Triptofano hidroxilase

Triptofano hidroxilase Química Bioinorgânica

Catarina Cruz Vaz Patrícia Ferreira de Castro (turma P4)

Licenciatura em Bioquímica 2º ano, 2º semestre Maio de 2013

hTPH1

Na imagem: primeira estrutura de chTPH1, sem substratos ou inibidores presentes no local activo.

Faculdade de Ciências da Universidade do Porto

EC 1.14.16.4

1. Oxidorreductases

Catalisam reacções de oxidação redução.

1.14. Actua sobre dadores acoplados, por incorporação ou redução de moléculas

1.14.16. Com a pteridina reduzida como dador, e incorporação de um átomo.

Coordenação de um catião Fe(III) no centro activo e de um cofactor ou

cofactor análogo.

Outras nomenclaturas • L-triptofano hidroxilase. • Triptofano 5-hidroxilase. • Triptofano 5-monoxigenase

Triptofano hidroxilase


SEROTONINA

Importante hormona e neurotransmissor regulador

de variados aspectos psicofisiológicos no cérebro

humano (sono, dor, apetite, humor) e da contracção

do músculo liso.

Função: Catálise do primeiro passo limitante da velocidade da reacção da síntese de

serotonina, um percursor da hormona melatonina.

Diversos distúrbios psiquiátricos (depressão, esquizofrenia, DOC, tendências suicidas) estão

directamente relacionados com anomalias no processo de regulação onde participa a serotonina e

outros neurotransmissores, nomeadamente resultantes de baixos níveis dos mesmos.

Triptofano hidroxilase

A TPH é uma enzima que contém Fe(III), e que catalisa a hidroxilação de

triptofano a 5-hidroxi-triptofano, na presença de O2 e 5,6,7,8 -

tetrahidrobiopterina (BH4) . O BH4 reduz o Fe(III) a Fe(II).

O cofactor enzimático BH4 actua como doador de electrões para a redução

de O2 e para a hidroxilação de Trp.

O O2 e o Trp actuam como substratos.


TrpOH Triptofano hidroxilase

A TrpOH participa na hidroxilação do L-Trp na posição 5, o passo limitante na biossíntese da serotonina e o passo inicial da biossíntese da melatonina.


O L-triptofano sofre a acção da enzima

triptofano hidroxilase, passando para a

forma de L-5 hidroxitriptofano. Por

conseguinte, ocorre a transformação

dessa última forma em serotonina, pela

acção da L-amina ácida descarboxilase.

Família e proteínas relacionadas


Hidroxilases de aminoácidos aromáticos

(AAAH)

PheOH

TyrOH TrpOH

Fenilalanina hidroxilase

Tirosina hidroxilase (domínio de tetramerização)

Família e proteínas relacionadas


Hidroxilases de aminoácidos aromáticos

(AAAH)

PheOH

TyrOH TrpOH

5,6,7,8-tetrahidrobiopterina

COFACTOR ENZIMÁTICO Hidroxilação do respectivo

aminoácido aromático

Isoformas: TPH1 e TPH2

As duas isoformas humanas consistem em 444 (hTPH1) e 490 (hTPH2) aminoácidos, respetivamente e têm uma sequência idêntica de 71%. A diferença mais pronunciada entre as isoformas é visto nos domínios de regulação, que é mais longo para a hTPH2 (mais 46 resíduos).

A divisão dos três domínios da TPH1 (hTPH1) e da TPH2 (hTPH2). Faculdade de Ciências da Universidade do Porto

•Expressa principalmente na glândula pineal, e nas partes periféricas do corpo, tais como as células da pele, células cancerosas e na mucosa intestinal.

•Controla a síntese da serotonina na periferia. hTPH1

•Expressa principalmente em neurónios serotoninérgicos do cérebro e intestino;

•Responsável pela síntese da serotonina no sistema nervoso central. hTPH2

Estrutura dos domínios e centro activo Triptofano hidroxilase


Estrutura geral

Todas as enzimas pertencentes a esta família contêm três domínios:

• Domínio regulador (N-terminal)

• Domínio catalítico

• Domínio de tetramerização (C-terminal).

