FREQUÊNCIA DO VÍRUS EPSTEIN-BARR (EBV) EM PACIENTES … · 2019-01-21 · Dissertação: Emanuele...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ – UFC

CENTRO DE BIOMEDICINA

DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA E MEDICINA LEGAL

PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA MÉDICA

FREQUÊNCIA DO VÍRUS EPSTEIN-BARR (EBV) EM PACIENTES

COM CÂNCER DE MAMA DO SERVIÇO DE MASTOLOGIA DE UM

HOSPITAL DO ESTADO DO CEARÁ.

EMANUELE SILVA DE OLIVEIRA

FORTALEZA-CE

2015

Dissertação: Emanuele Silva de Oliveira

Título: Frequência do Vírus Epstein-Barr (EBV) em pacientes com câncer de mama do

serviço de mastologia de um hospital do estado do Ceará

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FREQUÊNCIA DO VÍRUS EPSTEIN-BARR (EBV) EM PACIENTES COM CÂNCER

DE MAMA DO SERVIÇO DE MASTOLOGIA DE UM HOSPITAL DO ESTADO DO

CEARÁ.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Microbiologia Médica da

Universidade Federal do Ceará, como requisito

parcial à obtenção do título de Mestre em

Microbiologia Médica.

Orientadora: Profa Dra Sílvia Helena Barem

Rabenhorst.

FORTALEZA - CE,

2015




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FREQUÊNCIA DO VÍRUS EPSTEIN-BARR (EBV) EM PACIENTES COM CÂNCER

DE MAMA DO SERVIÇO DE MASTOLOGIA DE UM HOSPITAL DO ESTADO DO

CEARÁ.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Microbiologia Médica da

Universidade Federal do Ceará, como requisito

parcial à obtenção do título de Mestre em

Microbiologia Médica.

Aprovada em 26 / 01 / 2015

Banca examinadora

____________________________________________________________

Profa Dra Sílvia Helena Barem Rabenhorst (Orientadora)

Universidade Federal do Ceará - UFC

____________________________________________________________

Dra Márcia Valéria Pitombeira Ferreira


____________________________________________________________

Dr Renato Luiz Maia Nogueira


____________________________________________________________

Dr Sérgio Ferreira Juaçaba

Instituto do Câncer do Ceará - ICC




3

À minha família, em especial, às

mulheres da minha vida: minha

avó Julina e minha mãe...

Dedico.




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AGRADECIMENTOS

A Deus, pela sua presença, pelo seu amor que me conforta em todos os momentos, por

me fazer forte quando eu não tive outra alternativa e por me capacitar permitindo que eu

alcance etapas cada vez mais desafiadoras no caminho do crescimento profissional.

A minha família pelos exemplos de trabalho, bom humor e força representados por

aqueles que foram diretamente responsáveis pela minha formação: meus tios e tias (Ananias,

Paulinho, Eliane, Mary e Marlene). A meu pai pela serenidade e ouvidos dispostos a saber

como foi o meu dia. A minha mãe pelo exemplo de dedicação, esforço e competência e por

me oferecer um porto seguro diante de qualquer situação. A minha avó Julina pelo amor

“roxo”, pelas eternas demonstrações de carinho e pelos melhores cheiros e abraços.

A professora Dra. Sílvia Helena Barem Rabenhorst, pela orientação, pela fé na nossa

capacidade, pelo carinho e cuidado de mãe (“carões” e puxões de orelha também!) e pela

incansável busca de extrair o que nós temos de melhor.

Aos amigos do Laboratório, pelo apoio, ensinamentos, parcerias, “cafés da tarde” e

convivência sempre agradável. Àqueles presentes no início que me guiaram pelos primeiros

passos: Markênia, Denise e Patrícia. A Virllane, com quem convivi por pouco tempo, mas o

suficiente para cativar-me. A Débora, Isabelle, Eliane, Isaac e Ana Paula pela cumplicidade,

palavras incentivadoras, risos garantidos e abraços apertados.

Aos amigos mais ou menos próximos que fizeram e fazem parte da minha vida e

contribuíram para o que eu sou hoje, ainda que distantes, a minha sincera gratidão.

A minha amiga de qualquer hora e qualquer lugar, Sâmia que me inspira e me incentiva a

cada nova meta e que nunca deixou de me fazer sentir amada em cada dia de aniversário

(sendo tentativa de festa surpresa ou estando apenas nós duas diante de um bolo sobre a mesa

ao som da cantoria de “parabéns pra você”), em cada réveillon (que não me foi permitido

passar em casa dormindo), a cada surpresa diante de um postal enviado de algum lugar do

mundo dizendo que lembrou de mim ou em tantas outras demonstrações de carinho.

Aos participantes da banca, pela presteza em aceitar o convite, pela cuidadosa leitura e

pelas valiosas contribuições.

Ao programa de Pós Graduação em Microbiologia Médica representado pelos professores

e demais funcionários pelo empenho na formação científica dos pós graduandos.

A FUNCAP pelo suporte financeiro.




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"Se as coisas são inatingíveis... ora!

Não é motivo para não querê-las...

Que tristes os caminhos, se não fora

A presença distante das estrelas!"

Mario Quintana




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RESUMO

O câncer de mama representa a maior causa de mortalidade por câncer entre as mulheres em

todo o mundo. Apesar de possuir bom prognóstico quando diagnosticado e tratado

adequadamente, as taxas de mortalidade continuam elevadas no Brasil. A etiologia do câncer

de mama é multifatorial e alguns fatores de risco são descritos, como: idade, história familiar

e pessoal de câncer, fatores ligados a aspectos endócrinos, entre outros. Entretanto, em 50 a

80% dos casos, nenhum desses fatores é identificado, sugerindo a existência de outros.

Estudos apontam a associação do câncer de mama com o Vírus Epstein-Barr (EBV),

entretanto, os estudos são controversos. Assim, o presente estudo teve como objetivo verificar

a presença de EBV, utilizando a técnica de Hibridação in situ, em 75 pacientes diagnosticadas

com carcinoma mamário invasivo, provenientes do Ambulatório de Mastologia da

Maternidade Escola Assis Chateaubriand. Para a classificação molecular, os marcadores RE,

RP, HER2, Ki67, TP53, CK5/6 e CK8/18 foram detectados pela técnica de

imunohistoquímica. Neste estudo, a mediana da idade das pacientes foi de 55 anos, das quais

28% tinham até 45 anos. Apenas 8,7% dos tumores foram diagnosticados precocemente.

Graus de estadiamento mais avançados e comprometimento de linfonodos caracterizaram essa

amostra. A maioria dos tumores expressaram marcadores de citoqueratinas luminais,

receptores hormonais e marcador de proliferação celular (Ki67). Por outro lado, TP53 e

HER2 estiveram presentes em uma fração menor dos tumores. EBV foi positivo em apenas

6,67% dos casos nos quais a presença do vírus foi restrita a poucos núcleos de células

tumorais. O subtipo luminal B foi o mais frequente, seguido do luminal A. TP53 foi mais

frequente nos tumores do subtipo basal símile (75%), diferindo significativamente dos

tumores luminais A (16,7%) (p= 0,03) independente da idade. Entre as pacientes com até 45

anos, todos os tumores do subtipo triplo negativo (basal símile e normal símile) foram TP53

positivos, enquanto uma baixa frequência foi encontrada nos subtipos luminal A e luminal B

com uma diferença estatística entre triplo negativo (100%) e luminal A (14,3%) (p = 0,02),

triplo negativo e luminal B (16,7%) (p = 0,02), entre basal símile (100%) e luminal A (p =

0,04) e basal símile e luminal B (p = 0,04). As frequências de TP53 não diferiram

significativamente entre os subtipos moleculares nas pacientes acima de 45 anos.

Comparando-se os grupos de idade, é interessante notar que os tumores do subtipo triplo

negativo nas pacientes de até 45 anos de idade tiveram TP53 estatisticamente mais frequente




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do que em pacientes acima de 45 anos quando comparados com luminal B, enquanto nos

tumores do subtipo luminal B, TP53 foi mais frequente em pacientes acima de 45 anos de

idade. Em conclusão, apesar da presença de EBV observada, o pequeno número de casos e a

fraca positividade não permitem afirmar ser este um fator etiológico para o desenvolvimento

do câncer de mama e nem a associação da sua presença com algum subtipo molecular.

Entretanto, é importante ressaltar que o vírus foi pesquisado com base no seu perfil de

latência considerando a expressão de EBER e esses dados suscitam a adição de outros alvos

para a pesquisa da real participação do vírus. Por outro lado é interessante ressaltar a

importância do TP53 como marcador diferencial dos tumores triplo negativos em mulheres

abaixo de 45 anos.




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ABSTRACT

Breast cancer is the leading cause of cancer death among women worldwide. Despite having

good prognosis when diagnosed and treated properly, breast cancer mortality rates remain

high in Brazil. The etiology of breast cancer is multifactorial and some risk factors are

described, such as age, family and personal history of cancer, factors linked to endocrine

aspects, among others. However, by 50 to 80% of cases none of these factors is identified,

suggesting the existence of another one. Studies point to an association of breast cancer with

the Epstein-Barr Virus (EBV), but the studies are controversial. Thus, this study aimed to

verify the presence of EBV, using in situ hybridization in 75 patients diagnosed with invasive

breast carcinoma, from the Mastology Clinic of the Maternity School Assis Chateaubriand.

For molecular classification, ER, PR, HER2, Ki67, TP53, CK5/6 and CK8/18 markers were

detected by immunohistochemistry. In this study, the median age of patients was 55 years, of

which 28% were aged up to 45 years. Only 8,7% of the tumors were diagnosed early. More

advanced stage of degrees and lymph node involvement characterized this sample. Most

tumors express luminal cytokeratins markers, hormone receptors and marker of cell

proliferation (Ki67). Moreover, TP53 and HER2 were present in a minor fraction of tumors.

EBV was positive in only 6.67% of the cases in which the presence of the virus was restricted

to a few nuclei of tumor cells. The luminal B subtype was the most common, followed by

luminal A. TP53 was more frequent in tumors of the basal-like subtype (75%), significantly

differing from the luminal A tumors (16,7%) (p = 0.03) regardless of age. Among the patients

up to 45 years, all triple negative (basal-like and normal-like) subtype tumors were TP53

positive, while a low frequency was found in luminal A and B subtypes with a statistical

difference between triple negative (100%) and luminal A (14,3%) (p = 0.02), triple negative

and luminal B (16.7%) (p = 0.02), between basal-like (100%) and luminal A (p = 0.04) and

basal-like and luminal B (p = 0.04). The TP53 frequency did not differ significantly between

the molecular subtypes in patients over 45 years. Comparing the age groups, it is interesting

to note that in triple negative subtype tumors in patients under 45 years old TP53 was

statistically more frequent than in patients over 45 years old compared with luminal B, while

in luminal B tumors, TP53 was more frequent in patients over 45 years old. In conclusion,

despite the presence of EBV observed, the small number of cases and the weak positivity does

not allow to say that this is an etiological factor for the development of breast cancer neither




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the association of their presence with some molecular subtype. However, it is important to

note that the virus was investigated based on your profile latency considering the EBER

expression and these data raise the addition of other targets for studying the real participation

of the virus. Furthermore, it is interesting to note the importance of TP53 as a marker of

differential triple negative tumors in women below 45 years.




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LISTA DE FIGURAS

Figura 01 - Estimativas para o ano de 2014 do número de casos novos de câncer de

mama e distribuição proporcional entre os dez tipos de câncer mais incidentes

estimados para 2014........................................................................................................... 15

Figura 02 – Genoma do Vírus Epstein-Barr.................................................................... 32

Figura complementar A - Percentual de casos de câncer de mama estudados

distribuídos segundo a faixa etária das pacientes (n=75)................................................... 76

Figura complementar B - Frequência da expressão das proteínas celulares RE, RP,

HER2, Ki67, TTP53, CK5/6 e CK8/18 e percentual de células tumorais marcadas

(n=75)................................................................................................................................. 77




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LISTA DE TABELAS

Tabela 01 – Classificação histológica do carcinoma mamário invasivo........................... 16

Tabela 02 – Definição do TNM patológico...................................................................... 22

Tabela 03 - Estadiamento TNM para câncer de mama.................................................... 26

Tabela 04 – Técnicas de detecção do EBV em amostras de tumores mamários.............. 28

Tabela 05 - Expressão de genes latentes do EBV quanto aos tipos de latência e tecido

associado............................................................................................................................ 33

Tabela 06 - Regiões celulares de expressão dos alvos das técnicas empregadas e os

respectivos clones dos anticorpos...................................................................................... 41

Tabela 07 - Critérios de positividade definidos para as proteínas detectadas por

imunohistoquímica............................................................................................................. 42

Tabela complementar A - Percentual de casos de carcinoma mamário estudados,

distribuídos quanto à gestação e presença de fatores de risco (história prévia de câncer,

história familiar, tabagismo e etilismo............................................................................... 76

Tabela complementar B - Características imunohistoquímicas de carcinomas de

mama em pacientes ≤ 45 anos e > 45 anos........................................................................ 77

Tabela complementar C - Características imunohistoquímicas de carcinomas de

mama em pacientes tabagistas/não tabagistas e com/sem história prévia/familiar de

câncer................................................................................................................................. 78




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SUMÁRIO

1. Introdução...................................................................................................................

1.1. Câncer de mama....................................................................................................

1.1.1. Epidemiologia do câncer de mama.............................................................

1.1.2. Características histopatológicas do câncer de mama..................................

1.1.2.1. Classificação histológica................................................................

1.1.2.2. Fatores prognósticos.......................................................................

1.1.3. Etiologia do câncer de mama.....................................................................

1.1.4. Os vírus e o câncer de mama......................................................................

1.2. Vírus Epstein-Barr (EBV)....................................................................................

1.2.1. Histórico.....................................................................................................

1.2.2. Características do vírus Epstein-Barr.........................................................

1.2.3. Técnicas de detecção do EBV....................................................................

1.2.4. EBV em tumores sólidos............................................................................

1.3. Justificativa do estudo...........................................................................................

1.4. Hipótese................................................................................................................

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2. Objetivos.....................................................................................................................

2.1. Objetivo geral.......................................................................................................

2.2. Objetivos específicos............................................................................................

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37

37

3. Material e métodos......................................................................................................

3.1. Casuística..............................................................................................................

3.2. Aspectos éticos.....................................................................................................

3.3. Instrumentos e procedimentos de coleta de dados................................................

3.4. Hibridação in situ..................................................................................................

3.5. Imunohistoquímica...............................................................................................

3.6. Critérios para análise das lâminas.........................................................................

3.7. Análise estatística.................................................................................................

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4. Referências bibliográficas........................................................................................... 44

Apêndices...........................................................................................................................

Apêndice I - Low frequency of virus Epstein-Barr (EBV) in Breast Cancer in

patients from Ceara – Brazil…………………………………………………………

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Apêndice II - Molecular characterization of Breast Cancer in Brazilian Northeast

women..........................................................................................................................

Apêndice III – Tabelas e figuras complementares.......................................................

Apêndice IV - Parecer do Comitê de Ética em pesquisa da Maternidade Escola

Assis Chateaubriand (MEAC).....................................................................................

Apêndice V - Ficha de coleta de dados socioepidemiológicos.................................

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1. INTRODUÇÃO

1.1 Câncer de mama

1.1.1 Epidemiologia do câncer de mama

O câncer de mama (CM) representa a maior causa de mortalidade por câncer entre as

mulheres em todo o mundo. Foram estimadas cerca de 520 mil mortes para o ano de 2012. É a

segunda causa de morte por câncer nos países desenvolvidos (depois do câncer de pulmão) e a

maior causa nos países em desenvolvimento. Nos últimos 40 anos, a sobrevida vem

aumentando nos países desenvolvidos (85% em cinco anos), mas permanece com valores

entre 50 a 60% nos países em desenvolvimento. Apesar de ser considerado de bom

prognóstico quando diagnosticado e tratado adequadamente, as taxas de mortalidade por

câncer de mama continuam elevadas no Brasil, provavelmente devido ao fato de a doença

ainda ser diagnosticada em estágios avançados (INCA, 2014).

No Brasil, o exame clínico das mamas anualmente a partir dos 40 anos e a mamografia

bienal para mulheres entre 50 a 69 anos é a estratégia recomendada para a detecção precoce

da doença em mulheres com risco padrão. Para aquelas que pertencem a grupos de risco

elevado (com história familiar de câncer de mama em parentes de primeiro grau), recomenda-

se o exame clínico da mama e a mamografia, anualmente, a partir de 35 anos (INCA, 2014).

Cerca de 1,67 milhões de casos novos desta neoplasia foram esperados para o ano de

2012 em todo o mundo, representando 25% de todos os tipos de câncer diagnosticados nas

mulheres. Suas taxas de incidência variam entre as diferentes regiões do mundo, com as

maiores taxas em 2012 na Europa Ocidental (96/100 mil) e as menores taxas na África

Central e na Ásia Oriental (27/100 mil) (INCA, 2014).

Segundo o Instituto Nacional de Câncer (INCA) 2014, no Brasil, o câncer de mama foi

responsável por 20% dos casos novos para o ano de 2014, sendo esperados 57.120 novos

casos, com um risco estimado de 56,09 casos por 100.000 mulheres. Desconsiderando-se o

câncer de pele, é o tipo de câncer mais frequente nas mulheres nas regiões Sudeste (71,18/100

mil), Sul (70,98/100 mil), Centro-Oeste (51,30/100 mil) e Nordeste (36,74/100 mil). Na

região Norte, é o segundo tumor mais incidente (21,29/100 mil) (figura 01).




15

Figura 01 - Estimativas para o ano de 2014 do número de casos novos de câncer de mama e

distribuição proporcional entre os dez tipos de câncer mais incidentes estimados em 2014.

Fonte: Instituto Nacional de Câncer – INCA, 2014.

1.1.2 Características histopatológicas do câncer de mama

O curso clínico do câncer de mama e a sobrevida são elementos variáveis de paciente

para paciente. Esta variação é determinada por uma série complexa de fatores, tais como a

diferença na velocidade de duplicação do tumor, o seu potencial de metastatização e outros

mecanismos ainda não completamente compreendidos, relacionados com a condição

imunológica, hormonal e nutricional da paciente (Clark, 1996; Abreu e Koifman, 2002).

1.1.2.1 Classificação histológica

Com relação ao tipo histológico, recentemente foi publicada a quarta edição da

classificação de tumores de mama da Organização Mundial de Saúde (OMS). Os tumores

mamários invasivos, em sua maioria, são carcinomas ductais, que não apresentam padrão

citológico ou arquitetural especial. São reconhecidos o carcinoma mamário invasivo de tipo

não especial e mais de 20 tipos histológicos especiais definidos predominantemente por

critérios morfológicos (tabela 01) (Bacchi et al. 2013, Geyer e de Nigro, 2013).




