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FACULDADE TECSOMA Curso de Biomedicina

Marcos Alan Oliveira Santos

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIMICROBIANO DO ÓLEO DA SEMENTE DE SUCUPIRA (Pterodon emarginatus)

Paracatu-MG 2012



Projeto monográfico apresentado á

disciplina Trabalho de Conclusão de

Curso I, ministrada pelo professor Geraldo

Benedito B. de Oliveira, do curso de

Biomedicina da Faculdade Tecsoma

como pré-requisito a obtenção do titulo de

bacharel em Biomedicina.

Orientador (a): MSc.Cláudia Peres da

Silva

Orientador Metodológico: Geraldo B.B. de

Oliveira

Paracatu-MG 2012

Santos, Marcos Alan Oliveira S237a Avaliação do potencial antimicrobiano do óleo da semente de sucupira

(Pterodon emarginatus). / Marcos Alan Oliveira Santos. Paracatu, 2012.

39f. Orientador: Cláudia Peres da Silva Monografia (Graduação) – Faculdade Tecsoma, Curso de

Bacharel em Biomedicina.

1. Microbiologia. 2. Staphylococcus aureus. 3. Pterodon emarginatus. 4. Potencial antimicrobiano. I. Silva, Cláudia Peres da. II. Faculdade Tecsoma. III. Título.

CDU: 579:61



Projeto monográfico apresentado á disciplina

Trabalho de Conclusão de Curso I,

ministrada pelo professor Geraldo Benedito

B. de Oliveira, do curso de Biomedicina da

Faculdade Tecsoma como pré-requisito a

obtenção do titulo de bacharel em

Biomedicina.

______________________________________________

Prof (a): MSc. Cláudia Peres da Silva - FATEC Coordenadora do Curso e Orientadora da Monografia

_______________________________________________ Geraldo Benedito Batista de Oliveira - FATEC

Orientador Metodológico

Paracatu 07 de julho 2012.

Dedico este trabalho á toda minha família.

Aos meus colegas e professores que estiveram comigo nesta caminhada.

Deus obrigado por tudo senhor.

AGRADECIMENTOS

“O senhor guardara a minha entrada e minha saída desde agora e para

sempre.” Salmos121, 8.

A cada vitória o reconhecimento devido ao meu Deus, pois só Ele é

digno de toda honra, glória e louvor.

Agradeço aos meus pais José Maria e Maria dos Anjos pelo apoio e

incentivo que me deram desde o inicio desta caminhada. Aos meus irmãos

Mêcia Jordânia, Maisa Dabiane, Miqueias Danilo e Sâmela Talita que sempre

estiveram comigo.A todos da minha família pelo carinho.

Agradeço aos meus amigos de republica que desde o inicio da

caminhada compartilhamos pelo mesmo ideal de formamos em Paracatu Diogo

Oliveira, Josemar “Chuvisco”, Juscelio, Lázaro Antunes, Marcelo Mendes,

Reinaldo e Danilo “Badia”.

Á primeira turma de Biomedicina “minha turma” que durante quatro anos

buscamos esse objetivo de sermos Biomédicos.

Agradeço aos meus professores de curso. A professora Rita de Cássia,

Flavio Maia, Gilmar, Anderson e Camila que contribuíram e muito para minha

Formação.

Agradeço aos meus supervisores de estágio Carol, Esther, Mardei e

Josimar pela compreensão para comigo.

A minha coordenadora e orientadora Cláudia Peres que me ajudou e

muito de forma inexplicável no meu trabalho de conclusão de curso, me

auxiliando em tudo.

Agradeço principalmente ao meu Deus, obrigado por tudo senhor.

Tudo posso, naquele que me fortalece!

"O pensamento lógico pode levar você de A a B, mas a

imaginação te leva a qualquer parte do Universo." Albert

Einstain

RESUMO

O presente trabalho teve como objetivo avaliar o potencial antimicrobiano do

óleo da semente de sucupira (Pterodon emarginatus) contra a cepa de

Staphylococcus aureus. As sementes de sucupira foram adquiridas no

comercio local da cidade de Paracatu-MG, levadas ao laboratório de

bioquímica e microbiologia da Faculdade Tecsoma onde foram desidratadas

durante 4 dias á 100 °c em estufa da marca Quimis. Em seguida as sementes

foram trituradas obtendo o óleo da mesma. O papel filtro com 6 mm de

diâmetro foi impregnado com 30 μL do óleo da semente de sucupira (Pterodon

emarginatus), onde foi colocado em meio agar Muelle-Hinton com a bactéria

Staphylococcus aureus. O halo de inibição contra cepa de Staphylococcus

aureus foi de 8 mm. O trabalhou analisou o potencial antimicrobiano da

semente da sucupira (Pterodon emarginatus) conforme o halo de inibição.

Palavras chave: Pterodon emarginatus, Staphylococcus aureus, potencial

antimicrobiano.

ABSTRACT

The present work had as objective analyse the antimicrobial potential of the

seed oil sucupira (Pterodon emarginatu)s against strains of the Staphylococcus

aureus. The Sucupira seeds were obtidas in the town market local of the

Paracatu, MG, taken to the laboratory of biochemistry and microbiology at the

Faculty Tecsoma where they were dried for 4 days to 100 ° C in an oven brand

Quimis. Then the seeds were crushed to obtain oil from it. the the filter paper

was impregnated with 30 μl of the oil which was put in Mueller-Hinton Agar with

the bacterium Staphylococcus aureus. The filter paper with 6 mm diameter were

impregnated with 30 μL of the seed oil sucupira (Pterodon emarginatus), where

he was placed on Mueller-Hinton agar with the bacteria Staphylococcus aureus.

The inhibition zone against Staphylococcus aureus strain was 8 mm. The

worked discussed the antimicrobial potential of the seed of sucupira (Pterodon

emarginatus) as the inhibition zone.

Keywords: Pterodon emarginatu, Staphylococcus aureus, antimicrobial

potention.

