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Tesis de Grado

Generación y caracterización deGeneración y caracterización decélulas pluripotentes inducidascélulas pluripotentes inducidas

equinasequinas

Campetella, Carla Agustina

2017

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Campetella, Carla Agustina. (2017). Generación y caracterización de células pluripotentesinducidas equinas. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001604_Campetella

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Campetella, Carla Agustina. "Generación y caracterización de células pluripotentes inducidasequinas". Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2017.https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001604_Campetella

UNIVERSIDADDEBUENOSAIRES

FacultaddeCienciasExactasyNaturales CarreradeCienciasBiológicas

TesisdeLicenciatura

‘GeneraciónyCaracterizacióndeCélulasPluripotentesInducidasEquinas’

Alumna:CarlaAgustinaCampetellaDirectora:Dra.CarolinaBlüguermannDirectorAsistente:Dr.AdriánÁngelMuttoLugar de Trabajo: Instituto de Investigaciones Biotecnológicas(IIB),UniversidadNacionaldeSanMartín(UNSAM)

Noviembre,2017

2

‘GeneraciónyCaracterizacióndeCélulasPluripotentesInducidasEquinas’

Las célulasmadre representan unmodelo experimental único para numerosas áreas de investigación en

veterinaria,biologíaymedicinadebidoasucapacidaddeautorrenovaciónyasunaturalezapluripotente.En

losúltimosañoselcampodelascélulasmadrepluripotentesseviorevolucionadoporunanuevaformade

obtencióndecélulasmuysimilaresalascélulasmadreembrionarias(CME),lascélulasmadrepluripotentes

inducidas(CPI).Estascélulassonobtenidasapartirdelareprogramacióndecélulassomáticasadultas.Las

CPIpresentanexpresióngénicayproteicamuysimilaresa lasdeCMEyevitan losproblemaspresentados

porlasCME,dadoquesucostodeobtenciónesmenor,puedenserexpandidasengrancantidadinvitroy

diferenciadasadistintostiposcelulares,yaseanprogenitoresocélulasterminalmentediferenciadas.Debido

aesto,lasCPIresultanparticularmenteprometedorasenelcampodelamedicinaregenerativa.

Los caballos tienengranvalor comoanimales tantodeportivos comode compañía. En la saludequina las

lesionesarticularesymusculo-esqueléticasson lasmás frecuentes,y lasopcionesterapéuticasdisponibles

actualmente sólo logran proporcionar una solución a corto plazo. En este marco, las aplicaciones

terapéuticasdelascélulasmadreproporcionaríanunaalternativaparaalcanzarterapiasregenerativasque

permitanlacompletarestauracióndeltejidoadulto.ElestudiodeCPIequinasesuncampoemergenteque

actualmentesólocuentacon6trabajosaescalamundial.Sibienentodosloscasosseestudiólacapacidad

depluripotenciay laexpresióngénicayproteicadecada línea, lascaracterísticasdescriptasdifierenentre

líneas,porloquenoexisteunconsensoentrelaslíneasCPIexistentes.

ElobjetivodelpresentetrabajodeTesisfueestablecer,caracterizaryvalidarunalíneadeCPIequinassegún

loscriteriosactualesdepluripotencia.LasCPIfueroninducidasapartirdefibroblastosequinosembrionarios

quefuerontransfectadosconunplásmidoconteniendolassecuenciascodificantesparalosgenesOct4,Sox2,

Klf4 y C-Myc utilizando un vector lentiviral. Se seleccionó un clonCPI para analizar su cariotipo, perfil de

expresión génico y proteico, actividad de fosfatasa alcalina y capacidad de diferenciación in vitro. Los

resultados obtenidos indican que las células obtenidas presentan características asociadas a las células

pluripotentes.

3

ÍNDICE

Introducción…………………………………………………………………………………………………………………………4

CélulasMadre…………………………………………………………………………………………………………..5

Reprogramación…………………………………………………………………………………………………….…8

CélulasMadreenAnimalesDomésticos………….……………………………………………….………10

CélulasMadreenEquinos………………………………………………………………………………….……11

HipótesisyObjetivos…………………………………………………………………………………………….…12

Resultados………………………………………………………………………………………………………………………….13

Reprogramación…………………………………………………………………………………………………..…14

Validación…………………………………….…………………………….…………………………………………..16

Discusión…………………………………………………………………………………………………………………………….24

MaterialesyMétodos…………………………………………………………………………………………………………30

Bibliografía………………………………………………………………………………………………………………………….39

Agradecimientos………………………………………………………………………………………………………………….43

4

INTRODUCCIÓN

5

I.Célulasmadre

ConradWaddingtonasemejóeldesarrolloembrionarionormalaunapelotarodandocolinaabajo,desdeun

estadoinicialpluripotentehastaunodemuchosposiblesestadosdiferenciadosfinales(1).Elhechoqueun

embrión temprano deba contener células con la capacidad de generar y diferenciarse a todos los tipos

celularesadultos,yque los linajes individualespierdenpotencialidadgradualmenteamedidaqueavanzan

en su camino de diferenciación, ha sido el dogma establecido pormucho tiempo (2). De esta forma, se

entiende por ‘célula madre’ aquella célula que al dividirse genera una copia de sí misma y una célula

diferenciada. Según cuántos linajes celulares pueda generar una célulamadre, se define su potencia. Las

células‘Totipotentes’soncapacesdegenerartodoslostiposcelularespresentesenelembriónyeladulto,

célulasgerminalesyestructurasextraembrionarias.Lascélulas‘Pluripotentes’puedendarorigenatodoslos

tiposcelularesdelembriónyeladultoycélulasgerminales,peronosoncapacesdeoriginarlasestructuras

extraembrionariasnecesariasparael correctodesarrollodeun individuo.Colinaabajoen la topografíade

Waddington, se encuentran las células ‘Multipotentes’, que pueden generar los distintos tipos celulares

dentrodeunmismotejido,yporúltimo,lascélulas‘Unipotentes’quesólopuedenoriginaruntipocelular.

Unavezqueunacélulaseencuentracompletamentediferenciada, sólopuededividirseunaspocasveces,

generandocélulashijasigualesasímismas,ysudiferenciaciónaotrotipocelularnoesposible(3).

Eldesarrolloembrionariocomienzaconlaunióndelasgametasmasculinayfemenina,eventodenominado

fecundación, resultando en la formación del cigoto. Luego de la fecundación comienza el clivaje, que

comprende una serie de rápidas divisionesmitóticas en que el cigoto se divide en célulasmás pequeñas

denominadasblastómeros.Al finalizarelclivajequedaestablecidoelblastocisto,estadioenquesucede la

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primer diferenciación estableciéndose dos tipos celulares: elmacizo interno celular (MCI) y el trofoblasto

(Figura2)(4).

En los estadios pre-implantatorios, el embrión está compuesto por células capaces de generar todos los

tiposcelularesdelorganismoadulto.Estaampliacapacidaddedesarrolloesconocidacomo‘Pluripotencia

Naïve’ (5).Pocoantesdequeocurra la implantación,elMCIsesegregaenundiscoembrionariobilaminar

compuestopordoscapasepiteliales,elepiblasto(dorsal)yelhipoblasto(ventral).Luegodelaimplantación,

lascélulasdelepiblastomuestranunpotencialmásrestringido,denominado‘Primed’(delinglés‘preparar’)

(5).Durantelagastrulaciónseformalabandaprimitivaatravésdelacualmigrancélulasdelepiblastohacia

el interiordelembrión,medianteunprocesodenominado ‘TransiciónEpitelioMesenquimal’ (TEM).Como

consecuenciadeesteprocesosurgentrescapasembrionariascompletamentecomprometidas,endodermo,

mesodermo y ectodermo, que junto con el trofoblasto generaran todos los tejidos embrionarios y

extraembrionarios.

LaderivacióndeCélulasMadreEmbrionariasenmurinos(6,7)yluegoenhumanos(8),permitióestablecer

un tipo celular con capacidad de autorrenovación casi ilimitada y de naturaleza pluripotente, capaz de

diferenciarse y generar derivados de las tres capas embrionarias in vitro (8,9). Debido a esto, las CME se

convirtieron en unmodelo novedosopara el estudio del desarrollo embrionario y una herramienta tanto

para análisis de drogas como para posibles terapias regenerativas. La derivación de CME implica el

aislamiento del MCI de un blastocisto, que es luego cultivado in vitro en condiciones específicas. La

pluripotenciadelaslíneascelularesasígeneradasdependerádelmomentoeneldesarrolloembrionarioen

queseaíslalascélulasdelMCI.Enratonesporejemplo,esposiblederivarlíneasCMEtantoenestadiospre

comopost-implantatorios(10-14).ActualmenteseconsideraquelasverdaderasCMEmurinassonobtenidas

de laderivacióndeestadiospre-implantatorios, las cualesexhibenpluripotencia ‘Naïve’in vitro. Las líneas

obtenidas a partir de estadiospost-implantatoriosmuestranpluripotencia ‘Primed’ y son conocidas como

célulasEpiSC,queaunquesoncapacesdegenerarderivadosdelastrescapasnosoncapacesdecontribuira

laformacióndequimerasinvivocomolasCMENaïve(5).

