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células pluripotentes induzidas (iPS’s)

Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012

Licenciatura em Biologia Humana

2º Ano (4º Semestre)

Ano Letivo 2011/2012

Elaborado por:

Maria Ferreira nº 27496

Mariana Ascensão nº 27756

Júri:

Prof. Fernando Capela

Prof. Paulo de Oliveira

“Stem Cells”

Células indiferenciadas

Diferenciar em

células

especializadas

Autorrenovar

2 Fontes

Embrião

Tecidos adultos

De acordo com o tipo de células que

podem gerar dividem-se em:

Totipotentes

Pluripotentes

Multipotentes

Oligopotentes

Unipotentes

“Stem Cells”

Figura

1 –

“Ste

m c

ells

” plu

ripote

nte

s

“Stem cells” pluripotentes derivadas

artificialmente de células não-

pluripotentes pela indução de uma

manifestação “forçada” de certos genes

Não são obtidas a partir do embrião,

mas sim de células diferenciadas

Células iPS

Yamanaka (2006) – 1ª vez que se geraram

iPSCs a partir de fibroblastos de ratinhos

Foram isolados 4 genes essenciais para a

produção de “stem cells”

Yamanaka (2007) – descobriu que:

Nanog um dos principais determinantes da

pluripotência celular

c-Myc é oncogénico

História das células iPS

Yamanaka (2007) – transformou fibroblastos

humanos em células iPS’s

Hochedlonger (2008) - utilizou um

adenovírus para transportar os 4TF para o

DNA de célula da pele e fígado de ratinhos

Yamanaka (2008) - concluiu que

se poderiam transferir os 4 genes

necessários com um plasmídeo

História das células iPS

Figura 2 - Yamanaka

Freed (2009) – demonstrou outra

vantagem do adenovírus

Morrisey (2011) – usou microRNAs,

melhorando a eficiência da

reprogramação

História das células iPS

Células para reprogramação:

Eficácia, período de tempo e extensão da

reprogramação varia conforme as células

iniciais

Tecidos da medula óssea são uma fonte de

“stem cells”

Produção de células iPS

Cirurgia invasiva e dolorosa

Produção de células iPS

Figura3 – Indução de iPSC’s

Produção de células iPS

Geração de iPSCCélulas Adultas

Células adultas podem ser reprogramados para um estado

pluripotente pela expressão “forçada” de alguns fatores

embrionários de transcrição

Eficiência da produção extremamente

baixa

Se forem usados vírus poderá haver

alteração genética das células e a

expressão de oncogenes pode ser

acionada

iPSC’s são tipicamente derivadas por

transfecção de certas células

Produção de células iPS

Exemplo: Fibroblastos

O estado de diferenciação da célula alvo

influencia a sua suscetibilidade para a

reprogramação e para o potencial de

diferenciação das iPSC’s daí derivadas

Stem cells de músculo de rato

reprogramam com maior eficiência que as

suas células filhas mais diferenciadas

(mioblastos e fibroblastos)

Influência do estado de diferenciação das células

depende

Reguladores transcricionais cruciais

envolvidos no processo de indução, cuja

ausência torna impossível a indução

Oct-3/4

Sox2

Genes de indução

Genes utilizados para a indução

Geração de iPSC’s

Fatores adicionais para ↑ eficiência da

indução:

Klf4

c-Myc

Nanog

LIN28

Genes de indução

oncogénico

Células Adultas

Transferência dos 4TF,

exceto c-Myc

Processo: + lento - eficaz Não se desenvolve cancro

Células iPS

Oct-3/4

Papel crucial na manutenção da pluripotência

Ausência → conduz à diferenciação

Sox2

Semelhante ao Oct-3/4 → mantém pluripotência

Expresso em “stem cells” pluripotentes e

unipotentes

Klf4

fator capaz de gerar células iPS

Genes de indução

c-Myc

Mostrou-se desnecessários para a geração de iPSC’s humanas

Oncogene → por isso o seu uso é preocupante

Nanog

Necessário para promover pluripotência

Poder de renovar “stem cells”

Ausência → rápida diferenciação

Desnecessário para a indução

LIN28

Fator de geração de iPSC’s

Desnecessário

Genes de indução

Proteína supressora de tumores

Principal inibidora da geração de células iPS

Liga-se diretamente ao promotor do Nanog

para suprimir o seu nível de expressão

p53

Inicia-se a diferenciação de “stem cells” em células

adultas Deleção do gene p53 ↑ eficiência de

geração de iPSCs em 1000x

Proteínas envolvida na geração de células

iPS humanas

Possui 2 promotores alternativos:

TAp73 funções semelhantes à p53

DNp73 inibe o p53 e o p73 ↑a expressão

Nanog

p73

pode ↑ eficiência da geração de iPSC’s humanas

células geradas com a sua expressão são +

resistentes à diferenciação (in vitro e in vivo)

Os 2 promotores da p73 têm papéis

opostos

Lin et al descobriu que a adição do

gene humano de DNp73 ↑ a geração de

iPSC’s

DNp73

Condições basais:

• Oct-3/4

• Sox 2

• Klf4

• c-MycCondições

basais +

DNp73

Gráfico 1 – Colónias de iPSC humanas

Contribui diretamente para a expressão

do Nanog e do Oct-3/4

DNp73

Manutenção da pluripotência

Gráfico 2 – Expressão de fatores de transcrição

Até 2009, todos os métodos

desenvolvidos envolviam a utilização de

materiais genéticos

Proteínas recombinantes

Possibilidade de ocorrerem

modificações genéticas

Tumores

Hongyan et al

Utilizaram proteínas recombinantes capazes de

reprogramação celular piPSC’s

Hongyan et al

Proteínas recombinantes

piPSC’s

Autorrenovam-se

Pluripotentes in vitro e in vivo

Evitam introdução de modificações

genéticas

piPSC’s

Foram criadas em ratinhos

Indistinguíveis das “stem cells”

embrionárias

Exigem métodos de aperfeiçoamento

Representa um avanço em relação aos

outros métodos Vantagens

Proteínas recombinantes

Vantagens:

Elimina o risco de modificar o genoma da célula-

alvo Oferece um método para gerar iPSC’s +

seguras

Confere uma abordagem + simples e + rápida

Poderia potencialmente permitir a aplicação de

uma metodologia de reprogramação mais ampla e

mais económica produção de proteína

recombinantes em larga escala

Proteínas recombinantes

Obstáculos

Reduzido número de células

Falta de metodologias simples

Custos

Rendimento

Inserção genómica

Rejeição Imunológica

Teratomas

Vetores Alternativos

Plasmídeos – evita vírus, necessita de

oncogenes e é menos eficiente

Adenovírus – não incorpora os seus

genes no hospedeiro alvo e necessita de

pouco tempo de apresentação

Proteínas recombinantes

Semelhanças entre iPSC’s e ‘stem cells’

Propriedades celulares biológicas:

Morfologia – forma redonda, nucleótidos grandes e citoplasma escasso

Propriedades de crescimento – tempo de duplicação e atividade mitótica

Marcadores de stem cells - iPS humanas expressam os marcadores

específicos para hESC, incluindo SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-

2-49/6E e Nanog

Genes de ‘stem cells’ – Oct-3/4, Sox2, Nanog, GDF3, REX1, FGF4, ESG1,

DPPA2, DPPA4 e hTERT

Atividade da telomerase – hESCs expressam alta atividade de telomerases

para sustentar a autorrenovação e proliferação e assim como as iPS

Plutipotência:

Diferenciação neural – iPS diferenciadas em

neurónios, expressando βIII-tubulina, tirosina

hidroxilase, AADC, DAT, Chat, LMX1B e MAP2

Diferenciação cardíaca – iPSC diferenciadas em

cardiomiócitos

Formação de teratomas

Quimeras de ratinhos

Complementação tetraploide

Semelhanças entre iPSC’s e ‘stem cells’

Vantagens e desafios das iPSC’s

Grande plasticidade celular

Não geram riscos de rejeição imune

Possibilidade de modelos de doenças in vivo

Possibilidade de reparação de doenças por

mutações

A eficácia de indução de iPSC’s é muito baixa

dando origem a células insuficientemente

reprogramadas

Medicina personalizada

A tecnologia das iPS tem potencial para avançar com a terapia médica personalizada, a medicina regenerativa e criar novos modelos de doenças humanas para pesquisa e testes terapêuticos

Uso de iPSC’s para a terapia de doenças incuráveis: produção de células adultas específicas para cada paciente e doença específica

Medicina personalizada

O transplante de órgãos exige disponibilidade de tecidos e tratamento com imunossupressores

As iPSCs humanas poderiam ser induzidas nos tipos de células desejados e seriam geneticamente compatíveis com o paciente

Surgiram discussões sobre o fornecimento de terapias celulares em humanos, nomeadamente para pacientes com doenças debilitantes e distúrbios neurológicos – Questão ética

Um futuro aberto

É necessário superar a barreira que está

entre a eficiência e a integração genómica.

Caracterização proteómica de iPSC’s.

Uso de iPSC’s para identificar fármacos

terapêuticos capazes de resgatar um

fenótipo.

Por exemplo, linhas de células iPS derivadas de pacientes afetados pela síndrome de displasia ectodérmica (CEE), onde o gene p63 está mutado, exibem um compromisso epitelial anormal que poderia ser parcialmente resgatado.

Potenciais aplicações das iPSC’s

Modelação de doenças

Descoberta de fármacos

Terapia genética

Terapia de substituição/reprogramação

Terapia para o Parkinson

Terapia para reparação cardíaca

Terapia para reparação hepática

Estas técnicas de geração de células iPS

são revolucionárias pois, anteriormente

só se podiam obter células pluripotentes

a partir do embrião e agora, é possível

obtê-las a partir de células adultas.

A eficiência das iPSC é muito baixa

células insuficientemente rerogramadas

Conclusões

A utilização de vírus pode levar a

alterações genómicas

Reguladores transcricionais cruciais

envolvidos no processo de indução, cuja

ausência torna impossível a indução

Importante descoberta para a terapêutica.

Conclusões

FIM

Lin et al. DNp73 improves generation

efficiency of human induced pluripotent stem

cells. BMC Cell Biology. 2012; 13:9

TAN, Kah Yong et al. Efficient Generation of iPS

Cells from Skeletal Muscle Stem Cells. PLoS

ONE. Outubro 2011; vol. 6

ZHOU, Hongyan et al. Generation of Induced

Pluripotent Stem Cells Using Recombinant

Proteins. Cell Press. Maio 2009

Biografia

Fonte das imagens

Figura 1 - “Stem cells” pluripotenes em http://dererummundi.blogspot.pt/2008/03/clulas-estaminais-e-expresso-gnica.html

Figura 2 – Yamanaka em http://www.gladstone.ucsf.edu/gladstone/site/publicaffairs/content/1/648

Figura 3 – Indução de iPSC’s em http://en.wikipedia.org/wiki/File:Induction_of_iPS_cells.svg

Gráfico 1- Colónias de iPSCs humanas em Lin et al. DNp73 improves generation efficiency of human induced pluripotent stem cells. BMC Cell Biology. 2012; 13:9

Gráfico 2 - Expressão de fatores de transcrição em Lin et al. DNp73 improves generation efficiency of human induced pluripotent stem cells. BMC Cell Biology. 2012; 13:9