Fatores de transcrição Foxo e indução de células T reguladoras Djalma Jonilson Jaqueline.

Fatores de transcrição Foxo e indução de células T reguladoras

Djalma

Jonilson

Jaqueline

Origem de células T reguladoras no timo e na periferia

Workman et al. Cell Mol Life Sci (2010) 66, 2603-2622

Vias de sinalização que convergem para a indução de Foxp3

Existe uma rede transcricional que determina a expressão de foxp3 e outros genes relacionados

às células T reguladoras?

Identificação molecular, estrutura e padrão de expressão do gene fkh (fox)

As proteínas expressas pelo gene fkh estão localizadas no núcleo

e portanto podem agir como um reguladores transcricionais

6

Subfamílias das protíenas Fox

15 Subfamílias classificadas de acordo com sua homologia

Kaestner, K. H., et al. Genes Dev. 2000 14: 142-146

Modificações pós-traducionais nos fatores de trancrição Foxo

Calnan, D.R., et al. Oncogene (2008) 27, 2276–2288

NES: Sequência de exportação nuclearNLS: sinal de localização nuclear

Funções dos fatores de transcrição FoxO nas células e organismos


Regulação dos fatores de transcrição FoxO


Regulação dos fatores de transcrição FoxO

Ouyang, W., et al. Trends in Immunology (2011) 32, 26-33

Interação entre FoxO e outros fatores de transcrição

Indução de genes pró-apoptóticos Inibição de genes relacionados ao ciclo celular

Indução da expressão de genes supressores de tumor

ER: Receptor nuclear de estrógenoCalnan, D.R., et al. Oncogene (2008) 27, 2276–2288

Remodelamento da cromatina por proteínas FoxO


Regulação de genes envolvidos na migração e homeostase de células T por Foxo1


(Naive) (Ativadas)

Papel de proteínas FoxO na ativação e diferenciação de células T

Ouyang, W., et al. Immunity (2009) 30, 358-371

Outra funções de proteínas FoxO em células T

Peng, S. L. Oncogene (2008) 27, 2337-2344


Modelo provável de diferenciação de nTregs no timo


Controle molecular da diferenciação de células T reguladoras induzida por TGF-β

OBJETIVO

Avaliar as funções de Foxo1 e Foxo3 em linfócitos T, principalmente no que se refere ao desenvolvimento de funcionalidade de Tregs.

Qual o efeito da deleção de Foxo1 e/ou Foxo3 em linfócitos T?WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)Foxo1-/-Foxo3+/-

Foxo1+/-Foxo3-/-

Foxo1-/-Foxo3-/-

Expressão Foxo Score

clínico

Histologia

8 semanas

A deleção de Foxo1 e Foxo3 em linfócitos T de camundongos resultou em caquexia, esplenomegalia, linfadenopatia, grande infiltrado de células mononucleares em órgãos vitais, aumento do título de

autoanticorpos e falecimento precoce dos animais, demonstrando um papel cooperativo de Foxo1 e Foxo3 na proteção contra uma desordem inflamatória fatal.

ELISA

Quais são as causas da imunopatologia observada em camundongos Foxo1-/-Foxo3-/-?

WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)Foxo1-/-Foxo3+/-

Foxo1+/-Foxo3-/-

Foxo1-/-Foxo3-/-

FACS

6 a 8 semanas

A desordem inflamatória observada em camundongos de 6 a 8 semanas está associada com a expansão específica da população de células CD4.

CD4

CD8

Qual é o fenótipo e função das células CD4 em camundongos Foxo1-/-Foxo3-/-? WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)Foxo1-/-Foxo3+/-

Foxo1+/-Foxo3-/-

Foxo1-/-Foxo3-/-

6 a 8 semans

Isolamento CD4 (FACS)

Foxo1 e Foxo3 desempenham função crítica na inibição da ativação e diferenciação de linfócitos T, mais especificamente a diferenciação em células CD4 efetoras

do tipo Th1 e Th17.

FACS

PMA+iono (4h)

FACS

Como é a diferenciação de Tregs em camundongos Foxo1-/-Foxo3-/-?


Foxo1+/-Foxo3-/-

Foxo1-/-Foxo3-/-

FACS (timo e baço)

3 semanas

timo

baço

timo baço

Em camundongos deficientes de Foxo1 e Foxo3 é possível observar menor frequência e número total de células T reguladoras no timo e no baço.

Como é a sobrevivência e proliferação das Tregs na ausência de Foxo1 e Foxo3?

FACS


Foxo1+/-Foxo3-/-

Foxo1-/-Foxo3-/-

Tregs

Cultura com FITC-VAD-FMK

FACS

3 semanas

Camundongos com 6 semanas

As Tregs deficientes de Foxo1 e Foxo3 apresentam sobrevivência semelhante às Tregs WT e maior proliferação.


