil logo após

seu descobrimento (Paiva, 1980).

A cana-de-açúcar (Saccharum officinarum) cresce na maioria dos países

tropicais e subtropicais e seu uso principal é na obtenção de açúcar e álcool.

Após moagem, o principal subproduto é o bagaço. Em muitas áreas do mundo

tem aumentado o valor econômico do bagaço, notadamente na produção de

polpa celulósica, papel e papelão. O bagaço parece satisfazer também os

requerimentos necessários para a obtenção de papel de impressão já que o

material cru é até melhor que outras fibras (Atchison, 1993).

3

As características, composição e disponibilidade do bagaço de cana têm

impulsionado diferentes grupos de pesquisas a desenvolver tecnologias

alternativas que viabilizem seu aproveitamento. A composição típica do bagaço

de cana in natura, determinada por um trabalho realizado na África do Sul é a

seguinte: celulose 45,3%, pentasanas 24, 1 %, lignina 22, 1 % e cinzas 1,6%

(Paturau, 1969). Como comparação a composição determinada no nosso

laboratório é a seguinte: glucana 43%, xilana 25%, grupos acetil 2%, lignina

Klason 20%, lignina solúvel em H2S04 1 %, extrativos 8%, cinzas totais 1 %

(Urbano e Gonçalves, 1996).

Os custos dos processos de colheita e lavagem do bagaço já são

incluídos ao processo de extração do açúcar, tornando assim as condições

econômicas excelentes para o processamento do bagaço como polpa moída.

As fibras do bagaço são finas, flexíveis e fortes e, portanto, úteis para a

manufatura do papel; no entanto, cerca de 30% da massa do bagaço consiste

de medula e células de parênquimas e cerca de 5% de material epidérmico

denso. Nenhum desses componentes é fibroso in natura e, se levado à

polpação, têm efeito negativo na qualidade do papel. Aproximadamente 50%

da massa do caule consiste de alta quantidade de feixe de fibras concentradas,

uma estrutura compacta que protege os reservatórios de açúcar. As fibras do

anel são camadas mais largas do que os elementos fibrosos no interior do

caule e mais resistentes a ação química, em comparação com a medula interior

da fibra; 15% da massa do caule consiste de feixe de fibras curtas de baixa

resistência e células de vasos.

As características dimensionais das fibras do bagaço são similares às de

madeiras de fibras curtas (folhosas ), porém são mais curtas do que madeiras

de fibras longas (coníferas). As características químicas do bagaço variam de

um país para o outro dependendo do solo e duração da estação de

crescimento (Atchison, 1993).

O Brasil possui uma vasta área de plantação de cana de açúcar e os

produtos principais são açúcar e etanol usado como combustível. A produção

de cana-de-açúcar foi relatada como sendo de 287x106 ton em 1998

(Matioli et ai., 1998) e, segundo cálculos de Lora et ai. (1997), a quantidade de

bagaço produzida é cerca de 15 % do total de cana colhida. Assim, o bagaço é

4

- ·--

produzido em quantidades acima de 40x106 ton/ano, mas a maior parte é

queimada para obtenção de energia para as destilarias de álcool (Armas e

Bianchi, 1990). No entanto, calcula-se que há ainda cerca de 1x106 ton/ano

de excesso (2,5% do total de bagaço) que causa sérios problemas de

estocagem e impacto ao meio ambiente e que pode ser aproveitado para fins

mais nobres. Esses valores podem ser ainda maiores como mostram os dados

da Copersucar: além do bagaço consumido nas próprias usinas de açúcar e

destilarias de álcool com fins energéticos para geração de vapor e energia

elétrica, ainda há um excedente médio de bagaço de 7 % em relação à

produção total do subproduto (Fornai, 1991 ). A possibilidade do uso da polpa

de bagaço para a produção de papel de jornal vem sendo estudada desde

1950 (Johnsrud et ai., 1987), mas muitos projetos fracassaram, mostrando que

o bagaço não é uma matéria-prima de fácil uso, em função do baixo

rendimento e da qualidade da polpa.

1.3 Estrutura e Ultraestrutura da parede da célula vegetal

Estruturalmente, a parede celular do vegetal é composta pela parede

primária e secundária e a lamela média (Essau, 1984). A parede primária

representa 15% do volume total da parede celular. As microfibrilas de celulose

são o principal componente da parede primária e estão organizadas em

lâminas formando uma armação cristalina que rodeia a célula (figura 38)

(Cowling e Kirk, 1976; Kollman e Côte, 1984).

5

e

MLHc

Figura 3. Estrututa da parede celular vegetal em célula do tipo traqueídeos (Ft).

A- Componente da parede celular, P1: parede prlmárla; P2: parede secundária

e as camadas 81, 82 e 83, ML: lamela média. 8- Disposição dos

componentes químicos da parede celular, Cm: microfibrilas de celulose, Hc:

hemicelulose (polioses), MLHc: matriz de lignina e polioses. Os elementos

fibrilares das microfibrilas estão formadas de celulose que apresentam regiões

cristalinas: ZC e amorfas: ZA. Adaptado de Cowling e Kirk, (1976) e Goring,

(1977).

As xiloglicanas formam parte da parede primária na mesma proporção que

a celulose. A parede secundária é o componente espesso formado por 60% de

celulose e 27% do seu volume é de lignina (Kollman e Côte, 1984);

ultraestruturalmente ela é composta de três camadas 81, 82 e 83 com

dilerentes orientação e espessura das microfibrilas de celulose (figura 3 8). A

82 é a camada de maior espessura, concentração e grau de polimerização da

celulose na parede celular ( Fujita e Harda, 1991, Saka, 1991 ).

A lamela média é uma camada fina que une as células vizinhas entre si,

composta por 60% de lignina, 14% de celulose, e taninos fortemente unidos a

proteínas estruturais (figura 3 A) (Fengel e Wegener, 1989; Kollman e Côte,

1984). 6

Em geral, a porcentagem de lignina na parede celular reduz-se

gradualmente em direção ao lúmen (Speranza, 1998).

1.4 Processos de separação dos constituintes do bagaço

Para a utilização dos diferentes componentes dos materiais

lignocelulósicos, uma separação seletiva é requerida. Isso implica na ruptura

do complexo lignina-carboidrato e na remoção de cada fração por técnicas de

pré-tratamento e deslignificação.

Os processos de separação dos componentes de materiais

lignocelulósicos podem ser térmicos, químicos, físicos, biológicos ou uma

combinação de todos esses, o que dependerá do grau de separação requerido .

e do fim proposto (Clark et ai., 1989; Cápek-Mênard et ai., 1992; Kokta e

Ahmed, 1992; Heitner et ai., 1993; Ferraz et ai., 1994, Silva, 1995; Reni e Silva,

1999 a e b; Maciel e Silva, 1999; Gravitis et ai, 1999; Consentino e Silva, 1999).

A separação química é feita em larga escala através da polpação. A

celulose e parte das polioses constituem o produto principal (polpa) sendo a

lignina um subproduto. A produção em larga escala de lignina é restrita à

indústria de polpa. Várias possibilidades de uso têm sido propostas para a

lignina, tais como a obtenção de fenóis, surfactantes e estabilizantes para

borracha (Chum eta/.,1985), quelantes (Oviedo, 1998, Gonçalves et ai., 1999)

e como matriz polimérica, tanto na forma in natura como em formas

modificadas, para obtenção de sistemas de liberação controlada de defensivos

agrícolas, como por exemplo herbicidas e pesticidas (Silva e Wilkins, 1992,

Ferraz et ai. 1997).