16

Tabela 01 - Classificação histológica do carcinoma mamário invasivo.

Classificação histológica do carcinoma mamário invasivo

Carcinoma invasivo de tipo não especial

Carcinoma lobular invasivo

Carcinoma tubular

Carcinoma cribiforme

Carcinoma com características medulares

Carcinoma metaplásico

Carcinoma com diferenciação apócrina

Carcinoma adenóide cístico

Carcinoma mucoepidermóide

Carcinoma polimorfo

Carcinoma mucinoso e carcinoma com células em anel de sinete

Carcinoma com características neuroendócrinas

Carcinoma papilífero invasivo

Carcinoma micropapilífero invasor

Carcinoma secretor

Carcinoma oncolítico

Carcinoma sebáceo

Carcinoma rico em lipídeos

Carcinoma de células claras rico em glicogênio

Carcinoma de células acinares

(Geyer e de Nigro, 2013).

Usualmente identificado como carcinoma ductal invasivo (CDI), o carcinoma

mamário invasivo de tipo não especial corresponde a cerca de 70% dos casos, sendo definido

como uma neoplasia epitelial mamária invasiva que não preenche critério para nenhum tipo

especial (Geyer e de Nigro, 2013). Alguns tumores exibem características peculiares que

determinam um padrão morfológico especial e também um prognóstico diferenciado (Bacchi

et al. 2013). Esses tumores são chamados tipos especiais puros quando essas características

estão presentes em mais de 90% da neoplasia. Dentre estes, o carcinoma lobular invasivo




17

(CLI) é o mais prevalente (aproximadamente 15%). Não é incomum uma mesma neoplasia

apresentar áreas com diferentes morfologias, sendo consideradas neoplasias de padrão misto.

Além da subjetividade dos critérios diagnósticos, ao aplicá-la, cerca de 85% dos casos

acabam por pertencer às duas categorias principais de CDI ou CLI. Dentro da mesma

categoria histológica, a avaliação imunohistoquímica para receptor de estrógeno (RE),

receptor de progesterona (RP) e receptor de fator de crescimento epidérmico 2 (HER2)

passam a ter um papel fundamental para aumentar o valor discriminatório entre os casos

(Geyer e de Nigro, 2013).

O carcinoma invasivo do tipo não especial e o carcinoma lobular invasivo são as

formas mais comuns de carcinomas de mama. Pacientes portadoras de carcinoma invasivo do

tipo não especial apresentam normalmente um maior comprometimento de linfonodos e um

pior prognóstico que aquele verificado nos pacientes com tipos menos frequentes de

carcinoma invasivo de mama (Reinfuss et al. 1995; Diab et al., 1999). Embora nos primeiros

cinco anos, pacientes com carcinoma invasivo do tipo não especial apresentem maior taxa de

recorrência em relação a pacientes com carcinoma lobular invasivo, as curvas de sobrevida

tendem a se igualar aos dez anos de seguimento (Geyer e de Nigro, 2013).

Os tumores malignos de mama do tipo carcinoma tubular estão entre aqueles que

apresentam o melhor prognóstico. O carcinoma tubular apresenta excelente prognóstico,

mesmo nas pacientes com comprometimento de linfonodos, estando a sobrevida muito

próxima daquela verificada na população geral (Abreu e Koifman, 2002).

É na correta identificação dos tipos histológicos especiais, os quais refletem

características biológicas e clínicas bastante homogêneas, que reside a maior importância da

tipagem histológica (Ellis et al., 2003; Viale, 2012).

Alguns marcadores têm sido considerado clássicos para o estabelecimento do

prognóstico dos tumores mamários por imunohistoquímica, como os receptores de estrógeno

e progesterona (RE e RP) e o receptor de fator de crescimento epidérmico 2 (HER2).

A expressão do receptor de estrógeno (RE) é, sem dúvida, o mais importante

biomarcador em câncer de mama, pois fornece o índice de sensibilidade ao tratamento

endócrino. Tumores RE positivos usam o esteróide hormonal estradiol como seu principal

estímulo para crescimento, sendo, portanto, o alvo direto das terapias endócrinas. O

tratamento com tamoxifeno reduz a taxa anual de morte por câncer de mama em 31% na

doença RE positiva. Evidências a partir de 1970 sugerem uma correlação direta entre os níveis




18

de expressão de RE e resposta à terapia endócrina (Viale et al., 2007). O Early Breast Câncer

Trialists’ Collaborative Group relatou que os níveis mais elevados de RE foram associados a

um menor risco de recorrência quando receberam tamoxifeno adjuvante (Buitrago et al.,

2011).

A expressão do Receptor de Progesterona (RP) é dependente da presença de RE.

Tumores que expressam RP, mas não o RE, são incomuns e representam 1% dos casos de

câncer de mama. Por isso, tumores com expressão de RP e falta de expressão de RE devem

passar por um novo teste para confirmar os resultados para o RE e eliminar a possibilidade de

falso negativo. Nesses casos de expressão apenas de RP, foram descritos benefícios limitados

com uso de tamoxifeno, por isto a terapia endócrina é ainda amplamente recomendada. Há

evidências de que no câncer de mama metastático a resposta ao tratamento antiestrogênio é

melhor entre pacientes com tumores que expressam tanto RE como RP versus aqueles que

apenas mostram positividade para RE, mas falta a expressão de RP (Buitrago et al., 2011).

O receptor do fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2) pertence à família

dos receptores de crescimento. A sua expressão tem sido associada a maior agressividade

biológica do tumor e à resistência a alguns tipos de tratamento (Ferrero et al., 2000). O HER2

codifica uma proteína de membrana das células tumorais que faz com que estas se

desenvolvam mais rápido e aumentem a sua duplicação, tornando os tumores mais agressivos

(Slamon et al., 1987; Di Fiore et al., 1987). Diversos estudos têm sugerido que existe uma

relação entre o estado HER2 e a resistência hormonal (Benz et al., 1992; Fernandez et al.,

1997). A presença do HER2 está associado a maior risco de recidiva tumoral (Press et al.,

1997) e desempenha um papel fundamental na carcinogênese (Slamon et al., 1987; Di Fiore et

al., 1987). O HER2 é amplificado em 15% a 25% dos casos de câncer de mama humano

(Konecny et al., 2003). Amplificação do HER2 ou superexpressão são reconhecidas como

importantes marcadores de doença agressiva e são os alvos moleculares para terapias

específicas, como trastuzumab e lapatinib (Piccart-Gebhart et al., 2005).

Outros marcadores têm sido vistos como emergentes para contribuir com o

conhecimento sobre o prognóstico dos tumores mamários, como o Ki67.

Devido à grande heterogeneidade dos tumores, outros marcadores vêm sendo propostos

como emergentes no estudo do câncer mamário para contribuir com o conhecimento sobre o

prognóstico desses tumores. Dentre estes, a mutação do TP53 (Schneider et al., 2007), receptores




19

andrógenos (Rakha et al., 2007), receptor de crescimento epitelial EGFR (HER-1) (Hoadley et al,

2007; Cheang et al, 2008) e Ciclina D1 (Reis-Filho et al, 2006).

O gene TP53 é um gene regulador chave do ciclo celular, que quando sofre mutações

leva ao desenvolvimento de neoplasias, atuando como gene supressor tumoral em condições

normais (Hollstein et al., 1991). É um dos genes responsáveis pela integridade do genoma,

ativado pelo surgimento de DNA alterado. Sua ativação produz uma proteína que estimula a

síntese de outras proteínas que inibem a replicação celular e estimulam as enzimas de reparo

do DNA. Caso o reparo no DNA seja completo, o TP53 é inativado e a célula retorna ao

estado normal. Caso o reparo não ocorra, a célula permanece impedida de se replicar e é

induzida a apoptose (Lopes et al., 2002).

Ki67 é uma proteína nuclear que não é expressa nas células em repouso (G0), mas

pode ser detectada nas outras fases G1 a M do ciclo celular. Sua utilização como um marcador

de proliferação celular mostrou que o percentual de células positivas para Ki67 pode ser

usado para estratificar pacientes de bom prognóstico ou grupos de mal prognóstico (Buitrago

et al., 2011). O Ki67 pode ser considerado como um fator de proliferação facilmente avaliado

e reprodutível e pode ser uma alternativa ou complemento ao grau histológico como uma

ferramenta de prognóstico e para a seleção de tratamento adjuvante. Foi demonstrado o valor

prognóstico de Ki67 em pacientes com câncer de mama e linfonodos negativos, mas também

revela que o impacto prognóstico é restrito a tumores RE positivos e grau histológico 2.

Embora existam outros marcadores de proliferação celular, o Ki67 tem preço mais acessível, é

facilmente avaliado e reprodutível (Marie et al., 2010).

As citoqueratinas humanas (CKs) são uma família de proteínas codificadas por diferentes

genes que são expressos em vários tipos de células e estão relacionadas à regulação do

desenvolvimento e diferenciação celular. Existe uma relação entre o peso molecular da

citoqueratina e o tipo de epitélio onde está expressa. Assim, as de baixo peso molecular estão em

epitélios simples e as de alto peso molecular em epitélios estratificados (Ribeiro-Silva et al.,

2005).

Apesar de os grupos que estudam o câncer de mama reconhecerem há muito tempo a

diversidade dos tumores mamários, o conceito da heterogeneidade foi de fato incorporado à

pesquisa e à prática clínica. A heterogeneidade dos carcinomas de mama é decorrente do

envolvimento de diferentes genes relacionados à atividade proliferativa, diferenciação e supressão




20

de tumores, muitos destes vêm sendo estudados isoladamente ou em pequenos grupos quanto ao

seu papel na carcinogênese, assim como a sua implicação como fatores prognósticos.

Com os avanços na área de biologia molecular foi possível identificar perfis genômicos

importantes para a classificação clínica e biológica dos tumores de mama (Pollack et al., 2002;

Sorlie et al., 2003; Buitrago et al., 2011). As associações da caracterização fenotípica com o perfil

obtido pelas análises de microarray revelaram distintos subtipos que foram associados com

sobrevida. Dentro deste contexto, cinco grandes grupos de carcinomas de mama invasivos foram

identificados: luminal A, luminal B, HER2+, basal símile, e normal símile (Yersal e Barutca,

2014).

Aproximadamente 75% dos carcinomas mamários são positivos para RE e/ou RP. Os

tumores RE positivos expressam RE, RP e outros genes que codificam proteínas de células

epiteliais luminais, então, eles são caracterizados como subtipo luminal. Foram identificadas duas

subclasses dentro desse grupo: luminal A e luminal B (Yersal e Barutca, 2014).

O subtipo luminal A é o subtipo mais comum e representa 50 a 60% de todos os

carcinomas mamários. Esses tumores normalmente têm baixo grau histológico, pouco

pleomorfismo nuclear e baixa atividade mitótica, representando tumores de bom prognóstico. O

grupo é caracterizado pelos elevados níveis de expressão de RE e baixos níveis de expressão de

genes relacionados à proliferação celular. É caracterizado pela expressão de citoqueratinas

epiteliais luminais (CK8/18) e outros marcadores luminais associados. O subtipo luminal A é

definido então, como tumores RE e/ou RP positivos, HER2 negativos e com baixos níveis de

expressão de Ki67 (≤ 14%) (Carey et al., 2006; Guarneri et al., 2009; Carey et al., 2010;

Kennecke et al., 2010; Yersal e Barutca, 2014).

Tumores luminais B representam 15 a 20% dos cânceres mamários e têm fenótipo mais

agressivo, altos grau histológico e índice proliferativo e um pior prognóstico. Esse subtipo tem

alta taxa de recorrência e baixo índice de sobrevivência quando comparado ao subtipo luminal A.

O subtipo luminal B é constituído por tumores RE e/ou RP positivos, HER2 negativos e com altos

níveis de expressão de Ki67 (> 14%). Tumores luminais B têm menos resultados com

hormonioterapia com relação aos luminais A. No entanto, o câncer de mama luminal B responde

melhor à quimioterapia neoadjuvante que o luminal A. A maior taxa de reincidência da doença

em tumores luminais B estão limitados aos primeiros cinco anos depois do diagnóstico (Cheang et

al., 2009; Guarneri et al., 2009; Creighton et al., 2012; Geyer et al., 2012; Yersal e Barutca,

2014).




21

O receptor de fator de crescimento epidérmico 2 é um membro da família de quatro

tirosinas quinases de membrana. Os tumores HER2 positivos representam 15 a 20% dos tumores

mamários. A positividade para o HER2 representa comportamento clínico e biológico mais

agressivo. Esses tumores são caracterizados pela alta expressão do gene HER2.

Morfologicamente, esses tumores são altamente proliferativos, 75% tem altos graus histológico e

nuclear e mais de 40% tem mutação no gene TP53. Aproximadamente metade dos tumores HER2

positivos é também positivo para o RE, mas eles geralmente expressam esse marcador em baixos

níveis (Tsutsui et al., 2003; Gutierrez et al., 2011; Yersal e Barutca, 2014).

O subtipo basal símile representa de 8 a 37% de todos os carcinomas mamários. São

associados com altos graus histológico e nuclear, pouca formação de túbulos e presença de zonas

centrais necróticas ou fibróticas, bem como elevados níveis mitóticos e índices proliferativos. Boa

parte desses tumores são invasivos, com comportamento clínico agressivo e com elevadas taxas

de metástase para o cérebro e para os pulmões. Os tumores que fazem parte desse grupo

expressam elevados níveis de marcadores epiteliais basais, como CK5, CK14, CK17 e laminina e

não expressam RE, RP e HER2, sendo referidos portanto, como triplo negativos. Esses tumores

frequentemente apresentam mutações no gene TP53, evidências de instabilidade genômica e

inativação de retinoblastoma (Rb) (Yersal e Barutca, 2014).

É importante ressaltar que os termos “triplo negativo” e ”basal símile” não são

completamente sinônimos. O termo triplo negativo refere-se a tumores mamários que não

expressam RE, RP e HER2 utilizando-se da imunohistoquímica para detecção. Esse fenótipo

triplo negativo, atualmente, é um subtipo confiável na prática clínica (Kreike et al., 2007).

Microarray e análises imunohistoquímicas demonstram que o subtipo basal símile

constitui aproximadamente 75% dos cânceres de mama relacionados ao BRCA1. Esses cânceres

frequentemente expressam fenótipo triplo negativo e são frequentemente positivos para Ki67,

citoqueratinas basais, TP53, EGFR e E-caderina (Kreike et al., 2007; Rakha et al., 2009;

Ignatiadis et al., 2009; Yersal e Barutca, 2014).

Por fim, os tumores do tipo normal símile representam cerca de 5 a 10% de todos os

carcinomas mamários, expressam características genéticas de tecido adiposo, apresentam

prognóstico intermediário entre os cânceres luminais e basais e normalmente não respondem à

quimioterapia adjuvante. Como eles não expressam RE, RP e HER2, também são classificados

como triplo negativos, mas não são considerados basais símiles por serem negativos para CK5 e

EGFR (Kreike et al., 2007; Rakha et al., 2009; Ignatiadis et al., 2009; Yersal e Barutca, 2014).




22

As implicações da classificação molecular na terapêutica do câncer de mama têm sido

aceitas por vários painéis internacionais. Em 2011 e, mais recentemente, em 2013, especialistas

concordaram que as decisões terapêuticas devem ser feitas com base no reconhecimento dos

subtipos moleculares (Goldhirsch et al., 2013).

1.1.2.2. Fatores prognósticos

Fatores prognósticos são parâmetros possíveis de serem mensurados no momento do

diagnóstico e que servem como preditores da sobrevida do paciente (tabela 02) (INCA, 2014).

Certos aspectos anatômicos, como o tamanho do tumor primário e as condições dos

linfonodos, são fatores importantes na avaliação prognóstica (Andreopoulou et al., 2008;

Jemal et al., 2009; Buitrago et al., 2011), assim como características histológicas e biológicas,

como grau nuclear, grau histológico, dosagem de receptores hormonais e outros fatores

avaliados por imunohistoquíca são também determinantes para o prognóstico da evolução da

doença (Buitrago et al., 2011).

Tabela 02 – Definição do TNM patológico.

pT - Tumor primário

Ptx Não avaliável

pT0 Nenhuma evidência do tumor primário

pTis Carcinoma in situ

Tis CDIS (Carcinoma ductal in situ)

Tis CLIS (Carcinoma lobular in situ)

Tis Paget (Doença de Paget do mamilo sem carcinoma invasivo ou in situ na mama)

pT1 Tumor ≤ 2 cm

pT1mi Microinvasão (foco ou focos ≤ 0,1 cm)

pT1a > 0,1 cm e ≤ 0,5 cm

pT1b > 0,5 cm e ≤ 1 cm

pT1c >1 cm e ≤ 2 cm

pT2 Tumor > 2cm e ≤ 5 cm

pT3 Tumor > 5 cm

Continua




23

Continuação

Continua

pT4 Tumor de qualquer tamanho com invasão da parede torácica e/ou pele (com

ulceração ou nódulos)

pT4a

Extensão da parede torácica (invasão de costelas, músculos intercostais e músculo

serrátil anterior); a invasão de músculo peitoral isoladamente não está incluída

pT4b Edema (incluindo peau d’orange), ulceração ou nódulos-satélite ipsilaterais na pele da

mama

pT4c Presença de ambos pT4a e pT4b

pT4d Carcinoma inflamatório

pN – Linfonodos regionais (requer excisão com avaliação histológica de pelo menos o

nível I axilar (6 ou mais linfonodos)

pNX Linfonodos regionais não avaliados

pN0 Ausência de metástases ao exame histológico de rotina

pN0 (i+)

Presença de células tumorais isoladas (CTI), detectadas por HE ou por exame

imunohistoquímico (menor ou igual a 0,2 mm ou até 200 células em uma

única secção histológica completa do linfonodo)

pN0 (i-) Pesquisa imunohistoquímica negativa para células neoplásicas isoladas

pN0 (mol+) Pesquisa molecular (geralmente RT-PCR) para células tumorais positivas, mas

sem nenhuma célula detectada nos cortes corados pelo HE ou

imunohistoquímica

pN0 (mol-) Pesquisa molecular para células neoplásicas isoladas negativa

pN1 Metástase em 1 a 3 linfonodos axilares ipsilaterais e/ou linfonodos da cadeia

mamária interna pela biópsia do linfonodo-sentinela, mas não detectável

clinicamente

pN1mi Micrometástase (> 0,2 mm e/ou mais de 200 células, porém ≤ 2 mm)

pN1a Metástases em 1 a 3 linfonodos axilares, incluindo pelo menos um foco > 0,2 mm

pN1b Linfonodo da cadeia mamária interna com micrometástase ou macrometástase

detectada pelo linfonodo-sentinela, mas não detectável clinicamente

pN1c Metástases de 1 a 3 linfonodos axilares e em linfonodo da cadeia mamária interna

com micrometástase ou macrometástase detectada pela biópsia do linfonodo-

sentinela, mas não detectável clinicamente (se associada com mais de 3 linfonodos

axilares positivos, classificar como pN3b




24

Continuação

pN2 Metástases em 4 a 9 linfonodos ou em linfonodo da cadeia mamária interna

clinicamente aparente, na ausência de metástase axilar

pN2a Metástases em 4 a 9 linfonodos axilares, pelo menos uma metástase > 2 mm

pN2b Metástases em linfonodos da cadeia mamária interna detectadas clinicamente, na

ausência de comprometimento axilar

pN3 Metástases em 10 ou mais linfonodos axilares ou em linfonodos

infraclaviculares (nível III) ou em linfonodos da cadeia mamária interna

ipsilateral clinicamente aparentes, na presença de 1 ou mais linfonodos axilares

positivos; ou em mais de 3 linfonodos axilares com metástase microscópica

(macrometástase ou micrometástase) nos linfonodos da cadeia mamária interna

ipsilateral, clinicamente inaparente; ou em linfonodo supraclavicular ipsilateral

pN3a Metástases em 10 ou mais linfonodos axilares, pelo menos uma metástase > 2 mm ou

metástase em linfonodo infraclavicular (nível III)

pN3b Metástases em linfonodos da cadeia mamária interna ipsilateral detectadas

clinicamente na presença de um ou mais linfonodos axilares positivos; ou metástases

em mais de 3 linfonodos axilares associados com doença microscópica

(macrometástase ou micrometástase) em linfonodo sentinela da cadeia mamária

interna, mas não clinicamente aparente

pN3c Metástases em linfonodo(s) supraclavicular(es) ipsilateral (is)

pM – Metástases à distância

pMX Não avaliadas

pM0 Ausência de metástases à distância

pM1 Metástase à distância

Retirado de Manual de padronização de laudos histopatológicos (Bacchi, et. al., 2013).

