GENÉTICA HUMANATEMA 8 : GENÓMICA HUMANA – TERAPIA GÉNICA – FARMACOGENÉTICA/GENÓMICA

SECUENCIACIÓN DEL GENOMA HUMANO- ‐ Descubrimiento e implicaciones:

- ‐ Secuenciación del genoma humano completada finalmente en 2003.- ‐ Aceleración en el descubrimiento de genes.- ‐Número de genes: entre 20 mil y 25 mil. Se ha visto que el número de genes es algo irrelevante. Lo importante, en términos de información relevante para la salud, es la interacción entre genes (y el ambiente), la epigenética y la expresión génica, etc.- ‐Genoma humano: número de genes es de alrededor de 1/5 del número de proteínas. La diferencia: un exón puede ser parte de más de un gen (un gen, más de una proteína). El exoma, que era el foco de atención de proyecto de secuenciación del genoma humano, es ahora sólo una pequeña parte de la información total.

- ‐ Es decir, que un mismo transcrito primario del ADN, por el procesamiento alternativo de intrones y exones (splicing) puede generar distintas proteínas.

- ‐ Tres primeros genomas secuenciados:- ‐ Bastantes variantes compartidas y también muchas individuales

- ‐ Proyecto de los 1000 genomas: - ‐ Catálogo de la diversidad genética humana a nivel mundial (unos 2.500 participantes de todos los continentes).- ‐ Variación en el genoma humano (solamente las variaciones que tienen una frecuencia superior al 1%):

- ‐ Más de 15 millones de SNPs.- ‐ Alrededor de 1 millón de indels.- ‐ Unas 20 mil variantes estructurales.- ‐ En general: alrededor del 1% de variabilidad máxima del genoma en humanos.

- ‐ Genómica comparada. A medida que se secuencian los genomas de muchos otros organismos.- ‐ Genoma del chimpancé también secuenciado: 5% de diferencias con el humano

- ‐ Encode: - ‐ Secuenciar 1% del genoma para descubrir la función y el papel de cada gen, y ver diferencias de expresión en 92 estirpes celulares diferentes.- ‐Gran porcentaje del genoma se transcribe, pero no se traduce, y ese porcentaje está involucrado en el control de la expresión del genoma.

- ‐ Exoma: - ‐ Secuencias de DNA que se transcriben en RNA y que acaban traduciéndose en proteínas (1,5% del genoma).- ‐ Exoma: conjunto de los 180 mil exones del genoma humano.-‐ Hoy en día ya se puede secuenciar exoma a precios muy bajos (700-‐1.000 euros).

- ‐ La era de los ‘omas’: Proteoma, transcriptoma, secretoma (proteínas secretadas por la célula), lipidoma (genes y proteínas que participan en la síntesis o catabolismo de los lípidos), microbioma (genoma de los microorganismos en nuestro cuerpo), kinoma, etc.

MEDICINA PERSONALIZADA- ‐ Secuenciación personal del genoma:

- ‐ Utilidad: ¿para qué sirve hoy en día secuenciarse el genoma?- ‐ Por ejemplo, Stephen Quake, un hombre de 40 años sano, sabe que tiene varias variantes genéticas comunes y raras para padecer enfermedades cardiovasculares.

- ‐ Portador de hemocromatosis, epidermolisis bullosa y déficit de biotinidasa (todas ellas enfermedades recesivas).- ‐ Propenso a desarrollar trombos y también diabetes. Sensible a estatinas para bajar el colesterol, insensible a clopidogrel para trombos (tendría que tomar warfarina).

- ‐ Le costó 50 mil dólares y cuatro semanas secuenciar su genoma (los dos primeros genomas costaron 10 años y 3 mil millones de dólares).- ‐ ¿Cómo interpretar la información que da el genoma entero? Esta información es muy difícil de interpretar de momento (excepto la de enfermedades mendelianas).

- ‐ A la mayoría de nuestras enfermedades contribuyen también los factores ambientales.- ‐ A medida que se descubren nuevas variantes puede cambiar el significado de otras ya conocidas.

