GEORGE DOMINGUES DE MELLO MENDES

A INFLUÊNCIA DOS POLIFOSFATOS INORGÂNICOS SOBRE A ATIVIDADE DA

F -ATPase E NA ABERTURA DE POROS DE TRANSIÇÃO DE PERMEABILIDADE

MITOCONDRIAL EM EMBRIÕES DO CARRAPATO Rhipicephalus microplus.

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Novembro 2017

ii

GEORGE DOMINGUES DE MELLO MENDES

A INFLUÊNCIA DOS POLIFOSFATOS INORGÂNICOS SOBRE A ATIVIDADE DA

F-ATPase E NA ABERTURA DE POROS DE TRANSIÇÃO DE PERMEABILIDADE

MITOCONDRIAL EM EMBRIÕES DO CARRAPATO Rhipicephalus microplus.

Dissertação apresentada a Universidade

Federal do Rio de Janeiro, como parte das

exigências para obtenção do título de

Mestre em Produtos Bioativos e Biociências

ORIENTADOR: Dr. ELDO CAMPOS

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Macaé – RJ

Novembro 2017

iii

FICHA CATALOGRÁFICA

Domingues, George

A influência dos polifosfatos inorgânicos sobre a atividade da F-ATPase e

na abertura de poros de transição de permeabilidade mitocondrial em

embriões do carrapato Rhipicephalus microplus.

Dissertação de Mestrado em Produtos Bioativos e Biociências

apresentada a Universidade Federal do Rio de Janeiro, campus Macaé,

Professor Aloísio Teixeira.

Orientador: Eldo Campos

1. Metabolismo de polifosfatos 2. Bioquímica 3. Desenvolvimento

embrionário de artrópodes.

iv

GEORGE DOMINGUES DE MELLO MENDES

A INFLUÊNCIA DOS POLIFOSFATOS INORGÂNICOS SOBRE A ATIVIDADE DA

F-ATPase E NA ABERTURA DE POROS DE TRANSIÇÃO DE PERMEABILIDADE

MITOCONDRIAL EM EMBRIÕES DO CARRAPATO Rhipicephalus microplus.

Dissertação de mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Produtos

Bioativos e Biociências da Universidade

Federal do Rio de Janeiro, campus Macaé,

Professor Aloísio Teixeira, como parte dos

requisitos para a obtenção do título de Mestre.

COMISSÃO EXAMINADORA

Defendida em 14/11/2017

________________________________________________________

Dr. Jorge Luiz da Cunha Moraes / UFRJ - Campus Macaé

________________________________________________________

Dr. Arnoldo Rocha / Uenf – Campos dos Goytacazes

______________________________________________________

Dr. Evenilton Pessoa Costa / Uenf- Campos dos Goytacazes

________________________________________________________

Prof. Dr Eldo Campos – LIBHM / UFRJ – Campus Macaé

(Orientador)

Macaé – 2017.

v

DEDICATÓRIA

“À minha família, pelo carinho e apoio irrestrito na minha trajetória, propiciando as

condições necessárias para a realização desse sonho.”

vi

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por tudo. Por toda a coragem, luz, determinação e força na

escolha da direção correta a tomar e por dar-me a oportunidade de conhecer tantas

pessoas boas que tem cruzado o meu caminho ultimamente. Agradeço a ele todas

as vitórias e conquistas alcançadas durante a minha vida.

Agradeço à minha família, meus pais e meus irmãos pelo apoio e pela

compreensão do tempo de convívio muitas vezes sacrificado para realização deste

trabalho. Agradeço especialmente a minha esposa Cinthia Goulart e meu filho Enzo

que são o maior presente que Deus poderia ter me dado nesta vida. Por toda

felicidade, carinho, compreensão, apoio, incentivo, dedicação encontrada na minha

querida família que sempre farão parte de cada vitória.

Agradeço ao meu orientador, Prof. Dr. Eldo Campos, por sempre demonstrar

força, paz e confiança, por seus ensinamentos científicos de grande valia para

minha formação e por ter acreditado no meu potencial, na minha responsabilidade e

me confiar esse trabalho, se dedicando a me ajudar com minhas dificuldades e me

motivar a continuar buscando e aprendendo todos os dias em cada nova etapa.

A Universidade Federal do Rio de Janeiro através do NUPEM/Macaé que me

abriu a oportunidade para realizar o mestrado através do programa de Produtos

Bioativos e Biociências e me proporcionar grandes aprendizados através de um

curso de excelente qualidade e grande importância na minha vida profissional e

acadêmica.

Aos meus amigos; Bianca Fernandes, Keyte, Lina, Danielle Fraga, Ottassano,

Bianca Curitiba, Bruno Moraes, Luizinho, técnico Junior, Carina, Dani, Gabriel.

Obrigado pelo carinho e pelos bons momentos e por terem tornado essa caminhada

mais leve e alegre.

Aos meus amigos mais que especiais da educação física e nutrição, Elisaldo,

Gustavo, Lídia Santos, Nelma Leal e Sabrina Santos, pelas mensagens de apoio e

força.

vii

Aos professores, Dr. Jorge Luiz da Cunha Moraes e Marcos Cruz Lopes que

aceitaram participar das minhas bancas de acompanhamento e me orientaram para

melhoria do meu trabalho.

Aos professores que aceitaram fazer parte da minha banca de defesa, Dr.

Jorge Luiz da Cunha Moraes, Dr. Leonardo Araújo de Abreu, José Alberto Silva, Dr

Arnoldo Rocha, Dr. Cintia Monteiro de Barros e Dr. Evenilton Pessoa Costa.

À coordenação de pós-graduação em Produtos Bioativos e Biociências, pelo

apoio. Às agências de fomento, FAPERJ, CAPES, CNPq e INCT.

E a todos que de forma direta ou indireta, me auxiliaram durante a execução

desse trabalho, meu eterno agradecimento.

viii

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO

1.1. Polifosfato inorgânico .....................................................................................13

1.2. Principais enzimas do metabolismo de polifosfato .........................................14

1.3. Polifosfato: conteúdo e localização .................................................................15

1.4. Polifosfato inorgânico a molécula de muitas funções .....................................16

2.1. Mitocôndria e produção energética ................................................................18

2.1.1. F-ATP sintase ...........................................................................................20

2.2. Polifosfato e função mitocondrial ....................................................................20

2.2.1 Polifosfato inorgânico e abertura de PTPm ...............................................21

3.1 O carrapato Rhipicephalus microplus como modelo........................................23

3.1.1 O ciclo de vida do Carrapato Rhipicephalus microplus .................................26

4. JUSTIFICATIVA ....................................................................................................27

5. OBJETIVO GERAL ...............................................................................................28

5.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..............................................................................28

6. MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................29

6.1. Animais ............................................................................................................29

6.2. Isolamento da fração mitocondrial ...................................................................29

6.3. Quantificação de proteínas .............................................................................30

6.4. Ensaio da Exopolifosfatase mitocondrial .........................................................30

6.5. Determinação da Atividade da F-ATPase ................................................. 30

6.6. Análisa do inchamento mitocondrial ................................................................31

6.7. Análise da retenção de cálcio ..........................................................................31

6.8. Determinação da lipoperoxidação de membrana mitocondria .......................32

ix

6.9. Determinação de oxidação de proteínas sulfidrilas (P-SH) .............................32

6.10. Análises Estastísticas ....................................................................................33

6. RESULTADOS ......................................................................................................33

7.1. Avaliação da Atividade da F-ATPase ..............................................................34

7.2. Avaliação da Atividade da F-ATPase na presença de PoliP3......................... 35

7.3. Avaliação da Atividade da F-ATPase na presença de PoliP15

....................................................................................................................................36

7.4.Modulação da atividade exopolifosfatásica mitocondrial pela razão

ATP/ADP....................................................................................................................37

7.5.Modulação da atividade exopolifosfatásica mitocondrial pela razão

NADH/NAD+ ..............................................................................................................38

7.6. Modulação da atividade exopolifosfatásica mitocondrial por Acetil-CoA .......39

7.7. Avaliação do tugor mitocondrial ......................................................................40

7.8. Avaliação da retenção de Cálcio .....................................................................41

7.9. Avaliação da Lipoperóxidação ........................................................................42

7.10. Avaliação da oxidação de proteína ...............................................................43

7. DISCUSSÃO .........................................................................................................44

8. CONCLUSÃO .......................................................................................................53

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................54

x

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Estrutura do polifosfato linear onde M pode ser um H+ ou um cátion

metálico .....................................................................................................................13

Figura 2: O Papel da glicólise, o ciclo de Krebs e a cadeia transportadora de elétrons

na obtenção de energia na forma de ATP .................................................................19

Figura 3: Carrapato bovino Rhipicephalus microplus.................................................24

Figura 4: Representação esquemática de áreas de maior reprodução do

Rhipicephalus microplus pelo globo..........................................................................25

Figura 5: Representação esquemática do ciclo de vida do carrapato Rhipicephalus

microplus....................................................................................................................26

Figura 6: A Atividade da F-ATPase durante a embriogênese do R.

microplus....................................................................................................................34

Figura 7: A influência do PoliP3 sobre a atividade da F-ATPase

....................................................................................................................................34

Figura 8: A influência do PoliP15 sobre a atividade da F-

ATPase.......................................................................................................................35

Figura 9: A influência da razão ATP/ADP sobre a atividade da PPX ........................37

Figura 10: A influência da razão NADH/NAD+ sobre a atividade da PPX.................38

Figura 11: A influência de diferentes concentrações de Acetil Coa sobre a atividade

da PPX.......................................................................................................................39

Figura 12: O efeito do PoliP sobre o tugor mitocondrial induzido por

cálcio..........................................................................................................................40

Figura 13: O efeito do PoliP sobre a retenção de cálcio............................................41

Figura 14: O efeito do PoliP sobre a lipoperoxidação ..............................................42

Figura 15: O efeito do PoliP sobre a oxidação de proteínas sulfidrilas.....................43

xi

LISTA DE ABREVIATURAS

ANOVA – Análise sobre variância

ATP – Adenosina trifosfato

ANT – Translocador de nucleotídeo

CYPD- Ciclosporina D

DAPI – 6-Diamino-2-fenilindol

DNA – Ácido Desoxirribonucleo

EGTA- Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid

FADH- Favina adenina de nucleotídeo reduzida

FCCP-carbonilcianeto-P-triofluorometoxifenilhidrazona

PoliP – Polifosfatos

Pi – Fosfato inorgânico

PPX – Exopolifosfatase

PTPm- Poros de transição de permeabilidade mitocondrial

NAD+ – Nicotinamida adenina dinucleotídeo

NADH- Nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida

ROS- Especies reativas de oxigênio

xii

RESUMO

O polifosfato inorgânico (PoliP) é um polímero formado a partir de resíduos de

ortofosfatos ligados por ligações de fosfoanidrido similares ao ATP. O PoliP está

presente em todos os organismos, desde bactérias a mamíferos, onde desempenha

múltiplas funções fisiológicas.