Um mesmo marcador poderá ser considerado como preditivo, quando fornecer

informações úteis na seleção de pacientes susceptíveis à determinada terapêutica específica. O

protótipo do marcador preditivo são os receptores hormonais que mediam a resposta à

terapêutica hormonal adjuvante (Zuccari et al., 2008). Esses fatores prognósticos e preditivos

podem ser importantes na escolha do tratamento adequado e para determinar o risco de

recorrência e para a classificação de pacientes para ensaios clínicos (Buitrago et al., 2011). O

receptor de estrógeno e a superexpressão do HER2, por exemplo, se consolidaram como alvos

terapêuticos (Toikkanen et al., 1992).




25

O tamanho do tumor e o estado de linfonodos são os fatores mais importantes, tanto

que constituem a base do estadiamento TNM estabelecido e promulgado pela União

Internacional Contra o Câncer (Carter et al., 1989; Abreu e Koifman, 2002). O tamanho do

tumor está diretamente relacionado ao risco de recidiva, sendo que, nos casos de pacientes

com ausência de comprometimento metastático dos linfonodos, o tamanho do tumor torna-se

o melhor preditor desta recidiva (Abreu e Koifman, 2002). Sabe-se que pacientes com

tumores menores de 1,0 cm têm entre 10% a 20% de possibilidade de comprometimento

linfonodal e que pacientes com tumores menores de 1,0 cm com linfonodos negativos têm

uma sobrevida livre de doença em 10 anos de cerca de 90% (Rosen et al., 1993; Leitner et al.,

1995; Buitrago et al., 2011). O estado dos linfonodos é importante no câncer de mama como

indicador de sobrevida livre da doença (Cady et al., 1997; Leitner et al., 1995; Buitrago et al.,

2011). Cerca de 20% a 30% dos pacientes com linfonodos negativos irá desenvolver recidiva

no prazo de 10 anos, em comparação com cerca de 70% dos pacientes com comprometimento

de linfonodos axilares (Fisher et al., 1993; Veronesi et al., 1993; Buitrago et al., 2011).

O estadiamento tumoral pode ser clínico e patológico. O primeiro é realizado com

base na extensão do tumor, que é estabelecida através de exame físico auxiliado por exames

radiológicos, macroscópicos e histológicos. O patológico deve ser efetuado pela avaliação

macro e microscópica do espécime clínico proveniente de ressecção cirúrgica, visando

analisar a extensão da invasão do tumor no tecido, possível acometimento de estruturas

adjacentes, presença de linfonodos comprometidos e a presença de metástase a distância,

sendo definido pela classificação “pTNM”. Por conseguinte, o estadiamento tumoral é

estabelecido com base no resultado do pTNM (tabela 03) (Edge, 2010) e é diretamente

relacionado ao prognóstico.




26

Tabela 03 – Estadiamento TNM para câncer de mama.

Estadiamento Combinações TNM

0 Tis N0 M0

IA T1 N0 M0

IB T0, T1 N1 mi M0

IIA T0, T1 N1 M0

T2 N0 M0

IIB T2 N1 M0

T3 N0 M0

IIIA T0, T1, T2 N2 M0

T3 N1, N2 M0

IIIB T4 N0, N1, N2 M0

IIIC Qualquer T N3 M0

IV Qualquer T Qualquer N M1

Retirado de Manual de padronização de laudos histopatológicos (Bacchi et. al., 2013).

A graduação histológica Scarff-Bloom-Richardson modificado por Elston-Ellis

conhecida como o Sistema de Classificação de Nottingham (SCN) (Elston e Ellis, 1991) é o

sistema de gradação recomendado por vários organismos profissionais a nível internacional

como a Organização Mundial de saúde (OMS), American Joint Committee on Cancer

(AJCC), da União Europeia (UE), e do Royal Colégio de Patologistas (RCPath UK) (Buitrago

et al., 2011). Diversos estudos demonstraram que pacientes com grau histológico 1 tem

melhor prognóstico. Foi descrito que pacientes com tumores de grau 1 e menores de 2 cm de

tamanho tinham um excelente prognóstico, com 99% de sobrevida em 5 anos, mesmo quando

apresentavam comprometimento de linfonodos (Henson et al., 1991). O grau histológico é

fator prognóstico de relevância, independente ou combinado com o estado dos linfonodos e

tamanho o tumor.




27

1.1.3 Etiologia do câncer de mama

A exemplo de outros tipos, a etiologia do câncer de mama é multifatorial e alguns

fatores de risco são descritos, como: idade, história familiar, história pessoal de câncer, entre

outros (Leon et al.; 2009). De acordo com o INCA, 2014, ainda acrescentam-se fatores

ligados a aspectos endócrinos e genéticos, relacionados à vida reprodutiva da mulher,

etilismo, exposição a radiações ionizantes em idade inferior a 40 anos, obesidade,

sedentarismo e alta densidade do tecido mamário.

Segundo o INCA (2014), a idade é um dos mais importantes fatores de risco. As taxas

de incidência aumentam rapidamente até os 50 anos e após essa idade, esse aumento ocorre

mais lentamente, reforçando a participação dos hormônios femininos na etiologia da doença

(80% dos casos ocorrem após os 50 anos). A história familiar de câncer de mama está

associada a um aumento no risco relativo de cerca de duas a três vezes para o

desenvolvimento da neoplasia. Alterações genéticas (em BRCA1 e BRCA2) aumentam o

risco de desenvolver a doença, embora essas mutações sejam raras e contribuam para uma

pequena parcela de casos de câncer de mama (90% dos casos ocorrem em mulheres sem

história familiar). Amamentação, prática de atividade física e alimentação saudável estão

associadas a um menor risco de desenvolver o câncer de mama (cerca de 30% dos casos

podem ser evitados por medidas deste tipo).

Entretanto, em 50 a 80% dos casos, não se identifica nenhum desses fatores de risco, o

que sugere a existência de outros fatores envolvidos (Leon et al.; 2009). Dentro deste

contexto, alguns estudos sugerem a associação de infecções virais no desenvolvimento do

câncer de mama. Para ser considerado um vírus oncogênico no tecido mamário, o vírus deve

estar presente em amostras de câncer de mama e em alguns tecidos normais e pré-cancerosos

(Leon et al.; 2009).

1.1.4 Os vírus e o câncer de mama

Dentre os vírus que têm sido encontrados em amostras de tecido mamário neoplásico,

encontram-se o Papilomavírus humano (HPV), bem como o Vírus Epstein-Barr (EBV) e o

Vírus do tumor mamário de rato (MMTV) (Heng et al.,2009). Alguns estudos apontam uma

associação do câncer de mama com o EBV e mais recentemente com o vírus HPV, entretanto




28

esta relação ainda não está bem esclarecida (Huo et al., 2012 e Leon et al.,2009). Os estudos

relativos à presença de EBV e HPV em amostras de câncer de mama apresentam resultados

controversos.

O EBV foi o primeiro vírus humano a ser diretamente implicado na carcinogênese.

Apesar de infectar mais de 90% da população do mundo, a maioria dos seres humanos

coexiste com o vírus sem sequelas graves e apenas uma pequena proporção irá desenvolver

tumores tais como Linfoma de Burkitt, câncer de nasofaringe, Linfoma de Hodgkin e

cânceres associados com imunodeficiência (Thompson et al., 2004; Lima et al., 2006).

Estudos de associação deste herpesvírus com o câncer de mama são inconsistentes, pois as

frequências encontradas para este vírus são divergentes (de 0% a 100% dos tumores) (Gristein

et al.,2002; Glaser et al.,2004; Thompson et al., 2004; Kalkan et al., 2005; Preciado et

al.,2005; Murray et al., 2006; De Paoli et al.,2007; Fawzy et al., 2008; He et al., 2009;

Lorenzetti et al., 2010; Hachana et al., 2011; Kadivar et al.,2011; Khan et al.,2011; Mazouni

et al., 2011; Baltzell et al.,2012; Huo et al., 2012).

Uma justificativa para as diferentes frequências observadas para o EBV nos tumores

mamários são as diferentes técnicas utilizadas para a detecção do vírus, como demonstrado na

tabela 04.

Tabela 04 – Técnicas de detecção do EBV em amostras de tumores mamários.

Frequência Local Técnica Autore(s)

0% Califórnia Hibridação Glaser et al., 1998

0% Itália Hibridação e Imunohistoquímica Dadmanesh et al., 2001

0% Estados Unidos Hibridação e Imunohistoquímica Deshpande et al., 2002

0% Tunísia Hibridação e Imunohistoquímica Trabelsi et al., 2008

0% Estados Unidos PCR Perrigoue et al., 2005

31% Argentina Hibridação Lorenzetti et al., 2010

31,8% PCR e Hibridação Fina et al., 2001

47,5% Emirados Hibridação e Imunohistoquímica Khan et al. 2011

51% França PCR e Imunohistoquímica Bonnet et al., 1999

68% Austrália PCR e Imunohistoquímica Glenn et al., 2012

100% Estados Unidos PCR Grinstein et al., 2002

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Huo%20Q%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22363698

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Thompson%20MP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14871955




29

Outra das explicações para as diferentes frequências encontradas seria que diferentes

populações podem ter diferentes susceptibilidades aos EBVs, predispondo o desenvolvimento

de tumores, como demonstrado por variações geográficas e imunológicas na prevalência

destes cânceres (Thompson et al.; 2004). Kadivar e colaboradores (2011) não detectaram o

vírus EBV em nenhum dos casos estudados em pacientes iranianas com CM. Em

contrapartida, Fawzy e colaboradores (2008) encontraram frequência de 25% para o EBV nas

amostras de tecido de tumor mamário em pacientes egípcias. Hachana e colaboradores (2011)

documentaram a prevalência de 27% do vírus em amostras de pacientes tunisianas, já

Lorenzetti e colaboradores (2010) e Preciado e colaboradores (2005) documentaram

frequências de 31% e 35% do EBV, respectivamente, em pacientes argentinas.

É possível que as variações de prevalência do EBV nas amostras de câncer de mama

sejam consequência de uma dificuldade de detecção dos vírus nesse tipo de tecido, diferente

da facilidade de detecção dos mesmos em outros tipos de cânceres (Heng et al.,2009).

1.2 Vírus Epstein-Barr (EBV)

1.2.1 Histórico

Apenas a partir do início do século XX, a participação dos vírus no desenvolvimento

de neoplasias começou a ser aceita, pois alguns pesquisadores começaram a sugerir a

possibilidade de agentes virais estarem envolvidos no surgimento de tumores. Gerou-se certa

polêmica, pois isto implicava na possibilidade de transmissão do agente causador da doença

(Epstein, 2001). Em um dos primeiros e mais significativos estudos, Ellermann e Bang (1908)

estudando leucemia de galinhas, perceberam que podiam induzir o desenvolvimento da

doença em animais sadios através da inoculação de um filtrado cell-free obtido de células

tumorais. Seus achados não foram vistos com muito interesse na época, mas nos anos

seguintes, diversos autores realizaram pesquisas sob a participação de vírus em neoplasias de

vários animais. Por volta da década de 1950, novos estudos confirmaram os achados prévios,

derrubando um dogma ao confirmar que os vírus exerciam papel no desenvolvimento de

neoplasias (Epstein, 2001).

Em meio a este contexto, Epstein et al. (1964) cultivaram linhagens de linfoma de

Burkitt in vitro, em seguida, utilizaram microscopia eletrônica, através da qual foi possível


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kadivar%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21207256

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Fawzy%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18258188

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hachana%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22024152

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lorenzetti%20MA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21042577

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Preciado%20MV%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15737034




30

observar a presença de partículas virais, semelhantes aos membros da família Herpesvirus,

sendo posteriormente chamado de Vírus Epstein-Barr (EBV) em homenagem aos seus

descobridores. Pouco tempo após a demonstração da associação do EBV com o linfoma de

Burkitt, vários laboratórios conduziram estudos com o referido vírus. Em 1967, no laboratório

de Werner e Brigitte Henle na Filadélfia – EUA, durante análises de soros de pacientes para

rastreamento de anticorpos contra o EBV, constatou que após o desenvolvimento de

mononucleose infecciosa (MI), seu soro antes usado como controle negativo, havia se tornado

positivo para anticorpos contra o EBV (Epstein, 2001). Com base nesse evento, Henle et al.

(1968) desenvolveram um estudo utilizando o banco de soros da Universidade de Yale e logo

verificaram que todos os pacientes com história de mononucleose infecciosa apresentavam

elevados títulos de anticorpos contra o vírus, sugerindo assim, uma relação causal entre o

EBV com a referida afecção. Essa relação foi confirmada pelo estudo de Evans et al. (1968).

Adicionalmente, todos os pacientes com linfoma de Burkitt estudados por Henle et al. (1968),

também apresentaram elevados títulos de anticorpos.

Em 1966, MacMahon já sugeria que a Doença de Hodgkin (DH) deveria ser causada

por algum agente infeccioso. Contudo, foram Levine e colaboradores (1971) que relataram as

primeiras evidências do envolvimento do EBV no desenvolvimento da DH ao constatar

elevados títulos de anticorpos contra antígenos do EBV em pacientes com esse tipo de

linfoma.

Em 1973, Reedman e Klein demonstraram em células infectadas pelo EBV, o antígeno

nuclear do EBV (EBNA), sendo esta, a primeira proteína do EBV associada com o

desenvolvimento de neoplasias. Logo, alguns estudos relataram a presença do EBNA em

desordens linfoproliferativas em pacientes imunossuprimidos. Durante a década de 1980, com

o surgimento de novas terapias imunossupressoras destinadas a pacientes transplantados e o

aumento dos casos da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS), os casos de doenças

linfoproliferativas associadas ao EBV também aumentaram (Okano, 2000).

Os avanços das técnicas imunológicas e moleculares de detecção viral têm

possibilitado compreender melhor o papel do EBV em diversas doenças associadas, assim

como verificar novas associações.

Atualmente, sabe-se que o EBV também é verificado em linfomas de células T,

linfomas/leucemias de células NK (do inglês, Natural killers), leucoplasia pilosa,

adenocarcinoma gástrico e adenocarcinoma oral.




31

1.2.2 Características do vírus Epstein-Barr

O Vírus Epstein-Barr é um membro da subfamília gama-Herpervírus (Kieff, 2001).

Mede aproximadamente 150 nm de diâmetro, apresenta um cerne constituído de DNA linear

de fita dupla com cerca de 172 Kpb, envolto por um capsídeo icosadeltaédrico formado por

162 capsômeros e revestido por um envoltório glicoprotéico (Hsieh et al., 1999). Existem dois

subtipos virais chamados: tipo 1 e tipo 2, que diferem um do outro em apenas poucos genes

(Kieff, 2001).

O Genoma do EBV foi delimitado em regiões estabelecidas com base na posição dos

fragmentos no mapa de restrição da endonuclease BamHI (Bacillus amyloliquefaciens H),

nomeados em ordem alfabética de acordo com o tamanho, sendo o fragmento BamHI A o

maior entre eles (Arrand et al., 1981). Foi verificado que o genoma viral apresenta regiões de

repetição cuja função não é bem esclarecida. Ambas as extremidades da forma linear do

genoma apresentam uma sequência de repetição de 500 pb cada, denominada repetição

terminal. O EBV apresenta também, quatro sequências de repetição interna (IR 1-4), de 3 Kpb

cada. Demonstrou-se que na região BamHI C do genoma viral está localizada uma sequência

denominada OriP (Origem da Replicação Plasmidial) (Kieff, 2001). Essa região contém dois

elementos chamados de FR (Family of Repeats), que inclui 20 repetições em 30 pb em

sequência; e DS (Dyad Symmetry), constituído de quatro repetições (Ambinder et al., 1991).

O EBV é amplamente distribuído no mundo, sendo estimado que mais de 90% da

população adulta esteja infectada e que a maioria destes indivíduos transmita o vírus

intermitentemente. A transmissão é mediada através da saliva, principalmente através de

beijos e perdigotos. Inicialmente, o EBV infecta células epiteliais da orofaringe, nasofaringe e

glândulas salivares, penetrando nestas células e sendo replicado. Posteriormente, os vírus

disseminam-se para tecidos linfóides subjacentes infectando linfócitos B, que representam o

principal reservatório viral (Thorley-Lawson, 2001). Nos linfócitos, a penetração é viabilizada

pela fusão do envoltório com a membrana celular (Dolcetti e Masucci, 2003). No citoplasma,

o capsídeo é desnudado e o genoma viral, antes linear, torna-se imediatamente circular, sendo

transportado para o núcleo, onde permanece sob a forma de DNA epissomal

extracromossômico (Kieff, 2001; Hsieh et al., 1999).




