FORMAÇÃO DE BANCOS DE GERMOPLASMA E SUA …

Ciência Animal, 22(1): 219-234, 2012 – Edição Especial

Ciência Animal, 22(1), 2012

Palestra apresentada no VI Congresso Norte Nordeste de Reprodução Animal, Fortaleza, CE, Brasil,

27 a 29 de junho de 2012. 219

FORMAÇÃO DE BANCOS DE GERMOPLASMA E SUA CONTRIBUIÇÃO

PARA A CONSERVAÇÃO DE ESPÉCIES SILVESTRES NO BRASIL.

(Formation of germplasm banks and its contribution to the wildlife conservation in

Brazil.)

Alexandre Rodrigues SILVA1*, Ana Liza Paz SOUZA

1, Erika Aparecida Araújo

dos SANTOS1, Gabriela Liberalino LIMA

1, Gislayne Christianne

Xavier PEIXOTO1, Patrícia Cunha SOUZA

1, Thibério Souza CASTELO

1.

1 Laboratório de Conservação de Germoplasma Animal – LCGA, Universidade Federal Rural do Semi-

Árido – UFERSA, BR 110, Km 47, Costa e Silva, 59625-900 Mossoró, RN, Brasil

*E-mail: [email protected]

RESUMO

A biodiversidade vem sofrendo grande diminuição nas últimas décadas, apesar do

incremento de algumas iniciativas, que visam o uso sustentável da diversidade

biológica. A criação de bancos de germoplasma, os quais abrigam coleções-base para a

conservação de ampla variabilidade genética vegetal e animal, surge como alternativa

para manutenção da biodiversidade. O presente trabalho apresenta dados acerca da

legislação vigente que regulariza a conservação e uso de recursos genéticos, bem como

os aspectos técnicos relativos a formação de coleções de gametas e embriões,

particularmente, visando a preservação de espécies silvestres no Brasil.

Palavras-chave: germoplasma, animais silvestres, conservação.

ABSTRACT

Biodiversity has suffered great loss in recent decades, despite the increased number of

initiatives that aims the sustainable use of biological diversity. The creation of

germplasm banks, which are collections that conserves the broad genetic variability of

plants and animals, is an alternative to maintaining biodiversity. This paper presents




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data about the legislation that regulates the use and conservation of genetic resources, as

well as the technical aspects of the formation of collections of gametes and embryos,

particularly in the preservation of wild species in Brazil.

Key words: germplasm, wildlife, conservation.

INTRODUÇÃO

A distribuição e o comportamento da vida selvagem têm sido afetados

diretamente pelas mudanças climáticas globais ou regionais e, indiretamente, por

mudanças na vegetação decorrentes do uso indevido da terra, fragmentando os habitats

e elevando os obstáculos à migração de espécies. Assim, é esperado que em poucos

anos muitas espécies em risco extremo sejam extintas e espécies vulneráveis se tornem

mais raras e mais próximas à extinção (IPCC, 2001). A redução da biodiversidade vem

apresentando uma preocupante aceleração nos últimos 100 anos (IUCN, 2011), apesar

do incremento de algumas iniciativas, das quais pode ser citada a ampliação da

superfície de área protegida no planeta. Contudo, as áreas de proteção raramente são

capazes de proteger todos os habitats e espécies de interesse (Kati et al., 2004).

Diante disso, surge a necessidade de iniciativas para o uso sustentável da

diversidade biológica. A conservação in situ, mecanismo mais utilizado na conservação

de espécies animais, permite que pequenas populações sejam mantidas em seu ambiente

original (Andrabi & Maxwell, 2007). Além disso, são utilizados métodos e técnicas de

manutenção dos animais vivos fora de seu ambiente (ex situ, in vivo), ou ainda a

criopreservação de seu germoplasma (ex situ, in vitro) (Hiemstra et al., 2005),

merecendo destaque a criação de bancos, os quais abrigam coleções-base para a

conservação de ampla variabilidade genética vegetal e animal (MMA, 2002).