O perfil de atividade da enzima F-ATPase foi determinado durante a

embriogênse do carrapato Rhipicephalus microplus. A partir da determinação dos

maiores níveis de atividade dessa enzima, foi avaliada a influência da molécula de

polifosfato (PoliP) de cadeia curta (PoliP3) e longa (PoliP15). As diferentes

concentrações de polifosfatos de cadeia curta foram capazes de gerar modificações

na atividade da F-ATPase. Essa enzima é a grande produtora de ATP da célula e,

mudanças na sua atividade podem gerar profundas alterações no metabolismo

celular. Examinamos os mecanismos envolvidos no metabolismo do PoliP, sendo

avaliada a atividade da exopolifosfatases (PPX) em diferentes situações de

demanda energética. A atividade da PPX foi estimulada em situações de alta

demanda energética (concentrações elevadas de ADP e NAD+), observando

diminuição do efeito estimulatório durante a diminuição da demanda energética

(aumento das concentrações de ATP e NADH). Acetil-coA, uma reguladora do

metabolismo, não foi capaz de estimular a atividade da PPX.

A abertura de poros de transição de permeabilidade mitocondrial (PTPm)

induzida por cálcio, foi estimulada pelo PoliP15. O PoliP3 e PoliP15 reduziram a

retenção de cálcio nas mitocôndrias, sugerindo a participação do PoliP15 na

estrutura do poro. Avaliamos o suposto papel protetor do PoliP, não observamos

proteção contra danos a lipídios e/ou proteínas em condições de estresse. Os

resultados aqui apresentados contribuíram para elucidar o papel dos polifosfatos no

metabolismo mitocondrial e sua correlação na abertura de PTPm durante a

embriogênese do carrapato do Rhipicephalus microplus, além de garantir novas

perspectivas na área da bioenergética mitocondrial e do metabolismo de polifosfatos

em artrópodes.

xiii

Palavras-chave: mitocôndria, polifosfatos, espécies reativas de oxigênio

(ROs), Poros de transição de permeabilidade mitocondrial, embriogênese,

Rhipicephalus microplus.

ABSTRACT

Inorganic polyphosphate (PolyP) is a polymer formed from orthophosphate

residues linked by phosphoanhydride bonds similar to ATP. PolyP is present in all

organisms, from bacteria to mammals, where it performs multiple physiological

functions.

The activity profile of the F-ATPase enzyme was determined during

embryogenesis of the Rhipicephalus microplus tick. After that the influence of the

short chain (PoliP3) and long (PoliP15) polyphosphates was evaluated on enzyme

activity. The different concentrations of short chain polyphosphates were able to

induce changes in F-ATPase activity. This enzyme is the major ATP producer in the

cell, and changes in its activity can cause profound changes in cellular metabolism.

The PPX activity was stimulated in the presence of high energy demand (high

concentrations of ADP and NAD+), but is reduced when enegy demand is low

(increased concentrations of ATP and NADH). Regulatory molecule of metabolism

such as acetyl-coA was not able to stimulate PPX activity.

The release of calcium by PTPm was stimulated by PolyP15 .PolyP3 and

PolyP15 reduced the retention of Calcium in the mitochondria, suggesting the

participation of PolyP15 in the pore structure. The evaluation of the supposed

protective role of PolyP was determined. We did, not observe protection against

damage to lipids and / or proteins. The results presented here contributed to

elucidate the role of polyphosphates in mitochondrial metabolism and its correlation

in the opening of PTPm during the embryogenesis of the Rhipicephalus microplus

tick, besides guaranteeing new perspectives in the area of mitochondrial

bioenergetics and polyphosphate metabolism in arthropods.

Key words: mitochondria, polyphosphates, reactive oxygen species (ROs),

mitochondrial permeability transition pores, embryogenesis, Rhipicephalus microplus.

13

1.1. Polifosfatos Inorgânicos

O fósforo, sob a forma de fosfato inorgânico (Pi) é indispensável para todos

os organismos, participando de inúmeros processos metabólicos, tais como:

biossíntese de ácidos nucléicos e fosfolipídeos, metabolismo energético e

transdução de sinais, além de regular enzimas de vias metabólicas (LEI et al., 2010;

DICK et al., 2010).

No curso da evolução, os organismos demonstraram ser dependentes de

fatores ambientais, sendo estes, moduladores do seu metabolismo. Assim, como

respostas as adversidades e intempéries, eles criaram eficientes mecanismos para

captação, utilização e estoque de metabólitos importantes à sobrevivência e

manutenção da vida, sob a forma de polímeros (Mullan et al., 2002). Os polifosfatos

inorgânicos (PoliP) são polímeros que resultaram destas respostas adaptativas e

evolucionárias, sendo estocado sob a forma de polímeros lineares formados por

resíduos de ortofosfatos ou fósforo inorgânico. As ligações fosfoanidrídicas

constituintes das moléculas de PoliP, termodinamicamente, são equivalentes as

chamadas ligações fosfatadas de alta energia da molécula Trifosfato de Adenosina

(ATP), que formam estruturas não ramificadas e quando hidrolisadas liberam

energia equivalente a aproximadamente 10 Kcal/mol, isto é, uma quantidade

equivalente de energia à liberada na hidrólise da ligação fosfoanidro entre os

fosfatos β e γ do ATP (KULAEV et al., 2004). O tamanho da cadeia ou grau de

polimerização do PoliP, pode assumir valores que variam de 3 a 300, quando

obtidos de forma sintética (VAN WAZER & CALLIS, 1955; VAN WAZER, 1958).

Contudo, na natureza podem ser encontrados cadeias que variam de três a milhares

de resíduos de ortofosfatos (KULAEV et al., 2000), sempre formando estruturas

linears (KULAEV et al., 1999).

14

Figura 1: Estrutura do polifosfato linear onde M pode ser um H+ ou um cátion metálico –

retirado de KULAEV et al., 2004.

Por ser um composto energético e estruturalmente mais simples do que o

ATP, o polifosfato é considerado um precursor do ATP durante a evolução

(HAROLD, 1966; KULAEV et al. 2000). Esses polímeros estão classificados em dois

grupos, pirofosfatos (molécula simples constituída por dois átomos de fósforo unidos

por apenas uma ligação fosfoanidra) e polifosfatos (três ou mais fosfatos). O PoliP é

dividido em dois grupos: cadeia curta, formados por três resíduos de ortofosfatos e

os de cadeia longa contendo valores acima de três átomos de fósforo (KORNBERG

et al., 1999).

1.2. Principais enzimas do metabolismo de polifosfatos

Logo após a compreenção da estrutura do PoliP, inúmeros questionamentos

surgiram, principalmente, como ocorriam as ligações de fosfoanidridos. Durante esse

processo foi descoberta uma enzima em procariotos responsável por catalizar a

transferência reversível do fosfato livre apartir da hidrólise do ATP e o grupo terminal

do PoliP. A polifosfatoquinase (PPK), que atua como ponte entre esses dois

compostos energéticos (HAROLD, 1966). Até o momento a PPK não foi identificada

em eucariotos.

Em relação aos eventos de degradação de polifosfatos, são relatadas duas

classes de enzimas, as endopolifosfatases e as exopolifosfatases (PPX). As

endopolifosfatases, são detectadas apenas em eucariotos e estão localizadas,

principalmente, em vacúolos (KUMBLE E KORNBERG, 1996; KULAEV E

KULAKOVSAYA, 2000).

As exopolifosfatases (PPX) são consideradas as enzimas regulatórias

centrais do metabolismo de PoliP (KULAEV et al., 2000). Estas enzimas estão

presentes em procariotos e eucariotos, onde atua hidrolisando a cadeia do polímero,

desde sua extremidade para o interior, liberando moléculas de fosfato inorgânico

(KULAEV et al., 2004; UGOCHUKWU et al., 2007).Em eucariotos, a PPX apresenta-

se ainda mais diversificada, com apresentação de diferentes exopolifosfatases nos

15

multiplos compartimentos celulares (ANDREEVA E OKOROKOV, 1993; ANDREEVA

et al., 1998; KULAEV E KULAKOVSKAYA, 2000; LICHKO et al., 2003;

UGOCHUKWU et al., 2007).

Esse conjunto de enzimas mantem o equilíbio dinâmico do PoliP, garantindo a

regulação entre síntese e degradação do polímero, de forma que qualquer

interferência nesse balanço pode resultar em um acúmulo ou mesmo na degradação

total deste poliânion pela célula (BROWN E KORNBERG, 2008).Tem sido

demonstrado, que o polifosfato inorgânico está presente em todos os organismos

até o momento estudados, independentes do grau de evolução, o que sugere uma

função biológica fundamental à vida (KORNBERG et al., 1999).

1.3. Polifosfato inorgânico: conteúdo e localização

Embora a maioria das pesquisas sobre polifosfatos tenha sido realizada em

microorganismos, a presença de PoliPs foi demonstrada em muitos tecidos de

mamíferos, como fígado, rins, pulmão, cérebro e coração de roedores (KUMBLE E

KORNBERG, 1996), coração de coelho (SEIDLMAYER et al., 2012), plaquetas

(MORRISSEY;CHOI; SMITH, 2012) e fibroblastos (SHIBA et al., 2003),

apresentando concentrações entre 25-200 resíduos de Pi em concentrações

micromolares. Já em microorganismos estão presentes em concentrações bem

maiores (50-120 mM) sobre a forma altamente polimerizada de 800-1000 resíduos

de ortofosfatos (KULAEV et al. 2000).