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Las CME constituyen una herramienta única para estudiar los mecanismos celulares y moleculares que

definenlaespecificacióntisularduranteeldesarrolloembrionario.Esposibleestudiarnumerososaspectos

de la embriogénesis mediante el modelo de cuerpos embrioides (CE). Los CE consisten en agregados

celulares tridimensionales formadosapartirdecoloniasdeCME,ysoncapacesdediferenciarsea las tres

capas germinales a través de un conjunto secuencial de eventos que imitan parcialmente la gastrulación.

Durantelosúltimos20añoslasCMEhandemostradoserungranmodelo invitroquelograrecapitularde

manerafielloseventosqueocurrendurantelaembriogénesis.

8

II.Reprogramación

En 1962 John Gurdon transfirió el núcleo de células del epitelio intestinal de rana a oocitos enucleados,

obteniendo renacuajos normales (15). Esto no solo hirió el modelo reinante que consideraba la

diferenciación como un hecho terminal e irreversible, sino que consistió en el primer ejemplo de

reprogramacióncelulardecélulassomáticas.Utilizandoestemétodo,conocidocomo‘TransferenciaNuclear

deCélulasSomáticas’(SCNTporsussiglaseninglés),hasidoposibleclonardistintasespeciesdemamíferos

(porejemploovinos (16), bovinos (17), caprinos (18),porcinos (19))poniendoenevidenciaque las células

somáticasdemamíferostambiénpuedenserreprogramadas.

Losexperimentosmencionadosdemostraronqueenelcitoplasmadelosoocitosexistenfactorescapacesde

reprogramarcélulasterminalmentediferenciadas.Enelaño2006,KazutoshiTakahashiyShinyaYamanaka

lograron identificar factores de transcripción capaces de reprogramar células somáticas en un método

sencillodereprogramacióndirectaquenorequiereembrionesnioocitos(20).Ensutrabajoseleccionaron

24 genes candidatos que codifican para factores inductores de pluripotencia en células somáticas. Estos

factoresfuerontransfectadosenfibroblastosembrionariosmurinos(MEF)utilizandounsistemaretroviral.

Encontraronquesibienningúnfactoreracapazdegenerarcélulaspluripotentesporsísolo,lacombinación

decuatrodeelloserasuficiente.MediantelainduccióndelaexpresiónexógenadeOct3/4(Octamer-binding

transcription factor 3/4), Klf4 (Kruppel-like factor 4), Sox2 (Sex determining Region Y-box 2) y C-Myc (set

‘OSKM’), lograron generar células madre pluripotentes inducidas (CPI). Luego de la reprogramación, las

células recuperan la capacidad para auto-renovarse y la pluripotencia, pudiendo así dar lugar a todos los

tiposcelularesdeunorganismoadulto(20).Lascélulasreprogramadassonsimilaresenmúltiplesaspectosa

lasCME,incluyendolamorfología,latasadeproliferación,laexpresióndeantígenosdesuperficie,elestado

epigenéticoylaactividaddelaenzimatelomerasa.Además,lasCPIpuedendiferenciarseacadaunodelos

tiposcelularesqueconformanlastrescapasgerminales(21).Deestaforma,losautoreslograrondemostrar

queesposibleinducirelestadopluripotenteencélulassomáticasygeneraruntipocelularmuysimilaralas

CME,aunquenoidéntico(20,21).

Considerandoelcampodelaterapiaregenerativa,resultadifícilpensarenlaaplicaciónagranescaladeCME.

Suobtenciónesmuydificultosa, limitandopor lotantosudisponibilidad.Lautilizacióndeestascélulasen

terapias regenerativas seve limitadadebidoaproblemasdehistocompatibilidadcomosucedehoyendía

con los trasplantes de órganos, sinmencionar los problemas éticos que representa la obtención de estas

célulasennumerosospaísesenelmundo.Dadoquelareprogramacióndecélulassomáticasnoinvolucrala

destrucción de embriones y que sólo se requiere de células adultas diferenciadas (como por ejemplo

fibroblastos, queratinocitos, células de médula ósea o células del epitelio de la mucosa gástrica), esta

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tecnología ha revolucionado el campo de estudio. Las CPI presentan expresión génica, proteica y

modificaciones epigenéticasmuy similares a las CME.Estas características las equiparan a las CME, y por

endesonvistascomosustitutosaccesibles(22).

La reprogramación de células es el resultado de la remodelación de la expresión transcripcional y

epigenéticadeunacélulasomáticahaciaunestadotipo-CME.EstoincluyelareactivacióndelcromosomaX

encélulasfemeninas,lademetilaciónderegionespromotorasdegenesencargadosdeinducirymantenerel

estadopluripotente(porejemploOct4yNanog),yelrestablecimientoanivelgenómicodelatrimetilación

delaslisinas4y27delahistona3(H3K4me3yH3K27me3),marcasepigenéticascaracterísticasderegiones

transcripcionalmenteinactivas.Esentoncesunprocesogradualquepuededemorarvariosdíasosemanas,y

que depende de una cascada de activación de genes de autorrenovación y pluripotencia e inhibición del

compromiso a un linaje determinado. En ratón, por ejemplo, se observó que este proceso requiere

mantener los factoresde reprogramaciónexógenos activospor aproximadamentediezdías,momentoen

que el genoma se encuentra preparado para la conversión a un estado pluripotente. Esto incluye la

reactivacióndegenesendógenosdepluripotencia(Oct4,Sox2,Nanog,etc).Cuandoestoocurre, lasCPIse

tornan independientes de los factores exógenos usados en la reprogramación para mantener el estado

pluripotente(23).

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III.CélulasMadreenAnimalesDomésticos

Con la introducciónde la tecnologíade reprogramacióndirecta, se logróestablecer líneasCPIendistintas

especiesdomésticas(bovinos,equinos,porcinos,caprinos,ovinos)generalmentepartiendodefibroblastos

fetalesyutilizandovectoresviralesparalaintroduccióndelosfactoresnecesariosparalareprogramación.

Estemétodo,entonces,permitióladerivacióndecélulaspluripotentesenespeciesenqueladerivaciónde

CME aún no ha sido posible. Actualmente se cuenta con gran cantidad y variedad de líneas CPI en estas

especies,conpropiedadesdeproliferaciónydiferenciaciónvariables,pocasde lascualescumplencon los

requisitosdeCMEverdaderas(24).

DadoquelasCPIsonmuysimilaresalasCME,representanunafuentepotencialmenteilimitadadecélulas

pluripotentes individuo-específicas que podrían ser usadas en terapias de reemplazo celular con células

autólogas, modelado de enfermedades, screening de drogas e investigación en temas relacionados a la

biologíadeldesarrollo.Actualmenteexisten45trabajospublicadosdescribiendogeneracióndelíneasCPIen

animalesdegranja(17enporcinos,8enbovinos,6enequinos,6encaprinos,4enovinos,4enconejos),

utilizandodistintosmétodosdetransfecciónysetsdefactoresdetranscripción.Estosestudiosdemuestran

que es posible reprogramar células de animales domésticos empleando factores de transcripción ya sean

especie-específico,humanos,murinosounacombinacióndeellos.En lamayoríade loscasoselsetOSKM

fue suficiente para inducir la reprogramación, en algunos casos utilizado en combinación con otros

elementosparaaumentarlaeficienciaylaestabilidaddelaslíneasCPI.

En lamayoría de los casos las células reprogramadas son fibroblastos y se empleamétodos integrativos,

basadosenretro-olentivirusoentransposonespiggyback.LacaracterizacióndelapluripotenciadelasCPI

obtenidas es generalmente determinada por la expresión de marcadores específicos de pluripotencia,

capacidaddediferenciacióninvitroyformacióndeteratomasenratonesinmunodeficientes.

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IV.CélulasMadreenEquinos

Loscaballospresentanunenormevalorcomoanimalesdeportivosydecompañía.Lasaludequinaesunade

lasprincipalespreocupacionespara la industria,yaqueelcostopor lesionesyenfermedadesenanimales

deportivosseestimaen6,5milmillonesdedólaresporañoanivelmundial(25).Las lesionesarticularesy

musculo-esqueléticassonlasmásfrecuentesysóloentreel25y50%delosanimaleslesionadoslogravolver

acompetir(26).Lasopcionesterapéuticasdisponiblesactualmentesólologranproporcionarunasolucióna

cortoplazoyestánasociadasaunaelevadatasaderecurrenciadelesiones(27).Porlotanto,lanecesidad

dedesarrollarnuevasterapiasparaeltratamientodelesionesmúsculoesqueléticasencaballosesevidente.

En este marco, las aplicaciones terapéuticas de las células madre proporcionarían una alternativa para

alcanzarterapiasregenerativasquepermitanlacompletarestauracióndeltejidoadulto.

Encomparaciónaotrasespecies,elcampodelasCMEequinasseencuentraactualmentepocoestudiado.

En 2002 Saito et al lograron aislar la primer línea de células equinas tipo-CME a partir de embriones

criopreservados (28). Más recientemente, en 2006 y 2007 dos grupos establecieron líneas tipo-CME

partiendo delMCI (29, 30). En ambos casos las células mostraron la morfología característica de CME y

fueroncapacesdegenerarderivadosdelastrescapasgerminales.Apesardeestonogeneraronteratomas

alserinyectadosenratonesinmunodeficientes,ynosehaverificadosucontribuciónaquimeras.Debidoa

diferencias en los métodos de marcación, falta de controles y la calidad de las imágenes, aún quedan

preguntaspor responder yno seha logradoun consenso sobrequé caracterizaunaverdadera líneaCME

equina (31). Esta incertidumbre, junto a la dificultad intrínseca de la derivación de CME y los costos

asociados a la recuperaciónde los embrionesnecesarios, limita el usodeCMEen terapias regenerativas.

