genetica DNA e sintese proteica

8/7/2019 genetica DNA e sintese proteica

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GENGENTICATICA MOLECULARMOLECULAR

Daniel Macedo de Melo [email protected]

SUMSUMRIORIO

Histria da Gentica Molecular;

Organizao e estrutura dos genomas;

DNA e RNA

Dogma Central

Genes e genomas;

Tcnicas Gentica Molecular

ReplicaoTranscrioTraduo

PCRSequenciamentoEST

O QUEO QUE GENGENTICA?TICA?

o estudo dos genes e de sua transmisso para asgeraes futuras.

dividida em:- Gentica Clssica Mendel (1856 1865)

unidade fundamental da hereditariedade

- Gentica ModernaWatson e Crick (1953)pedao de DNA que codifica uma protena

O QUEO QUE GENGENTICA?TICA?

Terra

Pas

Estado

Municpio

Pessoas

Clula

Cromossomo

Fragmento

cromossmico

Bases de

pares

Gene

Escala ComparativaEscala Comparativa

Acontecimentos na genAcontecimentos na genticaticae genmicae genmica

Acontecimentos na genAcontecimentos na genticaticae genmicae genmica


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Acontecimentos na genAcontecimentos na genticaticaee genmicagenmica

cido desoxirribonuclcido desoxirribonuclicoico -- DNADNA

A estrutura do DNAA estrutura do DNA

DNA o material gentico

Estrutura regular (difrao de Raio-X)

Fitas complementares de nucleotdeos

Dupla hlice

DNA associado a protenas

A dupla hA dupla hlice de DNAlice de DNA

A estrutura do DNAA estrutura do DNA

Nucleotdeo:- Acar: pentose, desoxirribose- Fosfato- Bases nitrogenadas:

- Purina: Adenina guanina- Pirimidina: citosina timina- Pareamento- Ligadas por pontes de hidrognio

Ligaes fosfodiester

Quantidade de A = quantidade de T

Quantidade de G = quantidade de C

NucleotNucleotdeodeo A unidade deA unidade deconstruconstruo do DNAo do DNA


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Desoxirribose:Desoxirribose:o ao acar do DNAcar do DNA

PirimidinasPirimidinasPurinasPurinas

Bases nitrogenadasBases nitrogenadas

cido ribonuclcido ribonuclicoico -- RNARNA

Principais Tipos de RNAPrincipais Tipos de RNA

RNA mensageiro (mRNA): contm a informao genticapara a seqncia de aminocidos das protenas

RNA transportador (tRNA): identifica e transporta osaminocidos at o ribossomo

RNA ribossmico (rRNA): constituinte dos ribossomos

RibonucleotRibonucleotdeodeo O blocoO blocode construde construo do RNAo do RNA

RNA: umRNA: um cido nuclcido nuclico comico comestrutura questrutura qumica diferente do DNAmica diferente do DNA


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DNADNA RNARNADesoxirribose Ribose

A; G; C; T A; G; C; U

Dupla fita Fita simples; dobrada

Armazena informaes Transportainformaes; funesestrutural e cataltica

Molcula grande Molcula pequena

DNA x RNADNA x RNA

Replicao

Transcrio

Traduo

Protena

TranscrioReversa

Replicao deRNA

Dogma Central da BiologiaDogma Central da BiologiaMolecularMolecular

ReplicaReplicaoo

o processo na qual oDNA duplicado, a partirda fita molde.

Regras bRegras bsicas do processo desicas do processo dereplicareplicao do DNAo do DNA

Processo semiconservativo

Incio da replicao

- Origem

Movimento da forquilha de replicao

- Unidirecional ou bidirecional

Direo da replicao

- 5 3Semidescontinuidade da replicao

Enzimas que participam daEnzimas que participam dareplicareplicaoo

DNA Polimerase

SSB (Single Strand Binding Protein)

Primase

Helicases (DnaB)

Topoisomerases

DNA ligase

ReplicaReplicaoo


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TranscriTranscrioo

o processo pelo qual uma molcula de RNA sintetizada a partir da informao contida nasequncia de nucleotdeos de uma molcula deDNA de fita dupla