A distribuição intracelular de PoliPs também varia com níveis relativamente

mais elevados detectados em núcleos e membranas plasmáticas isoladas do fígado

de rato em comparação com o citosol e mitocôndrias (KUMBLE E KORNBERG,

1996). Foi observado que em mitocôndrias isoladas de corações de coelho a média

predominate de cadeia é de 25 resíduos de ortofosfatos (SEIDLMAYER et al., 2012).

Foram encontrados grandes conteúdos de PoliP armazenados em grânulos ,

localizados no citoplasma. Estes grânulos foram, inicialmente, identificados, de

forma mais proeminente em Mycobacterium sp. e em Corynebacterium diphtheriae

16

há mais de um século. No entanto, foram também encontrados em Corynebacterium

glutamicum (PALLERLA et al., 2005), sendo armazanados em associação com Ca2+

e Mg2+ (KOMINE et al., 2000). Dessa forma, há evidencias que o contendo

polifosfatos inorgânicos podem ter sido conservados durante a evolução de

bactérias a humanos (DOCAMPO et al., 2005).

1.4. Polifosfatos, moléculas de múltiplas funções

Inicialmente, os polifosfatos foram considerados como “fóssil molecular” ou

somente como reserva de fósforo e de energia para a sobrevivência de organismos

em condições severas (PESTALOV et al.,2004). Inúmeros estudos foram realizados

desde a sua descoberta, confirmando o seu importante papel no funcionamento

celular. Esses compostos são polímeros multifuncionais, em que suas funções são

dependentes do tipo de organismo, localização celular e grau de polimerização

(KULAEV et al., 1999).

Por ser substratos energéticos estruturalmente mais simples que o ATP, o

PoliP é considerado um possível precursor do ATP durante a evolução. Nesse

contexto o PoliP, apresenta-se como um eficiente substituto do ATP em todas as

suas funções de substratos de quinase. O PoliP pode substituir o ATP na

fosforilação de glicose em muitas bactérias. Procariontes primitivos menos derivados

parecem mostrar uma preferência mais elevada por PoliP sobre ATP (KORNBERG

et al., 1999). Sendo assim, as funções do PoliP podem ter sofrido alterações durante

o processo evolutivo, se adaptando aos diferentes tipos celulares (KULAEV et al.,

1999).

Em microorganismos o PoliP está envolvido em diversos processos, incluindo

transcrição de genes, armazenamento de fosfato inorgânico, quelação de metais,

produção de energia, formação de canais de membrana e na proteção contra ROS

(KULAKOVSKAYA E KULAEV, 2013; RAO et al., 2009; BAEV; NEGODA;

ABRAMOV, 2016; GRAY et al., 2014). Em células de mamíferos, o PoliP

desempenha um papel na estimulação da apoptose, onde foi demonstrado que a

adição de PoliP em células sanguíneas produziu uma inibição inesperada da

17

secreção de imunoglobulina, estimulando a morte celular. PoliP induziu apoptose

especificamente em células de mieloma (células plasmáticas malignas) e linhagens

de células linfóides B (HERNANDEZ-RUIZ et al., 2006).

A introdução de PoliP em culturas de células tronco mesenquimais durante o

processo de diferenciação em osteoblastos, contribuiu acelerando esse processo,

além de gerar formação de complexos de Golgi bem desenvolvidos (MORIMOTO et

al., 2010; MULLER et al., 2015) .

Estudos mostraram que os PoliPs são potentes moduladores da cascata de

coagulação do sangue, atuando como um agente pró-hemostático, pró-trombotico e

pró-inflamatório, dependendo do tamanho e da localização do polímero (SMITH;

MORRISSEY, 2008). Dessa forma o PoliP pode representar pelo menos um dos

ativadores fisiológicos acelerando as reações de coagulação plasmática (MÜLLER

et al., 2009).

Os PoliPs atuam como moléculas de sinalização no sistema nervoso central,

ativando um grande número de astrócitos, independentemente da região cerebral e

uma pequena proporção de neurônios do SNC, sugerindo que os astrócitos ativados

são capazes de utilizar o PoliP como um gliotransmissor. O que pode ter um papel

importante no controle de comportamentos vitais em que astroglia estão envolvidas,

haja visto que, o desbalanceamento na homeostase de PoliP foi encontrada em

inúmeras doenças, incluindo a doença de Parkinson (HOLMSTROM et al., 2013;

ANGELOVA et al., 2014). Em patologias com formação de agregados de proteínas

como a doença de Alzaimer, o PoliP vem sendo proposto como um possível protetor

ao evitar danos proteicos impossibilitando a formação de agregados formados por b-

amilóide e tau, assim diminuindo sua toxicidade (GRAY et al., 2014), podendo ser

aplicado extracelularmente absorvido por células de mamíferos (RAO et al., 2009),

sendo uma estratégia terapêutica viável.

Assim, como em bactérias os PoliPs desempenham papeies fundamentais na

atividade mitocondrial e a variação do seu conteúdo interfere no funcionamento

dessa organela (ABRAVANOV et al., 2007; PAVLOV et al., 2010). Em um estudo

realizado por Muller et al. (2015), células semelhantes a osteoblastos tratadas com

PoliPs, desenvolveram mitocôndrias mais robustas e em maior número. Dessa forma

18

é de fundamental importância uma maior compreensão sobre esse polímero,

mostrando que inúmeras funções relacionadas à atividade mitocondrial ainda estão

por serem descobertas.

2.1. Mitocôndria e a energética celular

Durante o processo de obtenção de energia dentro das células a degradação

de moléculas energéticas como a glicose não acontece em um único passo e sim,

em múltiplas etapas compostas por reações coordenadas. Essa produção de

energia é obtida através de inúmeros processos enzimáticos, constituídos por três

estágios (DUDLEY & WINTER, 2002). No primeiro estágio os metabólitos

intermediários produzidos a partir da glicose, ácidos graxos e alguns aminoácidos se

convergem para um caminho central que,posteriormente, poderão ser transformadas

em um intermediário comum (Acetil-CoA) que, então, é completamente oxidado

dentro da mitocôndria através das reações do ciclo de Krebs (completando o

segundo estágio). Essa etapa é responsável pela principal produção de coenzimas

reduzidas, como as nicotinamidas adeninas di-nucleotídeo e as flavinas adeninas di-

nucleotídeos (NADH e FADH2). No terceiro estágio, todas as coenzimas são

direcionadas para a cadeia transportadora de elétrons a fim de gerar um gradiente

eletroquímico de prótons estabelecido entre a matriz e o espaço intermembranar, o

qual impulsiona a atividade da síntese de ATP pela F-ATP sintase (Figura 2)

(LEHNINGER E NELSON E COX, 2004).

19

Figura 2: O Papel da glicólise, o ciclo de Krebs e a cadeia transportadora de elétrons na

obtensão de energia na forma de ATP. Retirado (LEHNINGER E COX, 2004).

20

2.1.1 F - ATP sintase

A F-ATP sintase, ou ATPases tipo F, possuem similaridades estruturais que

remontam sua evolução molecular comum com outras famílias de ATPases

classificadas como do tipo V e A . As diferentes ATPases foram categorizadas com

base em sua função e origem taxonômica, apresentando semelhanças na estrutura

e no mecanismo de ação (CROSS; MÜLLER, 2004; JONCKHEERE; SMEITINK;

RODENBURG, 2011).

A F-ATP sintase é formada por duas sub-unidades, a F1 e FO. A síntese e a

hidrólise de ATP ocorrem no domínio F1 majoritariamente composto por 3 sub-

unidades Alfas/α e 3 Betas/β (DEVENISH; PRESCOTT; RODGERS, 2008; BOYER,

1975; ADACHI et al., 2007). Sua atividade é cordenada pela respiração mitocondrial,

que quando está comprometida, caindo abaixo de um limiar, passa a hidrolizar ATP

para manter o gradiente de protóns, assumindo a sua atividade de ATPase, uma vez

que a depleção de ATP pode ser um possível sinal de morte celular, ou induzido por

substâncias sintéticas que alteram a atividade mitocondrial (DEVENISH;

PRESCOTT; RODGERS, 2008; LI et al., 2002; SALABEI et al., 2014).

Fisiologicamente, o transporte de elétrons e a síntese de ATP medeado pela

atividade da F-ATP sintase, podem ser regulados pela concentração de ADP, ATP,

Pi, NAD+ e NADH (SENIOR, 2007; AGARWAL, 2011). A razão ATP/ADP e

NADH/NAD+ e acetil-CoA, são utilizados como sensores que coordenam diversas

respostas enzimáticas e metabólicas associados ao controle do metabolismo

energético (YING, 2008; HARDIE, 2011; SHI; TU, 2015).

2.2. Polifosfatos e a função mitocôndrial

O entendimento sobre a função do conteúdo de PoliPs presentes na

mitocôndria é alvo de interesse de muitos pesquisadores (SEIDLMAYER et al.,

2012; PAVLOV et al., 2010; ABRAMOV et al., 2007), e está focado em dois

aspectos: o primeiro é pelo fato desse polímero ser um composto macroenergético,

21

carregado negativamente como o ATP e também por apresentar atividades

regulatórias. Sendo a mitocôndria uma organela com a função básica de geração e

regulação energética, consequentemente, os PoliPs podem participar desta

regulação (Beauvoit et al., 1991).

E o segundo, que, de acordo com a teoria endossimbiótica, as mitocôndrias

foram originárias de células procarióticas antigas; portanto, seria intrigante explorar

se as mitocôndrias preservam ou não as funções do polifosfato procariótico, como a

regulação do metabolismo energético (CLEMENTS et al., 2009; KULAKOVSKAYA et

al., 2010 )

A depleção de PoliPs por superexpressão de PPX em leveduras prejudicou

significativamente a atividade da cadeia respiratória (ABRAMOV et al., 2007) e com

isso, diminuiu a taxa de produção de ATP. Até a presente data, não foram

identificadas enzimas produtoras de PoliPs em eucariotos, porém demonstrou-se

que a produção de PoliP em células de mamífero depende de fatores envolvidos na

produção de energia (PAVLOV et al., 2010; SEIDLMAYER et al., 2012). Essas

afirmações estão apoiadas em experiências realizadas em mitocôndrias de fígado

de rato isoladas, células intactas cultivadas (astrócitos) e cardiomiócitos de coelho,

onde foi demonstrado que os níveis de PoliP foram aumentados por substratos da

cadeia respiratória mitocondrial e, por sua vez, reduzidos por inibidores mitocondrias

(rotenona) ou desacopladores de cadeia respiratória como o carbonilcianeto p-

trifluorometoxifenil-hidrazona (FCCP) ou carbonilcianeto-m-clorofenil-hidrazona

(CCCP). A oligomicina, um inibidor da F-ATP sintase mitocondrial, também bloqueou

a produção de PoliP, sugerindo que de forma similar às bactérias o metabolismo do

PoliP pode estar relacionado ao estado metabólico mitocondrial (SEIDLMAYER et

al., 2012; GRAY et al., 2014), indicando uma possível existência de um mecanismo

regulatório (Feedback) entre a produção de PoliP e o metabolismo energético

mitocondrial (PAVLOV et al., 2010).