1.4.1 Processo de polpação Kraft O processo sulfato ou kraft teve grande desenvolvimento a partir de

1940 e hoje domina totalmente os processos de polpação. A principal

vantagem desse processo é a possibilidade de um sistema de recuperação dos

produtos químicos utilizados. Outro fator favorável é que o processo sulfato

pode ser utilizado tanto para madeiras de fibras longas (coníferas) como para

madeiras de fibras curtas (folhosas) e plantas anuais como bagaço de cana e

7

bambu. Os ciclos de cozimentos são mais curtos que os dos processos sulfito

ácidos e a pasta obtida pode ser branqueada a altos níveis de alvura. O

processo sulfato também apresenta vantagens como a produção de pastas de

alta resistência e a produção de valiosos subprodutos, como resina da polpa e

terebentina, no caso da utilização de madeiras resinosas. O processo também

apresenta algumas desvantagens como alto custo de investimento na

construção da fábrica, problemas de odor dos gases produzidos, baixa alvura

da polpa não-branqueada quando comparada com polpas sulfito, baixo

rendimento de polpação e alto custo de branqueamento (Assumpção et ai.,

1988; Biermann, 1993). A principal crítica quanto a esse processo está

relacionado com a contaminação do meio ambiente (Mendonça, 1997). O

processo sulfato é denominado também processo' kraft, devido às excelentes

características de resistência mecânica da celulose obtida (kraft provém do

alemão e significa "forte"). O kraft é um processo alcalino que tem como

agentes deslignificantes o hidróxido de sódio (NaOH) e o sulfeto de sódio

(Na2S), sendo que a adição deste último, produz íons hidrogenossulfeto (HS-)

que aceleram a remoção da lignina (aumento na velocidade de polpação)

resultando em uma polpa de melhor qualidade. Outros sais de sódio também

são encontrados no licor de polpação em menor quantidade, como carbonato

de sódio, tiossulfato de sódio, sulfito de sódio e silicato de sódio. Pequenas

quantidades de íons polissulfeto também estão presentes quando o enxofre

elementar é adicionado ao licor branco para manter a sulfidez alta (Assumpção

et ai., 1988; Biermann, 1993; Mimms et ai., 1993).

No processo kraft a deslignificação ocorre em 3 etapas bem definidas:

inicial, principal e residual (MacDonald e Franklin, 1969; Biermann, 1993;

Mimms et ai., 1993). Na etapa inicial a solubilização de lignina é pequena, da

ordem de 15 a 25% do total, dependendo da espécie de madeira e das

condições de cozimento. Nessa etapa, parte dos carboidratos é dissolvida e

cerca da metade da carga de álcali efetivo é consumida, neutralizando os

ácidos formados na dissolução de extrativos e na degradação de carboidratos.

Na etapa principal, ocorre a remoção da maior parte da lignina, havendo uma

ligeira diminuição da quantidade de carboidratos e da concentração de álcali no

licor. Na etapa residual, a quantidade de carboidratos decresce

8

- ·-

significativamente, acompanhada por um aumento no consumo de álcali,

enquanto a velocidade de deslignificação diminui. Portanto, um cozimento

alcalino ideal não deve atingir o estágio de deslignificação residual, pois

haveria prejuízo quanto ao rendimento. Com coníferas, a etapa final inicia-se

geralmente com teores de lignina residual entre 2,5 e 3%. Na prática industrial

para a produção de polpas branqueáveis de madeira moles (coníferas),

evita-se atingir teores de lignina inferiores a 4 ou 5% ( 45 a 50% de rendimento)

correspondentes a números kappa entre 26 e 33. A deslignificação de

madeiras duras (folhosas) é mais rápida que coníferas, e a etapa de

deslignificàção residual é atingida em níveis mais baixos de lignina, permitindo,

na maioria dos casos, cozimentos até teores de lignina de 2% sem efeitos

danosos ao rendimento da qualidade da polpa (Assurnpção et ai., 1988).

Na polpação kraft do bagaço de cana é prevista uma redução na

porcentagem de lignina de 20% a cerca de 3% no final do processo. Essa

lignina residual ou recalcitrante não é desejável pois escurece o papel e exige

um processo de branqueamento mais drástico, com o uso de oxidantes fortes

(Cl2, CI02, 02, 03, H202, etc). A lignina residual em polpa kraft não branqueada

é altamente modificada por reações de condensação alcalina. As polpas

branqueadas são obtidas removendo-se a lignina residual por uma série de

tratamentos baseados principalmente em compostos de cloro e os efluentes

desses processos de branqueamento contêm numerosas substâncias

orgânicas cloradas que têm mostrado uma atividade mutagênica (Fujita et ai.,

1993).

1.4.1.1 Terminologias empregadas no processo de polpação kraft

Na polpação alcalina, segundo a norma TAPPI, empregam-se as

definições relacionadas a seguir. De um modo geral, na América do Norte

(Estados Unidos e Canadá), os compostos são expressos em base de Na20

equivalente, enquanto que na Europa, principalmente países escandinavos, os

compostos são reportados em base da quantidade de NaOH equivalente. No

Brasil o padrão empregado varia de uma fábrica para outra, podendo ser

empregada tanto uma relação quanto outra (Assumpção et ai., 1988).

9

Álcali total titulável (AT): soma de todas as bases no licor branco que podem

ser tituladas com ácido forte.

Álcali ativo (AA): soma dos ingredientes ativos no licor de polpação kraft.

AA = NaOH + Na2S

Álcali efetivo (AE): soma dos ingredientes que produzem OH nas condições

de polpação.

AE = NaOH + % Na2S

Freqüentemente têm-se AA e AE e para calcular as concentrações individuais

usa-se a relação:

Na2S = 2(AA-AE)

sulfidez: a razão ( em % ) entre o teor de Na2S e o teor de álcali ativo.

SULFIDEZ = Na2S X100% NaOH+Na2S

Causticidade: a razão (em%) entre o teor de NaOH e o teor de álcali ativo.

CAUSTICIDADE= NaOH X100% NaOH+Na2S

Sulfidez + Causticidade = 100%.

álcali ativo Carga de ãlcali ativo : CAA = X100% massa bagaço seco

10

álcali efetivo Carga de álcali efetivo: CAE = X100% massa bagaço seco

1.4.2 Polpação Acetosolv Como processo alternativo, os processos organosolv de polpação têm

recebido uma atenção significativa nos últimos 20 anos (Aziz e Sarkanen,

1989; Vázquez et ai., 1995; Benar, 1992; Curvelo e Pereira, 1995; Baeza

et a/.,1999 a e b). Dentro da polpação Organosolv destaca-se o processo

Acetosolv, que consiste no cozimento com ácido acético de madeiras e outros

materiais lignocelulósicos, cujas polpas são semelhantes às obtidas nos

processos convencionais (Benar e Schuchardt, 1991; Nimz e Casten, 1986). O

processo Acetosolv foi adaptado para a polpação do bagaço de cana com

excelentes resultados (Benar, 1992). O objetivo é utilizar solventes orgânicos

(ou misturas de solventes) como nucleófilo para a remoção da lignina. Uma

grande vantagem desse tipo de processo é a reutilização do solvente e a

obtenção da lignina com alta pureza que pode ser utilizada de forma mais

nobre.

O desenvolvimento de processos conhecidos como Organosolv pode em

grande parte colaborar com a diminuição do impacto ambiental causado por

processos de deslignificação convencionais, além de possibilitarem um uso

integral dos componentes dos materiais lignocelulósicos e apresentarem

vantagens quanto ao baixo capital de investimento e a possibilidade de

instalação de plantas para produção em pequena escala (Aziz e Sarkenen,

!989, Mac Donald e Franklin, 1969, Bendzala e Kokta, 1995).

1.4.3 Separação alternativa Uma possibilidade promissora na separação dos constituintes dos

materiais lignocelulósicos é a combinação de processos, por exemplo,

utilizando um pré-tratamento biológico seguido da polpação química. O

processo biológico é baseado na utilização de microrganismos (fungos e

bactérias) capazes de produzir enzimas envolvidas principalmente na

degradação da lignina. Tais microrganismos podem promover uma

deslignificação parcial dos materiais lignocelulósicos, com concomitante perda

11

de outras frações em diferentes intensidades, dependendo do microrganismo

empregado.