LISTA DE TABELAS

TABELA 1: Valores de halos inibitórios esperados para Staphylococcus spp . 28

TABELA 2: Antibiograma: Staphylococcus aureus ........................................... 32

TABELA 3: Valores de referência dos halos dos antibióticos usados na clinica

Staphylococcus spp ......................................................................................... 32

TABELA 4: Halo de inibição do óleo da semente de Sucupira ........................ 33

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1: Procedimentos Gerais para a Obtenção de Compostos

Biologicamente Ativos ...................................................................................... 21

FIGURA 2: Procedimento Geral de Partição e Provável Separação dos

Principais Metabólitos Secundários Presentes em Plantas .............................. 22

FIGURA 3: Pterodon emarginatus. (A) Árvore, (B) folhas e flores, (C) frutos, (D)

sementes, (E) tronco e (F) madeira ................................................................. 25

LISTA DE GRÁFICOS

GRAFICO 1 : Classificação dos Antibióticos .................................................... 33

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 12 1. 1 Justificativa .............................................................................................. 13 2 OBJETIVOS .................................................................................................. 14 2.1 Objetivo Geral ........................................................................................... 14 2.2 Objetivos Específicos .............................................................................. 14 3 REFERENCIAL TEÓRICO ............................................................................ 15 3.1 Metabolismo Vegetal ................................................................................ 15 3.2 Metabolismo Vegetal Secundário ........................................................... 16 3.2. 1. Terpenoides ......................................................................................... 17 3.2.2. Fenólicos ............................................................................................... 18 3.2.3 Compostos Contendo Nitrogênio ........................................................ 19 3.3 Estudos Fitoquímicos – Panorama Geral .............................................. 20 3.4 O Gênero Pterodon ................................................................................. 23 3.5 Aspectos Biológicos Pterodon emarginatus Benth .............................. 24 3.6 Aspectos Quimicos Pterodon emarginatus Benth ................................ 26 3.7 Atividades biológicas descritas ............................................................. 26 3.8 Bactéria ..................................................................................................... 27 3.9 Atividade Antimicrobiana ........................................................................ 28

4 METODOLOGIA .......................................................................................... 29 4.1 Tipo de Estudo ......................................................................................... 29 4.2 Local de Estudo ....................................................................................... 29 4.3 Obtenção de Material Botânico ............................................................... 29 4.4 Extração do Òleo Essencial .................................................................... 29 4.5 Cultura ....................................................................................................... 30 4.6 Ensaio Antimicrobiano ............................................................................ 30 5 RESULTADO E DISCURSÃO ..................................................................... 31 6 CONCLUSÃO .............................................................................................. 36 REFERÊNCIAS ................................................................................................ 37

12

1. INTRODUÇÃO

Um dos maiores problemas de Saúde Pública refere-se ao agravamento

da resistência de cepas bacterianas frente a antibióticos, tal situação agrava o

mundo inteiro, acometendo tanto países desenvolvidos como em

desenvolvimento. Nesta situação, as plantas representam fontes valiosas de

produtos para a manutenção da saúde humana em virtude de sua grande

biodiversidade. (DUARTE, 2006; DUTRA et al, 2009)

Segundo Carvalho e outros (2008) o Brasil é um país de grande

biodiversidade vegetal, sendo que inúmeras plantas são utilizadas por grande

parte de nossa população, na forma de fitoterápicos, nutracêuticos ou

alimentos.

Para Rocha citado por Barraca (1999), as plantas são utilizadas pela

população como fitoterápicos, devido à produção de substâncias ativas, sendo

divididas em dois tipos. O primeiro tipo de substância, essencialmente

sacarídeos é oriundo do metabolismo primário, ocorrendo em todas as plantas

verdes, graças à fotossíntese, ou seja, substâncias estas indispensáveis à vida

das plantas. O segundo tipo de substâncias é oriundo do metabolismo

secundário, resultante essencialmente da assimilação do azoto (nitrogênio

amínico). Estes produtos do metabolismo secundário freqüentemente parecem

ser inúteis á vida das plantas, contudo os seus efeitos terapêuticos, em

contrapartida, são notáveis.

As plantas através do metabolismo secundário são capazes de produzir

substâncias e óleos com propriedades antimicrobianas, os quais são

reconhecidos empiricamente durante séculos em diversas regiões do mundo,

sendo vários os estudos sobre a atividade biológica das plantas. (DUARTE,

2006).

Os extratos e os óleos essenciais oriundos do metabolismo secundário

das plantas são utilizados como mecanismo de defesa contra predação por

microrganismo, insetos e herbívoros. (GOTLIEB apud GONÇALVES;ALVES;

MENEZES,2005).

Essas substâncias se mostram eficientes no controle do crescimento de

uma ampla variedade de microrganismos, incluindo fungos filamentosos,

leveduras e bactérias. (DUARTE, 2006).

13

A planta em estudo, Pterodon emarginatus vogel ou Sucupira branca é

uma árvore aromática nativa muito encontrada no cerrado brasileiro, tendo uma

altura aproximada de 5 a 10 metros, produz sementes que são largamente

comercializadas em mercados populares em virtude de suas propriedades

terapêuticas. É utilizada para tratamento de dores de garganta, disfunções

respiratórias e reumatismo, tendo atividades também analgésica, depurativa,

tônica e antiinflamatória. (LORENZI e MATOS apud DUTRA et al, 2009).

Estudos fitoquímicos realizados no gênero Pterodon emarginatus ou

(sucupira) tem confirmado alcalóides nas cascas das árvores, isoflavonas e

triterpenos na madeira, e no óleo das sementes, isoflavonas e diterpenos.

(TORRENEGRA et al apud DUTRA et al,2009).

Tendo em vista que o agravamento da resistência bacteriana é um dos

mais graves problemas de saúde pública. Sabendo-se de tais problemas o

presente estudo teve como foco avaliar o potencial antimicrobiano do óleo da

semente de sucupira (Pterodon emarginatus).

1.1 Justificativa

Atualmente um dos maiores problemas de saúde publica refere-se á

resistência bacteriana. Tendo em vista tal problema, o estudo teve como foco

avaliar o potencial antimicrobiano do óleo da semente de sucupira.

14

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Esse projeto tem como objetivo avaliar o potencial antimicrobiano do

óleo da semente de sucupira (Pterodon emarginatus) em cepas de

Staphylococcus aureus.

2.2 Objetivos Específicos

Obter o halo de inibição do óleo de sucupira (Pterodon emarginatus).

Testa o efeito do óleo da semente de sucupira na bactéria gram positiva

Staphylococcus aureus.