Másaún,suaplicaciónenestasterapiasseveimpedidaporproblemasdehistocompatibilidad.

En este contexto, el desarrollo de CPI equinas resulta particularmente atractivo. Las CPI eluden los

problemaspresentadosporlasCME,dadoquesucostodeobtenciónesmenor,puedenserexpandidasen

gran cantidad in vitro y diferenciadas a distintos tipos celulares, ya sean progenitores o células

terminalmente diferenciadas. El estudio de CPI equinas es un campo emergente que actualmente sólo

cuentacon6trabajosaescalamundial.En2011NagyetalderivaronlaprimerlíneaCPIequinaapartirde

fibroblastos equinos fetales utilizando el setOKSMy unmétodode transfecciónbasado en transposones

(32). Seguidamente, en 2013 Bretonet al y en 2014 Whitworth et al generaron CPI equinas a partir de

fibroblastosadultosconelsetOSKMymétodosdetransfecciónvirales(retroy lentiviralrespectivamente)

(33,34).Sibienentodosloscasosseestudiólacapacidaddepluripotenciaylaexpresióngénicayproteica

decadalínea,lascaracterísticasdescriptasdifierenentrelíneas,porloquenoexisteunconsensoentrelas

líneas CPI existentes. Más aún, debido a la ausencia de verdaderas líneas CME equinas resulta muy

dificultosoestablecermarcadoresconfiablesquepermitanlacorrectavalidacióndelaslíneasCPIobtenidas.

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CabedestacarquenoexisteenArgentinaningunalíneaequinadeCPI.Porlotantoconsideramosqueesde

sumaimportanciaeldesarrollodenuevastecnologíasquenospermitanexplotarlasventajasdelamedicina

veterinariaregenerativaennuestropaís.

V. HipótesisyObjetivosTeniendoencuentalopreviamenteexpuesto,seevidencialanecesidaddedesarrollarfuentescelularesque

permitanelavancedenuevosenfoquesterapéuticosbasadosentecnologíasdemedicinaregenerativa.Por

lo tanto,elobjetivoprincipaldeeste trabajode tesis fueestableceruna líneaCPIequina, caracterizarlay

validarla.

13

RESULTADOS

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Reprogramación

Paragenerar lasCPIsecomenzópor laproducciónde laspartículas lentivirales.Paraelloseutilizócélulas

HEK293T,lascualesfuerontransfectadasconelplásmidoSTEMCCA(portadordelaregióncodificantedelos

genes humanos OCT4-Klf4-SOX2-cMyc) y los plásmidos empaquetadores PSPAX2 y VSVG utilizando el

reactivodetransfecciónFUGENE.Elvirusfuerecolectadoalas48y72hsposttransfecciónyutilizadofresco

sobrelosfibroblastosequinos.Luegodetresdíaslosfibroblastosinfectadosfueronpasadossobreunacapa

nutriciadefibroblastosmurinosembrionariosinactivadosmitóticamenteporirradiacióngamma(MEFi)yse

comenzó a utilizar el medio KO-DMEM 20% KSR, específico para CPI, con el fin de generar una presión

selectivasobreaquellascélulasquehabíansido transfectadasexitosamente.Durante losprimerosdíasde

cultivoenestascondiciones,lascélulasaúnconservabanlamorfologíacaracterísticadelosfibroblastos,sin

embargosecomenzóaobservaralgunoscambiosmorfológicosprincipalmenteeneltamañodelosnúcleos

(Figura3A).Elsurgimientodelascoloniasseobservóapartirdeldía8post-infección.Lascoloniasdecélulas

pluripotentessecaracterizanporcrecercomounconjuntodecélulascompactasdenúcleosdegrantamaño,

por lo que presentan una relación núcleo/citoplasma elevada, y con bordes definidos (Figura 3B).

Aproximadamente al día 12 post-infección se seleccionó las colonias según sumorfología (Figura 3C). Las

coloniasseleccionadasfueronaisladasmecánicamenteycultivadasindividualmenteenpocillosdeunaplaca

de24pocillosconelfindecultivarcadaclonporseparado.Delos105fibroblastosquefueronplaqueados

paraserinfectadosselogróaislarenpromediodiezcolonias,porloquelaeficienciaestimadadelatécnica

fuedel0,01%.Esimportanteremarcarquemuchasdeestascoloniasnoprogresan,esdecirquenologran

sermantenidasencultivo luegodevariospasajesyaseaporquepierdensumorfología, sucrecimientose

vuelveinestable(dejandecrecerocrecendescontroladamente)omueren.Porlotantopodemosdecirque

este valor refleja la eficiencia de reprogramación parcial. La eficiencia total de esta técnica se estima en

0,001%(20).

Lascoloniasdecélulaspluripotentesnormalmentepresentanunatasadediferenciaciónbasalquesueleser

bajayestarpresenteenlosbordesdelascolonias.LasCPIsuelensermásinestablesdurantelosprimeros

pasajes(Figura3D)(35).Enmuchoscasoslamorfologíadelascoloniascambiadrásticamente,perdiendolas

característicasdecoloniaCPI.Enalgunoscasoslascoloniasperdieronsusbordesdefinidos(Figura3E)y/ose

observó que parte de la colonia se desprende (Figura 3F), lo cual reflejaría que en estos casos la

reprogramación ocurrió de forma incompleta. Estos clones fueron descartados y sólo se utilizó para la

validaciónaquellosclonesquemantuvieransumorfologíaa lo largode lospasajesencultivo.Tambiénse

tuvo en cuenta que la tasa de crecimiento fuera acorde a la que presentan las células pluripotentes (las

célulasnormalmentedebenserpasadascada5-7días).

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Duranteeldesarrollodeeste trabajo se realizóquinceensayosde reprogramación,de los cuales se logró

aislarnoventaclones,muchosdeloscualesnoprosperaron.Generalmenteel75%delascoloniasaisladasen

cada ensayo perdió su morfología 15 días post-infección. Para realizar los ensayos de validación, se

seleccionóunclon,denominadoA5,quemantuvolamorfologíaytasadecrecimientoadecuadadurantelos

sucesivospasajes.EsteclonfuedenominadoA5.

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Validación

I) EnsayodeactividaddeFosfatasaAlcalina

Lascélulasmadreindiferenciadassecaracterizanporexhibirunaactividadelevadadefosfatasaalcalina,que

disminuyemarcadamente amedida que se diferencian. Se comparó la actividad de fosfatasa alcalina de

coloniasdelclonA5enpasaje8ydecélulasdeunclon(denominadoclon2)queperdiólascaracterísticas

morfológicas de CPI (Figura 4). Al analizar la actividad de fosfatasa alcalina de las colonias del clon 2, se

observóunamarcamuytenueconcentradaenpartedelascolonias.EnelcasodelascoloniasdelclonA5,la

tincióngeneróunacoloraciónmásintensaconunadistribuciónmáshomogéneaenlascolonias.Estosugiere

quelascélulasdelclonA5presentanmayoractividaddefosfatasaalcalina.

II) Expresióndemarcadoresdepluripotencia

SeestudiólaexpresióndemarcadoresdepluripotenciaOct4ySox2enlasCPIgeneradas(Figura5).Debidoa

queelplásmidoutilizadoparainducirlareprogramaciónincluyeestosgenes,sediseñóprimersdemanera

talque fueseposibledistinguirentreelARNmprovenientede laexpresióndelplásmido(“ARNviral”)yel

endógeno.ComosepuedeobservarenlaFigura5A,lascélulasdelclonA5enpasajecuatrohansilenciadola

expresióndeOct4viralyhanencendidolaexpresióndeOct4equino.Sinembargo,nohansilenciadoSox2

viralytampocoexpresanaúnlaversiónequina.Enpasajeonce,semantieneelpatrónobservadoparaOct4

yademásseobservalaexpresióndeSox2equino,peroaúnnohansilenciadoSox2viral.Comocontrolesde

la técnica se verificó la expresión de estosmarcadores en los fibroblastos utilizados para reprogramar y

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embriones equinos, en estadio de blastocisto temprano. Se observó que los fibroblastos no expresan

ningunodeestosmarcadores yque losembrionesexpresanOct4peronoSox2, loquepodríadeberseal

estadio embrionario empleado. A su vez, al analizar la expresión de fibroblastos infectados, se observó

expresión de Oct4 endógeno lo que sugiere que su activación sería un evento temprano en la

reprogramación.

Los componentes del medio de cultivo CPI varían según la especie cultivada. La citoquina LIF (Leukemia

InhibitoryFactor)esunacitoquinadelafamiliadelaInterleuquina-6involucradaenlavíadeseñalizaciónde

JAK/STAT3, relacionada al mantenimiento de la pluripotencia y la proliferación (36). Esta citoquina es

suficienteynecesariaparamantenerelestadopluripotenteenCPImurinas,peronoenCPIhumanas.Enel

casodeanimalesdomésticos,lamayoríadelosprotocolosempleanLIFensumediodecultivo,porloquese

quisoestudiarelefectodeestacitoquinaenCPIequinas.Paraello,lascélulasdelclonA5fuerongeneradas

ycultivadasenpresenciadeLIF,yalrealizareltercerpasajesedividióelcultivoparacultivarlascélulasen

presenciayausenciadeLIF.LuegodedospasajesenausenciadeLIFseobservóquelascélulasperdieronsu

morfología, muerte celular y que las células se desprendían de la placa. Al analizar la expresión de los

marcadoresOct4ySox2(Figura5B)seobservaexpresióndeSox2viralenpresenciayausenciadeLIF,pero

lascélulasenausenciadeLIFtienenmenorexpresióndeOct4equino.