Os desafios principais a serem vencidos para utilização desse tipo de

processo são relacionados com o aumento .da seletividade dos microrganismos

para degradar preferencialmente ou exclusivamente a lignina, reduzindo, desta

forma, as perdas das frações desejáveis, com o aumento da atividade

ligninolítica.

1.5 Aplicação da biotecnologia na indústria de polpa Uma revisão recente da literatura mostra diversas possibilidades de

aplicação da biotecnologia na indústria de polpa e papel (Ferraz, 1999, Ferraz

et ai., 1998), desde o uso da engenharia genética para a obtenção de mudas de

árvores mais resistentes e de melhor produção, até o uso de microrganismos

degradadores de lignina na polpação e no branqueamento. As indústrias

continuam a desenvolver novas tecnologias de biobranqueamento com o intuito

de eliminar o uso do cloro, investigando processos de branqueamento da polpa

kraft com fungos de decomposição branca (Bourbonnais e Paice, 1996). As

propriedades ópticas e mecânicas e o rendimento das polpas biobranqueadas

são comparáveis com as polpas convencionalmente branqueadas, resultando

em um consumo significativamente menor de cloro (Fujita et ai., 1993).

Outra aplicação da biotecnologia na indústria papeleira envolve o uso de

celulases e hemicelulases na reciclagem de papel. As enzimas atuam

hidrolisando parcialmente a celulose e as polioses, o que facilita

consideravelmente a flotação dos pigmentos na etapa de destintamento. Uma

das mais antigas aplicações da biotecnologia na indústria papeleira é o

tratamento de efluentes em lagoas aeróbias (Ferraz, 1999). Esses efluentes

contêm principalmente produtos originados da lignina, o que levou a uma

grande expansão da pesquisa relacionada à biodegradação da lignina. O bagaço de cana-de-açúcar é um substrato complexo mas que também

pode ser eficientemente biodegradado, especialmente por fungos de

decomposicão branca (Zadrazil e Puniya, 1995, Esposito et ai., 1995,

Esposito et el., 1996, Gao et et., 1996, Breccia et el., 1997).

12

1.6 Fungos de decomposição branca

A maioria dos fungos de decomposição branca pertence à classe dos basidiomicetos. Os fungos dessa classe degradam a celulose, polioses e

lignina, sendo alguns deles degradadores seletivos de lignina.

Os fungos de decomposição branca têm a habilidade para deslignificar

os materiais lignocelulósicos ou degradar as ligações lignina-carboidrato; a

porcentagem de lignina removida neste pré-tratamento pode ser pequena ( da

ordem de 2% ), mas o resíduo é menos recalcitrante o que pode facilitar o

processo de branqueamento, sendo menos prejudicial ao meio ambiente.

Vários fungos têm sido propostos para a deslignificação de bagaço de

cana-de-açúcar. Breccia et ai. (1997) fizeram um estudo sistemático com 42

fungos de decomposição branca. Nesse trabalho foram determinadas as

composições do bagaço antes e após a degradação com 30 e 60 dias e foi

calculada a razão de lignina residual por celulose residual (RURC) para as

amostras do bagaço tratado e não tratado. Os fungos que apresentaram os

melhores resultados na degradação da lignina foram Phanerochaete

chrysosporium, Punctularia artropurpurascens, Trametes versicolor, Athelia sp,

Phebia sp, Ganoderma applanatum, Spongypellis pachyodon, Hyphodontia sp

e Panus tigrinus. Os fungos desse tipo de decomposição colonizam o material pelas vias

anatômicas de mais fácil acesso e menor resistência e movem-se por áreas

com nutrientes mais facilmente assimiláveis. As células parenquimais de raio

são normalmente as primeiras a serem atingidas e, a partir delas, as hifas

movimentam-se pelo lúmen em direção à parede celular e lamela média

(Fengel e Wegener, 1989; Blanchete et al.,1992; Messner e Srebotnik, 1994;

Shimada, 1996). A biodegradação da lignina por esse tipo de fungo tem início e

é mais intensiva na parede celular secundária das células e é progressiva até

atingir a lamela média. Os mecanismos de colonização e invasão do lúmen das

células da madeira são conhecidos devido aos estudos por microscopia

eletrônica (Daniel, 1994; Evans et ai., 1994; Blanchette et a/., 1997; Speranza,

1998).

13

Uma propriedade comum aos fungos de decomposição branca é a

capacidade de oxidação de compostos fenólicos e não-fenólicos relacionados

com a lignina, devido à atividade de suas enzimas ligninolíticas extracelulares (Blanchette, 1991; Blanchette et ai., 1997, Ortega et ai., 1993). A produção e as

características de enzimas ligninolíticas e. hemicelulolíticas têm sido bastante

estudadas nos útimos tempos (Prasad et ai., 1996 a e b; Pessoa et ai., 1997;

Abd EI-Nasser et el., 1997, Cazemier et ai., 1999; Bium et ai., 1999; Kang et ai.,

1999).

1. 7 Enzimas Ligninolíticas e Hidrolíticas Dentre o vasto arsenal de enzimas extracelulares degradadoras de

lignina, particularmente o grupo das fenoloxidasés é tido como o de maior

importância (Hatakka, 1994; Peláez et ai., 1995; Tuor et el., 1995; Pai

et ai., 1995). Fazem parte desse grupo as enzimas lignina peroxidase (LiP),

rnanqanês-peroxidase (MnP) e lacase (Lac) que estão diretamente envolvidas

na degradação da lignina. Dada sua baixa especificidade as enzimas oxidativas

como as peroxidases atuam sobre uma ampla gama de substratos de difícil

degradação.

A lacase (EC 1.10.3.2, benzenodiol: oxigênio oxi-redutase) representa

um grupo de enzimas encontradas principalmente em fungos e plantas

superiores, onde são abundantes. A maioria das diferentes lacases conhecidas

(provenientes de diferentes fontes) apresentam massa molar (MM) de 60 a

70 kDa, sendo conhecidas lacases no intervalo de 60 a 100 kDa (Thurston,

1994). Possuem uma estrutura de glicoproteína com conteúdo relativo de

carboidrato variando de 15 a 20 % (Thurston, 1994). Todas as lacases

conhecidas contêm cobre no seu sítio ativo, sendo em geral 4 átomos de cobre

por molécula, os quais apresentam número de oxidação +2. Tais átomos de

cobre estão diferentemente coordenados, podendo assim ser distinguidos três

tipos ou estados de coordenação denominados 1, li, Ili, sendo esse último constituído por um par de átomos de cobre (Messerschmidt e Hubert, 1990;

Reinhammar, 1984; Thurston, 1994).

A lacase é tipicamente uma oxidase que catalisa reações de oxidação, na ausência de H202, utilizando 02 como oxidante, o qual é reduzido a H20

14

num processo de oxidação envolvendo no total quatro elétrons (Kirk e Farrel,

1987; Thurston, 1994). Essa enzima não apresenta uma especificidade muito

estrita quanto à estrutura do substrato, podendo catalisar a oxidação de uma

grande variedade de estruturas aromáticas, especialmente estruturas fenólicas,

como mono-, dl-, poli- e metoxifenóis. Estudos mais recentes demonstraram

que a lacase também foi capaz de degradar estruturas não fenólicas na

presença de mediadores específicos (Bourbonnais e Paice, 1990; Johannes et

ai., 1996). O mecanismo de oxidação do substrato é pela retirada de um elétron

com formação inicial de um radical cátion, o qual, subseqüentemente, pode

reagir através de mecanismo não enzimático (figura 4) (Bourbonnais e Paice,

1990, Kersten et ai., 1990, Thurston, 1994, Tuor et ai., 1995).