CaracterCaractersticas da transcristicas da transcrioo

RNA imediatamente liberado do DNA

Produo simultnea de muitas cpias a partirdo mesmo gene

- Gene com 1.500pbTranscrio = 50 segundos

15 RNA-polimerase/gene

1 hora = milhares de transcritos

TranscriTranscrioo TranscriTranscrioo

DNA fita codificadora

DNA fita molde

RNA transcrito

intronsexons

Processamento do transcrito primrio

Exciso dos exons

Unio dos exons

Processamento doProcessamento do mRNAmRNA ntronsntrons ee xonsxons

ntron regio no-codificante de umgene, transcrita na mlecula de RNA, masremovida pelo processamento do RNA

- 80 a 10.000 nucleotdeos

xon Seguimento de um gene formadopor uma seqncia de nucleotdeos quesero representados no RNA

Processamento: processo de remoo dentrons e juno de xons no RNAmensageiro de eucariotos


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TraduTraduoo

Processo na qual uma seqncia demRNA convertido em uma protena.

TraduTraduoo

CCdigo Gendigo Genticotico

Conceito:

So as instrues para sintetizarmolculas proticas e esto inscritas emcdigo nas molculas de DNA dosorganismos vivos.


Caractersticas do cdigo gentico

Trplice: 3 bases = cdon codificam um aa

Degenerado ou redundante: um mesmo aminocido pode sercodificado por vrios cdons diferentes

No ambguo: cada cdon corresponde a somente umaminocido

Com sentido: Startcdon a um stopcdon;

Universal: o mesmo para todos seres vivos

Utilizao preferencial de codons: codon usage


Trincas do Cdigo Gentico

Cada trinca de nucleotdeo do DNA corresponde a um aa naprotena.

A combinao das 4 letras genticas TACG, 3 a 3, permiteobter 64 trincas diferentes.

61 correspondem a aminocidos e 3 correspondem a cdonsde terminao; UAA, UAG e UGA.



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Arg-Tyr-Ser-Val

TraduTraduoo

DNA fita codificadora

DNA fita molde

RNA transcrito

Protena traduzida

Resumo da traduResumo da traduoo

DNA ou RNADNA ou RNA

DNA e RNADNA e RNA

Cromossomo

Plasmdios

CromossomoPlasmdios

ProcariticasProcariticas EucariticasEucariticas

Cromossomo

Mitocndrias

Cloroplastos

Cromossomo

Mitocndrias

Cloroplastos

Os GenomasOs Genomas

Vrus

Clulas

Fita simplesFita simples

Fita DuplaFita Dupla


Organismos Procariticos: Bactrias

CromossomoPlasmdeo


Cromossomo + Plasmdeos

O genoma da E. coli

- 4.639 kb

- 2.400 genes

- 80% da molcula de DNA

- 1.897 genes codificantes de protenas

OsOs PlasmPlasmdiosdios

Elemento gentico, extra-cromossmico, capazde replicar independente do cromossomo

- Dupla fita de DNA; Circular

- 1 100(+) Kb; < 1/20 do cromossomo

Diferentes dos vrus- No causam danos s clulas

- No so formas extracelulares

Diferentes do cromossomo

- No contm genes essenciais


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O Genoma dos OrganismosO Genoma dos Organismos

EucariEucariticosticos

O Genoma HumanoO Genoma Humano

23 cromossomos

31.000 genes

3.000 milhes de bases

O Genoma HumanoO Genoma Humano

Clula

Genoma

nuclear

Genoma mitocondrial

Famlia

O Genoma dos EucariO Genoma dos Eucariticosticos

O genoma nuclear:

- E. coli: 2.400 genes; 1.897 codificam protenas

- Saccharomyces cerevisiae: 6.600 genes; 5.800codificam protenas Exemplos utilizao

- Humanos: 100.000 genes, codificam protenas;genes > (+ ntrons)

O Genoma dos EucariO Genoma dos Eucariticosticos

Genoma humano:

- xons

-ntrons

- DNA repetitivo (no essencial ?)