Os bancos de germoplasma apresentam, como principal objetivo, o resgate de

populações que se extinguiram, ou que tenham importantes características biológicas a

serem preservadas (Hiemstra et al., 2005), ou ainda espécies localmente adaptadas ou

em risco de extinção (Ramos et al., 2011). Esse programa de conservação ex situ pode

ser beneficiado por modernas técnicas de biotecnologias da reprodução, como

inseminação artificial, transferência de embriões, produção in vitro de embriões,

micromanipulação de gametas e sexagem de sêmen/embriões (Galli et al., 2003).




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O presente trabalho discute aspectos da conservação dos recursos genéticos

animais, enfatizando a descrição de criações de bancos de germoplasma no âmbito

nacional, bem como abrangendo os desafios e perspectivas da conservação de material

genético de animais silvestres no Brasil.

Aspectos legais

Existe uma grande preocupação com o estabelecimento e a manutenção dos

centros biológicos de pesquisa, especialmente no que diz respeito às tecnologias de

criopreservação, as quais precisam ser confiáveis o suficiente para que o material

recuperado exerça a mesma função de quando estava intacto (Silvestre et al., 2004). Nos

bancos, devem-se adotar medidas que reduzam o risco de contaminação dos tecidos,

como também reduzir a possibilidade de transmissão de doenças. Para tanto, os pontos

cruciais seriam a triagem do doador e realização de boas práticas durante a coleta,

transporte e armazenamento do material. Porém, o risco de contaminação durante o

armazenamento ainda é alto, principalmente quando se utiliza o nitrogênio líquido

(Bielanski & Vajta, 2009).

Com a conscientização da importância dos recursos genéticos, faz-se

imprescindível a adoção de medidas e procedimentos no intuito de salvaguardá-los

(Wetzel & Bustamante, 2000). Desta maneira, a formação e constituição de bancos de

germoplasma devem ser reguladas, conforme legislações específicas em cada país. A

Convenção sobre a Diversidade Biológica – CDB, estabelecida pela Organização das

Nações Unidas, incluindo o Brasil a partir do Decreto Nº 2.519 de 16 de março de 1998,

dispõe sobre o acesso ao patrimônio genético, a proteção e o acesso ao conhecimento

tradicional associado, a repartição de benefícios e o acesso e transferência de tecnologia

para a conservação e utilização do patrimônio genético existente em território nacional

(Wolf, 2009). A CDB tem levado à implementação de legislações nacionais de

afirmação de soberania sobre recursos biológicos, reforçando a necessidade do país de

políticas públicas que protejam o seu próprio patrimônio genético, de modo que essa

proteção também permita que seja ampliado o intercâmbio com outros países,

garantindo ao Brasil capacidade de acessar e se beneficiar de avanços obtidos em

âmbito internacional na pesquisa em recursos genéticos (Wolf, 2009).




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No Brasil, as convenções brasileiras sobre a criação de um Sistema Nacional de

Coleções Biológicas e Bancos de Germoplasma objetivam, em suas diretrizes,

sensibilizar o governo a investir na conservação de coleções biológicas e bancos de

germoplasma, numa visão estratégica de segurança nacional e de combate à pirataria,

através da formação de uma rede brasileira que englobe instituições públicas de

pesquisa (Embrapa, Ministério da Agricultura e Conselho Nacional dos Sistemas

Estaduais de Pesquisa Agropecuária) e, se possível, empresas do setor privado (SAA,

2011).

Atualmente, o acesso e a conservação dos recursos genéticos da biodiversidade

brasileira podem ser definidos de acordo com a legislação vigente no Ministério do

Meio Ambiente, sobre a qual seguem alguns exemplos: em 07 de março de 2002, foi

aprovado o Decreto nº 4.154, que Regulamenta a Lei nº 10.332, de 19 de dezembro de

2001, na parte que institui mecanismo de financiamento para o Programa de

Biotecnologia e Recursos Genéticos – Genoma (CS, 2012). No ano de 2008, a

Subchefia para Assuntos Jurídicos da Casa Civil da Presidência da República realizou

consulta pública, via Internet, sobre uma minuta de Anteprojeto de Lei, de autoria do

Poder Executivo, que dispõe acerca de parte do assunto tratado pela Medida Provisória

nº 2.185-16, de 2001. O referido Anteprojeto de Lei - no momento em discussão

interministerial – tratou da coleta de material biológico; do acesso aos recursos

genéticos e seus derivados para pesquisa científica ou tecnológica (Wolf, 2009).