Para a enzima triptofano hidroxilase apenas se conhece a estrutura do domínio

catalítico.

Os domínios reguladores e de tetramerização são semelhantes às outras duas enzimas

(tirosina hidroxilase e fenilalanina hidroxilase). Portanto, a caracterização da TPH é

principalmente construída através de estudos sobre as duas outras enzimas desta

família.


A estrutura geral do domínio catalítico de hTPH1 com ferro(III) e 7,8-dihidrobiopterina (BH2).


Centro activo

A TPH contém Fe(II) no seu centro activo, quando na sua forma activa.

Octaedricamente coordenado com His272, His277, Glu317 numa face

e 3 H2O na outra.


Os centros activos residem dentro do domínio catalítico e são responsáveis pela hidroxilação

dos respectivos resíduos aminoácidos aromáticos.

O BH2 é um inibidor competitivo, análogo ao BH4

(compete com o cofactor pelo centro activo da

enzima). Da mesma forma actuam os compostos

análogos ao triptofano p-clorofenilalanina e p-

etinilfenilalanina.

Centro activo

O centro activo, com o Fe(III)

(em verde) coordenado com a

His272,His277, Glu317 e três

H2O (em vermelho).

O BH2, análogo ao cofactor

BH4, é mostrado com átomos

de C a roxo, átomos de O a

vermelho, e átomos de N a

azul.

Centro activo

A conformação do L-Trp ligado

à enzima e do mesmo

aminoácido livre em solução

são semelhantes, o que indica

que este não sofre

significativas alterações

induzidas pela ligação à TPH.

Centro activo

A Phe313 interage com o

substrato através de ring

stacking define fortemente a

especificidade da ligação ao

substrato, sendo um resíduo

não conservado entre a TPH e

a PAH.

A conformação do L-Trp ligado

à enzima e do mesmo

aminoácido livre em solução

são semelhantes, o que indica

que este não sofre

significativas alterações

induzidas pela ligação à TPH.

University of Bergen, Noruega

Centro activo da chTPH1

O ião Fe(III) (a verde)

encontra-se coordenado

octaedricamente por uma

His272, His277, Glu317 e

ainda por 3 H2O .


Domínio de tetramerização

Os domínios de tetramerização das

quatro TPH interagem através de

interacções hidrofóbicas, com um

motivo superenrolado. Isto deve-se à

presença de uma repetição 3,4-

hidrofóbica, também presente no

domínio de tetramerização de TPH.

Este domínio é o responsável pela

oligomerização através de interacções

hidrofóbicas num motivo

superenrolado.

Estrutura da TPH com BH4

• Tyr125 a Asp130 • Densidade electrónica alterada

• chTPH1 tem outra conformação.

• Primeira estrutura de chTPH1 sem substratos presentes no centro activo e apenas a estrutura com nº de coordenação seis da hTPH.


Catálise pela hTPH Mecanismo, substratos e inibidores


Mecanismo da reacção enzimática

Diferentes intermediários de hidroxilação têm sido propostos.

O mecanismo de formação do intermediário Fe(IV)=O não é clara.

Forma activa do ferro nas hidroxilases de aminoácidos aromáticos:

Estado ferroso Fe(II) Fe(III) passa a Fe(II) por acção da BH4.

Fe(II)-peroxibiopterina Espécie de peroxo-BH4 Faculdade de Ciências da Universidade do Porto

• A formação e a reacção seguinte da espécie de peroxo-BH4 não inclui

o ferro, e como a hidroxilação do aminoácido não ocorre sem a

presença de ferro, a espécie de peroxo-BH4 não é um candidato

provável.

• Se a espécie de hidroxilação formada for a Fe(II)-peroxibiopterin, a

quebra da ligação O-O deve ser combinada com a adição do oxigénio

ao aminoácido.

• Nas hidroxilases de aminoácidos aromáticos, pensa-se que a espécie

Fe(IV)=O é formada pela quebra da ligação O-O existente na espécie

intermediária.


Coordenação no centro activo

• Ausência de substratos

Os ligandos que se ligam ao ferro são 2 histidinas, um glutamato, e três moléculas de água.

