Forma selvagem e formas mutantes da Fenilalanina Hidroxilase … · 2010. 10. 3. · mutantes. Os...

UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA VEGETAL

Forma selvagem e formas mutantes da Fenilalanina Hidroxilase Humana

(hPAH) recombinante: avaliação de interacções com diferentes Chaperones

Moleculares

INÊS RODRIGUES SILVA CRISTO Dissertaçã

o orientada

pelas Prof.as Doutoras Ana Paula Leandro e Isabel Tavares de

FACULDADE DE CIÊNCIAS DA UL

MESTRADO EM BIOLOGIA MOLECULAR E GENÉTICA

2008

ii

UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE CIÊNCIAS


Forma selvagem e formas mutantes da Fenilalanina Hidroxilase Humana

(hPAH) recombinante: avaliação de interacções com diferentes Chaperones

Moleculares

INÊS RODRIGUES SILVA CRISTO Dissertação orientada

pela Prof.a Doutora Ana Paula Leandro GRUPO DE METABOLISMO E GENÉTICA

iMED.UL, FACULDADE DE FARMÁCIA DA UL

e pelo Prof. Doutor Mário Santos


FACULDADE DE CIÊNCIAS DA UL

MESTRADO EM BIOLOGIA MOLECULAR E GENÉTICA

2008

iii

Resumo

Os chaperones moleculares desempenham um papel crucial nos vários processos

celulares relacionados com a aquisição e manutenção da conformação proteica, sendo

por isso peças importantes na patogénese das doenças conformacionais,

nomeadamente da fenilcetonúria (PKU), uma doença genética causada por uma

deficiente actividade da fenilalanina hidroxilase (hPAH). Embora seja presentemente

reconhecido que a maior parte das proteínas hPAH mutantes apresentam alterações na

sua conformação, são ainda escassos os conhecimentos acerca das interacções entre

estas proteínas e os chaperones moleculares.

Utilizando um sistema procariota, a forma selvagem e as formas de hPAH mutantes

I65T, R261, R270K e V388M foram co-expressas com os sistemas de chaperones

moleculares GroESL, DnaKJ e DnaKJ/GrpE. Após purificação, as proteínas hPAH

recombinantes foram caracterizadas relativamente à quantidade obtida, actividade

enzimática e perfil de oligomerização. A mesma estratégia experimental foi utilizada

para estudar o efeito da adição do chaperone químico glicerol sobre as proteínas hPAH

mutantes.

Os resultados obtidos indicam que a co-expressão dos chaperones moleculares,

embora induza um aumento das proteínas totais da célula, não resulta num aumento do

rendimento das proteínas hPAH mutantes. No entanto, a presença de GroESL conduziu

a um aumento da actividade enzimática das formas mutantes que variou entre 1,3

(I65T) e 2,8 vezes (R261Q). Na presença do sistema DnaKJ, apenas as formas

mutantes I65T e R270K apresentaram um aumento de actividade de 1,3 e 2,6 vezes,

respectivamente. Este aumento da actividade não foi, no entanto, acompanhado por

incremento na percentagem dos tetrâmeros. Curiosamente, não foi possível observar

um efeito aditivo após adição de glicerol ao sistema de co-expressão.

Os dados obtidos indicam que, embora o sistema GroESL não apresente

especificidade relativamente às proteínas mutantes, o efeito do sistema DnaKJ será

dependente da forma mutante. Adicionalmente, os chaperones moleculares não

parecem estar envolvidos no processo de montagem pós-tradução da estrutura

tetramérica da proteína. Finalmente, as interacções que ocorram entre as proteínas

mutantes e os chaperones moleculares não serão estabilizadas pela presença de

chaperones químicos.

Palavras-chave: Fenilcetonúria; Fenilalanina hidroxilase humana; Chaperones

moleculares; Estabilização de proteínas mutantes.

iv

Abstract

Molecular chaperones play a crucial role in the several celular processes related to

the acquisition and maintenance of protein folding, being important pieces in the

pathogenesis of conformational diseases, namely phenylketonuria (PKU), a genetic

disorder caused by a deficient activity of phenylalanine hydroxylase (hPAH). Although it

is now recognized that most of the hPAH mutant proteins present conformational

changes, there is a lack of knowledge concerning the interactions between these

proteins and molecular chaperones.

Using a prokaryotic system, the wild type hPAH and the mutant forms I65T, R261Q,

R270K and V388M were co-expressed with the molecular chaperone systems GroESL,

DnaKJ and DnaKJ/GrpE. After purification, the yield, activity and oligomerization profile

of hPAH recombinant proteins were characterized. The same experimental strategy was

used for the study of the effect of the chemical chaperone glycerol on the hPAH mutant

proteins.

The results indicate that co-expression of molecular chaperones, although induci in

the yield of the purified mutant hPAH enzymes. However, in the presence of GroESL,

the enzyme activity of I65T and R261Q presented an increment of 1.3 and 2.8 fold,

respectively. A similar result was obtained in the presence of DnaKJ system, where a

1.3 and 2.6 fold increase was observed for the mutant forms I65T and R270K,

respectively. Contrarily to the expected, an higher level of tetrameric forms were not

obtained. Furthermore, after the addition of glycerol to the co-expression system, an

additive effect was not observed.

The obtained data indicate that, although the GroESL system interactions are not

mutant-specific, contrarily to the effect of the DnaKJ system (mutant dependent).

Additionally, the molecular chaperones do not seem to be involved in the process of

post-translation assembly of the tetrameric structure of the protein. Finally, the

interactions that occur between the mutant protein and molecular chaperone are not

stabilized by the presence of a chemical chaperone.

Keywords: Phenylketonuria, human Phenylalanine Hydroxylase, Molecular

Chaperones, Stabilization of mutant proteins.

v

Agradecimentos

Gostaria de agradecer à Prof. Doutora Paula Leandro, por todo o seu apoio e por

me ter supervisionado no meu início no mundo da investigação. Todo o seu esforço,

optimismo e noites mal dormidas foram muito importantes para o bom decorrer de todo

este ano.

Gostaria também de agradecer à Prof. Doutora Isabel Tavares de Almeida, por me

ter recebido no seu grupo de investigação, e ao Prof. Doutor Mário Santos por aceitar

conduzir a orientação da minha tese de mestrado.

À Isabel e à Ana, um muito obrigado por fazerem com que o trabalho nunca

parasse e pelas conversas sempre “apetitosas”.

Um grande obrigado à “mamã” Sara e à “tia” Andreia pelo apoio e, mais importante,

o bom ambiente e brincadeiras que sempre proporcionaram no laboratório, sem

esquecer os bolinhos do Algarve e as bolachas holandesas.

Por tudo o que fez para me ajudar, entre discussões científicas e outras menos

científicas (conversas filosóficas e grandes intervenções), pelas piadas originais e boa

disposição, um grande obrigado ao meu colega de “stress” Rafael (e ao seu bolo de

chocolate).

Um grande beijinho para a Ana Rute, Bruno, Cátia, Leonor, Ricardo, Rita e Telma

(grupo do costume) pelo apoio e bons jantares.

Por último, mas sem dúvida o mais importante, queria agradecer aos meus pais e

irmão, por me terem aturado durante este ano, tanto rabugenta, cansada, como

eléctrica. Estiveram sempre lá para me ouvir e apoiar. Por tudo isso, um grande beijo e

obrigado.

vi

Lista de abreviaturas

A Adenina

ADP Adenosina difosfato

ATP Adenosina trifosfato

BH4 6(R)-L-eritro-5,6,7,8-tetra-hidrobiopterina

Bisacrilamida N,N’-metileno-bis-acrilamida

bp par de bases

BSA albumina sérica bovina

cDNA DNA complementar ao mRNA

Da Dalton

DNA ácido desoxirribonucleico

dNTP desoxinucleosidos trifosfato

G Guanina

h hora

His Histidina

HPA Hiperfenilalaninémia

hPAH Fenilalanina Hidroxilase humana

IPTG isopropil-1-tio-β-D-galactosídeo

kb quilobases

kDa quiloDalton

min minutos

mA mili amperes

mRNA ácido ribonucleico mensageiro

nm nanómetro

PAGE Electroforese em gel de poliacrilamida

PAH Fenilalanina Hidroxilase

PAH wt Fenilalanina Hidroxilase forma selvagem

PCR reacção de polimerização em cadeia

PKU Fenilcetonúria

PVDF difluoreto de polivinilideno

RNA ácido ribonucleico

SDS dodecil sulfato de sódio

T timina

Tris tris(hidroximetil)metilamina

U uracilo

V Volt

Índice

1. Introdução .............................................................................................1

1.1. Processos intracelulares de aquisição da conformação proteica....... 1

1.1.1. Sistema Hsp70 / DnaK ..................................................................................2 1.1.2. Sistema Hsp60 / GroEL.................................................................................3 1.1.3. Cooperação entre DnaK e GroEL ................................................................4

1.2. Doenças Conformacionais ....................................................................... 5

1.2.1. A Fenilcetonúria .............................................................................................6 1.2.2. A Fenilalanina Hidroxilase ............................................................................7 1.2.3. Modulação da estabilidade de hPAH mutantes ..........................................8

1.3. Objectivo do trabalho................................................................................ 9

2. Materiais e Métodos ...........................................................................10

2.1. Estudos sobre a interacção entre chaperones moleculares/químicos e hPAH recombinante .................................................................................... 10

2.1.1. Vectores e Estirpes bacterianas.................................................................10 2.1.2. Indução e Expressão Proteica ....................................................................11 2.1.3. Purificação de proteína PAH humana recombinante................................12 2.1.4. Quantificação proteica ................................................................................12 2.1.5. Ensaios enzimáticos....................................................................................13 2.1.6. Ensaios de cross-linking.............................................................................13 2.1.7. Análise proteica em géis de poliacrilamida...............................................14 2.1.8. Análise de Western blotting........................................................................15

2.2. Avaliação num sistema de expressão eucariótica in vitro do mecanismo de degradação da hPAH recombinante................................... 16

2.2.1. Vectores e Estirpes bacterianas ............................................................16 2.2.2. Mutagénese dirigida ....................................................................................16

3. Resultados e Discussão.....................................................................19

3.1. Efeito da presença de chaperones moleculares e químicos sobre formas mutantes de hPAH recombinante estruturalmente afectadas...... 19

3.1.1. Integridade dos vectores de expressão dos chaperones moleculares ..19 3.1.2. Co-expressão de chaperones moleculares e proteínas hPAH mutantes

na ausência e presença de glicerol......................................................................20

3.1.3. Purificação e quantificação das proteínas hPAH co-expressas com chaperones moleculares na ausência e presença de glicerol...........................21 3.1.4. Actividade enzimática das proteínas hPAH co-expressas com chaperones moleculares na ausência e presença de glicerol...........................25 3.1.5. Ensaios de cross-linking .............................................................................26

3.2. Clonagem e preparação de sistema de expressão eucariótica in vitro para avaliação do mecanismo de degradação da hPAH recombinante ... 27

4. Conclusões .........................................................................................29

5. Referências .........................................................................................31

Índice de figuras Figura 1 – Representação esquemática do mecanismo de acção do sistema

DnaKJ/GrpE ......................................................................................................................3 Figura 2 – A) Imagem de cristalografia dos chaperones GroES e GroEL. B)

Representação esquemática do mecanismo de acção do sistema GroESL . ..................4 Figura 3 – Representação esquemática do mecanismo de cooperação proposto para os

sistemas GroESL e DnaKJ/GrpE . ....................................................................................5 Figura 4 – Hidroxilação do aminoácido aromático L-fenilalanina (L-Phe) em L-tirosina