Entretanto, existem termos legais que exercem autonomia sobre os recursos genéticos

da biodiversidade em níveis estatais, como, por exemplo, a Lei nº 1.235, de 9 de julho

de 1997, que dispõe sobre os instrumentos de controle do acesso aos recursos genéticos

do Estado do Acre (DOEA,1997). Em âmbito mundial, os bancos de Germoplasma

podem ser regulamentados pelo o art. 15 da CDB, onde se estipula as obrigações

vinculadas ao acesso aos recursos genéticos que compõem a diversidade biológica,

constituindo a principal normativa internacional sobre o tema (Bertoldi, 2005).

Os bancos de germoplasma no brasil

No Brasil, existem bancos de germoplasma coordenados pela Embrapa Recursos

Genéticos e Biotecnologia por meio de um sistema conhecido como Plataforma

Nacional de Recursos Genéticos e distribuídos em várias instituições, como




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universidades federais e estaduais, institutos estaduais de pesquisa e desenvolvimento e

empresas estaduais (Ferreira et al., 2005). Entretanto, tais bancos são voltados,

principalmente, para a conservação de material genético de animais domésticos com

potencial produtivo dentro da pecuária (MAPA, 2012).

No tocante aos animais silvestres, o Jardim Zoológico de Brasília criou o

primeiro Banco de Germoplasma de Animais Selvagens da América Latina, inaugurado

no dia 29/07/2010, com a expectativa futura de perpetuação de muitas espécies da fauna

brasileira, ameaçadas ou em perigo de extinção. O banco tem finalidade de salvaguardar

tanto gametas a serem utilizados em biotécnicas reprodutivas, como também células

somáticas e células-tronco (FJZB, 2012).

Na cidade de Mossoró, situada no estado do Rio Grande do Norte, em 2007 foi

criado o Laboratório de Conservação de Germoplasma Animal – LCGA, no campus da

Universidade Federal Rural do Semi-Árido – UFERSA, o qual tem sido responsável por

inúmeras pesquisas voltadas para a coleta e criopreservação de gametas de diferentes

espécies silvestres, como quatis (Nasua nasua), catetos (Tayassu tajacu), cutias

(Dasyprocta aguti), tatus-peba (Euphractus sexcinctus) e preás silvestres da caatinga

(Galea spixi spixi) . Ainda, o Laboratório de Biologia e Medicina de Animais Silvestres

da Amazônia– BIOMEDAM da Universidade Federal do Pará, em conjunto com o

Centro Nacional de Primatas, situados em Belém do Pará, tem contribuído de forma

significativa para a adequação de biotécnicas reprodutivas voltadas para a preservação

de primatas neotropicais, como o macaco-prego (Cebus apella).

Como não existe um cadastro público de todas as instituições que hoje atuam

com pesquisas voltadas para o desenvolvimento de técnicas de conservação de

germoplasma em animais silvestres no Brasil, torna-se realmente difícil a citação de

todos os órgãos, bem como, permanece restrito o acesso àqueles trabalhos publicados

em veículos de baixa divulgação.

Aspectos técnicos

A formação de bancos de germoplasma consiste primeiramente na

criopreservação de gametas, embriões e células somáticas em botijões criogênicos, no

nitrogênio líquido a -196°C, ou em sua fase de vapor a -150°C (Domingues et al.,




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2011). No entanto, a capacidade do material biológico de sobreviver ao processo de

criopreservação depende de sua tolerância ao método de criopreservação (congelação

lenta ou vitrificação), aos agentes crioprotetores, desidratação e velocidade de redução

da temperatura (Santos et al., 2010). Haja vista que o presente texto tem foco principal

na reprodução assistida, serão aqui abordados apenas os aspectos técnicos relacionados

a conservação de gametas e embriões.

Conservação de gametas masculinos

Para aquisição dos gametas masculinos destinados a criopreservação, diferentes

métodos são reportados, mas a eletroejaculação (Silva et al., 2004) consiste no método

mais indicado para uso em animais silvestres, onde estão envolvidos riscos na

manipulação e manejo do animal, justificando sua contenção química (Domingues et

al., 2011).