32

Figura 02 – Genoma do Vírus Epstein-Barr.

Fonte: Young e Murray, 2003.

No estado epissomal o vírus é descrito como latente, sendo replicado apenas durante a

mitose da célula hospedeira. Apesar de seu genoma poder codificar cerca de 100 genes, pode-

se verificar a expressão de até 12 genes durante a latência, dependendo do tipo celular ou

estado imunológico do hospedeiro. Os produtos desses genes latentes incluem seis proteínas

conhecidas como antígenos nucleares do EBV (Epstein-Barr Virus Nuclear Antigen), EBNA-

1, EBNA-2, EBNA-3A, -3B (EBNA4), -3C (EBNA6) e LP (Leader Protein, também

conhecida como EBNA5); três proteínas latentes de membrana (Latent Membrane Protein):

LMP-1, LMP-2A e LMP-2B; duas pequenas moléculas de RNA: EBER-1 e EBER-2

(Epstein-Barr Virus Encoded small RNA) e transcritos com múltiplos splices da região

BamHI A do genoma viral, BARF0 (BamHI A Right-ward Open Reading Frame) e BARF1

(Ambinder e Mann, 1994). Sabe-se que linfócitos B primários infectados pelo EBV in vitro

tornam-se imortalizados, assumindo um fenótipo denominado de linhagem celular

linfoblastóide com potencial proliferativo ilimitado (Le Roux et al., 1994).




33

Da observação de que os genes latentes virais não são expressos concomitantemente

nas diversas células de tecidos ou linhagens tumorais EBV positivas, foi proposta a existência

de quatro tipos de latência com padrões distintos de expressão, descritos na tabela 05.

Tabela 05: Expressão de genes latentes do EBV quanto aos tipos de latência e tecido

associado.

TIPO DE

LATÊNCIA TECIDO ASSOCIADO

GENES EXPRESSOS PELO EBV

EBNA-1 -2 -3A -3B -3C LP LMP1 LMP2A LMP2B EBERs BARF0 BARF1

I Linfoma de Burkitt + - - - - - - - - + + -

Carcinoma gástrico + - - - - - - +/- - + + +

II Carcinoma de

nasofaringe + - - - - - + + + + + +

DH; Linfoma de células

T + - - - - - + + + + + -

III DLPT; Linfoma-AIDS* + + + + + + + + + + + -

IV Linf. B circulantes** +/- - - - - - - + - +

Outros Hepatocarcinoma + - - - - - - - - - +

Câncer de mama + - +/-

Leiomiossarcoma*** + - +

CCEO - + + +

*Linfoma não-Hodgkin associado a AIDS

**Linfócitos B circulantes de indivíduos sadios portadores

***Leiomiossarcoma em indivíduos imunocomprometidos

DH, Doença de Hodgkin

DLPT, Doença linfoproliferativa pós-transplante

CCEO, Carcinoma de célula escamosa oral

(Lima, 2006)

Nas células epiteliais, durante a infecção primária, onde o EBV é replicado

intensamente (ciclo lítico), é possível observar a expressão de proteínas líticas virais (Callan,

2004). Enquanto que nos linfócitos B inicialmente infectados, o EBV desenvolve uma

infecção latente com padrão completo de expressão, característico da latência tipo III.

Algumas destas células são capazes de migrar a partir do local primário de infecção, podendo

ser detectadas no sangue periférico. No entanto, após o controle da infecção inicial, o número

de linfócitos B infectados reduz significativamente, da razão de cerca de 10.000 células para




34

uma célula infectada por 1.000.000 de linfócitos B circulantes (Ohga et al., 2002). Também é

possível verificar uma mudança no padrão de expressão de proteínas latentes, assumindo o

padrão de latência tipo IV, caracterizado por uma mínima expressão de genes latentes, o que

possivelmente contribui para o escape do sistema imune (Hsieh et al., 1999).

Durante o ciclo lítico, as primeiras proteínas a serem observadas, denominadas

proteínas precoces imediatas, são codificadas pelos genes BZLF1 (ZEBRA) e BRLF1

(Gulley, 2001). A proteína codificada pelo BZLF1 pode regular negativamente o promotor Cp

e, consequentemente, a expressão de EBNAs, favorecendo a transição do estado latente para o

lítico. Os produtos dos dois referidos genes regulam a expressão dos genes precoces BHLF1 e

BSMLF1, que estão associados à transativação de outros genes precoces. A maioria dos

outros genes precoces está relacionada com a replicação do DNA, incluindo a DNA

polimerase viral (BALF5), uma proteína de ligação ao DNA (BALF2), timidina quinase

(BXLF1), uma exonuclease alcalina (BGLF5) e ribonucleotídeo redutase (BORF2 e BaRF1)

(Ambinder e Mann, 1994; Kieff, 2001). Posteriormente, verifica-se a expressão de genes

tardios, que consistem principalmente de proteínas estruturais do vírus ou proteínas

envolvidas na penetração celular e formação do envelope (Kieff, 2001).

O EBV usa suas proteínas virais, ações que imitam diversos fatores de crescimento,

fatores de transcrição e fatores antiapoptóticos para usurpar o controle das vias celulares que

regulam diversas funções celulares homeostáticas (Thompson et al., 2004).

Atualmente, de acordo com a International Agency from Research on Cancer, o EBV

é classificado como um agente carcinógeno do grupo I (IARC, 1997). Contudo, os

mecanismos oncogênicos empregados pelo EBV ainda não estão totalmente elucidados. Tem

sido sugerido que os efeitos tumorigênicos estejam relacionados com a expressão de seus

genes latentes que, por sua vez, podem atuar sobre mecanismos de proliferação e morte

celular.

1.2.3 Técnicas de detecção do EBV

As técnicas utilizadas para demonstrar o EBV em espécimes tumorais e que

permitiram analisar a participação do vírus no desenvolvimento das várias neoplasias

associadas incluem: amplificação de sequências conservadas do genoma viral através da

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), RT-PCR (Transcriptase reversa – PCR), hibridação





35

in situ (HIS), utilizando sondas complementares tanto à sequencia do genoma viral, quanto a

segmentos de RNAm viral, imunohistoquímica, imunofluorescência, Western blotting e

Southern blot (Tsuchiya, 2002; Ambinder e Mann, 1994; Sugawara et al., 1999).

É importante ressaltar que a hibridação in situ utilizando sondas específicas para os

EBERs é considerada “padrão ouro” na detecção do vírus, pois o alvo da técnica é expresso

em elevada quantidade e em diversos tecidos. Além disso, permite ao investigador identificar

quais células abrigam o EBV no contexto histopatológico ou citopatológico. O que não é

possível utilizando outras técnicas tais como PCR ou RT-PCR, que segundo Gulley (2001),

podem amplificar sequências nucleotídicas oriundas de outras células, tais como linfócitos

infectados infiltrados no tecido.

1.2.4 EBV em tumores sólidos

Os relatos da presença do vírus em neoplasias sólidas tem se tornado cada vez mais

frequentes. O carcinoma de nasofaringe foi a primeira neoplasia de origem epitelial a ser

associada ao EBV (Wolf et al., 1973) e, desde então, tem sido vastamente estudado no

mundo. O vírus também tem sido descrito em carcinoma linfoepitelial pulmonar,

leiomiossarcomas em pacientes imunossuprimidos, câncer testicular, câncer prostático,

carcinomas de glândula salivar, de glândula lacrimal, intracervical, gástrico, hepatocelular e

de mama, embora este último permaneça controverso (Thompson et al., 2004; Lima e

Rabenhorst, 2006).

Além da elevada frequência de associação, o caráter monoclonal do genoma viral e a

presença do vírus em quase todas as células tumorais são três indícios importantes

concernentes à sua relação causal do referido vírus.





36

1.3 Justificativa do estudo

Relatórios de serviço mostram que a grande maioria das pacientes do ambulatório de

Mastologia da Maternidade Escola Assis Chateaubriand (Fortaleza, Ceará) possui câncer de

mama avançado. Observa-se também a presença da doença em um número significante de

mulheres jovens.

Dados sobre a prevalência do EBV e sobre o perfil molecular das mulheres com

câncer de mama invasivo, levando em consideração os fatores prognósticos estabelecidos,

idade, outros marcadores moleculares, sobrevida e resposta terapêutica são de grande valia

para a caracterização das pacientes com câncer de mama do estado do Ceará. Esta

contribuição é importante para uma melhor compreensão da doença no meio cearense e soma

dados aos estudos nacionais e mundiais sobre a frequência do EBV e sobre os subtipos

moleculares desta neoplasia.

A importância dessa classificação molecular dos tumores mamários deve-se ao seu

potencial na identificação de um prognóstico mais preciso e no estabelecimento de

intervenções terapêuticas adequadas. Outro aspecto relevante é o fato de que quatro dos

marcadores propostos (RE, RP, HER2 e Ki67) já são requeridos para a rotina diagnóstica

financiada pelo SUS para a indicação de terapia específica. Desta forma, acredita-se que a

adição de marcadores complementares de alto valor prognóstico não terá grandes dificuldades

de implantação.

1.4 Hipótese

O EBV pode estar ligado à etiologia do câncer de mama.




37

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Verificar a presença do Vírus Epstein-Barr (EBV) em cânceres de mama de pacientes do

serviço de Mastologia da Maternidade Escola Assis Chateaubriand no estado do Ceará, no

período de 2009 a 2010, através da técnica de Hibridação in situ correlacionando com a

presença das proteínas celulares RE, RP, HER2, Ki67, TP53, CK5/6 e CK8/18.

2.2 Objetivos específicos

Detectar a presença do vírus EBV em pacientes com câncer de mama utilizando a técnica

de Hibridação in situ;

Caracterizar os padrões histopatológicos dos tumores;

Verificar a expressão das proteínas celulares RE, RP, HER2, Ki67, TP53, CK5/6 e

CK8/18 demonstradas através da técnica de imunohistoquímica, correlacionando com os

dados clínicos e histológicos;

Correlacionar a presença do vírus EBV com a expressão das proteínas RE, RP, HER2,

Ki67, TP53, CK5/6 e CK8/18.




38

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Casuística

Foram obtidos tumores mamários provenientes de 75 pacientes submetidas à

mastectomia radical, quadrantectomia, biópsia ou excérese de nódulos mamários provenientes

do Ambulatório de Mastologia da Maternidade Escola Assis Chateaubriand (MEAC)

localizada em Fortaleza, Ceará registrados no arquivo do Laboratório de Patologia do

Departamento de Patologia da Universidade Federal do Ceará (UFC).

De todos os casos, foram obtidos espécimes clínicos previamente fixados em

formalina e subsequentemente incluídos em blocos de parafina oriundos do serviço de

Patologia da UFC.

Foram admitidos como critérios de inclusão: (1) diagnóstico de carcinoma mamário

invasivo, (2) existência de mais de um bloco contendo amostra tumoral, (3) representatividade

de células tumorais no bloco de escolha, (4) bom estado de conservação do material (5)

disponibilidade de prontuários contendo informações relevantes ao estudo. O Ambulatório de

Mastologia da MEAC atende a cerca de 150 pacientes com câncer de mama anualmente, mas

durante a coleta das amostras para este estudo, nos deparamos com certos desafios como a

dificuldade de acesso à informação nos prontuários e aos blocos de parafina.

Foram realizados cortes histológicos de 4 µm de espessura, corados com

Hematoxilina-Eosina (HE), estes foram reavaliados pela patologista da equipe para

confirmação dos laudos e da graduação histológica e para a verificação da presença do tumor,

bem como o seu estado de conservação. Somente após este processo, os espécimes foram

submetidos às técnicas de Hibridação in situ e Imunohistoquímica.

3.2 Aspectos éticos

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em pesquisa da MEAC sob o

parecer nº 409.985 em 30 de setembro de 2013 (Apêndice A), respeitando as recomendações

das Resoluções 196/96 e 251/97 do Conselho Nacional de Saúde do Ministério da Saúde, que

regulamentam as pesquisas envolvendo seres humanos.




39

3.3 Instrumentos e procedimentos para a coleta de dados

Os dados sócio-epidemiológicos e clínicos foram registrados em fichas contendo as

informações obtidas através de consulta de prontuários (Apêndice B). Os dados

histopatológicos, tais como subtipo tumoral, grau de diferenciação, extensão da lesão e

acometimento de linfonodos foram extraídos dos laudos patológicos presentes nos respectivos

prontuários. Dados relacionados à presença de metástases à distância não puderam ser

avaliados em nenhum dos casos.

3.4 Hibridação in situ

O método utilizado neste estudo foi adaptado do descrito por Bacchi et al. (1996). A

sonda utilizada, descrita por Shibata et al. (1991), apresenta uma sequência oligonucleotídica

de 30 pb biotinilada na extremidade 3’ (5’–

AGACACCGTCCTCACCACCCGGGACTTGTA–3’) complementar ao RNA viral EBER1.

Sucintamente, o método consiste nos seguintes passos:

1. Cortes histológicos de 4 µm foram fixados em lâminas de vidro limpas e tratadas

com silano a 4%;

2. Passagem das lâminas em estufa pré-aquecida a 60º C durante 180 minutos;

3. Desparafinização e hidratação em gradiente xileno-álcool-água;

4. Bloqueio da peroxidase endógena em peróxido de hidrogênio a 3% por 20

minutos;

5. Digestão enzimática com Proteinase K (concentração final de 0,02 µg/µL) por 9

minutos;

6. Lavagem em água com DEPC 0,1%;

7. Desidratação em gradiente de água-álcool;

8. Incubação com solução de pré-hibridação (Solução de Denhardt [3,5X]; SSC

[4,5X]; EDTA [0,0075 M]; SDS [0,35%]; DNA desnaturado de esperma de

salmão; [75 µg/mL]; NaH2PO4 [0,75 M]; Sulfato de Dextrano [10%]) por 60

minutos em estufa a 37ºC;




40

9. Incubação com solução de hibridação (Solução de Denhardt [2X]; Formamida

[50%]; Sulfato de Dextrano [2%]; NaH2PO4 [0,002 M]); sonda na concentração

0,3 ng/µL) por 16 horas em estufa a 37ºC;

10. Incubação com Streptoavidina primária (GenPoint - DakoCytomation®) (diluição

1:400) por 15 minutos a 37ºC;

11. Biotinil-Tiramida (GenPoint - DakoCytomation®) por 15 minutos a 37ºC e

12. Strepto-Peroxidase – secundária (GenPoint - DakoCytomation®) por 15 minutos a

37º C;

13. Revelação com o cromógeno DAB líquido (3,3’-diaminobenzide)

(DakoCytomation®) preparado conforme as recomendações do fabricante;

14. Contra-coloração com Hematoxilina de Carazzi;

15. Desidratação em gradiente de água-álcool-xileno;

16. Montagem das lâminas com lamínulas e Bálsamo de Canadá.

Em cada bateria de reação, foi adicionado como controle positivo, um caso de

adenocarcinoma gástrico sabidamente positivo pelo EBV.

3.5 Imunohistoquímica

Realizou-se o método imunohistoquímico da estreptoavidina-biotina-peroxidase

adaptado de Hsu et al. (1981) para a detecção das proteínas celulares RE, RP, HER2, Ki67,

TP53, CK5/6 e CK8/18 conforme descrito a seguir:

1. Cortes histológicos de 4 µm foram fixados em lâminas de vidro limpas e tratadas

com silano a 4%;

2. Passagem das lâminas em estufa pré-aquecida a 60ºC durante 180 minutos;

3. Desparafinização e hidratação em gradiente xileno-álcool-água;

4. Recuperação antigênica em panela pressurizada (Pascal - DakoCytomation®)

utilizando tampão Citrato 10 mM pH=6,0 (120º C, 18 psi) por 3 minutos e 40

segundos;

5. Bloqueio da peroxidase endógena em peróxido de hidrogênio a 3% por 10

minutos;

6. Incubação das lâminas com anticorpo primário (RE – Spring Bioscience®,

diluição 1:50; RP - Spring Bioscience®, diluição 1:50; HER2 - Spring




41

Bioscience®, diluição 1:80; Ki67 - Spring Bioscience®, diluição 1:80; TP53 -

Spring Bioscience®, diluição 1:50; CK5/6 Biocare medical®, diluição 1:70 e

CK8/18 Biocare medical®, diluição 1:150) em geladeira (4 a 8ºC) por 16 horas;

7. Detecção pelo sistema LSAB/HRP seguindo as recomendações do fabricante

(tabela 06);

8. Revelação com o cromógeno DAB líquido (3,3’-diaminobenzide)

(DakoCytomation®) preparado conforme as recomendações do fabricante;

9. Contra-coloração com Hematoxilina de Carazzi;

10. Desidratação em gradiente de água-álcool-xileno;

11. Montagem das lâminas com lamínulas e Bálsamo de Canadá.

Em cada bateria de imunohistoquímica foi incluído um espécime clínico sabidamente

positivo para cada proteína como controle positivo das reações.

3.6 Critérios para Análise das lâminas

Admitiu-se como marcação, a presença de uma coloração marrom característica,

adquirida pelo cromógeno após oxidação, situadas nas regiões celulares previstas para cada

alvo avaliado (tabela 06) em contraste com o azul/violeta conferido pela hematoxilina

constatada por microscopia óptica.

Tabela 06: Regiões celulares de expressão dos alvos das técnicas empregadas e os

respectivos clones dos anticorpos e kits de detecção.

Técnica Alvo Região celular de

expressão

Clone Kit de detecção

Hibridação in situ EBER1 Nuclear - GenPoint

Imunohistoquímica RE Nuclear SP1 Match 4

RP Nuclear SP42 Match 4

HER2 Membranar SP3 Match 4

Ki67 Nuclear SP6 DBS

TP53 Nuclear SP5 DBS

Continua




42

Continuação

Técnica Alvo Região celular de

expressão

Clone Kit de detecção

Imunohistoquímica CK5/6 Citoplasmática CK5/6.007 Match 4

CK8/18 Citoplasmática 5D3 Easy path

GenPoint - DakoCytomation®; Match 4 - Universal HRP-polymer detection (Biocare

Medical®); DBS - Universal HRP immunostaining kit (Diagnostic BioSystems®); Easy Path

– Sistema de detecção ultra estreptavidina (Erviegas®).

No caso da Hibridação in situ, considerou-se positivo qualquer marcação nuclear em

células tumorais, independente do percentual de células marcadas.

Quanto à imunohistoquímica, o índice de marcação LI (do inglês, Labelling índex) foi

estimado através da contagem manual utilizando microscopia óptica (Landberg e Ross, 1993).