- ‐ Utilidad clínica de las variantes de predisposición: Ejemplo de la variante del gen APOE E4 y Alzheimer.- ‐Heterocigotos para la variante E4 tienen tres veces más posibilidades que la población general de tener Alzheimer, sobre todo porque parece que la edad de comienzo se adelanta unos 15 años con respecto a los demás.- ‐ Homocigotos para E4: riesgo 20 veces mayor que la población general. Puede aparecer hasta 25 años antes que en la población general.- ‐ El test genético de APOE entonces no te dice mucho sobre un individuo (mucha gente tiene la variante E4 y no tiene Alzheimer).

- ‐ Alrededor de un 2% de la población general es homocigota para el alelo E4.- ‐ Todavía hay menos de un 25% de posibilidades de que siendo homocigoto para el alelo E4 tengas Alzheimer. Poco valor predictivo y falta de utilidad clínica en individuos asintomáticos.

- ‐ Además, saber la propensión no ayuda a prevenir la enfermedad (no hay opciones terapéuticas).- ‐ Los clínicos sólo usan este test para valorar casos en los que ya existen síntomas o signos de demencia senil

- ‐ Útil para decidir si la enfermedad es realmente Alzheimer.- ‐ Si se descubriera una manera de prevenir o tratar el Alzheimer antes de que apareciera: el test genético sería muchísimo más útil.

- ‐ Productos de consumo: - ‐ Ya existen empresas que venden directamente a los consumidores este tipo de servicios:

- ‐ Secuenciación de tu genoma.-‐ Tu predisposición a padecer 50-‐60 enfermedades complejas.- ‐ Análisis de ancestralidad (contribución de diferentes poblaciones o pueblos a tu genoma, etc)- ‐ Etc.

- ‐ Problemas de rigor científico y de interpretación de los resultados (de momento ‘venden humo’).

TERAPIA GÉNICA- ‐ Medicina molecular:

- ‐ La medicina molecular se encarga de diagnosticar, interpretar y tratar enfermedades desde el punto de vista de las moléculas alteradas, deficientes o acumuladas.-‐ Para enfermedades genéticas mendelianas, la medicina molecular puede sustituir o reemplazar la proteína o enzima dañada con una administración directa (por ejemplo, administrar el factor de coagulación VIII en la hemofilia, o administración de enzimas en déficits enzimáticos), con un trasplante de células u órganos, o por terapia génica.

- ‐ Método de la terapia génica: - ‐ Introducción deliberada de material genético en células somáticas con propósitos diagnósticos, terapéuticos o profilácticos.- ‐ Introducción en las células de un individuo con un gen o genes dañados, mediante un vector, de una versión ‘corregida o sana’ de dicho gen o genes.- ‐ Los primeros ensayos de terapia génica empezaron en 1990, y no se ha conseguido prácticamente nada hasta hace unos 4-‐5 años. Se ha mostrado muy difícil de aplicar.- ‐ Sólo se ha conseguido curar dos formas de inmunodeficiencia combinada severa. Aunque otros tratamientos parece que van a surgir en relativamente poco tiempo (leucemias agudas)- ‐ Riesgos: ha habido 4 muertes de pacientes en ensayos clínicos de terapia génica en los últimos 14 años.- ‐ Acuerdo o consenso científico y social universal: no terapia génica germinal (los cambios introducidos pasarían a la descendencia). Moral y éticamente inaceptable.

- ‐ Vectores virales: - ‐ Se utilizan diferentes tipos de virus con el gen normal insertado en sus genomas como vectores para infectar las células.- ‐ Retrovirus. No son tóxicos para la célula y el DNA que lleva es muy estable (hasta 80 kb de inserto).

- ‐ Limitación: su DNA sólo se integra en la célula cuando ésta se divide

- ‐ Adenovirus: Se pueden obtener fácilmente en mucha abundancia e infectan prácticamente todo tipo de células.

- ‐ Pero pueden causar fuerte respuesta inmune (una muerte reportada)

- ‐ Virus adenoasociados: No causan ningún tipo de efecto adverso y son bien tolerados. Infectan todo tipo de células.