Uma vez obtidos esses gametas, pode-se proceder à criopreservação cuja

eficácia é dependente da composição do diluente e de uma taxa ideal de congelação

(Hussain et al., 2011). Ainda, o desenvolvimento de protocolos de congelação envolve a

identificação de diferentes aditivos e crioprotetores, utilizados em concentrações

adequadas (Holt, 2000). Os principais diluentes utilizados consistem do Tris (tris-

hidroximetil-aminometano) e TES (ácido sulfônico N-tris-hidroximetil-metil-2-

aminometano) (Li et al., 2005). Como alternativa, citam-se os diluentes a base de água

de coco em pó (Silva et al., 2011) ou in natura (Oliveira et al., 2011).

A maioria dos protocolos de preservação utiliza o glicerol como crioprotetor

(Polge et al., 1949). Entretanto, a utilização de outras substâncias crioprotetores tem

sido também relatada, como o dimetilsulóxido (DMSO), etilenoglicol, e as amidas

(Dantas et al., 2011). Associada a estes, a gema de ovo (Castelo et al., 2010) ou a

lipoproteína de baixa densidade purificada (Bencharif et al., 2010) podem ser utilizadas

em procedimentos de congelação de sêmen tanto de animais domésticos como

silvestres. Substâncias iônicas ou não, que contribuem para manter a osmolaridade e o

pH (tampão) ou também aditivos como enzimas e antibióticos, podem ser adicionados

ao meio de congelação (Vishwanath & Shannon, 2000).

Apesar da criopreservação de sêmen ser uma técnica já consolidada, diferenças

na sua eficácia podem ser atribuídas a particularidades de cada espécie. No Brasil, esta




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técnica foi utilizada com sucesso na conservação de sêmen de gatos do mato

(Leopardus tigrinus - Erdmann, 2005), onças pintadas (Panthera onca - Paz et al.,

2007), jaguatiricas (Leopardus pardalis - Ávila, 2009), catetos (Tayassu tajacu -

Castelo et al., 2010; Silva et al., 2011), e macacos prego (Cebus apela - Oliveira et al.,

2011). Recentemente, foi também descrita a recuperação e criopreservação de

espermatozoides epididimários de cutias (Dasyprocta aguti - Silva et al., 2011).

Entretanto, relatos acerca do nascimento de crias viáveis a partir do uso destes materiais

permanecem ainda desconhecidos.

Gametas femininos

A criopreservação de gametas femininos ainda não é uma técnica bem

estabelecida, principalmente para as espécies silvestres, mas sua relevância é

indiscutível, constituindo-se de uma interface entre os programas de conservação animal

in situ e ex situ. (Andrabi & Maxwell, 2007). Esta técnica representa uma alternativa e

um complemento à criopreservação de sêmen e, para este propósito, pode ser realizada a

estocagem do tecido ovariano, dos folículos isolados ou dos oócitos maduros ou

imaturos (Lermen et al., 2009). A obtenção destes gametas pode ser realizada através de

punções foliculares, biópsias do tecido ovariano, ovariectomia uni ou bilateral ou

colheita do ovário imediatamente após a morte do animal, independente da idade

(Domingues et al., 2007).

Como a maioria dos animais doadores de gametas encontra-se distante dos

laboratórios especializados (Lopes et al., 2009), o desenvolvimento de protocolos de

preservação do material genético por curtos períodos é necessário, no intuito de manter

sua viabilidade no período compreendido entre a coleta e o uso em técnicas de

reprodução assistida (Santos et al., 2004). No Brasil, foi demonstrada que a solução a

base de água de coco em pó (ACP®) consiste em uma alternativa viável para a

preservação de gametas femininos de catetos (Tayassu tajacu) sob refrigeração por até

36h (Lima, 2011).

Em se tratando da criopreservação de oócitos, atualmente, são relatados dois

métodos para este fim, a congelação lenta e a vitrificação (Xu et al., 2012). A

congelação lenta é considerada o método convencional de criopreservação e como seu

princípio é a redução gradual da temperatura, geralmente controlada por um freezer




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programável, são utilizadas baixas concentrações de agentes crioprotetores (Naik et al.,

2005). Em outros países, seu uso já foi descrito em diferentes espécies silvestres como

elefantes africanos (Loxodonta africana - Gunasena et al., 1998), wombats (Vombatus

ursinus - Cleary et al., 2004), e porquinhos da Índia (Cavia porcellus - Xu et al., 2012),

dentre outros. Porém, no Brasil, esta técnica foi utilizada apenas para a preservação de

gametas femininos de cutias (Dasyprocta aguti - Wanderley et al., 2012).