Comparar o halo de inibição do óleo com outros antibióticos disponíveis

no mercado.

Verificar se é viável a utilização do óleo da semente de sucupira como

matéria prima para o desenvolvimento de novos fármacos.

Verificar a concentração inibitória mínima do óleo da semente de

sucupira em cepa de Staphylococcus aureus através de revisão da

literatura.

Verificar se o óleo tem efeito bactericida ou bacteriostático através de

revisão da literatura.

15

3 REFERÊNCIAL TEÓRICO

3.1 Metabolismo Vegetal

As plantas produzem uma larga e diversa ordem de componentes

orgânicos divididos em metabólitos primários e secundários. Os metabólitos

primários possuem função estrutural, plástica e de armazenamento de energia.

Os metabólitos secundários, produtos secundários ou produtos naturais,

aparentemente não possuem relação com crescimento e desenvolvimento da

planta. (TAIZ; ZEIGER apud VIZZOTO; KROLOW e WEBER, 2010).

Segundo Kiatkoski (2011) todas as plantas produzem constituintes

químicos, os quais fazem parte de suas atividades metabólicas normais. Estes

podem ser divididos em metabólitos primários, como açúcares, aminoácidos,

nucleotídeos e lipídeos, encontrados em todas as plantas.

O metabolismo primário é responsável pela maioria dos compostos

presentes nas plantas. Esses compostos são polissacarídeos, açúcares,

proteínas e graxas, substâncias essenciais à sobrevivência e desenvolvimento

das plantas. (VERPOORTE e MEMELINK apud LOURENÇO, 2003).

Além desses metabólitos as plantas produzem uma grande variedade de

metabólitos secundários. Esses compostos, não necessariamente essenciais

ao organismo produtor, têm um papel importante na sobrevivência da planta

em seu ecossistema. (SANTOS apud LOURENÇO, 2003).

Para Rocha citado por Barraca (1999), as plantas medicinais produzem

substâncias ativas de dois tipos. O primeiro tipo de substância, essencialmente

sacarídeos, é oriundo do metabolismo primário, ocorrendo em todas as plantas

verdes, graças à fotossíntese, ou seja, substâncias estas indispensáveis à vida

das plantas. O segundo tipo de substâncias é oriundo do metabolismo

secundário, resultante essencialmente da assimilação do azoto (nitrogênio

amínico). Estes produtos do metabolismo secundário frequentemente parecem

ser inúteis á vida das plantas, contudo os seus efeitos terapêuticos, em

contrapartida, são notáveis.

16

3.2 Metabolismo Vegetal Secundário

Para Taiz e Zeiger citado por Kiatkoski (2011) os estudos abordando as

substâncias oriundas do metabolismo secundário foram iniciados pelos

químicos orgânicos do século XIX e início do século XX, devido às suas

diversas aplicações. O homem utiliza muito destes compostos como alimentos

de alto valor nutritivo (nutracêuticos), temperos, aromas e fragrâncias, óleos

vegetais, resinas, inseticidas, matérias-primas agrícolas, bem como

medicamentos e outros fins industriais. Estes usos se refletem diretamente

sobre os metabólitos secundários que são utilizados comercialmente como

compostos biologicamente ativos (produtos farmacêuticos, temperos,

fragrâncias, etc.), gerando produtos de alto valor em pequena quantidade

quando comparados aos metabólitos primários.

Embora os produtos secundários possuam uma variedade de funções

nas plantas, é provável que a sua importância ecológica tenha alguma relação

com potencial efeito medicinal para os seres humanos. Por exemplo, produtos

secundários envolvidos na defesa das plantas através de citotoxicidade para

patógenos microbianos podem ser úteis como medicamentos antimicrobianos

em humanos, se não forem demasiado tóxicos. Da mesma forma, produtos

secundários envolvidos na defesa contra herbívoros através de atividade

neurotóxica poderia ter efeitos benéficos em seres humanos (ou seja, como

antidepressivos, sedativos, relaxantes musculares ou anestésicos) através de

sua ação no sistema nervoso central. (KAUFMAN et al apud VIZZOTO;

KROLOW e WEBER, 2010).

Os metabólitos secundários podem ser classificados com base na sua

estrutura química, composição, a via pela qual é biossintetizado, origem da

planta ou sua solubilidade em vários solventes. (SHERMA; KOWALSKA apud

KIATKOSKI, 2011).

Uma classificação simples inclui três grupos principais:

1. Terpenoides (originários da via do mevalonato, compostos quase que

inteiramente de carbono e hidrogênio).

2. Fenólicos (originários de açúcares simples, contendo anéis

benzênicos, hidrogênio, e oxigênio).

17

3. Compostos contendo nitrogênio (ou também contendo enxofre).

(SIMÕES et al; TAIZ; ZEIGER apud KIATKOSKI ,2011).

3.2.1 Terpenoides

Os terpenos e os seus derivados são moléculas, em regra constituídas

por unidades contendo cinco átomos de carbono derivadas do isopreno

representando o maior e mais amplamente distribuído grupo de metabolitos

secundários, dos quais, mais de 4.000 foram já identificados. De acordo com a

regra do isopreno, os terpenos podem ser considerados usualmente como

produtos resultantes da ligação de várias unidades de isopreno. (FONTES E

ALÇADA apud COELHO, 2009).

Os terpenos ou terpenóides podem ser classificados de acordo com o

número de isoprenos que constituem: hemiterpenóides, monoterpenóides,

sesquiterpenóides, diterpenóides, triterpenóides, tetraterpenóides e

politerpenóides. (OLIVEIRA et al apud JAKIEMIU,2008 )

Segundo Buchanan e outros citado por Coelho (2009) os terpenos mais

simples são os hemiterpenos, formados por apenas uma unidade de isopreno.

Os monoterpenos são constituídos por 2 unidades de isopreno , os

sesquiterpenos por 3 , os diterpenos, por 4 , triterpenos, e tetraterpenos por 6

e 8 e os politerpenos ou poli-isoprenos por números mais elevados.

Os hemiterpenóides são o menor grupo dos terpenos, sendo que o seu

representante mais conhecido e estudado é o isopreno, um produto volátil

liberado de tecidos fotossinteticamente ativos. (CROTEAU et al apud

JAKIEMIU,2008)

Os monoterpenóides são compostos por duas unidades de isopreno.