Neste caso são freqüentes as reações de acoplamento radical-radical,

desproporcionamento, retirada de próton e ataque nucleofílico pela molécula de

H20, resultando em polimerização, clivagem de ligações tipo alquil-aril,

oxidação no carbono a e desmetoxilação das estruturas fenólicas (Hatakka,

1994; Kirk e Farrel, 1987).

R,

O, +46 == fü~R,-

OH

~. ~~rno

o

! R'

Reações. não.en~ticas* pollrrlenzaçao

R2 R., o.

> /~. À R2~R,

o

Figura 4- Representação de uma reação típica catalisada por lacase.

R1 = cadeia propânica, R2 e ~ = H ou OCH3

Diversos estudos com substâncias modelos de subestruturas de lignina

mostram que as lacases podem catalisar a clivagem de ligações tipo Ca-Cí3

das cadeias laterais. de estruturas ditnéricas tipo (3-1 e (3-0-4 15

(Kawai et ai., 1988), bem como catalisar a clivagem de anéis aromáticos de

estruturas como 4,6-di(tert-butil)guaiacol (Kawai et ai., 1988). Esses resultados

demonstraram que as lacases podem degradar e despolimerizar a lignina.

A lignina peroxidase (LiP) constitui um grupo de glicoproteínas contendo

um grupamento heme [Fe(lll)-protoporfirina IX] como grupo prostático por

molécula. Requer H202 para sua atividade catalítica e apresenta massa molar

em torno de 38-43 kDa (Kirk e Farrel, 1987; Kuwahara et ai., 1984; Tuor et ai., 1995).

Durante o ciclo catalítico, o ferro contido no grupamento heme da LiP

passa por etapas de reações de oxi-redução (figura 5). A oxidação do Fe(III) da

enzima nativa para Fe(IV) se dá através da ação do peróxido de hidrogênio,

formando o composto 1. A redução do composto I via transferência de um

elétron forma o composto li. O agente redutor pode ser álcool veratrílico ou

peróxido de hidrogênio. A redução via um elétron retorna a enzima a seu

estado nativo, completando o ciclo catalítico. Na ausência do substrato redutor,

o composto li é oxidado pelo peróxido de hidrogênio, formando o composto Ili

(uma forma de LiP com capacidade catalítica limitada), que com excesso de

peróxido de hidrogênio é rapidamente inativado (Cai e Tien, 1993; Schoemaker

et ai., 1994; Barr e Aust, 1994; De-Jong et ai., 1994 ).

H20 H202 ~ composto I

Fe~~~ ~ ~:: O(P~.)

AH FeIV =O A.•

comf:; (excesso) Fe III 02 .:!.

composto Ill

Figura 5- Ciclo Catalítico da Enzima Lignina Peroxidase. A• substrato· na

forma radicalar; AH representa um substrato aromático; o qual age como

doador de elétrons para o grupamento heme; O(P:) enzima com átomo de

oxigênio na forma de radical cátion.

16

A enzima lignina peroxidase catalisa reações de uma variedade de

compostos modelo de lignina não fenólicos (Kirk e Farrel, 1987; Buswell e

Odier, 1987; Gold et ai., 1989; Higuchi, 1990; Schoemaker, 1990; Valli e Gold,

1991; Valli et ai., 1992) bem como lignina sintética (Hammel e Moen 1991 ).

Essas reações incluem oxidações de álcool benzílico, clivagem de cadeia

lateral, reações de abertura do anel, desmetoxilações e desclorinação

oxidativa. Todas essas reações são relacionadas com mecanismo envolvendo

a retirada inicial de um elétron do núcleo aromático, formando um radical cátion

arila, e esse pode sofrer várias reações não enzimáticas, formando outros

produtos (Reneganathan et ai., 1985; Marquez et ai., 1988; Schoemaker,

1990).

A MnP (peroxidase-manganês dependente, EC.1.11.1. 7) é uma heme-

enzima e a maioria de suas propriedades estruturais são semelhantes às da

LiP. É uma glicoproteína de massa molar em torno de 45-47 kDa contendo

também um grupamento prostético tipo Fe(lll)-protoporfirina IX. A diferença é

que, além de H202, essa peroxidase requer Mn +2 como cofator e sua atividade

é potencializada ou estabilizada por um derivado de a.-acetoácido, como

lactato, malonato e outros (Mester et ai., 1995; Moilanen et ai., 1996; Perez e

Jeffries, 1992).

H20 }L(h .L composto l

Felll~ k, ~:::o(P+~AH A,~ Mnll FeIV -o Mnlll X.A.

) composto II

AH -~ H,O, (excesso)

t'-1-120 Fe III 02 s

composto III

Figura 6-. Ciclo Catalítico da Enzima Manganês-Peroxidase. AH substrato

doador de elétrons; A• radical do substrato; O(P.+) enzima com átomo de

oxigênio na forma de radical cátion. 17

Seu ciclo catalítico é semelhante ao da LiP (figura 6), com formação de

composto 1, li, Ili (Wariishi et ai., 1988). Porém nesse caso, ocorre a oxidação

de Mn(II) para Mn(III), que atua como espécie ativa nos processos de oxidação

catalisados por MnP (Kuwahara et ai., 1984). Devido a alta reatividade de

Mn(III), a disponibilidade para oxidar os substratos de MnP depende da

presença de ácidos orgânicos que atuam como quelantes de Mn(III), formando

um complexo mais estável de alto potencial de oxi-redução (Moilanen et ai.,

1996; Perez e Jeffries, 1992). Como consequência, o potencial de oxi-redução

do sistema oxidante é diferente do apresentado pela LiP, determinando

diferenças na especificidade entre as duas enzimas, com relação às estruturas

aromáticas dos substratos. Assim por exemplo, MnP oxida apenas estruturas

fenólicas, mas, por outro lado, a inativação de MnP por H202, via formação do

composto Ili, parece requerer concentrações mais altas de peróxido, indicando

uma maior estabilidade dessa enzima (Wariishi et ai., 1988). O fato de que

essa enzima oxida apenas estruturas fenólicas impõe uma limitação a sua

capacidade de degradar integralmente lígninas de alta massa molar (Kirk e

Farrel, 1987; Owens, 1991 ).

Devido a heterogeneidade das xilanas, sua hidrólise requer um conjunto

de isoenzimas para a sua degradação que pode ser visto na figura 7

(Coughnlan e Hazzewood, 1993, sunna e Antranikian 1997).

As endo-!3-1,4-D-xilanases são enzimas que atuam sobre a xilana

produzindo grandes quantidades de xilo-oligossacarídeos substituídos e não

substituídos de diversos tamanhos (figura 7). As exo-13-1,4-D-xilanases atuam

removendo somente unidades de xilose a partir das extremidades da cadeia de

xilana. As !3-xilosidase hidrolisam dissacarídeos como xilobiose e

xilo-olígossacarídeos maiores até xilose. Algumas xilanases produzidas pelo

fungo Penicillium janthinellum por exemplo apresentam massa molar de

20 kDa e 50 kDa ( Milagres e Lacis, 1991, Milagres et ai., 1993, Rodrigues,

1997).

18

o;-4-0-Me-GlcA

IACETIL(XILAN.\IES'IERASE I

que visam a produção e recuperação de enzima em larga escala são de

grande relevância (Milagres e Duran, 1992).