- ‐ Pero aceptan fragmentos de DNA o insertos pequeños, solamente de 5 kb máximo.

- ‐ Métodos no virales: lisosomas. -‐ No existe reacción inmune. Y además, el fragmento o inserto que se puede introducir es una secuencia muy grande de DNA, incluso con varios cientos de kbs.- ‐ Pero tampoco se produce buena transferencia génica (el porcentaje de DNA que se transfiere del lisosoma al núcleo es bajo, por degradación de dicho DNA por parte del mismo lisosoma); y la expresión del DNA foráneo es bastante transitoria (el tratamiento ha de repetirse).

- ‐ Tipos: la transferencia de la copia normal del gen a las células dañadas puede realizarse:- ‐ in vivo : administrarle el vector con el gen corregido dentro del cuerpo.- ‐ ex vivo: fuera del cuerpo, utilizando cultivos celulares del paciente.

- ‐ Inconvenientes: - ‐Bajos niveles de expresión (niveles subterapéuticos porque sólo un pequeño porcentaje de genes se insertan en el núcleo celular), o efectos transitorios o temporales. Regulación del gen insertado (puede que no se exprese, gen insertado al azar).

- ‐ También debido a metilación de DNA foráneo por parte de la célula.- ‐ Dificultades para alcanzar la célula diana. Por ejemplo neuronas.- ‐ Difícil la regulación precisa de los niveles de proteína alcanzados.

- ‐ En algunas enfermedades esto es muy importante (por ejemplo, en talasemias y las cadenas de alfa y beta-‐globinas).

- ‐ Mutagénesis por inserción. La integración en el genoma celular es impredecible y esa inserción puede inactivar un gen esencial.

- ‐ Parece ser un evento muy raro, pero se ha visto que ha ocurrido en varios pacientes.- ‐ Respuesta inmune adversa en contra del virus/vector.

FARMACOGENÉTICA Y FARMACOGENÓMICA- ‐ Fundamentaciones:

- ‐ Algunos individuos son especialmente sensibles a los efectos de un fármaco en particular, mientras otros son muy resistentes.- ‐ En algunos casos esta variación no es el resultado de factores genéticos: por ejemplo, efecto de la morfina en niños, ancianos y pacientes con enfermedades hepáticas.- ‐ Sin embargo, en muchos otros casos las diferencias en respuesta a distintos fármacos sí están determinadas genéticamente.

- ‐ Farmacogenética : describe la influencia de los genes en la eficacia y los efectos secundarios de los fármacos. Es decir, estudia las diferencias entre individuos en la respuesta farmacológica, debidas a la variación alélica en genes que afectan al metabolismo, eficacia, toxicidad de los fármacos.

- ‐ Farmacogenómica: es la aproximación o enfoque genómico de la farmacogenética. Describe la interacción entre los fármacos y el genoma (múltiples genes). En lugar de analizar genes individuales y sus variantes, se determina un perfil genómico con gran número de genes polimórficos, y se analizan sus alelos y variantes para averiguar si un perfil genómico específico responde bien o mal a uno o varios fármacos.

- ‐ Sin embargo, los dos términos normalmente se usan indistintamente, y no parece existir una definición específica y consensuada de cada uno de ellos.

- ‐ Reacciones adversas: - ‐ Se estima que en Norteamérica y Europa, alrededor de un 15% de los pacientes en Hospitales se han visto afectados por reacciones adversas a medicamentos, y éstas son responsables del 5% de las admisiones hospitalarias.- ‐Una comparación entre los fármacos más frecuentemente implicados en reacciones adversas y las enzimas metabolizantes con polimorfismos conocidos reveló que la mayoría de los fármacos con frecuentes efectos adversos eran también los mismos que eran metabolizados por enzimas con variantes polimórficas conocidas.- ‐ Los conocimientos en farmacogenética son importantes para intentar predecir las respuestas de diferentes pacientes a un fármaco y así, limitar la aparición de reacciones adversas.- ‐ La reacción de cada persona a sustancias químicas naturales o sintéticas está determinada, en parte, por sus polimorfismos genéticos en genes implicados en las vías de transformación o metabolización de esas sustancias.- ‐ Estudios genéticos que determinen esos polimorfismos asociados a la variación del metabolismo de fármacos nos permitirán predecir mejor la respuesta de una persona a un fármaco determinado, y reducirá la incidencia de efectos secundarios y reacciones adversas.