Foram selecionados campos aleatórios com representativa quantidade de células tumorais.

Um mínimo de 300 células foi contado e o índice de marcação foi calculado com base na

seguinte fórmula:

LI = (Total de células marcadas) / (Total de células contadas) X 100

Os critérios de positividade definidos para as diferentes proteínas detectadas foram

estabelecidos de acordo com a tabela 07.

Tabela 07: Critérios de positividade definidos para as proteínas detectadas por

imunohistoquímica.

Proteína Negativo Positivo

RE Nenhuma coloração ou menos de 1% dos

núcleos das células neoplásicas corados.

Coloração nuclear em 1% ou mais dos

núcleos das células neoplásicas.

RP Nenhuma coloração ou menos de 1% dos




Continua




43

Continuação

Proteína Negativo Positivo

HER2 Escore 0 ausência de reatividade ou

reatividade em ≤ 10% das células

tumorais.

Escore + Reatividade fraca em > 10%

das células tumorais, mas a coloração é

incompleta, só parte da membrana é

positiva.

Escore ++ Reatividade fraca ou

moderada, mas completa em > 10% das

células tumorais ou há coloração intensa,

circunferencial ≤ 30% das células

tumorais.

Escore +++ Mais de 30% das células

tumorais mostram coloração intensa,

circunferencial, homogênea.

Ki67 Nenhuma coloração ou menos de 1% dos




TP53 Nenhuma coloração nuclear ou menos de

30% das células neoplásicas coradas.

Marcação nuclear em ≥ 30% das células

neoplásicas.

CK5/6 Nenhuma coloração membranosa ou

citoplasmática ou menos de 25% das

células neoplásicas coradas.

Marcação membranosa ou citoplasmática

em mais de 25% das células neoplásicas.

CK8/18 Nenhuma coloração membranosa ou

citoplasmática ou menos de 25% das

células neoplásicas coradas.

Marcação membranosa ou citoplasmática

em mais de 25% das células neoplásicas.

(Subhawong et. al., 2009; Bacchi et. al., 2013)

3.7 Análise estatística

Os dados sócio-epidemiológicos e clínicos, assim como os resultados das técnicas de

hibridação in situ e imunohistoquímica foram demonstrados através de gráficos e tabelas com

o auxílio do programa Microsoft Excel® 2007. A correlação das variáveis observadas foi

realizada através do programa estatístico EPINFO® versão 6.04d e SPSS® 17.0, utilizando-se

o Teste do Qui-quadrado (x2), Teste Exato de Fisher, Correlação Linear de Spearman e de

Pearson. Foram considerados estatisticamente significantes, os valores de p ≤ 0,05.




44

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Abreu E, Koifman S. Fatores prognósticos no câncer da mama feminina. Revista brasileira de

cancerologia. v. 48, p. 113 – 131, 2002.

Ambinder RF, Mann RB. Detection and characterization of Epstein-Barr virus in clinical

specimens. Am. J. Pathol., v. 145, n. 2, p. 239-252, 1994.

Ambinder RF et al. Functional Domains of Epstein-Barr Virus Nuclear Antigen EBNA-1.

Journal of Virology, v. 65, n. 3, p. 1466-1478, 1991.

Andreopoulou E, Hortobagyi GN. Prognostic Factors in Metastatic Breast Câncer: Successes

and Challenges Toward Individualized Therapy. J Clin. Oncol., v. 26, p. 3660–3662, 2008.

Arrand JR et al. Molecular cloning of the complete Epstein-Barr virus genome as a set of

overlapping restriction endonuclease fragments. Nucleic Acids Research, v. 9, n. 13, 1981.

Bacchi CE et al. AIDS-related lymphoma in Brazil. Histopatology, immunophenotype and

associated with Epstein-Barr Virus. Am. J. Clin. Pathol., v. 105, p. 230-237,1996.

Bacchi CE, Melo CRA, Franco MF, Neto RA. Manual de padronização de laudos

histopatológicos. Sociedade Brasileira de Patologia, 4 ed. São Paulo: Manole, 2013.

Baltzell K, Buehring GC, Krishnamurthy S, Kuerer H, Shen HM, Sison JD. Epstein-Barr

virus is seldom found in mammary epithelium of breast cancer tissue using in situ molecular

methods. Breast Cancer Res Treat., v. 132, n. 1, p. 267-74, 2012.

Benz CC, Scott GJ, Sarup JC et al: Estrogen- dependent tamoxifen-resistant Tumorigenic

growth of MCF-7 cells transfected with HER-2/neu. Breast Câncer Res Treat., v. 24, p. 85-95,

1992.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Baltzell%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22042367

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Buehring%20GC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22042367

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Krishnamurthy%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22042367

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kuerer%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22042367

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Shen%20HM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22042367

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sison%20JD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22042367

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22042367




45

Bonnet M, Guinebretiere J-M, Kremmer E, Grunewald V, Benhamou E et al. Detection of

Epstein-Barr virus in invasive breast cancer. J Natl Cancer Inst., v. 91, p. 1376 – 1381, 1999.

Buitrago F, Uemura G, Sena MCF. Fatores prognósticos em câncer de mama Com. Ciências

Saúde, v. 22, p.69-82, 2011.

Cady B. Use of primary breast carcinoma characteristics to predict lymph node metastases.

Câncer, v. 79, p. 1856–1861. 1997.

Callan MFC. The immune response to Epstein-Barr virus. Microbes and Infection, v. 6, p.

937-945, 2004.

Carey LA, Perou CM, Livasy CA, Dressler LG, Cowan D, Conway K, Karaca G, Troester

MA, Tse CK, Edmiston S, Deming SL, Geradts J, Cheang MC, Nielsen TO, Moorman PG,

Earp HS, Millikan RC. Race, breast cancer subtypes, and survival in the Carolina Breast

Cancer Study. JAMA, v. 295, p. 2492-2502, 2006.

Carey LA. Through a glass darkly: advances in understanding breast cancer biology. 2000-

2010. Clin Breast Cancer, v. 10, p. 188-195, 2010.

Carter CL, Allen C, Henson DE. Relation of tumor size, lymph node status and survival in

24740 breast cancer cases. Cancer, v. 63, p. 181-187, 1989.

Cheang MC, Voduc D, Bajdik C, Leung S, McKinney S, Chia SK, Perou CM, Nielsen TO.

Basal-like breast cancer defined by five biomarkers has superior prognostic value than triple-

negative phenotype. Clin Cancer Res., v. 14, p. 1368-1376, 2008.

Cheang MC, Chia SK, Voduc D, Gao D, Leung S, Snider J, Watson M, Davies S, Bernard PS,

Parker JS, Perou CM, Ellis MJ, Nielsen TO. Ki67 index, HER2 status, and prognosis of

patients with luminal B breast cancer. J Natl Cancer Inst., v. 101, p. 736-750, 2009.




46

Clark GM. Prognostic and predictive factors. In: Harris JR, Lippman ME, Morrow M,

Hellman S, editors. Diseases of breast, 5th ed., Philadelphia: Lippincott-Raven, p. 461-70,

1996.

Creighton CJ. The molecular profile of luminal B breast cancer. Biologics, v. 6, p. 289-297,

2012.

Dadmanesh F, Peterse JL, Sapino A, Fonelli A, Eusebi V. Lymphoepithelioma-like carcinoma

of the breast: lack of evidence of Epstein-Barr virus infection. Histopathol., n. 38, p. 54-61,

2001.

De Paoli P, Pratesi C, Bortolin MT. The Epstein Barr Virus DNA Levels As A Tumor Marker

In EBV-Associated Cancers. J Cancer Res Clin Oncol., v. 133, p. 11, p. 809-15, 2007.

Deshpande CG, Badve S, Kidwai N, Longnecker R. Lack of expression of the Epstein-Barr

Virus (EBV) gene products, EBERs, EBNA1, LMP1, and LMP2A, in breast cancer cells. Lab

Invest., v. 82, p.1193-1199, 2002.

Di Fiore PP, Pierce JH, Fleming TP, Hazan R, Ullrich A. King CR, Schlessinger J, Aaronson

SA. Overexpression of the human EGF receptor confers an EGF-dependent transformed

phenotype to NIH 3T3 cells. Cell, v. 51, p. 1063-1070, 1987.

Diab SG, Clark GM, Osborne CK, Libby A, Allred DC, Elledge M. Tumor characteristics

and clinical outcome of tubular and mucinous breast carcinomas. J Clin Oncol., v. 17, p. 1442

- 1448, 1999.

Dolcetti R, Masucci MG. Epstein-Barr vírus: Induction and controlo of cell transformation.

Journal of Cellular Physiology, v. 196, p. 207-218, 2003.

Edge SB, Burd DR, Compton CC et al. AJCC câncer staging handbook. 7 ed. New York:

Springer, 2010.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11135047?ordinalpos=3&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPanel.Pubmed_RVDocSum


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=De%20Paoli%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17653573

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Pratesi%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17653573

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bortolin%20MT%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17653573







47

Ellerman V, Bang O. Experimentelle leukÌmie beihÏhnern. Zentralbl. Bakt. Abt. I (Orig.), v.

46, p. 595-609, 1908.

Ellis I et al. Tavassoli F.A., Devilee P. (Eds.): World Health Organization Classification of

Tumours. Pathology and Genetics of Tumours of the Breast and Female Genital Organs.

IARC Press: Lyon, 2003.

Elston CW, Ellis IO. Pathological prognostic factors in breast câncer I. The value of

histological grade in breast câncer: experience from a large study with long-term follow-up.

Histopathology, v. 19, p. 403-410, 1991.

Rakha EA, El-Sayed ME, Green AR, Lee AHS, Robertson JF, Ellis IO. Prognostic Markers in

Triple-Negative Breast Cancer. Cancer, v. 109, n. 1, 2007.

Epstein MA, Achong BG, Barr YM. Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt’s

lymphoma. Lancet, p. 702-703, 1964.

Epstein MA. Historical background. Phil. Trans. R. Soc. Lond B., v. 356, p. 413-420, 2001.

Evans AS, Niderman JC, Mccollum RW. Seroepidemiologic studies of infectious

mononucleosis with EB vírus. New England Journal of Medicine, v. 279, p. 1121-1127, 1968.

Fawzy S, Sallam M, Awad NM. Detection of Epstein-Barr Virus In Breast Carcinoma In

Egyptian Women. Clin Biochem., v. 41, n. 7-8, p. 486 – 492, 2008.

Fernandez MJ, Farina GJ, Arangoncillo BP. Immunohistochemical expression of p-53 and c-

ERβ-2 in breast carcinoma: relation with epide- miologic factors, histologic featuresand

prognosis. Gen & Diagnostic Pathol., v. 142, p. 289-96,1997.

Ferrero-Pous M, Hacene K, Bouchet C et al. Relationship between c-ERβB-2 and other tumor

characteristics in breast câncer prognosis. Clin. Câncer Res., v. 6, p. 4745–4754, 2000.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Fawzy%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18258188

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sallam%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18258188

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Awad%20NM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18258188





48

Fina F, Romain S, Ouafik L, Palmari J, Ben Ayed F et al. Frequency and genome load of

Epstein-Barr virus in 509 breast cancers from different geographical areas. Br J Cancer., v.

84, p. 783 – 790, 2001.

Fisher ER, Anderson S, Redmond C, Fisher B. Pathologic findings from the National Surgical

Adjuvant Breast Project Protocol B-06: 10-year pathologic and clinical prognostic

discriminants. Câncer, v. 71, p.. 2507–2514, 1993.

Geyer FC, Rodrigues DN, Weigelt B, Reis-Filho JS. Molecular classification of estrogen

receptor-positive/luminal breast cancers. Adv Anat Pathol., v. 19, p. 39-53, 2012.

Geyer FC, de Nigro MV. Tipos histológicos especiais de câncer de mama. Onco&, 2013.

Glaser SL, Ambinder RF, DiGiuseppe JA, Horn-Ross PL, Hsu JL. Absence of Epstein-Barr

virus EBER-1 transcripts in an epidemiologically diverse group of breast cancers. Int J

Cancer, v. 75, p. 555-558, 1998.

Glaser SL, Hsu JL, Gulley ML. Epstein-Barr virus and breast cancer: state of the evidence for

viral carcinogenesis. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev., v. 13, n. 5, p. 688 – 697, 2004.

Glenn WK, Heng B, Delprado W, Lacopetta B, Whitaker NJ, Lawson JS, Epstein-Barr virus,

human papillomavirus and mouse mammary tumour virus as multiple viruses in breast cancer.

PloS One, v. 7, n. 11, 2012.

Grinstein S, Preciado MV, Gattuso P, Chabay PA, Warren WH et al. Demonstration of

Epstein-Barr virus in carcinomas of various sites. Cancer Res., v. 62, p. 4876-4878, 2002.

Goldhirsch A, Winer EP, Coates AS, Gelber RD, Piccart- Gebhart M, Thürlimann B, Senn

HJ. Personalizing the treat- ment of women with early breast cancer: highlights of the St

Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2013.

Ann Oncol., v. 24, p. 2206-2223, 2013.





http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Glaser%20SL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15159298

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hsu%20JL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15159298

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gulley%20ML%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15159298





49

Guarneri V, Conte P. Metastatic breast cancer: therapeutic options according to molecular

subtypes and prior adjuvant therapy. Oncologist, v. 14, p. 645-656, 2009

Gulley ML. Molecular diagnosis of Epstein-Barr vírus-related diseases. J. Mol. Diagn., v. 3,

n. 1, p. 1-10, 2001.

Gutierrez C, Schiff R. HER2: biology, detection, and clinical implications. Arch Pathol Lab

Med., v. 135, p. 55-62, 2011.

Hachana M, Amara K, Ziadi S, Romdhane E, Gacem RB, Trimeche M. Investigation of

Epstein-Barr virus in breast carcinomas in Tunisia. Pathol Res Pract., v. 207, n. 11, p. 695 –

700, 2011.

He JR, Song EW, Ren ZF. Research advancement on relationship between Epstein-Barr virus

and breast cancer. Chinese Journal of Cancer, v. 28, n. 8, 2009.

Heng B, Glenn WK, Ye Y, Tran B, Delprado W, Lutze-Mann L, Whitaker NJ, Lawson JS.

Human papilloma virus is associated with breast cancer. British Journal of Cancer, v. 101, p.

1345 – 1350, 2009.

Henle G, Henle W, Diehl V. Relation of Burkitt’s tumor-associated herpes-type virus to

infectious mononucleosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, v.

59, p. 94-101, 1968.

Henson DE, Ries L, Freedman LS, Carriaga M. Relationship among outcome, stage of

disease, and histologic grade for 22,616 cases of breast cancer. The basis for a prognostic

index. Câncer, v. 68, p. 2142-2149, 1991.

Hoadley KA, Weigman VJ, Fan C, Sawyer LR, He X, Troester MA, Sartor CI, Rieger-House

T, Bernard PS, Carey LA, Perou CM. EGFR associated expression profiles vary with breast

tumor subtype. BMC Genomics, v. 31, p. 8-258, 2007.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hachana%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22024152

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Amara%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22024152

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ziadi%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22024152

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Romdhane%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22024152

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gacem%20RB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22024152

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Trimeche%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22024152





50

Hollstein M et al. P53 mutations in human cancers. Science, v. 253, n. 49, 1991.

Hsieh WS, Ambinder RF, Lemas MV. The biology of Epstein-Barr virus in post-transplant

lymphoproliferative disease. Transplant Infectious Disease, v. 1, p. 204-212, 1999.

Hsu SM, Raine L, Fagner H. Use of avidin-biotin peroxidade complex (ABC) in

immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabled antibody (PAP)

procedures. J. Histochem. Cytochem., v. 29, p. 577-580, 1981.

Huo Q, Zhang N, Yang Q. Epstein-Barr virus infection and sporadic breast cancer risk: A

meta analysis. Plos one, v. 7, n. 2, 2012.

IARC – International Agency of Research on Cancer. Epstein-Barr vírus and Kaposi’s

sarcoma hervesvirus/human herpesvirus 8. IARC monographs on the evaluation of

carcinogenic risks to humans, v. 70, Lyon, 1997.

Ignatiadis M, Bedard P, HaibeKains B, Singhal S, Loi S, Criscitiello C, Desmedt C, Bontempi

G, Piccart M, Piccart M, Sotiriou C. A meta analysis of gene expression profiling studies

identifies clinically relevant oncogenic pathways in basal like breast cancer. Cancer Res., v.

69, p. 106, 2009.

INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA (Brasil).

Estimativa 2014 - Incidência do Câncer no Brasil. Disponível em:

http://www.inca.gov.br/estimativa/2014/. Acesso em 01 de outubro de 2014.

Jemal A, Siegel R, Ward E, Hao Y, Thun, MJ. Câncer statistics, Cancer J Clin., v. 59, p. 225–

49, 2009.

Kadivar M, Monabati A, Joulaee A, Hosseini N. Epstein-Barr Virus And Breast Cancer: Lack

Of Evidence For An Association In Iranian Women. Pathol Oncol Res., v. 17, n. 3, p. 489 –

492, 2011.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hubbard%20RA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12873165


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kadivar%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21207256

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Monabati%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21207256

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Joulaee%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21207256

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hosseini%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21207256





51

Kalkan A, Ozdarendeli A, Bulut Y, Yekeler H, Cobanoglu B, Doymaz M. Investigation Of

Epstein-Barr Virus Dna In Formalin-Fixed And Paraffin- Embedded breast Cancer Tissues.

Med Princ Pract., v. 14, n. 4, p. 268-71, 2005.

Kennecke H, Yerushalmi R, Woods R, Cheang MC, Voduc D, Speers CH, Nielsen TO,

Gelmon K. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. J Clin Oncol., v. 28, p. 3271-3277,

2010.

Khan G, Philip PS, Al Ashari M, Houcinat Y, Daoud S Localization of Epstein-Barr virus to

infiltrating lymphocytes in breast carcinomas and not malignant cells. Exp Mol Pathol., v. 91,

n. 1, p. 466-70, 2011.

Kieff E, Rickinson AB. Epstein-Barr virus and its replication. In: Fields BN et al. Virology. 4ª

ed. Philadelphia: Lippincott William & Wilkins, 2001. 3280p.

Konecny G, Pauletti G, Pegram M, Untch M, Dandekar S, Aguilar Z, Wilson C, Rong HM,

Bauerfeind I, Felber M, Wang H-J, Beryt M, Seshadri R, Slamon DJ. Quantitative association

between HER-2/neu and steroid hormone receptors in hormone receptor positive primary

breast câncer.J Natl Câncer inst., v. 95, p. 142-153, 2003.

