GIOVANA CÁSSIA DE FREITAS LEMESZENSKI - USP · 2013-06-06 · GIOVANA CÁSSIA DE FREITAS...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

INSTITUTO DE QUÍMICA

Programa de Pós-Graduação em Química

GIOVANA CÁSSIA DE FREITAS LEMESZENSKI

Protoflavonoides e meroterpenos de

espécies de Piper

Versão corrigida da tese defendida conforme resolução CoPGr 5890 O original se encontra disponível na Secretaria de Pós-Graduação do IQ-USP

São Paulo

Data de depósito na SPG

04/06/2013

GIOVANA CÁSSIA DE FREITAS LEMESZENSKI

Protoflavonoides e meroterpenos de

espécies de Piper

Tese apresentada ao Instituto de Química

da Universidade de São Paulo para obtenção

do Título de Doutor em Química

Orientador: Prof. Dr. Massuo Jorge Kato

São Paulo

2013

Ficha Catalográfica

Elaborada pela Divisão de Biblioteca e

Documentação do Conjunto das Químicas da USP.

Lemeszenski , Giovana Cássia de Frei tas

L552p Pro tof lavonoides e mero terpenos de espéc ies de Piper /

Giovana Cáss ia de Fre i tas Lemeszenski . -- São Paulo , 201 3 .

203p.

Tese (doutorado ) – Inst i tuto de Química da Universidade de

São Paulo. Departamento de Química Fundamental .

Orientador: Kato, Massuo Jorge

1 . Produtos naturais 2. Quimiometr ia I . T . I I . Kato, Massuo

Jorge , or ientador .

547.7 CDD

Giovana Cássia de Freitas Lemeszenski

Protoflavonoides e meroterpenos de espécies de Piper

Tese apresentada ao Instituto de Química

da Universidade de São Paulo para obtenção

do Título de Doutor em Química

Aprovado em 05 de abril de 2013.

Banca Examinadora

Prof. Dr. Massuo Jorge Kato

Instituição: Instituto de Química – USP

Prof. Dr. Paulo Cezar Vieira

Instituição: Universidade Federal de São Carlos

Prof. Dr. Frederico Guaré Cruz

Instituição: Universidade Federal da Bahia

Prof. Dr. Angelo Cunha Pinto

Instituição: Universidade Federal do Rio de Janeiro

Prof. Dr. Reinaldo Carmino Bazito

Instituição: Instituto de Química – USP

A Deus.

Aos meus pais Cleide e Luis Carlos.

Aos meus irmãos André e Mônica.

Ao meu esposo Daniel.

Com amor e gratidão por estarem sempre ao meu lado.

AGRADECIMENTOS

À Universidade de São Paulo e ao Instituto de Química pela oportunidade em

realizar este trabalho de pesquisa.

Ao Prof. Dr. Massuo Jorge Kato, pela orientação, compreensão,

ensinamentos e pelos conselhos no decorrer destes seis anos de trabalho.

À FAPESP e ao CNPq pelas bolsas concedidas e pelo apoio financeiro.

Aos funcionários da SPG do IQ-USP pela atenção e apoio.

Ao Gilberto Franchi e à Profa. Maria Claudia Max Young pelos ensaios

realizados.

Ao Dr. João Marcos Batista Junior (Instituto de Química – UNESP) pela

colaboração nos cálculos de DFT.

Ao Prof. Dr. Marcus Tullius Scotti (UFPB) e Msc. Harold Hilarion Fokoue

(LQPN-IQUSP) pela colaboração nos cálculos de quimiometria.

À Profa. Dra. Elsie F. Guimarães (Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do

Rio de Janeiro) pela identificação das espécies vegetais.

Ao Dr. Frederico Drumont Martins, Chefe da Floresta Nacional de Carajás

(ICMBio – MMA) e a Cia Vale pela colaboração nas coletas das plantas.

Aos amigos e colegas do LQPN: Adalberto, Alberto, Aline, Anderson,

Augusto, Camila, Celso, Cristina, Edgard, Erica, Fábio Chaves, Fábio Rodrigues,

Graça, Harold, Homero, Juliana, Joca, Joaquim Matheus, Karina, Lucas, Lydia,

Marcilio, Mariana, Mauro, Nidia, Renata, Vitor Bueno, Vitor Ferraz e Yasmin.

Aos amigos e colegas do IQ: Viviane, Tati, Claudinei, Denise, Georgia, Lya,

Luciana, Emerson e Fernanda, pela amizade.

Aos colegas da Central Analítica, pelas análises realizadas, pelo apoio e

amizade: Alessandra, Alfredo, Cristiane, Denize, Emerson, Fernando, Janaína,

Luzia, Márcio Nardelli, Márcio Santos, Margarida, Michele, Miriam, Nanci e Rebeca.

À minha família, principalmente por compreender minha ausência e me apoiar

no decorrer deste trajeto.

A todos que contribuíram para a realização deste trabalho.

“Cada planta tem centenas de substâncias

e uma delas pode ser mais importante do que uma galáxia.”

(Otto R. Gottlieb)

RESUMO

Freitas Lemeszenski, G.C. Protoflavonoides e meroterpenos de espécies de Piper. 2013. 203p. Tese. Programa de Pós-Graduação em Química. Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.

As espécies da família Piperaceae, Piper bowiei, P. caldense, P.

carniconnectivum e P. permucronatum apresentam uma característica morfológica

em comum que são os frutos pendentes e globosos. Seus extratos brutos foram

submetidos às análises de espectrometria de massas e ressonância magnética

nuclear e os espectros obtidos submetidos às análises quimiométricas por PCA

(análise de componentes principais) e HCA (análise por agrupamento hierárquico) a

fim de obter uma diferenciação entre as espécies ou observar suas possíveis

similaridades. Os resultados obtidos em uma análise preliminar estimularam-nos a

realizar o estudo fitoquímico em busca de seus constituintes majoritários. Foram

isoladas e identificadas treze substâncias, sendo quatro meroterpenos e nove

flavonoides, dos quais seis são descritos pela primeira vez. Ensaios de atividade

antifúngica e antitumoral foram realizados levando em consideração relatos da

literatura de substâncias com estruturas similares.

Palavras Chave: Piperaceae, Piper, protoflavonoides, meroterpenos, metabolôma.

ABSTRACT

Freitas Lemeszenski, G.C. Protoflavonoids and meroterpenes from Piper species. 2013 203p. PhD Thesis. Graduate Program in Chemistry. Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.

The Piperaceae species Piper bowiei, P. caldense, P. carniconnectivum and

P. permucronatum have pendant fruits as a common morphological characteristic.

Thus, their extracts were analyzed by mass spectrometry and nuclear magnetic

resonance and submitted to chemometric analysis by PCA (principal component

analysis) and HCA (hierarchical cluster analysis) in order to get a differentiation

between species and to observe their possible similarities. Based on the results

obtained in a preliminary analysis the phytochemical studies were carried out on their

crude extracts in order to identify their major constituents. The study allowed the

identification of thirteen compounds, being four meroterpenes and nine flavonoids,

six of which were described for the first time. Biological activity assays were

performed taking into account the potential activities reported for similar compounds.

Keywords: Piperaceae, Piper, protoflavonoids, meroterpenes, metabolome.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Distribuição geográfica das espécies de Piper (Jaramillo; Manos, 2001). . 22

Figura 2. Estrutura da aristolactama caldensina. ...................................................... 24

Figura 3. Imagens da planta P. caldense. ................................................................ 24

Figura 4. Imagem da planta P. carniconnectivum. .................................................... 26

Figura 5. Metabólitos isolados das raízes de Piper carniconnectivum. .................... 26

Figura 6. Estrutura da protoapigenona (55). ............................................................. 35

Figura 7. Efeito dos substituintes na atividade antitumoral das protoflavonas (Lin; Nakagawa-Goto; et al., 2007). ................................................................................... 35

Figura 8. Processamento da matriz por PCA resultando nos gráficos de scores e loadings. .................................................................................................................... 42

Figura 9. Processamento da matriz por HCA resultando no dendrograma. ............. 43

Figura 10. Cromatograma obtido por CLAE-UV-Vis (254 nm) do extrato bruto das folhas de P. caldense (K842-FA). .............................................................................. 50

Figura 11. Espectro de RMN de 1H do extrato bruto das folhas de P. caldense (K-842 FA, CDCl3, 500 MHz). ......................................................................................... 51

Figura 12. Cromatograma obtido por CLAE-UV-Vis (254 nm) do extrato bruto das folhas de P. bowiei (K-364FA). .................................................................................. 52

Figura 13. Espectro de RMN de 1H do extrato bruto das folhas de P. bowiei (K-364 FA, CDCl3, 200 MHz). ................................................................................................ 52

Figura 14. Cromatograma obtido por CLAE de K-1022 FA. ..................................... 54

Figura 15. Espectro de RMN de 1H do extrato K-1022 FA (500 MHz, CDCl3). ......... 54

Figura 16. Cromatograma CLAE de K-1441 FA. ...................................................... 55

Figura 17. Espectro de RMN de 1H de K-1441 FA (500 MHz, CDCl3). ..................... 56

Figura 18. Cromatograma CLAE de K-1441 FrA. ..................................................... 57

Figura 19. Espectro de RMN de 1H de K-1441 FrA (500 MHz, CDCl3). .................... 57

Figura 20. Cromatograma obtido por CLAE de K-1600 FC. ..................................... 58

Figura 21. Espectro de RMN de 1H do extrato K-1600 FC (500 MHz, CDCl3) .......... 59

Figura 22. Reação de metilação das substâncias 12 e 13. ...................................... 60

Figura 23. Reação de acetilação da substância 12. ................................................. 61

Figura 24. Reação de hidrogenação catalítica das substâncias 8 e 12. ................... 62

Figura 25. Diagrama ilustrativo da bioautografia dos extratos brutos. ...................... 63

Figura 26. Diagrama ilustrativo da bioautografia das substâncias puras. ................. 64

Figura 27. Gráfico de scores de (PC1 v PC2) com base nos dados de ESIMS dos extratos de espécies de Piper (61% de variância). ................................................... 72

Figura 28. Gráfico de loadings com base nos dados de ESIMS dos extratos de espécies de Piper (61% de variância). ...................................................................... 73

Figura 29. Estruturas das substâncias 1 e 2............................................................. 77

Figura 30. Espectro de massas (IE) das substâncias a) 1 e b) 2. ............................ 77

Figura 31. Espectro de RMN de 1H de 1 (200 MHz, CDCl3). .................................... 78

Figura 32. Espectro de RMN de 13C de 1 (50 MHz, CDCl3)...................................... 79

Figura 33. Espectro de RMN de 1H de 2 (500 MHz, Acetona –d6). .......................... 80

Figura 34. Estruturas das substâncias 3, 4 e 5. ........................................................ 82

Figura 35. Estrutura da substância 3. ....................................................................... 82

Figura 36. Espectro de massas de alta resolução (ESI-TOF) da substância 3. ....... 83

Figura 37. Espectro de RMN de 1H de 3 (Acetona-d6, 500 MHz). ........................... 83


Figura 39. Espectro de massas de alta resolução de 4 (ESI-TOF). ......................... 85


Figura 41. Correlações HMBC selecionadas de 4. ................................................... 86


Figura 43. Espectro de massas de alta resolução da substância 5 (ESI-TOF). ....... 87

Figura 44. Espectro de RMN de 1H de 5 (500 MHz, Acetona-d6). ........................... 88


Figura 46. Espectro de massas (IE) das substâncias a) 6 e b) 7. ............................ 90


Figura 48. Espectro de RMN de 1H de 6 (CDCl3, 300 MHz). .................................... 92


Figura 50. Espectro de RMN de 1H de 7 (Acetona-d6, 300 MHz). ........................... 93



Figura 53. Espectro de massas de alta resolução (HR-ESI-TOF) da substância 8. . 96

Figura 54. Espectro de absorção na região do infravermelho de 8 (KBr). ................ 96


Figura 56. Espectro de RMN de 1H de 8 (500 MHz, CDCl3) (ampliação de 7,2 a 3,5 ppm). ......................................................................................................................... 98

Figura 57. Espectro de RMN de 1H de 8 (500 MHz, CDCl3) (ampliação 3,17 a 2,60 e de 2,60 a 2,00 ppm). .............................................................................................. 98

Figura 58. Principais correlações HMBC observadas nos anéis B e C de 8. ........... 99

Figura 59. Espectro de RMN de 13C de 8 (125 MHz, CDCl3).................................. 100

Figura 60. Espectro de RMN de 13C de 8 (125 MHz, CDCl3) (ampliação de 210 a 120 ppm e de 105 a 30 ppm). ........................................................................................ 100

Figura 61. Correlações NOE (----) e HMBC ( ____) observadas no anel A de 8. ...... 101

Figura 62. Mapa de contorno HMBC de 8 (ampliação nas regiões de 13,5 a 3,0

ppm em F2 e de 80,0 a 220,0 ppm em F1). ......................................................... 101

Figura 63. Mapa de contorno do experimento 2D NOESY de 8 (ampliação na região de 7,5 a 3,5 ppm em F1 e F2). ................................................................................ 102

Figura 64. Estrutura da substância 8. ..................................................................... 102


Figura 66. Espectro de massas de alta resolução de 9 (ESI-TOF). ....................... 104

Figura 67. Espectro de absorção na região do Infravermelhor de 9 (KBr). ............ 104

Figura 68. Espectro de RMN de 1H de 9 (DMSO-d6, 500 MHz). ............................ 105

Figura 69. Ampliação do espectro de RMN de 1H de 9 de 6,5 a 1,5 ppm (DMSO-d6, 500 MHz). ................................................................................................................ 106

Figura 70. Ampliação do espectro de RMN de 1H de 9 de 3,2 a 1,5 ppm (DMSO-d6, 500 MHz). ................................................................................................................ 106

Figura 71. Espectro de RMN de 13C de 9 (DMSO-d6, 125 MHz)............................ 107

Figura 72. Principais correlações NOE (----) e HMBC (____) observadas para 9. .... 108

Figura 73. Mapa de contorno HSQC de 9 (DMSO-d6, 500 MHz). .......................... 108

Figura 74. Mapa de contorno HMBC de 9 (DMSO-d6, 500 MHz) ........................... 109

Figura 75. Mapa de contorno COSY de 9 (DMSO-d6, 500 MHz). .......................... 109


Figura 77. Estrutura da substância 8 com estereoquímica definida. ...................... 111

Figura 78. a) Espectro DC calculado para (2S,1’S)-8; b) Espectro DC experimental obtido para 8; c) Espectro DC calculado para (2S,1’R)-8. ....................................... 112

Figura 79. Estrutura da substância 9 com estereoquímica definida. ...................... 113

Figura 80. a) Espectro DC calculado para (2S,1’S,2’S)-9; b) Espectro DC experimental obtido para 9; c) Espectro DC calculado para (2S,1’R,2’R)-9. ........... 113

Figura 81. Estrutura da substância 8a. ................................................................... 114

Figura 82. Espectro de massas de alta resolução de 8a (ESI-TOF). ..................... 114

Figura 83. Espectro de RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) da substância 8a. .............. 115

Figura 84. Ampliação do espectro de RMN de 1H de 8a (500 MHz, CDCl3) na região de 3,1 a 1,7 ppm. .................................................................................................... 116

Figura 85. Espectro de RMN de 13C (125 MHz, CDCl3) da substância 8a. ............ 116

Figura 86. Estruturas das substâncias 10 e 11. ...................................................... 118

Figura 87. Estrutura da substância 10. ................................................................... 118

Figura 88. Espectro de massas de alta resolução (HRESIMS-TOF) de 10. ........... 119

Figura 89. Espectro de RMN de 1H de 10 (CDCl3, 500 MHz). ................................ 120

Figura 90. Espectro de RMN de 13C de 10 (CDCl3, 125 MHz). ............................... 121


Figura 92. Espectro de massas de alta resolução de 11 (ESI-TOF). ..................... 122

Figura 93. Espectro de RMN de 1H de 11 (MeOD, 500 MHz). ............................... 123

Figura 94. Espectro de RMN de 13C de 11 (MeOD, 125 MHz) ............................... 123

Figura 95. Estruturas das substâncias 12 e 13. ...................................................... 125


Figura 97. Espectro de massas de alta resolução (HRESIMS-TOF) de 12. ........... 126

Figura 98. Espectro de absorção na região do infravermelho de 12. ..................... 126

Figura 99. Espectro de RMN de 1H de 12 (500 MHz, MeOD). ............................... 128

Figura 100. Espectro de RMN de 1H de 12 (500 MHz, MeOD), ampliação de 5,38 a 5,05 ppm e de 1,76 a 1,53 ppm. .............................................................................. 128

Figura 101. Espectro de RMN de 13C de 12 (125 MHz, MeOD). ............................ 129

Figura 102. Espectro de RMN de 13C de 12 (125 MHz, MeOD), ampliação de 42 a 15 ppm e de 175 a 113 ppm.................................................................................... 130

Figura 103. Mapa de contorno de HSQC de 12 (125 MHz, MeOD), ampliação 8,0 a 1,2 ppm em F1 e de 160,0 a 0,0 ppm em F2. ......................................................... 130

Figura 104. Correlações HMBC selecionadas para a substância 12. ..................... 131

Figura 105. Ampliação do mapa de contorno HMBC de 12 (de 4,85 a 7,70 ppm em

F1 e de 10,0 a 190,0 ppm em F2) ........................................................................ 132


F1 e de 10,0 a 180,0 ppm em F2). ....................................................................... 132

Figura 107. Mapa de contorno 1H-1H COSY de 12 (500 MHz, MeOD). ................. 133

Figura 108. Correlações NOE observadas para 12. ............................................... 134

Figura 109. Mapa de contorno 1H-1H NOESY de 12 (500 MHz, MeOD). .............. 134

Figura 110. Estrutura da substância 13. ................................................................. 135

Figura 111. Espectro de massas de alta resolução (HRESIMS-TOF) de 13. ......... 135

Figura 112. Espectro de RMN de 1H de 13 (500 MHz, CDCl3). .............................. 136

Figura 113. Espectro de RMN de 13C de 13 (125 MHz, CDCl3). ............................. 137

Figura 114. Espectro de RMN de 13C de 13 (125 MHz, CDCl3) (Ampliação).......... 137

Figura 115. Correlações NOE observadas para 13. ............................................... 138

Figura 116. Mapa de contorno 1H-1H COSY de 13 (500 MHz, MeOD). .................. 139

Figura 117. Mapa de contorno 1H-1H NOESY de 13 (500 MHz, MeOD). ............... 139

Figura 118. Estruturas das substâncias 12a, 12b, 12c e 13a. ............................... 141

Figura 119. Espectro de massas de alta resolução (ESI+) de a) 12a; b) 12b; c) 12c. ................................................................................................................................ 142

Figura 120. Estrutura do derivado 12a. .................................................................. 142

Figura 121. Espectro de RMN de 1H de 12a (500 MHz, CDCl3). ............................ 143

Figura 122. Espectro de RMN de 1H de 12a (500 MHz, CDCl3) ampliação de 4,2 a 1,4 ppm. .................................................................................................................. 143

Figura 123. Espectro de RMN de 13C de 12a (125 MHz, CDCl3) ampliação de 171 a 108 ppm e de 62 a 9 ppm. ...................................................................................... 144