1.8 Utilização de PCA na seleção de cepas com capacidade ligninolítica e

hidrolítica

Em estudo recente, Gonçalves et ai. (1998) propuseram o uso da

espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) como

técnica auxiliar para seleção de cepas de Panus tigrinus que atuam no bagaço

de cana-de-açúcar, em conjunto com determinações das atividades

enzimáticas de MnP, t.ac e LiP e o monitoramento da ação fúngica sobre o

bagaço, utilizando microscopia eletrônica de varredura. A espectroscopia no

infravermelho é uma técnica muito utilizada na identificação de compostos

orgânicos (Silverstein et ai., 1979); a porção de mais utilidade para os químicos

orgânicos está situada entre 4000 e 666 cm" (2,5 a 15,0 µm), mas até

moléculas simples podem produzir espectros extremamente complexos. Os

espectros de compostos desconhecidos são comparados ao de uma amostra

conhecida, e a correlação pico a pico constitui boa· identidade, \Visto ser pouco l.-

provável que dois compostos diferentes tenham o mesmo espectro no

infravermelho, à exceção de pares enancioméricos. É a presença de bandas características de grupos que permite a obtenção, através de simples exame

do espectro e consulta a tabelas, de informações estruturais úteis.

Já no caso de moléculas mais complexas, como é o caso dos

constituintes dos materiais lignocelulósicos, a simples comparação de

espectros não resulta necessariamente em identificação. Isso mesmo quando

os espectros são obtidos com alta resolução, em equipamento interferométrico

e tratados com transformadas matemáticas (FTIR).

Os conjuntos de espectros FTIR de materiais lignocelulósicos são

melhor avaliadas pela Análise por Componentes Principais (PGA), cujo

fundamento é reduzir as várias informações contidas nos espectros

(absorbância X número de onda) em um número pequeno de vetores

(componentes principais) que expliquem a maioria dessas informações. Esse

tipo de análise foi empregada recentemente para a classificação de ligninas de

20

diferentes origens (Cotrim et ai., 1999) e no acompanhamento da

hidroximetilação de ligninas (Benar et ai., 1999).

Nesse estudo de seleção de cepas do Panus tigrinus (Gonçalves et ai.,

1996, Gonçalves et ai., 1998) foi também utilizada a análise química das

amostras de bagaço antes e após tratamento, bem como das polpas obtidas

dessas amostras. A análise química baseia-se na hidrólise das amostras e

quantificação dos componentes macromoleculares. A maior parte da lignina

não é hidrolisada e é quantificada por gravimetria. Na fração líquida

(hidrolisado) quantifica-se a lignina solúvel por espectroscopia na região de

UV-visível (Goldschimd, 1977) e os carboidratos derivados da celulose e

hemicelulose por cromatografia líquida de alta eficiência.

No estudo citado (Gonçalves et ai., 1998) foram utilizadas sete cepas de

P. tigrinus e selecionadas três (FTPT-4741, FTPT-4742 e FTPT-4745) como as

mais promissoras para a deslignificação do bagaço de cana como um

pré-tratamento para uma posterior polpação química.

2. OBJETIVOS O objetivo principal desse trabalho é a avaliação de um pré-tratamento

biológico do bagaço de cana-de-açúcar com o fungo ligninolítico Panus tigrinus,

que antecede a polpação convencional kraft e a polpação alternativa

Acetosolv.

Para atingir este objetivo foram propostas as seguintes etapas: - Avaliação do pré-tratamento fúngico em relação ao regime estacionário e

agitado.

- Estudo das atividades enzimáticas e sua correlação com a eficiência da

biodeslignificação do bagaço de cana por P. tigrinus.

- Estudo da polpação química do bagaço pré-tratado e determinação das

propriedades da polpa.

- Monitoramento da ação fúngica sobre as fibras do bagaço por microscopia

eletrônica de varredura e FTI R.

21

3. PARTE EXPERIMENTAL

3.1 Fungos: Foram utilizadas três cepas de Panus tigrinus FTPT -47 41,

FTPT-4742 e FTPT-4745 cedidas gentilmente. pela professora Mariela

Speranza (Faculdade de Ciências Biológicas, Universidade de La República-

Uruguai) e preservadas na Fundação Tropical de Pesquisa e Tecnologia André

Tosello (Campinas, SP, Brasil). Essas linhagens foram mantidas em ágar

extrato de malte 4% a 28ºC durante 5 dias. Elas foram selecionadas a partir de

resultados obtidos previamente ( Gonçalves et ai., 1998).

3.2 Bagaço de cana-de-açúcar: Foi utilizado o bagaço de cana-de-açúcar

desmedulado e previamente caracterizado, contendo 51 % de glucana, 23% de

polioses, 2% de grupos acetil, 21 % de lignina Klason, 1 % de lignina solúvel em

H2S04 e 3% de cinzas. O tamanho médio das partículas do bagaço utilizado

foi de 2, 1 cm de comprimento e O, 12 cm de largura.

3.3 Condições de cultura: As culturas de fermentação em meio semi-sólido

foram realizadas em duas séries.

Série 1: Nesta primeira série os experimentos foram realizados em triplicatas

utilizando-se Erlenmeyer de 250 ml sob agitação a 150 rpm por 1 O dias a

30ºC. O bagaço de cana-de-açúcar foi 'suplementado a uma concentração de

6% (m/v) somente com 1 ml de solução de sais [NaN03 (2 g/L), K2HP04

(1 g/L), MgS04 (0,5 g/L). KCI (0,5 g/L) , CaCb (0,3 g/L), CuS04.5H20 (O, 10

mg/L), FeS04.7H20 (0,20 mg/L), MnS04 (0,02 mg/L), z-ci, (O, 15 mg/L)] e 49 ml de água destilada. Nenhuma outra fonte adicional de carbono foi utilizada.

O meio foi esterilizado por autoclavagem a 121 ºC durante 20 min.

Série 2: As fermentações foram realizadas em duplicatas e conduzidas em

sistemas sob agitação e estacionário. Foram realizados experimentos sob

agitação constante utilizando-se 6 g de bagaço em frascos Erlenmeyer de 250

ml. Em sistema estacionário foram realizados experimentos utilizando-se 6 g

de bagaço em frascos Erlenmeyer de 250 ml e também experimentos

utilizando quantidades maiores de bagaço (100 g) em bolsas de polipropileno.

Nas bolsas foram adicionados 17 ml da solução de sais e 816 ml de água

destilada. A solução de sais adicionada aos experimentos da série 2 foi uma

22

solução com um número reduiid,b de sais (CaCb (0,3 g/L), (NH4)2HP04 (2g/L),

FeCI (0,2 mg/L), KH2P04, MgS04( 0,5 g/L). O bagaço nas bolsas foi incubado

por 30 dias. O meio foi esterilizado por autoclavagem durante 30 min a 121 ºC.

Nessa série 2 o bagaço de cana-de-açúcar foi suplementado a uma concentração de 5% (m/v).

O procedimento experimental do cultivo do Panus tígrínus no bagaço de

cana-de-açúcar e análise do bagaço biodegradado e do controle foi

esquematizado nas figuras 8 e 9.

r- 49 ml de água destilada f 1 ml de solução de sais (NaN03, MEIO DE CULTURA~ K2HP04, MgS04, KCI, CaCl2,

CuS04.5H20, FeS04.7H20, MnS04, ZnCl2)

,.~;: ~ ~~:- 6 g de bagaço

Autoclave por 20 min.121°C

+ 50 ml do caldoô

contendo as cepas . FTPT 4741 FTPT 4742 ..... FTPT 4745 - ...

...

INÓCULO

Bagaço pré-tratado

+ t gAnálise química FTIR MEV . Caldo filtrado Ri Atividade LJI enzimática Figura 8. Fluxograma de todo procedimento experimental (série 1 ).