Kreike B, Van Kouwenhove M, Horlings H, Weigelt B, Peterse H, Bartelink H, Van de

Vijver MJ. Gene expression profiling and histopathological characterization of triple-

negative/basal-like breast carcinomas. Breast Cancer Res., v. 9, p. R65, 2007.

Landberg G, Ross G. Proliferating cell nuclear antigen and Ki67 antigen expression in human

haematopoietic cells during growth stimulation and differenciation. Cell Prolif., v. 26, p. 427-

437, 1993.

Le Roux A, Kerdiles B, Walls D, Dedieu JF, Perricaudet M. The Epstein-Barr virus

determined nuclear antigens EBNA-3A, -3B, and -3C repress EBNA-2-mediated

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kalkan%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15961939

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ozdarendeli%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15961939

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bulut%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15961939

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Yekeler%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15961939

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Cobanoglu%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15961939

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Doymaz%20MZ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15961939


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Khan%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21600202

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Philip%20PS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21600202

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Al%20Ashari%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21600202

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Houcinat%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21600202

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Daoud%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21600202


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Le%20Roux%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7975264

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kerdiles%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7975264

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Walls%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7975264

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Dedieu%20JF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7975264

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Perricaudet%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7975264




52

transactivation of the viral terminal protein 1 gene promoter. Virology, v. 205 (2), p. 596-

602, 1994.

Leitner SP, Swern AS, Weinberger D et al. Predictors of recurrence for patients with small

(one centimeter or less) localized breast câncer (T1a,b N0 M0). Cancer, v. 76, p. 2266–2274,

1995.

Leon DC, De Montiel DP, Nemcova J, Mykyskova I, Turcios E, Villavicencio V, Cetina L,

Coronel A, Hes O. Human Papillomavirus (HPV) in breast tumors: prevalence in a group of

Mexican patients. BMC Cancer, v. 9, n. 26, 2009.

Levine PH et al. Elevated antibody titers to Epstein-Barr vírus in Hodgkin’s disease. Cancer,

v. 27, p. 416-421, 1971.

Lima MAP, Rabenhorst SHB. Associação do vírus de Epstein-Barr (EBV) com tumores

sólidos. Revista Brasileira de Cancerologia, v. 52(1), p. 87-96, 2006.

Lima MAP. Estudo do Vírus Epstein-Barr (EBV) em adenocarcinoma gástrico: frequência,

associação clínico-histopatológica e relação com a expressão das proteínas BCL-2, BAX e C-

MYC. Dissertação de mestrado. Fortaleza-CE, 2006.

Lorenzetti MA, De Matteo E, Gass H, Martinez Vazquez P, Lara J, Gonzalez P, Preciado

MV, Chabay PA. Characterization of Epstein Barr Virus Latency Pattern In Argentine Breast

carcinoma. Plos One, v. 5, n. 10, 2010.

Lopes AA, Oliveira AM, Prado CBC. Principais genes que participam da formação de

tumores. Revista de Biologia e Ciências da Terra, v. 2, p. 02, 2002.

Macmahon, B. Epidemiology of Hodgkin’s disease. Cancer Res., v. 26, p. 1189-1201, 1966.

Marie K, Par-Ola B, Dorthe G, Kristina L, Per M, Marten F, for the South Sweden Breast

Câncer Group. The prognostic value of Ki67 is dependent on estrogen receptor estado and



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=De%20Matteo%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21042577

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gass%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21042577

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Martinez%20Vazquez%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21042577

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lara%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21042577

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gonzalez%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21042577



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Chabay%20PA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21042577





53

histological grade in premenopausal patients with node-negative breast cancer. Modern

Pathology, v. 23, p. 251–259, 2010.

Mazouni C, Fina F, Romain S, Ouafik L, Bonnier P, Brandone JM, Martin PM. Epstein-Barr

virus as a marker of biological aggressiveness in breast cancer. British Journal of Cancer, v.

104, p. 332–337, 2011.

Murray PG. Epstein-Barr virus in breast cancer: artefact or aetiological agent? J. Pathol., v.

209, n. 4, p. 427 – 429, 2006.

Ohga S et al. Immunological aspects of Epstein-Barr virus infection. Critical Reviews in

Oncology/Hematology, v. 44, p. 203-215, 2002.

Okano M. Haematological associations of Epstein-Barr vírus infection. Baillieres Best Pract.

Res. Clin. Haematol., v. 13, n. 2, p. 199-214, 2000.

Perrigoue JG, den Boon JA, Friedl A, Newton MA, Ahlquist P et al. Lack of association

between EBV and breast carcinoma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.. n. 14, p. 809-814,

2005.

Preciado MV, Chabay PA, De Matteo EN, Gonzalez P, Grinstein S, Actis A, Gass HD.

Epstein-Barr virus in breast carcinoma in Argentina. Arch Pathol Lab Med., v. 129, n. 3, p.

377 – 381, 2005.

Press MF, Berstein L, Thomas PA et al. HER-2/neu gene amplification characterized by

fluorescence in situ hybridization: poor prognosis in node-negative breast carcinomas. J Clin

Oncol., v. 15, p. 2894- 2904, 1997.

Piccart-Gebhart MJ, Procter M, Leyland-Jones B et al. Trastuzumabe after adjuvant

chemotherapy in HER-2-positive breast cancer. N Engl J Med., v. 353, p. 1659-1672, 2005.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Mazouni%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21179039

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Fina%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21179039

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Romain%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21179039

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ouafik%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21179039

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bonnier%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21179039

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Brandone%20JM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21179039

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Martin%20PM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21179039

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Murray%20PG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16906594


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Perrigoue%20JG%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22den%20Boon%20JA%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Friedl%20A%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Newton%20MA%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Ahlquist%20P%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=De%20Matteo%20EN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15737034


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Grinstein%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15737034

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Actis%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15737034

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gass%20HD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15737034





54

Pollack JR, Sorlie T, Perou CM, Rees CA, Jeffrey SS, Lonning PE, Tibshirani R, Botstein D,

Borresen-Dale AL, Brown PO. Microarray analysis reveals a major direct role of DNA copy

number alteration in the transcriptional program of human breast tumors. Proc Natl Acad Sci

U S A., v. 99, p. 12963-12968, 2002.

Rakha EA, Elsheikh SE, Aleskandarany MA, Habashi HO, Green AR, Powe DG, El-Sayed

ME, Benhasouna A, Brunet JS, Akslen LA, Evans AJ, Blamey R, Reis-Filho JS, Foulkes WD,

Ellis IO. Triple-negative breast cancer: distinguishing between basal and nonbasal subtypes.

Clin Cancer Res., v. 15, p. 2302-2310, 2009.

Reedman B, Klein G. Cellular localization of Epstein-Barr vírus associated complement-

fixing antigen in producer and nonproducer lymphoblastoid cell lines. International Journal of

Cancer, v. 11, p. 499-520, 1973.

Reinfuss M, Stelmach A, Mitus J, Rys J, Duda K. Typical medullary carcinoma of the breast:

a clinical and pathological analysis of 52 cases. J Surg Oncol., v. 60, p. 89-94, 1995.

Reis-Filho JS, Milanezi F, Steele D et al. Metaplastic breast carcinomas are basal-like

tumours. Histopathol., v. 49, p. 10-21, 2006.

Ribeiro-Silva A, Ramalho LN, Garcia SB, Brandão DF, Chahud F, Zucoloto S. p63 correlates

with both BRCA1 and cytokeratin 5 in invasive breast carcinomas: further evidence for the

pathogenesis of the basal phenotype of breast cancer. Histopathology, v. 47, p. 458-466, 2005.

Rosen PP, Groshen S, Kinne DW, Norton L. Factors influencing prognosis in node-negative

breast carcinoma: analysis of 767 T1N0M0/T2N0M0 patients with long-term follow up. J

Clin Oncol., v. 11, p. 2090–2100, 1993.

Schneider J. et al. Molecular subgroups of small (pT1) breast carcinomas belonging

exclusively to the ductal infiltrating variety. Cancer Genomics Proteomics, v. 4, n. 6, p. 399-

402, 2007.




55

Shibata D et al. Association of Epstein-Barr virus with undifferentiated gastric carcinomas

with intense lymphoid infiltration. Lymphoepithelioma-like carcinoma. Am. J. Pathol., v. 139,

p. 469-474, 1991.

Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer:

correlation of relapse and survival with amplification of HER-2/ neu oncogene. Science, v.

235, p. 177-182, 1987.

Sorlie T, Tibshirani R, Parker J et al. Repeated observation of breast tumor subtypes in

independent gene expression data sets. Proc Natl Acad Sci., v. 100, p. 8418–8423, 2003.

Sorlie T, Tibshirani R, Parker J, Hastie T, Marron JS, Nobel A, Deng S, Johnsen H, Pesich R,

Geisler S, Demeter J, Perou CM, Lonning PE, Brown PO, Borresen-Dale AL, Botstein D.

Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets. Proc

Natl Acad Sci U S A., v. 100, p. 8418-8423, 2003.

Subhawong AP, Subhawong T, Nassar H, Kouprina N, Begum S, Vang R, Westra WH,

Argani P. Most Basal-like Breast Carcinomas Demonstrate the Same Rb−/ p16+

Immunophenotype as the HPV-related Poorly Differentiated Squamous Cell Carcinomas

Which They Resemble Morphologically. Am J Surg Pathol., v. 33, n. 2, p. 163-175, 2009.

Sugawara Y et al. Detection of Epstein-Barr virus (EBV) in hepatocellular carcinoma tissue: a

novel EBV latency characterized by the absence of EBV-encoded small RNA expression.

Virology, v. 256, n. 2, p. 196-202, 1999.

Yersal O, Barutca S. Biological subtypes of breast cancer: Prognostic and therapeutic

implications. World J Clin Oncol August, v. 10, p. 412-424, 2014.

Thompson MP, Kurzrock R. Epstein-Barr virus and cancer. Clin Cancer Res., v. 10, n. 3, p.

803–821, 2004.


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kurzrock%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14871955





56

Thorley-Lawson DA. Epstein-Barr virus: exploiting the immune system. Nat. Rev. Immunol.,

vol. 1, n. 1, p. 75-82, 2001.

Toikkanen S, Helin H, Isola J Joensuu H. Prognostic significance of HER-2 oncoprotein

expression in breast câncer: a 30-year follow-up. J Clin Oncol., v. 10, p. 1044–1048, 1992.

Trabelsi AR, Stita W, Mokni W, Mourou A, Korbi S. Detection of Epstein Barr virus in

breast cancers with lymphoid stroma. Ann Biol Clin., v. 66, p. 59-62, 2008.

Tsuchiya S. Diagnosis of Epstein-Barr virus associated diseases. Critical Reviews in

Oncology/Hematology, v. 44, p. 227-238, 2002.

Tsutsui S, Ohno S, Murakami S, Kataoka A, Kinoshita J, Hachitanda Y. Prognostic

significance of the coexpression of p53 protein and c-erbB2 in breast cancer. Am J Surg., v.

185, p. 165-167, 2003.

Veronesi U, Galimberti V, Zurrida S et al. Prognostic significance of number and level of

axillary nodal metastases in breast cancer. Breast, v. 2, p. 224– 228, 1993.

Viale G, Regan MM, Maiorano E, Mastropasqua MG, Dell’Orto P, Rasmussen BB, Raffoul J,

Neven P, Orosz Z, Braye S et al. Prognostic and predictive value of centrally reviewed

expression of estrogen and progesterone receptors in a randomized trial comparing letrozole

and tamoxifen adjuvant therapy for postmenopausal early breast cancer: BIG 1-98. Journal of

Clinical Oncology, v. 25 p. 3846–3852, 2007.

Viale G. The current state of breast cancer classification. Ann Oncol., v. 23, p. 10, 2012.

Young LS, Murray PG. Epstein–Barr virus and oncogenesis: from latent genes to tumours.

Oncogene, v. 22, p. 5108–5121, 2003.




57

Wolf H, Zur Hausen H, Becker V. EBV viral genomes in epithelial nasopharyngeal

carcinoma cells. Nature, v. 244, p. 245-247, 1973.

Zuccari DAPC, Berton CR, Terzian ACB, Ruiz CM. Fatores prognósticos e preditivos nas

neoplasias mamárias – importância dos marcadores imunohistoquímicos nas espécies humana

e canina – estudo comparativo. Arq Ciênc Saúde, v. 15 (4), p. 189-198, 2008.




58

APÊNDICE I – ARTIGO

Low frequency of Epstein-Barr virus (EBV) in Breast Cancer in patients from Ceara –

Brazil

Emanuele Silva de Oliveira1; Márcia Valéria Pitombeira Ferreira

2; Sílvia Helena Barem

Rabenhorst3

1. Department of Pathology and Forensic Medicine, Federal University of Ceará, Fortaleza, CE, Brazil.

[email protected].


[email protected].


[email protected].

ABSTRACT

Breast cancer (BC) is the major cause of cancer mortality among women worldwide.

Recently, an association between BC and Epstein-Barr Virus (EBV) infection was reported,

but the results are controversial. Thus, this study aimed to determine the presence of EBV in

archival formalin-fixed paraffin-embedded samples from 75 patients diagnosed with invasive

BC. EBV was detected by In situ hybridization, and the expression of ER, PR, HER2, Ki67,

TP53, CK5/6 and CK8/18 was evaluated by immunohistochemistry for tumor molecular

characterization. The median age of the patients was 55 years. Absence of known risk factors

was observed in 48.6% (34/70) of them. Five cases were positive for EBV (6.67%), however

with few infected cells. Only four tumors were diagnosed in early stages, of which two were

EBV positive, but there was no difference in the number of EBV positive cells between the

tumor degrees, nor was there a difference between specific molecular subtypes. All EBV+

tumors were ER+ and only two were TP53+. Despite the EBV presence observed, the small

numbers of cases and the weak positivity do not support the notion that EBV is an etiologic

factor for BC development. Nonetheless, it is important to note that EBV was detected based

on the latency profile in BC considering EBER expression, but other EBV targets could be

considered in BC tissue.




59

INTRODUCTION


This is a multifactorial disease and although some risk factors are well described. In about 50

to 80% of cases none of the known risk factors are identified, suggesting the existence of

additional factors (1, 2). More recently, it was suggested that there is an association between

viral infection and the development of BC, such as in the case of Epstein-Barr Virus (EBV),

Human Papillomavirus (HPV) and Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV) (3).

EBV is a gamma herpes virus and was the first human virus to be directly involved in

carcinogenesis. EBV is a well-established etiological factor of Burkitt's lymphoma,

nasopharyngeal cancer, Hodgkin's disease and cancers associated with immunodeficiency (4).

In BC, the presence of EBV is a controversial issue (5, 6, 7). Thus, this study aimed to

determine the presence of EBV in breast cancer of patients in the state of Ceará, Northeast

Brazil.

MATERIAL AND METHODS

Clinical specimens: The present study was approved by the Hospital Ethics Committee of the

Assis Chateaubriand Maternity School, Ceará, Brazil. Seventy-five samples from the

pathology archives at the Federal University of Ceará were obtained. Histological and

clinical data of BC cases were from pathology records. Confirmed cases of invasive breast

carcinoma of no special type were included.

In situ hybridization (ISH) for EBV: ISH was performed using deparaffinized sections.

Tissues were hybridized (8) with the probe described by Shibata et al. (9), which was

complementary to viral RNA EBER1. The cases were considered positive when there was

nuclear staining in tumor cells, regardless of the percentage of labeled cells. Cases of gastric

adenocarcinomas previously tested and found positive for EBV were used as positive reaction

controls.

Immunohistochemistry (IHC): IHC adapted from Hsu et al. (10) was performed for

detection of cellular proteins ER, PR, HER2, Ki67, TP53, CK5/6 and CK8/18 for tumor

molecular characterization. In each round of IHC, we included a known positive clinical

sample for each protein as positive control reactions.




60

Statistical analyses: The data were organized using tables in Microsoft Excel® 2007, and the

analyses were carried out using the statistical software EPINFO® version 6.04d and SPSS

version 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Statistically significant differences were evaluated by

the chi-square test and Fisher’s exact test, and correlations between groups were analyzed by

Spearman’s and Pearson’s rank correlation coefficient. The results were considered

statistically significant when p-values were ≤ 0.05.

RESULTS

The median age of the 75 patients included in this study was 55 years, ranging from 28

to 100 years. Of these, 21 were younger than 45 years. With regard to risk factors, 32.4%

(22/70) of the women were smokers, 13.2% (9/70) drank alcohol, 20% (14/70) were

nulliparous, 8.57% (6/70) uniparous and 71.42% (50/70) multiparous. It was observed that

48.6% (34/70) of women had none of the above risk factors. Only four tumors (8.7%) were

diagnosed early stages (IA and IB). Regarding the analysis of the expression of cellular

proteins, most tumors were positive for CK8/18, ER, PR and Ki67 (frequencies: 88%, 72%,

57% and 89%, respectively), while two were present in only a small fraction of tumors,

namely TP53 (31%) and HER2 (15%). In the patients studied, the luminal subtype B was the

most common (33.3%), followed by luminal A (32%), HER2 positive (14.7%) and normal

like (14.7%).

The analysis showed positivity for EBV in five (6.67%) cases, all of them displaying

stained nuclei of tumor cells, which was occasional and weak (Figure 1).

Figure 1 – EBV-positive cases. [a] and [b] Breast carcinoma: nuclear staining in a few tumor cells

(arrows); [c] Positive control (400X).




61

There was no difference in the number of EBV+ cells between the most advanced and

early tumor stages. One of the cases was luminal A molecular subtype, three cases were

luminal B and one case was HER2 positive. All EBV+ cases were positive for hormone

receptors, one case had Ki67 index under 10%, three had Ki67 between 25% and 35% index

and the last one had high Ki67 index. They were predominantly negative for HER2 and TP53.

One EBV+ patient was younger than 45 years old and the four other patients were

over 45. The average age of EBV+ cases was slightly lower (53) than that of the uninfected

cases (58.36).

Table 1 - Pathological profile and protein expression of ER, PR, HER2, TP53, Ki67, CK5/6

and CK8/18 in EBV+ cases (n= 5).

ISH Immunohistochemistry

Histopathology ER PR HER2 TP53 Ki67 CK5/6 CK8/18

Age R S R LI R LI R E R LI R LI R R G S. Tumor

55 + F + 60 + 20 - - - 0 + 99 - + III T2

45 + F + 5 - 0 - - + 80 + 8 - + I T2

64 + F + 40 - 0 - + - 0 + 35 - + I T1

54 + F + 80 + 40 - + - 0 + 20 - + III T1

47 + F + 80 + 80 + +++ + 95 + 25 - + III T3

ER, estrogen receptor; PR, progesterone receptor; HER2, epidermal growth factor receptor 2;

CK, cytokeratin; R, result; S, staining; F, focal; LI labelling index (%); E, score; G, grade; S.

tumor, tumor size.