Figura 124. Estrutura do derivado 12b. .................................................................. 146

Figura 125. Espectro de RMN de 1H de 12b (MeOD, 300 MHz). ........................... 146

Figura 126. Espectro de RMN de 13C de 12b (MeOD, 75 MHz). ............................ 147

Figura 127. Estrutura do derivado 12c. .................................................................. 149

Figura 128. Espectro de RMN de 1H de 12c (MeOD, 400 MHz) ............................ 149

Figura 129. Espectro de RMN de 13C de 12c (125 MHz, MeOD). .......................... 150

Figura 130. Espectro de RMN de 13C/DEPT 135º de 12c (125 MHz, MeOD). ....... 151

Figura 131. Estrutura do derivado 13a. .................................................................. 152

Figura 132. Espectro de RMN de 1H de 13a (CDCl3, 500 MHz) ............................. 152

Figura 133. Espectro de RMN de 13C de 13a (CDCl3, 125 MHz) ............................ 153

Figura 134. Placas de CCDA reveladas com UV (=254 nm), esporos de C. cladosporioides e C. sphaerospermum. .................................................................. 157

Figura 135. Estrutura da substância protoapigenona. ............................................ 158

Figura 136. Substâncias submetidas ao ensaio de atividade antitumoral (5, 6 e 8) e controles positivos (Gleevec e vincristina) .............................................................. 159

Figura 137. Substâncias submetidas ao ensaio de atividade antitumoral (8, 8a e 9) ................................................................................................................................ 160

Figura 138. Gráfico de scores (PC1 v PC2) (61% de variância) com base nos dados de ESIMS, por injeção direta, dos extratos de espécies de Piper. .......................... 164

Figura 139. Gráfico de loadings (61% de variância) com base nos dados de ESIMS, por injeção direta, dos extratos de espécies de Piper. ............................................ 164

Figura 140. Cromatogramas CLAE-UV de alguns extratos. ................................... 166

Figura 141. Gráfico de scores (PC1 v PC2) (82% de variância) com base nos dados de CLAE-EM, dos extratos de espécies de Piper. ................................................... 167

Figura 142. Gráfico de loadings (82% de variância) com base nos dados de CLAE-EM dos extratos de espécies de Piper. ................................................................... 168

Figura 143. Gráfico de HCA para análise de CLAE-EM. ........................................ 169

Figura 144. Gráfico de scores (PC1 v PC2) (66% de variância) com base nos dados de RMN de 1H (CDCl3), dos extratos de espécies de Piper. ................................... 171

Figura 145. Gráfico de loadings (82% de variância) com base nos dados de RMN de 1H (CDCl3) dos extratos de espécies de Piper. ....................................................... 171

Figura 146. Gráfico de scores (PC1 v PC2) (71% de variância) com base nos dados de RMN de 1H (CDCl3), dos extratos de espécies de Piper. ................................... 172

Figura 147. Gráfico de loadings (PC1 v PC2) (71% de variância) com base nos dados de RMN de 1H (CDCl3), dos extratos de espécies de Piper.......................... 173

Figura 148. Gráfico de HCA para análise de RMN de 1H da fase orgânica. ........... 174

Figura 149. Gráfico de scores (PC1 v PC2) (55% de variância) com base nos dados de RMN de 1H (D2O) dos extratos de espécies de Piper. ....................................... 175

Figura 150. Gráfico de loadings (PC1 v PC2) (55% de variância) com base nos dados de RMN de 1H (D2O) dos extratos de espécies de Piper. ............................. 175

Figura 151. Gráfico de HCA para análise de RMN de 1H da fase hidroalcoólica. .. 176

Figura 152. Biossíntese de meroterpenos e flavonóides em espécies de Piper..... 179

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Derivados de ácidos benzoicos de espécies de Piper (continua). ............ 29

Tabela 2. Protoflavonoides de ocorrência natural (continua). ................................... 36

Tabela 3. Gradiente de eluição realizado na CLAE. ................................................. 47

Tabela 4. Local de coleta das espécies estudadas. .................................................. 49

Tabela 5. Extratos preparados para estudo fitoquímico. ........................................... 50

Tabela 6. Linhagens de células leucêmicas testadas. .............................................. 64

Tabela 7. Espécies de Piper analisadas por ESI-EM – infusão direta. ..................... 66

Tabela 8. Espécies de Piper analisadas por CLAE-EM e RMN de 1H. ..................... 67

Tabela 9. Espécies de Piper analisadas por ESI-EM- Infusão direta. ....................... 71

Tabela 10. Substâncias isoladas e identificadas de P. caldense, P. bowiei, P.

permucronatum e P. carniconnectivum (continua). ................................................... 74

Tabela 11. Dados de RMN de 1H e 13C de 1 e RMN de 1H de 2. .............................. 81

Tabela 12. Dados de RMN de 1H e 13C de 3, 4 e 5 (500 e 125 MHz). ...................... 89

Tabela 13. Dados de RMN de 1H e 13C de 6 e 7 (300 e 75 MHz). ............................ 94

Tabela 14. Dados de RMN de 1H e13C de 8 (500 e 125 MHz, DMSO-d6). ............ 103

Tabela 15. Dados de RMN de 1H e13C de 9 (500 e 125 MHz, DMSO-d6). ............ 110

Tabela 16. Dados de RMN de 1H e 13C de 8a (500 e 125 MHz, CDCl3). ................ 117

Tabela 17. Dados de RMN de 1H e 13C de 10 e 11 (500 e 125 MHz). .................... 124

Tabela 18. Dados de RMN de 1H e 13C de 12 e 13 (500 e 125 MHz). .................... 139

Tabela 19. Dados de RMN de 1H e 13C (CDCl3, 500 e 125 MHz) obtidos para a

substância 12a. ....................................................................................................... 145

Tabela 20. Dados de RMN de 1H e 13C (MeOD, 300 e 75 MHz) obtidos para a

substância 12b. ....................................................................................................... 148

Tabela 21. Dados de RMN de 1H e 13C (MeOD, 500 e 125 MHz) de 12c. .............. 151

Tabela 22. Dados de RMN de 1H e 13C (CDCl3, 500 e 125 MHz) obtidos para a

substância 13a. ....................................................................................................... 154

Tabela 23. Atividade antifúngica contra C. cladosporioides e C. sphaerospermum.

................................................................................................................................ 156

Tabela 24. Citotoxidade de 5, 6 e 8 para as linhagens de células leucêmicas K-562 e

NALM-6. .................................................................................................................. 159

Tabela 25. Citotoxidade de 8, 8a e 9 para as doze linhagens de células leucêmicas

avaliadas. ................................................................................................................ 160

Tabela 26. Espécies de Piper analisadas por PCA. ................................................ 162

Tabela 27. Espécies de Piper analisadas por CLAE-EM e RMN de 1H. ................. 165

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

APCI Ionização química à pressão atmosférica

CC Cromatografia em coluna

CL Cromatografia líquida

CLV Cromatografia líquida à vácuo

CCDA Cromatografia em camada delgada analítica

CCDP Cromatografia em camada delgada preparativa

CG-EM Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas

CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência

COSY Correlation Spectroscopy

DC Dicroismo circular

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

EM Espectrometria de massas

EM-ESI Espectrometria de massas com ionização por electrospray

EM-IE Espectrometria de massas com ionização por elétrons

ESI Ionização por electrospray

FDA Food and Drug Administration

HCA Hierarchical cluster analysis (Análise por agrupamento hierárquico)

IE Ionização por elétrons

TDDFT Time-dependent density functional theory

HSQC Heteronuclear Single-Quantum Correlation

HMBC Heteronuclear Multiple-Bond Correlation

IV Infravermelho

J Constante de acoplamento

m/z Relação massa carga

NOESY Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy

PC Principal component (Componente principal)

PCA Principal components analysis (Análise de componentes principais)

RMN de 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

RMN de 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13

TOF Time of flight (Tempo de voo)

tR Tempo de retenção

deslocamento químico em ppm

s simpleto

sl simpleto largo

d dupleto

dd duplo dupleto

ddd duplo duplo dupleto

dddd duplo duplo duplo dupleto

dt duplo tripleto

dl dupleto largo

t tripleto

td triplo dupleto

tsep triplo septupleto

m multipleto

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 22

1.1 FAMÍLIA PIPERACEAE ................................................................................................. 22

1.1.1 Piper caldense .................................................................................................. 23

1.1.2 Piper bowiei ...................................................................................................... 25

1.1.3 Piper permucronatum ....................................................................................... 25

1.1.4 Piper carniconnectivum .................................................................................... 25

1.2 METABÓLITOS SECUNDÁRIOS EM PIPER ....................................................................... 27

1.2.1 Meroterpenos ................................................................................................... 27

1.2.2 Protoflavonoides ............................................................................................... 34

1.3 ANÁLISES METABOLÔMICAS DE PLANTAS ..................................................................... 38

1.3.1 Preparo da amostra .......................................................................................... 38

1.3.2 Aquisição de dados .......................................................................................... 39

1.3.3 Quimiometria .................................................................................................... 41

Análise exploratória .................................................................................................. 41

Padrão de reconhecimento não supervisionado ....................................................... 42

2. OBJETIVOS ................................................................................................................ 44

3. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 45

3.1 ESPECIFICAÇÕES DE MATERIAIS, INSTRUMENTOS E TÉCNICAS UTILIZADAS ..................... 45

3.1.1 Solventes utilizados em cromatografia ............................................................. 45

3.1.2 Cromatografia líquida ....................................................................................... 45

3.1.3 Cromatografia em camada delgada analítica e preparativa .............................. 46

3.1.4 Cromatografia líquida de alta eficiência ............................................................ 46

3.1.5 Espectrometria de Massas ............................................................................... 47

3.1.6 Ressonância Magnética Nuclear ...................................................................... 47

3.1.7 Espectrofotometria de absorção na região do UV-Vis....................................... 47

3.1.8 Espectroscopia na região do Infravermelho ...................................................... 48

3.1.9 Polarímetro ....................................................................................................... 48

3.1.10 Espectropolarímetro ..................................................................................... 48

3.2 MATERIAL VEGETAL ................................................................................................... 48

3.3 EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS ....................................... 49

3.3.1 Preparo dos extratos brutos.............................................................................. 49

3.3.2 Metabólitos de Piper caldense .......................................................................... 50

3.3.3 Metabólitos de Piper bowiei .............................................................................. 52

3.3.4 Metabólitos de Piper permucronatum ............................................................... 53

3.3.5 Metabólitos de P. carniconnectivum (K-1441) ................................................... 55

3.3.6 Metabólitos de P. carniconnectivum (K-1600) ................................................... 58

3.4 OBTENÇÃO DE DERIVADOS ......................................................................................... 59

3.4.1 Reação de metilação ........................................................................................ 60

Preparação do diazometano .................................................................................... 60

Metilação .................................................................................................................. 60

3.4.2 Reação de acetilação ....................................................................................... 61

3.4.3 Hidrogenação catalítica .................................................................................... 61

3.5 ENSAIOS DE ATIVIDADE BIOLÓGICA .............................................................................. 62

3.5.1 Atividade antifúngica ........................................................................................ 62

3.5.2 Atividade antitumoral ........................................................................................ 64

3.6 ANÁLISE DE COMPONENTES PRINCIPAIS (PCA) ........................................................... 65

3.6.1 Preparo dos extratos ........................................................................................ 66

Extratos para injeção direta ...................................................................................... 66

Preparo dos extratos para CLAE-EM e RMN de 1H .................................................. 67

3.6.2 Obtenção de dados .......................................................................................... 68

Análise por ESI-EM (Injeção direta) ......................................................................... 68

Análise por CLAE-EM .............................................................................................. 68

Análise por RMN de 1H ............................................................................................ 69

3.6.3 Processamento dos dados ............................................................................... 70

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES ................................................................................. 71

4.1 ANÁLISE DOS COMPONENTES PRINCIPAIS (PCA) DOS EXTRATOS ................................... 71

4.2 SUBSTÂNCIAS ISOLADAS E IDENTIFICADAS ................................................................... 74

4.3 IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL DO CROMENOS 1 E 2 ....................................................... 77

4.4 IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL DAS FLAVONAS 3, 4 E 5 ................................................... 82

Substância 3 ............................................................................................................ 82

Substância 4 ............................................................................................................ 84

Substância 5 ............................................................................................................ 86

4.5 IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL DAS FLAVANONAS 6 E 7 ................................................... 90

Substância 6 ............................................................................................................ 91

Substância 7 ............................................................................................................ 92

4.6 IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL DAS SUBSTÂNCIAS 8, 9 E 8A ............................................ 95

Substância 8 ............................................................................................................ 95

Substância 9 .......................................................................................................... 103

Configuração absoluta de 8 e 9 .............................................................................. 111

Substância 8a ........................................................................................................ 114

4.7 IDENTIFICAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS 10 E 11 ................................................................ 118

Substância 10 ........................................................................................................ 118

Substância 11 ........................................................................................................ 121

4.8 IDENTIFICAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS 12, 13 E DERIVADOS ............................................. 125

Substância 12 ........................................................................................................ 125

Substância 13 ........................................................................................................ 135

Substâncias 12a, 12b e 12c e 13a ......................................................................... 141

4.9 ENSAIOS DE ATIVIDADE BIOLÓGICA ............................................................................ 155

4.9.1 Avaliação da atividade antifúngica contra Cladosporium cladosporioides e Cladosporium sphaerospermum. ............................................................................... 155

4.9.2 Atividade antitumoral ...................................................................................... 158

4.10 ANÁLISES QUIMIOMÉTRICAS .................................................................................. 162

4.10.1 Espectrometria de massas com injeção direta ............................................ 163

4.10.2 Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas 165

4.10.3 Ressonância magnética nuclear da fase orgânica ...................................... 169

4.10.4 Ressonância magnética nuclear da fase hidroalcoólica .............................. 174

4.11 VIAS BIOSSINTÉTICAS ENVOLVIDAS NA FORMAÇÃO DOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS

IDENTIFICADOS ................................................................................................................ 178

5. CONCLUSÕES .......................................................................................................... 180

6. REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 182

APÊNDICE A –ESPECTROS DE MASSAS POR INJEÇÃO DIRETA DOS EXTRATOS ANALISADOS POR PCA .................................................................................................. 189

APÊNDICE B - ESPECTROS DE RMN DE 1H DOS EXTRATOS ANALISADOS POR PCA (FASE ORGÂNICA) .......................................................................................................... 191

APÊNDICE C - ESPECTROS DE RMN DE 1H DOS EXTRATOS ANALISADOS POR PCA (FASE HIDRO ALCOÓLICA) ............................................................................................ 192

SUMULA CURRICULAR ................................................................................................... 193

ANEXO A - CÁLCULOS DE DFT DAS SUBSTÂNCIAS 8 E 9 .......................................... 197

Introdução 22

1. INTRODUÇÃO

1.1 Família Piperaceae

A família Piperaceae, uma das mais primitivas famílias entre as

Angiospermas, pertence à ordem Piperales e é constituída por cinco gêneros, sendo

os mais representativos Piper e Peperomia com cerca de 2000 e 1700 espécies,

respectivamente (Jaramillo; Manos, 2001). As espécies de Peperomia são em sua

maioria de pequeno porte, suculentas e muitas vezes epífitas, enquanto que

espécies de Piper são geralmente arbustos ou pequenas árvores. A maior

diversidade de espécies de Piper encontra-se na região neotropical, com cerca de

dois terços das espécies descritas (Figura 1) (Dyer; Dodson; Richards, 2004;

Jaramillo; Manos, 2001; Quijano-Abril; Callejas-Posada; Miranda-Esquivel, 2006).

Figura 1. Distribuição geográfica das espécies de Piper (Jaramillo; Manos, 2001).

Essa é uma família bastante comum nas formações florestais brasileiras,

particularmente na Mata Atlântica, onde espécies do gênero Piper são pequenos

arbustos ou árvores sub-lenhosas, comuns no sub-bosque, sendo facilmente

reconhecidos mesmo em estado vegetativo pela presença de caules articulados com

nós foliares geniculados e folhas simples e alternadas. As inflorescências são

Introdução 23

particularmente distintas contendo de dezenas a milhares de minúsculas flores em

frutos verticais ou pendentes (Dyer; Dodson; Richards, 2004; Souza, 2005).

Poucas espécies possuem importância econômica, com exceção de Piper

nigrum, que é a fonte da pimenta do reino, uma das pimentas mais utilizadas no

mundo e das raízes de P. methysticum, fonte de Kava ou chá de cava-cava, que são

utilizadas como ansiolítico (Dyer; Dodson; Richards, 2004).

Estudos fitoquímicos de espécies do gênero Piper, realizados com cerca de

15 % das espécies, levaram à descoberta de muitos metabólitos secundários,

principalmente alcalóides, amidas, lignanas, neolignanas, terpenos, derivados de

ácidos benzoicos e flavonóides, com um alto potencial de bioatividade (Dyer;

Dodson; Richards, 2004; Parmar et al., 1997; Scott et al., 2008; Sengupta; Ray,

1987).

Espécies de Piper presentes nas regiões tropicais e subtropicais têm sido

amplamente investigadas devido às inúmeras substâncias biologicamente ativas

nelas presentes, o que justifica seu amplo uso na medicina popular como remédios

para dores no estômago, agentes anti-inflamatórios, antipiréticos, contra asma, e até

como repelentes de insetos (Leite et al., 2012; Parmar et al., 1997).

1.1.1 Piper caldense

A espécie Piper caldense C.DC. (Figura 3) conhecida como “pimenta d’agua”

é utilizada na Paraíba como sedativo, antídoto para picadas de cobras e para

tratamento de dores de dente (Cardozo-Junior; Chaves, 2003). Esta é uma espécie

endêmica do Brasil, com ocorrência no nordeste, centro-oeste, sudeste e região sul,

sendo encontrada principalmente na Mata Atlântica (Guimarães et al., 2012).

Introdução 24

Estudos realizados com as raízes de Piper caldense levaram ao isolamento da

aristolactama caldensina (Figura 2) (Cardozo-Junior; Chaves, 2003).

Figura 2. Estrutura da aristolactama caldensina.

Figura 3. Imagens da planta P. caldense.

N

O

H3CO

H3CO

Introdução 25

1.1.2 Piper bowiei

Piper bowiei Yunck., uma espécie endêmica do Brasil é encontrada na Mata

Atlântica nas regiões de São Paulo, Rio de Janeiro e Espirito Santo (Guimarães et

al., 2012). Não há relatos na literatura sobre o estudo químico desta planta.

1.1.3 Piper permucronatum

Piper permucronatum Yunck. é encontrada predominantemente nos estados

de São Paulo e Rio de Janeiro (Guimarães et al., 2012). Não há relatos de estudos

fitoquímicos na literatura, sendo somente relatado o estudo da composição de seu

óleo essencial, que é constituído predominantemente pelos arilpropanoides

miristicina (25,6%), dilapiol (54,7%), asaricina (8,6%) e elemicina (9,9%) (De Morais

et al., 2007).

1.1.4 Piper carniconnectivum

Piper carniconnectivum C. DC. (Figura 4) é uma espécie encontrada na região

norte do Brasil, principalmente na região Amazônica (Guimarães et al., 2012).