Devido a sua baixa massa molecular, estes costumam ser voláteis, sendo os

constituintes das essências voláteis e óleos essenciais, atuando na atração de

polinizadores. (OLIVEIRA et al apud JAKIEMIU,2008).

Segundo Vizzoto; Krolow e Weber (2010) muitos sesquiterpenoides

também são voláteis e, assim como os monoterpenos, estão envolvidos na

defesa da planta contra pragas e doenças. Além disso, numerosos compostos

sesquiterpenoides atuam como fitoalexinas, um antibiótico produzido pelas

18

plantas em resposta a infecções microbianas. Também atuam como defensivos

que desencorajam os herbívoros oportunistas a realizarem o ataque.

Os diterpenóides compreendem um grande grupo de compostos não

voláteis, possuindo uma vasta gama de atividades diferentes que incluem os

hormônios, ácidos resínicos e agentes anticancerígenos. (ROBBERS et al apud

JAKIEMIU,2008).

Os diterpenos dividem-se em várias classes de acordo com o arranjo de

seus esqueletos carbônicos. Assim, são conhecidos diterpenos acíclicos,

bicíclicos dos tipos labdano e clerodano, tricíclicos dos tipos pimarano,

abietano, vouacapano e tetracíclicos. (ROCHA, 2010).

Dentre os diterpenos, tem sido observado certo interesse em relação

aos diterpenos com esqueleto caurânico, pois apresentam uma variedade de

atividades biológicas como antiparasitária, fitotóxica, hormonal, antioxidante,

citotóxica, antiviral, antimicrobiana. (ROCHA, 2010).

Para Vizzoto; Krolow e Weber (2010) as saponinas são uma classe

importante de triterpenos que nas plantas desempenham um importante papel

na defesa contra insetos e microrganismos.

3.2.2. Fenólicos

Os compostos fenólicos por apresentarem atividade farmacológica e

antinutricional e também por inibirem a oxidação lipídica e a proliferação de

fungos são muitos estudados, além de participarem de processos responsáveis

pela cor, adstringência e aroma em vários alimentos. (PELEG et al apud

SOARES,2002).

Para Angelo e Jorge (2007) os compostos fenólicos são originados do

metabolismo secundário das plantas, sendo essenciais para o seu crescimento

e reprodução, além disso, se formam em condições de estresse como,

infecções, ferimentos, radiações UV, dentre outros.

Os compostos fenólicos englobam desde moléculas simples até outras

com alto grau de polimerização. Estão presentes nos vegetais na forma livre ou

ligados a açúcares (glicosídios) e proteínas. (CROFT apud SOARES, 2002).

Segundo Vizzoto; Krolow e Weber (2010) quimicamente, os chamados

compostos fenólicos são substâncias que possuem pelo menos um anel

19

aromático no qual ao menos um hidrogênio é substituído por um grupamento

hidroxila. Esses compostos são sintetizados a partir de duas rotas metabólicas

principais: a via do ácido chiquímico e a via do ácido mevalônico, a qual é

menos significativa.

Alem disto possuem estrutura variável e com isso, são multifuncionais.

Existem cerca de cinco mil fenóis, dentre eles, destacam-se os flavonóides,

ácidos fenólicos, fenóis simples, cumarinas, taninos, ligninas e tocoferóis.

(PELEG; BODINE; NOBLE apud ANGELO; JORGE, 2007).

Ribéreau-Gayon citado por Soares (2002) adotou a seguinte

classificação para estes compostos: pouco distribuídos na natureza, polímeros

e largamente distribuídos na natureza.

Conforme Soares (2002) na família dos compostos fenólicos pouco

distribuídos na natureza estão um número reduzido deles, embora estes sejam

encontrados com certa frequência. Neste grupo estão os fenóis simples, o

pirocatecol, a hidroquinona e o resorcinol. A esta família também pertencem os

aldeídos derivados dos ácidos benzóicos, que são constituintes dos óleos

essenciais como a vanilina.

Para Angelo e Jorge (2007) os polímeros são alguns fenólicos que não

se apresentam na forma livre nos tecidos vegetais, esta família engloba os

taninos e as ligninas.

Ainda segundo Angel e Jorge (2007) na família dos compostos

largamente distribuídos na natureza estão os fenólicos encontrados geralmente

em todo o reino vegetal, mas às vezes podem estar localizados em uma só

planta. Estes fenólicos estão divididos em dois grandes grupos: os flavonóides

e derivados e os ácidos fenólicos (ácidos benzóico, cinâmico e seus derivados)

e cumarinas.

3.2.3 Compostos Contendo Nitrogênio

Segundo Vizzoto; Krolow e Weber (2010) os alcaloides são compostos

orgânicos cíclicos que possuem pelo menos um átomo de nitrogênio no seu

anel. Na sua grande maioria os alcaloides possuem caráter alcalino, pois a

presença do átomo de N representa um par de elétrons não compartilhados.

Os alcaloides são sintetizados no retículo endoplasmático, concentrando-se,

20

em seguida, nos vacúolos e, dessa forma, não aparecem em células jovens.

Essa classe de compostos do metabolismo secundário é famosa pela presença

de substâncias que possuem acentuado efeito no sistema nervoso, sendo

muitas delas largamente utilizadas como venenos ou alucinógenos. O

isolamento da morfina, em 1806 pelo farmacêutico alemão Friedrich Sertürner,

deu origem ao estudo dos alcalóides.

3.3 Estudos Fitoquímicos – Panorama Geral

A pesquisa fitoquímica tem por objetivo conhecer os constituintes

químicos de espécies vegetais ou avaliar a sua presença. (FALKENBERG;

SANTOS; SIMÕES apud BRESOLIN; FILHO, 2010).

Diante da ampla diversidade química encontrada nas plantas medicinais,

a pesquisa nessa área pode ser sumarizada como segue. (NYIREDY apud

BRESOLIN; FILHO, 2010).

Análise qualitativa e quantitativa dos constituintes das plantas

medicinais;

Fracionamento, purificação e determinação estrutural de novas

moléculas;

Avaliação biológica dos extratos, frações e compostos isolados;

Otimização dos procedimentos utilizados para obtenção dos compostos

responsáveis pelos efeitos terapêuticos ou das propriedades estruturais.