• Ligação dos substratos

Duas das três moléculas de água dissociam-se e o glutamato passa de um ligando monodentado a um ligando bidentado.

Diminuição do número de ligandos de seis para cinco, levando à abertura de um espaço para o O2.

Rearranjo por parte dos ligandos no centro activo quando tanto o aminoácido como o BH4 se

ligam, sendo esta a forma da enzima que reage com o oxigénio.


De um modo geral…

Hidroxilação do Trp a 5-hidroxitriptofano catalisada pela TPH na presença de O2 e BH4.


1. Reacção entre o sítio activo de ferro, oxigénio e o BH4 para formar um

intermediário reactivo , o Fe(IV)=O.

2. Hidroxilação do aminoácido pela espécie intermediária referida.

O aminoácido é hidroxilado pelo intermediário Fe(IV)=O através de um mecanismo

de substituição eletrofílico.

Estas duas reacções estão bastante acopladas, sendo que por cada molécula de BH4

oxidada, uma molécula de aminoácido é hidroxilada. No entanto, nem sempre ocorre

desta forma, sendo um mecanismo ainda pouco estudado.


2 “meias reacções” sequenciais:

De um modo geral…

1. Formação do intermediário de hidroxilação Intermediário: Fe(IV)=O

O mecanismo pelo qual se forma ainda não é bem conhecido

Mecanismo proposto

O Fe(II) liga-se ao O2, é convertido num complexo que vai atacar o C4 da BH4 formando então o intermediário Fe(II)-peroxibiopterina

Quebra da ligação O-O na Fe-peroxibiopterina


2. Mecanismo da hidroxilação do L-triptofano Regeneração da BH4

1. Ataque eletrofílico do Fe (IV) = O no átomo de C aromático originando um catião intermediário.

• Durante a formação do intermediário, Fe (IV) = O, BH4 é oxidado a 4-hidroxi-BH4, e é libertado pela enzima.

• A regeneração de BH4 é importante para o fornecimento contínuo de substrato reduzido para o mecanismo catalítico.


Reacção catalisada pela TPH e a regeneração da BH4


A TPH usa o BH4 como

dador de um electrão na

redução do oxigénio e na

hidroxilação do triptofano.

O 4a-hidroxi-BH4 é

convertido pela enzima

desidratase pterina-4a-

carbinolamina para qBH2.

A qBH2 é então reduzida

para BH4 pela

dihidrobiopteridina

redutase, à custa do NADH.

Inibidores da hTPH


BH2 Análogo ao cofactor BH4

p-etinilfenilalanina Análoga ao triptofano

p-clorofenilalanina Análogo ao triptofano

Estudo da triptofano hidroxilase • Dicroísmo Circular (DC) e Dicroísmo Circular Magnético

(DCM) • Cristalografia de raios-X • Mutações no centro activo


Dicroísmo Circular

• Estrutura geométrica

Separação entre as orbitais d depende da geometria de coordenação do ferro (teoria de campo de ligando).

Transições d-d difíceis de observar, por apresentarem ε muito baixas (transições proibidas por paridade- Laporte).

Recentemente começaram-se a usar técnicas que provam essas transições: DC e DCM.


Transições electrónicas dependentes da coordenação geométrica do Fe(II)

Determinação da energia de transição d-d (separação de orbitais)

Dicroísmo Circular e DC Magnético

Técnicas de Dicroísmo Circular e Dicroísmo Circular Magnético

• Estudo da coordenação do ferro no local ativo da TPH

na ligação do substrato e / ou cofator.

• Usaram-se estas técnicas para estudar a estrutura

geométrica e eletrónica do ferro no local ativo do

domínio catalítico de chTPH2 tendo em conta as

transições eletrónicas d-d.

• Este método pode ser usado para determinar a

coordenação do Fe (II), em enzimas não-heme, como os

AAAHS.


Espectros DCM para as 4 combinações de TPH substrato/cofator.

Resultados obtidos por DCM e DC para a TPH


Resultados obtidos por DCM e DC para a TPH


Espectros obtidos por DC para as 4 combinações de TPH substrato/cofactor

Análise dos resultados obtidos por DC e DCM

• TPH em repouso

Dois picos, que correspondem ao ferro hexacoordenado.