Estudos realizados com as raízes desta planta levaram ao isolamento e identificação

de quatro flavonoides C-metilados (1-4), uma cumarina (5) e três derivados

ciclopentenodiônicos (6-7) (Figura 5) (Facundo; Braz, 2004; Facundo et al., 2004).

Introdução 26

Figura 4. Imagem da planta P. carniconnectivum.

O

R2

MeO

R1

OH O

OMeMeO

OH O

(1) R1= Me; R

2= H

(2) R1= H; R

2= Me

(3) R1= R

2= Me

(4)

O

R1

R2

O

O

OH O

OR2

R1

OO O

(6) R1= Me; R

2= H

(7) R1= H; R

2= Me

(8) R1= Me; R

2= H

(8a) R1= H; R

2= Me

(5)

Figura 5. Metabólitos isolados das raízes de Piper carniconnectivum.

Introdução 27

1.2 Metabólitos secundários em Piper

As espécies de Piper são conhecidas por apresentarem uma grande

variedade de metabólitos secundários bioativos, como alcaloides, amidas,

flavonoides, lignanas, neolignanas, terpenos e meroterpenos, como cromenos e

derivados de ácidos benzoicos prenilados, os quais têm apresentado diversas

atividades biológicas como antifúngica, antioxidante, bactericida, tripanossomicida,

inseticida e citotóxica (Batista et al., 2008; Flores et al., 2008; Flores et al., 2009;

Kato; Furlan, 2007; Parmar et al., 1997; Yamaguchi et al., 2006).

Dentre as substâncias bioativas obtidas a partir de espécies de Piper, é

possível destacar a grandisina, uma lignana tetraidrofurânica de P. solmsianum, que

apresentou atividade tripanossomicida in vitro contra T. cruzi (Martins et al., 2003) e

atividade larvicida contra Aedes aegypti (Cabral et al., 2009), e as amidas de P.

tuberculatum que apresentaram atividade inseticida contra lagarta da soja e contra a

broca da cana-de-açúcar (Navickiene et al., 2007) e mais recentemente, atividade

moluscicida (Rapado et al., 2011) e schistossomicida (Moraes et al., 2011).

1.2.1 Meroterpenos

Produtos naturais provenientes de via biossintética mista e que são

parcialmente derivados da via dos terpenoides são denominados meroterpenos.

Uma grande quantidade de meroterpenos é descrita na literatura, como

fenilpropanoides, alcaloides e flavonoides contendo cadeia lateral isoprênica (Geris

e Simpson, 2009).

Diversos meroterpenos tem sido identificados nas plantas da família

Piperaceae, principalmente os derivados de ácido benzoico, os quais têm

Introdução 28

apresentado inúmeras atividades biológicas demonstrando o potencial desta classe

de substâncias. Dentre estes compostos destacam-se os antifúngicos (1, 3, 5, 6, 11-

16, 19, 25 e 31) (Lago et al., 2004), antioxidantes (29-31) (Yamaguchi et al., 2006),

bactericidas (1, 27, 36, 44-47, 50, 53 e 54) (Rüegg et al., 2006), leishmanicidas (1-4,

17, 25, 26, 38-44, 46, 48 e 50) (Cabanillas et al., 2012; Flores et al., 2009) e os

tripanossomicidas (2, 4 e 31) (Flores et al., 2008) (Tabela 1).

Introdução 29

Tabela 1. Derivados de ácidos benzoicos de espécies de Piper (continua).

Substância Planta Atividade Referência

(1) P. aduncum; P. hostmannianum; P.

glabratum

Antifúngica; Bactericida;

Leishmanicida

(Lago et al., 2009; Lago et al., 2004; Orjala, J. et al.,

1993)

(2) P. glabratum; Leishmanicida; tripanossomici-

da; (Flores et al., 2008)

(3) P. aduncum; P. dilatatum; P.

hostmannianum; P. glabratum;

Antifúngica; Leishmanicida;

(Diaz; Arias; Joseph-Nathan,

1987; Lago et al., 2009; Orjala,

Jimmy et al., 1993; Terreaux;

Hostettmann; Kurt, 1998) (Flores et al., 2008; Lago et al.,

2004)

(4) P. glabratum; Leishmanicida; tripanossomici-

da; (Flores et al., 2008)

(5) P. aduncum; Antifúngica; (Lago et al., 2009)

(6) P. gaudichaudianum; Antifúngica; (Lago et al., 2004)

(7) P. dilatatum;

(Terreaux; Hostettmann; Kurt,

1998)

(8) P. taboganum; P.

dilatatum;

(Roussis; Ampofo; Wiemer, 1990;

Terreaux; Hostettmann; Kurt,

1998)

(9) P. lanceaefolium; (Lopez; Ming; Towers, 2002)


COOCH3

OH

R1

1 R1=H

2 R1=OH

COOCH3

OH

R1

R2

3 R1=H R2=OH

4 R1=R2=OH

5 R1=H R2=OOH

OH

COOCH3

O

COOR1

OH

R2

O

7 R1=R2=H

8 R1=CH3 R2=H

9 R1=H R2=OH

10 R1=CH3 R2=OH

Introdução 30

Tabela 1. Derivados de ácidos benzoicos de espécies de Piper (continuação).

(11) P. aduncum; Antifúngica; (Lago et al., 2004)

(12) P. hostmannianum; Antifúngica; (Lago et al., 2004)

(13) P. hostmannianum; Antifúngica; (Lago et al., 2009)

(14) P. aduncum; Antifúngica;

(Baldoqui et al., 1999; Lago et al.,

2004)

(15) P. taboganum; P. aduncum; P.

hostmannianum; P. dilatatum;

Antifúngica;

(Baldoqui et al., 1999; Diaz; Arias; Joseph-Nathan,

1987; Lago et al., 2004; Orjala,

Jimmy et al., 1993; Roussis; Ampofo;

Wiemer, 1990; Terreaux;

Hostettmann; Kurt, 1998)

(16) P. aduncum; Antifúngica;

(Baldoqui et al., 1999; Lago et al.,

2004; Orjala, Jimmy et al., 1993)

(17) P. aduncum; P. dennisii;

Leishmanicida;

(Cabanillas et al., 2012; Orjala,

Jimmy et al., 1993)

(18) P. aduncum; (Baldoqui et al.,

1999)

(19) P. gaudichaudianum;

Antifúngica; (Lago et al., 2004)

(20) P. hostmannianum;

(Diaz; Arias; Joseph-Nathan,

1987)

(21) P. dilatatum;

(Terreaux; Hostettmann; Kurt,

1998)

O

COOCH3

H3CO

COOR1

OHOH

OH

12 R1=H

13 R1=CH3

O

O

R1O

R2

14 R1=R2=H

15 R1=CH3 R2=H

16 R1=CH3 R2=OH

O

O

R1O

17 R1=H

18 R1=CH3

O

O

OH

O

O

H3COR

1 20 R1=H

21 R1=OH

Introdução 31



(23) P. taboganum; P. gaudichaudianum; P.

dilatatum;

(Lago et al., 2004; Roussis; Ampofo;

Wiemer, 1990; Terreaux;

Hostettmann; Kurt, 1998)


(25) P. aduncum; P. gaudichaudianum;

Leishmanicida; Antifúngica;

(Flores et al., 2009) (Flores et al., 2008; Lago et al., 2004)

(26) P. aduncum; P.

dennisii; Leishmanicida;

(Baldoqui et al., 1999; Cabanillas et al., 2012; Flores et al., 2009) (Lago et

al., 2004)

(27) P. aduncum; Bactericida; (Orjala, J. et al.,

1993)

(28) P. aduncum; (Orjala, Jimmy et

al., 1993)

(29) P. crassinervium; Antioxidante; (Yamaguchi et al.,

2006)

(30) P. crassinervium; Antioxidante; antifúngica;

(Lago et al., 2004; Lopes et al., 2008; Yamaguchi et al.,

2006)

(31) P. crassinervium;

Antioxidante; antifúngica;

tripanossomici-da;

(Lago et al., 2004; Lopes et al., 2008; Yamaguchi et al.,

2006)

O

O

R1O

R2

O

22 R1=H R2=OH

23 R1=CH3

R2=H

24 R1=CH3 R2=OH

COOR1

OR2

25 R1=R2=H

26 R1=H R2=CH

3

27 R1=R2=CH3

OCH3

COOCH3

OH

OH O

COOH

OH O

COOH

OH O

COOH

OH

Introdução 32


(32-35) P. marginatum; (Maxwell;

Rampersad, 1988)

(36) P. multiplinervium; Bactericida; (Rüegg et al.,

2006)

(37) P. arieianum; (Green; Treadwell;

Wiemer, 1999)

(38) P. heterophyllum; P. arieianum;

Leishmanicida; (Flores et al., 2009)

(39) P. heterophyllum; Leishmanicida; (Flores et al., 2009)

(40) P. arieianum;

P. heterophyllum; Leishmanicida;

(Flores et al., 2009; Green; Treadwell;

Wiemer, 1999)




OR2

COOR1

32 R1=R2=H

33 R1= H R2=CH3

34 R1=CH3 R2=H

35 R1=R2=CH3

OH

HOOC

COOH

OH

OH

COOH

OH

R1

38 R1=H

39 R1=OH

COOH

OH

OHCHO

COOH

OH

OHCOOH

R1

41 R1=H

42 R1=OH

COOH

OH

OHCOOH

OH

Introdução 33

Tabela 1. Derivados de ácidos benzoicos de espécies de Piper (conclusão).

(44) P. aduncum; P. acutifolium; P. dennisii;

Bactericida;

Leishmanicida;

(Cabanillas et al., 2012; Flores et al., 2008; Orjala, J. et

al., 1993)

(45) P. aduncum; P. acutifolium;

Bactericida;

(Flores et al., 2008; Orjala, J. et al.,

1993)


Bactericida;

Leishmanicida;

(Cabanillas et al., 2012; Orjala, J. et

al., 1993)

(47) P. aduncum; Bactericida; (Orjala, J. et al.,

1993)

(48) P. acutifolium; Leishmanicida; (Flores et al., 2008)

(49) P. acutifolium; (Flores et al., 2008)


Leishmanicida; bactericida;

(Cabanillas et al., 2012; Flores et al., 2009; Orjala, J. et

al., 1993)



(53-54) P. aduncum; Bactericida; (Orjala, J. et al.,

1993)

COOR1

OR2

44 R1=R2=H

45 R1= H R2=CH3

46 R1=CH3 R2=H

47 R1=R2=CH3

COOH

OR1

OH

48 R1=H

49 R1= CH3

COOH

OH O

COOH

OCH3 OH

COOH

OH OHOH

OR1

O O

53 R1=H

54 R1= CH3

Introdução 34

1.2.2 Protoflavonoides

Flavonoides contendo anel B não aromático são também denominados de

protoflavonoides e representam uma sub-classe de produtos naturais das mais

raras. Os principais relatos de ocorrência desta classe de flavonoides são em

espécies de samambaias das famílias Thelypeteridaceae, Equisetaceae e

Dryopteridaceae (Noro et al., 1969; Wada, Hiroshi et al., 1987; Wei et al., 2011)

pertencentes à divisão das Pteridófitas, com vinte substâncias relatadas,

relacionando a principal ocorrência deste esqueleto em plantas primitivas. Em

Angiospermas, há apenas um relato da ocorrência de quatro substâncias na espécie

Ongokea gore (Olacaceae) (Jerz; Waibel; Achenbach, 2005) (Tabela 2).

Estudos de atividade biológica realizados com protoflavonoides têm relatado

que esta classe de substâncias apresenta um grande potencial citotóxico,

apresentando resultados promissores contra inúmeras linhagens de células

tumorais. Apesar de sua atividade não ser tão potente (~1uM) em comparação aos

fármacos cisplatina, vicristina e taxol (~2 nM), por exemplo, estudos realizados com

a combinação dessas substâncias com as drogas atualmente utilizadas no

tratamento do câncer têm apresentado um aumento no potencial citotóxico (Lin, A.-

S. et al., 2005; Liu et al., 2011; Wei et al., 2011).

Entre os protoflavonoides identificados, a protoapigenona (Figura 6) tem sido

bastante investigada e apresentou inibição do crescimento de células tumorais de

câncer de ovário in vitro e in vivo (MDAH-2774 e SKOV3) sem grandes efeitos

colaterais. Sua administração combinada com o fármaco cisplatina no tratamento de

células MDAH-2774 aumentou significantemente a inibição em relação à

demonstrada por cada uma das substâncias isoladamente (Chang; Su; et al., 2008).

Introdução 35

Figura 6. Estrutura da protoapigenona (55).

A potencial atividade citotóxica demonstrada pela protoapigenona motivou

também a realização de sua síntese total e a avaliação da atividade de seus

análogos, bem como o estudo de sua relação estrutura atividade. Isso permitiu

demonstrar que a presença de duplas ligações simétricas no anel B faz a

protoflavona exibir uma atividade citotóxica maior quando comparada com a

presença de apenas uma dupla ligação. A presença de alguns substituintes, como o

grupo metoxílico na posição C-7 do anel B, demonstrou aumentar a seletividade e

potencializar sua atividade contra diferentes tipos de linhagens de células tumorais

(Figura 7) (Lin; Nakagawa-Goto; et al., 2007).

Figura 7. Efeito dos substituintes na atividade antitumoral das protoflavonas (Lin; Nakagawa-Goto; et al., 2007).

O

O

OH

OOH

OH

O

O

OH

OR1

R2

OCH3>H>OH

anel aromático conjugado

OCH3 ou OH são permitidos

OH>OCH3

CO>OH

duplas simétricas

Introdução 36

Tabela 2. Protoflavonoides de ocorrência natural (continua).

Protoflavonoide Nome Planta Atividade Referência

(55) Protoapigenona

Thelypteris torresiana (Thelypteridaceae);

Phegopteris decursive-pinnata (Thelypteridaceae) Macrothelypteris viridifrons

(Thelypteridaceae);

Antitumoral

(Chang; Su; et al., 2008;

Chang; Wu; et al., 2008; Lin, A. S. et al., 2005; Pouny et al.,

2011; Wei et al., 2011)

(56) Protogenkwanona

Pseudophegopteris hirtirachis

(Thelypteridaceae);

Phegopteris decursive-pinnata (Thelypteridaceae)

(Pouny et al.,

2011; Wada, H. et al., 1987)

(57) Protoapigenina


Macrothelypteris viridifrons

(Thelypteridaceae);

Antitumoral

(Lin, A. S. et al., 2005; Wei et al.,

2012)

(58)


Macrothelypteris viridifrons (Thelypteridaceae);

Equisetum arvense (Equisetaceae);

(Hauteville et al., 1981; Lin, A. S. et al., 2005; Wei

et al., 2012)

(59) Protogenkwanina


(Thelypteridaceae); Equisetum arvense

(Equisetaceae);

(Hauteville et al., 1981; Wada, H.

et al., 1987)

(60-62) Pseudophegopteris

hirtirachis (Thelypteridaceae);

(Wada, H. et al.,

1987)

(63) Protofarrerol Leptorumohra miqueliana

(Dryopteridaceae);

(Akahori et al., 1970;

Fukushima et al., 1969;

Murakami et al., 1987; Noro et

al., 1969)

(64) 2’,3’-di-hidroproto-

genkwanona

Phegopteris connectilis (Thelypteridaceae);

Phegopteris decursive-pinnata

(Thelypteridaceae);

Antitumoral (Adam, 1999; Pouny et al.,

2011)

(65) Macrothelypteris viridifrons

(Thelypteridaceae);

(Wei et al.,

2011)

(66) 2’,3’-di-hidro-2’-hidroxiprotoapi-

genina


Phegopteris decursive-pinnata (Thelypteridaceae)

Antitumoral (Pouny et al.,

2011; Wei et al., 2011)

(67) 5’,6-di-hidro-6’-metoxiprotoapi-

genina



Antitumoral

(Lin, A. S. et al., 2005; Wei et al.,

2012)

O

OOH

OH

R1O

O

55 R1= H

56 R1= Me

O

OOH

OH

R1O

OR2

57 R1=H, R2=H

58 R1=H, R2=Glu

59 R1=Me, R2=H

O

OOH

OH

MeO

H

O

O

OHOH

OR2

OR1

60 R1=Ac, R2=H

61 R1=H, R2=Ac

62 R1=H, R2=H

O

OOH

OH

OH

O

H

O

OOH

OH

R1O

OR2

64 R1=H, R2=H

65 R1=H, R2=OH

66 R1=Me, R2=OH

67 R1=H, R2=OMe

Introdução 37

Tabela 2. Protoflavonoides de ocorrência natural (conclusão).

(68) Di-

hidroprotofarrerol

Leptorumohra miqueliana (Dryopteridaceae);

(Fukushima et

al., 1969)

(69) (2S)-ongokein-4’-ona

Ongokea gore (Olacaceae);

(Jerz; Waibel; Achenbach,

2005)

(70) Tetra-hidro-protogenkwanona


(Thelypteridaceae);

(Wada, H. et al., 1987)


(Thelypteridaceae);

(Wei et al.,

2012)

(72) Tetra-hidro-protogenkwanina


(Thelypteridaceae);

(Wada, H. et al., 1987)


(Thelypteridaceae);

(Wei et al., 2012)

(74) Flavotorresina Thelyptheris torresiana

(Thelypteridaceae);

(Lin; Chang; et al., 2007)

(75) Macrothelypteris

torresiana (Thelypteridaceae);

(Tang et al.,

2010)

(76)(2S)-cis-4’-hidroxi-ongokeina (77) (2S)-trans-4’-hidroxi-ongokeina



2005)

(78) (2S)-4’-4’-dimetoxi-

ongokeina



2005)

O

OOH

OH

OH

O

H

O

OOH

OH

MeO

O

H

O

OOH

OH

MeO

O

O

OOH

OH

R1O

OR2

71 R1= H, R2=H

72 R1= Me, R2=H

73 R1=H, R2=Glu

O

OOH

OH

OH

OH

OH

O

OOH

OH

OH

OHMeO

OMe

O

OOH

OH

MeOH

OH

O

OOH

OH

MeOH

OMe

OMe

Introdução 38

1.3 Análises metabolômicas de plantas

O termo metabolôma compreende o conjunto de todos os metabólitos

primários e secundários presentes em um determinado organismo. A análise

metabolômica de plantas é a chave para a compreensão da complexidade de seu

metabolismo e da ligação entre genótipos e fenótipos (Villas-Bôas et al., 2005).

A obtenção do metabolôma constitui-se num grande desafio, visto que a

quantidade de metabólitos presente em uma única planta pode chegar a 30.000.

Além da grande quantidade de metabólitos, outra limitação está relacionada com a

presença de substâncias com uma grande variedade estrutural, com diferentes

tamanhos, polaridades, estabilidade e reatividade, o que dificulta a realização da

análise de todo o metaboloma utilizando uma única técnica analítica (Verpoorte;

Choi; Kim, 2010).

A análise metabolômica consiste em três partes experimentais distintas:

preparo da amostra, aquisição de dados e tratamento de dados, e os principais

desafios são a padronização e a reprodutibilidade de todas as etapas (Schripsema,

2010).