23

49 mL H20 + 1 mL de solução

(CaCl2, (NH4)2HP04, FeCI, KH2P04, MgS04)

6 g de bagaço

Agitação (série 2)

Autoclave por 20 min, 121ºC

ontrole

10 dias

13 placas contendo fungo 1866 mL H20

+ + bagaço i

+ Caldo filtrado

Atividade Análise química enzimática FTIR

17mL de solução de sais+ 816 mL de H20

i 100 g de bagaço

Polpação Rendimento kraft Número Kappa

Viscosidade FTIR

Controle

30 dias

1

o Caldo filtrado

Atividade enzimática com 10 dias e com

30 dias (antes e após a diálise)

OBS: Para as bolsas a polpação Acetosolv foi realizada em escala ampliada e foi feita a medida das propriedades óptico-mecânicas

da polpa

Pigura 9~ Fluxograma de todo procedimento experimem~(§érie 2).

24

3.4 lnóculo: Para a primeira série de experimentos sob agitação, o inóculo foi

preparado retirando-se o micélio submerso . de duas placas contendo

Panus tigrinus, e triturando-o em 50 ml de água destilada esterilizada. Uma

alíquota de 50 ml desse caldo obtido foi adicionado aos frascos Erlenmeyer

contendo o bagaço de cana, que foram mantidos nas condições descritas no

item 3.3. Para os experimentos da série 2, 13 placas contendo

Panus tigrinus foram trituradas em 1866 ml de água destilada e esterilizada;

do caldo obtido foram adicionados 833 ml em cada bolsa e 50 ml em cada

Erlenmeyer. As bolsas e frascos Erlenmeyer foram mantidas nas condições

descritas no item 3.3. Para as duas séries, os bagaços autoclavados (item

3.3) nos frascos e bolsas sem inóculo serviram de controle do processo.

3.5 Avaliação das Atividades Enzimáticas: Após fermentação, o extrato líquido foi separado do bagaço, filtrado a vácuo em membrana Millipore

(OA7µm) para determinação das enzimas presentes, recuperando-se cerca de

50 ml de caldo nos frascos Erlenmeyer de 100 ml e cerca de 500 ml nas

bolsas de 1666 ml. O pH do extrato líquido foi ·medido em um potênciometro

Metrohm 632 pH Meter com eletrodo de vidro e foi cerca de 4,2. As atividades

da lignina peroxidase (LiP) (Tien e Kírk, 1984), manganês-peroxidase (MnP)

(Kuwahara et ai., 1984), lacase (Lac) (Szklarz et ai., 1989) e xilanase (Xyl)

(Bailey et ai., 1992) foram determinadas por métodos publicados. Foram

medidas as atividade enzimáticas dos extratos obtidos das duas séries após

1 O dias e para as bolsas, o sistema de fermentação foi mantido até 30 dias,

uma vez que o crescimento fúngico foi demorado. Com o extrato líquido das

bolsas após 30 dias de incubação foram feitas as medidas de atividades

enzimáticas antes e após diálise, nas condições descritas no item 3.6. Foram

medidas as atividades enzimáticas nos controles e descontados os valores.

25

3.5.1 Lacase (Lac): A atividade de lacase foi determinada segundo

metodologia descrita por- Szklarz e/ ai. (1989). A 600 µL do caldo enzimático

foram adicionados 300 µL de tampão citrato-fosfato 50 mM pH=5,0, 100 µL de

o-dianisidina 1 mM e a absorbância foi lida a 11,=460 nm (s=29400 M-1cm-1),

durante 1 O min em um espectrofotômetro UV/visível GBS-Cintra 20. Uma

unidade de atividade enzimática de Lac foi definida como a quantidade de

µmoles de o-dianisidina oxidado L-1 min".

3.5.2 Lignina peroxidase (LiP): Para determinação da enzima lignina

peroxidase foi utilizado o método modificado de Tien e Kirk (1984), baseado na

oxidação do álcool veratrílico a aldeído veratrílico na presença de peróxido de

hidrogênio. A reação foi acompanhada durante 5 min a 310 nm

(s=9300 M-1cm-1) em um espectrofotômetro UV/visível GBS-Cintra 20. A 250 µL

do caldo enzimático foram adicionados 125 µL de álcool veratrílico 4,0 mM,

50 µL de H202 0,4 mM, 375 µL de tampão tartarato de sódio 0,33 mM a pH=3,0

e 450 µL de água destilada. Uma unidade de atividade enzimática de LiP foi

definida como sendo a quantidade de enzima necessária para oxidar 1,0 µmal

de substrato L-1min-1.

3.5.3 Manganês-peroxidase (MnP): A atividade manganês-peroxidase foi

determinada pelo método de Kuwahara et ai. (1984) e baseia-se na oxidação

do vermelho de fenol em presença de Mn(II) e peróxido de hidrogênio. A

absorção foi medida a 610 nm (s= 4460 M-1cm"1) em um espectrofotômetro

UV/visível GBS-Cintra 20. A 500 µL do caldo filtrado foram adicionados 100 µL

de solução de vermelho de fenol O, 1 %, 100 µL de lactato de sódio 250 mM,

200 µL de albumina bovina 0,5%, 50 µL de sulfato de manganês(II) 2 mM,

50 µL de tampão succinato de sódio/ H202 20 mM a pH = 4,5. O volume final

foi 1 ml. A mistura de reação foi incubada por 5 min a 30ºC e a reação foi

interrompida pela adição de 40 µL de NaOH 2 N. Uma unidade de atividade

enzimática de MnP foi definida como a quantidade de enzima que oxida 1,0 µmal de vermelho de fenol L''rnin".

26

3.5.4 Xilanase: A atividade de xilanase extracelular foi determinada pela medida da quantidade de açúcares redutores liberados a partir de xilana, de

acordo com o método de Bailey et ai. (1992). Os açúcares redutores foram

dosados pelo método do ácido 3,5-dinitrossalicílico (DNS) (Miller, 1959). Uma

unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de enzima

necessária para produzir 1 µmol de xilose por minuto a 50ºC. A solução de

xilana foi preparada a partir de 1 g de xilana ("Birchwood"- Sigma) adicionada

em 80 ml de tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,5. A solução foi aquecida

sob agitação e o volume completado para 100 ml com o mesmo tampão.

Um volume de 900 µL de xilana 1 % foi colocado em tubos de ensaio que

foram incubados em banho termostatizado, à temperatura de 50°C por 5 min.

Em seguida, acrescentaram-se 100 µL das amostras contendo enzima. Após

5 min, adicionou-se 1,5 ml de DNS para dosagem dos açúcares liberados,

sendo a mistura aquecida em banho de água fervente por 5 min. A reação foi

interrompida em banho de água à temperatura ambiente e as leituras foram feitas a 540 nm em um espectrofotômetro Shimadzu modelo UV-150-02. As

leituras de cada amostra foram feitas utilizando-se tampão acetato de sódio

50 mM a pH 5,5 e DNS como referência.

Para detectar as unidades redutoras provenientes da hidrólise

enzimática da xilana, foram utilizados dois controles. O primeiro, denominado

controle do substrato, continha a xilana sem a ação da enzima. O segundo,

denominado controle da enzima, foi constituído de tampão acetato, meio

fermentado contendo a enzima e o DNS, para detectar a presença de açúcares

redutores do próprio meio fermentado. Das leituras obtidas com as amostras,

foram descontadas as absorbâncias verificadas nos controles ( enzima e

substrato). A curva padrão foi estabelecida a partir de xilose (Merck) nas

concentrações entre 2 e 1 O µmol/ml.

3.6 Diálise: 20 ml do extrato provenientes da fermentação em bolsas por 30 dias foram dialisados utilizando membrana celulósica de corte 12 kDa, com

diâmetro de 21 mm e capacidade de 11 O ml contra solução tampão de

acetato de sódio de concentração 50 mM pH= 5,5 durante 12 h a 4ºC.

27

Dos extratos dialisados foram medidas as atividades enzimáticas pelos

métodos descritos no item 3.5.