22

2.2.1. Polifosfato inorgânico e abertura de PTPm

Sabe-se, há algumas décadas, que a mitocôndria desempenha um papel

importante como regulador da homeostase de cálcio citosólico, além de

desempenhar um papel fundamental na regulação de processos múltiplos em

mamíferos, desde sua essencial participação na energética celular até a indução de

morte celular provocada por estresses diversos. O transporte de Ca2+ através das

membranas é realizado por canais específicos que coordenam a entrada e saída

desse íon na matriz mitocondrial (GUNTER et al., 1994; CROMPTON, 1999;

RASOLA; BERNARDI, 2011). Dentre outras funções tal trânsito de cálcio nas

mitocôndrias é de grande relevância para a sinalização da produção de energia

(TARASOV; GRIFFITHS; RUTTER, 2012).

Durante disfunções mitocondriais ou por sobrecarga de cálcio, observa-se

aumento das concentrações desse íon na matriz mitocondrial, causando

citotoxicidade e desencadeando perda da permeabilidade da membrana, resultando

na abertura de um poro não seletivo na membrana mitocondrial interna (RASOLA;

BERNARDI, 2011; ORRENIUS; ZHIVOTOVSKY; NICOTERA, 2003). Este poro de

transição de permeabilidade mitocondrial (PTPm) é formado por proteínas presentes

na membrana interna da mitocondria e congadas com outras associadas a

membrana externa. Inúmeras proteínas têm sido descritas como componentes deste

complexo, tais como: o canal aniônico dependente de voltagem (VDAC), o

translocador de nucleotídos de adenina (ANT), a ciclofilina D (CypD), e mais

recentemente foi demonstrado o possível envolvimento da F-ATP sintase na

estruturação do PTPm, participando de um mecanismo que resulta na dissipação de

energia e diminuição do ATP celular (BERNARDI; LISA, 2015).

Embora já se saiba que picos de cálcio são suficientes para gerar alterações

na permeabilidade (em mitocôndrias de fígado, coração, rim e córtex adrenal) os

constituintes moleculares dessa estrutura ainda não são resolvidos (BERNARDI;

LISA, 2015; WONG; STEENBERGEN; MURPHY, 2011;CROMPTON; VIRJI; WARD,

1998).

23

Durante a abertura desses canais não seletivos uma grande entrada de

moléculas menores que 1500 kDa migram para a matriz mitocondrial, gerando a

despolarização da membrana mitocondrial, inibição da síntese de ATP, pela inibição

da respiração e o turgor do lúmen mitocondrial, com ruptura das membranas, e

eventualmente, a liberação de proteínas pró-apoptóticas, como o citocromo c

(BERNARDI et al., 2006; RASOLA; BERNARDI, 2011).

As mitocôndrias de células cultivadas com concentrações reduzidos de PoliP

apresentaram-se mais resistentes à abertura de PTPm induzida por Ca2+ (Abramov

et al., 2007). Estudos realizados por Solesio et al. (2016), demonstraram que o

esgotamento de PoliP leva a níveis significativamente mais baixos de cálcio

mitocondrial em condições de sobrecarga patológica de cálcio, concordando com

observações anteriores, que mostram, que o polifosfato inorgânico pode inibir a

precipitação de cálcio-fosfato, desempenhando um papel importante na regulação

do trânsito cálcio.

De forma semelhante, Seidlmayer et al. (2012) propuseram que o PoliP

citoplasmático pode inibir a capacidade mitocondrial de tamponar Ca2+, esse

acontecimento está relacionado ao fato desse polímero ser um forte quelante de

cátions divalentes, além de possuir a capacidade de interagir com o Ca2+ e formar

um complexo estável capaz de atuar sobre a permeabilidade da membrana interna

da mitocôndria. Posteriormente, em um trabalho realizado em cardiomiócitos de

coelho, foi percebido que a depleção de PoliP por maior hidrólise da PPX, impediu a

abertura de PTPm induzida por Ca2+, sugerindo que a elevação do conteúdo do

PoliP seja um potente ativador de abertura de PTPm induzido por

Ca2+(SEIDLMAYER et al., 2015).

3.1. O carrapato R. microplus como modelo de estudo

O carrapato Rhipicephalus microplus, pertence ao filo Arthropoda, classe

Aracnida, ordem Acarina e família Ixodidae, gênero Rhipicephalus (Figura 3)

(MURRELL E BAKER, 2003). Este carrapato é um ectoparasito que se alimenta

unicamente de sangue apresentando um ciclo monoxeno, isto é, depende apenas de

24

um hospedeiro em seu ciclo de vida, de preferência o gado e secundariamente

outras espécies, como búfalos, cavalos, ovelhas, cabras e veados. É uma das

maiores pragas existentes na pecuária (GONZALES et al., 1974).

Figura 3: Fêmea do carrapato R. microplus parasitando o bovino

Retirada de: http://icb.usp.br/~marcelcp/Boophilus.htm

Originário da Ásia, sua incidência é maior em produções pecuárias

localizadas em zonas tropicais e subtropicais do planeta, mais precisamente entre

os trópicos 320N e 320S do globo (Figura 4).

http://icb.usp.br/~marcelcp/Boophilus.htm

25

Figura 4: Áreas de maior reprodução do carrapato R. microplus pelo globo terrestre. O

carrapato encontra-se presente em toda a área em verde no mapa. Retirado de: Tópicos

Avançados em Entomologia Molecular Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em

Entomologia Molecular INCT – EM – 2012.

No Brasil, é conhecido como carrapato do gado e a espécie tem sido descrita

como presente em aproximadamente 96 % dos municípios, sendo o clima um fator

preponderante para o sucesso do ciclo. A produção nacional foi recentemente

estimada, sendo considerado o segundo maior rebanho do mundo e o primeiro

maior exportador e produtor de carne (ANUALPEC, 2013; TONIN; DEL CARLO,

2014). De acordo com Grisi et al., (2014), o R. microplus é responsável por danos

econômicos significativos para produção bovina brasileira, e os dados indicam um

impacto anual superior a US $ 324 bilhões, devido a diminuição da produção de

carne, baixa produção de leite, diminuição reprodutiva, lesões cutâneas que

diminuem a qualidade do courodo animal, sem contar a transmissão de agentes

patogênicos (Babesia bovis, Babesia bigemina e Anaplasma). Além das perdas

relacionadas à bovinocultura em si, existem diversos prejuízos relacionados à mão-

de-obra necessária para o controle desse parasito, despesas com instalações,

compra de acaricidas e equipamentos adequados para sua aplicação, entre outros

(FARIAS, 2014; SACCO, 2002).

26

3.1.1. O Carrapato R. microplus e seu ciclo de vida

Este carrapato apresenta duas etapas distintas no seu ciclo de vida: uma fase

parasitária, durante um período médio de 22 dias sobre um único hospedeiro, e uma

fase de vida livre, que ocorre no solo, podendo durar de dois a três meses,

dependendo das condições climáticas existentes (Figura 5) (GONZALES et al.,

1974). As fêmeas ingurgitadas apresentam um tamanho cerca de 10 vezes superior

ao dos machos. Após a fecundação caem ao solo iniciando a fase não parasitária

composta pelos estágios de fêmea adulta (teleógina), ovo e larva infestante

(GONZALES et al., 1974). A larva é bastante ativa na busca por lugares específicos

do hospedeiro de difícil acesso para o mesmo, favorecendo assim o sucesso da

infestação, dando início há um novo ciclo (Gonzales et. al., 1974).

Figura 5: Representação esquemática do ciclo de vida do carrapato Rhipicephalus

microplus. (Retirado de GONZALES et al., 1974).

27

4. Justificativa

Polifosfatos são encontrados em todas as células, possuindo diversas

funções específicas e cruciais para a sobrevivência celular, como a capacidade de

estimular a expressão gênica (MULLER et al., 2011), poencializar atividades de

células osteoblásticas responsáveis pela mineralização óssea (OMELON E

GRYNPAS 2008; OMERON et al., 2009), participação em processos de coagulação

do sangue, atividade enzimática, morte celular e como molécula de sinalização no

sistema nervoso central (GRAY et al., 2014;HOLMMSTROM et al., 2013;

MORRISSEY et al., 2012). Portanto, a sua vasta ocorrência e multifuncionalidade

indicam que muitas importantes funções em distintos organismos ainda estão por

serem descobertas possibilitando neste caso a ampliação do conhecimento da

bioenergética celular e da embriogênese em artrópodes.

28

5. Objetivo geral

Estudar o metabolismo mitocondrial dos polifosfatos de cadeia curta (PoliP3)

e longa (PoliP15) em relação à carga energética mitocondrial, estado redox e o seu

envolvimento na abertura de poros de transição de permeabilidade mitocondrial

5.1. Objetivos específicos

5.1.1: Analisar o metabolismo de polifosfato mitocondrial em relação à carga

energética mitocondrial;

5.1.2: Analisar a possível influência do ADP/ATP, NADH/NAD+ e Acetil-CoA nas

atividades exopolifosfatásicas mitocondriais;

5.1.3: Avaliar a influência do PoliP3 e PoliP15 sobre a atividade da F- ATPase;

5.2: Determinar os efeitos do polifosfato de cadeia curta e longa na função

mitocondrial;

5.2.1: Avaliar a influência do PoliP3 e PoliP15 na dinâmica de turgor mitocondrial;

5.2.2: Avaliar a influência do PoliP3 e PoliP15 no Transporte de Cálcio;

5.3: Determinar os efeitos do PoliP3 e PoliP15 no estresse oxidativo mitocondrial;

5.3.1: Avaliar o efeito do PoliP15 sobre a Lipoperoxidação;

5.3.2: Avaliar o efeito do PoliP15 sobre a oxidação de proteínas sulfidrilas- SH;

29

6. Materiais e métodos

6.1. Animais

As fêmeas dos carrapatos da espécie Rhipicephalus microplus foram criadas

em bovinos no Instituto de Veterinária da Universidade Federal do Rio Grande do

Sul (UFRGS) e na Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ).