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Adicionalmente, se analizó el perfil de expresión demarcadores de pluripotencia de siete clones que no

progresaron,esdecirqueperdieronsuscaracterísticasmorfológicasdecélulasCPI(Figura6).Enestecasose

observa que el perfil difiere en granmedida respecto a lo observadopara el clonA5. A diferencia de las

células del clon A5, todos estos clones ya han silenciado Oct4 y Sox2 exógenos en el segundo pasaje, y

algunos(clones1,3,6,8y9)expresanSox2equino.Aexcepcióndelclon7,todoslosclonesexpresanOct4

endógeno,comoseobservóparaelclonA5.Deestaforma,seobservaqueestossieteclonespresentanun

perfildeexpresióndistintoaldelascélulasdelclonA5.Considerandoqueningunodeestosclonesprogresó,

esposiblequenosehayansucedidoloseventosnecesariosenelordencorrectoparaunareprogramación

exitosa,resultandoenunareprogramaciónincompleta.

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Con el fin de evaluar la expresión de proteínas características de las células pluripotentes se realizó un

ensayodeinmunofluorescenciaenlascélulasCPIgeneradas.Comosemencionópreviamente,estascélulas

crecensobreunacapanutriciadefibroblastosmurinos,loscualesalsercélulasterminalmentediferenciadas

noexpresanestosmarcadoresy,porlotanto,actúancomocontrolnegativodentrodelamismamuestra.

ComoseobservaenlaFigura7A,lascélulasdelclonA5expresanlosmarcadoresOct4,Sox2yNanog.Enel

casodeOct4ydeSox2seobservaquelamarcadelanticuerpocorrespondienteseencuentraúnicamenteen

lascélulasdelascolonias,mientrasquelascélulasmurinasestánmarcadassóloporlatincióndesuADNpor

DAPI.ConsiderandoqueseutilizólosgenesdeOct4ySox2parainducirlareprogramación(enamboscasos

lahomologíadesecuenciaequina/humanaessuperioral90%),losresultadosdelasPCRdemarcadoresde

pluripotenciayqueenesteensayoseutilizócélulasenpasaje8,noesposibleidentificarsilaexpresiónde

Sox2identificadacorrespondeala inducidaexógenamente.EnelcasodeNanog,seobservaclaramentela

marca concentrada en la colonia, pero también se observa unas células MEFi positivas. Sin embargo,

tambiénseobservacélulasMEFiquesonpositivasparaDAPIynegativasparaNanog,locualindicaquese

tratadeunamarcainespecífica,debidaprobablementealaconcentraciónutilizadadeanticuerpoprimario.

Porotrolado,serealizóunamarcacióndeOCT4enembrionesequinosenestadiodeblastocistotemprano

comocontrolpositivo(Figura7B-C).

Enconjuntoestosresultados indicanque lascélulasdelclonA5expresan losmarcadoresdepluripotencia

Oct4,Sox2yNanog,yquehansilenciadolaexpresióndelostransgenescuyaactividadfuereemplazadapor

laexpresiónendógena.

20

21

III) Diferenciacióninvitro

Comosemencionoenlaintroducción,unadelascaracterísticasdelascélulaspluripotenteseslacapacidad

deoriginarderivadosdelastrescapasembrionarias.ParaevaluarestacapacidadsesometiólasCPIdelclon

A5aunprotocolodediferenciación invitroenpresenciadesuerofetalbovinocomoagentediferenciante.

Para ello las colonias fueron cultivadas por 5 días en suspensión, tiempo en el cual adquieren una

conformaciónesféricadenominada‘CuerpoEmbrioide’(CE)debidoasusemejanzaalosprimerosestadios

del desarrollo embrionario (Figura 8A). Los CE son luego adheridos en placas pre-tratadas con gelatina y

cultivadospordossemanasmás.Comosemuestraen laFigura8B,adía6seobservaelCEadheridoa la

placa, caracterizado por células compactas, del cual se originan células demorfología muy distinta a las

coloniasdecélulasindiferenciadas.Eneldía9nosedistinguefácilmenteelCEyseobservagrancrecimiento

de las células (Figura 8C).Durante la segunda semanade cultivo se puededistinguir células con distintas

morfologías,característicasdediversostiposcelulares,principalmentecélulasconmorfologíamesenquimal

(Figura8D-F).

22

Conelfindeanalizarlacapacidaddegenerarderivadosdelastrescapasgerminales,seestudióelperfilde

expresión del cultivo de CE al término de veinte días, a excepción de T/Brachyury. Dado que este es un

marcador demesodermo temprano, presentamáxima expresión entre los días cuatro y cinco de cultivo

coincidenteconlaespecificacióndelmesodermo,porloqueseevaluósuexpresiónalquintodíadeiniciada

ladiferenciación.ComoseobservaenlaFigura9,seobservóexpresióndeSox17,marcadordeendodermo

(37) y T/Brachyury e Islet-1, marcadores de mesodermo (38,39). Sin embargo, no se pudo observar

expresiónde losmarcadoresdeectodermoNestina (40)yPax6 (41)peseahaberobservadoenel cultivo

célulasconmorfologíatipo-neural.Apesardeesto,losresultadosobtenidosindicanquelascélulasdelclon

A5poseencapacidaddediferenciarseygenerardistintostiposcelulares.

23

IV) Cariotipo

OtrocriteriodevalidacióndeCPIgeneralmenteempleadoeselanálisisdesucariotipo.Enestosensayosse

evalúa la aparicióndeposibles rearreglos cromosómicos causadospor la inducciónde la reprogramación.

ParaanalizarelcariotipodelosfibroblastosutilizadosenlareprogramaciónydelascélulasdelclonA5,se

contóconlacolaboracióndelLaboratoriodeBiotecnologíadel‘InstitutodeInvestigaciónsobreProducción

AgropecuariaAmbienteySalud’delaFacultaddeCienciasAgrariasdelaUniversidaddeLomasdeZamora.

Alanalizarelcariotipodelosfibroblastosfetalesempleadoselmismorevelóquesóloel28%delascélulas

presentaba64cromosomas,elnúmerocromosómicocaracterísticodeequinos(Figura10A).De lascélulas

restantes,el64%presentóunnúmerocromosómicoinferioryel8%presentóunnúmeromayor.Asuvez,se

analizóelcariotipodecélulasequinaspertenecientesaunahembraenpiecomocontroldelmétodo.Eneste

casoelcariotiporesultónormal(Figura10B).SibienseintentóanalizarelcariotipodelascélulasdelclonA5,

estono fueposibledebidoaproblemas técnicos.Apesardeesto, se consideraqueprobablementeestas

células también posean un cariotipo anormal. Esto explicaría las dificultades experimentadas tanto en la

derivacióndeCPIcomoenlageneracióndeCEyenlaimplementacióndelcultivoensuspensión.

24

DISCUSIÓN

25

Durantelosúltimosañosel interésenlamedicinaregenerativahacrecidoenormemente.Sehaempleado

numerosasestrategiasconelfindehallareltipocelularmásadecuadoparaemplearenaplicacionesclínicas,

entreellas la identificaciónydiferenciacióndeprogenitorestejidoespecíficooladiferenciaciónadistintos

tiposcelularesapartirdeCME.ElsurgimientodelasCPIabriólaspuertasaldesarrollodecélulaspaciente-

específicas,marcandounpuntode inflexiónenel campode las terapias regenerativas.Deesta forma, el

tratamientodeenfermedadesdegenerativasmedianteterapiasdereemplazocelulardejódeserunautopía,

ycomenzóaserconsideradocomounaposibilidadconcreta.

EnelpresentetrabajodeTesishemosgeneradoCPIequinasennuestrolaboratorioapartirdefibroblastos

dérmicos(Figura3).LainduccióndelaexpresiónexógenadelosgenesOSKMencélulassomáticasequinas

generócoloniasdecélulasconmorfologíacaracterísticadecélulasmadre.Sinembargo,luegodeaislarestas

coloniasmuchasdeellassufrieroncambiosmorfológicos,principalmente lapérdidadecompactaciónyde

bordes definidos en las colonias, diferenciación y muerte celular. Considerando que sólo el 25% de las

colonias seleccionadas fue capaz de mantener su morfología inicial, esto indica que el proceso de

reprogramación no ha culminado al momento de la selección. Es importante remarcar que el criterio

morfológico empleado se basó principalmente en la morfología de líneas CME humanas y murinas. Este

criteriotambiénfueempleadoporotrosautoresparalaseleccióndeCPIequinas.Nagyetal(32),Bretonet

al (33) y Whitworth et al (34) describen sus colonias como compactas, con bordes definidos y elevada

relaciónnúcleo/citoplasma, locualconcuerdacon lamorfologíade lascoloniasdescriptasenestetrabajo.

Hastalafechanosehareportadoelestablecimientodeunalíneadecélulasmadreequinasembrionariasy

solo existen escasos reportes de líneas CPI por lo tanto existe la posibilidad que el criterio de selección

basadoenlamorfologíaempleadoeneltrabajonohayasidoelóptimo.