Segundo Bresolin e Filho (2010) métodos de separação rápidos e

eficientes são imprescindíveis para o direcionamento no processo de obtenção,

pois uma simples planta possa conter centenas de metabólicos secundários

diferentes.

Para Kiatkoski (2011) a primeira etapa da investigação fitoquímica é a

coleta do material vegetal. É essencial que a seleção do material coletado seja

feita com cuidado, evitando coletar partes do vegetal afetadas por doenças,

parasitas e também materiais estranhos, tais como outras plantas ou mesmo

partes da própria planta que não sejam de interesse para a investigação. Deve-

se registrar o local, a hora e a data da coleta, já que o meio ambiente, a hora

do dia e a época do ano exercem grande influência sobre a produção e o

acúmulo dos metabólitos vegetais.

21

Posteriormente a escolha adequada do material vegetal, segue-se á

preparação dos extratos brutos que será o ponto de partida para uma posterior

purificação. A escolha do solvente para extração dever ser feita tendo em vista

os objetivos do estudo e os resultados da abordagem. Para obter uma extração

eficiente é necessária a utilização de solventes puros e condições brandas,

utilizando sempre que possível solvente de baixa reatividade. (GHISALBERTI

apud BRESOLIN; FILHO, 2010).

FIGURA 1: Procedimentos Gerais para a Obtenção de Compostos Biologicamente Ativos.

FONTE: Niero et al,citado por KIATKOSKI (2011).

.

Conforme Kiatkoski (2011) outro aspecto importante a ser considerado é

o processo utilizado na extração, dentre eles, a turbolização, a maceração e a

22

percolação (extrações à frio); infusão, turbolização e decocção (extrações à

quente em sistemas abertos); e extração sob refluxo e a em aparelho de

Soxhlet (extrações à quente em sistemas fechados).

Segundo Gobbo-Neto e Lopes citado por Bresolin e Filho (2010) a

composição química, na maioria dos casos, pode variar nas distintas partes da

planta. Muitas vezes, uma mesma espécie botânica que ocorre em diferentes

regiões pode apresentar diferença devido às variações climáticas (temperatura,

índice pluviométrico, altitude, poluição atmosférica). Outros fatores que podem

coordenar ou alterar a taxa de produção de metabólitos secundários

isoladamente ou em conjunto com os fatores supracitados são os seguintes:

sazonalidade, ritmo circadiano e método de cultivo.

FIGURA2: Procedimento Geral de Partição e Provável Separação dos Principais Metabólitos Secundários Presentes em Plantas.

FONTE: Niero et al,citado por KIATKOSKI (2011).

As plantas secas ao ar ou sob-baixa temperaturas são extraídas com

uma variedade de solvente e algumas vezes sequencialmente de baixa para

23

alta polaridade. Outra alternativa para obtenção do extrato bruto pode ser a

utilização do metanol ou etanol. A utilização desses solventes possibilita a

extração de um maior numero de compostos líquidos, com solvente de

polaridade crescente como hexano, diclorometano, acetato de etila e butanol.

Esses solventes possibilitam a seperação (semipurificação) das substancias

por meio de suas polaridades. (CECHINEL-FILHO e YUNES apud BRESOLIN;

FILHO, 2010)

3.4 O Gênero Pterodon

Segundo Euzébio e outros citado por Kiatkoski (2011) o gênero Pterodon

é amplamente distribuído sobre as savanas do Brasil Central e compreende

quatro espécies nativas brasileiras: P. abruptus Benth, P. apparuccuri

Pedersoli, P.pubescens Benth (P. emarginatus Vog.) e P. polygalaeflorus

Benth. Sua distribuição é disjuntiva e populações mistas não foram

observadas, o que pode indicar algumas características do solo como fator

limitante para o seu desenvolvimento.

De acordo com Lorenzi e Matos citado por Dutra e outros (2009) devido

suas propriedades terapêuticas as sementes de Sucupira são largamente

comercializadas em mercados populares.

As sementes são popularmente utilizadas para dores na coluna, dor de

garganta, reumatismo, e até mesmo como tônico (fortificante) e depurativo.

(SPINDOLA apud KIATKOSKI, 2011).

Extratos alcoólicos dos frutos destas plantas são utilizados na medicina

popular como antiinflamatórios (principalmente contra reumatismo), para dores

de garganta e analgesia em geral. Os óleos dos frutos ou da semente de pelo

menos três espécies têm ação protetora contra a infecção por Schistosoma

mansoni inibindo a penetração de cercárias na pele. (EUZÉBIO apud

KIATKOSKI, 2011).

Segundo Torrenegra e outros citado por Dutra e outros (2009) estudos

fitoquímicos do gênero Pterodon (sucupira) tem confirmado alcalóides nas

cascas das árvores, isoflavonas e triterpenos na madeira, e no óleo das

sementes, isoflavonas e diterpenos.

24

3.5 Aspectos Biológicos Pterodon emarginatus Benth

Segundo Lorenzi e Matos citado por Kiatkoski (2011) Pterodon

emarginatus Benth é conhecida popularmente como faveiro, sucupira,

sucupira-branca, fava-de-sucupira, fava-de-santo-inácio ou sucupira-lisa.

Conforme Lorenzi e Matos citado por Dutra e outros (2009), Pterodon

emarginatus vogel ou Sucupira branca tem uma altura aproximada de 5 a 10

metros. Sendo nativa dos estados de Tocantins, Mato Grosso, Goiás, Minas

Gerais, São Paulo e Mato Grosso do Sul.

Ainda segundo Lorenzi e Matos citado por Kiatkoski (2011) suas folhas

são caracterizadas por serem compostas de pinadas, com 20-36 folíolos. A

sucupira floresce em setembro e outubro. Suas flores são esbranquiçadas ou

róseas, dispostas em panículas axilares e apicais amplas.

Para Lorenzi citado por Kiatkoski (2011) é quando a planta esta quase

totalmente despida da folhagem que ocorre a maturação dos frutos isto é

verificado de junho a julho. Os frutos são caracterizados como vagens tipo

sâmara (pterocarpo) arredondadas, indeiscentes e aladas, contendo uma única

semente fortemente protegida dentro de uma cápsula fibro-lenhosa e envolvida

externamente por uma substância oleosa amarga numa estrutura esponjosa

como favos de mel.