Anteriormente ao início da ovoposição estas fêmeas foram enviadas ao Laboratório

Integrado de Bioquímica Hatisaburo Massuda (LIBHM) no Núcleo em Ecologia e

Desenvolvimento Sócio-Ambiental de Macaé (NUPEM) da Universidade Federal do

Rio de Janeiro (UFRJ) no Campus UFRJ-Macaé Professor Aloisio Teixeira. Neste as

fêmeas adultas plenamente ingurgitadas foram mantidas em estufas a 28 °C e 80 %

de umidade relativa, até ao final da ovoposição e os ovos mantidos nas mesmas

condições sendo utilizados para obtenção e isolamento mitocondrial.

6.2. Isolamento da fração mitocondrial

Um grama de ovos fora homogeneizado em 2 ml de tampão de isolamento

Tris-HCl 100 mM, sacarose 0,5 M, MgCl2 20 mM, leupeptina 10 mM e pepstatina 1

mM e Ph 7,2. O homogenato foi mantido a 4 °C e centrifugado a 200 xg por 2 min, o

precipitado foi descartado e o sobrenadante formado adicionado em novo tubo e

centrifugado a 2000 xg por 5 min. Após esta segunda centrifugação, o precipitado

formado também foi descartado e o sobrenadante novamente centrifugado a 8000

xg por 15 minutos. Nesta última centrifugação o sobrenadante foi descartado e o

precipitado formado contendo a fração mitocondrial foi re-homogeneizado em 30 μL

de tampão de isolamento (Campos et al., 2007).

30

6.3. Determinação da concentração de proteínas

A concentração de proteínas das amostras mitocondriais foi determinada pelo

método descrito por Bradford, (1976). O método se baseia na observação de que o

azul brilhante de Coomassie BG-250 se converte da cor vermelha para o azul após

ligação à proteína. O complexo corante e proteínas nas amostras foi formado

rapidamente e as leituras realizadas a 595 nm em espectrofotômetro Shimadzu,

modelo UV/VIS. A curva padrão para dosagem de proteínas foi construída utilizando

albumina bovina (BSA) na concentração de 2 mg/ml.

6.4. Atividade da F-ATPase

A atividade F-ATPase sensível a azida foi determinada

espectrofotometricamente de acordo com (PULLMAN 1960), na presença de

diferentes concentrações de PoliP3 e PoliP15. O ensaio foi realizado a 30º C em

uma reação contendo Tris-HCl 50 mM pH 8,0, MgCl2 2 mM, KCl 100 mM e ATP 2

mM. Foi usada azida como inibidor na concentração de 5 mM, sendo a atividade

acompanhada em espectrofotômetro a 740 nm. Foi definido como 1 unidade de

atividade enzimática a quantidade de enzima capaz de liberar 1 μmol de Pi por

minuto.

6.5. Ensaio da exopolifosfatase mitocondrial

Para avaliar a regulação da exopolifosfatase mitocondrial foi analisada sua

atividade através da liberação do fosfato inorgânico. O fosfato inorgânico formado

durante a reação foi determinado espectrofotometricamente adicionando molibdato

de amônio 0,5 %, ácido sulfúrico 0,35 M, SDS 0,5 M e ácido ascórbico 10 %. A

absorbância foi medida a 750 nm após 15 minutos de incubação (Campos et al.,

31

2007). Foi definido como 1 unidade de atividade enzimática a quantidade de enzima

capaz de liberar 1 μmol de Pi por minuto.

6.6. Avaliação do turgor mitocondrial

O poro de transição de permeabilidade mitocondrial (PTPm) foi acompanhado

como recomendado por (Kowaltowski et al.,1996), analisando o decréscimo na

absorbância em 540 nm devido ao inchamento mitocondrial, induzido por cálcio.

Utilizamos um meio de incubação composto de: KCL160 mM, HEPES-KOH 10 mM,

rotenona 5 μM, cálcio 34 μM, pH 7,4. A proteína mitocondrial (1mg/ml) foi incubada

em 2 ml do meio descrito e a captação de cálcio foi induzida pela adição de

succinato de potássio 10mM. O volume final da reação de 1ml foi mantido a 28º C.

Como moduladores da reação foram adicionados PoliP3 e PoliP15 no início do

experimento, nas concentrações de 20 μM. A adição de EGTA 1 μM, foi realizada

para confirmar se o inchamento mitocondrial observado era decorrênte do PTPm.

6.7. Avaliação da retenção de cálcio pela mitocôndria

A captação de cálcio pelas mitocôndrias foi estimada pela variação na

absorbância do arsenazo III, um indicador metalocrômico de cálcio livre, que reage

com o cálcio formando um complexo de coloração azulada. Quando a mitocôndria é

energizada, há um influxo de cálcio para seu interior, através da membrana interna,

dirigido pelo potencial elétrico formado pelo gradiente de prótons, o que diminui a

concentração do complexo no meio, reduzindo a absorbância (BORLE, 1990).

Foi utilizado um meio de incubação composto de: KCL160 mM, HEPES-KOH

10 mM, cálcio 34 μM e arsenazo III 25 μM, pH 7,4. A proteína mitocondrial (1mg/ml)

foi incubada em 2 ml do meio descrito e a captação de cálcio foi induzida pela

adição de succinato de potássio 10mM, o arsenazo III foi adicionado no início do

experimento. Foram adicionados PoliP3 e PoliP15 no início do experimento nas

32

concentrações de 20 μM (SCARPA,1979). A leitura foi realizada no espectrofômetro

há 680nm.

6.8. Lipoperoxidação da membrana mitocondrial

A peroxidação de lipídios em mitocôndrias foi avaliada através da reação de

produtos da lipoperoxidação com o ácido tiobarbitúrico, principalmente o

malondialdeído (MDA). A quantidade de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

(TBARS) foi monitorada em espectrofotômetro.

Foram adicionados 30 μL de homogenato mitocondrial (resultante do

isolamento mitocondrial, descrito anteriormrnte), sendo adicionada ao meio de

ressuspensão mitocondrial até completar o volume final de 400 μL. Foram então

incorporados ao experimento: 400 μL de ácido tiobarbitúrico 1% (TBA, solubilizado

em Na OH 50 mM), 200 μL de Ácido fosfórico 20%, 40 μL de Na OH 10 M e 10 μL

de BHT 100 mM (butil-hidroxitolueno). Para indução de um quadro de estresse

oxidativo foi adicionado ATP 1mM e succinato 5mM. Foram adicionados ao

procedimento PoliP3 e PoliP15 nas concentrações de 5 e 10 μM.

A solução foi homogeneizada e aquecida a 85º C por 20 minutos. Após esfriar

naturalmente, foram somadas ao experimento 1,5 ml de butanol, a mistura foi

agitada em votex por 3 minutos. A fase orgânica (superior) foi coletada e a

concentração determinada a partir da medida da absorbância em 535 nm, segundo

(KOWALTOWISKI et al.,1996).

6.9. Oxidação de proteínas sulfidrilas (P-SH)

Foi empregado o método de Ellmann, cujo princípio baseia-se na reação do

DTNB com grupos SH, formando o ácido 5-tio-2-nitrobenzóico (TNB), que na forma

ionizada, produz uma coloração amarelada, com pico de absorbância em 412 nm

(OWUSU- APENTEN, 2005).

33

As proteínas (1mg) da suspensão mitocondrial foram precipitadas com 1,0 ml

de ácido metafosfórico 25% e submetidas a uma centrifugação de 300 xg por 5

minutos. O precipitado resultante foi solubilizado com 0,8 μL de guanidina 6M, pH

6,0 e PoliP3 e PoliP15 nas concentrações de 5 e 10 μM. Foram então realizadas

leituras nos comprimentos de onda 412 e 530 nm no espectrofotômetro. Após as

leituras foram adicionados 50 μL de DTNB 10 mM (acido 5,5'-ditiobis-2-

nitrobenzoico), solubilizado em metanol. A solução foi incubada por 30 minutos no

escuro, à temperatura ambiente e uma nova leitura a 412 e 530 nm foi realizada. A

concentração foi obtida pela diferença de leitura nesses comprimentos de onda,

antes e após a adição do DTNB (GRATTAGLIANO, et al., 1996).

6.10. Análises estatísticas

Os resultados apresentados foram obtidos através da análise de média ± erro

de três experimentos independentes em triplicata. Na avaliação do papel do

polifosfato analisou-se a média ± desvio padrão dos resultados. Foi utilizado one

way ANOVA para análise estatística, seguido por pós-teste de Tukey para

comparações múltiplas no programa GraphPad Prism 6.

7. Resultados

Para estudar o metabolismo mitocondrial dos polifosfatos em relação à função

mitocondrial e o estado redox, primeiramente determinamos se polifosfatos de

tamanhos diferentes são capazes de modular a atividade da enzima F-ATP sintase,

(utilisando seu modo reversível) a qual atua na síntese ou degradação do ATP e se

o metabolismo desse polímero é dependente de carga energética mitocondrial.

Avaliado também o envolvimento dos referidos PoliPs na abertura de poros de

transição de permeabilidade mitocondrial em mitocôndrias extraídas de embriões de

R. microplus.

34

7.1. Avaliação da Atividade da F-ATPase

A F-ATP sintase mitocondrial é responsável pela síntese do ATP a partir de

ADP e fosfato inorgânico (Pi) a favor de um gradiente eletroquímico sendo regulada

por demanda energética. Determinamos a atividade da F-ATP sintase, através da

sua atividade reversível (F-ATPase) pela liberação de Pi, oriunda da hidrólise de

ATP, durante o desenvolvimento embrionário de R. microplus. A Figura 6 representa

o perfil de atividade da A F-ATPase, sendo observado atividade moderada no 1° e 3°

dias. No 5° dia, verificamos uma tendência da redução da atividade de hidrólise e no

7° dia observa-se um aumento na sua atividade, que atingiu seu auge no 18° dia de

embriogênese.