Laelevadaactividaddelafosfatasaalcalinaseasociacontiposcelularespluripotentes.Sehaobservadoque

a medida que se va restringiendo la pluripotencia su actividad decae (42). Los ensayos de actividad de

fosfatasaalcalinarealizadosenestetrabajomostraronelevadaactividadenzimáticaparalascélulasdelclon

A5,evidenciadoporlacoloraciónintensa(Figura4).Alensayarlascélulasdeunclonquenoprogresóenel

cultivo (clon 2), la coloración observada fue mucho más tenue y no uniforme dentro de las colonias,

indicandomenoractividadenzimática.EstosugierequelascélulasdelclonA5seencuentranenunestado

másindiferenciadoqueelclon2.Análogamente,laslíneasCPIequinasreportadasporotrosgrupos(32-34)

tambiénpresentanactividadelevadadefosfatasaalcalina.

Elmodelodecinéticadereprogramaciónactualconsideratresetapasenelproceso.Laprimera,‘Iniciación’,

implica una transición mesénquimo-epitelial que se traduce en un cambio en el fenotipo y la firma

26

transcriptómica celular. La siguiente fase es denominada ‘Maduración’, caracterizada por la expresión de

ciertosmarcadoresdepluripotenciacomoOct4,NanogySall4.Finalmente,enla‘Estabilización’seinducela

expresión de marcadores de pluripotencia silenciados anteriormente, como Sox2, Pecam y DppalV.

Adicionalmente, sehaobservadoqueelpasajede la fasedemaduraciónaestabilizaciónrequiereque las

células adquieran la capacidad de sustentarse en ausencia de los factores exógenos. Esto se traduce en

encenderunaredregulatoriaespecíficaquedifieredelanecesariaparamantenerelestadodepluripotencia.

En conjunto, si bien se considera una adquisición secuencial de la pluripotencia, muchas células quedan

bloqueadas en alguna de estas etapas (35). Esto se correlaciona con lo observado en los ensayos de

validación del clon A5. En primer lugar, al analizar el perfil de expresión génica (Figura 5A), se observó

expresión de Oct4 endógeno y silenciamiento de Oct4 exógeno en pasaje 4. A su vez, en pasaje 11 se

observó expresión tanto de Sox2 endógeno como del exógeno. Sorprendentemente, se observó que la

expresión de Oct4 endógeno pudo ser detectada en los fibroblastos 4 días post infección (previo a la

aparición de cambios morfológicos), por lo que esto constituiría un evento muy temprano en la

reprogramación. Por otro lado, al analizar la expresión de estos genes en células de siete clones que no

progresaronencultivo,seobservóquetodospresentanunperfildeexpresióndistintoaldelascélulasdel

clonA5(Figura6).Másaún,todosloscloneshabíansilenciadolosgenesexógenosyalgunosyaexpresaban

Sox2 endógeno.Debido a que las colonias de estos clones no fueron capaces demantener lamorfología

adecuada en el tiempo, es probable que los eventos de la reprogramación hayan ocurrido en un orden

incorrecto,causandounareprogramaciónincompleta.Estosugierequelosprimeroseventosqueocurrenen

lareprogramaciónsonlaexpresióndeOct4endógenoyelsilenciamientodeOct4exógeno,mientrasquela

expresióndeSox2endógenoseríauneventotardío.Asuvez,laexpresióndeambosSox2sugierequeelclon

A5 no ha finalizado el proceso de reprogramación por completo o bien se encuentra bloqueado.

Similarmente,en los trabajospresentadosporWhitwhorthetal yBretonetalseestudió laexpresiónde

diversosgenes,comoOct4,Sox2,Nanog,TERT,Rex1yLin28,paracaracterizarelestadopluripotentedesus

líneasdeCPI.Enamboscasostambiénseobservóexpresiónpersistentedegenesinducidosexógenamente.

EnelcasodeWhitwhorthetaltodoslosclonesseleccionadosexpresabanOct4exógenoenpasaje25yuno

de ellos también presentaba expresión de Sox2 exógeno (34). Breton et al, por otro lado, seleccionaron

cuatroclonesdeloscualesdospresentabanunaexpresiónpersistentedeOct4exógenoy,losotrosdos,de

c-Mycexógeno(33).Estosresultadostambiénsugierenquelareprogramaciónnosehacompletadoobien

quehasidobloqueada.Deesta forma,esposibleque losmétodosdereprogramaciónactualesdebanser

modificadosparalograrinducirelestadopluripotenteenequinosexitosamente.Adicionalmente,alestudiar

lainfluenciadelacitoquinaLIFenelcultivodelclonA5,seobservóqueenausenciadeLIFlaexpresiónde

Oct4 endógeno disminuyó. Esto, junto a los cambios morfológicos observados, sugiere que LIF estaría

involucradaenelmantenimientodelapluripotencia,yenlaexpresiónsostenidadeOct4.Ladependenciade

27

LIF para elmantenimiento de la pluripotencia en equinos también fue observada anteriormente. Existen

trabajosquedescribenlapérdidadelamorfologíatípicadecélulamadrealquitarestacitoquinadelmedio

decultivo(32-34).

Al analizar la expresión de marcadores de pluripotencia mediante ensayos de inmunofluorescencia, se

observóexpresióndeOct4,Sox2yNanog.Sinembargo,dadoqueseutilizó losgenesdeOct4ySox2para

inducir la reprogramación no es posible identificar si la proteína detectada es la endógena o la exógena.

Considerandolosresultadosdeexpresióngénica,esprobablequeenelcasodeOct4setratedelaproteína

endógena,yaqueseutilizócélulasenpasajeochoyseobservósilenciamientodeOct4exógenoenpasaje

cuatro. Enel casode Sox2, sinembargo, esposibleque sehayadetectadoambasproteínas, dado que la

expresióndeARNprovenientedelplásmidoaúnesdetectadaencélulasdepasajeonce.Paralatincióncon

NanogseobservóunamarcaclaramenteconcentradaenlacoloniaCPI.DadoqueNanognofueutilizadoen

la inducciónde lareprogramación,esto indicaquese logró inducir laexpresióndemarcadoresendógenos

de pluripotencia y, por ende, encender redes de señalización relacionadas al estado pluripotente. Es

importante remarcar que en el caso de la marcación con Nanog se observó que algunas células

pertenecientesa lacapanutriciapresentaronunamarcapositiva.Dadoquenosecuentaconanticuerpos

primarios específicos que reconozcan las proteínas equinas que se desea marcar, se debió utilizar

anticuerposcomercialesquedetectanlasproteínashumanas.Debidoaesto,yapesardelahomologíade

secuencias entre ambas especies, no se observó señal al utilizar concentraciones bajas de anticuerpo

primario (1:400-1:100), por lo que fue necesario emplear lamáxima concentración posible (1:50). Por lo

tantoesprobablequelamarcaobservadaparalosfibroblastosmurinosseainespecíficaysedebaalaalta

concentración de anticuerpo primario que fue necesario emplear. Estos resultados coinciden con lo

observadoporotrosautoresquetambiénhanrealizadoinmunomarcacionesparavalidarsusCPIequinas(32,

34).EnestostrabajossepudoobservarexpresióndeOct4,NanogySox2juntoaotrasproteínasutilizadas

comomarcadoresdepluripotenciaenmurinos,comoSSEA1,SSEA4,TRA1-60yTRA1-80.Seconsideraque

losmarcadores de pluripotencia de CMEdeberían ser proteínas que sólo se expresen en aquellas células

correspondientesalMCI, sinembargo laexpresióndemuchosde losmarcadoresempleadosactualmente

varíaentrelasdistintasespecies.Porejemplo,SSEA1(stage-specificembryonicantigen1)seexpresaenCME

murinas pero no en humanas, Oct4 es específico del MCI en murinos pero se expresa en MCI y

trofoectodermoenotrasespecies(humanos,bovinos,caprinos,porcinos).Nanogesespecíficodelepiblasto

pluripotentemurino,perodefineelMCIenembrioneshumanosyestáausenteenlaformacióndelepiblasto

yMCIporcino.EnequinosenparticularsehareportadoexpresióndeOCT4,SSEA1,SSEA3,SSEA4,TRA-1-60

yTRA-1-81enMCIy trofoectodermo,yexpresióndeNanogenventanastemporalesquecoincidencon la

especificacióndelepiblasto (42).Estasdiferenciasprobablementesedebanaqueexistendiferenciasenel

28

desarrolloembrionarioentrelasespecies,porloquelaexpresióngénicatambiéndifiere.Deestaforma,no

es posible analogar marcadores de pluripotencia entre especies, sino que deben ser definidos

específicamente para cada una de ellas. Actualmente aún no existe consenso sobre cuál es el perfil de

expresiónquedefineunacélulapluripotenteequina.