1.3.1 Preparo da amostra

Inúmeras metodologias referentes ao preparo de amostra para as análises

metabolômicas estão descritas na literatura, no entanto, o ponto mais importante

nesta etapa é obter um método eficaz (Verpoorte; Choi; Kim, 2010).

Após a coleta do material é necessário realizar uma etapa de quenching, que

consiste em realizar mudanças bruscas de temperatura através do congelamento

Introdução 39

em nitrogênio líquido, por exemplo, reduzindo assim o aparecimento de artefatos

resultantes da atividade enzimática.

Para a determinação do método de extração dos metabólitos deve-se

considerar a técnica analítica a ser utilizada na etapa seguinte. Assim, a seleção da

polaridade das substâncias deverá envolver o tipo de solvente extrator, podendo ser

utilizadas misturas de solventes com polaridades distintas. A qualidade do material e

solventes utilizados também é importante para evitar a presença de contaminantes e

inserção de artefatos, além disso, o material a ser extraído pode ser fresco,

liofilizado ou seco. Um aspecto de grande importância é a realização de amostragem

adequada para se obter um suporte estatístico para a análise em questão.

1.3.2 Aquisição de dados

Atualmente nenhum método analítico simples ou combinado é suficiente para

detectar todos os metabólitos em um organismo. Diversas técnicas analíticas vêm

sendo utilizadas nas análises metabolômicas, principalmente cromatografia gasosa

ou líquida acoplada à espectrometria de massas (CG-EM e CLAE-EM), injeção

direta no espectrômetro de massas e ressonância magnética nuclear (RMN)

(Allwood; Goodacre, 2010).

A escolha da melhor técnica deve levar em consideração quais são os

metabólitos de interesse, além das vantagens e desvantagens de cada técnica. A

técnica de CG-EM é aplicada na separação, identificação e quantificação de

diferentes classes de metabólitos, principalmente os voláteis, de baixa polaridade e

termoestáveis. A presença de uma biblioteca para comparação torna possível a

identificação de grande parte dos metabólitos. Para os metabólitos de média

Introdução 40

polaridade muitas vezes é necessário acrescentar uma etapa de derivatização, o

que dificulta a identificação de metabólitos desconhecidos (Villas-Bôas et al., 2005).

Na análise de CLAE-EM podem ser analisados os metabólitos de média e alta

polaridade presentes em matrizes complexas com alta sensibilidade na detecção. O

acoplamento da cromatografia líquida com espectrometria de massas permite a

análise de metabólitos termicamente instáveis e não voláteis. No entanto há

limitações quanto ao uso das fases móveis utilizadas na separação cromatográfica,

fazendo-se necessário o uso de fases móveis e tampões voláteis, quando

necessário. As principais fontes de ionização empregadas são electrospray (ESI) e

ionização química sob pressão atmosférica (APCI). O ESI é utilizado principalmente

para a ionização de compostos polares e o APCI para os de menor polaridade

(Allwood; Goodacre, 2010; Villas-Bôas et al., 2005).

A injeção direta no espectrômetro de massas também pode ser utilizada para

uma identificação rápida dos metabólitos presentes, sendo frequentemente

necessária a realização de fragmentação para a identificação e caracterização

destes. Neste tipo de análise há uma grande interferência da matriz da amostra, pois

não há uma etapa prévia de separação cromatográfica (Villas-Bôas et al., 2005).

O emprego de RMN permite analisar diferentes classes de metabólitos

primários e secundários. Os experimentos de RMN 2D são também utilizados para a

elucidação estrutural dos principais constituintes da mistura. De uma forma geral, a

RMN possibilita obtenção de resultados quantitativos, no entanto, a principal

desvantagem é sua baixa sensibilidade, principalmente quando são analisadas

matrizes complexas, sendo necessária uma quantidade muito maior (cerca de 10 a

50 mg) de material em comparação às técnicas de espectrometria de massas

(menos de 1 mg) (Kim; Choi; Verpoorte, 2010, 2011).

Introdução 41

1.3.3 Quimiometria

A quimiometria constitui-se em uma área dentro da química onde os dados

são processados por métodos estatísticos ou matemáticos com a finalidade de

identificar padrões e expressá-los de uma maneira mais simplificada, evidenciando

as similaridades e diferenças existentes entre eles. Existem diversas técnicas

quimiométricas, como a análise de componentes principais (PCA), análise por

agrupamento hierárquico (HCA), entre outros (Brereton, 2003).

As técnicas quimiométricas podem ser de análise exploratória de dados,

reconhecimento de padrão não supervisionado, reconhecimento de padrão

supervisionado, modelos de regressão, entre outros.

Análise exploratória

A análise exploratória de dados consiste principalmente na técnica de análise

de componentes principais (PCA) e é utilizada no processamento de dados

complexos e com muitas variáveis, como os cromatográficos e espectrais. Busca-se

uma simplificação desses dados para um sistema composto por componentes

principais (PCs), que representam o conjunto total das variáveis presentes e que

descrevam a variância dos mesmos. Nesta análise é possível observar as relações

entre os dados, como as diferenças e similaridades, no entanto, algumas vezes as

variáveis não podem ser correlacionadas, impossibilitando a obtenção de um bom

resultado (Manly, 2008).

No PCA, a matriz original, contendo muitas variáveis, é reduzida através de

uma transformação matemática resultando em dois gráficos, os quais podem ser

interpretados mais facilmente. No gráfico de scores, que possui o mesmo número de

Introdução 42

linhas da matriz original, é apresentado o resultado em função da quantidade de

amostras analisadas onde é possível observar as similaridades e diferenças entre

elas. No gráfico de loadings, que possui o mesmo número de colunas da matriz,

original, apresenta o resultado em função das variáveis presentes na matriz (Figura

8). As PCs descrevem a variância dos dados, em porcentagem, a qual está

diretamente relacionada com a quantidade de dados originais utilizados para a

obtenção dos gráficos (Brereton, 2003; Livingstone, 1995; Wold; Esbensen; Geladi,

1987).

Figura 8. Processamento da matriz por PCA resultando nos gráficos de scores e loadings.

Padrão de reconhecimento não supervisionado

O padrão de reconhecimento não supervisionado consiste principalmente na

análise de agrupamentos hierárquicos (HCA) e é utilizado com a finalidade de

evidenciar as similaridades entre padrões de dados.

A base da HCA é a realização dos cálculos das distâncias entre objetos em

um espaço multidimensional. Essas distâncias são usadas para a construção de um

diagrama, conhecido também como dendrograma, o qual permite a identificação de

MATRIZ DE DADOS

SCORES LOADINGS

PCA

11

P(Amostras)

N (Variáveis)

11

P(Amostras)

PC (scores) 11

N(Variáveis)

PC (loadings)

Introdução 43

grupos de similaridades entre as amostras (Figura 9) (Brereton, 2003; Livingstone,

1995).

Figura 9. Processamento da matriz por HCA resultando no dendrograma.

No HCA as distâncias pequenas indicam uma maior similaridade entre as

amostras, e distâncias maiores indicam que estas são distintas entre si. Várias

metodologias podem ser empregadas nos cálculos das distâncias, sendo as

principais: ligação simples (vizinho mais próximo), ligação completa (vizinho mais

distância) e método de Ward (Brereton, 2003).

MATRIZ DE DADOS

HCA

11

P(Amostras)

N (Variáveis)

A B E C D

Objetivos 44

2. OBJETIVOS

O objetivo geral deste trabalho foi utilizar técnicas metabolômicas para a

análise de um conjunto de espécies vegetais com o propósito de realizar um estudo

fitoquímico. Os extratos de Piper bowiei, P. caldense, P. carniconnectivum e P.

permucronatum, espécies com frutos pendentes, foram analisados por técnicas

espectrométricas (ESI), cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à

espectrometria de massas de alta resolução e Ressonância Magnética Nuclear, e os

dados obtidos foram submetidos à análise quimiometria (PCA e HCA).

O trabalho também teve como objetivo a caracterização dos agrupamentos

observados no PCA através do isolamento e elucidação estrutural dos principais

constituintes através de técnicas cromatográficas e espectroscópicas. Finalmente,

os produtos naturais isolados foram analisados quanto às atividades biológicas em

função de suas características estruturais para as quais relatos haviam sido

descritos.

Materiais e Métodos 45

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Especificações de materiais, instrumentos e técnicas utilizadas

3.1.1 Solventes utilizados em cromatografia

Os solventes utilizados nos procedimentos de extrações e eluições de

colunas cromatográficas foram devidamente destilados e tratados pela Central de

Solventes do Instituto de Química da USP. Nas análises de CLAE e CG foram

utilizados solventes de grau cromatográfico (Merck, Tedia e J.T. Baker), e água

deionizada (18m, Milli-Q, Millipore), todos filtrados e posteriormente

desgaseificados.

3.1.2 Cromatografia líquida

As separações por cromatografia líquida (CL) foram realizadas utilizando uma

coluna de vidro em diferentes dimensões. As separações por cromatografia líquida a

vácuo (CLV) foram realizadas sob vácuo utilizando-se um funil de placa sinterizada

acoplado a um kitassato.

As fases estacionárias utilizadas foram sílica Gel 60 de 0,070 – 0,200 nm

(sílica comum) e 0,035-0,060 nm (sílica flash) (Acrós Organics ou Merck), C-18

preparativo (125 Å, 22-105 m) (Waters) e Sephadex LH-20 (GE Healthcare).


3.1.3 Cromatografia em camada delgada analítica e preparativa

As cromatografias em camada delgada analítica (CCDA) foram realizadas em

placas de alumínio revestidas com Sílica gel 60 F254 0,2 mm (Merck).

As cromatografias em camada delgada preparativa (CCDP) foram realizadas

em placas de vidro de 20 x 20 cm revestidas com sílica gel 60 PF254 (Merck) com 1,0

mm de espessura.

Os reveladores utilizados foram lâmpada de ultravioleta em câmara escura

nos comprimentos de onda 254 e 365 nm e aspersão de solução de vanilina

sulfúrica (5,1 g de vanilina, 50 mL de ácido sulfúrico concentrado e 800 mL de

etanol) seguida de aquecimento.

3.1.4 Cromatografia líquida de alta eficiência

As análises por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foram

realizadas em um sistema de cromatografia acoplado a um detector na região do

UV-Vis com arranjo de diodos (Sistema CLAE-DAD). Foi utilizado um cromatógrafo

líquido Shimadzu modelo CMB-20A, equipado com um detector UV-DAD modelo

SPD-20A, duas bombas modelo LC-20AD, forno de coluna CTO-20A e um injetor

automático modelo SIL-20AC, controlados pelo software LC solutions (Shimadzu).

Foi utilizada coluna de fase reversa C-18 da marca Phenomenex (Luna C-18

(2) 250 x 4,6 mm – 5) acoplada a uma pré-coluna de material equivalente.

O gradiente de eluição utilizado nas separações por CLAE foi constituído

pelos eluentes A: H2O - 0,1% ácido fórmico e B: ACN - 0,1% ácido fórmico (Tabela

3).


Tabela 3. Gradiente de eluição realizado na CLAE.

Tempo (min) %B

0.01 20

2.00 20

25.00 100

30.00 100

32.00 20

35.00 20

3.1.5 Espectrometria de Massas

As análises por espectrometria de massas (ESI) foram realizadas nos

equipamentos ESQUIRE 3000 plus, MicrOTOF e MicrOTOF-Q (Bruker Daltonics)

para identificação das amostras por injeção direta ou por CLAE acoplada à

espectrometria de massas.

As análises por espectrometria de massas com ionização por impacto de

elétrons foram realizadas cromatógrafo Shimadzu modelo GCMS-QP5050

3.1.6 Ressonância Magnética Nuclear

As análises de RMN foram realizadas nos espectrômetros Bruker DPX 300

(300 MHz), Bruker DRX 500 (500 MHz), Varian Inova 300 (300 MHz) e Varian

Gemini 200 (200 MHz). As amostras foram solubilizadas em solventes deuterados

(CDCl3, CD3OD, Acetona-d6, D2O e DMSO-d6, Aldrich).

3.1.7 Espectrofotometria de absorção na região do UV-Vis

As análises de espectrofotometria de absorção na região do ultravioleta-

visível foram realizadas em um espectrofotômetro Shimadzu modelo UV-1650 PC,

utilizando-se cubetas de quartzo com 10 mm de caminho óptico.


3.1.8 Espectroscopia na região do Infravermelho

As análises por espectroscopia na região do infravermelho foram realizadas

no espectrômetro BOMEM-MB100. As amostras sólidas foram analisadas em KBr

(proporção 1 mg amostra: 100 mg KBr) e as líquidas viscosas em filme com cerca de

0,01 mm de espessura.

3.1.9 Polarímetro

O ângulo de desvio de luz plano polarizada []D foi medido em um polarímetro

da marca Perkin-Elmer, modelo 343, equipado com uma lâmpada de sódio e

utilizando uma célula de quartzo de 100 mm de caminho óptico.

3.1.10 Espectropolarímetro

As curvas de dicroísmo circular foram obtidas em um espectropolarímetro

Jasco, modelo J-720 e utilizando uma célula de quartzo de 1 mm de caminho óptico.

3.2 Material Vegetal

As espécies: Piper bowiei, Piper caldense, Piper carniconnectivum e Piper

permucronatum foram selecionadas para estudo considerando o fato terem sido

pouco estudadas e por terem em comum a presença de frutos pêndulos e globosos.

Os espécimes estudados foram coletados com a autorização para atividades com

finalidade científica número 15780-3 (ICMBio e Sisbio) e vêm sendo mantidos na

estufa para plantas do Laboratório de Química de Produtos Naturais no Instituto de

Química da USP. As espécies foram identificadas pela Profa. Dra. Elsie Franklin


Guimarães no Instituto de Pesquisas do Jardim Botânico do Rio de Janeiro (Tabela

4)

Tabela 4. Local de coleta das espécies estudadas.

Espécie Código Local de coleta

P. bowiei K-364 São Paulo – SP

P. caldense K-484 Ubatuba – SP


P. caldense K-951 Santa Tereza – ES


P. permucronatum K-310 São Paulo – SP

P. permucronatum K-1022 Cubatão – SP

P. permucronatum K-1210 Ubatuba - SP

P. permucronatum K-1220 Ubatuba - SP

P. carniconnectivum K-976 Carajás – PA



P. carniconnectivum K-1441 Belterra – PA

P. carniconnectivum K-1600 Manaus – AM

3.3 Extração e purificação dos metabólitos secundários

3.3.1 Preparo dos extratos brutos

Para o estudo fitoquímico foi selecionada uma planta de cada espécie

coletada. Os diversos órgãos de cada planta (folhas, caule, galhos, frutos e raízes)

foram separados e secos em uma estufa a 50 ºC por 48 horas e moídos em um

moinho de facas.

O material foi extraído com AcOEt ou CHCl3/MeOH por 3 dias a temperatura

ambiente. O solvente foi filtrado e concentrado em um evaporador rotativo (Büchi). O

material restante foi extraído novamente com o mesmo solvente e concentrado junto

com o extrato anterior (Tabela 5). Após a filtração do extrato das folhas de P.


carniconnectivum, este foi submetido a uma extração líquido-líquido com adição de

250 mL de H2O, apenas a fase orgânica CHCl3 foi submetida ao fracionamento.

Tabela 5. Extratos preparados para estudo fitoquímico.

Espécie/código

da planta

Parte da planta

Massa de material seco (g)

Solvente de extração

Código Massa extrato

P. caldense (K-842) Folhas 10,5 AcOEt K-842 FA 2,6 g

P. bowiei (K-364) Folhas 11,7 AcOEt K-364 FA 1,7 g

P. permucronatum (K-1210) Folhas 50,0 AcOEt K-1210 FA 7,0 g

P. carniconnectivum (K-1441) Folhas 14,0 AcOEt K-1441 FA 3,5 g

P. carniconnectivum (K-1441) Frutos 5,0 AcOEt K-1441 FrA 1,4 g

P. carniconnectivum. (K-1600) Folhas 15,1 CHCl3/MeOH

(1:1) K-1600 FC 1,6 g

3.3.2 Metabólitos de Piper caldense

Através das análises de CLAE (Figura 10) e RMN de 1H (Figura 11) foi

possível verificar a presença de um composto majoritário (tR=19.5 min) no extrato

bruto das folhas de P. caldense (K- 842 FA).

Figura 10. Cromatograma obtido por CLAE-UV-Vis (254 nm) do extrato bruto das folhas de P. caldense (K842-FA).

12


Figura 11. Espectro de RMN de 1H do extrato bruto das folhas de P. caldense (K-842 FA, CDCl3, 500 MHz).

O extrato K-842 FA foi submetido a um fracionamento por CLV utilizando

como fase estacionária sílica comum (h = 10 cm, ø = 10 cm) e eluição gradiente

com os solventes hexano, AcOEt e MeOH. Neste fracionamento foram obtidas doze

frações que foram analisadas por CCDA e posteriormente por CLAE. A substância

majoritária da fração K-842FA 3 foi purificada por CCDP utilizando-se como eluente

hexano: AcOEt (3:2), que levou ao isolamento da flavona 4.

Através da análise de CLAE foi possível detectar o metabólito majoritário do

extrato, na fração K-842FA 6, que foi fracionada por CC utilizando-se eluição

gradiente com os solventes hexano, acetato de etila e metanol, a fase estacionária

utilizada foi Sílica gel 60 comum. Neste fracionamento foram obtidas dez frações e

na fração K-842FA 6.5 foi identificado o ácido caldensínico (12), composto

majoritário do extrato.

.

12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

-0.0

1-0

.00

0.0

10.8

40.8

40.8

50.8

60.8

70.8

80.8

91.2

3

1.2

51.2

81.2

91.3

11.3

31.5

61.5

71.5

91.6

01.6

2

1.6

61.6

81.7

31.7

41.7

91.9

61.9

82.0

02.0

12.0

22.0

4

2.0

52.0

62.0

82.0

92.1

02.1

42.1

52.2

42.2

62.2

82.2

9

3.3

53.3

74.1

45.0

95.1

15.1

25.3

26.8

47.2

67.4

37.4

6


3.3.3 Metabólitos de Piper bowiei

Através das análises de CLAE (Figura 12) e RMN de 1H (Figura 13), foi

possível verificar a presença de um composto majoritário (tR=23.4 min) no extrato

das folhas de P. bowiei K- 364 FA.

Figura 12. Cromatograma obtido por CLAE-UV-Vis (254 nm) do extrato bruto das folhas de P. bowiei (K-364FA).

Figura 13. Espectro de RMN de 1H do extrato bruto das folhas de P. bowiei (K-364 FA, CDCl3, 200 MHz).

ppm (t1)

0.02.55.07.510.0

11.8

8

7.73

7.46

7.45

7.45

7.43

7.42

7.27

6.15

5.68

5.67

5.66

5.63

5.62

5.52

5.50

5.46

5.44

5.35

5.00

4.98

4.85

3.86

3.67

3.51

3.47

3.08

3.02

2.91

2.89

2.34

2.30

2.29

1.80

1.78

1.72

1.48

1.45

1.25

1.21

1.18

0.00

0

1/2

6


O extrato K-364 FA foi submetido a um fracionamento por cromatografia

líquida a vácuo (CLV) utilizando como fase estacionária sílica comum (h = 10 cm, ø

= 10 cm) e eluição gradiente com hexano, AcOEt e MeOH. Neste fracionamento

foram obtidas quatorze frações.