1 3 5 7 9 12 15 18

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

U / m

g P

TN

Figura 6: Atividade da F-ATPase durante o desenvolvimento embrionário do carrapato R.

microplus. Atividade da F-ATPase foi determinada em mitocôndrias isoladas nos diferentes

dias do desenvolvimento embrionário. A liberação de Pi foi monitorada a 740 nm. Os dados

expressam a média ± erro de 3 ensaios independentes em triplicata.

35

7.2. Avaliação da influência do polifosfato na atividade da F-ATPase.

A partir do dia de maior atividade da F-ATPase, conforme (Figura 6), foi

determinada a influência do polifosfato de cadeia curta (PoliP 3) sobre a atividade

desssa enzima. Os resultados da Figura 7 mostraram que o PoliP 3 nas

concentrações de 5, 10 e 20 μM estimulou a atividade da enzima F- ATPase se

comparado ao grupo controle.

Con

trol

e M5

M10

M

20

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

*** *** ***

U / m

g P

TN

Figura 7: Influência do PoliP3 na atividade da F-ATPase durante os últimos dias de

embriogenese do carrapato R. microplus. PoliP3 foi adicionado nas concentrações de 5,10 e

20 μM. A liberação de Pi foi monitorada a 740 nm. Os dados expressam a média ± erro de 3

ensaios independentes em triplicata.

De forma similar ao teste anterior, a F-ATPase também foi avaliada na

presença de PoliP15, nas concentrações (5, 10 e 20 μM). Observa-se que na Figura

8 não há diferença significativa com relação ao grupo controle, o que indica que o

PoliP de cadeia longa não foi capaz de gerar alterações na atividade da F-ATPase.

36

Con

trol

e M5

M10

M

20

0.00

0.05

0.10

0.15

U / m

g P

TN

Figura 8: Influência do PoliP15 na atividade da F-ATPase durante os últimos dias de

embriogenese do carrapato R. microplus. PoliP15 nas concentrações de 5, 10 e 20 μM. A

liberação de Pi foi monitorada a 740 nm. Os dados expressam a média ± erro de 3 ensaios

independentes em triplicata

7.3. Modulação da atividade exopolifosfatásica mitocondrial por demanda

energética.

Mitocôndrias de embriões de R. microplus foram isoladas, e a relação da

exopolifosfatase mitocondrial com o metabolismo energético mitocondrial foi

determinado nestas. Para isto, foi investigada a influência de substratos energéticos

moduladores da atividade mitocondrial sobre o metabolismo do polifosfato

(avaliando a atividade da principal enzima de degradação desse polímero).

37

7.3.1 A influência da razão ATP/ADP na atividade da exopolifosfatase.

Investigamos a atividade da exopolifosfatase mitocondrial utilizando como

modulador da reação a razão ATP/ADP. Esta razão respeitou as proporções de 1:1,

5:1 e 10:1 que foram utilizadas para os dois substratos energéticos. O teste mostrou

que a PPX foi estimulada em momentos de diminuição da razão ATP/ADP, há uma

maior disponibilidade de ADP. Esse efeito estimulatório diminuiu com o aumento da

concentração de ATP (Figura 9).

ATP : ADP

1:10 1:

51:

15:

110

:1

0.00.2

0.3

0.5

0.7

**

***

U / m

g P

TN

Figura 9: Influência da razão ATP/ADP na atividade da exopolifosfatase mitocondrial em

ovos de R. microplus no estágio de desenvolvimento embrionário, nas proporções de 1:1,5:1

e 10:1. A atividade foi determinada pelo método de Campos et al. (2008). Os dados

expressam a média ± desvio padrão de 3 ensaios, sendo cada ensaio realizado em

triplicata.

38

7.3.2. A influência da razão NADH/NAD+ na atividade da exopolifosfatase.

As coenzimas NADH/NAD+ são de extrema importância para a produção e

manutenção do gradiente de prótons e suas concentrações são utilizadas como

indicadores do estado energético. Dessa forma é necessária uma relação

NADH/NAD+, ideal para uma eficiência no metabolismo mitocondrial, sendo essa

relação indispenável para produção de ATP (YING, 2008). Verificamos maiores

atividades na presença de altas concentrações de NAD+, caracterizando maior

hidrólise em condições energéticas desfavoráveis. Esse quadro estimulatório

diminuiu com o aumento das concentrações de NADH (Figura 10).

NADH : NAD+

1:10 1:

51:

15:

110

:1

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

**

U / m

g P

TN

Figura 10: Influência da razão NADH/NAD+ na atividade da exopolifosfatase mitocondrial em

ovos de R. microplus no estágio de desenvolvimento embrionário, nas proporções de 1:1,5:1

e 10:1. A atividade foi determinada pelo método de Campos et al. (2008). Os dados

expressam a média ± desvio padrão de 3 ensaios, sendo cada ensaio realizado em

triplicata.

39

7.3.3. A influência de diferentes concentrações de Acetil Coa na atividade da

exopolifosfatase.

O Acetil-CoA é um metabólico derivado de glicose, ácidos graxos e

catabolismo de aminoácidos. Desta forma, apesar de ser um composto

intermediário, ele influencia diretamente a produção energética mitocondrial. Como

pode ser observado, o Acetil-Coa nas concentrações de 30, 60 e 300 μM, não

promoveu modulação significativa na atividade da PPX se comparado ao grupo

controle (Figura 11).

Con

trol

e M30

M

60

M

300

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

U / m

g P

TN

Figura 11: Influência do efeito do Acetil-CoA na atividade da exopolifosfatase mitocondrial

em ovos de R. microplus no estágio de desenvolvimento embrionário. Foram utilizadas

concentrações de 30, 60 e 300 μM, e a atividade foi determinada pelo método de Campos et

al. (2008). Os dados expressam a média ± desvio padrão de 3 ensaios, sendo cada ensaio

realizado em triplicata.

40

7.4. Avaliação do tugor mitocondrial

O tugor mitocondrial é um evento que caracteriza a formação de poros de

transição de permeabilidade mitocondrial. Neste sentido, foi avaliada a influência do

polifosfato, sobre o tugor mitocondrial induzido pelo cálcio. Foi possível observar

esse evento com a diminuição da absorbância em 520 nm, representando a

formação do PTPm ao considerar que, na presença do EGTA, um conhecido inibidor

do PTPm (KOWALTOWSKI; CASTILHO; VERCESI, 2001), não houve alterações na

estrutura mitocondrial. O PoliP15 foi capaz de potencializar o tugor mitocondrial na

presença de cálcio, enquanto que o PoliP3 não apresentou modificação sobre esse

evento (Figura 12).

Con

trol

e S/ C

a+

Con

trol

e C/ E

GTA

Con

trol

e C/ C

a +

Pol

y P3

poly

P15

0

1

2

3

4***

AB

S / m

in

Figura 12: Efeito do PoliP3 e PoliP15 sobre o tugor mitocondrial induzido por cálcio . Foi

adicionado ao experimento um estimulante da cadeia respiratória (succinato 10 mM). Cálcio

foi adicionado na concentração de 34 μM ao meio de reação e PoliP à 20 μM. Adicionamos

ao experimento EGTA 1 μM, como inibidor do poro. Os dados expressam a média ± desvio

padrão de 3 ensaios, sendo cada ensaio realizado em triplicata.

41

7.4.1. Retenção de cálcio pela mitocôndria.

A Figura 13 mostra que a adição do PoliP de cadeia curta e longa

promoveram uma diminuição da retenção de cálcio pela mitocôndria em relação ao

grupo controle, sendo o PoliP3 mais eficiênte na promoção da retenção se

comparado ao PoliP15.

Con

trol

e

Pol

y P3

Pol

y P1

5

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

***

**

A

BS

/ m

in / m

g P

TN

Figura 13: Efeito do PoliP3 e PoliP15 sobre a retenção de cálcio em mitocôndrias de ovos

de R. microplus no estágio de desenvolvimento embrionário. Foi adicionado ao experimento

um estimulante da cadeia respiratória (succinato de potássio 10 mM). Cálcio foi adicionado

na concentração de 34 μM ao meio de reação e PoliPs nas concentrações de 20 μM. Os

dados expressam a média ± desvio padrão de 3 ensaios, sendo cada ensaio realizado em

triplicata.

42

7.5. Avaliação da Lipoperóxidação

Con

trol

e M5

M10

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

AB

S

Figura 14: Efeito do PoliP15 sobre a lipoperoxidação em mitocôndrias de embriões de R.

micriplus. Os resultados não mostraram diferença significativa nas comparações com o

controle. As concentrações testadas foram de 5 e 10 μM de PoliP. Os dados expressam a

média ± erro de 3 ensaios independentes em triplicata.

Para avaliar o papel dos polifosfatos na prevenção contra danos gerados pelo

estresse oxidativo, utilizou-se a metodologia de avaliação da lipoperoxidação. As

membranas biológicas são ricas em lipídios tornando facilmente suscetíveis ao

ataque peroxidativo. Neste ensaio, os produtos da lipoperoxidação foram

quantificados através da reação com o ácido tiobarbitúrico, em meio com

mitocôndrias isoladas de embriões de R. micriplus, na presença de PoliP15, nas

concentrações de 5 e 10 μM. Observamos na Figura 14 que o PoliP não gerou efeito

inibitório sobre a lipoperoxidação em nenhuma das concentrações.

43

7.5.1. Avaliação de oxidação de proteínas sulfidrilas (SH)

Con

trol

e M5

M10

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

AB

S

Figura 15: Efeito do PoliP15 sobre a oxidação de proteínas, em mitocôndrias de embriões

de R. micriplus. As concentrações testadas foram de 5 e 10 μM . Os resultados não

mostraram diferença significativa nas comparações com o controle. Os dados expressam a

média ± erro de 3 ensaios independentes em triplicata

Os tióis são uma classe de compostos orgânicos que contêm um grupo

sulfidrilo (-SH). Na verdade, os tióis podem sofrer processos de oxidação na

presença de oxidantes para produzir uma ampla gama de produtos, alguns dos

quais, como os dissulfetos (STADTMAN; LEVINE, 2003).