(L-Tyr) pela enzima fenilalanina hidroxilase (PAH). ..........................................................7 Figura 5 – A) Diferentes perspectivas do modelo da forma tetramérica da fenilalanina

hidroxilase. B) Dímero da fenilalanina hidroxilase humana...............................................8 Figura 6 – Separação electroforética, em gel de agarose (1%), dos produtos de

hidrólise dos vectores de expressão pOFX contendo os diferentes chaperones

moleculares .....................................................................................................................19 Figura 7 – Análise por SDS-PAGE dos lisados celulares obtidos após indução dos

vectores de expressão pOFX contendo os chaperones moleculares GroESL, DnaKJ e

DnaKJ/GrpE ....................................................................................................................20 Figura 8 – Análise por Western blotting (anticorpo Anti-His) das fracções solúveis dos

lisados celulares, após co-expressão das diferentes formas hPAH e os sistemas de

chaperones moleculares GroESL e DnaKJ/GrpE, na ausência e na presença de glicerol

........................................................................................................................................21 Figura 9 – Análise por SDS-PAGE e Western Blotting da purificação, por IMAC

(gradiente de imidazol) da proteína hPAHwt na ausência e presença de sobre-

expressão de diferentes chaperones moleculares . ........................................................22

Figura 10 – Rendimento de proteína hPAH recombinante obtida (µg hPAH/g proteína

total solúvel) após expressão na ausência e presença de co-expressão de chaperones

moleculares, com e sem glicerol no meio de cultura.......................................................24 Figura 11 – Actividade enzimática específica (nmol Tyr.min-1.mg-1) da forma selvagem

da hPAH (hPAHwt) produzida na ausência e presença de co-expressão dos diferentes

sistemas de chaperones moleculares, com e sem glicerol no meio de cultura...............25 Figura 12 – Actividade enzimática específica (nmol Tyr.min-1.mg-1) da formas hPAH

mutantes I65T, R261Q, R270K e V388M produzidas na ausência de co-expressão dos

diferentes sistemas de chaperones moleculares, na presença dos chaperones

moleculares e na presença de chaperones moleculares e glicerol a 1% .......................26

Figura 13 – Análise por separação electroforética em géis nativos de poliacrilamida das

proteínas recombinantes hPAH produzidas na presença e ausência de glicerol e

diferentes chaperones moleculares ...............................................................................27

Figura 14 – Análise em gel de agarose (1%) do perfil electroforético dos fragmentos

obtidos após hidrólise com a enzima XmaI. (A) Amostras provenientes da reacção de

mutagénese dirigida (pSG5Xma); (B) Amostras provenientes da reacção de ligação

entre o cDNA-PAHwt e pSG5Xma ..................................................................................28 Figura 15 – Electroforetograma do DNA proveniente da reacção de ligação entre o

cDNA-PAHwt e pSG5Xma .............................................................................................28

Índice de Tabelas Tabela 1 – Características gerais dos vectores de expressão utilizados para produção

das proteínas recombinantes em estudo. .......................................................................11

Tabela 2 – Anticorpos e respectivas diluições utilizados nos ensaios de Western Blotting

........................................................................................................................................16

Tabela 3 – Características dos programas utilizados na reacção de mutagénese dirigida

........................................................................................................................................17

Tabela 4 – Enzimas de restrição utilizadas para confirmação da integredidade dos

vectores de expressão dos sistemas de chaperones moleculares. ................................19

Tabela 5 – Quantidade de proteína obtida ao longo do processo de produção da forma

selvagem e de formas mutantes da hPAH sem e com sobre-expressão de chaperones

moleculares na ausência e presença de glicerol no meio de cultura. .............................23

1

1. Introdução 1.1. Processos intracelulares de aquisição da conformação proteica

Para que uma proteína exerça a sua função biológica é fundamental que apresente

uma conformação tridimensional específica (folding), a qual se encontra codificada na

sua estrutura primária. Esta estrutura funcionalmente activa (estrutura nativa), terciária

e/ou quaternária, resulta do estabelecimento de inúmeras interacções (covalentes e

não-covalentes) entre resíduos de aminoácidos da cadeia polipeptídica e a sua

aquisição é um processo complexo, que se encontra sujeito a inúmeras interferências.

No ambiente intracelular, onde estão presentes um elevado número de macromoléculas

e metabolitos, não é favorecida a formação de estruturas de dimensões elevadas, como

é o caso da estrutura nativa da maior parte das proteínas celulares. Paralelamente, à

medida que a cadeia polipeptídica é sintetizada nos ribossomas, são expostas ao meio

intracelular pequenas porções hidrofóbicas da sua sequência, as quais, caso não ocorra

o folding, terão tendência para agregar. Finalmente, sendo as proteínas moléculas

estruturalmente frágeis, situações de stress celular levam facilmente à perda da sua

conformação com consequente perda da funcionalidade.

Assim, para assegurar a formação e manutenção de proteínas estruturalmente

funcionais, a célula recorre a uma classe de proteínas designadas por chaperones

moleculares, que se encontram presentes na maior parte dos sistemas celulares

(procariotas e eucariotas). Estas moléculas são responsáveis: (i) pelo acompanhamento

e proteccção das proteínas nascentes, até estas estarem completamente sintetizadas e

apresentarem a sua conformação final [5, 6], prevenindo a formação irreversível de

agregados [7]; (ii) pelo acompanhamento de proteínas não-nativas destinadas à

translocação através de membranas e (iii) pelo folding de novo de proteínas

conformacionalmente alteradas. Os chaperones moleculares são ainda elementos

activos do sistema de controlo de qualidade proteica (Protein Quality Control; PQC),

reconhecendo proteínas misfolded e encaminhando-as para posterior degradação.

Os chaperones moleculares englobam um conjunto de proteínas estruturalmente

muito diversas, cujo modo de actuação assenta basicamente no reconhecimento de

resíduos hidrófobos expostos ou de segmentos não-estruturados da cadeia

polipeptídica [8-10]. Estas macromoléculas não fazem parte da estrutura proteica final

nem fornecem qualquer informação para o folding proteico. Embora, até à data, não

tenham sido ainda estabelecidas normas para a nomenclatura e classificação destas

proteínas, elas são frequentemente designadas por Hsp (Heat Shock Proteins),

2

encontrando-se agrupadas em famílias de acordo com a sua função e modo de acção.

Podemos realçar entre elas, a família das Hsp70, chaperoninas, Hsp90 e Small

Chaperone Like Proteins, sendo representantes desta última família o Trigger Factor

(TF) nas células procariotas e o complexo GimC/prefoldina nos sistemas eucariotas. De

entre estas macromoléculas, a família das Hsp70 e das chaperoninas são as que se

encontram melhor caracterizadas, quer a nível estrutural quer a nível funcional.

1.1.1. Sistema Hsp70 / DnaK

As proteínas pertencentes à família Hsp70, representada pelo DnaK nos organismos

procariotas, apresentam uma massa molecular na ordem dos 70 kDa, sendo

responsáveis pelo acompanhamento e protecção de proteínas recém-sintetizadas que

ainda não atingiram o folding final [5, 11-13]. Estes chaperones apresentam uma

especificidade baixa, uma vez que reconhecem não proteínas mas pequenas fracções

hidrofóbicas da cadeia peptídica recém-sintetizada, que normalmente se encontram

inacessíveis nas proteínas nativas, evitando a sua agregação [7, 9]. As Hsp70 são

proteínas monoméricas, constituídas por um domínio N-terminal de ligação ao ATP

(nucleotide binding domain; NBD) e um domínio C-terminal de reconhecimento do

péptido alvo (peptide binding domain; PBD) e que se podem encontrar num estado-

ATP, de baixa afinidade para o substrato e elevada taxa de permuta, ou num estado-

ADP, de elevada afinidade para o substrato e baixa taxa de permuta. Deste modo, a

associação e dissociação destes chaperones moleculares do péptido alvo é regulada

por ciclos de ligação e hidrólise do ATP, o qual por sua vez é regulado por co-factores

específicos, nomeadamente o Hsp40 (homólogo eucariota do DnaJ) [14]. Estes co-

chaperones são constituídos por um domínio N-terminal que estimula a hidrólise do ATP

ligado às Hsp70, designado por domínio J e um domínio C-terminal de ligação a

sequências péptidicas hidrofóbicas ou não estruturadas.

Assim, nas células procariotas, a acção do DnaK é iniciada pela ligação do DnaJ à

proteína nascente (Figura 1). Este conjunto associa-se então ao DnaK, que se encontra

no estado-ATP. Esta associação estimula a hidrólise do ATP ligado ao DnaK, que passa

ao estado-ADP com elevada afinidade para a proteína alvo. Para que haja libertação do

DnaJ, é necessária a actuação de um co-chaperone adicional, o GrpE. Este péptido, de

23 kDa, ao ligar-se ao domínio NBD do DnaK, induz uma alteração na sua

conformação, que conduz à libertação do ADP e dissociação do DnaJ. A ligação de

uma nova molécula de ATP ao domínio NBD do DnaK irá então induzir a libertação do

péptido alvo [7]. Este processo permite que a proteína alvo seja encaminhada para o

local correcto, onde será libertada após consumo de uma molécula de ATP [15-17].

3

Figura 1 – Representação esquemática do mecanismo de acção do sistema DnaKJ/GrpE. Adaptado de Frydman, J. [7]. (I) estado intermédio; (N) estado nativo; (U) proteína unfolded. Ver texto para detalhes.

1.1.2. Sistema Hsp60 / GroEL

À família das chaperoninas pertence um conjunto de complexos proteícos de

elevada massa molecular (≈ 900 kDa), que se apresentam como um duplo anel

cilindrico [16, 18-20]. Embora estruturalmente semelhantes, as chaperoninas

apresentam sequências bastante distintas, sendo geralmente divididas em dois grupos.

As proteínas pertencentes ao grupo I estão presentes nas eubactérias e em organitos

celulares de origem procariota, como as mitocôndrias e cloroplastos, sendo

representantes deste grupo o GroEL (Escherichia coli) e o Hsp60 (mitocôndria). As

chaperoninas do Grupo II encontram-se nas arqueobactérias e no citoplasma das

células eucariotas, sendo exemplo deste grupo o TRiC (Tailless complex polypeptide-1

[TCP1] Ring Complex).

Nas células procariotas, o duplo anel cilíndrico do complexo GroEL encontra-se

associado ao co-chaperone GroES (que tem como homólogo eucariota Hsp10), que

“tapa” uma das entradas da cavidade central formada pelo sistema GroEL [21],

designado lado cis (Figura 2A). Cada anel deste sistema é constituído por 7 sub-

unidades proteicas iguais. Por seu lado, cada monómero (≈ 60 kDa) apresenta os

domínios equatorial, intermédio e apical. Os dois anéis contactam entre si através do

domínio equatorial, onde se situa também o sítio de ligação ao ATP. O domínio apical

contém o sítio de ligação aos péptidos alvo e o sítio de ligação ao GroES, heptâmero

em anel em que cada sub-unidade apresenta uma massa molecular de 10 kDa.

4

O GroEL pode existir em dois estados conformacionais: um estado T (tense) com

baixa afinidade para o ATP mas elevada afinidade para péptidos não-nativos; e um

estado R (relaxed) que, pelo contrário, apresenta uma elevada afinidade para o ATP e

uma baixa afinidade para os péptidos não-nativos. Após ligação do péptido não-nativo

ao domínio apical do GroEL [22-24], dá-se a ligação do ATP e do GroES a esse mesmo

anel GroEL (ligação em cis), o que induz alterações conformacionais [25] que levam a

que a proteína não-nativa seja guiada para o interior da cavidade formada (Figura 2B),

onde encontra o ambiente adequado para que possa iniciar o processo de folding, de

acordo com o seu potencial termodinâmico [26] sem estar sujeita a agregação [27]. A

hidrólise do ATP, associado ao anel GroEL cis, induz alterações conformacionais no

anel GroEL trans tornando-o apto para se ligar ao ATP e a novas proteínas não-nativas,

o que por sua vez induz a libertação do GroES, do ADP e da proteína alvo do anel cis,

prosseguindo o ciclo.