3. 7 Análise química da composição do bagaço: A fração principal de lignina

foi determinada por gravimetria pelo método Klason (ASTM, 1956) após

hidrólise com H2S04 72%. O bagaço foi seco a 60ºC por 40 min e moído a

40 mesh (0,42 mm). Amostras de 1 g de bagaço foram secas, pesadas com

precisão de O, 1 mg e transferidas para béqueres de 100 ml e tratadas com

5 ml de H2S04 72 %, sobre vigorosa agitação, em banho termostatizado a

45 ± 0,5ºC por 7 min. As reações foram interrompidas com adição de 25 ml de água destilada. As amostras foram transferidas para frascos Erlenmeyer de

250 ml, elevando-se o volume de água a 137,5 ml.

Para a completa hidrólise dos oligômeros restantes, os frascos

Erlenmeyer foram fechados com papel alumínio e autoclavados por 30 min a

1,05 bar. Após a descompressão da autoclave, os frascos foram retirados e

resfriados à temperatura ambiente, sendo a mistura reacional filtrada e os hidrolisados transferidos e avolumados com água destilada em balões

volumétricos de 250 ml.

Os materiais retidos no papel de filtro previamente tarado (lignina

Klason) foram lavados com aproximadamente 900 ml de água destilada e

secos em estufa a 105±3ºC até massas constantes.

As quantidades de lignina solubilizadas em meio ácido foram

determinadas segundo a metodologia desenvolvida por Rocha et a~. (1993). Alíquotas de 5 ml de hidrolisado foram diluídas com água destilada em

balões de 100 ml, após alcalinização com NaOH 6,5 mo1L·1 até pH 12,5.

As frações de ligninas solúveis foram determinadas pela absorbância a

280 nm em um equipamento UN visível GBS-Cintra 20, usando como

referência NaOH 6,5 mo1L·1. A determinação da lignina solúvel foi calculada

pela equação 1 .

28

C u9= [(0,04187 X A1ig2so - Apol 200) - 0,32790] X 10-3 (equação 1)

onde:

Cli9 ... concentração de lignina em g/L

Ali92so absorbância da solução de lignina, em 280 nm.

Apd2so c1s1 + c2s2 = absorbância, em 280 nm dos produtos de

decomposição dos açúcares (furfural e hidroximetilfurfural) cujas concentrações

(e, e c2) e absortividade (s1 e s2) foram determinadas previamente por

cromatografia líquida de alta eficiência e por UV (Rocha et ai., 1993)

As cinzas foram determinadas utilizando cerca de 1 g das amostras de

bagaço de cana ou 1 g de lignina. As amostras com umidade conhecida foram

pesadas com precisão de O, 1 mg em um cadinho de porcelana previamente

calcinado e tarado. Em seguida, o material foi calcinado inicialmente a 300ºC e

depois por mais de 2 h a 800ºC. Após a calcinação, o cadinho foi resfriado em

dessecador e o teor de cinzas calculado pela equação 2.

%czy= (M2 -M1) I M3x 100 (equação 2)

onde:

%czy ... porcentagem em massa de cinzas

M1 massa do cadinho calcinado vazio, em g

M2 massa do cadinho com cinzas, em g

M3 massa de bagaço ou lignina seca, em g

Para os experimentos do sistema sob agitação ( série 1 ) não foram

calculadas as porcentagens de cinzas do bagaço e somente para os sistemas

sob agitação (série 2), estacionária e em bolsas.

A celulose e as hemiceluloses foram determinadas por cromatografia

líquida de alta eficiência (CLAE) segundo metodologia de Rocha et ai. (1997).

Foi realizada a quantificação dos açúcares produzidos presentes nos

hidrolisados ácidos, que foram filtrados em Sep-Pak C18 (Waters), para a

remoção de partículas em suspensão e de compostos aromáticos e então,

injetados diretamente (alça de injeção de 20 µL) em uma coluna Aminex

HPX-87H (300 X 7,8 mm) de troca iônica, utilizando H2S04 0,005 M como fase

móvel com fluxo de 0,6 mtrnin", a 45 ºC e detector de índice de refração. A

quantificação dos açúcares foi realizada por comparação com padrões.

29

O furfural e hidroximetilfurfural foram determinados por CLAE em coluna

(RP-18 1 O µL) utilizando-se acetonitrila I água 1 :8 (v/v) com 1 % de ácido

acético como fase móvel, com fluxo de 0,8 rnl.min' a 25ºC. O hidrolisado foi

filtrado em membrana RC 25 de 45 µm e injetado diretamente na coluna

através de uma alça de injeção de 20 µI. Os compostos. foram detectados a

276 nm e as concentrações de furfural e hidroximetilfurfural foram

determinadas a partir de curvas de calibração obtidas de compostos puros.

A perda de massa do bagaço de cana-de-açúcar durante o período de

biodegradação foi calculada como sendo:

Pm(%) = ( mi ~imf )x100% (equação 3)

onde:

Pm ... perda de massa

mi. .. massa inicial de bagaço (base seca)

mf ... massa final de bagaço (base seca)

O bagaço biodegradado foi caracterizado quimicamente conforme

metodologia descrita acima. Após a caracterização química foi possível

determinar a perda de cada componente do bagaço durante os períodos de

biodegradação estudados da seguinte forma:

Pc(%) = (mci - ~cf )x100% mci

(equação 4)

onde:

Pc perda do componente

mci %componente inicial X massa inicial de bagaço

mcf %componente final X massa final de bagaço

3.8 Análise do bagaço autoclavado: Foram utilizados 6 g do bagaço in natura, colocados em frasco Erlenmeyer de 250 ml e adicionados 100 ml

de água destilada. O frasco foi fechado com papel alumínio e autoclavado.por

30 min a 1, 05 bar. Após a descompressão da autoclave, o frasco foi retirado e

resfriado à temperatura ambiente. Depois da autoclavagem o líquido foi separado do bagaço filtrado em Sep-Pak C18 (Waters) e analisado por CLAE

30

como descrito no item 3. 7. Com as áreas obtidas foram calculadas as

porcentagens de xilana e glucana perdidas em função da autoclavagem.

3.9 Microscopia eletrônica de varredura (MEV): Amostras do bagaço

inoculado com P. tigrinus e do controle ( série 1) foram separadas e secas a

50ºC durante 40 min. Um conjunto de feixes de cada amostra foi preso no

suporte com uma fita de carbono e o conjunto foi mantido em dessecador até o

momento da análise morfológica em MEV, utilizando um microscópio modelo

JSMT-300 para a observação das fibras do bagaço antes e após o tratamento

fúngico.

3.1 O Espectros no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) e

análise por componentes principais (PCA): Amostras do bagaço original e

inoculado com P. tigrinus bem como das polpas obtidas (itens 3.11 e 3.12),

foram secas a 50ºC durante 40 min para análise por FTIR. Os espectros de

FTIR foram obtidos diretamente das amostras de bagaço utilizando a técnica

de reflexão difusa (DRIFT) em um equipamento Nicolet 520. Depois da

correção da linha base pelo método poligonal (Faix et ai., 1992), os espectros

foram normalizados pela absorção a 151 O cm", correspondente à vibração do esqueleto aromático da lignina, que não sofre influência de outros grupos. Para

as polpas obtidas dos processos kraft e Acetosov, os espectros foram

normalizados pela absorção em 900 cm", que corresponde ao carbono-1

anomérico do grupo 0-C-O em polissacarídeos (Gonçalves e Ruzene, 1999).

Os espectros de FTIR foram digitalizados e convertidos para arquivos texto

usando o programa OMNIC (Nicolet, lnc.). As absorbâncias normalizadas

foram analisadas por PCA como um conjunto de dados formados por uma

coluna correspondente aos números de onda e outra coluna com os

respectivos valores de absorbância. A matriz consistia de 557 valores de

intensidade de absorção medidos a cada 2 cm" entre 792 e 1865 cm",

fornecidos pelo espectrofotômetro FTIR. Os espectros normalizados foram

analisados pelos softwares de análise multivariada BIOTEC e FAEN

compilados em FORTRAN e desenvolvidos por Bruns (1994).