O nível de tióis é mais comumente medido usando o reagente Ellman

clássico, ácido 5,5'-ditiobis (2-nitrobenzóico). Foram avaliados os produtos da

oxidação de proteínas apartir do grupo SH, na presença de polifosfatos de cadeia

curta. Observamos na Figura 15 que o PoliP não gerou efeito inibitório sobre a

oxidação de proteínas em nenhuma das concentrações.

44

8. DISCUSSÃO

O PoliP foi encontrado em todos os organismos estudados até o momento,

apresentando variadas concentrações e tamanhos de cadeias que são dependentes

do tipo de organismo e localização celular. Em microorganismo, nos quais grande

parte dos estudos sobre PoliP tem sido feitos, há evidências do envolvimento dessas

moléculas em inúmeros processos, incluindo armazenamento de fosfato inorgânico

e de energia e quelação de metais (KULAKOVSKAYA; KULAEV, 2013; RAO;

GÓMEZ-GARCÍA; KORNBERG, 2009). Em células de mamíferos, o PoliP

desempenha funções na coagulação sanguínea, regulação de atividades

enzimáticas e como molécula de sinalização do sistema nervoso central (GRAY et

al., 2014;HOLMSTROM et al., 2013).

Pavlov et al. (2010), sugerem que a mitocôndria seja a grande produtora de

PoliP da célula, sendo necessária a atividade mitocondrial em condições normais.

Kulakovskaya (2010) observou grande conteúdo de PoliP em mitocôndrias de

leveduras, compreendendo de 7 a 10 % do volume total celular sendo localizados e

interligados às membranas, no espaço intermembranar e na matriz mitocondrial.

Segundo Abramov et al. (2007) o PoliP está envolvolvido na atividade da

cadeia respiratória, mostrando que a redução das suas concentrações pelo aumento

da expressão PPX, gera modulações significativas da bioenergética mitocondrial em

condições normais, sugerindo um suposto mecanismo de regulação entre a F -ATP

sintase e as enzimas do metabolismo do PoliP (PAVLOV et al., 2010).

O complexo mitocondrial F-ATP sintase é um complexo enzimático que

funciona como uma máquina molecular capaz de gerar em condições fisiológicas

ATP, mas in vitro também pode funcionar em modo reverso e hidrolisar ATP. Essa

enzima garante a maior produção de energia da célula, sendo assim, sua atividade

se torna indispensável para a viabilidade celular (WAGNER et al., 2010). Durante o

desenvolvimento embrionário a necessidade de energia é muito elevada, devido às

modificações celulares características dessa fase. No R. microplus essa energia é

obtida pela quebra de biomoléculas como lipídeos, proteínas e carboidratos, que são

estocadas pela mãe e mobilizadas de forma seletiva garantido toda formação do

45

embrião (MORAES et al., 2007). Foi demonstrado que a F-ATP sintase é

indispensável para os processos de diferenciação celular, promovendo a maturação

das cristas mitocondriais em células tronco em Drosophila melanogaster, processo

essencial para o desenvolvimento do animal e a homeostase dos tecidos (TEIXEIRA

et al., 2015).

A atividade da F-ATPase foi avaliada durante o desenvolvimento embrionário

do carrapato R. microplus, mostrando baixa atividade durante os sete primeiros dias

de embriogênese, com um aumento gradativo de atividade, chegando ao seu nível

mais elevado próximo ao período de eclosão (Figura 6).

De forma curiosa, o aumento da atividade dessa enzima próximo à eclosão,

não reflete um maior consumo de oxigênio necessário para síntese de ATP.

Segundo CAMPOS et al. (2006), o consumo de oxigênio no ovo de R. microplus foi

mais elevado durante os 12 primeiros dias de desenvolvimento, períodos que

incluem a celularização e segmentação do embrião.

Um fator relevante, seria uma possível alteração das mitocôndrias, já que o

grau de acoplamento para gerar ATP varia em diferentes tecidos, ambiente,

espécies e tempo de vida (BROOKES et al.,1998).

Dessa forma sugerimos que parte do oxigênio consumido durante a fase

inicial tenha sido direcionado para outros fins metabólicos. Segundo BRAND et al.

(2000) as mitocôndrias podem se apresentar parcialmente acopladas durante a

fosforilação oxidativa, sendo que parte da energia redox é perdida como calor. O

acoplamento incompleto deve-se principalmente a um vazamento natural de prótons

através da membrana interna mitocondrial, responsável por perdas de 20-25% da

respiração, gerando um consumo elevado de oxigênio e substratos energéticos, com

baixa atividade da ATP sintase. Esse evento foi indispensável para diminuição da

produção de ROS. Esse fato é de grande importância para minimizar os danos

oxidativos ao DNA e a outras estruturas. Dessa forma, essa baixa produção de

energia pode ser um mecanismo de proteção importância para o carrapato R.

microplus, que apresenta taxas elevadas de produção de ROS, durante os dez

primeiros dias de embriogenese (FRAGA 2013). Com isso outras fontes energéticas

podem ser mobilizadas a fim de compensar essa diminuição na produção de ATP

46

via fosforilação oxidativa. Dessa forma Campos et al. (2008) em um de seus

trabalhos sugere uma maior utilização do PoliP, sendo mobilizados durante a fase

inicial de desenvolvimento embrionário.

Esses fatos nos levam a sugerir, que o aumento da atividade da F-ATP

sintase, utilizando menor conteúdo de oxigênio, nos últimos dias de desenvolvimento

embrionário, possam indicar uma maior eficiência energética mitocondrial, sugerindo

como uma possibilidade de estratégia adaptativa desse animal.

A partir dos dados obtidos inicialmente, decidimos utilizar os últimos dias de

desenvolvimento embrionário para avaliar o papel regulador do polifosfato nas

concentrações de 5, 10 e 20 μM, sobre a atividade da F- ATPase. Observamos um

aumento de atividade dessa enzima, na presença de PoliP3 (Figura 7). De forma a

corroborar com nossos resultados Abramov et al. (2007), observaram que a

depleção de PoliP diminuiu o potencial de membrana em condições normais da

mitocôndria. Curiosamente Muller et al. (2015), a partir da exposição de células

semelhantes a osteoblasto incubadas com PoliP durante três dias, observaram

modificações mitocondriais, refletindo em aumento intracelular da produção de ATP,

que alcançou concentrações dez vezes maiores. Como resultado, houve uma maior

deposição óssea por essas células. Em nossos experimentos não observamos

resultados estimulatórios da atividade da F- ATPase na preseça de PoliP15 (Figura

8).

Modificações na atividade da F- ATPase, podem gerar comprometimentos ao

desenvolvimento embrionário, sendo a diminuição da produção de ATP um fator

crítico para embriogênese (TEIXEIRA et al., 2015). Salin et al. (2012),

acompanharam a capacidade mitocondrial de gerar ATP durante o desenvolvimento

larval de girinos, através de exposição crônica (34 dias) ao desacoplador

mitocondrial 2,4-dinitrofenol (dNP). Como resultado os animais desenvolveram

baixas taxas de crescimento e alterações fisiológicas.

Foi demonstrado que o nível de PoliP em células eucarióticas é muito

dinâmico e muda rapidamente em resposta a vários inibidores e ativadores da

respiração mitocondrial (CAMPOS et al., 2008), sendo proposto que o PoliP seja

constantemente produzido e consumido por células de mamíferos, e que essa

47

elevada taxa de renovação é consistente com um papel regulador do PoliP na

fisiologia celular (PAVLOV et al., 2010).

Foi proposto que a produção de PoliP está diretamente ligada à respiração

mitocondrial e à fosforilação oxidativa, tendo a exopolifosfatase aumentado sua

atividade durante a respiração mitocondrial após a adição de desacopladores e

inibidorores da cadeia respiratória, e o seu efeito estimulatório desapareceu após a

adição de estimulantes da cadeia respiratória como o piruvato e succinato

(SEIDLMAYER et al., 2015; FRAGA et al., 2013).

Segundo Lindner et al. (2009) o metabolismo do PoliP intracelular em

bactérias é controlado pela carga energética. Nosso grupo,estabeleceu uma

metodologia de isolamento de mitocondrias acopladas que permite compreender

diferentes quadros energético em embriões de R. microplus, a partir de utilização de

substratos moduladores da atividade mitocondrial, que podem variar entre

estimulação da produção energética ou colapso energético (CAMPOS et al., 2008),

possibilitando o estudo de diferentes condições

A atividade de inúmeras enzimas é regulada pelas concentrações de

ATP/ADP (MOR; CHEUNG;VOUSDEN, 2011; YTTING et al., 2012). Essas

concentrações são dependentes do estágio de crescimento e acesso a nutrientes

(YTTING et al., 2012; DREW et al.,2003).

A influência da condição metabólica mitocondrial sobre o metabolismo do

PoliP, foi avaliada, sendo acompanhada a atividade da PPX, que é a principal

enzima responsável pela hidrólise do polímero. Foram utilizados diferentes

substratos metabólicos reguladores da atividade mitocondrial e apenas o PoliP3

como substrato da PPX, pois em R. microplus essa enzima apresenta maior

afinidade ao PoliP de cadeia curta (CAMPOS et al., 2008).

Para relacionarmos a condição metabólica com a atividade da

exopolifosfatase, primeiramente estabelecemos uma razão ATP/ADP. Manter uma

relação ATP/ADP alta é um dos parâmetros mais fundamentais para a manutenção

da viabilidade celular e alterações nessa relação (diminuição ou aumento do

conteúdo de ATP), provocam profundas alterações no metabolismo energético

(STEIN; IMAI, 2012; TOWLER; HARDIE, 2007; SHI; TU, 2015). Observamos, de

48

acordo com os resultados na (Figura 9), maior atividade da exopolifosfatase, com a

diminuição da razão ATP/ADP. Nessas condições as concentrações de ADP estão

elevadas, caracterizando um quadro de baixa energia (STEIN; IMAI, 2012;

TOWLER; HARDIE, 2007; SHI; TU, 2015). Estudos realizados por Andreeva et al.