- 30%

- No codifica

- No transcreve

- Repetidas muitas vezes

70%70%

CompactaCompactao do DNA emo do DNA emCromossomosCromossomos

Genoma humano

- 23 cromossomos - 1 metro

- DNA + Protenas

Protenas

- RNA polimerase, DNA polimerase, reguladoras, Histonas

Cromatina

- DNA-Protena Compactao do DNA


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TTcnicas de Gencnicas de GenticaticaMolecularMolecular

PCR

SequenciamentoEST

ReaReao em Cadeia dao em Cadeia daPolimerasePolimerase -- PCRPCR

1983: Kary Mullis

1985: 1 artigo

Processo patenteado em1989 por Cetus Corporation& Hoffman-LaRoche

1993: Nobel da Qumica

PCRPCR

Grande quantidade de DNA em pouco tempo.

Baixo custo

A amostra de DNA no necessita de estar altamentepurificada

PCR pode amplificar uma nica molcula de DNA / RNA

O produto do PCR pode ser digerido com enzimas derestrio, sequenciado ou clonado.

difcil exagerar o impacto da PCR na Biologia Molecular

Simplificou e democratizou as tcnicas de BiologiaMolecular

Possibilitou extender a Biologia Molecular para disciplinasnunca pensadas como Ecologia, Direito, Arqueologia,Economia, etc.

PCRPCR

dCTP

dGTP

dTTP

Mg2+

dATP

DNApolimerase

IniciadoresdNTPs

O queO que necessnecessrio?rio?

Em soluo tampo de PCR, H2O ultra-filtrada (pH 7,0)e leo mineral.

TermocicladoresTermocicladores


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www.dbbm.fiocruz.br/helpdesk/mbiology/PCRcurso.pdf

MecanismoMecanismo

Divide-se em 3 passos principais, que se repetem por25 a 35 ciclos:

- Desnaturao

- Hibridao

- Extenso

A quantidade de DNA final segueuma funo exponencial, onde:

N=N0.2nN: nmero final de cadeias de DNA

N0: nmero inicial de DNA molde (template)

n: nmero de repeties do ciclo

DesnaturaDesnaturaoo

Processo no qual ocorre a separao dafita dupla de DNA por meio da elevao datemperatura.

As amostras so aquecidas a 94-96 Cdurante um a vrios minutos.

HibridaHibridaoo

A temperatura reduzida a 55-65 C durantealguns minutos.

Os iniciadores hibridam com as seqnciascomplementares do Molde.

ExtensoExtenso

Eleva-se a temperatura a 72C durante 2 minutos.

O DNA polimerase atua junto dos iniciadores

que hibridaram, comeando a duplicao dacadeia e recrutando no meio os nucletidoscomplementares disponveis.