PararealizarlosensayosdediferenciacióninvitroseempleóunprotocolobasadoenlaformacióndeCEyse

los expuso a suero fetal bovino como agente diferenciante. Al término de veinte días se logró distinguir

distintostiposcelulares,principalmentecélulasconmorfologíamesenquimaloneural(Figura8).Dadoque

lamorfologíadeestostiposcelularesdistadeaquelladelasCPIydelosfibroblastos,estoindicaríaquelas

célulasdelclonA5soncapacesdegenerardistintostiposcelulares.Paravalidaresteresultado,seevaluóla

expresión de genes característicos de las tres capas germinalesmediante ensayos de PCR. Se observó la

expresión génica del marcador de endodermo Sox17 y de los marcadores de mesodermo Islet-1 y

T/Brachyury. Sin embargo, a pesar de haber observado células con morfología neural no se observó

expresióndelosmarcadoresdeneuroectodermoPax6yNestina(Figura9).Valeaclararqueseexperimentó

ciertasdificultadesalquererimplementarelprotocolodediferenciaciónenestalíneadecélulasequinas.Los

CE no siempre se formaban correctamente y en la mayoría de los casos sufrían gran perdida de células

conformeavanzabaelcultivoensuspensión.Aúnexistepocainformaciónsobrelosrequisitosnutricionales

delmediode cultivosparaCPI equinas loqueevidencia lanecesidaddeponer apunto losprotocolosde

diferenciación invitro. Losreportesdeotrosgruposdescribenprotocolosmuyvariables,convariantesen

susmediosdecultivo(distintostiposyproporcióndesuero)ytiemposdecultivoensuspensión(decinco

días(32)aseissemanas(34)),sinembargoentodosloscasoslograronidentificarderivadosdelastrescapas

germinales.Lasdificultadespresentadastambiénpuedensersíntomadeunareprogramaciónincompletalo

quelimitaríalacapacidaddeestascélulasdediferenciarsecorrectamente.

ParagenerarcélulasCPIsepartiódefibroblastosfetalesequinos,obtenidosdeunamuestradeunfetoque

habíasidogeneradoporclonaciónycuyagestaciónfueinterrumpidaporunabortoinducido,debidoaque

presentabaproblemasrelacionadosconelcierredelalíneamediaventral.Estainformaciónfuedenuestro

conocimientounavezqueyasehabíaobtenidolasCPI.Porellodecidimosrealizarunanálisisdecariotipode

las células originantes. Éste análisis reveló que el 64% de las células analizadas presentó un número

cromosómicomenora64,elcaracterísticodeequinos,el8%presentóunnúmeromayoryel28%restante

resultó normal (Figura 10). Si bien se intentó analizar el cariotipo de las células del clon A5, esto no fue

posible por causas que exceden a nuestro laboratorio, por lo que estamos a la espera de un resultado

definitivo. Sin embargo, consideramos que es altamente probable que estas células también posean un

cariotipoanormal.Estopodríaexplicarenpartelagrandificultadquepresentólareprogramacióndeestas

célulasyporqué,aunqueelclonA5fueelquemayorescualidadesdeCPIreuníaencomparaciónalrestode

29

los clones generados, aún presenta deficiencias como la pobre diferenciación. Actualmente nos

encontramos adaptando las CPI a un cultivo sin capa nutricia para facilitar el análisis del cariotipo y

generandolíneasdeCPIapartirdefibroblastosadultosconcariotiponormal(Figura10B).

Duranteeltranscursodeestetrabajo,logramosinducirlaformacióndeunalíneadeCPIenunaespeciepara

la cual el campo de estudio es aún muy reciente. Debido a la falta de protocolos establecidos

experimentamosdiversos inconvenientesal intentaradaptarprotocolosempleadoscomúnmenteenotras

especies como humanos omurinos. Pese a esto logramos generar una línea de células CPI partiendode

fibroblastos fetalesequinosmediante la transfeccióndeunvector lentiviral con los genesOSKM. La línea

celular aquí estudiada presenta características asociadas a las células pluripotentes, tales como su

morfología,laexpresióndemarcadoresdepluripotencia(tantoARNcomoproteínas),elevadaactividadde

laenzimafosfatasaalcalinaycapacidaddediferenciarseadistintostiposcelulares.Deestaforma,yapesar

de las limitaciones mencionadas, hemos logrado establecer exitosamente líneas de CPI equinas con

características similares a las descriptas en la bibliografía. Estas líneas podrán, en un futuro cercano, ser

aplicadas en el desarrollo de terapias de medicina regenerativa o bien en investigación relacionada al

desarrollo embrionario, resultando beneficiosas tanto para la medicina veterinaria como para la

investigaciónbásica.

30

MATERIALESYMÉTODOS

31

CélulasUtilizadas

I. FibroblastosEquinosFetales(FEF)

Los fibroblastos equinos fetales fueron derivados a partir de una biopsia de un embrión generado por

clonacióncuyagestaciónfueinterrumpidaporunabortoespontáneo.Paraellosecolocólabiopsiaenuna

placa de cultivo conmedio DMEM 10% SFB (ver apartado ‘Condiciones de Cultivo’) de forma tal que se

adhiriera. Se mantuvo el cultivo aproximadamente una semana. Los fibroblastos equinos fetales fueron

gentilmentecedidosporCrestviewGenetics.

II. HEK293T

LascélulasHEK293TfueronprovistasgenerosamenteporellaboratoriodelDr.DiegoÁlvarez.

III. FibroblastosEmbrionariosMurinos(MEF)

Se obtuvo ratones hembra de 12 a 13 días de preñez de la cepa CD1 del Bioterio del Instituto de

Investigaciones Biotecnológicas de la Universidad Nacional de SanMartín (IIB-UNSAM), los cuales fueron

sacrificadospordislocacióncervical. Enun flujo laminarvertical se limpióel abdomenconetanol70%, se

ingresóalacavidadperitonealyremovióloscuernosuterinos,quefueroncolocadosenunaplacadePetriy

lavadosconPBS.Luegoseseparólosfetosdelaplacentaydelasmembranasfetales,seloscolocóenuna

segunda placa de Petri y lavó con PBS. Seguidamente fueron decapitados y eviscerados bajo lupa

estereoscópica,pasandoeltejidoremanenteaunanuevaplacadePetridondefuelavadoconPBS.Eltejido

sedisgregóprimeromecánicamenteconhojasdebisturíy luegomedianteelagregadode10mililitrosde

Tripsina-EDTA0,25%(Gibco)yseincubódurante40minutosa37°Cen5%CO2hastaqueeltejidoestuviera

completamentedisgregado.Eltejidoprocesadofuetransferidoauntubocónicode50mlconmedioDMEM

10%SFBysedejódecantarparaluegorecuperarelsobrenadante.Elsobrenadanteobtenidofuedivididoen

XbotellasdecultivoT75(siendoX=NúmerodeEmbrionesObtenidos/3), llevandoelvolumenfinala20ml

conmedioDMEM10%SFB. Las células obtenidas fueron cultivadas a 37°C en5%CO2durante 2 a 3 días

hasta obtener confluencia, para luego ser amplificadas o criopreservadas. Para poder usarlas como capa

nutricia,fuenecesarioinactivarlasmitóticamente,paralocuallosfibroblastosfetalesfueronirradiadoscon

80Gyde radiacióngamma, servicioprovistopor la empresaCEBIRSAS.A. (Centrode Irradiación, FitzRoy

2455,CiudadAutónomadeBuenosAires,Argentina).Finalmente,secontólascélulasirradiadas(MEFi)yse

criopreservódea1,5x106célulasporcriotubo.

32

CultivoCelular

I. CondicionesdeCultivo

Los fibroblastos (tanto FEF como MEF) fueron cultivados en medio DMEM alta glucosa (GIBCO)

suplementado con 10% v/v de suero fetal bovino (GIBCO), L-glutamina 2mM, aminoácidos no esenciales

2mM y penicilina-estreptomicina 50 U/ml (medio de cultivo ‘DMEM 10% SFB’). Los mismos fueron

mantenidosencultivohastaquesealcanzaraun80%deconfluencia, luegode locualfueronamplificados

y/ocriopreservados.

LascélulasCPIyCPIputativasfueroncultivadasenmedioKO-DMEM(Gibco)suplementadocon20%v/vde

KSR (KnockOut Serum Replacement, Gibco),β-mercaptoetanol 55uM (Sigma), L-glutamina 2mM (Gibco),

aminoácidos no esenciales 2 mM (Gibco), penicilina-estreptomicina 50 U/ml (Gibco), 8 ng/ml de bFGF

(Invitrogen) y 1,000U/ml LIF (Invitrogen) (medio de cultivo ‘KO-DMEM20%KSR’). Elmedio de cultivo se

cambiódiariamente.

Elcultivodecuerposembrioides(CE)fuerealizadoenplacasbacteriológicasdePetriconmedioDMEMalta

glucosa (Gibco) suplementadocon20%v/vdesuero fetalbovinoHyClone(GEHealthcareLifeSciences), L-

glutamina 2 mM (Gibco), aminoácidos no esenciales 2 mM (Gibco), penicilina-estreptomicina 50 U/ml

(Gibco)(mediodecultivo‘DMEM20%HyClone’).Elmediodecultivosecambiódíapormedio.

Entodosloscasos,lascélulasfueroncultivadasa37°Ccon5%CO2.

II. Criopreservacióndecélulas

Paralacriopreservacióndefibroblastosprimeroseremovióelmediodecultivo,selavóconPBSyseincubó

conTripsin-EDTA0,25%(Gibco)porunosminutosa37°Cen5%CO2paradesprenderlascélulas.Luegode

inhibirlaenzimaconmedioDMEM10%SFB,lasuspensiónresultantefuetransferidaauntubocónicoyse

centrifugó5minutosa1300rpm.LascélulasfueronresuspendidasenmedioDMEMsuplementado20%SFB

y 10% DMSO (Sigma), que fue agregado lentamente mezclando suavemente, como criopreservante. Los

criotubos(Corning)fueroncolocadosenundispositivoMr.Frosty(ThermoScientific)conisopropanol,elcual

permiteundescensocontroladode la temperaturaa razónde1°Cporminuto,queestuvo24hsa -80°Cy

luegofuerontransferidosauntanquedenitrógenolíquido.