31

3.11 Determinação da composição do licor de polpação kraft pelo teste

ABC: A composição escolhida do licor utilizado para as polpações kraft foi de

15% de álcali ativo e 20% de sulfidez, valores próximos aos sugeridos na

literatura (Paturau, 1969). Para verificar se a composição do licor kraft utilizado

para as polpações correspondia aos valores de álcali ativo e sulfidez

desejados, foi feita a análise de uma alíquota do licor através do teste ABC

(TAPPI, 1985) que permite determinar as concentrações de hidróxido de sódio,

sulfeto de sódio e carbonato de sódio (quando presentes) dissolvidos no licor.

Estes testes foram realizados em triplicatas segundo a metodologia descrita

por Mimms et ai. 1993 .

Teste A

Em um Erlenmeyer de 250 ml foram colocados 5 ml do licor e adicionados

50 ml de água destilada e 25 ml de BaCb 10%. Foram adicionadas algumas

gotas de fenolftaleína e titulada a solução com HCI 0,5 N até o

desaparecimento da cor rósea (pH 8,3). O volume indicado na bureta (A) foi

anotado. A bureta não foi completada.

Teste B

Foram adicionado 5 ml de formaldeído 40% à solução após a viragem da fenolftaleína no teste A A solução volta a ter coloração rósea e após 30 s continuou-se a titulação até a cor rósea desaparecer. Foi anotado o volume

indicado na bureta (B). A bureta não foi completada.

Teste C

Foram adicionadas algumas gotas de alaranjado de metila à solução após a segunda viragem da fenolftaleína no teste B. A titulação foi continuada até o primeiro traço da cor vermelha aparecer (pH 4,0). Foi anotado o volume

indicado na bureta (C).

Através das relações abaixo é possível obter o volume de HCI 0,5 N necessário

para neutralizar a quantidade de cada componente adicionado ao licor de

polpação (expresso em base de NaOH ou Na20 equivalente) e, através de

32

cálculos estequiométricos, calculou-se a quantidade do componente realmente

dissolvido no licor:

NaOH = 2A-B Na2S = 2(8-A) Na2C03 = C-B

3.11.1 Polpação kraft: As reações de polpação kraft do bagaço in natura desmedulado, do controle dos processos de biodegradação e do bagaço

biodegradado, foram realizadas em reatores de aço inox 316 com capacidade

total de 85 ml (3 cm de diâmetro por 12 cm de altura). Foram feitas reações

com nível de álcali ativo de 15% e sulfidez de 20% (sendo todos os valores

expressos em base de Na20). As reações foram realizadas à temperatura de

170ºC utilizando-se 8 ml de licor para 2 g de bagaço (relação licor/ bagaço de

4: 1 ). O bagaço ficou embebido no licor durante um período de 24 h para

garantir que não haveria a limitação da reação por penetração ou difusão do

licor na matriz lignocelulósica. O reator foi carregado e fechado e a reação foi

conduzida por imersão do reator em banho de silicone pré-aquecido a 170ºC e

a temperatura foi mantida constante durante toda a reação. Após o tempo

pré-determinado de reação, o reator foi imerso em água fria para rápido

resfriamento até temperatura ambiente. O reator foi aberto e o material residual

obtido foi filtrado a vácuo sobre papel de filtro em funil de Büchner. A polpa ou

bagaço não desfribado foi lavada abundantemente com água destilada para a

máxima remoção do licor residual (8 a 1 O lavagens com 2 L de água cada).

Durante o processo de lavagem, a polpa era desfibrada manualmente com o

auxílio de um bastão de vidro. Para o bagaço in natura as palpações kraft foram realizadas com 5, 1 O, 15, 20, 40 e 60 min de reação; para o bagaço das

bolsas foram realizadas com 20, 40 e 60 min de reação e para os frascos com

e sem agitação foram realizadas as palpações com 20 min de reação.

3.12 Polpação Acetosolv do bagaço: A polpação Acetosolv do bagaço· de cana-de-açúcar desmedulado foi realizada com ácido acético 93%, na

presença de HCI como catalisador, conforme metodologia otimizada para

bagaço por Benar (1992).

33

Os experimentos foram realizados em bateladas, utilizando-se 2 g de

bagaço de cana que foram pesados com precisão de O, 1 g e colocados em um

balão de fundo redondo de 100 ml juntamente com 25 ml de ácido acético

glacial [relação bagaço:solvente 1 :14 (m/v)], 70 µL de HCI 37% e 2 ml de

água destilada. Este procedimento foi realizado para o bagaço in natura bem

como para as amostras biodegradadas e de controle obtidos dos três sistemas

(agitação, estacionário e em bolsas). A polpação em escala ampliada para o

· bagaço in natura foi realizada em batelada, utilizando-se 30 g de bagaço de

cana que foram pesados com precisão de O, 1 g e colocados em um balão de

fundo redondo de 1000 ml juntamente com 372,5 ml de ácido acético glacial

[relação bagaço:solvente 1 :14 (m/v)], 1,05 ml de HCI 37% e 24,5 ml de água

destilada. Para as amostras de controle e bagaço biodegradado pelas três

cepas nas bolsas, as· palpações foram também realizadas em escala

ampliada em batelada, utilizando-se 44 g de bagaço de cana que foram

pesados com precisão de O, 1 g e colocados em um balão de fundo redondo de

2000 ml juntamente com 500 ml de ácido acético glacial [relação

bagaço:solvente 1 :14 (m/v)], 1,4 ml de HCI 37% e 35 ml de água destilada.

Foi utilizado um condensador para evitar a evaporação do ácido.

O balão foi aquecido em banho de óleo de silicone à temperatura de

refluxo do solvente (ácido acético) (110 ± 5ºC) por 120 min. O banho levou em torno de 30 min para atingir essa temperatura.

Após a polpação, a polpa foi removida e filtrada em funil de Büchner. O

licor de polpação contendo lignina foi separado e guardado. A polpa obtida foi

lavada exaustivamente com água destilada a 70ºC até a água de lavagem

atingir pH>3,5.

As polpas foram secas em estufa a 11 OºC por 2 h e levadas

posteriormente a um dessecador por 30 min e foram calculados os

rendimentos das palpações. As polpas foram guardadas para análises

posteriores, como descrito nos itens 3.12 e 3.14.

34

3.13 Determinação do número kappa: O número kappa (medida da lignina

residual na polpa) foi determinado pela oxidação por permanganato de potássio

e titulação com tiossulfato de sódio, seguindo-se a metodologia padrão (TAPPI,

1985).

As polpas foram secas em estufa a 11 OºC por 2 h. As amostras de

polpa de bagaço tratado e não tratado foram pesadas em béqueres com

massas entre 0,30 e 0,35 g (com precisão de 0, 1 mg) e cada uma delas foi

· suspensa em 1 O ml de água destilada. Cada suspensão de polpa foi

transferida com 140 ml de água para um Erlenmeyer de 500 ml que foi

mantido a 25ºC sob agitação magnética. Foram misturados 25 ml de uma ·-·-·· .

solução padrão de KMn04 O, 1 N (recém preparada) com 25 ml de H2S04 4 N

em um Erlenmeyer de 125 ml, que foi mantido a 25ºC sob agitação magnética

(solução A).

A solução A foi adicionada quantitativamente a cada Erlenmeyer

contendo a suspensão de polpa, utillzando-se 50 ml de água destilada para

lavar as paredes do Erlenmeyer. Após exatos 1 O min (medidos com um

cronômetro) foram adicionados 5,0 ml de uma solução de KI 0, 1 N. Essa·

mistura foi titulada com uma solução padronizada de Na2S203 O, 1 N até

próximo ao ponto de viragem (desaparecimento da cor castanha). Foram

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