As frações foram analisadas por CCDA e a fração K-364FA 2 foi submetida à

uma CCDP utilizando-se como fase móvel a mistura hexano e AcOEt (9:1), levando

ao isolamento da substância 1, o cromeno 2,2-dimetil-2H-cromeno-6-carboxilato de

metila.

A fração K-364FA 5 foi fracionada por CC utilizando-se como fase

estacionária Sephadex LH-20 e eluição isocrática com MeOH. Foram obtidas dez

frações, sendo que na fração K-364FA 5.7 foi identificada a substância 2, cromeno

8-hidroxi-2,2-dimetil-2H-cromeno-6-carboxilato de metila. Na fração K-364FA 5.5 foi

identificada a substância 6, a flavanona di-hidrowogonina, constituinte majoritário do

extrato.

3.3.4 Metabólitos de Piper permucronatum


possível verificar a presença de dois compostos (tR=14.5 e 16.5 min) no extrato das

folhas de P. permucronatum K- 1022 FA.


Figura 14. Cromatograma obtido por CLAE de K-1022 FA.

Figura 15. Espectro de RMN de 1H do extrato K-1022 FA (500 MHz, CDCl3).

O extrato K-1210FA (2,7 g) foi submetido à cromatografia líquida à vácuo

(CLV) utilizando fase estacionária reversa C-18 (h = 5 cm, ø = 10 cm). O extrato foi

solubilizado em 90 mL de MeOH e à solução foram adicionados 10 mL de água, com

a intenção de precipitar ácidos graxos e clorofila. A mistura foi então submetida à

filtração (4 X 100 mL de MeOH:H2O - 9:1). A solução foi concentrada em um

evaporador rotativo e submetida ao fracionamento cromatográfico por CLV

12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

0.0

00.8

10.8

4

0.8

50.8

60.8

70.8

70.8

80.8

91.2

51.2

91.3

31.3

71.5

81.5

91.6

8

1.7

91.8

41.9

61.9

71.9

92.0

42.1

02.1

22.3

62.7

72.7

72.8

02.8

13.0

63.0

83.0

93.1

23.8

13.9

03.9

15.0

95.1

15.1

25.3

45.3

45.3

65.3

76.0

46.0

56.0

66.0

76.0

86.8

86.8

97.2

67.3

27.3

412.0

0

12.0

2

3

7


utilizando-se como fase estacionária sílica flash (h = 7 cm, ø = 10 cm) e eluição

gradiente com hexano, AcOEt e MeOH. Neste fracionamento foram obtidas quatorze

frações. Na fração K-1210FA-4 foi identificada a substância 7, a flavanona

sakuranetina, que foi purificada por CC (h = 25 cm, ø = 3,5 cm) utilizando-se como

fase estacionária sílica flash e eluição gradiente com os solventes hexano, AcOEt e

MeOH. Na fração K-1210FA-12 foi identificada a substância 3, que foi purificada por

CL utilizando-se como fase estacionária Sephadex LH-20 (h =45 cm, ø = 2,5 cm) e

eluição isocrática com MeOH. Esta substância foi identificada como a flavanona 7-O-

metil-luteolina

3.3.5 Metabólitos de P. carniconnectivum (K-1441)

Através das análises de CLAE (Figura 16) e RMN de 1H (Figura 17) do extrato

K-1441 FA foi possível verificar a presença de um composto majoritário (tR= 11.0

min) no extrato das folhas de P. carniconnectivum K- 1441 FA.

Figura 16. Cromatograma CLAE de K-1441 FA.

O extrato K-1441 FA (3,5 g) foi submetido ao fracionamento cromatográfico

por CLV utilizando-se como fase estacionária sílica Gel 60 Comum (h = 5 cm, ø = 5

9

8


cm) e eluição gradiente com os solventes hexano, AcOEt e metanol. As quatorze

frações obtidas foram analisadas por CCDA, CLAE e RMN, levando à identificação

de duas novas substâncias. Na fração K-1441FA-9 foi identificada a substância 8,

que foi purificada por CL utilizando-se como fase estacionária Sephadex LH-20 (h =

50 cm, ø = 2,5 cm) e eluição isocrática com MeOH. Na fração K-1441FA-12 foi

identificada a substância 9, através do procedimento de recristalização utilizando

MeOH.

Figura 17. Espectro de RMN de 1H de K-1441 FA (500 MHz, CDCl3).

No extrato dos frutos de P. carniconnectivum (K-1441 FrA) observou-se a

predominância de uma substância em tR= 25,5 min, através das análise de CLAE

(Figura 18) e RMN de 1H (Figura 19).

12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm-0

.01

-0.0

00.0

10.8

50.8

81.2

31.2

51.2

81.6

01.6

82.0

42.0

5

2.0

62.0

72.0

82.0

92.1

02.1

12.1

52.1

62.4

72.4

82.5

1

2.5

22.6

42.6

42.6

72.6

82.7

62.7

72.7

82.7

92.7

9

2.8

03.0

63.0

93.1

03.1

23.8

23.8

33.9

03.9

04.4

24.4

3

4.4

54.4

66.0

86.1

06.1

27.0

97.1

07.1

17.1

27.2

611.7

7


Figura 18. Cromatograma CLAE de K-1441 FrA.

Figura 19. Espectro de RMN de 1H de K-1441 FrA (500 MHz, CDCl3).

O extrato K-1441 FrA (3,5 g) foi submetido ao fracionamento cromatográfico


cm) e eluição gradiente com os solventes hexano, AcOEt e metanol. Foram obtidas

treze frações. As frações obtidas foram analisadas por CCDA, CLAE e RMN,

levando à identificação de duas novas substâncias, na fração K-1441FrA-5 foi

identificada a substância 13, que foi purificada por CL utilizando-se como fase

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm

1.2

11.2

51.2

61.2

61.2

8

1.2

91.5

81.5

91.6

71.7

12.0

53.2

53.3

23.8

23.8

93.9

04.1

24.1

34.8

34.9

35.0

35.0

95.1

45.1

65.3

05.6

26.0

9

6.8

66.8

8

7.3

2

7.8

47.9

07.9

2 Current Data ParametersNAME K1441 FrAEXPNO 1PROCNO 1

F2 - Acquisition ParametersDate_ 20121229Time 17.12INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 13C ZPULPROG zgTD 65536SOLVENT CDCl3NS 16DS 0SWH 7002.801 HzFIDRES 0.106854 HzAQ 4.6793203 secRG 90.5DW 71.400 usecDE 6.50 usecTE 298.1 KD1 1.00000000 secTD0 1

======== CHANNEL f1 ========SFO1 500.1330032 MHzNUC1 1HP1 7.64 usecPLW1 13.69999981 W

F2 - Processing parametersSI 131072SF 500.1299827 MHzWDW EMSSB 0LB 0.30 HzGB 0PC 1.00

13


estacionária sílica comum (h = 40 cm, ø = 2,5 cm) no modo gradiente com os

solventes hexano, AcOEt e MeOH.

3.3.6 Metabólitos de P. carniconnectivum (K-1600)


possível verificar a presença de três compostos majoritários (tR= 9,0, 12,0 e 15,0

min) no extrato das folhas de P. carniconnectivum K-1600 FC. Este extrato

apresentou um perfil cromatográfico diferente do obtido para as folhas de P.

carniconnectivum K-1441-FA.

Figura 20. Cromatograma obtido por CLAE de K-1600 FC.

11

10

5


Figura 21. Espectro de RMN de 1H do extrato K-1600 FC (500 MHz, CDCl3)

O extrato K-1600 FC (1,6 g) foi submetido ao fracionamento cromatográfico


cm) e eluição gradiente com hexano, AcOEt e MeOH. Foram obtidas dez frações. Os

compostos majoritários 5, 10 e 11 foram identificados nas frações K-1600FC-6, 4 e

9, respectivamente, e foram purificados por CCDP utilizando-se como eluente

hexano:AcOEt (2:3).

3.4 Obtenção de derivados

A obtenção de derivados dos metabólitos secundários isolados foi realizada

para as substâncias 8, 12 e 13, conforme procedimentos descritos a seguir, com a

finalidade de obter substâncias com variedade estrutural para o estudo de atividade

biológica.

12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

0.0

0

1.2

5

1.6

8

2.0

4

3.8

83.8

93.9

23.9

23.9

7

5.1

2

6.3

46.4

06.4

26.4

96.6

26.8

96.9

17.2

6

12.3

2


3.4.1 Reação de metilação

Preparação do diazometano

A um balão de destilação de 500 mL, equipado com condensador de tubo reto

(sem juntas esmerilhadas), contendo uma solução de 0,1 mol de N-metil-N-nitroso-

para-tolueno-sulfonamida (Diazald®) em 240 ml de éter etílico foi adicionado uma

solução de KOH (0,1 mol) em 7 ml de água destilada e 25 ml de etanol. A seguir,

esta mistura foi aquecida em torno de 35ºC em um banho de água quente a 45ºC e

a solução destilada de diazometano foi coletada em frasco refrigerado.

Metilação

As substâncias 12 e 13 (80 e 72 mg, respectivamente) foram tratadas com

excesso de solução etérea de diazometano e deixadas em repouso por 12 horas à

temperatura ambiente. A formação dos produtos desejados foi verificada por CCDA.

Os produtos de cada uma das reações foram separados por CCDP utilizando-se

como eluente uma mistura de hexano e AcOEt (7:3). Foram obtidos 70 mg de 12a

(rendimento: 88%) e 55 mg de 13a (rendimento: 76%) (Figura 22).

COOH

OCH3

COOH

COOCH3

OCH3

COOCH3

CH2N2

éter

13 13a

Figura 22. Reação de metilação das substâncias 12 e 13.

COOH

OH

OH

COOH

COOCH3

OCH3

H3CO

COOCH3

CH2N2

éter

12 12a


3.4.2 Reação de acetilação

A substância 12 (140 mg, 0,3 mmol), foi dissolvida em excesso de anidrido

acético (1,0 mmol) a qual foram adicionadas Et3N (1,0 mmol) e DMAP (4-N,N-

dimetil-aminopiridina (0,03 mmol) (Figura 23). A mistura reacional foi mantida sob

agitação por 24 horas à temperatura ambiente (Virsu et al., 2001). O produto 12c (70

mg, rendimento: 50%) foi purificado por CCDP utilizando-se como eluente hexano:

AcOEt (2:3).

Figura 23. Reação de acetilação da substância 12.

3.4.3 Hidrogenação catalítica

As substâncias 8 e 12 (30 mg, 100 mg) foram dissolvidas em 3 mL de

metanol, e foram adicionados 2 mg e 5 mg, respectivamente, de catalisador Pd-C

(10%) (Aldrich) (Figura 24). A mistura foi colocada sob agitação em um reator em

atmosfera de hidrogênio à pressão de 4 atm por 3 horas. Os produtos 12c, 8a foram

purificados por CCDP utilizando-se como eluente uma mistura de diclorometano e

metanol (9,5:0,5) para a substância 12c (80 mg, rendimento: 80%), e para a

substância 8a (22 mg, rendimento: 73%) foi utilizada uma mistura de hexano e

AcOEt (2:3).

COOH

OH

OH

COOH

COOH

O

O

COOH

O

O

O

OO

DMAP

Et3N

12 12c


Figura 24. Reação de hidrogenação catalítica das substâncias 8 e 12.

3.5 Ensaios de atividade biológica

3.5.1 Atividade antifúngica

Os ensaios de atividade antifúngica dos extratos brutos e das substâncias

isoladas foram realizados em colaboração com o Instituto de Botânica de São Paulo,

sob a supervisão da Dra. Maria Cláudia Marx Young. As amostras foram ensaiadas

contra os fungos Cladosporium cladosporioides e Cladosporium sphaerospermum.

Ambas as espécies foram selecionadas por produzirem uma grande quantidade de

esporos e apresentarem crescimento uniforme em condições de cultura in vitro.

Uma avaliação qualitativa do potencial fungitóxico foi realizada com os

extratos brutos das espécies em estudo através da metodologia de bioautografia

(Homans; Fuchs, 1970). Este ensaio consiste na observação da ação inibitória de

extratos e substâncias antifúngicas sobre esporos de fungos utilizados para

revelação das placas cromatográficas.

Para a realização dos experimentos com os extratos brutos, as amostras (400

g) foram aplicadas em placas comerciais de sílica PF254 (MERCK) sob suporte de

O

O

OOH

H3CO

H3CO

OHO

O

OOH

H3CO

H3CO

OH

H2, Pd/C

MeOH4 atm/ 4 h

8 8a

COOH

OH

OH

COOH

H2, Pd/C

MeOHCOOH

OH

OH

COOH12

4 atm/ 4 h

12b


alumínio e eluídas com fase móvel adequada para a separação cromatográfica de

cada extrato. Após a evaporação completa do solvente as placas foram aspergidas

com uma solução contendo glicose, sais e os esporos dos fungos reveladores, e em

seguidas incubadas a 25ºC, em câmara escura por 48 horas. Após o tempo de

incubação pôde-se observar o crescimento do fungo na superfície da placa, sendo

que nas regiões onde são encontradas substâncias com atividade antifúngica não há

crescimento do fungo, sendo observados os halos de inibição (Figura 25).

Figura 25. Diagrama ilustrativo da bioautografia dos extratos brutos.

Após a purificação dos metabólitos secundários dos extratos, foram

realizados ensaios para determinação do limite de detecção da atividade, através da

variação da concentração da amostra aplicada na placa. Os resultados foram

comparados com a atividade de substâncias antifúngicas padrão, como a nistatina.

As substâncias puras foram dissolvidas em 10l de MeOH nas quantidades

100, 50, 25, 10, 5 e 1 g e aplicadas em uma placa cromatográfica de alumínio

A B C

solução de glicose,sais e esporos

48 horas25ºC

Câmara escura

A B C A B C

Eluição

Extratos

Incubação


revestida com sílica PF254 (Merck). As placas foram incubadas nas mesmas

condições realizadas com os extratos brutos (Figura 26).

Figura 26. Diagrama ilustrativo da bioautografia das substâncias puras.

3.5.2 Atividade antitumoral

O ensaio de atividade antitumoral foi realizado pelo CIPOI (Centro Integrado

de Pesquisas Oncohematológicas na Infância – Unicamp) através da colaboração

com o farmacêutico Gilberto Carlos Franchi Junior. As amostras foram testadas

contra doze linhagens de células leucêmicas in vitro (Tabela 6).

Tabela 6. Linhagens de células leucêmicas testadas.

Linhagem de célula

K562, HL60, NB4 Leucemia mielóide

P39 Síndrome mielodisplásica (SMD)

NAMALWA, DAUDI, RAMOS Linfoma de Burkitt

JURKAT, MOUT4 Leucemia linfoblástica aguda T

U937 Linfoma histiocítico

NALM6, B15 Leucemia linfoblástica aguda B

Neste ensaio as células neoplásicas foram distribuídas em uma placa com 96

poços (100 μL células/poço contendo meio RPMI 1640 (Sigma R6504)

suplementando com 10% de soro fetal bovino (Gibco 16000-044), 1% de penicilina

Padrão

Substâncias

100 50 25 10 5 1 g

solução de glicose,sais e esporos

48 horas25ºC

Câmara escura

Incubação


(10,000 IU / ml) e 10mg/ml de estreptomicina (15,070 Gibco). A placa contendo as

células foi mantida em estufa umidificada a 97% com temperatura de 37ºC. Após o

tempo de incubação, as substâncias a serem testadas foram dissolvidas em 0,1 %

de DMSO nas concentrações de 100, 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 e 0,00001 g/ml

e adicionadas às placas contendo as células.

Para a contagem das células, todas as etapas do ensaio foram automatizadas

utilizando a estação de manuseamento líquido epMotion® 5070 (Eppendorf,

Vaudaux, Schonenbuch, Switzerland). A placa foi incubada novamente por 48 horas

a 37 oC em estufa umidificada com atmosfera de 5% de CO2.

A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de redução de MTT (Sigma

M2128), utilizando um sal de tetrazólio (1-[4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil-tetrazólio.

A densidade óptica foi medida por espectrofotometria em 570 nm (Bio-Tek Power

Wave XS). O valor de IC50 foi determinado considerando os 50% da atividade em

relação a células de controle. Neste ensaio foi utilizado como controle positivo o

princípio ativo vincristina (Freshney, 1987).

3.6 Análise de Componentes Principais (PCA)

A PCA foi realizada com os dados obtidos a partir dos extratos das plantas

estudadas utilizando-se duas técnicas de espectrometria de massas, sendo uma por

injeção direta e outra por CLAE-EM ambas com ionização por electrospray. Outra

técnica utilizada na obtenção de dados para a PCA foi RMN de 1H.


3.6.1 Preparo dos extratos

Extratos para injeção direta

Aproximadamente 500 mg de material fresco (Tabela 7) foram congelados em

nitrogênio líquido, triturados e homogeneizados em um almofariz. Cerca de 20 mg

do material triturado foram submetidos à extração utilizando 1 mL de solvente

AcOEt, que em seguida foram agitados em um vortex por 30 s. A solução foi

mantida em agitação em um agitador automático (T = 25º C) por 48 horas seguida

da centrifugação à temperatura ambiente por 10 min em uma rotação de 12000 rpm.

O sobrenadante (200 ul) foi separado e seco. O extrato seco foi acondicionado em

freezer à temperatura de -20º C até o momento das análises.

Tabela 7. Espécies de Piper analisadas por ESI-EM – infusão direta. Espécie Parte da planta Código Local de coleta

Piper bowiei Folhas K-364 F São Paulo – SP

P. caldense Folhas K-484 F Ubatuba – SP


P. caldense Galhos K-842 G Ubatuba – SP

P.r caldense Frutos K-842 Fr Ubatuba – SP

P. caldense Sementes K-842 S Ubatuba – SP


P. caldense Galhos K-951 G Santa Tereza – ES

P. caldense Frutos K-951 Fr Santa Tereza – ES

P. caldense Sementes K-951 S Santa Tereza – ES

P. caldense Caule K-951C Santa Tereza – ES

P. caldense Raiz K-951 R Santa Tereza – ES

P. permucronatum Folhas K-310 F São Paulo – SP

P. permucronatum Folhas K-1022 F Cubatão – SP

P. permucronatum Galhos K-1022 G Cubatão – SP

P. carniconnectivum Folhas K-963 F Carajás – PA






Preparo dos extratos para CLAE-EM e RMN de 1H

Os extratos para CLAE-EM (Tabela 8) foram preparados em triplicata

utilizando o mesmo procedimento realizado no preparo para análise por injeção

direta.

Para os extratos de RMN de 1H, aproximadamente 500 mg de material fresco

foram congelados em nitrogênio líquido, triturados e homogeneizados em um

almofariz. Cerca de 50 mg do material triturado foram transferidos para um tubo

eppendorf de 2 mL e submetido à extração utilizando uma mistura de 700 l de

solvente CHCl3, 350 l de CH3OH e 350 l de H2O. A mistura foi agitada em um

vortex por 30 s e mantida em repouso por 20 min à temperatura ambiente, seguida

de nova agitação no vortex por 30 s e centrifugada por 20 min a 12000 rpm.