Foxo1+/-Foxo3-/-

Foxo1-/-Foxo3-/-

Tregs

CD4 naive – CFSEAnti – CD3Esplenócitos irradiados (72h)

FACS

3 semanas

Como é a funcionalidade das Tregs in vitro e in vivo na ausência de Foxo1 e Foxo3?

FACS

CD4 T naive (4x105 )

Tregs WTTregs Foxo1-/-Foxo3-/-

(1x105)

Rag1 -/-

Mudança de pesoDesenvolvimento de colite

Foxo1 e Foxo3 são necessários para a função supressiva de células Treg.

6 semanas

Quais são os genes regulados por Foxo1 e Foxo3? WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)Foxo1-/-Foxo3-/-

Tregs baço (FACS)

Extração e amplificação

RNA

Hibridização Affymetrix

603 sondas analisadas (genes assinatura Treg)

189 sondas com diferença de expressão

(1.5)

• 33 genes positivamente correlacionados com a expressão de Foxp3 downregulados no DKO

• 3 genes negativamente correlacionados com a expressão de Foxp3 upregulados no DKO

• Sem mudanças na expressão de Foxp3, CTLA4 e CD25

• Maior expressão de genes correlacionados à proliferação celular• Maior expressão de genes codificantes para receptores de citocinas do padrão

Th1 e Th17 (IL-12, IL-18, IL-1 e IL-17)• Maior expressão de genes de fatores de transcrição (STAT1, Rorc, Rora e Ahr)

Devido à expressão semelhante de Foxp3 em Tregs WT e DKO, Foxo1 e Foxo3 podem controlar a expressão de uma série de genes assinatura de Treg

independentemente da expressão de Foxp3.

3 semanas

Os defeitos de Tregs deficientes para Foxo1 e Foxo3 são responsáveis pela imunopatologia observada em camundongos?

Foxo1-/-Foxo3-/- (CD45.2)

WT Tregs (CD45.1)(3x105)

FACS (Treg e CD4)

V

CD4

Os defeitos funcionais de Treg contribuem para o fenótipo inflamatório em camundongos deficientes de Foxo1 e Foxo3, sendo que estes também têm função na

supressão da expressão de citocinas inflamatórias nas Tregs.

3-4 dias

8 semanas

Qual a importância de Foxo1 e Foxo3 no controle de doenças autoimunes sistêmicas causadas por deficiência de Tregs?

BM scurfy (2x106 )

BM WTBM Foxo1-/-Foxo3-/-

(2x106)

Rag1 -/-

SobrevivênciaFACS

Foxo1 e Foxo3 são essenciais para a geração de um compartimento efetivo de Tregs para evitar a ativação de linfócitos T scurfy.

6ª 8 semanas

Qual a importância de Foxo1 e Foxo3 na diferenciação de Tregs no timo?

WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)Foxo1-/-Foxo3-/-

Isolamento CD4 timo

Cultura IL-2, anti-CD3 e anti-CD28 por 18 ou 54h

(TGF-β)

Expressão Foxp3 (FACS)Expressão mRNA Foxp3 (RT-PCR)

3 semanas

BM WT (2x106 ) CD45.1

BM Foxo1-/-Foxo3-/-

(2x106) CD45.2

Rag1 -/-

FACS Tregs timo

Foxo1 e Foxo3 podem controlar a transcrição e expressão de Foxp3 em Tregs do timo.

6ª 8 semanas

Qual a importância de Foxo1 e Foxo3 na diferenciação de Tregs na periferia?

WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)Foxo1-/-Foxo3-/-

Isolamento CD4 periferia(naive)

Cultura IL-2, anti-CD3 e anti-CD28 por 54h com ou sem TGF-β

Expressão Foxp3 (FACS)Expressão mRNA Foxp3 (RT-PCR)

3 semanas

Foxo1 e Foxo3 podem controlar a transcrição e expressão de Foxp3 em Tregs induzidas por TGF-β.

Foxo1 e Foxo3 se ligam no gene de Foxp3 para controlar a transcrição?

WT

Isolamento CD4 e Tregs (Foxp3+)

Preparação cromatina

Incubação com Ab anti-foxo1 e anti-foxo3

3 semanas

Precipitação com beads de proteína A agarose

PCR do precipitado

Anti-Foxo1 Anti-Foxo3

rVISTA tool

Foxo1 e Foxo3 interagem com o gene de Foxp3 e, possivelmente, podem controlar a sua transcrição.

Objetivo: Avaliar o papel dos fatores de transcrição Foxo na diferenciação de linfócitos.

Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos T na ausência de foxo1?

Animais com 3, 8 ou15 semanas

foxo1f/ f- WtCd4Cre foxo1f/f - KO

Citometria de fluxo CD44, CD69Linfocitos CD4+ TCRb+

LN, baço


Animais com 8 semanas


Linfocitos CD4+ TCRb+Incorporação de BrdU

LN, baço

Linfocitos CD4+ TCRb+PMA+IonomicinaElisa


Foxo1 é essencial na prevenção a ativação sistêmica e patológica de linfócitos T.