25

FIGURA 3: Pterodon emarginatus. (A) Árvore, (B) folhas e flores, (C) frutos, (D) sementes, (E) tronco e (F) madeira.

FONTE: adaptado de Lorenzi ,citado por Kiatkoski (2011)

26

3.6 Aspectos Químicos Pterodon emarginatus Benth

As principais substâncias isoladas de Pterodon emarginatus Benth são

os diterpenos, estruturas pertencentes ao grupo dos terpenos, ou terpenóides,

os quais constituem a maior classe de metabólitos secundários. As diversas

substâncias desta classe são, em geral, insolúveis em água e sintetizados a

partir de acetilCoA ou de intermediários glicolíticos . (TAIZ e ZEIGER apud

KIATKOSKI, 2011).

3.7 Atividades biológicas descritas

Varias são as atividades biológicas descritas para Pterodon emarginatus

um dos estudos relata que os diterpenos e alguns derivados, isolados de P.

pubescens, tem sido associados à ação protetora contra infecção por cercárias

de Schistosoma mansoni, quando aplicados topicamente em caudas de ratos.

(COELHO et al apud KIATKOSKI ,2011).

Segundo Vieira e outros citado por Kiatkoski (2011) o ácido 6α,7β-

dihidroxivouacapan-l7β-óico isolado de P. pubescens apresenta atividade

antiproliferativa de células de melanoma humano.

Para Menna-Barreto e outros citado por Kiatkoski (2011), o

geranilgeraniol é o principal composto responsável pela atividade anti-

Tripanossoma cruzi da espécie.

Dentre as demais atividades biológicas já estudadas nesta espécie

encontram-se:

Quimioprofilática contra Schistosoma mansoni. (KATZ et al apud

KIATKOSKI , 2011).

Citotóxica. (SABINO et al apud KIATKOSKI, 2011).

Toxicidade subaguda. (COELHO et al apud KIATKOSKI ,2011).

Antinociceptiva. (COELHO et al apud KIATKOSKI ,2011).

Antimicrobiana e Leshmanicida. (DUTRA et al,2009)

27

3.8 Bactéria

As bactérias são seres procaríotos que se reproduzem por divisão

assexuada. São formadas por várias estruturas, porém há uma estrutura

essencial, a membrana citoplasmática. A maioria das bactérias possui

externamente á membrana uma espessa e rígida camada, a parede celular,

que é externamente á membrana resistente. Envolvendo a parede, pode

ocorrer uma terceira camada, a cápsula. No interior da célula, se encontram o

citoplasma, núcleo e diversos grânulos. Partindo da superfície, pode haver

flagelos e fimbrias. (JUNQUEIRA; CARNEIRO; MURRAY et al apud

VIOLANTE,2008 ).

Para Schaechter e outros citado por Violante (2008) as características

da parede celular, das bactérias podem ser classificadas em Gram-positivas ou

Gram-negativas. As diferenças estão baseadas nas suas propriedades de

permeabilidade e nos componentes de superfície.

O principal componente estrutural da parede celular é o peptideoglicano,

um polímero misto de açúcares e aminoácidos. Nas bactérias Gram-positivas o

peptideoglicano forma uma camada espessa (20-80nm), constituindo uma

estrutura extremamente forte em tensão, sendo menos espessa (5-10nm) nas

Gram-negativas e consequentemente, mais frágil. Contudo, a parede na célula

Gram-negativa é constituída por estruturas complexas, que a envolvem

externamente, como as lipoproteínas, membrana externa e os

lipopossacarideos. (TRABULSI et al,2008).

Segundo Santos e outros (2007) os Staphylococcus são cocos Gram e

catalase-positivos, com aproximadamente 0,5 a 1,5 µm de diâmetro, imóveis,

não esporulados e geralmente não encapsulados. Essa bactéria pode

apresentar-se em diversas formas, que vão desde isolados, aos pares, em

cadeias curtas, ou agrupados irregularmente (com aspecto semelhante a um

cacho de uvas), devido à sua divisão celular, que ocorre em três planos

perpendiculares. O Staphylococcus foi descrito pela primeira vez em 1880, em

pus de abscessos cirúrgicos, pelo cirurgião escocês Alexandre Ogston e

atualmente é um dos microorganismos mais comuns nas infecções piogênicas

em todo o mundo.

28

Ainda segundo Santos e outros (2007) o gênero Staphylococcus

pertence à família Micrococcae, juntamente como os gêneros Planococcus,

Micrococcus e Stomatococcus. Atualmente, o gênero Staphylococcus possui

33 espécies, sendo que 17 delas podem ser isoladas de amostras biológicas

humanas. Geralmente, esse gênero faz parte da microbiota da pele humana

normal e de outros sítios anatômicos. A espécie de maior interesse médico,

principalmente em ambiente nosocomial, é o Staphylococcus aureus, que está

frequentemente relacionado com diversas infecções em seres humanos.

TABELA 1: Valores de halos inibitórios esperados para Staphylococcus

spp

AGENTE DISCO RESISTENTE INTERMEDIARIO SENSÍVEL

Amoxicilina +Clavulanato

20/10 μg 19 - 20

Ciprofloxacin 5 μg 15 16-20 21 Gentamicina 10 μg 12 13-14 15 Imipenem 10 μg 13 14-15 16 Sulfazotrim 23,75/1,25

μg

10 11-15 16

FONTE: Adaptado do Manual para Antibiograma Difusão em Disco, 2011.

3.9 Atividade Antimicrobiana

Segundo Tavares citado por Machado (2005), os agentes

antimicrobianos provocam dois tipos de efeitos em células microbianas: a

morte da bactéria ou a interrupção do seu crescimento e reprodução, desde

que a bactéria seja sensível ao agente. No primeiro caso denomina-se efeito

bactericida e no segundo efeito bacteriostático.

Segundo Tralbusi e outros citado por Machado (2005) a concentração

inibitória dos antimicrobianos pode ser determinados direta ou indiretamente. A

determinação direta é feita pelos métodos de diluição e, a indireta pelo método

de difusão em placa ou método de disco.