GENES IMPORTANTES EN FARMACOGENÉTICA

- ‐ Citocromo P450 (CYP): - ‐ El citocromo P450 humano es una gran superfamilia de 56 enzimas funcionales diferentes, cada una codificada por un gen CYP diferente, implicadas en el metabolismo de multitud de fármacos. Están presentes en prácticamente todos los seres vivos (en total, se conocen unos 11 mil genes CYP presentes en diferentes organismos).- ‐ Estas enzimas participan en el metabolismo de un gran número de sustancias exógenas (no producidas en el interior del cuerpo: compuestos xenobióticos).- ‐ Seis genes en particular (CYP1A1, CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 y CYP3A4) son muy importantes en farmacogenética porque codifican seis enzimas responsables del 90% de los fármacos usados comúnmente.

- ‐ Además, son extremadamente polimórficos, con distintos alelos que tienen consecuencias funcionalessobre la capacidad de respuesta a los fármacos en diferentes individuos.

- ‐ Los genes CYP pueden tener alelos que producen aumento, disminución o ausencia total de actividad enzimática, y por tanto afectan a la velocidad con la que muchos fármacos son metabolizados.- ‐ Por ejemplo, CYP2D6 presenta 26 alelos diferentes, con mutaciones puntuales disminuyendo la actividad enzimática; mutaciones de splicing o de cambio de pauta de lectura (frameshift) anulando la actividad; y alelos con variación de número de copias (en los que el gen está presente en varias copias – dos, tres, cuatro o más – en un mismo cromosoma) que aumentan los niveles de la enzima.

-‐ Diferentes combinaciones de las cuatro clases de alelos (wild-‐type, aumento, disminución,ausencia) son las que producen los diferentes niveles cuantitativos de actividad metabolizadora de la enzima.- ‐ Aunque a efectos prácticos, sólo tres o cuatro fenotipos son generalmente reconocidos:

- ‐ metabolizador normal o extensivo- ‐ metabolizador intermedio- ‐ metabolizador lento- ‐ metabolizador ultrarrápido.

- ‐ Lo que se persigue al fin y al cabo: medicina personalizada, con dosis óptimas de fármacos a cada paciente según su genotipo o fenotipo.- ‐ Importante también en la aplicación de la farmacogenética en la medicina personalizada: presencia de metabolizadores lentos y ultrarrápidos varía en diferentes poblaciones.

- ‐ UGT1A1: -‐ Irinotecan es un alcaloide con potentes propiedades antitumorales, ya que inhibe la DNA topoisomerasa, necesaria para la replicación del DNA. El gen UGT1A1 codifica una glucuronato transferasa que glucuronida el irinotecan y lo hace más fácilmente excretable a través de la bilis.- ‐ Existe un polimorfismo de repetición en tándem A(TA)nTAA en la TATAA box del promotor del gen UGT1A1. Lo normal es que haya seis TA (alelo *1).

-‐ Si hay siete, una variante bastante común (alelo *28), el promotor funciona muy defectuosamente, y se reduce la transcripción del gen y los niveles de actividad de la enzima.- ‐ También hay alelos más raros con cinco repeticiones que transcriben con mayor facilidad el gen, y por tanto tienen niveles superiores de enzima…- ‐ y con ocho repeticiones, que reducen la expresión del gen todavía más que el de siete.

- ‐ Los heterocigotos de siete repeticiones, y sobre todo los homocigotos (*28/*28), con tratamiento quimioterápico con irinotecan, tienden a presentar niveles mucho más altos de toxicidad debida a dicho fármaco.