O sistema GroESL é extremamente importante no controlo da formação de

agregados proteicos, uma vez que em células onde este sistema se encontra inactivado

foi observado um aumento de cerca de 30% de agregados [28]. Adicionalmente, este

sistema deverá constituir também uma peça fundamental na correcção da conformação

de grandes proteínas constituídas por vários domínios [29].

Figura 2 – A) Imagem de cristalografia dos chaperones GroES e GroEL (azul escuro); a azul claro encontra-se representada a estrutura do domínio equatorial, a verde o dominío intermédio e a azul esverdeado o domínio aplical . B) Representação esquemática do mecanismo de acção do sistema GroESL. Adaptado de Petsko, G. [30]. ( ) Proteína não-nativa; ( ) Proteína nativa.

1.1.3. Cooperação entre DnaK e GroEL

Na célula, à medida que vão sendo sintetizadas, as proteínas podem adquirir o seu

folding sem necessitar do apoio dos chaperones moleculares ou, pelo contrário,

poderão necessitar do acompanhamento de um ou mais sistemas de chaperones

5

moleculares, que neste caso irão actuar de uma forma concertada (Figura 3). Na

realidade, vários estudos indicam que, embora o DnaK tenha uma acção preferencial

sobre proteínas nascentes e o GroEL actue numa fase pós-tradução [6, 31], estes

sistemas poderão actuar sequencialmente [6]. Experiências onde foi induzida a sobre-

expressão da GroEL demonstraram um aumento das associações das proteínas-

substrato com o DnaK, as quais antecedem as associações com a GroEL no percurso

que leva à aquisição da conformação final dos péptidos produzidos [7]. Por outro lado,

ensaios onde foram efectuadas diferentes combinações de sobre-expressão dos

sistemas DnaK e GroEL, foi observado a diminuição da quantidade de proteínas

agregadas, sugerindo a existência de funções complementares entre estes chaperones

[32-36].

Figura 3 – Representação esquemática do mecanismo de cooperação proposto para os sistemas GroESL e DnaKJ/GrpE. A proteína nascente interage com o TF (Trigger factor), um chaperone molecular ATP-independente associado aos ribossomas, que mantem a proteína recém-sintetizada numa conformação “aberta” reconhecida pelo DnaJ. O sistema DnaKJ pode ainda conduzir a proteína ao sistema GroESL. Em qualquer um dos passos pode ser adquirida a conformação nativa da proteína alvo. Adaptado de Young J.C. et al [37]).

Finalmente, é de realçar que os chaperones moleculares não interagem

exclusivamente com proteínas nascentes, mas têm também um papel activo no folding

de novo de proteínas que se encontram estruturalmente alteradas, como resultado de

mutações ao nível do gene que as codifica ou de situações de stress celular [8].

1.2. Doenças Conformacionais

Presentemente, é reconhecido que um grande número de doenças que afectam o

ser humano, são resultado de alterações na conformação nativa de proteínas, que

deste modo perdem a sua função biológica [38, 39]. Estas patologias, designadas por

doenças conformacionais, têm assim como origem alterações no gene que codifica para

a proteína em causa (hereditárias ou adquiridas) ou modificações proteicas provocadas

6

por situações de stress celular. Quando a proteína alterada tende a formar agregados

intracelulares, uma vez que estes estados conformacionais têm frequentemente um

efeito tóxico para a célula (nova função), estamos na presença de um estado de gain of

function. Pelo contrário, quando as proteínas conformacionalmente alteradas são

reconhecidas pelo sistema PQC, sendo posteriormente encaminhadas para as vias de

degradação da célula, estamos na presença de um estado de loss of function [40].

1.2.1. A Fenilcetonúria

As Hiperfenilalaninémias (HPA) são Doenças Hereditárias do Metabolismo que

resultam de alterações no sistema de hidroxilação do aminoácido L-fenilalanina (L-Phe),

o qual é convertido em L-tirosina (L-Tyr). Este sistema é complexo, envolvendo a

actuação de várias enzimas e cofactores. No entanto, cerca de 99% das HPAs são

devidas a uma deficiente actividade da fenilalanina hidroxilase (PAH; EC 1.14.16.1)

sendo então designadas por fenilcetonúria (PKU; OMIM 261600). As manifestações

clínicas desta doença, que incluem disfunção cerebral (microcefalia, atraso mental

severo e irreversível e epilepsia) e alterações das capacidades motoras, são resultado

quer da acumulação de L-Phe no organismo (efeito tóxico), quer da diminuição de L-Tyr

(precursor dos neurotransmissores). O grave atraso psicomotor pode ser prevenido se

for instaurada a terapia adequada o mais precocemente possível, após o nascimento.

Presentemente, o tratamento desta patologia consiste apenas numa restrição na

ingestão de alimentos ricos em L-Phe (tratamento dietético), a qual deve ser observada

ao longo da vida.

Tendo em conta os valores de L-Phe plasmática apresentados pelos doentes à

nascença, a PKU pode ser agrupada em três classes: (i) PKU clássica, (ii) PKU

moderada e (iii) HPA não-PKU [41, 42]. A PKU clássica representa a forma mais grave

e necessita de uma terapia mais restritiva, enquanto a HPA não-PKU corresponde à

forma mais suave. Sabe-se presentemente que a heterogeneidade clínica observada é

resultado directo da elevada heterogeneidade genética. Na realidade, até Setembro de

2008 tinham sido já identificadas 531 mutações patogénicas no gene PAH

(www.pahdb.mcgill.ca).

Dos 226 doentes PKU detectados em Portugal até 2005, através do Programa

Nacional do Diagnóstico Precoce, foi possível obter o genótipo completo de 103

doentes [43, 44]. Foram assim identificadas 29 mutações diferentes, sendo as mutações

mais frequentes a IVS10nt-11G>A (17,3%), R261Q (16,3%), R270K (9,7%), V388M

(9,7%) e I65T (8,2%). Enquanto que as mutações I65T, R261Q e V388M estão

geralmente associadas a um fenótipo de PKU moderada, a IVS10nt-11G>A e a R270K

7

encontram-se associada ao fenótipo de PKU clássica. Devido à elevada

heterogeneidade genética, a maioria dos doentes PKU são heterozigotos compostos, ou

seja, apresentam dois alelos mutantes diferentes, pelo que tem sido postulado a

existência de fenómenos de complementação interalélica negativa entre as duas

diferentes sub-unidades mutantes [45].

1.2.2. A Fenilalanina Hidroxilase

A fenilalanina hidroxilase humana (hPAH) é uma enzima fundamental na regulação

dos níveis de L-Phe circulante, que, no Homem, são de aproximadamente 58±15 μM

[46]. Esta enzima é codificada pelo gene PAH, localizado no crossoma 12 [47] e que

cobre uma sequência genómica de 90 kb. Embora tenha sido já detectada expressão

residual nos rins [48] melanócitos [49], linfócitos [50] e vilosidades coriónicas [51, 52], a

PAH é uma enzima citosólica expressa maioritariamente nos hepatócitos. Esta proteína

catalisa a reacção de hidroxilação do anel aromático da L-Phe na presença de oxigénio

molecular (O2) e do cofactor 6(R)-L-eritro-5,6,7,8-tetrahidrobiopterina (BH4) originando

como produto da reacção L-tirosina (L-Tyr) (Figura 4).

Figura 4 – Hidroxilação do aminoácido aromático L-fenilalanina (L-Phe) em L-tirosina (L-Tyr)

pela enzima fenilalanina hidroxilase (PAH).

A clonagem do cDNA da PAH [53] permitiu a obtenção em larga escala da proteína

humana recombinante por expressão heteróloga o que por seu lado contribuiu para a

elucidação das características enzimáticas e estruturais desta proteína [54]. Assim, é

presentemente reconhecido que na sua conformação nativa a PAH é uma proteína

homotetramérica (Figura 5A) que resulta da dimerização de dímeros (Figura 5B) [55,

56]. Cada sub-unidade, constituída por 452 aminoácidos (≈ 50 kDa), apresenta no seu

centro activo um ião ferro, não hémico, na forma reduzida (Fe2+) e é constituída por 3

domínios, um domínio N-terminal regulador, um domínio catalítico e um domínio C-

terminal responsável pela tetramerização.

Em solução a hPAH encontra-se num equilíbrio dinâmico entre dímeros e

tetrâmeros, o qual se desloca para a forma tetramérica na presença do substrato L-Phe

[56-58]. Enzimaticamente, estas duas formas oligoméricas apresentam propriedades

8

diferentes. Enquanto que a forma dimérica segue uma cinética Michaeliana em resposta

ao aumento da concentração de substrato, os tetrâmeros apresentam uma resposta

sigmoidal, cooperatividade positiva, inibição por concentrações elevadas de substrato e

um Vmax superior ao da forma dimérica.

A BA B

Figura 5 – A) Diferentes perspectivas do modelo da forma tetramérica da fenilalanina hidroxilase. B) Dímero da fenilalanina hidroxilase humana. Adaptado de Flatmark T. e Stevens R.C. [54].

Estruturalmente, a PAH é uma proteína extremamente sensível a alterações de

resíduos de aminoácidos em qualquer parte da sua sequência. Deste modo, é

reconhecido, presentemente, que na sua maioria as mutações no gene PAH codificam

proteínas PAH conformacionalmente alteradas, mais susceptíveis a fenómenos de

agregação e/ou degradação proteolítica [2], pelo que a PKU é considerada uma doença

conformacional onde o efeito patológico resulta de uma loss of function.

1.2.3. Modulação da estabilidade de hPAH mutantes

Estudos recentes demonstraram que é possível obter um aumento da actividade

enzimática de formas mutantes da hPAH, quando estas proteínas são sintetizadas, num

sistema procariota [2, 59], na presença dos osmólitos naturais glicerol (1 %) e N-óxido

de trimetilamina (TMAO; 5 mM). Estes compostos de pequena massa molecular,

designados por chaperones químicos, foram responsáveis pela diminuição do conteúdo

de formas agregadas e pelo aumento das formas tetraméricas com maior actividade

[59]. Ensaios preliminares, onde a estrutura secundária destas formas tetraméricas

foram monitorizadas por dicroísmo circular, indicam que os chaperones químicos

induzem um aumento da estruturação, conduzindo deste modo à estabilização das

formas de hPAH mutantes.

9

1.3. Objectivo do trabalho Presentemente, é reconhecido que os chaperones moleculares exercem um papel

fundamental na modulação da patogenicidade das doenças conformacionais, uma vez

que têm a capacidade de intervir activamente não só no folding de proteínas recém-

sintetizadas, mas também no folding de novo de proteínas conformacionalmente

alteradas [7, 16, 60]. Embora para algumas doenças este mecanismo começe a ser

desvendado, são ainda raros os trabalhos envolvendo a PKU. Uma vez que foi já

demonstrado que proteínas hPAH mutantes conformacionalmente alteradas são

passíveis de ser estabilizadas pela acção de chaperones químicos, podemos postular

que também os chaperones moleculares apresentarão a capacidade de estabilizar

proteínas hPAH mutantes e assim conduzir a uma melhoria do fenótipo PKU.

Deste modo, este trabalho teve como objectivo principal o estudo das interacções

entre os chaperones moleculares ATP-dependentes DnaK e GroEL, homólogos

procariotas de Hsp70 e Hsp60, e as proteínas hPAH mutantes mais frequentes na

população PKU portuguesa, nomeadamente as formas I65T, R261Q, R270K e V388M

[43]. Como modelo de trabalho foram utilizadas células procariotas, onde os sistemas

DnaKJ/GrpE e GroESL foram co-expressos com as diferentes formas hPAH mutantes

em estudo. Adicionalmente, foi também investigado o efeito da presença de chaperones

químicos (glicerol) sobre as interacções chaperones moleculares/proteínas hPAH

mutantes recém-sintetizadas.