DISCUSSION

For the last years, EBV has been hypothesized to have potential causal roles in breast

cancer, however, the establishment of this virus as an etiological factor of breast cancer has

been challenging (11). This virus is the most cited as a possible cause of breast cancer,

although the literature is controversial about this. The different methods used and different

populations studied may be the reason for the disparities reported (12). In this study, EBV

positivity was 6.67% in breast tumors, in disagreement with other studies using ISH (13, 14,

15, 16, 17), in which no positive cases were found. This difference could be due to our use of




62

GenPoint™ Amplified Signal Detection System, which is more sensitive than the usual Dako

PNA ISH Detection kit used in the above cited studies.

On the other hand, the presence of EBV in BC has been confirmed by PCR at

frequencies varying from 0% to 100% (18, 19, 20). Even when EBV is PCR positive, this is

not a confirmation that the virus is in the tumor cells. In this way, Fina et al. (21) confirmed

their results using HIS and found that in some of the 31.8% EBV positive cases, revealed by

PCR, the signal intensity with HIS was lower in paraffin-embedded sections than in frozen

sections. This observation may explain the few EBV-staining cells in our study, where the

paraffin-embedding process can affect the preservation of the EBER molecules, making them

more difficult to detect.

Glenn et al. (11) detected EBV by PCR in situ and immunohistochemistry and found a

statistically significant difference in mean age between the EBV-positive and -negative

patients (57.3 and 65.9 years, respectively). This study showed the same tendency, but not

statistically significant (53 and 58.36 years for EBV-positive and -negative cases,

respectively). Fina et al. (21) did not find any correlation between age, tumor size, nodal

status, or histological grade, the same results as observed in the present study. However, it is

interesting to note that among the four cases with grade I (early stage) in this study, two were

EBV-positive. An agent is required to be present in the tumor from the beginning of its

development, if it is to be recognized as a cause of the disease.

Despite detecting the presence of EBV in this study, we cannot affirm that this is an

etiologic factor of breast carcinogenesis because of the low number of positives cases. The

methods chosen ensured that EBV was exclusively localized in malignant cells, however, this

technique is based on EBER-1 detection, which is a protein that may or may not be

overexpressed in the EBV latency pattern of BC. As already cited, the detection of this

protein might have also been hindered due to tissue being formalin-fixed and paraffin-

embedded, resulting in a lower signal intensity.




63

REFERENCES

1. Leon DC, De Montiel DP, Nemcova J, Mykyskova I, Turcios E, Villavicencio V, Cetina L,

Coronel A, Hes O. Human papillomavirus (HPV) in breast tumors: prevalence in a group

of Mexican patients. BMC Cancer, v. 9, n. 26, 2009.

2. NATIONAL INSTITUTE FOR CANCER (INCA) José Alencar Gomes da Silva (Brazil).

Estimate 2014 - Cancer Incidence in Brazil. Available in:

http://www.inca.gov.br/estimativa/2014/. Access to October 1, 2014.

3. Heng B, Glenn WK, Ye Y, Tran B, Delprado W, Lutze-Mann L, Whitaker NJ, Lawson JS.

Human papilloma virus is associated with breast cancer. British Journal of Cancer, v. 101,

p. 1345 – 1350, 2009.

4. Lima MAP, Rabenhorst SHB. Associação do Vírus Epstein-Barr (EBV) com tumores

sólidos. Revista Brasileira de Cancerologia, v. 52, n. 1, p. 87 – 96, 2006.

5. Chu JS, Chen CC, Chang KJ. In situ detection of Epstein-Barr virus in breast cancer.

Cancer Lett., v. 124, p. 53 – 57, 1998.

6. Bonnet M, Guinebretiere J-M, Kremmer E, Grunewald V, Benhamou E et al. Detection of

Epstein-Barr virus in invasive breast cancer. J Natl Cancer Inst., v. 91, p. 1376 – 1381,

1999.

7. Grinstein S, Preciado MV, Gattuso P, Chabay PA, Warren WH et al. Demonstration of

Epstein-Barr virus in carcinomas of various sites. Cancer Res,. v. 62, p. 4876 – 4878, 2002.

8. Bacchi CE et al. AIDS-related lymphoma in Brazil. Histopatology, immunophenotype and

associated with Epstein-Barr virus. Am. J. Clin. Pathol., v. 105, p. 230-237, 1996.

9. Shibata D et al. Association of Epstein-Barr virus with undifferentiated gastric carcinomas

with intense lymphoid infiltration. Lymphoepithelioma-like carcinoma. Am. J. Pathol., v.

139, p. 469-474, 1991.

10. Hsu SM, Raine L, Fagner H. Use of avidin-biotin peroxidade complex (ABC) in

immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP)


11. Glenn WK, Heng B, Delprado W, Lacopetta B, Whitaker NJ, Lawson JS, Epstein-Barr

virus, human papillomavirus and mouse mammary tumour virus as multiple viruses in

breast cancer. PloS One, v. 7, n. 11, 2012.





64

12. Khan G, Philip PS, Al Ashari M, Houcinat Y, Daoud S Localization of Epstein-Barr virus

to infiltrating lymphocytes in breast carcinomas and not malignant cells. Exp Mol

Pathol., v. 91, n. 1, p. 466-70, 2011.

13. Glaser SL, Ambinder RF, DiGiuseppe JA, Horn-Ross PL, Hsu JL. Absence of Epstein-

Barr virus EBER-1 transcripts in an epidemiologically diverse group of breast cancers. Int

J Cancer, v. 75, p. 555 – 558, 1998.

14. Dadmanesh F, Peterse JL, Sapino A, Fonelli A, Eusebi V. Lymphoepithelioma-like

carcinoma of the breast: lack of evidence of Epstein-Barr virus infection. Histopathol, v.

38, p. 54 – 61, 2001.

15. Deshpande CG, Badve S, Kidwai N, Longnecker R. Lack of expression of the Epstein-Barr

virus (EBV) gene products, EBERs, EBNA1, LMP1, and LMP2A, in breast cancer cells.

Lab Invest., v. 82, p. 1193 – 1199, 2002.

16. Trabelsi AR, Stita W, Mokni W, Mourou A, Korbi S. Detection of Epstein Barr virus in

breast cancers with lymphoid stroma. Ann Biol Clin., v. 66, p. 59 – 62, 2008.

17. Lorenzetti MA, De Matteo E, Gass H, Martinez Vazquez P, Lara J, Gonzalez P, Preciado

MV, Chabay PA. Characterization Of Epstein Barr virus latency pattern In

Argentine breast carcinoma. Plos One, v. 5, n. 10, 2010.

18. Bonnet M, Guinebretiere J-M, Kremmer E, Grunewald V, Benhamou E et al. Detection of

Epstein-Barr virus in invasive breast cancer. J Natl Cancer Inst., v. 91, p. 1376 – 1381,

1999.

19. Grinstein S, Preciado MV, Gattuso P, Chabay PA, Warren WH et al. Demonstration of

Epstein-Barr virus in carcinomas of various sites. Cancer Res., v. 62, p. 4876 – 4878, 2002.

20. Perrigoue JG, Den Boon JA, Friedl A, Newton MA, Ahlquist P et al. Lack of association

between EBV and breast carcinoma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev., v. 14, p. 809 –

814, 2005.

21. Fina F, Romain S, Ouafik L, Palmari J, Ben Ayed F et al. Frequency and genome load of

Epstein-Barr virus in 509 breast cancers from different geographical areas. Br J Cancer, v.

84, p. 783 – 790, 2001.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Khan%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21600202

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Philip%20PS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21600202

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Al%20Ashari%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21600202

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Houcinat%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21600202

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Daoud%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21600202










http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=De%20Matteo%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21042577

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gass%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21042577

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Martinez%20Vazquez%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21042577

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lara%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21042577






http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Perrigoue%20JG%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22den%20Boon%20JA%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Friedl%20A%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Newton%20MA%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Ahlquist%20P%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus






65

APÊNDICE II – ARTIGO

Molecular characterization of Breast Cancer in Brazilian Northeast women

Emanuele Silva de Oliveira1; Márcia Valéria Pitombeira Ferreira

2; Ana Patricia Freitas

Vieira3; Denise Ellen Francelino Cordeiro

4; Sílvia Helena Barem Rabenhorst

5


[email protected].


[email protected].

3. Federal University of Ceará, Fortaleza, CE, Brazil. [email protected].

4. Federal University of Ceará, Fortaleza, CE, Brazil. [email protected].


[email protected].

ABSTRACT

Breast cancer (BC) is the major cause of cancer mortality among women worldwide and

represents a heterogeneous group of tumors that differ in behavior, outcome, and response to

therapy. Breast tumor can be classified into five subtypes: luminal A and B, HER2-positive,

basal-like and normal-like. This study aimed to characterize BC tumors from Brazilian

Northeast women according to molecular subtypes, including the tumor supressor TP53. The

expression of ER, PR, HER2, Ki67, TP53, CK5/6 and CK8/18 was evaluated by

immunohistochemistry for tumor molecular characterization in archival formalin-fixed

paraffin-embedded samples from 75 patients diagnosed with invasive BC. The median age of

the patients was 55 years. Twenty one patients were younger than 45 years. Only 8.7% of

tumors were diagnosed early. The more frequent molecular subtype was luminal B (33.3%),

followed by luminal A (32%), normal-like (14.7%), HER2-positive (14.7%) and basal-like

(5.3%). HER2-positive and basal-like included the more advanced staging. TP53 was

significantly more frequent in basal-like subtype than in luminal A. Considering the age, only

in patients up to 45 years, TP53 frequencies of triple-negative and specifically the basal-like

tumors differed significantly from luminal subtypes (A and B). These data show the

importance of TP53 as a marker for triple-negative tumors in women below 45 years.

mailto:[email protected]




66

Although is not part of the characterization of triple-negative and HER2-positive tumors

subtypes. The verification of the TP53 frequencies offers more information about tumor

behavior. There are limited data regarding breast cancer subtypes among Brazilian women.

The significant data found was interesting and contribute to an understanding the molecular

subtypes in the population studied.

INTRODUCTION


This is a multifactorial disease and although some risk factors are well described (1, 2). Breast

tumors are diverse and represent a heterogeneous group of tumors that are diverse in

behavior, outcome, and response to therapy (3, 4, 5).

Recently, it has been demonstrated that breast tumor may be classified by gene

expression profiles into five subtypes based on immunohistochemical markers: luminal A and

B, HER2-positive, basal-like and normal-like (4, 6, 7).

The luminal subtypes A and B are characterized by the ER (estrogen receptor)

expression and high expression of many genes expressed by breast luminal cells. As they

differ in cell proliferation index, the Ki67 is the marker that differentiates luminal B tumors

from luminal A in clinical practice (cut off point: 14%). The ER negative tumors are further

divided into HER2-positive, basal-like and normal-like. HER2-positive tumors are

characterized by the expression of high levels of HER2 oncogene. Basal-like and normal-like

tumors are HER2 negative and they can also be classified as triple-negative. Basal-like tumors

express basal keratins (CK5/6) and many of the characteristics of breast basal epithelial cells

while, normal-like tumors are negative for CK5/6 and EGFR (7).

Even with this classification, tumors with similar pathological presentations and

markers may have different behaviors (7). Then, It is important to characterize new tumors

markers. Among the tumors marker, one of the most studied is TP53, which is associated to

poor prognosis (4), however it is not used to categorize any subtype. Knowing the tumor and

have information about its biology allow to ensure adequate therapy and to improve patients’

outcome to reduce mortality from breast cancer. Besides the importance of this classification,

there are no reports about the incidence of the molecular subtypes in the Brazilian Northeast.

Thus, this study aimed to know the distribution of mammary tumors of patients in the state of




67

Ceará, Northeast Brazil according to the molecular subtypes, including the tumor suppressor

TP53.

MATERIAL AND METHODS

Clinical specimens: The present study was approved by the Hospital Ethics Committee of the

Assis Chateaubriand Maternity School, Ceara, Brazil. Seventy-five samples from the

pathology archives at the Federal University of Ceara were obtained. Histological and

clinical data of BC cases were from pathology records. Confirmed cases of invasive breast

carcinoma of no special type were included.

Immunohistochemistry (IHC): IHC adapted from Hsu et al. (8) was performed for detection

of cellular proteins ER, PR, HER2, Ki67, TP53, CK5/6 and CK8/18 for tumor molecular

characterization. In each round of IHC, we included a known positive clinical sample for each

protein as positive control reactions.

Statistical analyses: The data were organized using tables in Microsoft Excel® 2007, and the

analyses were carried out using the statistical software EPINFO® version 6.04d and SPSS

version 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Statistically significant differences were evaluated by

the chi-square test and Fisher’s exact test, and correlations between groups were analyzed by

Spearman’s and Pearson’s rank correlation coefficient. The results were considered

statistically significant when p-values were ≤ 0.05.

RESULTS

The median age of the 75 patients included in this study was 55 years, ranging from 28

to 100 years. Of these, 21 were younger than 45 years. With regard to risk factors, 32.4%

(22/70) of the women were smokers, 13.2% (9/70) drank alcohol, 20% (14/70) were

nulliparous, 8.57% (6/70) uniparous and 71.42% (50/70) multiparous. Previous history of

cancer (uterus and ovary cancer) was observed in 4.3% (3/70) of the patients, only one patient

aged 45 years, and familiar history of other cancers was observed in a larger fraction of

patients 20.3% (14/70). Two patients had a family history of cancer, smoking and alcohol

concomitantly. Conversely, 48.6% (34/70) of women had none of the above risk factors.




68

As shown in table 1, only four tumors (8.7%) were diagnosed early (stages IA and IB).

Most of them belonged to the upper grades and had lymph node involvement. In neither case

distant metastases was informed.

Table 1 - Histopathological characteristics of women's tumors (≤45 and >45 years old) with

breast carcinomas.

Variables Total ≤ 45 years old > 45 years old

n (%) n (%) n (%)

Clinical staging IA 2 (4,3%) 0 (0%) 2 (6,3%)

IB 2 (4,3%) 1 (9,1%) 1 (3,1%)

IIA 8 (17,4%) 2 (18,2%) 6 (18,8%)

IIB 5 (10,9%) 3 (27,3%) 2 (6,3%)

IIIA 9 (19,6%) 1 (9,1%) 8 (25%)

IIIB 10 (21,7%) 2 (18,2%) 7 (21,9%)

IIIC 10 (21,7%) 2 (18,2%) 6 (18,8%)

IV 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)

Tumor size T1 19 (26,8%) 4 (21,1%) 15 (28,8%)

T2 35 (49,3%) 12 (63,2%) 23 (44,2%)

T3 3 (4,2%) 0 (0%) 3 (5,8%)

T4 14 (19,7%) 3 (15,8%) 11 (21,2%)

Histolopathological

grade

I 16 (24,2%) 3 (15,8%) 13 (27,7%)

II 17 (25,8%) 8 (42,1%) 9 (19,1%)

III 33 (50%) 8 (42,1%) 25 (53,2%)

Lymph node

involvement

NEG 11 (19,3%) 2 (13,3%) 9 (21,4%)

POS 34 (59,6%) 10 (66,7%) 24 (57,1%)

Most tumors included in this study were positive for CK8/18, ER, PR and Ki67

(frequencies: 88%, 72%, 57% and 89%, respectively), while TP53 and HER2 were present in

a smaller fraction of tumors, (31% and 15% respectively). There were no differences in the

cellular markers frequencies between the age groups taken in account cut-off point of 45

years.




69

Considering the risk factors, the frequencies of hormone receptors and CK8/18 were

higher in non-smokers (ER: 82.6% vesus 50%, RP: 65.2% vesus 45.5% and CK8/18: 91.3%

vesus 77.3%), but only the ER showed a tendency of significance (p = 0.07). The frequency of

HER2 was higher in smokers (22.7% vesus 10.9%), but these frequencies were not

statistically different. The three patients’ tumors with previous history of cancer were ER and

CK 8/18 positives and negatives to HER2 and CK 5/6. Two of them were PR and Ki67

positives and finally, one of the tumors was TP53 positive.

Regarding to molecular subtypes, in the patients studied, the luminal subtype B was

the most common (33.3%), followed by luminal A (32%). The HER2-positive and normal-

like subtypes had the same frequency (14.7%) and basal-like subtype were less common

(5.3%). The tumors classified as subtypes HER2-positive and basal-like included the more

advanced staging and those classified as normal-like subtype included grades II and III

tumors. There is a lower frequency of lymph nodes involvement in luminal A subtype tumors

(42,9%) differing statistically from the luminal B (68,4%) and HER2-positive (75%) subtypes

(p = 0.02 and 0.05 respectively).

The table 3 shows the distribution of the molecular markers according to the molecular

subtypes. From this table, it is possible to observe that, as expected, Ki67 was statistically

more frequent in luminal B than in luminal A tumors in the total sample and among patients

older than 45 years. TP53 was significantly more frequent in the basal-like than luminal A in

all patients, independently of the age. Among patients up to 45 years, all tumors triple-negativ

e subtype (basal-like and normal-like) were TP53 positive, while a low positivity was found

in the luminal A and B subtypes with a statistical difference between triple-negative and

luminal A and B, and basal-like and luminal A and B. TP53 frequencies did not differ

between the molecular subtypes among over 45 years.

Comparing the age groups, it is interesting to note that triple-negative tumors subtype

in patients up to 45 years old had TP53 statically more frequent than patients over 45 years

when compared to luminal B, while in tumors luminal B, TP53 was more frequent in patients

over 45 years old.




70

Table 2 - Histopathological features of the tumors according to the molecular subtypes.