De acordo com Sejas e outros (2003) o método de disco-difusão foi

idealizado por Bauer e outros. O teste de disco-difusão baseia-se na difusão,

através do ágar, de um antimicrobiano impregnado em um disco de papel-filtro.

A difusão do antimicrobiano leva à formação de um halo de inibição do

crescimento bacteriano, cujo diâmetro é inversamente proporcional à

concentração inibitória mínima.

29

4 METODOLOGIA

4.1 Tipo de Estudo

Trata-se de um trabalho experimental, qualitativo do potencial

antimicrobiano do óleo da semente de sucupira.

Para Cervo, Bervian e Silva (2007), a pesquisa é uma atividade voltada

para a investigação de problemas práticos ou teóricos por meio do emprego de

processos científicos, buscando uma resposta ou solução.

De acordo com Cervo, Bervian e Silva (2007), a experimentação

consiste no conjunto de processos utilizados para verificar as hipóteses.

4.2 Local do Estudo

O estudo foi desenvolvido no laboratório de microbiologia e bioquímica

da Faculdade Tecsoma, situado no município de Paracatu. O município

encontra-se localizado na região do Noroeste do Estado de Minas Gerais,

tendo como limites municipal ao norte a cidade de Unai-MG, ao sul as cidades

de Vazante-MG e Guarda-mor MG, ao Leste João Pinheiro-MG e Lagoa

Grande-MG e a oeste a cidade de Cristalina-GO.Ficando a 220Km de Brasília,

capital federal. (IBGE, 2011).

4.3 Obtenção do Material Botânico

As sementes de sucupira (Pterodon emarginatus) foram obtidas no

comercio local da cidade de Paracatu-MG.

4.4 Extração do Óleo Essencial

Após obtenção das sementes de sucupira (Pterodon emarginatus) no

comercio local da cidade de Paracatu-MG, essas foram levadas ao laboratório

de bioquímica e microbiologia da Faculdade Tecsoma, em seguida foram

desidratadas em estufa da marca Quimis, durante 4 dias, á temperatura de

30

100°c . Posteriormente foram trituradas em moinhos de faca, obtendo assim o

óleo bruto da semente de sucupira.

4.5 Cultura

Para elaboração do meio de cultura, inicialmente mediu-se 2.52

gramas de agar Muelle-Hintom , sendo colocados no vidro de relógio. Em

seguida mediu-se 62,5ml de água com a proveta e transferiu, tanto a água

como o meio agar Muelle-Hintom para o balão volumétrico. Posteriormente o

meio (Agua+ agar Muelle-Hintom) foi levado para o tripé e tela de amianto,

sobre o bico de Bulsen, depois procedeu-se com a homogeneização da

solução com o bastão de vidro, até o ponto de fervura. Logo após vedou-se a

abertura do balão volumétrico com algodão para ser esterilizado na autoclave.

Em seguida o meio de cultura foi distribuído nas placas de Petri.

4.6 Ensaio Antimicrobiano

Para avaliação in vitro, discos estéreis de papel filtro com 6 mm de

diâmetro foram impregnados com 30 μL, baseado na técnica descrita por Bauer

e outros citado por Araujo (2010) de óleo essencial da semente de sucupira

(Pterodon emarginatus) e depois distribuídos em meio agar Muelle- Hilton com

a bactéria Staphylococcus aureus.

31

5 RESULTADO E DISCURSÃO

A resistência aos antimicrobianos tornou-se um dos grandes problemas

de saúde pública do mundo contemporâneo, a resistência progressiva tem

despertado uma preocupação mundial, principalmente na busca continua de

novos antimicrobianos. O aumento de cepas resistentes a vários

antimicrobianos tem se tornado comum, destacando-se o Staphylococcus

aureus como um dos agentes mais frequentemente isolados em infecções

humanas. (DANTAS et al, 2010).

Neste contexto, segundo Melo citado por Kiatkoski (2011) as plantas

sempre desempenharam e continuam a desempenhar um papel fundamental

na manutenção da vida humana, não apenas pelo fornecimento de alimentos,

mas também por prover outras necessidades como o fornecimento de energia

térmica e medicamentos.

Durante séculos, as plantas foram a única fonte de agentes

terapêuticos para o homem, e o profundo conhecimento do arsenal químico da

natureza, pelos povos primitivos e indígenas pode ser considerado fator

fundamental para o descobrimento de substâncias tóxicas e medicamentosas

ao longo do tempo. (HOSTETTMAN; QUEIROZ; VIEIRA apud KIATKOSKI,

2011).

Para Cos e outros citado por Bresolin e Filho (2010) as principais fontes

de antimicrobianos tem sido as bactérias e os fungos, bem como a química

orgânica,entretanto deve-se ressalta que é crescente o interesse por outras

fontes, como as plantas.

O entusiasmo em relação ao uso de plantas medicinais e seus extratos

na assistência à saúde podem ser entendidos pela sua aceitabilidade, derivada

da inserção cultural e pela atual disponibilidade desses recursos, ao contrário

do que ocorre com outros medicamentos, que na sua maioria são dependentes

de matéria-prima e tecnologias externas. (SCHENKEL et al; SIMÕES et al apud

DUTRA et al, 2009).

No presente trabalho realizou-se antibiograma utilizando antibióticos

fornecidos pelo laboratório Laborclínica contra Staphylococcus aureus, em que

o resultado obtido é esboçado na seguinte tabela 2:

32

TABELA 2: Antibiograma: Staphylococcus aureus

Antibióticos Milímetros (mm)

Imipenem 22 mm

Sulfazotrim 11 mm

Norfloxacino 12 mm

Amoxilina + ácido Clavulânico 13 mm

Acido Pipemidico 2 mm

Gentamicina 11 mm

Ciprofaflaxcina 17 mm

Nitrofuramtoina 7 mm

FONTE: Elaborado pelo acadêmico Marcos Alan Oliveira Santos

Para classificação dos antibióticos testados em cepa de Staphylococcus

aureus, utilizamos como referência, os valores apresentados pelo manual para

antibiograma difusão em disco, conforme apresentado na seguinte tabela 3.