Numa segunda parte do trabalho, foram dados os primeiros passos experimentais

que irão permitir realizar o estudo destas interacções num sistema de expressão

eucariota cell free system, ensaios essenciais para extrapolar para a célula eucariota os

resultados observados no sistema de expressão procariota.

10

2. Materiais e Métodos

2.1. Estudos sobre a interacção entre chaperones moleculares/químicos e hPAH recombinante

2.1.1. Vectores e Estirpes bacterianas

As proteínas recombinantes em estudo (diferentes formas de hPAH e chaperones

moleculares) foram produzidos em células de Escherichia coli DH5αPro (deoR, endA1,

gyrA96, hsdR17(rk-mk

+), recA1, supE44, thi-1, Δ(lacZYA-argFV169), φ80δlacZΔM15, F-,

λ-, PN25/tetR, Placiq/laci, Spr), provenientes da Clontech. O cDNA PAH (Anexo 1)

encontrava-se já clonado [45] no sítio BamHI do sítio de clonagem múltipla (MCS) do

vector de expressão procariota pTrcHisB (Invitrogen). Este vector apresenta a montante

do MCS (Anexo 1): (i) o promotor trc (Ptrc), constituído por uma parte das sequências

dos promotores trp e lac (trp-lac); (ii) a sequência do gene LacIq, que codifica a proteína

repressora Lac; (iii) um potenciador de tradução, proveniente do gene 10 do

bacteriófago T7; (iv) a sequência de reconhecimento de ligação ao ribossoma (RBS); (v)

o codão de iniciação da tradução ATG; (vi) uma sequência de seis codões CAT, que

codificam o péptido hexa-histidil (6xHis) com afinidade para metais e que permite a

posterior purificação da proteína recombinante por cromatografia de afinidade com iões

metálicos (IMAC); (vii) a sequência codificante do epítopo Xpress (Asp-Leu-Tyr-Asp-

Asp-Asp-Asp-Lys) e (viii) a sequência codificante do péptido reconhecido pela

enterocinase, (EK; Asp-Asp-Asp-Asp-Lys ↓) que permite a posterior clivagem e remoção

do péptido de fusão. Este vector apresenta ainda a marca de resistência à ampicilina

(Amp) e a origem de replicação ColE1 (Tabela 1).

Os chaperones moleculares utilizados neste estudo foram gentilmente cedidos por

Olivier Fayet e o seu cDNA encontrava-se clonado no vector de expressão procariota

pOFXtac1 [4], derivado do vector pAPT110. O vector pOFXtac1 apresenta a origem de

replicação p15A, os genes de resistência à canamicina (Kan) e à espectinomicina (Spc),

o promotor tac (igualmente induzido na presença de IPTG) e o gene LacIq, que

assegura uma repressão eficiente da transcrição a partir do promotor tac (Tabela 1).

11

Tabela 1 – Características gerais dos vectores de expressão utilizados para produção das proteínas recombinantes em estudo.

Vector Tamanho (kb)

Origem de replicação Promotor Indutor1 Resistência2 Proteína

codificada pOFXtac1 7 p15A Ptac IPTG Kan/Spc - pOFXtac1-SL 9,2 p15A Ptac IPTG Kan/Spc GroESL pOFXtac1-KJ 10,5 p15A Ptac IPTG Kan/Spc DnaKJ pOFXtac1-KJE 11,3 p15A Ptac IPTG Kan/Spc DnaKJ/GrpE

pTrcHisB 4,4 ColE1 Ptrc IPTG Amp - pTrcHisB-PAH 6,6 ColE1 Ptrc IPTG Amp hPAH

pSG5 4,1 f1 PT7 - Amp - pSG5/Xma 4,1 f1 PT7 - Amp - pSG5/Xma-PAH 6,3 f1 PT7 - Amp hPAH

1IPTG - isopropil-β-D-tiogalactosidase. 2Kan – canamicina; Spc – espectinomicina; Amp – ampicilina.

2.1.2. Indução e Expressão Proteica Para produção das proteínas recombinantes, procedeu-se em primeiro lugar à

transformação, por choque térmico [61], de alíquotas de 100 μL de células de E.coli

DH5αPro competentes, com 10 ng do cDNA respectivo, isoladamente ou em simultâneo

consoante se pretendia obter apenas uma (hPAH ou chaperone molecular) ou duas

proteínas (hPAH e chaperone molecular), respectivamente. Estas células foram

incubadas durante a noite (D.N.), a 37ºC, após espalhamento em meio LB sólido

(triptona 1%, extracto de levedura 0,5%, NaCl 0,17 M, pH 7, agar 1,5%) contendo Amp

(LB/Amp), Kan e Spc (LB/Kan/Spc) ou Amp, Kan e Spc (LB/Amp/Kan/Spc), sempre

numa concentração de 50 μg/mL em cada, consoante pretendessemos produzir a

proteína hPAH, os chaperones moleculares ou simultaneamente a hPAH e os

chaperones moleculares, respectivamente.

Dos transformantes obtidos, foi seleccionada uma colónia bem isolada, para inocular

5 mL de meio LB líquido (triptona 1%, extracto de levedura 0,5%, NaCl 0,17 M, pH 7)

contendo Amp, Kan/Spc ou Amp/Kan/Spc. Após incubação a 37ºC, D.N., com agitação,

a cultura celular obtida foi utilizada para inocular 1 L de meio LB contendo o(s)

antibiótico(s) necessários, e novamente incubada a 37ºC, com agitação, até ser atingida

a fase exponencial de crescimento, monitorizada pela leitura da absorvência a 600 nm

(Abs600 ~0,5) num espectrofotómetro Hitachi (modelo U-2000).

A expressão das proteínas em estudo foi induzida através da adição de 1 mM de

isopropil-β-D-tiogalactosidase (IPTG; Eurobio). No caso da produção das diferentes

formas de hPAH, no momento da indução o meio de cultura foi ainda suplementado

12

com 0,1 mM de sulfato de amónio ferroso. Nos ensaios onde se pretendia estudar o

efeito da adição do chaperone químico, após adição do indutor a cultura foi dividida em

duas alíquotas iguais, tendo a uma delas sido adicionada glicerol numa concentração

final de 1%. Após 3 h de incubação a 37ºC, com agitação, foi obtido o sedimento

bacteriano, por centrifugação a 15294xg, a 4ºC, durante 15 min, o qual foi armazenado

a -20 ºC, nunca por períodos superiores a 1 mês.

2.1.3. Purificação de proteína PAH humana recombinante

O sedimento celular foi ressuspenso em tampão de lise (NaH2PO4 50 mM, NaCl 300

mM, pH 7,8; glicerol 10%) suplementado com 1 mM de fenilmetanosulfonil fluoreto

(PMSF; Sigma) e 1 mg/mL de lisozima (Eurobio), num volume correspondente a 1/100

do seu volume inicial. Após incubação, durante 30 min, a 4ºC, as células foram lisadas

por sonicação, a 4ºC, num sonicador Vibra Cell (Sonics Materials), utilizando 6 ciclos de

60 segundos cada (duty free cycle de 50%), com um intervalo de 30 segundos entre

cada ciclo. O lisado celular foi centrifugado a 10621xg, durante 20 min, a 4ºC, de forma

a separar a fracção proteíca solúvel da fracção insolúvel.

A purificação das proteínas hPAH recombinantes foi efectuada por IMAC, utilizando

a resina Ni-NTA (Qiagen) numa proporção de lisado celular:resina de 1:0,05

(volume:volume), de acordo com o método descrito anteriormente [45]. Deste modo,

após adição à fracção proteica solúvel de imidazol e β-mercaptoetanol, ambos numa

concentração final de 10 mM, a proteína foi purificada utilizando um gradiente de

imidazol (5x4 volumes de tampão de lise 20 mM de imidazol; 2x1 volume de tampão de

lise 150 mM em imidazol e; 5x1 volume de tampão de lise 250 mM em imidazol).

As fracções proteicas referentes às eluições com 150 mM e 250 mM de imidazol

foram introduzidas numa membrana de diálise com um Molecular Weight Cut-Off

(MWCO) de 12-14.000 Da (Spectra/Por®4) e colocadas em tampão de diálise (Tris-HCl

20 mM pH 7,5 e NaCl 100 mM), D.N., a 4 ºC, com agitação. As proteínas dialisadas

foram aliquotadas e armazenadas em azoto líquido. Após descongelamento, as

amostras proteicas não voltaram a ser congeladas.

2.1.4. Quantificação proteica As proteínas foram quantificadas pelo método colorimétrico de Bradford [62],

utilizando o reagente Bio-Rad Protein assay (Bio-Rad) e uma curva de calibração

(Anexo 3) constituída por albumina sérica bovina (BSA). As absorvências foram lidas a

595 nm no espectrofotómetro Hitachi. Todos os ensaios foram realizados em triplicado.

13

2.1.5. Ensaios enzimáticos A actividade enzimática específica das diferentes formas de hPAH recombinante em

estudo foi calculada por determinação da quantidade de tirosina formada por unidade

de tempo e em função da quantidade de hPAH presente no meio reaccional (ng Tyr.min-

1.mg-1), de acordo com o método descrito por Mártinez A. et al [56], com algumas

modificações. A reacção enzimática decorreu na presença de oxigénio atmosférico, à

temperatura de 25ºC, num volume reaccional de 800 µL contendo tampão Na-Hepes

100 mM pH 7, 1080 U/mL de catalase (Sigma), 1 mM de L-Phe (Sigma) e 5 µg de hPAH

recombinante de acordo com Leandro, P. [45].

Para quantificação da L-Tyr formada, foi utilizado o método do nitrosonaftol [63],

Este composto reage com a L-Tyr formando derivados fluorescentes que emitem a 570

nm (λem) quando excitados ao comprimento de onda de 460 nm (λexc). Deste modo, a

700 µL do sobrenadante da reacção enzimática, foram adicionados 350 μL de uma

solução de nitrosonaftol (1-nitroso-2-naftol 0,1% em etanol a 95%) e 350 μL de uma

solução extemporânea de NaNO2 (NaNO2 0,5 mg/mL; HNO3 20%). Após incubação a

55ºC, durante 30 min, esta solução foi colocada em gelo durante 5 min. O derivado

fluorescente foi extraído da mistura reaccional pela adição de 3,5 mL de 1-2-

dicloroetano. A intensidade de fluorescência da fase aquosa, obtida após centrifugação

a 453xg (rotor basculante) durante 5 min, à temperatura ambiente, foi determinada

utilizando um espectrofluorímetro Hitachi, (modelo F-2000) e ao λexc de 460 nm e um

λem de 570 nm. A concentração de L-Tyr presente na solução foi determinada utilizando

duas curvas padrão (Anexo 4), cobrindo diferentes gamas de concentração de L-Tyr

nomeadamente de 0,5-5 μM (gama baixa) e de 5-25 μM (gama alta). Os ensaios

enzimáticos foram sempre realizados em triplicado.