Variables LUM. A LUM. B HER2+ BL NL TN

Age n n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%)

Total 75 24 (32%) 25 (33.3%) 11 (14.7%) 4 (5.3%) 11 (14.7%) 15 (20%)

≤ 45 21 7 (33.3%) 6 (28.6%) 3 (14.3%) 2 (9.5%) 3 (14.3%) 5 (23.8%)

> 45 54 17 (31.5%) 19 (35.2%) 8 (14.8%) 2 (3.7%) 8 (14.8%) 10 (18.5%)

Clinical staging

IA 2 2 (11.8%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)

IB 2 2 (11.8%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)

IIA 8 6 (35.3%) 1 (7.7%) 0 (0%) 0 (0%) 1 (20%) 1 (14.3%)

IIB 5 1 (5.9%) 1 (7.7%) 2 (33.3%) 0 (0%) 1 (20%) 1 (14.3%)

IIIA 9 2 (11.8%) 2 (15.4%) 4 (66.7%) 1 (50%) 0 (0%) 1 (14.3%)

IIIB 9 1 (5.9%) 5 (38.5%) 0 (0%) 1 (50%) 2 (40%) 3 (42.9%)

IIIC 8 3 (17.6%) 4 (30.8%) 0 (0%) 0 (0%) 1 (20%) 1 (14.3%)

IV 0 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)

Tumor size

T1 19 7 (31.8%) 5 (20.8%) 3 (27.3%) 1 (25%) 3 (30%) 4 (28.6%)

T2 35 13 (59.1%) 11 (45.8%) 7 (63.6%) 1 (25%) 3 (30%) 4 (28.6%)

T3 3 0 (0%) 0 (0%) 1 (9.1%) 1 (25%) 1 (10%) 2 (14.3%)

T4 14 2 (9.1%) 8 (33.3%) 0 (0%) 1 (25%) 3 (30%) 4 (28.6%)

Histopathological

grade

I 16 9 (47.4%) 7 (29.2%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)

II 17 5 (26.3%) 6 (25%) 4 (44.4%) 1 (33.3%) 1 (9.1%) 2 (14.3%)

III 33 5 (26.3%) 11 (45.8%) 5 (55.6%) 2 (66.7%) 10 (90.9%) 12 (85.7%)

Lymph node

involvement

NEG 11 8 (38.1%) 1 (5.3%) 0 (0%) 1 (33.3%) 1 (16.7%) 2 (22.2%)

POS 75 9 (42.9%) 13 (68.4%) 6 (75%) 2 (66.7%) 4 (66.7%) 6 (66.7%)

LUM. A, Luminal A; LUM. B, Luminal B; HER2+, HER2-positive; BL, Basal-like; NL,

Normal-like; NEG, negative; POS, positive.




71




72

DISCUSSION

In this study, luminal B molecular subtype was the most common found (33.3%),

followed by luminal A (32%), contradicting the literature that relates the luminal A subtype is

the most frequent, representing 50%-60% and luminal B, 15%-20% of all breast cancers (7).

On the other hand, 14,7% of the tumors were classified as HER2-positive subtype,

corroborating with the 15-20% described by Yersal & Barutca (7), the triple-negative

phenotype frequency found in this study was 20%, corroborating with 16.3% observed by the

survey from Rakha et al. (4) with 1944 cases of breast carcinoma from Nottingham. Another

Brazilian study found in the literature also selected the invasive breast carcinoma and showed

different frequencies of the current study, where the luminal A subtype was the most frequent,

followed by basal-like, HER2-positive and at lastly, luminal B, however this published study

was restricted to women aged between 19 and 40 years (11).

Breast cancer is a heterogeneous disease and molecular classification is affected

by race, ethnicity and geographic variation of patients (9, 5, 10), then, molecular subtype

frequencies vary according to the different ethnic groups of patients. In Egyptian women,

luminal A subtype was the most prevalent (41.2%), followed by triple-negative (28.5%),

HER2-positive (19.4%) and luminal B (13.9%) (6). In Iranian women, luminal A subtype was

the most common (63.8%) followed by luminal B (8.4%), basal-like (15.9%) and HER2-

positive (11.9%) (9). In United States, non Hispanic white women had the highest incidence

rate of the luminal subtypes and non Hispanic black women had the highest rate of the triple-

negative subtype (12).

In this study, part of the differences among the subtypes may be due to pre selection of

the invasive breast carcinoma of no special type, while the other studies carried out tests in all

histological types of tumors. However, since the invasive breast carcinoma of no special type

is the most common type of breast cancer, the frequencies should vary slightly (13, 6).

Considering the triple-negative subdivision, in the population studied, the basal-like

subtype frequency was very low, while normal-like subtype was slightly higher than related in

the literature. In the literature, Yersal & Barutca (7) relate that the basal-like subtype

represents from 8% to 37% and normal-like subtype, 5% to 10% of all breast cancers.

Triple-negative tumors are more aggressive and were associated with high expression

of TP53 when compared with other tumor groups (4), as was also observed in this study. Han




73

et al. (14) study with Korean women reveals that the high grade tumors with high TP53 and

Ki-67 were found more commonly in non-luminal tumors using cDNA microarray technique.

In this study, 31% of tumors were TP53 positive, corroborating with Ihemelandu et al. (15)

that reported in African-American women, 27.6% cases over-expressed TP53. They searched

the clinical significance of TP53 and Bcl-2 coexpression but although TP53 and Bcl-2 were

assessed concurrently, it was concluded that the TP53 positive tumors are related to basal-like

and HER2-positive subtypes and TP53 negative tumors were related to luminal subtype.

Likewise, in this study, TP53 positive was more frequent in basal-like subtype tumors,

differing significantly from the luminal A and luminal B tumors.

Considering the age, only in patients up to 45 years, TP53 frequencies of triple-

negative and specifically the normal-like tumors differed significantly from luminal subtypes.

In fact the TP53 were significantly more frequent in this age group comparing with patients

over 45 years old. This data point the importance of the age in the TP53 evaluation.

Data from this study indicate that TP53 has been shown to be important for the

scoreboard of malignancy of the triple-negative and HER2-positive tumors. It is interesting to

note the importance of TP53 as a marker of differential triple-negative tumors in women

below 45 years. Although is not part of the characterization of HER2-positive tumors subtype,

verification of the TP53 frequencies offer more information about tumor behavior.

There are limited data regarding breast cancer subtypes among Brazilian women.

Besides this study did not include a very large number of samples, the significant data found

are interesting and contribute to understanding the molecular subtypes in the population

studied.




74

REFERENCES

1. Leon DC, De Montiel DP, Nemcova J, Mykyskova I, Turcios E, Villavicencio V, Cetina L,

Coronel A, Hes O. Human papillomavirus (HPV) in breast tumors: prevalence in a group

of Mexican patients. BMC Cancer, v. 9, n. 26, 2009.

2. INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA

(Brasil). Estimativa 2014 - Incidência do Câncer no Brasil. Disponível em:

http://www.inca.gov.br/estimativa/2014/. Acesso em 01 de outubro de 2014.

3. Perou CM, Sorlie T, Eisen MB, Van de Rijn M, Jeffrey SS, Rees CA, Pollack JR, Ross

DT, Johnsen H, Akslen LA, Fluge O, Pergamenschikov A, Williams C, Zhu SX, Lonning

PE, Borresen-Dale AL, Brown PO, Botstein D. Molecular portraits of human breast

tumours. Nature, v. 406, p. 747-752, 2000.

4. Rakha EA, El-Sayed ME, Green AR, Lee AHS, Robertson JF, Ellis IO. Prognostic

Markers in Triple-Negative Breast Cancer. Cancer, v. 109, n. 1, 2007.

5. Mehdi I, Monem AA, Al Bahrani B, Ramadhan FA. Breast cancer molecular subtypes in

oman: correlation with age, histology, and stage distribution - analysis of 542 cases. Gulf

J Oncolog., v. 1, n. 15, p. 38-48, 2014.

6. El-Hawary AK, Abbas AS, Elsayed AA, Zalata KR.

Molecular subtypes of breast carcinoma in Egyptian women: clinicopathological features.

Pathol Res Pract., v. 208, n. 7, p. 382-386, 2012.

7. Yersal O, Barutca S. Biological subtypes of breast cancer: Prognostic and therapeutic

implications. World J Clin Oncol., v. 5, n. 3, p. 412-424, 2014.

8. Hsu SM, Raine L, Fagner H. Use of avidin-biotin peroxidade complex (ABC) in

immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabled antibody (PAP)


9. Kadivar M, Mafi N, Joulaee A, Shamshiri A, Hosseini N.

Breast cancer molecular subtypes and associations with clinicopathological

characteristics in Iranian women, 2002- 2011. Asian Pac J Cancer., v. 13, n. 5, p. 1881-

1886, 2012.

10. Telli ML, Chang ET, Kurian AW, Keegan TH, McClure LA, Lichtensztajn D, Ford

JM, Gomez SL. Asian ethnicity and breast cancer subtypes: a study from the California

Cancer Registry. Breast Cancer Res Treat., v. 127, n. 2, p. 471-478, 2011.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sørlie%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10963602

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Eisen%20MB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10963602

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=van%20de%20Rijn%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10963602

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Jeffrey%20SS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10963602

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Rees%20CA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10963602

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Pollack%20JR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10963602

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ross%20DT%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10963602

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ross%20DT%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10963602

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Johnsen%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10963602

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Akslen%20LA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10963602

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Fluge%20O%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10963602

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Pergamenschikov%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10963602

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Williams%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10963602

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhu%20SX%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10963602

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lønning%20PE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10963602

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lønning%20PE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10963602

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Børresen-Dale%20AL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10963602

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Brown%20PO%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10963602

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Botstein%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10963602

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mehdi%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24610287

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Monem%20AA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24610287

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Al%20Bahrani%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24610287

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ramadhan%20FA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24610287



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=El-Hawary%20AK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22641056

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Abbas%20AS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22641056

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Elsayed%20AA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22641056

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zalata%20KR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22641056


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kadivar%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22901141

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mafi%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22901141

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Joulaee%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22901141

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Shamshiri%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22901141

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hosseini%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22901141


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Telli%20ML%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20957431

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chang%20ET%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20957431

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kurian%20AW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20957431

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Keegan%20TH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20957431

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=McClure%20LA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20957431

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lichtensztajn%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20957431

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ford%20JM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20957431

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ford%20JM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20957431

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gomez%20SL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20957431





75

11. Carvalho LV, Pereira EM, Frappart L, Boniol M, Bernardo WM, Tarricone V, Tavtigian

S, Southey MC. Molecular Characterization Of Breast Cancer In Young Brazilian

Women. Rev Assoc Med Bras., v. 56, n. 3, p. 278-287, 2010.

12. Howlader N, Altekruse SF, Li CI, Chen VW, Clarke CA, Ries LA, Cronin KA. US

incidence of breast cancer subtypes defined by joint hormone receptor and HER2 status. J

Natl Cancer Inst., v. 106, n. 5, 2014.

13. Geyer, FC, de Nigro, MV. Tipos histológicos especiais de câncer de mama. Onco&,

2013.

14. Han W, Nicolau M, Noh DY, Jeffrey SS. Characterization of molecular subtypes of

Korean breast cancer: an ethnically and clinically distinct population. Int J Oncol., v. 37,

n. 1, p. 51-59, 2010.

15. Ihemelandu CU, Dewitty RL Jr, Leffall LD Jr, Suryanarayana SM, Frederick WA.

Clinical significance of p53 and bcl-2 protein coexpression phenotypes

in molecular breast cancer subtypes of pre-menopausal and post-menopausal African-

American women. Am Surg., v. 75, n. 9, p. 776-784, 2009.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Howlader%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24777111

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Altekruse%20SF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24777111

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Li%20CI%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24777111

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chen%20VW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24777111

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Clarke%20CA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24777111

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ries%20LA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24777111

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Cronin%20KA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24777111



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Han%20W%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20514396

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nicolau%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20514396

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Noh%20DY%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20514396

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Jeffrey%20SS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20514396


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ihemelandu%20CU%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19774948

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Dewitty%20RL%20Jr%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19774948

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Leffall%20LD%20Jr%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19774948

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Suryanarayana%20SM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19774948

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Frederick%20WA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19774948





76

APÊNDICE III – TABELAS E FIGURAS COMPLEMENTARES

Figura complementar A - Percentual de casos de câncer de mama estudados distribuídos

segundo a faixa etária das pacientes (n=75).

Tabela complementar A - Percentual de casos de carcinoma mamário estudados,

distribuídos quanto à gestação e presença de fatores de risco (história prévia de câncer,

história familiar, tabagismo e etilismo.

Total ≤ 45 anos > 45 anos

n (%) n (%) n (%)

Tabagismo 22 (32,4%) 7 (36,8%) 15 (30,6%)

Etilismo 9 (13,2%) 3 (15,8%) 6 (12,2%)

Gestação 56 (80%) 15 (75%) 41 (82%)

Uníparas 6 (10,7%) 2 (33,3%) 4 (66,7%)

Multíparas 50 (89,3%) 13 (26%) 37 (74%)

História prévia (útero e ovário) 3 (4,3%) 1 (5%) 2 (4%)

História familiar (outros tipos de câncer) 14 (20,3%) 4 (21,1%) 10 (20%)




77

Figura complementar B - Frequência da expressão das proteínas celulares RE, RP, HER2,

Ki67, TTP53, CK5/6 e CK8/18 e percentual de células tumorais marcadas (n=75).

Tabela complementar B - Características imunohistoquímicas de carcinomas de mama em

pacientes ≤ 45 anos e > 45 anos.

Marcador Total ≤ 45 anos > 45 anos

Valores de p n (%) n (%) n (%)

RE 54 (72%) 14 (66,7%) 40 (74,1%) 0,26

RP 43 (57%) 11 (52,4%) 32 (59,3%) 0,29

HER2 11 (15%) 03 (14,3%) 08 (14,8%) 0,17

Ki67 67 (89%) 17 (81,0%) 50 (92,6%) 0,09

TP53 23 (31%) 08 (38,1%) 15 (27,8%) 0,2

CK5/6 9 (12%) 03 (14,3%) 06 (11,1%) 0,35

CK8/18 66 (88%) 18 (85,7%) 48 (88,9%) 0,35

RE, receptor de estrógeno; RP, receptor de progesterona; HER2, receptor de fator de

crescimento epidérmico 2; CK, citoqueratina (n = 75); Valor de p calculado entre pacientes ≤

45 e > 45 anos.




78

Tabela complementar C - Características imunohistoquímicas de carcinomas de mama em

pacientes tabagistas/não tabagistas e com/sem história prévia/familiar de câncer.

Tabagistas Não tabagistas Com história

prévia/familiar

Sem história

prévia/familiar

Marcadores n (%) n (%) n (%) n (%)

RE 11 (50%) 38 (82,6%) 14 (82,4%) 40 (72,7%)

RP 10 (45,5%) 30 (65,2%) 12 (70,6%) 31 (56,4%)

HER2 5 (22,7%) 5 (10,9%) 2 (11,8%) 8 (14,5%)

Ki67 19 (86,4%) 41 (89,1%) 16 (94,1%) 47 (85,5%)

TP53 7 (31,8%) 14 (30,4%) 9 (52,9%) 15 (27,3%)

CK5/6 5 (22,7%) 4 (8,7%) 0 (0%) 9 (16,4%)

CK8/18 17 (77,3%) 42 (91,3%) 17 (100%) 46 (83,6%)

RE, receptor de estrógeno; RP, receptor de progesterona; HER2, receptor de fator de

crescimento epidérmico 2; CK, citoqueratina.




79

APÊNDICE IV – PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA DA

MATERNIDADE ESCOLA ASSIS CHATEAUBRIAND (MEAC).




80




81

APÊNDICE V - FICHA DE COLETA DE DADOS SOCIOEPIDEMIOLÓGICOS

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

LABORATÓRIO DE GENÉTICA MOLECULAR- LABGEM

CADASTRO CÂNCER DE MAMA FICHA Nº

I- IDENTIFICAÇÃO

Nome Completo:_____________________________________________________

Hospital/Prontuário n°.:_____________________Data da 1ª consulta:___/___/___

Médico responsável:__________________________________________________

Sexo: ( ) F ( ) M Data de Nascimento: ___/___/___ Idade: ________ ABO:_____

Cor: ( ) caucasiano ( ) negro ( ) pardo ( ) outra- especificar:_______________

Grau de instrução:___________________ Profissão: ________________________

Naturalidade:____________________ Procedência:____________________

Endereço: ___________________________________________________________

CEP:__________________ Cidade: ____________________Estado:_____________

Tel.: (__)___________/______________ email: ____________________________

II- HÁBITOS

( )Tabagista Tipo______ Freqüência________________ Fum. passivo ( )

( ) Etilista Tipo______ Freqüência________________

III- HISTÓRIA GINECO-OBSTETRÍCIA

Menarca:_________ Ciclo:__________ Última menstruação:__________________

Gravidez:__________ Parto: __________ Aborto: __________ Idade 1º parto: __________

Amamentou: __________ TRH: __________ Tempo de uso: ____________________

Idade da primeira mamografia: ____________




82

IV- ANTECEDENTES PESSOAIS E FAMILIARES

Patologias associadas: ( ) Diabetes mellitus ( ) HAS ( )DST ( ) Outra –

especificar __________________________________________________________________

História prévia de câncer: ( )sim ( )não

Se sim, qual o tipo____________________ Idade na época do diagnostico: _______

Familiares com história de câncer

( ) Avô materno ( ) paterno ( ) Avó materna ( ) paterna ( ) Mãe( ) Pai

( )Tio(a) ( ) Materno ( ) Paterno ( ) Irmão(a)

Obs:________________________________________________________________

V- DADOS RELATIVOS À NEOPLASIA

Data do primeiro diagnóstico ___/_____/___

Histopatologia: __________________________________________________

Estadiamento: ____________________ Est. Clínico: T___N_____M___

Mama do tumor primário: ( ) 1-direita ( ) 2-esquerda ( ) 3-bilateral

Quadrante: ( ) 1-QSD ( ) 2-QSE ( ) 3-QID ( ) 4-QIE ( ) 5-S/especificação

Quimioterapia: Data do início ____/_____/____Data do término ___/____/___

Radioterapia Adjuvante: ( ) Sim ( ) Não. Período ___/___/___ a ___/____/___

Esquema: ( ) CMF ( ) FAC ( ) FEC ( ) AC Número de ciclos _______

Cirurgia: ( ) Mastectomia radical ( ) Quadrantectomia ( ) Outro_______________

VI- MARCADORES MOLECULARES

RE __________

RP __________

C-erb-2 __________

TP53 __________




83

VII- RECORRÊNCIA

( 1a ) Data ___/____/____ (2

a )Data ___/____/____ ( 3

a )Data ___/____/____

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

VIII- SOBREVIDA

Livre de doença (meses)_______________________________________________

Com evidência de doença (meses) _______________________________________

Geral (meses)________________________________________________________

Data do óbito ___/___ /___ ( ) Relacionado á neoplasia primária da mama

( ) Relacionado à outra causa______________

IX- MAPA DO RETORNO AMBULATORIAL

Data Observações:

___/____/____ ____________________________________________________

_____________________________________________________

_____________________________________________________

___/____/____ ____________________________________________________

_____________________________________________________

_____________________________________________________

___/____/____ ____________________________________________________

_____________________________________________________

_____________________________________________________

FREQUÊNCIA DO VÍRUS EPSTEIN-BARR (EBV) EM PACIENTES … · 2019-01-21 · Dissertação: Emanuele...

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