Foram coletados 400 l da fase hidroalcóolica e 200l da fase CHCl3,

separadamente, e transferidos para um tubo Eppendorf. As soluções foram secas e

acondicionadas à -20ºC até o momento da análise.

Tabela 8. Espécies de Piper analisadas por CLAE-EM e RMN de 1H. Espécie Código Local coleta

P. caldense K1209A Ubatuba-SP

K1209B Ubatuba-SP

K1209C Ubatuba-SP

K1569A Cunha-AM

K1569B Cunha-AM

K1581A Cunha-AM

P. permucronatum K1210A Ubatuba-SP

K1210B Ubatuba-SP

K1210C Ubatuba-SP

K1220A Ubatuba-SP

K1220B Ubatuba-SP

P. carniconnectivum K1441A Belterra-PA

K1441B Belterra-PA

K1441C Belterra-PA

K1600A Cunha-AM

K1600B Cunha-AM


3.6.2 Obtenção de dados

Análise por ESI-EM (Injeção direta)

As amostras secas foram dissolvidas em 1 mL de MeOH e filtradas com filtros

de 0,45 m. A análise por espectrometria de massas foi realizada em um

equipamento Quattro II triploquadrupolo (Micromass, Manchester, U.K.) com

ionização por electrospray (ESI+) no modo positivo, voltagem do capilar 4,5 kV e do

skimmer 70 V, o fluxo do gás nitrogênio de nebulização e de secagem foi de 250 e

30 L/h. O fluxo da fase móvel foi de 50 L/min. As amostras foram analisadas por

infusão direta e os dados processados pelo programa Masslynx (Micromass) versão

3.2.

Os dados dos espectros de massas foram convertidos ao formato ASCII

através do programa Masslynx (Micromass) e exportados para o programa Excel

(Microsoft) onde foi elaborada a matriz de dados. As variáveis selecionadas na

matriz foram os valores de massas na faixa de m/z 100 a 650 Da obtidos para cada

extrato.

Análise por CLAE-EM

As amostras secas foram dissolvidas em 1 mL de MeOH e filtradas com filtros

de 0,45 m. As análises de CLAE-EM foram realizadas no equipamento MicrOTOF-

Q II (Bruker) acoplado à um cromatógrafo líquido de alta eficiência da marca

Shimadzu, composto por uma controladora CBM-20A, duas bombas LC-20AD, um

detector UV-Vis (dois canais) SPD-20A, injetor automático SIL-20AC e forno de

coluna CTO-20A. Foi utilizada coluna de fase reversa C-18 da marca Phenomenex

(Luna C-18 150 x 4,6 mm – 5) acoplada a uma pré-coluna de material equivalente.


Os eluentes utilizados foram A: H2O-0.1% ácido fórmico e B: ACN-0,1% ácido

fórmico. O método cromatográfico utilizado nesta análise foi 0.01-1.00 min – 20%B;

1.00-15.00 min – 20 a 100%; 15.00-18.00 min – 100%; 18.00-20.00 min – 100-20%,

fluxo 0,2 mL.min-1.

Os espectros de massas obtidos foram transformados em netCDF e

transportados para uma matriz em duas dimensões através do algoritmo

disponibilizado na aplicação web XCMS Online (Tautenhahn et al., 2012). As

variáveis selecionadas na matriz foram os valores de massas na faixa de m/z 100 a

1000 Da obtidos para cada extrato em função do tempo de retenção e intensidade

dos picos.

Análise por RMN de 1H

Para cada amostra, o extrato seco correspondente a fase hidroalcoólica

(CH3OH+H2O) foi dissolvido em 600 L de D2O e transferido para um tubo de RMN

de 5 mm e o extrato seco correspondente a fase orgânica (CHCl3) foi dissolvido em

600 L de CDCl3 e transferido para um tubo de RMN de 5 mm. Os experimentos de

RMN de 1H foram realizados no equipamento de RMN de 500 MHz, modelo Avance

III da Bruker Biospin (Alemanha).

Os parâmetros de aquisição dos espectros de RMN de 1H foram os seguintes:

sequência de pulso de 90º (zg), TD= 64K, DS= 4, NS= 64, SW= 12,9836 ppm (ou

6493,506 Hz), AQ= 5,046s, FID res= 0,099083Hz, O1= 3125,81 Hz (ou O1P= 6,250

ppm), d1= 2s. O processamento do espectro foi realizado através da transformada

de Fourier utilizando multiplicação exponencial, SI= 64K e lb=0,3 Hz. O espectro

transformado teve sua fase e linha de base ajustadas, e foi referenciado através do


sinal do TMS em 0,00 ppm, para amostra em CDCl3 e através do sinal do TPS em

0,00 ppm, para amostra em D2O.

Por fim, foi realizada a integração do espectro em faixas de 0,02 ppm (10,00

Hz). Os valores dos deslocamentos químicos médios das faixas integradas e suas

integrais foram transferidos para uma matriz elaborada no programa Excel

(Microsoft).

3.6.3 Processamento dos dados

Esta etapa foi realizada em colaboração com o Msc. Harold H. Fokoue

(LPQN-IQUSP). As matrizes de dados obtidas para cada uma das técnicas analíticas

foram submetidas à análise de componentes principais (PCA) utilizando-se o

software The Unscrambler (versão 9.5, CAMO Process AS, Noruega), no qual foi

realizada a normalização pela média. Os dados foram visualizados (gráficos de

scores e loadings) de acordo com as componentes principais mais representativas.

Para análise de agrupamento hierárquico (HCA) foi utilizado o programa

Statistica (versão 11, StatSoft, EUA). Os cálculos foram realizados utilizando

distância Euclidiana e o método de Ward.

Resultados e Discussões 71

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES

4.1 Análise dos componentes principais (PCA) dos extratos

Com a finalidade de obter uma visão geral das similaridades entre as

espécies de Piper estudadas, os extratos foram preparados e analisados por EM. Os

espectros obtidos foram então submetidos ao PCA.

As quatro espécies analisadas, que possuem frutos pendentes e globosos, P.

caldense, P. bowiei, P. permucronatum e P. carniconnectivum foram coletadas em

diferentes regiões (Tabela 9).

Tabela 9. Espécies de Piper analisadas por ESI-EM- Infusão direta. Espécie Parte da planta Código Local de coleta

P. bowiei Folhas K-364 F São Paulo – SP




P. caldense Frutos K-842 Fr Ubatuba – SP
















Na análise das amostras por PCA (Figura 27) os componentes principais

(PC1 e PC2) representam aproximadamente 61% dos dados. No gráfico scores foi

possível observar a formação de três agrupamentos distintos, de acordo com a


espécie, sendo o grupo principal (I) constituído majoritariamente pelos extratos de P.

caldense, além dos galhos de P. permucronatum (K1022G). No grupo II observou-se

a presença dos extratos de P. carniconnectivum, e no grupo III as amostras de P.

bowiei e P. permucronatum foram agrupadas, mas não foram diferenciadas entre sí.

Figura 27. Gráfico de scores de (PC1 v PC2) com base nos dados de ESIMS dos extratos de espécies de Piper (61% de variância).

No gráfico de loadings (Figura 28) foi possível observar os valores das

variáveis que tiveram uma maior contribuição para a discriminação observada no

gráfico de scores, nesta análise os valores das variáveis são os valores de m/z

obtidos na análise de EM-ESI. Nas amostras de P. carniconnectivum a variável de

m/z 335 Da foi a que apresentou maior influência no agrupamento das amostras

desta espécie, enquanto para P. bowiei e P. permucronatum a maior contribuição foi

da variável m/z 287 Da. No grupo principal, constituído pelas amostras de P.

caldense, observou-se a presença de inúmeras variáveis na faixa de m/z 450 Da.


Figura 28. Gráfico de loadings com base nos dados de ESIMS dos extratos de espécies de Piper (61% de variância).

Com os resultados observados, nesta análise preliminar, iniciou-se o estudo

fitoquímico das espécies de Piper com a finalidade de caracterizar os valores

observados no gráfico de loadings através do isolamento e determinação estrutural

dos principais constituintes químicos.


4.2 Substâncias isoladas e identificadas

O estudo fitoquímico realizado com as espécies Piper caldense, P. bowiei, P.

permucronatum, P. carniconnectivum levou ao isolamento e identificação de 13

substâncias (Tabela 10).

Tabela 10. Substâncias isoladas e identificadas de P. caldense, P. bowiei, P. permucronatum e P. carniconnectivum (continua).

Cromenos

P. bowiei (K-364 Folhas)

(1) 2,2-dimetil-2H-1-benzopiran-6-carboxilato de metila


(2) 8-hidroxi-2,2-dimetil-2H-1-benzopiran-6-carboxilato de metila

Flavonas

P. permucronatum (K-1210 Folhas)

(3) 7-O-metil-luteolina

2-(3’,4’-di-hidroxifenil)-5-hidroxi-7-metoxi-4H-1-benzopiran-4-ona

P. caldense (K-951 Folhas)

(4) velutina

5-hidroxi-2-(4’-hidroxi-3’-metoxifenil)-7-metoxi-4H-1-benzopiran-4-ona

P. carniconnectivum (K-1600 Folhas)

(5) Scrofuleina

5-hidroxi-2-(4’-hidroxifenil)-6,7-dimetoxi-4H-1-benzopiran-4-ona

O

O

O

R

(1) R= H

(2) R= OH

O

O

R4

R3

OH

R1

R2

R1 R2

R3 R4

(3) H OCH3 OH OH

(4) H OCH3 OCH

3 OH

(5) OCH3 OCH

3 H OH


Tabela 10. Substâncias isoladas e identificadas de P. caldense, P. bowiei, P. permucronatum e P. carniconnectivum (continuação).

Flavanonas


(6) di-hidrowogonina

(2S)-2,3-di-hidro-5,7-di-hidroxi-2-fenil-8-metoxi-4H-1-benzopiran-4-ona

P. permucronatum (K-1210 Folhas)

(7) sakuranetina

(2S)-2,3-di-hidro-5-hidroxi-2-(4’-hidroxifenil)-7-metoxi-4H-1-benzopiran-4-ona

Protoflavonoides

P. carniconnectivum (K-1441- Folhas)

(8) (2S,1’R)-2,3-di-hidro-5-hidroxi-2-(1’-hidroxi-4’-oxo-2’-cicloexen-1’-il)-6,7-dimetoxi-4H-1-benzopiran-4-ona

Obtido através da hidrogenação de 8

(8a) (2S)-2,3-di-hidro-5-hidroxi-2-(1’-hidroxi-4’-oxocicloexil)-6,7-dimetoxi-4H-1-benzopiran-4-ona


(9) (2S,1’R)-2,3-di-hidro-5-hidroxi-2-(1’,2’-dihidroxi-4’-oxocicloexil)-6,7-dimetoxi-4H-1-benzopiran-4-ona


(10) 5-hidroxi-2-(1’-hidroxi-4’-oxo-2’,5’-cicloexadien-1’-il)-6,7-dimetoxi-4H-1-benzopiran-4-ona


(11) 5-hidroxi-2-(1’,4’-di-hidroxi-4’-oxo-2’,5’-cicloexadien-1’-il)-6,7-dimetoxi-4H-1-benzopiran-4-ona

O

O

R3

OH

R1

R2

R1 R2 R3

(6) OH OCH3 H

(7) OCH3 H

OH

O

OOH

H3CO

H3CO

OH

O

O

OOH

H3CO

H3CO

OH

O

O

OOH

H3CO

H3CO

OH

O

OH

O

OOH

H3CO

H3CO

OH

O

O

OOH

H3CO

H3CO

OH

OH


Tabela 10. Substâncias isoladas e identificadas de P. caldense, P. bowiei, P. permucronatum e P. carniconnectivum (conclusão).

Derivados de ácidos benzoicos prenilados

P. caldense (K-951 Folhas)

(12) ácido-3-[(2’E,6’E,10’E)-11’-carboxi-3’,7’,15’-trimetil-2’,6’,10’,14’-hexadecatetraen-1’-il]-4,5-di-hidroxibenzoico,

ácido caldensínico

Obtido através da reação de metilação de 12.

(12a) 3,4-dimetoxi-5-[11’-metoxicarbonil-3’,7’,15’ trimetilexadeca-2’E, 6’E, 10’E,14’-tetraen-1’-il]-benzoato

de metila

Obtido através da reação de acetilação de 12.

(12b) ácido-3,4-bis-(acetiloxi)-5-[(2’E,6’E,10’E)-11’-carboxi-3’,7’,15’-trimetil-2’,6’,10’,14’-hexadecatetraen-1-il]

benzoico

Obtido através da reação de hidrogenação de 12.

(12c) Ácido benzenododecanoico-5-carboxi-2,3-di-hidroxi-ε,ι-dimetil-α-(4-metilpentila)

P. carniconnectivum (K-1441 Folhas)

(13) ácido-3-[(2’E,6’E,10’Z)-11’-carboxi-3’,7’,15’-trimetil-2’,6’,10’,14’-hexadecatetraen-1’-il]-4-metoxibenzoico

Obtido através da reação de metilação de 13.

(13a) 4-metoxi-3-[11’-metoxicarbonil-3’,7’,15’ trimetilexadeca-2’E, 6’E, 10’Z,14’-tetraen-1’-il]-benzoato

de metila

COOR1

OR2

OR2

COOR1

(12) R1=R2= H

(12a) R1=R2 = CH3

(12b) R1= H R2= COCH3

COOH

OH

OH

COOH

R

(13) H

(13a) CH3

COOROCH3

COOR


4.3 Identificação estrutural do cromenos 1 e 2

As substâncias 1 e 2 (Figura 29) foram identificadas em pequena quantidade

como um óleo a partir do extrato das folhas de P. bowiei (K-364 FA), suas estruturas

foram determinadas a partir dos espectros de RMN de 1H e de 13C e por EM-IE.

Figura 29. Estruturas das substâncias 1 e 2.

No espectro de massas de 1 obtido por EM-IE (Figura 30) observou-se um

pico em m/z 218 Da correspondente a [M]+•, compatível com a fórmula molecular

proposta C13H14O3. O íon fragmentário com m/z 203 Da (pico base) indicou a perda

de um grupo metílico. Para a substância 2 observou-se um pico em m/z 234 Da,

correspondente a [M]+•, sendo que a diferença de 16 Da observada, corresponde à

presença de um grupo hidroxila na posição 8, sendo proposta a fórmula molecular

C13H14O4.

Figura 30. Espectro de massas (IE) das substâncias a) 1 e b) 2.

O

O

O

R

(1) R= H

(2) R= OH

50 100 150 200 250

0

20

40

60

80

100

7258

86115

144

187

203

Inte

nsid

ade r

ela

tiva (

%)

m/z

218

50 100 150 200 250

0

20

40

60

80

100

3951

7794

115

129 160174

203

234

Inte

nsid

ade R

ela

tiva

m/z

219a) b)

[M] +•

[M] +•


GFREITAS.007

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5Chemical Shift (ppm)

5.5

55.6

0

6.2

56.3

0

6.6

86.7

3

7.1

9

7.6

1

7.7

17.7

5

No espectro de RMN de 1H de 1 (200 MHz, CDCl3) (Figura 31) observou-se a

presença de um duplo dupleto em 7,75 (J 2,2 e 8,4 Hz, 1H, H-7) e dois dubletos

em 7,61 (2,2 Hz, 1H, H-5) e 6.70 (8,4 Hz, 1H, H-8) indicativos de um sistema

aromático 1,2,4-trissubstituído. Observou-se também dois dupletos em 6,27 (9,9

Hz, 1H, H-4) e 5,58 (9,9 Hz, 1H, H-3) referentes aos hidrogênios da dupla ligação

nas posições 3 e 4. O espectro apresentou ainda um simpleto em 3,80 (3H, H-12)

correspondente aos hidrogênios da metoxila do grupo metílico e um simpleto em

1,38 (6H, H-9 e H-10) referente às metilas C-10 e C-11.

Figura 31. Espectro de RMN de 1H de 1 (200 MHz, CDCl3).

No espectro de RMN de 13C de 1 (Figura 32) observou-se sinais

correspondentes a 12 átomos de carbono, sendo um correspondente a carbonila do

grupo éster em 166,9 (C-9), um carbono metoxílico em 51,8, seis carbonos

referentes ao anel aromático em 120,6 (C-4a), 131,1 (C-5), 122,5 (C-6), 131,0 (C-

GFREITAS.007

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0Chemical Shift (ppm)

6.523.351.000.970.970.931.07

0.0

0

1.3

8

3.8

0

5.5

55.6

0

6.2

56.3

06.6

86.7

3

7.1

9

7.6

17.7

17.7

5

H-7 dd, 2.2

e 8.4 Hz

H-5 d, 2.2 Hz

H-8 d, 8.4 Hz

H-4 d, 9.9 Hz

H-3 d, 9.9 Hz

OCH3

H-10 e H-11

O

O

O2

45

7

9

12

811


7), 116,1 (C-8) e 157,1 (C-8a). Observou-se também dois carbonos olefínicos em

121,7 (C-3) e 128,1 (C-4), um carbono carbinólico em 77,4 (C-2) e dois carbonos

referentes às metilas em 28,3 (C-10 e C-11).

Os dados de RMN e EM foram comparados com a literatura possibilitando a

identificação da substância 1 como sendo o cromeno 2,2-dimetil-2H-1-benzopiran-6-

carboxilato de metila (Diaz; Arias; Joseph-Nathan, 1987) (Tabela 11).

A ocorrência deste cromeno foi também relatada nas espécies Piper aduncum

(Orjala, Jimmy et al., 1993), P. dilatatum (Terreaux; Hostettmann; Kurt, 1998), P.

hostmannianum (Diaz; Arias; Joseph-Nathan, 1987), P. mollicomum (Lago et al.,

2007) e P. taboganum (Roussis; Ampofo; Wiemer, 1990).

Figura 32. Espectro de RMN de 13C de 1 (50 MHz, CDCl3).

No espectro de RMN de 1H da substância 2 (Acetona-d6, 500 MHz) (Figura

33) foram observados dois dupletos em 7,35 (1H, J 2,0) e 7,27 (1H, J 2,0)

GFREITAS.008

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0Chemical Shift (ppm)

28.3

0

51.8

3

76.3

777.0

077.3

777.6

4

116.1

3120.6

3121.6

8122.4

8128.0

6131.0

1131.0

6

157.1

4

166.8

5

C-2

C-6

C-4 C-7/C-5

OCH3

C-10/C-11

C-9 C-8a C-4a

C-3

C-8


indicativos de um sistema aromático 1,3,4,5-tetrassubstituído com a presença de um

grupo hidroxílico no carbono 8, diferenciando de 1 pela hidroxilação observada em

C-8.

Os dados de RMN e EM de 2 foram comparados com a literatura levando à

sua identificação como sendo o cromeno 8-hidroxi-2,2-dimetil-2H-1-benzopiran-6-

carboxilato de metila (Orjala, Jimmy et al., 1993) (Tabela 11).

A ocorrência deste cromeno foi também relatada nas espécies Piper aduncum

(Orjala, Jimmy et al., 1993), P. hostmannianum (Lago et al., 2009) e P. mollicomum

(Lago et al., 2007).

Figura 33. Espectro de RMN de 1H de 2 (500 MHz, Acetona –d6).