• Ligação do triptofano

A ligação deste sozinho não desencadeia a coordenação do ferro para uma penta coordenação, logo o ferro continua hexacoordenado. Há apenas uma ligeira perturbação na coordenação, mas não chega para haver uma mudança (o que é melhor visualizado pelos espectros de DC).

O pico deslocou-se ligeiramente para uma energia inferior.


Análise dos resultados obtidos por DC e DCM • Ligação do BH4

Dois picos observados pelos espectros do DC não evidentes por DCM.

À medida que o espectro de CD mostra claramente dois picos, conclui-se que a ligação de BH4 a TPH não altera a coordenação de ferro de forma significativa uma vez que permanece 6C. Não há grande alteração do pico relativamente à TPH em repouso.

A mudança no espectro é visualizada quando tanto o triptofano e BH4 são adicionados.

Um pico de baixa energia que aparece corresponde à mudança na coordenação do ferro de 6 para 5.

Posição dos picos retirados a partir dos espectros obtidos por DC para as quatro combinações de TPH substrato/cofactor


Cristalografia macromolecular de raios-X

• Cristalização por sitting drop vapour diffusion e posterior criopreservação

• Estudo macromolecular a resolução >5 Å permite estudo da estrutura cristalina e ainda do mecanismo reaccional/catalítico

• Incidência de raios X refractados pelos átomos na estrutura cristalina.


PADRÃO DE DIFRACÇÃO

Estrutura da biomolécula determinada por análise da intensidade e posição dos pontos de difracção

obtidos

Department of Molecular Biology, The Scripps Research Institute

chTPH1

Mutações no centro activo

Importância dos resíduos do centro activo

para a actividade da enzima.

Glu363 Coordenação com o Fe(II)

Proteína inactiva

Glu363 essencial à catálise

Tyr358 Proteína activa

Importante, mas não essencial à catálise


Investigadores e respectivas instituições envolvidas no estudo da TPH1 • Lin Wang, Heidi Erlandsen, Jan Haavik, Per M. Knappskog and Raymond C. Stevens (2002)

“Determinação da estrutura tridimensional da triptofano hidroxilase e o seu papel

na biossíntese de serotonina”

Department of Molecular Biology, The Scripps Research Institute

Department of Biochemistry and Molecular Biology, UniVersity of Bergen

Center of Medical Genetics and Molecular Medicine, UniVersity of Bergen

• Giovanni Cianchetta, Terry Stouch, Wangsheng Yu, Zhi-Cai Shi, Leslie W. Tari,Ronald V. Swanson, Michael J Hunter, Isaac D. Hoffman and Qingyun Liu (2010)

“Mecanismo de inibição da triptofano hidroxilase com a determinação das

estruturas cristalinas”

Department of Medicinal Chemistry, Lexicon Pharmaceuticals

Department of Pharmaceutical Discovery, Lexicon Pharmaceuticals

• Denmark Technical University


Bibliografia • M. S. Nielsen, Expression, purification and characterization of tryptophan hydroxylase,

Department of Chemistry, Technical University of Denmark, Kgs. Lyngby, 2007, Ph.D. dissertation

• K. M. Fisher and P. G. Nielsen, Cloning and expression of tryptophan hydroxylase, Department of Chemistry, Technical University of Denmark, Kgs. Lyngby, 2002, B.Sc. thesis

• C. R. Petersen and T. V. Rasmussen, Purification and stabilization of the catalytic domain of tryptophan hydroxylase, Department of Chemistry, Technical University of Denmark, Kgs. Lyngby, 2004, B.Sc. thesis

• M. S. Windahl, C. R. Petersen, H. E. M. Christensen and P. Harris, Crystal structure of tryptophan hydroxylase with bound amino acid substrate, Biochemistry, 47, 2008

• P. F. Fitzpatrick, Mechanism of aromatic amino acid hydroxylation, Biochemistry, 41, 2003, 14083-14091

• Enzyme Structures Database - The European Bioinformatics Institute (parte integrante do European Molecular Biology Laboratory)

http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/enzymes/

EMBL-EBI







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