2.1.6. Ensaios de cross-linking Nos ensaios de cross-linking, foi utilizado o suberato de bis-[sulfosuccinimidil] (BS3;

Pierce) como cross-linker. Este composto é um cross-linker homobifuncional, análogo

dos ésteres NSH que, em soluções tamponizadas entre pH 7 e 9, reage eficientemente

com aminas primárias (-NH2) presentes, por exemplo, nos resíduos de lisina [64]. Uma

vez que o BS3 reage com aminas primárias, não foi possível utilizar o tampão Tris

(grupos amina), pelo que, em primeiro lugar, foi necessário proceder a uma ultra-

filtração (filtros Amicon Microcon P30, Millipore) das amostras de hPAH recombinantes

14

para substituir o tampão Tris-HCl pelo tampão Na-Hepes. A reacção de cross-linking foi

então efectuada utilizando uma proporção molar de proteína:BS3 de 1:500. Nestes

ensaios, foi sempre utilizada uma solução extemporânea de BS3 (preparada em tampão

Na-Hepes 20mM, pH 7, NaCl 200 mM). Após incubação durante 30 min, à temperatura

ambiente, procedeu-se ao quenching da reacção, através da adição de Tris-HCl 1 M,

pH 7,5, durante 15 min.

2.1.7. Análise proteica em géis de poliacrilamida

As proteínas em estudo foram analisadas por separação electroforética em gel

desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE), utilizando o sistema Mini-vertical Hoefer-

SE245 (GE Healthcare) e o método descontínuo de Laemmli [65]. Deste modo, foram

utilizados três tampões diferentes nomeadamente o tampão de concentração (Tris-HCl

0,125 mM, pH 6,8; SDS 0,1%), o tampão de separação (Tris-HCl 0,375 mM, pH 8,8;

SDS 0,1 %) e o tampão de electroforese (Tris base 3 g/L; glicina 14,4 g/L; SDS 1 g/L;

pH 8,3). A separação decorreu em géis com as dimensões de 80x60x1mm, nas

concentrações de acrilamida/bisacrilamida (30% T e 2,67% C) no gel de separação e de

concentração de 10 e 4%, respectivamente.

As amostras foram aplicadas, após aquecimento a 100 ºC, durante 5 min, num

volume final de 18 μl contendo 3 μl de tampão de deposição (Tris-HCl 0,24 M, pH 6,8;

glicerol 40%; SDS 8%; azul de bromofenol 0,02%), ao qual foi adicionado β-

mercaptoetanol (25%) imediatamente antes da sua utilização. Para proceder à

separação electroforética, foi aplicada uma corrente contínua de 20 e 40 mM no gel de

concentração e de separação, respectivamente. O sistema foi ainda arrefecido por

passagem de um caudal de água fria.

Após a separação e para visualização das proteínas, os géis foram colocados numa

solução de azul brilhante de Comassie R250 0,1% (metanol 27% e ácido acético 18%),

durante 30 min, à temperatura ambiente e posteriormente mergulhados numa solução

de diferenciação (metanol 30% e ácido acético 10%).

As proteínas recombinantes foram também submetidas a uma separação

electroforética em géis nativos. O procedimento experimental foi efectuado de acordo

com o descrito para o sistema SDS-PAGE, exceptuando a ausência de SDS nos

tampões de concentração, de separação, de electroforese e de deposição, este último

não contendo também β-mercaptoetanol. As amostras foram aplicadas sem serem

previamente aquecidas a 100 ºC.

A massa molecular das proteínas recombinantes foi determinada por comparação

com o perfil electroforético de diferentes marcadores de massa molecular. Assim, de

15

acordo com a técnica utilizada recorreu-se aos marcadores: (i) SDS-PAGE Pre-Stained

Low Range (BioRad), constituído por fosforilase B (103 kDa) BSA (77 kDa), ovalbumina

(50 kDa), anidrase carbónica (34,3 kDa), inibidor de tripsina de soja (28,8 kDa) e

lisozima (20,7 kDa); (ii) SDS-PAGE Molecular Weight Standard Low Range (BioRad)

composto por fosforilase B (97,4 kDa), BSA (66,2 kDa), ovalbumina (45 kDa), anidrase

carbónica (31 kDa), inibidor de tripsina de soja (21,5 kDa) e lisozima (14,4 kDa) e; (iii)

Amersham High Molecular Weight for native electrophoresis (GE Healthcare), contendo

tiroglobina (669 kDa), ferritina (440 kDa), catalase (232 kDa), lactato desidrogenase

(140 kDa) e BSA (67 kDa).

2.1.8. Análise de Western blotting

As proteínas em estudo foram também analisadas pela técnica de Western Blotting.

Assim, após separação electroforética procedeu-se à transferência das proteínas para

uma membrana de PVDF (Amersham Hybond-P; GE Healthcare), previamente

equilibrada em tampão Towbin (Tris-HCl 25 mM, pH 8,3, glicina 192 mM, metanol 20%)

[66]. Foi utilizado um sistema de transferência semi-seco (Trans-Blot SD; Bio-Rad), o

qual foi submetido a uma corrente contínua de 100 mA (voltagem nunca superior a 25

V).

As proteínas transferidas foram visualizadas por imunodetecção, tendo-se recorrido

a anticorpos específicos (Tabela 2) conjugados com a enzima horseradish peroxidase

(HRP). O processo de conjugação com os anticorpos decorreu de acordo com as

instruções fornecidas pelos fabricantes utilizando tampão PBS/T (NaCl 137 mM, KCl 27

mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM e Tween-20 0,05%). O bloqueamento decorreu

durante 3 h, à temperatura ambiente, com agitação constante, em tampão PBS/T

contendo e 5% de leite magro. O anticorpo primário (diluído em tampão PBS/T) foi

incubado com a membrana durante 1 h, à temperatura ambiente e quando necessário

utilizar um anticorpo secundário (diluído em tampão PBS/T) este foi colocado em

contacto com a membrana durante 1 h, à temperatura ambiente, com agitação

constante.

A reacção de visualização foi efectuada com o sistema SuperSignal® West Femto

Trial (Pierce), tendo a membrana sido mergulhada durante 5 min numa solução

contendo 75 μL de solução de peróxido, 75 μL de solução de luminol e 2,5 mL de água.

Findo este tempo, a membrana foi colocada em contacto com o filme o Amersham

Hyperfilm ECL–High performance chemiluminescence film (GE Healthcare), durante 15

min, ao fim dos quais se procedeu à revelação através da passagem por uma solução

16

de revelação (Polymax RT Developer; KODAK) e uma solução de fixação (Polymax RT

Fixer; KODAK). Tabela 2 – Anticorpos e respectivas diluições utilizados nos ensaios de Western Blotting. Proteína recombinante

Anticorpo primário Anticorpo secundário Diluição do anticorpo (primário/secundário)

hPAH

Anti-His-HRP (Invitrogen) - 1:5000

GroEL Rabbit Anti-GroEL (Stressgen)

Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)-HRP (BioRad) 1:7500 / 1:20000

GroES Rabbit Anti-GroES (Stressgen)

Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)-HRP (BioRad)

1:7500 / 1:20000

DnaK Mouse Anti-DnaK (Stressgen)

Goat Anti-Mouse IgG (H+L)-HRP (BioRad)

1:7500 / 1:20000

DnaJ Rabbit Anti-DnaJ (Stressgen)

Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)-HRP (BioRad) 1:7500 / 1:20000

2.2. Avaliação num sistema de expressão eucariótica in vitro do mecanismo de degradação da hPAH recombinante

2.2.1. Vectores e Estirpes bacterianas

Nos ensaios de clonagem do cDNA da PAH, foi utilizada a estirpe de Escherichia

coli DH5αPro (alínea 2.1.1.) e nas reacções de mutagénese dirigida recorreu-se à

estirpe de Escherichia coli XL1-Blue supercompetentes (recA1, endA1, gyrA96, thi-1,

hsdR17, supE44, relA1 lac [F’ proAB lacIqZΔM15Tn10 (tetr)]).

O cDNA PAH foi inserido no vector de expressão eucariota pSG5, adquirido à

Stratagene [67]. Este vector apresenta: (i) as origens de replicação procariotas f1 (DNA

cadeia simples) e pUC e a origem de replicação eucariota SV40; (ii) os promotores

SV40 e T7; (iii) um sinal de poli-adenilação (SV pA); (iv) o intrão II da β-globina, que

possibilita o splicing dos transcriptos expressos. Apresenta ainda, a jusante do

promotor, um MCS com locais de restrição para a EcoRI, BamHI e BglII.

2.2.2. Mutagénese dirigida

A criação de um local de reconhecimento para a XmaI no MCS do pSG5 foi

efectuada por mutagénese dirigida, utilizando o sistema Quickchange II Site-Direct

Mutagenesis (Stratagene) [68]. O protocolo fornecido pelo fabricante foi modificado de

modo a permitir a inserção de 4 bp [69]. Assim, foram efectuados em primeiro lugar

17

duas reacções designadas de pré-PCRs, em que cada reacção de PCR apenas contém

um dos primers.

Os oligonucleótidos mutagénicos (Primer A: 5’- CTC ACT ATA GGG CCC GGG

AAT TCG GAT CC-3’ e Primer B: 5´-GG ATC CGA ATT CCC GGG CCC TAT AGT

GAG-3’), sintetizados pela Metabion, foram desenhados de acordo com os parâmetros

óptimos de tamanho, estabilidade de ligação nos terminais 5’ e 3’ (conteúdo em

citosinas (C) e guaninas (G); GC) e temperatura de fusão (Tm). As reacções de pré-

PCR decorreram num volume final de 50 μL contendo 40 ng de DNA molde, 1,25 pg de

cada um dos primers, dNTPs (40 μM em cada), 1U de DNA polimerase PfuUltra HF e o

tampão fornecido pelo fabricante. O DNA foi amplificado num termociclador PCR-

Express (Hybaid), utilizando o programa 1 (Tabela 3). Após terminada a reacção de pré-

PCR, foram retirados 25 µL de cada reacção para um novo tubo, tendo esta solução

sido suplementada com 1 U de DNA polimerase PfuUltra HF e sujeita a nova

amplificação (programa 2; Tabela 3).

Tabela 3 – Características dos programas utilizados na reacção de mutagénese dirigida. Programa

Nº Ciclos Tempo (segundos) Temperatura (ºC)

1 1 30 95 4 30/ 60/ 504 95/ 53/ 68 2 1 30 95 16 30/ 60/ 720 95/ 58/ 68

Finalmente, o produto de PCR final foi hidrolisado com 15 U de DpnI, durante uma

hora, a 37ºC. Findo este tempo, procedeu-se à transformação de células XL1-Blue por

choque térmico. Das colónias resultantes foi preparado DNA (mini-prep), utilizando a

técnica descrita por Konecki, D.S. [70].

A correcta introdução da sequência pretendida foi rastreada por digestão do DNA

proveniente das mini-preps com a enzima XmaI (New England Biolabs). O vector obtido

foi designado por pSG5/Xma.

2.2.3. Clonagem em pSG5

O cDNA da hPAHwt (phPAH247; referência de acesso - GenBank U49897)

encontrava-se clonado no sítio EcoRI do plasmídeo pBR322. Deste modo, para efectuar

a sua clonagem no vector pSG5/Xma, em primeiro lugar foi necessário retirar o insert

phPAH247 daquele plasmídeo, por hidrólise com a enzima EcoRI. Paralelamente, o

pSG5/Xma foi também submetido à acção da EcoRI. Após separação em gel de

agarose SeaPlaque a 1% (Lonza), os fragmentos linearizados foram extraídos utilizando

18

o sistema Qiaquick Gel Extraction (Qiagen) [71]. Procedeu-se então à hidrólise de

ambos os DNAs com a enzima XmaI. Os fragmentos obtidos foram novamente

purificados e utilizados para proceder à reacção de ligação. Deste modo, a reacção foi

executada num volume final de 30 µL, a 16ºC, D.N., na presença de 15 µL de cDNA

hPAHwt, 10 µL pSG5/Xma, 3 µL de tampão do fabricante e 2 µL de ligase (Biolabs).