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm

0.0

00

1.4

45

2.0

45

2.0

50

2.0

54

2.0

58

2.0

63

3.8

17

5.8

02

5.8

22

6.4

55

6.4

75

7.2

70

7.2

74

7.3

57

7.3

61

6.0

6

2.9

0

0.9

7

1.0

0

0.8

10.8

7

5.86.06.26.46.66.87.07.2 ppm

O

O

O

OH

2

45

7

9

12

811

10

H-4 d, 10,0 Hz

H-3 d, 10,0 Hz

H-5 d, 2.0 Hz

H-7 d, 2.0 Hz

OCH3


Tabela 11. Dados de RMN de 1H e 13C de 1 e RMN de 1H de 2.

Posição

1 2

1H

a

13C

a

1H lit

b

13C lit

b

1H

c

1H lit

d

2 - 77,4 - 77,2 - -

3 5,58 (1H, d, 9,9) 121,7 5,66 (1H, d, 9,0) 121,5 5,81 (1H, d, 10) 5,66 (1H, d, 9,9)

4 6,27 (1H, d, 9,9) 128,1 6,40 (1H, d, 9,0) 127,9 6,46 (1H, d, 10) 6,35 (1H, d, 9,9)

4a - 120,6 - 120,5 - -

5 7,61 (1H, d, 2,2) 131,1 7,70 (1H, d, 2,0) 130,9 7,27 (1H, d, 2,0) 7,33 (1H, d, 1,8)

6 - 122,5 - 122,4 - -

7 7,75 (1H, dd, 2,2 e 8,4)

131,0 7,85 (1H, dd, 2,0

e 7,5) 130,8 7,35 (1H, d, 2,0) 7,48 (1H, d, 1,8)

8 6,70 (1H, d, 8,4) 116,1 6,82 (1H, d, 7,5) 115,9 - -

8a - 157,1 - 156,9 - -

9 - 166,9 - 166,6 - -

10 1,38 (6H, s) 28,3 1,45 (6H, s) 28,3 1,45 (6H, s) 1,49 (6H, s)

11 1,38 (6H, s) 28,3 1,45 (6H, s) 28,3 1,45 (6H, s) 1,49 (6H, s)

OCH3 3,80 (3H, s) 51,8 3,87 (3H, s) 51,7 3,82 (3H, s) 3,88 (3H, s)

a CDCl3, 200 e 50 MHz;

b CDCl3,

90 e 25,2 MHz (Diaz et al., 1987);

c Acetona-d6, 500 MHz;

d CDCl3,

300 MHz (Orjala, Jimmy et al., 1993), em ppm; J em Hz.

O

O

O

OH

2

45

7

9

12

811

10O

O

O2

45

7

9

12

811


4.4 Identificação estrutural das flavonas 3, 4 e 5

As flavonas 3, 4 e 5 (Figura 34) isoladas de P. permucronatum, P. caldense e

P. carniconnectivum, respectivamente, foram identificadas através dos espectros de

RMN de 1H e 13C e EM.

Figura 34. Estruturas das substâncias 3, 4 e 5.

As fórmulas moleculares de 3, 4 e 5 foram estabelecidas de acordo com os

espectros de massas de alta resolução obtidos por EM-ESI.

Substância 3

Para a substância 3 (Figura 35), isolada de P. permucronatum, observou-se

um pico em m/z 301,0723 Da no espectro de massas de alta resolução (Figura 36),

compatível com a fórmula molecular proposta C16H12O6 (valor calculado para [M +

H]+: 301,0712 Da).

Figura 35. Estrutura da substância 3.

O

O

R4

R3

OH

R1

R2

A

B

C

R1 R2

R3 R4

(3) H OCH3 OH OH

(4) H OCH3 OCH3 OH

(5) OCH3 OCH3 H OH

O

O

OH

OH

H3CO

OH

2

45

71'

4'

3'


Figura 36. Espectro de massas de alta resolução (ESI-TOF) da substância 3.

Na análise do espectro de RMN de 1H de 3 observou-se sinais

correspondentes a dez hidrogênios. O simpleto em 12,98 (1H, OH-5) foi atribuído à

um hidrogênio de hidroxila quelatada. Observou-se um simpleto em 3,93 (3H)

correspondente a um grupo metoxilíco ligado ao carbono C-7 do anel aromático

(Figura 37).

Figura 37. Espectro de RMN de 1H de 3 (Acetona-d6, 500 MHz).

301.0723

+MS, 12.8min #762

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

5x10

Intens.

270 280 290 300 310 320 330 m/z

13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

2.0

42

.05

2.0

52

.05

2.0

62

.84

3.9

3

6.3

26

.33

6.6

16

.67

6.6

87

.00

7.0

27

.48

7.4

97

.51

7.5

27

.53

12

.98

3.0

7

0.9

20

.98

0.9

41

.00

1.0

00

.95

0.8

1

Current Data ParametersNAME Sub 07EXPNO 12PROCNO 1

F2 - Acquisition ParametersDate_ 20101130Time 18.59INSTRUM spectPROBHD 5 mm Dual 13C/PULPROG zgTD 65536SOLVENT CDCl3NS 64DS 4SWH 8064.516 HzFIDRES 0.123055 HzAQ 4.0632820 secRG 4DW 62.000 usecDE 10.00 usecTE 300.0 KD1 3.00000000 secTD0 1

======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 10.90 usecPL1 -5.00 dBSFO1 500.1334952 MHz


7.50 ppm 7.0 ppm 6.65 ppm 6.35 ppm

OH-5

[M+H]+

H-2’ d, 2,2 Hz

H-6’ dd, 2,2 e 8,5Hz

H-5’ d, 8,5 Hz

H-8 d, 2,3 Hz

H-3 s

H-6 d, 2,3 Hz

OCH3-7


Foram observados também um duplo dupleto em 7,50 (2,2 e 8,5 Hz, 1H,

H-6’) e dois dupletos em 7,52 (2,2 Hz, 1H, H-2’) e 7,01 (8,5 Hz, 1H, H-5’)

indicativos de um sistema aromático 1,3,4-trissubstituído, atribuídos aos hidrogênios

do anel B da flavona. Os dupletos observados em 6,68 (2,3 Hz, 1H, H-8) e 6,32

(2,3 Hz, 1H, H-6) são indicativos de um sistema aromático 1,2,3,5-tetrassubstituido,

e caracterizam o anel A da flavona. O simpleto observado em 6,61 (1H)

corresponde ao hidrogênio olefínico H-3 do anel C.

Os dados de 3 de RMN de 1H e 13C (Tabela 12) foram comparados aos da

literatura levando à sua identificação como sendo a flavona 2-(3’,4’-di-hidroxifenil)-5-

hidroxi-7-metoxi-4H-1-benzopiran-4-ona, também conhecida como 7-O-metil-

luteolina (Ahmad et al., 2000). Este é o primeiro relato desta flavona em uma

espécie de Piper.

Substância 4

Para a substância 4 (Figura 38), isolada de P. caldense, observou-se um

pico em m/z 315,0863 Da, no espectro de massas de alta resolução (Figura 39),

compatível com a fórmula molecular proposta C17H14O6 (valor calculado para [M +

H]+: 315,0869 Da).


O

O

OH

OH

H3CO

OCH3

2

45

71'

4'

3'


Figura 39. Espectro de massas de alta resolução de 4 (ESI-TOF).

A flavona 4 apresentou a mesma substituição observada no anel A de 3, um

sistema aromático 1,2,3,5-tetrassubstituído com dois dupletos referentes aos

hidrogênios meta em 6,49 (2,3 Hz, 1H, H-8) e 6,37 (2,3 Hz, 1H, H-6) (Figura 40).

O anel B apresentou sinais indicativos de um sistema aromático 1,3,4-

trissubstituído assim como observado em 3, no entanto, com uma metoxila em C-3’.

Foram observados um duplo dupleto em 7,48 (2,1 e 8,4 Hz, 1H, H-6’) e dois

dupletos em 7,33 (2,1 Hz, 1H, H-2’) e 7,04 (8,4 Hz, 1H, H-5’). O simpleto

observado em 6,57 (1H) corresponde ao hidrogênio da olefínico H-3.


284.3315

315.0863

337.0692

+MS, 11.5-11.9min #(689-710)

0

1

2

3

4

5

4x10

Intens.

280 290 300 310 320 330 340 350 m/z

13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

0.0

10

.07

1.2

41

.25

1.2

61

.27

1.6

12

.04

2.1

73

.49

3.8

93

.89

3.9

83

.99

3.9

94

.01

4.0

14

.12

4.1

36

.04

6.3

76

.38

6.4

96

.49

6.5

77

.03

7.0

57

.26

7.3

37

.33

7.4

87

.48

7.4

97

.50

12

.79

2.9

53

.16

0.9

11

.01

1.0

11

.04

1.0

01

.02

0.9

4


F2 - Acquisition ParametersDate_ 20080117Time 15.09INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 1H-13PULPROG zgTD 65536SOLVENT CDCl3NS 64DS 0SWH 8169.935 HzFIDRES 0.124663 HzAQ 4.0108533 secRG 203.2DW 61.200 usecDE 6.00 usecTE 298.0 KD1 5.00000000 secTD0 1

======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 9.60 usecPL1 0 dBSFO1 500.1335431 MHz


7.407.457.50 ppm 7.05 ppm 6.406.456.506.55 ppm

[M+H]+

[M+Na]+

H-6’ dd, 2,2 e 8,5 Hz

H-2’ d, 2,1 Hz

H-5’ d, 8,5 Hz

H-6 d, 2,3 Hz

H-8 d, 2,3 Hz

H-3 s

OH-5

OCH3-7 OCH3-3’


As posições das metoxilas foram determinadas através do espectro de

HMBC, no qual foi possível observar as correlações dos hidrogênios em 3,89 com

C-7, assim como os hidrogênios H-6 e H-8. Os hidrogênios da segunda metoxila em

4,01 se correlacionam com C-3’ assim como H-5’ e H-2’ (Figura 41).

Figura 41. Correlações HMBC selecionadas de 4.

Os dados de RMN de 1H e 13C de 4 (Tabela 11). foram comparados aos da

literatura levando à sua identificação como sendo a flavona hidroxi-2-(4’-hidroxi-3’-

metoxifenil)-7-metoxi-4H-1-benzopiran-4-ona, também conhecida como velutina

(Jensen et al., 1994). A ocorrência desta flavona em Piper foi relatada em P. clarkii

(Jensen et al., 1994), P. porphyrophyllum (Rajudin et al., 2010) e P. umbellata

(Baldoqui et al., 2009).

Substância 5

Para a substância 5 (Figura 42), isolada de P. carniconnectivum, observou-

se um pico em m/z 315,0869 Da, no espectro de massas de alta resolução (Figura

43), compatível com a fórmula molecular proposta C17H14O6 (valor calculado para [M

+ H]+: 315,0869 Da).



Figura 43. Espectro de massas de alta resolução da substância 5 (ESI-TOF).

A substância 5 apresentou uma substituição diferente de 3 e 4 no anel A,

sendo um sistema aromático pentassubstituído com o simpleto em 6,86 referente a

H-8. No anel B observou-se a presença de apenas um substituinte, uma hidroxila na

posição C-4’. Os sinais dos hidrogênios simétricos do anel B foram observados em

7,03 (d, 9,0 Hz, 2H, H-3’ e H-5’) e 7,97 (d, 9,0 Hz, 2H, H-2’ e H-6’) (Figura 44).

O

O

OH

OH

H3CO

H3CO2

45

71'

4'

300.0632 305.1560

315.0869

337.0692

+MS, 12.7min #761

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

5x10

Intens.

290 300 310 320 330 m/z

[M+H]+

[M+Na]+


Figura 44. Espectro de RMN de 1H de 5 (500 MHz, Acetona-d6).

Os dados de RMN de 1H e 13C de 5 (Tabela 12) foram comparados aos da

literatura levando à sua identificação como sendo a flavona 5-hidroxi-2-(4’-

hidroxifenil)-6,7-dimetoxi-4H-1-benzopiran-4-ona, conhecida também como

scrofuleina (Rao; Kingston; Spittler, 1970). Este é o primeiro relato da ocorrência

desta flavona em Piper.

As atribuições dos deslocamentos químicos das flavonas 3, 4 e 5 foram

realizadas de acordo com os espectros de RMN de 1H, 13C, HSQC e HMBC (Tabela

12).

13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm

-0.0

0

2.0

52

.06

2.0

6

2.8

9

3.8

03

.99

6.6

96

.86

7.0

37

.03

7.0

47

.05

7.9

67

.97

7.9

87

.98

12

.96

2.9

73

.20

1.0

21

.00

2.0

8

2.0

5

0.8

6

Current Data ParametersNAME K1600 P3_2EXPNO 1PROCNO 1

F2 - Acquisition ParametersDate_ 20121216Time 13.23INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 13C ZPULPROG zg30TD 65536SOLVENT AcetoneNS 16DS 0SWH 7507.507 HzFIDRES 0.114555 HzAQ 4.3647475 secRG 203DW 66.600 usecDE 6.50 usecTE 298.2 KD1 1.00000000 secTD0 1



6.86.97.0 ppmppm

H-2’ e H-6’

d, 9,0 Hz

H-8 s

H-3 s

OH-5

OCH3-6 OCH3-7

H-3’ e H-5’ d, 9,0 Hz

O

O

OH

OH

H3CO

H3CO2

45

71'

4'


Tabela 12. Dados de RMN de 1H e 13C de 3, 4 e 5 (500 e 125 MHz).

3 4 5

Posição 1H * 13C * 1H ** 13C ** 1H * 13C *

2 - 165,5 - 164,1 - 165,9

3 6,61 (s, 1H) 104,5 6,57 (s, 1H) 104,5 6,69 (s, 1H) 103,6

4 - 183,3 - 182,4 - 184,0

4 a - 106,1 - 105,5 - 106,9

5 - 163,2 - 162,2 - 154,5

6 6,32 (d, 2,3, 1H) 98,8 6,37 (d, 2,3, 1H) 98,1 - 134,0

7 - 166,7 - 165,5 - 160,6

8 6,68 (d, 2,3, 1H) 93,9 6,49 (d, 2,3, 1H) 92,7 6,86 (s, 1H) 91,7

8 a - 158,8 - 157,7 - 154,5

1' - 123,8 - 123,4 - 123,7

2' 7,52 (d, 2,2, 1H) 114,3 7,33 (d, 2,1, 1H) 108,3 7,97 (d, 9,0, 1H) 129,0

3' - 146,6 - 146,9 7,03 (d, 9,0, 1H) 116,6

4' - 150,3 - 149,3 - 162,5

5' 7,01 (d, 8,5, 1H) 116,8 7,04 (d, 8,4, 1H) 115,0 7,03 (d, 9,0, 1H) 116,5

6' 7,50 (dd, 2,2 e 8,5, 1H) 120,3 7,48 (dd, 2,1 e 8,4, 1H) 120,8 7,97 (d, 9,0, 1H) 129,0

-OCH3-6 - - - - 3,80 (s, 3H) 60,4

-OCH3-7 3,93 (s, 3H) 56,5 3,89 (s, 3H) 55,8 3,99 (s, 3H) 56,7

-OCH3-3’ - - 4,01 (s, 3H) 56,2 - -

-OH - 5 12,98 (s, 1H) - 12,79 (s, 1H) - 12,96 (s, 1H) -

-OH – 4’ *** - 6,04 (s, 1H) - *** -

*- Acetona-d6; **-CDCl3; *** - não observado; J em Hertz; em ppm;

O

O

OH

OH

H3CO

OH

2

45

71'

4'

3'

O

O

OH

OH

H3CO

OCH3

2

45

71'

4'

3'

O

O

OH

OH

H3CO

H3CO2

45

71'

4'


4.5 Identificação estrutural das flavanonas 6 e 7

As flavanonas 6 e 7 (Figura 45) isoladas de P. bowiei e P. permucronatum,

respectivamente, foram identificadas através dos espectros de RMN de 1H e 13C e

EM.


No espectro de massas de ambas as flavanonas 6 e 7 (IE) (Figura 46)

observou-se um pico em m/z 286 Da correspondente ao pico do íon molecular [M]+•,

este pico associado aos dados de RMN de 13C levou à fórmula molecular C16H14O5.

Figura 46. Espectro de massas (IE) das substâncias a) 6 e b) 7.

O

O

R3

OH

R1

R2

A

B

C

R1 R2 R3

(6) OH OCH3 H

(7) OCH3 H

OH

50 100 150 200 250 300

0

20

40

60

80

100

271

93

39

51

69

77 104

110

139

153

182

167

209

Inte

nsid

ade

re

lativa

m/z

286

50 100 150 200 250 300

0

20

40

60

80

100

41

55

147

110

91

69

95

120

138193

180

167

Inte

nsid

ade

re

lativa

m/z

286

a) b)


Apesar de ambas as substâncias apresentarem a mesma fórmula molecular,

pôde-se observar as diferenças estruturais através dos espectros de RMN de 1H.

Substância 6

Para a substância 6 (Figura 47), isolada de P. bowiei, no espectro de RMN

de 1H (CDCl3, 300 MHz) (Figura 48), observou-se três duplos dupletos em 5,48

(3,0 e 12,9 Hz, 1H, H-2), 3,08 (12,9 e 17,2 Hz, 1H, H-3) e 2,86 (3,0 e 17,3Hz, 1H, H-

3) correspondente ao sistema ABX do anel C de flavanonas.

O

OOH

OH

OCH3

2

45

71'

3'


Observou-se um simpleto em 11,88 (OH-5) referente ao hidrogênio de

hidroxila quelada, um simpleto em 3,88 (3H, OCH3-8) referente a uma metoxila no

anel A. A presença de simpleto em 6,15 (1H, H-6) é indicativa de um sistema

aromático pentassubstituído, e a presença de um multipleto na região de 7,39-7,49

(5H) sugere a presença de um anel B monossubstituído.


Figura 48. Espectro de RMN de 1H de 6 (CDCl3, 300 MHz).

Os dados de RMN de 1H e 13C de 6 (Tabela 13). foram comparados aos da

literatura sendo identificada como a flavanona (2S)-2,3-di-hidro-5,7-di-hidroxi-2-fenil-

8-metoxi-4H-1-benzopiran-4-ona, também conhecida como di-hidrowogonina

(Vinciguerra et al., 2003). Este é o primeiro relato da ocorrência desta flavanona em

Piper.

Substância 7

Para a substância 7 (Figura 49), isolada de P. permucronatum, o espectro de

RMN de 1H (Acetona-d6, 300 MHz) (Figura 50) apresentou dois simpletos em

12,15 (1H) e 8,57 (1H) referentes às hidroxilas em C-5 e C-4’, respectivamente.

Observou-se um simpleto em 3,85 (3H) correspondente a uma metoxila e três

duplos dupletos em 5,49 (3,1 e 12,9 Hz, 1H, H-2), 3,22 (12,9 e 17,2 Hz, 1H, H-3b)

e 2,76 (3,1 e 17,2 Hz, 1H, H-3a) correspondentes ao sistema ABX do anel C.