HE- infiltrado celularParalisia de membros posteriores

Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos B na ausência de foxo1?

Animais com 3,8 ou 15 semanas


LN, baço

Linfócitos B B220+Citometria de fluxo GL-7 e FAS




Quantificação de Igs e anticorpo anti DNA dupla fita.

Soro




Linfócitos T CD4+ CD44hiCitometria de fluxo CXCR5, PD-1, CD62L

Cxcr5-Tfh

LNBaço


A ausência de Foxo1 é capaz de induzir uma autoimunidade dependente de Linfócitos B (aumento de células no centro

germinativo, anticorpos circulantes, Tfh, expressão de il21 e Bcl6)



Linfócitos T CD4+ CD44hi do LNRT-qPCR Prdm1, Bcl6 e Il21.

LN

A ativação de linfócito T na ausência de Foxo1 é conseqüência da alteração homeostática devido a manutenção das células T?


foxo1f/ f- Cd4Cre foxo1f/f – foxo1f/ f- Il7ra tgCd4Cre foxo1f/f – Il7ra tg

Linfócitos T CD4+Citometria de fluxo CD44, CD69.

Fatores Foxo regulam 7Ilra



foxo1f/ fCd4Cre foxo1f/f foxo1f/ f- Il7ra tgCd4Cre foxo1f/f – Il7ra tg

Linfócitos T CD4+Citometria de fluxo CD44, CD69.


A expressão de IL-7Ra não é capaz de prevenir a ativação de linfócitos T na ausência de de foxo1 (não é conseqüência de

alteração homeostática).


foxo1f/ f- Cd4Cre foxo1f/f – foxo1f/ f- Il7ra tgCd4Cre foxo1f/f – Il7ra tg

LN, baço


A ausencia de Foxo1 interfere com as tolerâncias : central periférica ou dominante?

Transferência Medula óssea foxo1f/ f CD45.1Cd4Cre foxo1f/f CD45.1/2 E na proporção 1:4 WT:KO

Tcra-/-CD45.2

após 8 semanas

Linfócitos T CD4+Citometria de fluxo CD44, CD69., Foxp3

A ausência de Foxo1 interfere com as tolerâncias : central periférica ou dominante?

Foxo1 controla a tolerância dominante de células T (Tregs).

Transferência Medula óssea foxp3- foxo1f/ f+ foxp3-Cd4Cre foxo1f/f+ foxp3+

Tcra-/-CD45.2

após 6 semanas

Linfócitos T CD4+Citometria de fluxo CD44, CD69, Foxp3

Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das nTreg?



Citometria de fluxo Foxp3, CTLA-4 CD25 e CD62L.

Timo


periferia



Citometria de fluxo Foxp3, CD44, CD103 CD62L CD127

Linfócitos CD4+ TCRb+

LN, baço

Foxp3+


Foxo1 controla a homeostase e o desenvolvimento de célula nTreg (diminuição de CTLA-4, CD-25 e CD62L).



Linfócitos CD4+ TCRb+Citometria de fluxo CTLA-4

LN

Naive

Estimuladas3 dias aCd3 aCD28 e TGFb

Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das iTreg?

foxo1f/ f- WtER4Cre foxo1f/f – KO Tamoxifeno

Linfócitos naives CD4+ Cd69- Cd25- foram isoladas

Citometria :Proliferação CFSEExpressão de Foxp3 após 3 dias de tratamento com TGFb ou não



Linfócitos naivesCD4+ Cd69- Cd25- foram isoladas

Citometria :Expressão de Foxp3, CTLA-4, CD25 , IFN-g após 3 dias de tratamento com TGFb ou não


Foxo1 controla a responsividade de célula iTreg na TGF-b (diminuição de CTLA-4 CD-25 e CD62L).


Linfócitos naives CD4+ CD69- CD25- foram isoladas dos animais LN

Co- cultura células CD45.1 WT Naives também de LN

Citometria :Expressão de Foxp3,GITR g após 3 dias de estímulo com TGF ,b aCD3 e aCD28

Foxo3 colabora com Foxo1 no desenvolvimento de linfócitos T?


CD4Cre-Cd4Cre foxo1f/f foxo3kca/kca

HE- infiltrado celularImunofluorescencia a dsDNA



foxo1f/f foxo3f/fCd4Cre foxo1f/f foxo3f/f

Citometria de fluxo CD44, CD69Linfócitos CD4+ TCRb+




LN, baço



Foxo3 e Foxo1 possuem papeis sobrepostos no desenvolvimento e função de linfócitos t reguladores derivados do timo apesar de não serem necessários para

expressão e manutenção de Foxp3.



Linfócitos T CD4+citometria de fluxo CD25, FOxp3 eTCRb

Treg periférica

Timo

LN


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