(2015) e Campos et al. (2007), verificaram a presença de uma exopoliposfatase

mitocondrial em Saccharomyces cerevisiae e R.microplus, respectivamente, sendo

estimuladas na presença de concentrações elevadas de ADP. Trilisenko e

Kulakovskaya (2014) acompanharam o crescimento de culturas de S. cerevisiae sob

exaustão de glicose, onde observaram menores cadeias de PoliP em condições de

fome. Sugerimos que a maior atividade da PPx nessa condição seja para o possível

fornecimento de Pi, garantindo a manutenção do metabolismo energético. Campos

et al. (2007) mediram o consumo de oxigênio dependente de ADP na presença de

polifosfato e na ausência de qualquer outra fonte de Pi, sendo caracterizada

atividade dessa enzima para manutenção da síntese de ATP. Nossos dados

mostram uma diminuição do efeito estimulatório com aumento das concentrações de

ATP (Figura 9). De forma semelhante, Andreeva et al. (2015) relatou em

Saccharomyces cerevisiae inibição da atividade da PPX na presença de ATP e

magnésio. Portanto, apartir desses dados sugerimos que com a elevada razão

ATP/ADP, há inibição da via glicolítica, favorecendo outras vias (MOR; CHEUNG;

VOUSDEN, 2011). Sendo assim a liberação de fosfato inorgânico para a síntese de

ATP ou como possível fonte auxiliar de energia não se faz necessário, justificando o

decréscimo de atividade da PPX.

As produçõe de ATP mitocondrial a partir do potencial de membrana exigem o

cofator universal, as nicotinamidas adeninas dinucleotídeo (NAD+). Como uma

coenzima essencial, NAD+ ganha dois elétrons e um proton em etapas múltiplas do

ciclo de Krebs, sendo reduzido a NADH. A razão NADH/NAD+ apresenta diferenças

consideráveis em diferentes organismos em condições idênticas. Nas mitocôndrias o

seu conteúdo é relativamente distinto do resto da célula (YANG et al., 2007; HUNG

et al., 2011).

Além do seu papel como doador de elétrons, são utilizados por centenas de

enzimas que catalisam a oxidação do substrato e, como tal, desempenha um papel

fundamental na regulação mitocondrial, sendo indispensável para inúmeros

49

processos biológicos (DUMOLLARD et al., 2006; ETO et al., 1999; ZHANG et al.,

2006; GARRIGA-CANUT et al., 2006). Observamos menores atividades da PPX

quando a razão NADH/NAD+ se apresentava elevada (Figura 10) e um efeito

estimulatório com a diminuição da razão. Esses dados reforçam a hipótese de

maiores atividades da PPX em quadros de baixa energia.

No catabolismo, os metabólitos derivado de glicose, ácidos graxos e

aminoácidos convergem para um caminho central, que posteriormente poderão ser

transformadas em um intermediário comum, Acetil-CoA. Sob condições de excesso

de carboidratos ou glicose, o acetil-CoA é direcionado para longe das mitocôndrias e

de volta ao citosol para a síntese de ácidos graxos, indicando estado nutricional

favorável (SHI; TU, 2015). O Acetil-CoA é considerado uma molécula de sinalização

metabólica crítica de regulação de inúmeras vias (PERRY et al., 2017). No presente

trabalho não foi observado diferença significativa de atividade da PPX quando

utilizados concentrações de Acetil-CoA nas dosagens de 30, 60 e 300 µM (Figura

11).

A função mitocondrial e a sinalização de cálcio estão intimamente ligadas, já

que seu sinal é o principal meio de comunicação entre o citosol e a produção

energética. É o sinal de cálcio que informa para as mitocôndrias que é necessário

maior ou menor produção de energia (HERRERO-MENDEZ et al., 2009) mas seu

acúmulo excessivo no interior da mitocôndria é um dos principais fatores

responsáveis pela abertura do PTPm durante disfunções mitocondriais (RASOLA;

BERNARDI, 2011; RICCHELLI; ŀILEIKYTė; BERNARDI, 2011). Foi proposto um

possível papel do PoliP na regulação da permeabilidade mitocondrial ativando ou

participando da formação do poro de transição de permeabilidade mitocondrial

(ABRAMOV et al., 2007).

Foram avaliados a indução do PTPm pelo cálcio na presença de PoliP. Neste

fenômeno o cálcio promove alterações na produção de ROS promovendo colapso

energético, inchamento da matriz mitocondrial e liberação de citocromo c

(KOWALTOWISKI et al.,2001).

Inicialmente verificamos que o cálcio foi capaz de provocar o inchamento

mitocondrial (Figura 12). Esse dado já é bem descrito pela literatura, que mostra o

50

papel do cálcio na promoção desse evento (MARCHI et al., 2014). Além disto foi

verificado que esse efeito foi totalmente previnido por EGTA, um inibidor de abertura

de poros (KOWALTOWISKI et al.,2001;NICHOLLS et al., 1978), indicando o

envolvimento da abertura de PTPm nos mesmos.

No entanto, os detalhes da natureza molecular e os mecanismos indutores do

PTPm permanecem mal compreendidos. Os resultados da (Figura 12), mostram que

o PoliP15 potencializou os efeitos gerados pelo cálcio. Em contra partida o PoliP3

não gerou nenhuma modificação sobre o inchamento mitocondrial.

Inicialmente os dados nos levavam a acreditar que o estímulo gerado pelo

PoliP15 (maior inchamento mitocondrial), em grande parte, era decorrente da sua

capacidade de induzir um maior potencial de membrana (ABRAMOV et al., 2007),

tendo em vista que o transito de cálcio para o interior da mitocôndria é dependente

do potencial de membrana (GUNTER et al.,1990). Posteriormente para um maior

entendimento sobre o papel do PoliP no inchamento mitocondrial, utilizamos a

metodologia de retenção de cálcio pelas mitocôndrias durante a formação do PTPm.

Observamos que tanto o PoliP3 quanto o PoliP15 promoveram uma diminuição da

retenção de cácio pelas mitocôndrias, contudo, somento o PoliP15 potencializou a

formação do PTPm sugerindo a possibilidade de interação desse componente na

estrutura do poro (Figura 13).

Reusch et al., (1988) descreveram pela primeira vez a formação de um canal

em membranas de E.coli, sendo um complexo não protéico formado por dois

Polímeros o PoliP+Poli-hidroxibutirato+cálcio. Posteriormente um complexo similar

foi isolado de mitocôndrias do fígado do rato (PAVLOV et al., 2005). Esses

complexos apresentam condução de íons e propriedades similares às encontradas

em PTPm, sugerindo que a possibilidade da contribuição do PoliP para a indução da

abertura do PTPm pode ser explicado pelas suas interações mediadas por cálcio e

Poli-hidroxibutirato (PAVLOV et al., 2005).

Os dados recentes sugerem que os dímeros da F-ATPase podem formar

canais com características similares ao PTPm, pelo fato de se ligarem a ciclofilina D,

um regulador de abertura de poros, que sensibiliza o poro para cálcio (GIORGIO et

al., 2013). No entanto, os detalhes moleculares da formação do canal pela F-

51

ATPase permanecem obscuros. Uma atenção especial foi trazida para a subunidade

c da F- ATPase como um componente potencial do PTPm (BONORA et al., 2013).

Uma outra possível hipótese para a participação da F-ATPase seria que, após os

danos gerados pelo inchaço da matriz mitocondrial, com perdas de gradientes

eletroquímicos e consequentemente interrupção da produção de energia essa

enzima passe a hidrolisar ATP, aumentando os danos e acelerando a morte celular (

HALESTRAP; PASDOIS, 2009; BERNARDI; LISA, 2015). Observamos uma

estimulação da atividade da F-ATP ase (no modo reversível), na presença do PoliP3

(Figura 7). Dessa forma o conteúdo de PoliP pode ser um fator decisivo na

regulação do poro pelo fato de interagir com a F -ATPase.

Segundo Seidlmayer et al. (2012) a depleção de PoliP fosiológico nas

mitocôndrias de miócitos ventriculares de coelho, levou a inibição significativa da

abertura de PTPm. Esses dados apontam na direção de um possível efeito duplo do

PoliP relacionado ao PTPm, sugerindo um papel protetor desse polímero.

Com relação ao mecanismo indutor do PTPm, o ataque oxidativo decorrente

de alta produção de ROS tem sido um dos mais estudados (KOWALTOWISKI et

al.,2001; KOMARY; TRETTER; ADAM-VIZI, 2010; SEIDLMAYER et al., 2015).

Foi observado que a diminuição do conteúdo do PoliP torna as mitocôndrias

mais suscetíveis a condições de estresse (SEIDLMAYER et al., 2015), envolvendo o

PoliP nos mecanismos de resposta ao estresse.Esse papel protetor do PoliP é bem

conhecido em bactérias, sendo pouco investigado em mitocôndrias. Estudos

recentes realizados em bactérias indicam que, durante o estresse oxidativo, os

organismos podem responder por uma acumulação dramática de PoliP, sugerindo

ser usado para a proteção celular por interagir com proteínas promovendo proteção

dessas estruturas (GRAY et al., 2014). Demonstrou-se que E. coli de tipo selvagem

geraram quantidades significativas de PoliP em resposta ao estresse oxidativo. Esta

acumulação de PoliP desempenhou um papel crítico na defesa de E. coli, uma vez

que mutantes PPK que não são capazes de produzir o PoliP exibiram diminuição da

sobrevivência em comparação com cepas de tipo selvagem em resposta ao estress

oxidativo ou calor (GRAY et al., 2014). De forma interessante, foi relatado um

aumento significativo na geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) e morte

52

celular em miócitos ventriculares empobrecidos de PoliP, expostos à isquemia-

reperfusão (Seidlmayer et al., 2013).

Além disso, foi demonstrado que o ácido hipocloroso (HOCl), um ingrediente

ativo de uso doméstico, é um potente oxidante bactericida (GRAY; WHOLEY;

JAKOB, 2013). Sua ação está baseada por causar danos extremamente rápidos as

proteínas, pela oxidação de cisteína, metionina, histidina e outros aminoácidos,

levando ao desdobramento e agregação de proteínas oxidadas (DEBORDE; VON

GUNTEN, 2008). Um estudo recente, verificou a resposta de E. coli ao HOCl

mostrando que o tr