SequenciamentoSequenciamento

Reao deSequenciamento

Molde

Taqpolimerase

Primer

Deoxinucleotdeos

Dideoxinucleotdeos

SequenciamentoSequenciamento

Mtodo didesoxiconhecido tambm como determinadores de cadeiaou de Sanger


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5

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

|||||||

3

ATGCTTCATGCTTC5 3

AA

AA

AA

AA

AA

AA

AA

AA

AA

AA

TTTTTT TT

TT TT

TT

TT

TT

TT

TT

GG

GG

GGGG

GG

GG

GG

GG

GG

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CCCC

PolimerizaPolimerizao de DNAo de DNA

5


|||||||||

3

ATGCTTCATGCTTC5 3

AA

AA

AA

AA

AAAA

AA

AA

AA

AA

TTTTTT TT

TT TT

TT

TT

TT

TT

TT

GG

GG

GGGG

GG

GG

GG

GG

GG

CC

CC

CC

CCCC

CC

CC

CC

CC

CCCC


5


||||||||||

3

ATGCTTCATGCTTCTGTG5 3

AA

AA

AA

AA

AA AA

AA

AA

AA

AA

TTTT

TT

TT

TT TT

TT

TT

TT

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GG

GG

GGGG

GG

GG

GG

GG

GG

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC


5


|||||||||||||||||

3

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTTGGCAGATCT5 3

AA

AA

AA

AA

AAAA

AA

AA

AA AA

TT TTTT

TT

TTTT TT

TT

TT

TTTT GGGG

GGGG GG

GG

GG

GG GG

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC


5


|||||||||||||||||

3

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTTGGCAGATCT5 3

AA

AA

AA

AA

AAAA

AAAA

AA

AA

TT

TTTT

TT

TTTT

TT

TT

TT

TTTT

GG

GG

GGGG

GG GG

GG

GG

GG

CC

CC

CC

CCCC

CCCC

CC

CC

CC

CC


5


|||||||||||||||

3

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT5 3

AA

AA

AA

AA

AA

AA

AAAA

AA

AA

TTTT

TT

TTTT

TT

TTTT

TTTT

TT

GG

GGGG

GG

GGGG

GG

GGGG

CCCCCC

CCCC

CC

CC

CCCC

CC

CC



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5


|||||||||||||||

3


AA

AA

AA AAAA

AA

AAAA

AA

AA

TTTT

TT

TT

TTTT

TTTT

TT TT

TT

GG

GGGG

GG

GGGG

GG

GGGG

CC

CC

CCCC

CC

CC

CC

CC

CC

CC

CC


5


|||||||||||||||

3


AA

AA

AAAA

AA

AA

AAAA

AA

AATT

TTTT

TT

TTTT TT

TT

TTTT

TT

GG

GGGG

GG

GGGG

GG

GGGG

CC

CCCC

CCCC

CC

CC

CCCC

CC

CC


ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT TT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTAC TT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGC TT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT TT

ATGCTTCATGCTTCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGT TT

ATGCTTCATGCTTCTTGGATGCTTCATGCTTCTGTGGG

ATGCTTCATGCTTCTGGCATGGCAGG

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTTGGCAGATCTGG

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACATGGCAGATCTGAACAGG

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTTGGCAGATCTGAACAGTGG

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT GG

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT GG

ATGCTTCATGCTTCTGGTGGCC

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATTGGCAGATCC

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAATGGCAGATCTGAACC

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTATGGCAGATCTGAACAGTGTTACC

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTG CC

ATGCTTCATGCTTCTGGCTGGCAA

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGTGGCAGAA

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGTGGCAGATCTGAAATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGATGGCAGATCTGAAA

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACTGGCAGATCTGAACAA

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTTGGCAGATCTGAACAGTGTT AA

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG AA

ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT AA

G A T C

SeqSeqenciamento de DNAenciamento de DNA Gel de sequenciamento de DNAGel de sequenciamento de DNA

SequenciadoresSequenciadores

Seqenciamento parcial detranscritos


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intronsexons

Processamento do transcritoprimrio

Exciso dos exons

Unio dos exons

O que so ESTs?O que so ESTs?

EST= Expressed Sequence Tag

(Etiquetas de Seqncias Expressas)

cDNAREGIO CODIFICADORAREGIO CODIFICADORA

ATGATG STOPSTOP

AAAAAAAAAA

TTTTTTTTTTTT

AAAAAAAAAATTTTTTTTTTTT

EST 5EST 5

EST 5EST 5

EST 3EST 3

EST 3EST 3

AAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTEST 5EST 5

EST 3EST 3

SeqSeqenciamento parcial deenciamento parcial detranscritostranscritos

AAAAAAAATTTTTTTTTT

EST 5EST 5 EST 3EST 3

AAAAAAAATTTTTTTTTT

EST 5EST 5

AAAAAAAATTTTTTTTTT

EST 5EST 5

AAAAAAAATTTTTTTTTT

EST 5EST 5

AAAAAAAATTTTTTTTTT

Clusterde ESTs oude reads

Seqnciaconsenso

SeqSeqenciamento parcial deenciamento parcial detranscritostranscritos Agradecimentos

Ao Prof. Dr. Sergio Lifschitz. Ao comit organizador do BSB e ao

comit do IWGD. A todos os presentes.

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