Paralelamente, foi também efectuado um ensaio controlo, onde se omitiu a presença do

cDNA PAH. A reacção de ligação decorreu D.N., a 16ºC. O produto resultante desta

reacção foi, então, utilizado na transformação de células de Escherichia coli DH5αPro

competentes.

A correcta introdução da sequência pretendida foi, numa primeira fase, rastreada

por digestão do DNA proveniente das mini-preps com a enzima XmaI e, posteriormente,

confirmada por sequenciação (Stabvida) de uma das amostras.

19

3. Resultados e Discussão 3.1. Efeito da presença de chaperones moleculares e químicos sobre formas mutantes de hPAH recombinante estruturalmente afectadas

3.1.1. Integridade dos vectores de expressão dos chaperones moleculares Os chaperones moleculares utilizados no decorrer do trabalho, nomeadamente os

sistemas GroESL e DnaKJ/GrpE, encontravam-se clonados no vector de expressão

pOFX e foram cedidos por Olivier Fayet. Uma vez que este autor refere que estes

vectores apresentam alguma instabilidade, antes de dar início aos nossos estudos foi

verificada não só a sua integridade destes vectores, mas também a sua capacidade

para produzir as proteínas acima mencionadas. Assim, após a análise das sequências

nucleotídicas dos vectores fornecidos e do seu perfil de restrição, foram seleccionadas

as endonucleases de restrição SmaI e EcoRI para confirmação da presença dos cDNAs

correctos (Tabela 4). Tabela 4 – Enzimas de restrição utilizadas para confirmação da integredidade dos vectores de expressão dos sistemas de chaperones moleculares.

Vector de expressão Enzima de restrição Fragmentos obtidos (bp)

pOFX SmaI 5177 e 1764 pOFX-SL EcoRI 6849 e 2173 pOFX-KJ EcoRI 8303, 1204 e 845 pOFX-KJE EcoRI 9090, 1204 e 845

Como pode ser observado pela análise da Figura 6, os tamanhos dos fragmentos

obtidos, após digestão com as enzimas de restrição referidas na Tabela 4, apresentam

o tamanho esperado pelo que a integridade dos vectores de expressão dos sistemas de

chaperones moleculares foi confirmada.

Figura 6 – Separação electroforética, em gel de agarose (1%), dos produtos de hidrólise dos vectores de expressão pOFX contendo os diferentes chaperones moleculares. (M) Marcador de massas moleculares λDNA-BstEII (Biolabs); (1) pOFX; (2) pOFX hidrolisado com SmaI; (3) pOFX-SL; (4) pOFX-SL hidrolisado com EcoRI; (5) pOFX-KJ; (6) pOFX-KJ hidrolisado com EcoRI; (7) pOFX-KJE; (8) pOFX-KJE hidrolisado com EcoRI.

20

Posteriormente, procedeu-se à expressão destas proteínas, tendo a produção dos

chaperones sido verificada pela análise por SDS-PAGE dos lisados celulares (Figura 7).

Foi assim confirmada a sobre-expressão das proteínas GroEL (60 kDa), DnaK (70 kDa),

DnaJ (40 kDa) e GrpE (23 kDa). Neste sistema electroforético não foi possível detectar

a proteína GroES, por apresentar uma massa molecular de 10 kDa. No entanto a sua

presença foi posteriormente verificada por análise de Western blotting, utilizando o

anticorpo anti-GroES.

Figura 7 – Análise por SDS-PAGE dos lisados celulares obtidos após indução dos vectores de expressão pOFX contendo os chaperones moleculares GroESL (2), DnaKJ (3) e DnaKJ/GrpE (4). (M) marcador de massas moleculares SDS-PAGE Pre-Stained Low Range; (1) Expressão do vector pOFX; GroEL (60 kDa), DnaK (70 kDa), DnaJ (40 kDa) e GrpE (23 kDa) encontram-se assinalados.

Uma vez que as amostras aplicadas foram normalizadas em relação ao volume, e

não à quantidade de proteína total, é de realçar que o sistema DnaKJ/GrpE parece

induzir uma diminuição do teor proteico da célula, resultado que está de acordo com o

crescimento mais lento observado para as culturas de Escherichia coli transformadas

com o vector pOFX-KJE. Deste modo, e de acordo com Castanié [4], a sobre-expressão

destes chaperones parece exercer um efeito tóxico sobre estas células.

3.1.2. Co-expressão de chaperones moleculares e proteínas hPAH mutantes na ausência e presença de glicerol

Para se proceder ao estudo das interacções entre os chaperones moleculares e as

proteínas hPAH mutantes, estas foram produzidas num sistema de expressão onde

simultaneamente foram também sobre-expressos diferentes chaperones moleculares,

na ausência e na presença de glicerol a 1% (chaperone químico). A análise, por

Western blotting, da fracção solúvel dos lisados celulares (Figura 8) demonstra que, na

presença dos chaperones moleculares (e ausência de chaperones químicos), todas as

proteínas hPAH estudadas (wt e mutantes) apresentam um aumento muito significativo

de formas com uma menor massa molecular, que deverão representar formas truncadas

a C-terminal. Muito provavelmente também serão estabilizadas formas truncadas a N-

M 1 2 3 4

21

terminal, no entanto devido à perda do epítopo 6xHis estas formas não serão

detectadas.

Figura 8 – Análise por Western blotting (anticorpo Anti-His) das fracções solúveis dos lisados celulares, após co-expressão das diferentes formas hPAH e os sistemas de chaperones moleculares GroESL e DnaKJ/GrpE, na ausência (-) e na presença de glicerol (+). A proteína hPAH recombinante encontra-se assinalada (≈ 55 kDa).

3.1.3. Purificação e quantificação das proteínas hPAH co-expressas com chaperones moleculares na ausência e presença de glicerol

Após purificação das fracções solúveis dos lisados celulares por IMAC, as

diferentes amostras foram analisadas por SDS-PAGE, após coloração com o azul

brilhante de Coomassie R250 (Figura 9). Deste modo, foi possível constatar a presença

de uma banda adicional, com uma massa molecular semelhante à do chaperone

molecular co-expresso em cada caso. A posterior análise destas amostras por Western

blotting, utilizando anticorpos específicos para os diferentes chaperones moleculares,

demonstrou a identidade das proteínas co-eluídas (Figura 9). Embora os resultados

mostrados na Figura 9 sejam apenas referentes à purificação da proteína hPAHwt, a

referida co-eluição dos chaperones moleculares foi observada em todas as proteínas

hPAH estudadas.

Estes resultados (ensaios de pull down) apontam para a existência de uma forte

interacção entre as diferentes formas de hPAH (wt e mutantes) e os chaperones

moleculares.

(-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) hPAHwt V388M I65T R261Q R270K

Sem Chap. Moleculares

Co-expressão com GroESL

Co-expressão com DnaKJ

Co-expressão com DnaKJ/GrpE

22

s/ chaperones moleculares




SDS/PAGE

Western blotting

GroEL

DnaK

DnaK

1 2 3 4 5 6 7 8M1

2 3

GroES

2 3

DnaJ

DnaJ





SDS/PAGE

Western blotting

GroEL

DnaK

DnaK

1 2 3 4 5 6 7 8

2 3

GroES

2 3

DnaJ

DnaJ

SDS/PAGE

Western blotting

GroEL

DnaK

DnaK

1 2 3 4 5 6 7 8

M2

1 2 3 4 5 6 7 8

M2 2 32 3

GroES

2 32 3

DnaJ

DnaJM1





SDS/PAGE

Western blotting

GroEL

DnaK

DnaK

1 2 3 4 5 6 7 8M1

2 32 3

GroES

2 32 3

DnaJ

DnaJ





SDS/PAGE

Western blotting

GroEL

DnaK

DnaK

1 2 3 4 5 6 7 8

2 32 3

GroES

2 32 3

DnaJ

DnaJ

SDS/PAGE

Western blotting

GroEL

DnaK

DnaK

1 2 3 4 5 6 7 8

M2

1 2 3 4 5 6 7 8

M2 2 32 3

GroES

2 32 3

DnaJ

DnaJM1

Figura 9 – Análise por SDS-PAGE e Western Blotting da purificação, por IMAC (gradiente de imidazol) da proteína hPAHwt na ausência e presença de sobre-expressão de diferentes chaperones moleculares. (M1) Marcador de massas moleculares SDS Standards Low Range; (M2) Marcador de massas moleculares SDS-PAGE Pre-Stained Low Range (1) última fracção da lavagem com 20 mM de imidazol; (2-3) amostras eluídas com 150 mM de imidazol; (4-8) amostras eluídas com 250 mM de imidazol). As massas moleculares da hPAH (55 kDa), GroEL (60 kDa), DnaK (70 kDa) e DnaJ (40 kDa) encontram-se assinaladas.

Após diálise, foi determinado o teor proteico das amostras eluídas. O valor de hPAH

full-length (wt e mutantes) presente em cada uma das amostras, bem como o seu grau

de pureza, foi calculado após análise das imagens dos géis de SDS-PAGE com o

programa Gel-Pro analyser, versão 4.5 (MediaCybernetics).

Os dados obtidos (Tabela 5) foram utilizados para calcular o rendimento de proteína

hPAH (wt e mutantes) após co-expressão com os chaperones moleculares, na ausência

e presença do chaperone químico glicerol a 1% (Figura 10).

23

Tabela 5 – Quantidade de proteína obtida ao longo do processo de produção da forma selvagem e de formas mutantes da hPAH sem e com sobre-expressão de chaperones moleculares na ausência (-) e presença (+) de glicerol (1%) no meio de cultura.

Glicerol Proteína total solúvel

(g/L cultura)

Proteína total eluído

(µg/mL)1

Proteína hPAH (µg/mL)1

Grau de pureza

(%)

hPAHwt - 114 1206 977 81 + 88 846 761 90hPAHwt/GroESL - 117 1729 1262 73 + 128 1161 894 77hPAHwt/DnaKJ - 106 269 54 20 + 80 215 129 60hPAHwt/DnaKJE - 63 270 181 67 + 71 92 75 82 I65T - 30 349 157 45 + 39 369 148 40I65T/GroESL - 51 414 108 26 + 38 409 61 15I65T/DnaKJ - 65 335 37 11 + 79 263 45 17I65T/DnaKJE - 28 43 18 42 + 43 74 16 22 R261Q - 73 409 389 95 + 58 302 272 90R261Q/GroESL - 112 426 426 100 + 92 567 454 80R261Q/DnaKJ - 47 406 41 10 + 49 423 42 10R261Q/DnaKJE - 31 206 76 37 + 28 144 43 30 R270K - 41 139 26 19 + 57 236 45 19R270K/GroESL - 69 436 65 15 + 97 509 102 20R270K/DnaKJ - 57 14 3 19 + 99 122 21 17R270K/DnaKJE - 40 34 11 31 + 53 0 0 - V388M - 59 859 301 35 + 88 972 204 21V388M/GroESL - 82 1436 215 15 + 78 1006 151 15V388M/DnaKJ - 66 447 22 5 + 79 510 26 5V388M/DnaKJE - 29 386 19 5 + 32 300 15 5

Nota: Os cálculos apresentados referem-se aos valores obtidos partindo de 1 L de cultura. 1Valores referentes apenas à fracção eluída com 150 mM de imidazol.

Relativamente ao sistema GroESL, este apenas induziu um aumento da quantidade

das proteínas hPAH selvagem e R270K, muito significativo para esta última proteína.

Para as restantes formas mutantes, a alteração “negativa” observada, após co-

expressão com o GroESL, deve-se provavelmente ao facto de, na presença destas

24

moléculas, as proteínas totais da célula aumentarem significativamente (tabela 5), pelo

que o valor do rendimento da hPAH é mais baixo. Podemos ainda constatar que, na

presença do sistema DnaKJ e DnaKJ/GrpE, de um modo geral, todas as proteínas

hPAH recombinantes, incluindo a forma selvagem, apresentam um menor rendimento.