Alternativamente, a vitrificação se baseia no uso de altas concentrações de

agentes crioprotetores, proporcionando viscosidade à solução de vitrificação a um valor

suficientemente alto para comportar-se como um sólido, contudo sem a formação de

cristais de gelo (Chian et al., 2004). Seu uso já foi descrito na conservação de gametas

femininos de primatas (Ting et al., 2011) e porquinhos da Índia (Cavia porcellus - Xu et

al., 2012), dentre outros. No Brasil, apesar de ser uma técnica já utilizada em animais

domésticos, seu uso em animais silvestres ainda não foi descrito.

Independente do método utilizado, os principais crioprotetores intracelulares

utilizados são o etilenoglicol, o dimetilsulfóxido e o propanodiol por apresentarem uma

capacidade de penetração superior a do glicerol (Emiliani et al., 2000), os quais são

geralmente utilizados em associação aos crioprotetores extracelulares. Dentro deste

grupo, os mais utilizados são os açúcares, como a sacarose e a trealose (Santos et al.,

2006). A eficiência das substâncias crioprotetoras pode variar de acordo com a estrutura

a ser criopreservada (Fuller & Paynter, 2004), a concentração, o tempo de exposição

antes do processo de criopreservação e a espécie animal (Gandolfi et al., 2006).

Embriões

A criopreservação de embriões é uma das principais ferramentas para a

manutenção de recursos genéticos de animais domésticos e silvestres (Dinnyes et al.,

2006). A técnica sofre influencia da origem do embrião (in vivo ou in vitro), do estágio

de desenvolvimento no momento da congelação, e da espécie (Dobrinsky, 2002).

Rotineiramente, pode ser realizada por vitrificação ou criopreservação convencional

(Santin et al., 2009), permanecendo o etilenoglicol como o crioprotetor de eleição, haja

vista sua baixa toxicidade e alta permeabilidade (Sommerfeld & Niemann, 1999).

Percebe-se assim que a criopreservação de embriões está em um estágio bem

desenvolvido, no entanto se torna ainda necessário o aprimoramento das técnicas para




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que haja o aumento das taxas de sobrevivência embrionária e finalmente seu uso para

animais silvestres ameaçados de extinção.

Recentemente, no Brasil, um importante passo foi dado para a tecnologia de

embriões de animais silvestres, a partir da produção in vitro do embrião de um primata

neotropical (Cebus apella – Lima et al., 2012) pelo BIOMEDAM. Acredita-se que, num

futuro próximo, a produção associada à criopreservação de embriões possam ser

também aditivos importantes na luta pela preservação de espécies silvestres no país.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Devido à escassez de informações acerca dos aspectos reprodutivos de grande

parte das espécies silvestres da fauna brasileira, o sucesso das biotecnologias da

reprodução ainda se apresenta de forma limitada. Embora a utilização da criotecnologia

já tenha permitido grandes avanços para a biologia reprodutiva em várias espécies,

especialmente domésticas, o processo ainda apresenta distintas limitações. Diante

dessas características, a evolução e a adaptação dos protocolos utilizados para coleta e

criopreservação de gametas e de embriões vêm sendo essenciais para aumento da

eficiência dos programas de enriquecimento de germoplasma. Contudo, a aplicabilidade

dos resultados, tanto no Brasil como no mundo, apesar de promissores, apresentam

baixa repetitividade, provavelmente devido a não padronização de protocolos adequados

que garantam a viabilidade celular.

De todo modo, os bancos de germoplasma são apenas um elo dentro de uma

complexa cadeia que envolve a conservação das espécies. Este desafio faz parte de um

programa multidisciplinar, que envolve várias áreas do conhecimento, e não se dirige

apenas a cientistas, mas também a políticos, comunidades, estudantes, dentre outros.

Afinal, qualquer que seja a espécie, não haveria sentido algum em se conservar e

multiplicar material genético em um laboratório, sem contar com a existência de um

ambiente apropriado para receber os animais e permiti-los sobreviver e multiplicar-se.




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