Genoma funcional: identificar genes diferencialmente expressos

15 mil a 30 mil diferentes RNAsPopulação de RNA em uma célula >100 000 moléculas de RNAClasse RNA abundantes: 1% dos genes = 50% da pop. de RNAsClasse de RNA raros: metade dos genes = 1% pop. de RNAs

Alguns fatos que afetam a eficiência dos métodos em identificar esses genes

Genoma funcional: outras metodologias para identificar genes diferencialmente expressos

Subtração de bibliotecas

PCR supressivo

mRNA fingerprint

cDNA-AFLP

CAP Trapper

Limitações microarrays: Genes pouco expressos não são detectados Difícil separação da contribuição de diferentes isoformas de um mesmo gene

Outros métodos

Genoma funcional: outras metodologias para identificar genes diferencialmente expressos

Tester: biblioteca de cDNA aonde estão os genes que quero fisgar meu gene (gene

induzido peloetileno:: tratamento com etileno)

Driver: biblioteca de cDNA aonde não estão os genes que quero fisgar meu gene (genes não

induzidos pelo etileno:: tratamento sem etileno)

Subtração de bibliotecas de cDNAsistema utilizando biotina, streptavidina

e partículas magnéticas

Genoma funcional: outras metodologias para identificar genes diferencialmente expressos

PCR supressivo

PCR supressivo

PCR supressivo

Sequência não forma est. pan em moléculasmaiores, só em menores

SUPRESSION PCR

Condição 1 Condição 2

Gel de poliacrilamida e uréia (sequenciamento)

Differential RNA display

TTTTTT

Primer OligodT

GCUAAAGCGAPrimer decâmero

randômico

AAAAAAAAGene 1

AAAAAAAAGene 2

TTTTTT

Primer OligodTGCUAAAGCGA

Primer decâmero randômico

Reação de PCRcom baixa temperatura

de anelamento,com nucleotídeos marcados

radioativamente

TTTTTT

Primer OligodTGCUAAAGCGA

Primer decâmero randômico

AAAAAAAAGene 3

GCUAAAGCGA TTTTTT

GCUAAAGCGA TTTTTT

GCUAAAGCGA TTTTTT

Gene mais expresso na condição 1

Gene mais expresso na condição 2

Gene somente expresso na condição 2

2 d

ias

CriticismosPouca capacidade para detectar RNA raramente expressos

Banda do gel: mistura de cDNAs: 50-75% bandas = falsos positivos

Artefatos: primers curtos e baixa temp. anelamento: amplificação inespecífica

Limitada quantitividade: competição pelos primers por transcritos de diferentes abundâncias

Primers curtos: semi-pareamento em outras regiões do mesmo gene:dif. Clones positivos

podem ser o mesmo geneFragmentos pequenos (150-400 bp) contendo principalmente região 3’ UTR: difícil identific.

Modificações do método originalPrimers mais longos com programa com ciclo alterado

Combinação com subtração

Arbitrary primed PCR (RAP-PCR): dois primes curtos: probl. Falsos positivos

Integração do protocolo para PCR de longa distância no Differential display (até 2Kb- LDD-PCR)

EcoR I+CC and Mse I+AAA).Ecotipos de A.thaliana:

linhas 1 and 2.Columbia; linhas 3 and 4. Landsberg.

Genótipo: Columbia, Usando primer EcoR I+AC e: Mse I primer+AA (lanes 1 and 2);Mse I primer+AAA (lanes 3 and 4).

Introdução de um novo nucleotídeoLevou a amplificação de um outro subgrupo

de cDNAs

Sinchronized tobacco cells ( 12 point into S and M→G1 transition were

sampled.Exhaustive cDNA-AFLP: 360 AFLP primer combinationsÇ 18,000 AFLP tagsAbout 10% exhibited a modulated cell cycle profileÇ 1150 AFLP tags Tobacco BY2 cells were synchronised in the G1→S transition phase usingMajority of these AFLP tags either match genes of unknown function or

represent novel sequences.

Uso em larga escala do cDNA-AFLP