Estes resultados deverão estar directamente relacionadas com a toxicidade

mencionada anteriormente.

A presença de um chaperone químico no meio de cultura, em simultâneo à co-

expressão das proteínas hPAH e os chaperones moleculares, não parece condicionar a

quantidade de proteína recombinante purificada. Exceptua-se o caso da proteína

R261Q que, quando co-expressa com GroESL, a presença simultânea de glicerol leva a

um aumento bastante acentuado da sua quantidade.

PAH Wild Type

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

(-) Chap. Mol. GroESL DnaKJ DnaKJ/GrpE

Rend

imen

to

(ug

hPA

H/g

Pro

t. To

tal s

olúv

el)

PAH I65T

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0


Ren

dim

ento

(ug

hPAH

/g P

rot.

Tota

l sol

úvel

)

PAH V388M

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0


Ren

dim

ento

(ug

hPA

H/g

Pro

t. To

tal s

olúv

el)

PAH R261Q

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0


Ren

dim

ento

(ug

hPAH

/g P

rot.

Tota

l sol

úvel

)

PAH R270K

0,00,20,40,60,81,01,21,41,61,82,0


Ren

dim

ento

(ug

hPAH

/g P

rot.

Tota

l sol

úvel

)

PAH Wild Type

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0


Rend

imen

to

(ug

hPA

H/g

Pro

t. To

tal s

olúv

el)

PAH I65T

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0


Ren

dim

ento

(ug

hPAH

/g P

rot.

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l sol

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)

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0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0


Ren

dim

ento

(ug

hPA

H/g

Pro

t. To

tal s

olúv

el)

PAH R261Q

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0


Ren

dim

ento

(ug

hPAH

/g P

rot.

Tota

l sol

úvel

)

PAH R270K

0,00,20,40,60,81,01,21,41,61,82,0


Ren

dim

ento

(ug

hPAH

/g P

rot.

Tota

l sol

úvel

)

Figura 10 – Rendimento de proteína hPAH recombinante obtida (µg hPAH/g proteína total solúvel) após expressão na ausência (-) e presença de co-expressão de chaperones moleculares, com ( ) e sem ( ) glicerol no meio de cultura.

25

3.1.4. Actividade enzimática das proteínas hPAH co-expressas com chaperones moleculares na ausência e presença de glicerol A actividade enzimática das proteínas hPAH (wt e mutantes) foi também

determinada nas condições anteriormente referidas. Assim, pela análise da Figura 11,

podemos concluir que, provavelmente devido ao efeito tóxico referido anteriormente,

apenas na presença do sistema DnaKJ/GrpE foi observada uma diminuição da

actividade enzimática da forma selvagem. Na presença de GroESL e DnaKJ, não houve

alteração da actividade desta enzima. Estes resultados podem ser explicados pelo facto

de, nestas condições, a presença do chaperone molecular não irá alterar ou condicionar

a conformação desta proteína, que já se encontra no seu estado estruturalmente mais

estável (forma nativa), não alterando deste modo a sua funcionalidade.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

(-) Chap.Mol. GroESL DnaKJ DnaKJ/GrpE

Activ

idad

e es

pecí

fica

((nm

ol T

yr.m

in-1

.mg-1

)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

(-) Chap.Mol. GroESL DnaKJ DnaKJ/GrpE

Activ

idad

e es

pecí

fica

((nm

ol T

yr.m

in-1

.mg-1

)

Figura 11 – Actividade enzimática específica (nmol Tyr.min-1.mg-1) da forma selvagem da hPAH (hPAHwt) produzida na ausência (-) e presença de co-expressão dos diferentes sistemas de chaperones moleculares, com ( ) e sem ( ) glicerol no meio de cultura.

Relativamente às formas mutantes da hPAH, os resultados foram surpreendentes,

uma vez que na presença do sistema GroESL, todas as proteínas mutantes

apresentaram um aumento da sua actividade enzimática (Figura 12). Este aumento foi

mais pronunciado para as formas mutantes R261Q (2,8 vezes), R270K (2,6 vezes) e

V388M (2,4 vezes). Relativamente à forma mutante I65T, esta sofreu um aumento de

apenas 1,3 vezes. Na presença do sistema DnaKJ, as proteínas I65T e R270K foram as

únicas onde se verificou um aumento de actividade enzimática de 1,3 e 2,6 vezes,

respectivamente.

A presença simultânea do glicerol e dos chaperones moleculares aquando da

síntese das proteínas mutantes não apresentou, de um modo geral, um efeito

potenciador, não contribuindo para um aumento das actividades obtidas (ausência de

efeito aditivo).

26


0

500

1000

1500

2000

2500

3000

I65T V388M R261Q R270K

Activ

idad

e es

pecí

fica

((nm

ol T

yr.m

in-1.m

g-1 )


0

500

1000

1500

2000

2500

3000

I65T V388M R261Q R270K

Activ

idad

e es

pecí

fica

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ol T

yr.m

in-1.m

g-1 )


0

200

400

600

800

1000

1200

1400

I65T V388M R261Q R270K

Activ

idad

e es

pec í

fica

((nm

ol T

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in-1.m

g-1 )


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1000

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1400

I65T V388M R261Q R270K

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0100200300400500600700800900

1000

I65T V388M R261Q R270KAc

tivid

ade

espe

c ífic

a((

nmol

Tyr

.min

- 1.m

g-1 )


0100200300400500600700800900

1000


tivid

ade

espe

c ífic

a((

nmol

Tyr

.min

- 1.m

g-1 )


0

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1000

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1000

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3000

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((nm

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g-1 )


0

500

1000

1500

2000

2500

3000

I65T V388M R261Q R270K


0

500

1000

1500

2000

2500

3000

I65T V388M R261Q R270K

Activ

idad

e es

pecí

fica

((nm

ol T

yr.m

in-1.m

g-1 )


0

500

1000

1500

2000

2500

3000

I65T V388M R261Q R270K


0

500

1000

1500

2000

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3000

I65T V388M R261Q R270K

Activ

idad

e es

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((nm

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yr.m

in-1.m

g-1 )


0

200

400

600

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1200

1400

I65T V388M R261Q R270K

Activ

idad

e es

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fica

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g-1 )


0

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I65T V388M R261Q R270K

Activ

idad

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g-1 )


0

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400

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I65T V388M R261Q R270K

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idad

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g-1 )


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I65T V388M R261Q R270K


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200

400

600

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I65T V388M R261Q R270K

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idad

e es

pec í

fica

((nm

ol T

yr.m

in-1.m

g-1 )


0100200300400500600700800900

1000


tivid

ade

espe

c ífic

a((

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Tyr

.min

- 1.m

g-1 )


0100200300400500600700800900

1000


tivid

ade

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Tyr

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- 1.m

g-1 )


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tivid

ade

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c ífic

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nmol

Tyr

.min

- 1.m

g-1 )


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1000


tivid

ade

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c ífic

a((

nmol

Tyr

.min

- 1.m

g-1 )


0

500

1000

1500

2000

2500

3000

I65T V388M R261Q R270K

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idad

e es

pecí

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1000

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1000

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1500

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1000

1500

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idad

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yr.m

in-1.m

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200

400

600

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1000

1200

1400

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in-1.m

g-1 )


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200

400

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1200

1400

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in-1.m

g-1 )


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g-1 )


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tivid

ade

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c ífic

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- 1.m

g-1 )


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600

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1000

1200

1400

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g-1 )


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1200

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g-1 )


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- 1.m

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I65T V388M R261Q R270K


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Tyr

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- 1.m

g-1 )


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1000


tivid

ade

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c ífic

a((

nmol

Tyr

.min

- 1.m

g-1 )

* *


0

500

1000

1500

2000

2500

3000

I65T V388M R261Q R270K

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e es

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yr.m

in-1.m

g-1 )


0

500

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3000

I65T V388M R261Q R270K

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ol T

yr.m

in-1.m

g-1 )


0

500

1000

1500

2000

2500

3000

I65T V388M R261Q R270K


0

500

1000

1500

2000

2500

3000

I65T V388M R261Q R270K

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1500

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0

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0

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200

400

600

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1000

1200

1400

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1000


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.min

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1000


tivid

ade

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Tyr

.min

- 1.m

g-1 )


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1000

I65T V388M R261Q R270K


0100200300400500600700800900

1000


tivid

ade

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nmol

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.min

- 1.m

g-1 )


0100200300400500600700800900

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I65T V388M R261Q R270K


0100200300400500600700800900

1000


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ade

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nmol

Tyr

.min

- 1.m

g-1 )


0

500

1000

1500

2000

2500

3000

I65T V388M R261Q R270K

Activ

idad

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yr.m

in-1.m

g-1 )


0

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3000

I65T V388M R261Q R270K

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ol T

yr.m

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g-1 )


0

500

1000

1500

2000

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3000

I65T V388M R261Q R270K


0

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1500

2000

2500

3000

I65T V388M R261Q R270K

Activ

idad

e es

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yr.m

in-1.m

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0

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1500

2000

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I65T V388M R261Q R270K


0

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1000

1500

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idad

e es

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yr.m

in-1.m

g-1 )


0

200

400

600

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1200

1400

I65T V388M R261Q R270K

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e es

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in-1.m

g-1 )


0

200

400

600

800

1000

1200

1400

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Activ

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yr.m

in-1.m

g-1 )


0100200300400500600700800900

1000

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ctiv

idad

e es

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ol T

yr.m

in-1.m

g-1 )


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1000

I65T V388M R261Q R270KA

ctiv

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g-1 )


0

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g-1 )


0

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g-1 )


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1200

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I65T V388M R261Q R270K


0

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400

600

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e es

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in-1.m

g-1 )


0

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I65T V388M R261Q R270K


0

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I65T V388M R261Q R270K

Activ

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in-1.m

g-1 )


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1000

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ctiv

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in-1.m

g-1 )


0100200300400500600700800900

1000

I65T V388M R261Q R270K


0100200300400500600700800900

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I65T V388M R261Q R270KA

ctiv

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((nm

ol T

yr.m

in-1.m

g-1 )


0100200300400500600700800900

1000

I65T V388M R261Q R270K


0100200300400500600700800900

1000

I65T V388M R261Q R270KA

ctiv

idad

e es

pecí

fica

(nm

ol T

yr.m

in-1.m

g-1 )

* *

Figura 12 – Actividade enzimática específica (nmol Tyr.min-1.mg-1) da formas hPAH mutantes I65T, R261Q, R270K e V388M produzidas na ausência de co-expressão dos diferentes sistemas de chaperones moleculares ( ), na presença dos chaperones moleculares ( ) e na presença de chaperones moleculares e glicerol a 1% ( ). *Valores não apresentam desvio padrão pois tratam-se da média entre apenas 2 ensaios.

3.1.5. Ensaios de cross-linking O aumento da actividade enzimática observado para as diferentes formas mutantes

de hPAH expressas, na presença de alguns dos chaperones estudados, pode estar

directamente relacionado com um aumento da proporção das formas tetraméricas mais

activas. Deste modo, o perfil de oligomerização destas proteínas foi identificado após

separação electroforética em geis nativos (Figura 15). Para preservar a estrutura

quaternária das proteínas recombinantes, estas foram previamente sujeitas a uma

reacção de cross-linking com o BS3.