TABELA 3: Valores de referência dos halos dos antibióticos usados na clinica Staphylococcus spp

AGENTE DISCO RESISTENTE INTERMEDIARIO SENSÍVEL

Amoxicilina +Clavulanato

20/10 μg 19 - 20

Ciprofloxacin 5 μg 15 16-20 21 Gentamicina 10 μg 12 13-14 15 Imipenem 10 μg 13 14-15 16 Sulfazotrim 23,75/1,25

μg

10 11-15 16

FONTE: Adaptado do Manual para Antibiograma Difusão em Disco (Kieby e Bauer), 2011.

Analisando as duas tabelas expostas, observa-se que a cepa de

Staphylococcus spp, mostrou sensibilidade ao Imipenem e Ciprofloxacin.

Moderada inibição do halo a Amoxilicina+Clavulanato e resistente a

Gentamicina.

33

Observando as duas tabelas apresentadas, pode-se classificar quatro

antibióticos como é apresentado no seguinte gráfico 1.

GRÁFICO 1 : Classificação dos Antibióticos


Para avaliar o potencial antimicrobiano do óleo da semente de sucupira

utilizou-se o método de disco-difusão idealizado por Bauer e outros citado por

Sejas e outros (2003) em que o óleo da semente foi impregnado em discos de

papel-filtro e difundido no ágar Mueller-Hintom. A difusão do óleo levou a

formação de um halo de inibição do crescimento bacteriano.

TABELA 4: Halo de inibição do óleo da semente de Sucupira

Staphylococcus aureus

Óleo Milímetros

Óleo de sucupira 8 mm


34

O halo de inibição apresentado pelo óleo da semente de sucupira contra

cepa de Staphylococcus aureus correspondeu a 8mm.

Para Campos (2006) a atividade antimicrobiana é medida in vitro para

determinar a sensibilidade de um dado microorganismo a concentrações

conhecidas de determinado antimicrobiano. A determinação dessa atividade

pode ser efetuada por dois métodos principais: Diluição ou difusão.

O método de difusão, embora ainda seja muito utilizado, tem sido

substituído por outros métodos, pois não fornece bons resultados para

amostras pouco solúveis em sistema aquoso, bem como não permite a

comparação adequada entre diferentes amostras. Portando, para que se

obtenha resultados confiáveis nos testes de atividade antimicrobiana in vitro

deve-se levar em consideração as características físico-químicas da amostra

em teste. (BRESOLIN; FILHO, 2010).

Segundo Campos (2006) entre os numerosos fatores que afetam a

atividade antimicrobiana in vitro estão pH do meio,composição do meio,

estabilidade da amostra, tamanho do inoculo,tempo de incubação e atividade

metabólica do microorganismo.

Segundo Ricardo (2008) A concentração inibitória mínima do óleo,

consiste na menor concentração do antimicrobiano necessário para inibir a

multiplicação de um isolado bacteriano. Portanto a concentração inibitória

mínima é a menor concentração de um agente antibiótico que inibe o

crescimento visível de um após incubação in vitro.

Segundo Sejas e outros (2003) a difusão do antimicrobiano leva à

formação de um halo de inibição do crescimento bacteriano, cujo diâmetro é

inversamente proporcional à concentração inibitória mínima. Esse método é

qualitativo, ou seja, permite classificar a amostra bacteriana em suscetível,

intermediária ou resistente ao antimicrobiano.

Segundo Bresolin e Filho (2010) para á classificação da atividade

antimicrobiana, de extratos ou seus produtos de fracionamento podem ser

empregados os seguintes critérios: para concentração inibitória entre 10 e

100microlitros/ mL, é considerado como boa; entre 100 e 500 microlitros, como

atividade moderada; entre 500 e 1000microlitros/mL, como fraca atividade, e

quando a concentração inibitória mínima for maior que 1000microlitros/mL,

esses produtos podem ser classificado como inativos.

35

Utilizando a técnica de diluição, com o extrato da fração do óleo da

semente de sucupira, Dutra e outros (2009) relataram concentração inibitória

mínima de 2,5 gramas/mL para Staphylococcus aureus, e tendo a fração

atividade característica bactericida.

Segundo Araujo (2010) pode-se avaliar a eficácia dos extratos vegetais

considerados eficazes, ou seja, com atividade antimicrobiana desenvolvem

halo de inibição de maior ou igual a 8 mm.

O halo de inibição da semente de sucupira obteve inibição do halo de

8mm, tendo este halo boa eficácia na inibição de Staphylococcus aureus.

Não há um consenso sobre o nível de inibição aceitável de com base

no diâmetro do halo de inibição formado ao redor dos discos, extratos de óleos

ou outros produtos naturais quando comparados com antibióticos padrões.

Portando não se pode comparar o óleo de sucupira com os antibióticos

utilizados no antibiograma acima relacionado. (DUARTE, 2006).

Outro ponto importante é relatado quanto ao halo de inibição, pois

quanto menor o halo maior a concentração inibitória mínima, segundo Sejas

(2003) o diâmetro do halo é inversamente proporcional à concentração

inibitória mínima.

Contudo segundo Bresolin e Filho (2010) apesar das recentes pesquisas

com organismo marinhos e animais, e do reconhecimento da importância dos

antimicrobianos obtidos total ou parcialmente por síntese, ainda não existe

nenhum composto antimicrobiano obtido de plantas sendo empregado na

clinica.

36

6 CONCLUSÃO

Conclui-se no presente trabalho que, um dos maiores problemas de

Saúde Pública refere-se ao agravamento da resistência de cepas bacterianas

frente a antibióticos. No estudo desenvolvido foi avaliado o potencial

antimicrobiano do óleo da semente de sucupira, Pterodon emarginatus, contra

a cepa de Staphylococcus aureus. O óleo demonstrou um bom efeito

antimicrobiano, tendo sido avaliado pela técnica de difusão em agar. Outra

característica foi o efeito bactericida do óleo, frente ao Staphylococcus aureus

de com Dutra e outros (2009). Outro importante relato abordado no trabalho

corresponde ao fato de que, não possui nenhum antibiótico utilizado na clinica

proveniente de plantas, mesmo com tanta disponibilidade e aceitabilidade

desses recursos pela população e de serem reconhecidamente como

importantes antimicrobianos. Outro relato importante corresponde ao fato de

que não existe consenso sobre o nível de inibição aceitável de óleos ou outros

produtos naturais quando comparados com antibióticos padrões.

37

REFERÊNCIAS

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