- ‐ TPMT: -‐ Los fármacos 6-‐mercaptopurina y 6-‐tioguanina se usan en casos de leucemias infantiles y en otros casos

para inducir inmunodepresión. El gen TPMT codifica una enzima que se encarga de detoxificar estos fármacos.- ‐ Tres mutaciones puntuales frecuentes en el gen TPMT hacen que la enzima no funcione correctamente y estos dos fármacos tarden más en metabolizarse y se queden a concentraciones más altas.-‐ Paradójicamente, esto hace que los pacientes homocigotos o heterocigotos para estas mutaciones (10% en población caucásica) estos fármacos a veces sean más efectivos y curen mejor la leucemia, ya que se quedan en sangre más tiempo a dosis más altas; o también hacen que se produzca mayor toxicidad.

- ‐ G6PD: -‐ Un defecto de la glucosa-‐6-‐fosfato deshidrogenasa (G6PD), con más de 400 alelos diferentes descritos y

que afecta a alrededor de 200 millones de personas en el mundo, causa una sensibilidad mucho mayor a primaquina, un fármaco contra la malaria.- ‐ Las personas que tienen este tipo de variantes pueden padecer una anemia hemolítica severa si son tratados con este antimalárico (normalmente hombres, ya que el G6PD es un gen que se encuentra en el cromosoma X).

- ‐ Warfarina y genes CYP2C9 y VKORC1: - ‐Variaciones comunes en el gen CYP2C9 (un gen del citocromo P450) y del gen VKORC1 son importantes para la metabolización de la warfarina, un anticoagulante ampliamente utilizado.- ‐ La warfarina se usa para prevenir trombosis, pero por la variación en las dosis requeridas, complicaciones con hemorragias son frecuentes en este tipo de terapias.- ‐ Personas con al menos una copia de un alelo del gen CYP2C9 y otro del gen VKORC1 son más propensas a estas hemorragias, y en general requieren muchísima menos warfarina para alcanzar y mantener anticoagulación terapéutica.- ‐ Tests genéticos que determinen los alelos que un paciente porta en estos dos genes nos ayudarán a calibrar la dosis exacta y necesaria de warfarina, y reducir las posibilidades de hemorragias en este tipo de pacientes.

FARMACOGENÉTICA Y PERFIL GENÉTICO DEL CÁNCER

- ‐ Fármacos: - ‐ Varios fármacos para el tratamiento de diferentes cánceres son más o menos eficaces dependiendo del perfil genético y de la biología molecular del tumor.- ‐ Por ejemplo, herceptin (trastuzumab) es un fármaco que ataca la sobreexpresión de la proteína HER2/neu, una proteína que se expresa en alrededor de un tercio de los cánceres de mama.Por tanto, las pacientes son tratadas con herceptin solamente, sí se ha visto, mediante estudio genético, que su tumor sobreexpresa dicha proteína. Lo mismo ocurre con gleevec (imatinib), que es un inhibidor de tirosin-‐kinasa que se une a la proteína de fusión resultante de la translocación 9;22 (crom. Philadelphia), la proteína BCR-‐ABL.- ‐ El perfil genético de un tumor puede ayudar a mejorar la clasificación de diferentes tipos tumorales y también ayudar a guiar y elegir la mejor terapia antitumoral.

- ‐ Gen KRAS -‐ Mutaciones en el gen KRAS en cáncer de colon (o en otro tipo de cánceres) vaticinarán la no respuesta a fármacos inhibidores de EGFR.- ‐ Por ejemplo erlotinib o cetuximab, que son inhibidores de los receptores EGFR, no servirán para nada en pacientes que tengan una mutación en KRAS (downstream de EGFR), porque la señal de proliferación se produce ‘por debajo’ del receptor EGFR, y por tanto un fármaco que bloquee EGFR no será útil.- ‐ Por tanto, en casos de cáncer de colon hay que determinar en tejido tumoral si KRAS está mutado, ya que cetuximab es un antitumoral que funciona muy bien en cánceres de colon sin mutaciones en KRAS.

- ‐ Muy importante. En estos casos de cáncer estamos tratando con mutaciones somáticas, es decir, que estas mutaciones no las tiene el paciente, sino sólo el tumor. Se trata del perfil genético del tumor (no del individuo), y no influye en nada la capacidad individual de metabolización de estos fármacos (esas variantes, importantes en farmacogenética, sí que están en línea germinal