Relativamente à proteína hPAH wt (Figura 13A), a percentagem das formas

diméricas e tetraméricas que ronda os 20 e 60%, respectivamente, não parece sofrer

alterações na presença de glicerol. As proteínas mutantes onde geralmente é

observado uma deslocação daquele equilíbrio no sentido das formas diméricas e um

aumento da percentagem de formas agregadas, não parecem sofrer grandes alterações

quando produzidas na presença de GroESL e do sistema DnaKJ. No entanto, a proteína

mutante V388M, na presença de GroESL, apresenta uma banda que parece

corresponder às formas diméricas mas aparenta ter sofrido uma alteração da sua

mobilidade, o que pode indicar uma alteração na estrutura tridimensional destas formas

27

oligoméricas (Figura 13C). Uma vez que embora tenha sido observado uma aumento da

actividade das enzimas mutantes, sem ter sido acompanhada por uma estabilização de

uma forma tetramérica da hPAH aparentemente, os sistemas estudados actuarão

apenas ao nível da estabilização dos dímeros um processo que se pensa ocorrer num

processo de co-tradução.

1 M 2 3 4 5 6 (-)

A

(-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)

A

(-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)

B

(-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)

B

(-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)

C

(-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)

C

(-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)

D

(-) (+) (-) (+)

D

(-) (+) (-) (+)

E

(-) (+) (-) (+)

E

(-) (+) (-) (+)

A

(-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)

A

(-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)

B

(-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)

B

(-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)

C

(-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)

C

(-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)

D

(-) (+) (-) (+)

D

(-) (+) (-) (+)

E

(-) (+) (-) (+)

E

(-) (+) (-) (+)

(-) Chap. M

ol.

(-) Chap. M

ol.

(-) Chap. M

ol.

(-) Chap. M

ol.

GroESL

GroESL

GroESL

GroESL

DnaKJ

DnaKJDnaKJ

DnaKJ

DnaKJ/GrpE

DnaKJ/GrpE

DnaKJ/GrpE

DnaKJ/GrpE

1 M 2 3 4 5 6 (-)

A

(-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)

A

(-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)

B

(-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)

B

(-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)

C

(-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)

C

(-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)

D

(-) (+) (-) (+)

D

(-) (+) (-) (+)

E

(-) (+) (-) (+)

E

(-) (+) (-) (+)

A

(-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)

A

(-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)

B

(-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)

B

(-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)

C

(-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)

C

(-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)

D

(-) (+) (-) (+)

D

(-) (+) (-) (+)

E

(-) (+) (-) (+)

E

(-) (+) (-) (+)

(-) Chap. M

ol.

(-) Chap. M

ol.

(-) Chap. M

ol.

(-) Chap. M

ol.

GroESL

GroESL

GroESL

GroESL

DnaKJ

DnaKJDnaKJ

DnaKJ

DnaKJ/GrpE

DnaKJ/GrpE

DnaKJ/GrpE

DnaKJ/GrpE

Figura 13 – Análise por separação electroforética em géis nativos de poliacrilamida das proteínas recombinantes hPAH produzidas na presença (+) e ausência (-) de glicerol e diferentes chaperones moleculares. A – hPAH wt; B – hPAH I65T; C - hPAH V388M; D – hPAH R261Q *; E – hPAH R270K*. Pesos moleculares assinalados: ~220 kDa (tetrâmeros) e ~110 kDa (dímeros). *Não foi possível utilizar todas as conjugações devido à fraca quantidade de amostras obtidas.

3.2. Clonagem e preparação de sistema de expressão eucariótica in vitro para avaliação do mecanismo de degradação da hPAH recombinante

Uma vez que todas as tentativas prévias para clonagem do cDNA da PAHwt

(phPAH247) no vector de expressão eucariota pSG5 foram infrutíferas, foi desenvolvida

uma estratégia de clonagem orientada. Como referido anteriormente (alínea 2.2.3), o

cDNA phPAH247 encontra-se clonado no sítio EcoRI do plasmídeo pBR322 e apresenta, a 11 bp a montante do codão de iniciação de transcrição ATG, um sítio

XmaI. Dado que o MCS do pSG5 apenas apresenta apenas 3 sítios de restrição

(BamHI, EcoRI e BglII), foi criado neste DNA um novo sítio de restrição XmaI, por

28

mutagénese dirigida. Assim, a reacção de ligação entre o fragmento do cDNA da PAHwt

e do vector de expressão, ambos obtidos após hidrólise com XmaI e EcoRI, teria mais

hipóteses de ser bem sucedida.

Na Figura 14A, encontra-se representado o perfil electroforético do produto da

hidrólise, com XmaI, das mini-preps referentes à reacção de mutagénese dirigida. A

correcta modificação do vector traduziu-se pela sua linearização (fragmento de 4,1 kb),

após hidrólise com XmaI.

A B(-) 1 2 3 4 5 6 M 7 8

A B(-) 1 2 3 4 5 6 M 7 8 1 M 2 3 4 5 6 (-)

A B(-) 1 2 3 4 5 6 M 7 8

A B(-) 1 2 3 4 5 6 M 7 8 1 M 2 3 4 5 6 (-)

Figura 14 – Análise em gel de agarose (1%) do perfil electroforético dos fragmentos obtidos após hidrólise com a enzima XmaI. (A) Amostras provenientes da reacção de mutagénese dirigida (pSG5Xma); (-) amostra controlo constituída por pSG5. (B) Amostras provenientes da reacção de ligação entre o cDNA-PAHwt e pSG5Xma; (-) pSG5/Xma digerido com XmaI (M) Marcador de massas moleculares λDNA-BstEII.

Após efectuar a reacção de ligação, foram novamente preparados DNAs, os quais

foram hidrolisados com a enzima XmaI. A presença de um fragmento com o tamanho

de 6,3 kb (Figura 14B) apontou para o sucesso da reacção de ligação, o qual foi

posteriormente confirmado por sequenciação do DNA obtido (Figura 15).

Figura 15 – Electroforetograma do DNA proveniente da reacção de ligação entre o cDNA-PAHwt e pSG5Xma. O codão de iniciação ATG encontra-se assinalado.

29

4. Conclusões

Presentemente foram já identificadas mais de 500 mutações no gene PAH, a

maioria das quais resulta na síntese de proteínas hPAH mutantes conformacionalmente

alteradas que sendo reconhecidas pelo sistema PQC são rapidamente degradadas.

Neste contexto os chaperones moleculares poderão assumir um papel relevante nos

teores intracelulares destas proteínas se tiverem capacidade de interargir com estados

não-nativos da hPAH mutantes, quer a nível das proteínas recém-sintetizadas quer a

nível do folding de novo.

Os resultados obtidos no decurso deste trabalho indicam que, à semelhança de

outras proteínas humanas, também a PAH interage com os chaperones moleculares,

particularmente com o sistema GroESL, no processo de aquisição da sua estrutura

nativa. O aumento de actividade das formas mutantes simultaneamente com a ausência

do incremento das formas tetraméricas, mais activas, sugere que estas interacções

estabilizam uma estrutura dimérica da proteína, que no entanto não apresenta a

capacidade para tetramerizar. Deste modo, seria extremamente interessante isolar

estas formas e caracterizá-las relativamente às suas propriedades cinéticas, estruturais

e de estabilidade. A estabilização de uma estrutura dimérica parece indicar que os

chaperones moleculares actuam cedo na aquisição da estrutura quaternária da

proteína, já que este fenómeno está postulado ocorrer co-tradução. Particularmente

interessante foi o facto de o chaperone químico glicerol, que individualmente estabiliza

proteínas hPAH mutantes, em conjunto com a co-expressão dos chaperones

moleculares não conduziu a um aumento da actividade das proteínas mutantes. Assim,

poderemos concluir que o glicerol não parece estabilizar as interacções entre os

chaperones moleculare e as proteínas hPAH mutantes.

No contexto da PKU o efeito da co-expressão destes sistemas conduziu a aumentos

de actividades, que no caso das mutações I65T, R261Q e V388M, foram suficientes

para transformar um fenótipo de PKU moderada (∼30% de actividade residual) em HPA

não-PKU (∼60% de actividade residual). Assim, é de maior importância desenvolver um

sistema de expressão eucariota onde os homólogos eucariotas dos chaperones

moleculares estudados neste trabalho, nomeadamente o sistema Hsp70 e chaperoninas

do grupo II, possam ser investigados. Para atingir este objectivo foi já dado o primeiro

passo, com a clonagem do cDNA da PAHwt no vector de expressão eucariota pSG5.

Esta abordagem experimental irá permitir extrapolar os resultados obtidos no sistema

procariota para a célula eucariota.

30

Não é ainda possível antever uma possível aplicação terapêutica às doenças

conformacionais que passe pela modulação do nível de expressão dos chaperones

moleculares. No entanto, o conhecimento do papel dos chaperones moleculares nas

proteínas estruturalmente alteradas irá sem dúvida contribuir para desvendar o

mecanismo patofisiológico daquelas anomalias.

31

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i

7. Anexos A.1. Sequência completa do clone phPAH247, incluindo a sequência

nucleotídica do cDNA da hPAH e correspondente tradução.

ii

Intrão β-globina

Amp

Intrão β-globina

Amp

A.2. Mapas dos vectores utilizados: pTrcHis-PAH, pOFXtac1 e pSG5.

Local de clonagemdo cDNA de GroESL e DnaKJ/GrpE

Local de clonagemdo cDNA de GroESL e DnaKJ/GrpE

Para mais detalhes, consultar alíneas 2.1.1. e 2.2.1.

iii

A.3. Curva de calibração utilizada na quantificação proteica pelo método de

Bradford.

Valores de Absorvência a 595 nm para as diferentes soluções padrão de BSA.

[BSA] (μg/ml) Abs595nm Abs595nm média

0,088 1 0,083 0,089 0,095 0,125

2 0,128 0,129 0,133 0,210

4 0,183 0,202 0,213 0,374

8 0,369 0,377 0,388 0,420

10 0,436 0,434 0,447

y = 0,039x + 0,049

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0 2 4 6 8 10 12

R2 = 0,9972

[BSA] (μg/ml)

Abso

rvên

cia

a 59

5 nm

y = 0,039x + 0,049

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0 2 4 6 8 10 12

R2 = 0,9972

[BSA] (μg/ml)

Abso

rvên

cia

a 59

5 nm

iv

A.4. Curva de calibração gama baixa (A) e gama alta (B) para quantificação de

L-tirosina, pelo método do nitrosonaftol.

Valores de intensidade de fluorescência (I) para as diferentes soluções padrão de

tirosina (λexc 460 nm e λem 570nm).

[Tirosina] (μM) I Imédia Imédia corrigida

0,486

0 0,464 0,498 0

0,545

1,098

1 1,136 1,089 0,591

1,034

1,778

2 1,777 1,821 1,323

1,909

2,376

3 2,361 2,338 1,840

2,278

3,036

4 2,819 2,964 2,465

3,036

3,544

5 3,709 3,659 3,161

3,725

6,382

10 6,211 6,184 5,686

5,96

9,299

15 9,035 9,167 8,669

11,58

11,89

20 11,51 11,660 11,162

13,99

13,65

25 13,38 13,673 13,175

0,486

v

y = 0,6282x - 0,0086R2 = 0,9974

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

3,500

0 1 2 3 4 5 6

A

Inte

nsid

ade

[Tyr] (μM)

y = 0,6282x - 0,0086R2 = 0,9974

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

3,500

0 1 2 3 4 5 6

A

Inte

nsid

ade

[Tyr] (μM)

y = 0,4992x + 0,9368R2 = 0,9925

0,000

2,000

4,000

6,000

8,000

10,000

12,000

14,000

16,000

0 5 10 15 20 25 30

B

Inte

nsid

ade

[Tyr] (μM)

y = 0,4992x + 0,9368R2 = 0,9925

0,000

2,000

4,000

6,000

8,000

10,000

12,000

14,000

16,000

0 5 10 15 20 25 30

B

Inte

nsid

ade

[Tyr] (μM)

Forma selvagem e formas mutantes da Fenilalanina Hidroxilase … · 2010. 10. 3. · mutantes. Os...

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