Para descongelar las células, los viales fueron removidos del tanque de nitrógeno líquido y rápidamente

calentadosa37°Cenunbañotérmico.Inmediatamentesetransfirióelcontenidoauntubocónicocon10ml

33

deDMEM10%SFB.Secentrifugólasuspensióndurantecincominutosa1300rpm,sequitóelsobrenadante

yseresuspendióelpelletenDMEM10%SFBysesembrólacélulasenunabotellaoplacacorrespondiente.

III. Cultivodecélulasreprogramadas

LasCPIfueronmantenidasenestadoindiferenciadocultivándolassobreunacapanutriciadeMEFi.

La capa nutricia fue plaqueada sobre una placa de cultivo pre-tratada con gelatina bovina 0,1% (Sigma)

duranteunahora,alcabodelocualsedescongelóunvialdeMEFi,yseplaqueólascélulasrepartiendolas

mismasdemaneraequitativaentrepocillos.Luegoseagitólaplacacincominutosysedejó24hsa37°Cen

medioDMEM10%SFB.

PararealizarelpasajedecélulasCPI,primeroseremovióelmediodecultivoyserealizóunlavadoconPBS,

luegoseagregócolagenasatipoIV1mg/ml(Gibco).Sedejóactuarentrecincoydiezminutosa37°C,ohasta

quelosbordesdelascoloniasempezaranasepararsedelacapanutricia.LuegoseagregómedioKO-DMEM

20% KSR para diluir la enzima, se desprendió por completo las colonias de la placa suavemente con una

pipetaautomática,ysetransfirióelvolumentotalauntubocónico.Finalmentesecentrifugócincominutos

a 1300 rpm, se resuspendió el pellet suavemente en medio KO-DMEM 20% KSR y se plaqueó

equitativamente sobre la capa nutricia de MEFi en medio KO-DMEM 20% KSR cuidando que queden

fragmentosdetamañoregular.LasCPInormalmentefueronpasadascada5a7díasenunarelación1:3.

Preparacióndeplásmidos

I. Transformacióndebacteriascompetentes

SetransformóbacteriasEscherichiacolicompetentesmedianteshocktérmicoa42°Cdurante90segundos

con 25 a 50 ng del plásmido a amplificar. Luego se incubó las bacterias enmedio LB líquido (10 g/L de

PeptonadeCaseína,5g/LdeextractodeLevadura,10g/LdeclorurodeSodio)sinantibióticodurante30

minutosa37°Cenagitación.SeplaqueólasbacteriasenplacasdePetriconteniendoLB-agar(medioLBcon

15g/Ldeagar)ampicilina(0,1ng/ml),yselasdejóa37°Cdurante16hs.Finalmenteseseleccionóalgunas

colonias,apartirdelasqueserealizómini-cultivos(50ml)enLB-ampicilinaa37°Cpor16hsenagitación.

II. Midi-Preparacióndeplásmidos

Apartirdelosmini-cultivosenLB-ampicilinaserealizóunamidi-preparaciónconelMidiPrepKit(Promega),

siguiendo las instrucciones del fabricante. Partiendo del cultivo, primero se precipitó las bacterias por

centrifugacióna5000gpor10minutos,selasresuspendióylisó,conlassolucionesderesuspensiónylisis

incluidasenelkit,mezclandoporinversiónyseincubó3minutosatemperaturaambiente.Luegoseagregó

34

lasoluciónneutralizante,mezclóporinversiónyseesperólaformacióndeunfloculado.Acontinuaciónse

colocóunacolumnadentrodeuntubocónicode50ml,seagregóallíel lisadoyse incubódosminutosa

temperaturaambiente, luegode locualsecentrifugóporcincominutosa1500gconel findeclarificar la

suspensión.Enunnuevotubode50mlsecolocóuna‘ColumnadeUnión’(delinglés‘BindingColumn’)ala

queseagregóelfiltradoysecentrifugónuevamente.Seagrególasoluciónde‘RemocióndeEndotoxinas’,

secentrifugónuevamenteysedescartóelfiltrado.Despuésseagregóalacolumnala‘SoluciónLavadode

Columnas’,secentrifugódosvecesdescartandoelfiltradoenamboscasosysedejóescurrirlacolumnaen

papel.Finalmenteserealizólaelución,paralocualsecolocólacolumnaenunnuevotubo,seagregóagua

libredenucleasasysecentrifugócincominutosa2000g.

El filtrado resultante fue colectado, se agregó 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M (pH= 5,2) y 2,5

volúmenesdeetanol95%ysedejó15minutosenhielo.Porúltimo,secentrifugó15minutosa14000rpm,

selavócon70%etanolyseresuspendióelpelletenagualibredenucleasas.Sedeterminólaconcentración

delADNplasmídicoaisladomedianteunespectofotómetroNanoDropOne(Thermofisher).

ReprogramacióndeFibroblastosEquinosFetales(FEF)

I. ConstruccionesVirales

SeutilizóunvectorlentiviralpHAGE-STEMCCA(gentilmentedonadoporelDr.GustavoMostovlasky)enque

seencuentranclonadas lassecuenciasde losgeneshumanosOct4,Sox2,Klf4yc-Myc,quecodificanpara

factores de transcripción cruciales para la determinación y mantenimiento del estado pluripotente. Para

generar las partículas virales se realizó una co-transfección de este plásmido junto a los vectores

empaquetadoresPSPAX2(AddgenePlásmido#12260)yelvectorENV(Addgene#12259)utilizandoFUGENE

(Roche) como agente de transfección. Esto fue realizado en células HEK293T plaqueadas sobre placas de

cultivo pre-tratadas con poli-L-lisina (Sigma) durante 30 minutos en una densidad de 7x105 células por

pocillode9,5cm2.Enunacabinadebioseguridadvertical,serecolectóelsobrenadanteviral48y72hspost-

transfección, este fue clarificadomediante centrifugación a 3000 rpmdurante 10minutos a temperatura

ambiente.Finalmente,elsobrenadanteviralfueutilizadofrescosobrelosfibroblastosareprogramar.

II. MétododeReprogramación

Se plaqueó FEF (105 células por pocillo de 9,5 cm2)en medio DMEM 10% SFB. Luego de 24hs fueron

infectadosconel sobrenadanteviralclarificado.Para favorecer la infección, juntoal sobrenadanteviral se

agregóPolybrene (8ng/µl,Sigma)y secentrifugó40minutosa700g.Luegode tresdías lascélulas fueron

transferidasaunco-cultivosobreunacapanutriciaMEFiutilizandoTryPle(Gibco),ysecambióelmediopor

eldecélulaspluripotentesinducidas(KO-DMEM20%KSR).Enestepasajelascélulasfuerondiluídas1:5.

35

SeestimalaaparicióndecoloniasCPIputativasaproximadamentealdía8postinfección.Lasmismasfueron

identificadasmorfológicamente (8,9), aisladasmecánicamente con una aguja bajomicroscopio óptico en

unacabinadeseguridadbiológica,disociadasyamplificadasdemaneraclonogénicaenpocillosde1,9cm2

sobreunanuevacapanutriciaMEFienmedioKO-DMEM20%KSR.Luegode3o4pasajesmecánicos, las

célulasfueronpasadasenzimáticamenteutilizandoColagenasaIV(Sigma-Aldrich).

ValidacióndelaslíneasCPI.

I. EnsayodeActividaddeFosfatasaAlcalina(FA)

Paraevaluarlaactividaddelaenzimafosfatasaalcalina,seutilizóelKitdeActividaddeFA(Sigma).Primero

se preparó una solución con Fast Red Violet, Naftol y H2O (proporción 2:1:1), que vira a un color rojo-

violáceoenpresenciadeFAactiva.SeincubóestasoluciónsobreunaplacaconCPIpor15minutos,luegode

locualselavóconPBSysevisualizólareaccióncolorimétrica.

II. Expresióngénicademarcadoresdepluripotencia.

PreparacióndeARNtotal

Separtiódecélulascrecidasaconfluencia,quefueronremovidasdelaplacadecultivoconcolagenasatipo

IV(Gibco),pasadasauntuboeppendorfycentrifugadasa1500rpmpor5minutos.Serealizólaextracción

de ARN utilizando Trizol (Thermofisher), según las indicaciones del fabricante. Luego de resuspender las

célulasenTrizol,serealizóunaextracciónconcloroformo(J.T.Baker), seprecipitóelARNconisopropanol

(Sintorgan).Finalmenteselavóconetanol75%yresuspendióenagualibrederibonucleasas.Sedeterminó

laconcentracióndelARNaisladomedianteunespectofotómetroautomáticoNanoDropOne(ThermoFisher).

Retrotranscripción

Para latranscripciónreversaseutilizó1µgdeARNtotal, oligodT500µg/mly dNTPs1mM.Seutilizó la

retrotranscriptasa SuperScript III (Thermofisher) siguiendo el protocolo indicado por el fabricante.

Brevemente,lapreparación(sinlaenzima)fuellevadaa65°Cdurante5minutosenlatermocicladorapara

lograr la desnaturalización del ARN. Luego, para evitar la renaturalización, lasmuestras fueron colocadas

inmediatamente en hielo durante cinco minutos, seguidamente se agregó FS Buffer y DTT y se llevó 2

minutos a 42°C. Finalmente se agregó 0,5µl de la enzima SuperScript III y se colocó nuevamente en la

termocicladora bajo el siguiente programa: 50minutos a 42°C para que ocurra la retrotranscripción y 15

minutosa70°Cparainactivaralaenzima.Lasmuestrasfueronalmacenadasa-20°Chastasuutilización.

36

PCR

La reacción de PCR se realizó en un volumen final de 25 µl. Se utilizó la enzima ADN polimerasa TaqPol

(Thermofisher)siguiendolasinstruccionesdelfabricante.PortubodePCRsecolocó2,5µldeBufferdePCR,

1µldeMgCl250mM,0,5µldeunamezcladelos4deoxinucleótidostrifosfato(dNTPs)10mM(dATP,dGTP,

dCTPydTTP)(Thermofisher),2,5µldeprimerforward10µM,2,5µldeprimerreverse10µM,0,2µldela

ADNpolimerasaTaqDNAPolimerasa5U/µl (Invitrogen) y 2µl deADNcopia, completandoel volumena

25µlconagualibredeDNAsas.

SeutilizóelsiguienteprogramadePCR:

1.Desnaturalizacióninicialyactivacióndelapolimerasa:5minutosa94°C.

2.DesnaturalizacióndelADNmolde:30segundosa94°C

3.Apareamiento:30segundosa55°C

4.Extensión:1minutoa72°C

5.ExtensiónFinal:5minutosa72°C

Lospasos2a4fueronrepetidosen35ciclos

En loscasosde lasmuestrasdeembrionesequinosydediferenciaciones invitro,seutilizó laenzimaADN

polimerasa HotStar (Quiagen), siguiendo las instrucciones del fabricante. Para cada reacción se utilizó un

volumenfinalde25µlcompuestospor12,5µldeHotStarTaqMasterMix,1µldeprimerforward10µM,1µl

deprimerreverse10µMy2µldeADNcopiaparalasmuestrasdeembrionesy5µlparalasdediferenciación

invitro,completandoelvolumenconagualibredeDNAsas.

SeutilizóelsiguienteprogramadePCR:

1.Desnaturalizacióninicialyactivacióndelapolimerasa:15minutosa95°C.

2.DesnaturalizacióndelADNmolde:30segundosa94°C

3.Apareamiento:30segundosa55°C

4.Extensión:1minutoa72°C

5.ExtensiónFinal:10minutosa72°C

Lospasos2a4fueronrepetidosen35ciclos

LassecuenciasdelosprimersutilizadosseencuentrandetalladasenlaTabla1.

37

III. CaracterizacióndelInmunofenotipo

Enlosensayosdeinmunomarcaciónsefijólascélulasconparaformaldehído4%m/v(Sigma)por45minutos

yserealizótreslavadosde5minutoscadaunoconunasolución0,1%deseroalbúminabovina(BSA,Sigma)

enPBS.LuegosepermeabilizóybloqueólascélulasconunasolucióndeBSA10%tritónX-1000,1%(Sigma)

enPBSdurante45minutos.SeremoviólasoluciónyserealizótreslavadosconPBSconunasolución0,1%

BSA en PBS. Para la inmunomarcación se incubó las células con el anticuerpo primario en una solución

compuestaporBSA10%enPBSdurantedoshorasa temperaturaambienteo4°Cduranteunanoche.Se

lavótresvecesporcincominutosconunasolucióndeBSA0,1%enPBS.Luegoseincubólascélulasdurante

45minutos conel anticuerpo secundario correspondiente conjugadoa fluoróforos enunadilución1:400.

Para teñir los núcleos se utilizó 4-6-diamidino-2-fenil-indol (DAPI, Sigma) 200 ng/ml, por 15 minutos.

FinalmenteserealizótreslavadosconBSA0,1%enPBSdecincominutosyseagregóunvolumenadecuado

dePBS.LosanticuerposutilizadosseencuentrandetalladosenlasTablas2y3.

Elanálisisde lasmuestrasserealizóutilizandounmicroscopio invertidodefluorescenciaOlympusFV1000

equipadoconunlaserHe-Ne543nm,controladoporelsoftwareFV10-ASW.

IV. Diferenciacióninvitro.

Paragenerarcuerposembrioides (CE) se trató lascoloniasdeCPIconColagenasa tipo IV1mg/ml (Gibco)

durantetresacincominutosparalograrsepararlasdelacapanutriciadeMEFi.Secolectólascoloniasenun

tubocónico,selasdejódecantaryselasresuspendiósuavementeenmedioDMEM20%HyClone.Luegose

transfiriólascoloniasaunaplacabacteriológicadepetrinoadherenteyselascultivódurantecuatrodíasen

suspensiónparapermitirlaformacióndelosCE.Elmediodecultivofuerenovadocada48hs.Enelquinto

díaseadhirió losCEenplacasdecultivopre-tratadascongelatinabovina0,1%(Sigma)ysecultivóquince

díasmás.

V. EvaluacióndelCariotipo.

Seevaluóel cariotipode los fibroblastos empleadospara reprogramar y de las CPI obtenidas, lo cual fue

realizadoporelLaboratoriodeBiotecnologíadel Institutode InvestigaciónsobreProducciónAgropecuaria

AmbienteySaluddelaUniversidadNacionaldeLomasdeZamora(IIPAAS,FCA-UNLZ).

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Tabla1:SecuenciasdeoligonucleótidosempleadoscomoprimersenlasreaccionesdePCR

Tabla2:Anticuerposprimariosutilizadosenlasinmunomarcaciones

Tabla3:Anticuerpossecundariosutilizadosenlasinmunomarcaciones

Anticuerpo Fluoróforo Especie Marca NúmerodeCatálogo

Anti-IgGcabra AlexaFluor488 Burro Invitrogen A11055

Anti-IgGratón AlexaFluor488 Cabra Invitrogen A11001

Anti-IgGconejo AlexaFluor568 Cabra Invitrogen A11011

TranscriptoBlanco PrimerForward(sentido) PrimerReverse(antisentido)

OCT4Equino ATTGAGACCCGAGTGAGAGG CTGATCTGCTGCAGTGTGG

SOX2Equino CACCCACAGCAAATGACAGC TTTCTGCAAAGCTCCTACCG

GAPDHEquino CATCATCCCTGCTTCTACTGG TCCACGACTGACACGTTAGG

OCT4Viral TCAAGCCTCAGACAGTGGTTC TGGAAGCTTAGCCAGGTTCG

SOX2Viral TGGCTCTCCTCAAGCGTATT CAGCTCCGTCTCCATCATGTTA

Sox17Equino CATGGTGTGGGCTAAGGACG TGTAGTTGGGATGGTCCTGC

T/BrachyuryEquino CGCCTTGGAAAGTCCTGAGT TGCCAGTGGAATTAGAGCCG

Islet-1Equino CGCCTTGGAAAGTCCTGAGT TGCCAGTGGAATTAGAGCCG

NestinaEquino CCCGAAGCTGGAGCTACATT GGGCTCAGGACAGAAAGCAA

Pax6Equino CCAGTATAAGCGGGAGTGCC GTAACTGAGCGTGGGCTTCT

Anticuerpo Especie-Tipo Marca NúmerodeCatálogo

Oct3/4 ratón-monoclonal SantaCruz Sc-5279

Sox2 Cabra-policlonal SantaCruz SC-17320

Nanog Conejo-monoclonal CellSignaling 4903S

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BIBLIOGRAFÍA

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AGRADECIMIENTOS

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Enprimerlugarquieroagradeceralautodenominado‘ReproTeam’delIIB-UNSAM.AAdriánporabrirmelaspuertas de su laboratorio y brindarme la oportunidad de realizar este trabajo de tesis allí. A Caro enparticularporguiarmeconpacienciaenesteproceso,compartiendosuconocimientoeintroduciéndomeeneste vasto mundo de células madre, inconscientemente despertando mi interés por un área que antesdesconocía.Tambiénalaschicasdelgrupo,Clau,Mica,Maga,Clari,Bren,Vicky,ViviyMica(2),porsiempreescucharmeyaconsejarme,hacerqueiral laboratoriotodoslosdíasseaunaexperiencialindaydivertida,tenersiempreunmatepreparadoy,principalmente,porencontrartodaslasrazonesposiblesparafestejarconalgunatorta(obizcochitosensudefecto).Quieroahoraagradeceramiscompañerosdecursada,alallamada‘LámparadeArquímedes’,Aldi,Ax,Celes,Fleer, Flor,Guada,Hora, Santi y Seba,porhacerque las interminableshorasde cursada y estudio fuerantolerables, también por las fondue, paellas y otras excusas para juntarnos y engordar, y por intentarapasiguarmipánicoantesdecadaexamen(opeoraún:unseminario).Porotrolado,quieroagradeceraFloyOjos,‘LasNormales’,quienescompartenelrestodemilocura,quesiempre tuvieron un gesto o palabra de apoyo, aunquemuchas veces no entendieranmucho de qué leshablaba. A ‘Rolling Chickens', Geor, Pac,Misu, Chibi, Curi y Fran, que aunque ya no nos juntemos tantosiempreesunbuenmomento.Finalmente a mis padres, Oscar y Susana, que sin querer queriendo me acercaron a la biología y meempujaronparaquepudieracumplirmismetas.