12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

-0.0

0

2.8

52.8

52.8

82.8

93.0

63.0

83.0

93.1

23.8

85.4

75.4

75.4

95.5

06.1

56.5

37.2

67.3

97.4

07.4

17.4

17.4

17.4

27.4

27.4

37.4

37.4

47.4

47.4

57.4

57.4

67.4

67.4

67.4

67.4

77.4

77.4

87.4

87.4

87.4

97.4

9

11.8

8

1.0

21.0

3

3.0

2

1.0

0

0.9

6

0.9

4

5.1

0

0.9

9

Current Data ParametersNAME Sub 05 (6)EXPNO 1PROCNO 1

F2 - Acquisition ParametersDate_ 20120607Time 14.50INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 13C ZPULPROG zg30TD 65536SOLVENT CDCl3NS 16DS 8SWH 7500.000 HzFIDRES 0.114441 HzAQ 4.3691168 secRG 203DW 66.667 usecDE 6.50 usecTE 298.2 KD1 1.00000000 secTD0 1

======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 7.64 usecPLW1 13.69999981 WSFO1 500.1332522 MHz


7.457.50 ppm 5.50 ppm 2.93.03.1 ppm

OH-5

H-2 dd, 3,0 e 12,9 Hz

Anel-B

OCH3-8

H-3a dd, 12,9 e 17,2 Hz H-3b

dd, 3,0 e 17,2 Hz

H-6



A presença de dois dupletos em 6,04 (2,2 Hz, 1H, H-6) e 6,06 (2,2 Hz, 1H,

H-8), indicou a presença de um anel A 1,2,3,5-tetrassubstituído. Os dois dupletos em

6,91 (8,8 Hz, 2H, H-3’ e H-5’) e 7,40 (8,8 Hz, 2H, H-2’ e H-6’) são indicativos de um

sistema aromático 1,4-dissubstituído do anel B da flavanona.

Figura 50. Espectro de RMN de 1H de 7 (Acetona-d6, 300 MHz).

Os valores de RMN de 1H e 13C da substância 7 (Tabela 13) foram

comparados com dados da literatura levando à sua identificação como sendo 2,3-di-

hidro-5-hidroxi-2-(4’-hidroxifenil)-7-metoxi-4H-1-benzopiran-4-ona, também

denominada sakuranetina (Vasconcelos; Silva; Cavaleiro, 1998).

O

O

OH

OH

H3CO

2

45

71'

4'

13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm

-0.0

1-0

.00

2.0

42

.05

2.0

52

.06

2.0

72

.08

2.0

92

.09

2.7

32

.74

2.7

92

.80

2.8

32

.86

3.1

73

.21

3.2

33

.27

3.8

5

5.4

65

.47

5.5

05

.51

6.0

36

.04

6.0

56

.06

6.8

86

.89

6.9

06

.91

6.9

26

.93

7.3

87

.38

7.3

97

.39

7.4

07

.40

7.4

17

.41

7.4

27

.42

8.5

7

12

.15

1.1

95

.05

1.1

4

0.9

9

1.7

0

1.9

8

2.0

1

0.8

0

0.7

7


F2 - Acquisition ParametersDate_ 20120607Time 7.55INSTRUM spectPROBHD 5 mm BBO BB-1HPULPROG zgTD 65536SOLVENT AcetoneNS 16DS 4SWH 4504.504 HzFIDRES 0.068733 HzAQ 7.2745461 secRG 161DW 111.000 usecDE 6.50 usecTE 297.1 KD1 1.00000000 secTD0 1



6.06.57.0 ppm 3.3 ppm2.8 ppm

H-6’ H-2’

OCH3-7

H-5’ H-3’

H-6 H-8

H-2

H-3a H-3b

OH-5

OH-4’


A ocorrência desta flavanona em Piper foi relatada em P. crassinervium

(Lopes et al., 2008), P. hostmannianum (Portet et al., 2008), P. lhotzkyanum (Lago et

al., 2007) e P. marginatum (Reigada et al., 2007).

As atribuições dos deslocamentos químicos das flavanonas 6 e 7 foram

realizadas de acordo com os espectros de RMN de 13C, HSQC e HMBC (Tabela 13).

Tabela 13. Dados de RMN de 1H e 13C de 6 e 7 (300 e 75 MHz).

6

7

Posição 1H * 13C * 1H ** 13C **

2 5,48 (dd, 3,0 e 12,9, 1H) 79,6 5,49 (dd, 3,1 e 12,9, 1H) 80,1

3 3,08 (dd, 12,9 e 17,2, 1H)

2,86 (dd, 3,0 e 17,2, 1H) 43,5

2,76 (dd, 3,1 e 17,2, 1H)

3,22 (dd, 12,9 e 17,2, 1H) 43,5

4 - 195,6 - 197,7

4 a - 103,0 - 103,7

5 - 159,6 - 165,0

6 6,15 (s, 1H) 96,0 6,04 (d, 2,2, 1H) 95,5

7 - 157,9 - 168,9

8 - 127,6 6,06 (d, 2,2, 1H) 94,6

8 a - 152,8 - 164,2

1' - 138,3 - 130,7

2' 7,39-7,49 (m, 5H) 126,0 7,40 (d, 8,8, 1H) 129,6

3' 7,39-7,49 (m, 5H) 128,9 6,91 (d, 8,8, 1H) 116,2

4' 7,39-7,49 (m, 5H) 128,9 - 158,7

5' 7,39-7,49 (m, 5H) 128,9 6,91 (d, 8,8, 1H) 116,2

6' 7,39-7,49 (m, 5H) 126,0 7,40 (d, 8,8, 1H) 129,6

-OCH3-8 3,88 (s, 3H) 61,6 - -

-OH-5 11,88 (s, 1H) - 12,15 (s, 1H) -

-OH-7 6,53 (s, 1H) - - -

-OCH3-7 - - 3,85 (s, 3H) 56,3

-OH - 4’ - - 8,57(1H, s) -

*-CDCl3;**- Acetona-d6; J em Hertz; em ppm;

O

OOH

OH

OCH3

2

45

71'

3'

O

O

OH

OH

H3CO

2

45

71'

4'


4.6 Identificação estrutural das substâncias 8, 9 e 8a

As substâncias 8 e 9 (Figura 51) foram isoladas a partir do extrato em AcOEt

das folhas de Piper carniconnectivum (código: K-1441 FA) e tiveram suas estruturas

determinadas a partir dos espectros de RMN de 1H, 13C, HSQC, HMBC, COSY e

EM.


Substância 8

A fórmula molecular de 8 (Figura 52), isolada de P. carniconnectivum, foi

estabelecida de acordo com o espectro de massas de alta resolução, no qual se

observou um pico em m/z 335,1121 Da, correspondente ao íon quasimolecular [M +

H]+, levando à fórmula molecular C17H18O7 (valor calculado para [M + H]+: 335,1131

Da). Foi observado também um íon correspondente ao aduto de sódio em m/z

357,0925 Da [M+Na]+ (Figura 53). A principal fragmentação observada foi referente à

perda do anel B, levando ao íon fragmentário m/z 223,0596 Da.

O

OOH

H3CO

H3CO

OH

O

2

45

71'

4'

2'


O

OOH

H3CO

H3CO

OH

O

8

O

OOH

H3CO

H3CO

OH

O

OH

9


Figura 53. Espectro de massas de alta resolução (HR-ESI-TOF) da substância 8.

O espectro de absorção na região do infravermelho (Figura 54) indicou a

presença de grupos hidroxílicos devido à presença das bandas em 3389 e 3302 cm-1

provenientes da deformação axial de O-H e com a banda em 1310 cm-1 proveniente

da deformação axial da ligação C-O de grupo fenol. Foram observadas também

duas bandas de absorção em 1674 e 1637 cm-1 referentes à deformação axial de

C=O das carbonilas. As bandas referentes às deformações axiais simétricas e

assimétricas da ligação C-H dos grupos metilícos e metilênicos foram observadas na

região de 2950 cm-1.

Figura 54. Espectro de absorção na região do infravermelho de 8 (KBr).

207.0636

223.0596

247.0937

275.0900

289.1066

317.1009

335.1121

357.0925

+MS, 10.4min #623

0

2

4

6

4x10

Intens.

150 200 250 300 350 m/z

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

50

60

70

80

90

100

833

1674

2950

3302

3389

1118

1452

1211

1310

Wavenumber (cm-1)

Ab

so

rba

nce

(%

)

1637

1674

[M+H]+

[M+Na]+

[M+H-Anel B]+


No espectro de RMN de 1H de 8 (Figura 55, Figura 56 e Figura 57) observou-

se sinais típicos de substância da classe das flavanonas, com um simpleto

correspondente a um hidrogênio de um sistema aromático penta-substituído em

6,09 (1H, H-8), dois simpletos correspondente a grupos metoxilícos em 3,83 (3H,

OCH3-7) e 3,89 (3H, OCH3-6) e um simpleto correspondente ao próton da hidroxila

(OH-5) quelatado com a carbonila (C-4) em 11,76, com este conjunto de sinais foi

possível determinar o anel A da flavanona.


Os sinais correspondentes ao anel C da flavanona foram caracterizados por

três duplos dupletos com padrão de acoplamento ABX em 4,44 (2,8 e 13,8 Hz, 1H,

H-2), 3,09 (13,8 e 17,2 Hz, 1H, H-3) e 2,68 (2,8 e 17,2, 1H, H-3). No entanto, os

sinais de hidrogênios aromáticos esperados para o anel B não foram observados,

estes foram substituídos por sinais correspondentes a quatro hidrogênios alifáticos

em 2,08 (ddd, 4,8, 10,2 e 13,5 Hz, H-6’b), 2,16 (dddd, 1,4, 5,3, 6,3 e 13,5 Hz, H-

6’a), 2,50 (dddd, 0,5, 4,8, 6,3 e 17,3 Hz , H-5’b) e 2,79 (ddd, 5,3, 10,2 e 17,3 Hz, H-

13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm

0.0

00

1.5

63

2.0

85

2.1

05

2.1

50

2.1

52

2.1

54

2.1

65

2.4

50

2.5

19

2.5

20

2.6

40

2.6

45

2.6

74

2.6

80

2.7

55

2.7

65

2.7

75

2.7

86

2.7

89

2.8

00

2.8

09

3.0

58

3.0

86

3.0

92

3.1

20

3.3

59

3.8

27

3.8

91

3.9

03

4.4

26

4.4

31

4.4

53

4.4

59

6.0

81

6.1

01

6.1

02

6.1

22

6.1

23

7.0

86

7.0

88

7.1

06

7.1

08

7.2

61

11.7

58

1.0

71.1

31.1

31.0

7

1.1

61.0

5

2.9

82.9

9

1.0

0

0.9

30.9

7

1.0

0

0.7

5

Current Data Parameters

NAME Sub 08

EXPNO 1PROCNO 1

F2 - Acquisition Parameters

Date_ 20110405Time 17.03

INSTRUM spect

PROBHD 5 mm Dual 13C/

PULPROG zg

TD 65536

SOLVENT CDCl3

NS 128DS 4

SWH 7485.030 Hz

FIDRES 0.114212 Hz

AQ 4.3778548 secRG 362

DW 66.800 usec

DE 6.00 usec

TE 303.7 KD1 3.00000000 sec

TD0 1

======== CHANNEL f1 ========

NUC1 1H

P1 10.90 usec

PL1 -5.00 dBSFO1 500.1332511 MHz

F2 - Processing parameters

SI 65536SF 500.1300124 MHz

WDW EM

SSB 0LB 0.10 Hz

GB 0

PC 1.00

OH-5


5’a) e dois prótons olefínicos típicos de uma cicloexenona em 6,11 (dd, 0,5 e 10,3

Hz, H-3’) e 7,10 (dd, 1,4 e 10,3 Hz, H-2’).

Figura 56. Espectro de RMN de 1H de 8 (500 MHz, CDCl3) (ampliação de 7,2 a 3,5 ppm).

Figura 57. Espectro de RMN de 1H de 8 (500 MHz, CDCl3) (ampliação 3,17 a 2,60 e de 2,60 a 2,00 ppm).

4.04.55.05.56.06.57.0 ppm

3.8

27

3.8

91

3.9

03

4.4

26

4.4

31

4.4

53

4.4

59

6.0

81

6.1

01

6.1

02

6.1

22

6.1

23

7.0

86

7.0

88

7.1

06

2.9

8

2.9

9

1.0

0

0.9

30.9

7

1.0

0

7.10 ppm 6.10 ppm 4.45 ppm

2.652.702.752.802.852.902.953.003.053.103.15 ppm

2.6

40

2.6

45

2.6

74

2.6

80

2.7

55

2.7

65

2.7

75

2.7

86

2.7

89

2.8

00

2.8

09

3.0

58

3.0

86

3.0

92

3.1

20

2.052.102.152.202.252.302.352.402.452.502.55 ppm

2.0

85

2.0

95

2.1

05

2.1

15

2.1

50

2.1

52

2.1

54

2.1

62

2.1

65

2.1

66

2.4

50

2.4

84

2.4

86

2.5

09

2.5

19

2.5

20

H-2’ dd, 1,4 e 10,3 Hz H-3’

dd, 0,5 e 10,3 Hz

H-2 dd, 2,8 e 13,8 Hz

H-8

H-5’b dddd, 0,5, 4,8, 6,3 e 17,3 Hz

H-6’a

dddd, 1,4, 5,3, 6,3 e 13,5 Hz

H-6’b

ddd, 4,8, 10,2 e 13,5 Hz

H-5’a ddd, 5,3, 10,2 e

17,3 Hz

H-3b dd, 2,8 e 17,2 Hz

H-3a dd, 13,8 e 17,2 Hz

OCH3-6 OCH3-7


No espectro de RMN de 13C de 8 (Figura 59 e Figura 60) foram observados

sinais correspondentes a dezessete átomos de carbono. A atribuição dos

deslocamentos químicos foi realizada de acordo com os espectro de RMN 2D,

HSQC e HMBC (Figura 62). Foram observados dois sinais correspondentes a

carbono carbonílico, sendo um deles atribuído ao carbono C-4 em 196,0 e o

segundo em 198,3 foi atribuído ao carbono C-4’ do anel B, sugerindo a presença

de uma segunda carbonila no anel B não aromático. Esta modificação não usual no

anel B foi confirmada com as correlações HMBC observadas entre H-2’ com a

carbonila em 198,3 (C-4’), um carbono carbinólico em 69,7 (C-1’) além de um

carbono alifático em 30,9 (C-6’).

A conexão do anel B ao anel C foi confirmada com as correlações observadas

entre H-2’ e C-2, além de H-2 com C-2’. No experimento de HMBC observou-se

também correlação entre H-3’ com os carbonos em C-1’ e C-5’. Ao carbono C-1’ foi

associado uma segunda hidroxila (Figura 58).

Figura 58. Principais correlações HMBC observadas nos anéis B e C de 8.

O

O

O

OH

OH

H3CO

H3CO

H

H

H

8

6

2

4

3'

5'



Figura 60. Espectro de RMN de 13C de 8 (125 MHz, CDCl3) (ampliação de 210 a 120 ppm e de 105 a 30 ppm).

As posições dos grupos metoxilas foram estabelecidas de acordo com as

correlações HMBC e NOESY observadas. No experimento de HMBC, o hidrogênio

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 ppm

30.8

633.2

035.7

5

56.2

060.8

3

69.7

076.7

577.0

077.2

581.8

391.4

8

102.8

5

130.2

5130.6

5

147.6

8154.8

0157.7

0160.7

6

195.9

6198.3

4


NAME Sub 08EXPNO 13

PROCNO 1


Date_ 20100317

Time 23.51INSTRUM spect

PROBHD 5 mm Dual 13C/

PULPROG zgpg30TD 65536

SOLVENT CDCl3

NS 6327DS 4

SWH 32679.738 Hz

FIDRES 0.498653 HzAQ 1.0027508 sec

RG 32768DW 15.300 usec

DE 10.00 usec

TE 297.8 KD1 1.00000000 sec

d11 0.03000000 sec

DELTA 0.89999998 secTD0 1

======== CHANNEL f1 ========NUC1 13C

P1 10.70 usec

PL1 2.00 dBSFO1 125.7716224 MHz

======== CHANNEL f2 ========

CPDPRG2 waltz16

NUC2 1H

PCPD2 92.00 usecPL2 -5.00 dB

PL12 12.69 dBPL13 17.00 dB

SFO2 500.1320005 MHz


SI 65536

SF 125.7577985 MHzWDW EM

SSB 0

LB 1.00 HzGB 0

PC 1.40

130135140145150155160165170175180185190195200 ppm

130.2

5

130.6

5

147.6

8

154.8

0

157.7

0

160.7

6

195.9

6

198.3

4

35404550556065707580859095100105 ppm

30.8

6

33.2

0

35.7

5

56.2

0

60.8

3

69.7

0

76.7

577.0

077.2

5

81.8

3

91.4

8

102.8

5

C-4a

C-8 C-2 C-1’ OCH3-7 C-3 C-5’

C-6’

C-4’ C-4 C-6

C-8a

C-5 C-2’

C-3’

C-7

OCH3-6

C-8a

C-7


H-8 ( 6,09) apresentou correlações com os carbonos em 130,7 (C-7) e 160,8 (C-

6) enquanto o hidrogênio da hidroxila em C-5 ( 11,76) apresentou correlação com

os carbonos em 160,8 (C-6), 102,9 (C-4a), 130,7 (C-7) e 154,9 (C-5).

Os hidrogênios de metoxila observados em 3,83 apresentaram correlação J3

com o carbono atribuído à C-6 e os hidrogênios da segunda metoxila em 3,90

apresentaram correlação com C-7. O experimento de NOESY (Figura 63) confirmou

o posicionamento dos grupos metoxilícos devido à correlação NOE observada entre

os hidrogênios metoxílicos de OCH3-7 com o hidrogênio aromático H-8 (Figura 61).

O

O

O

OH

OH

H3CO

H3CO

H8

6

2

4

1'3'

5'

Figura 61. Correlações NOE (----) e HMBC ( ____) observadas no anel A de 8.

Figura 62. Mapa de contorno HMBC de 8 (ampliação nas regiões de 13,5 a 3,0

ppm em F2 e de 80,0 a 220,0 ppm em F1).

ppm

45678910111213 ppm

80

100

120

140

160

180

200

220


NAME Sub 08

EXPNO 11

PROCNO 1


Date_ 20110416

Time 1.30

INSTRUM spectPROBHD 5 mm TBI 1H-13

PULPROG hmbcgplpndqf

TD 4096

SOLVENT DMSONS 64

DS 16

SWH 7485.030 Hz

FIDRES 1.827400 Hz

AQ 0.2736628 sec

RG 16384

DW 66.800 usec

DE 6.00 usec

TE 298.8 K

CNST2 145.0000000CNST13 6.0000000

d0 0.00000300 sec

D1 1.50000000 sec

d2 0.00344828 secd6 0.08333334 sec

D16 0.00020000 sec

IN0 0.00001530 sec

======== CHANNEL f1 ========

NUC1 1H

P1 10.90 usec

p2 21.80 usec

PL1 -1.00 dB

SFO1 500.1335009 MHz

======== CHANNEL f2 ========

NUC2 13C

P3 12.60 usecPL2 -5.00 dB

SFO2 125.7716224 MHz

====== GRADIENT CHANNEL =====

GPNAM1 SINE.100GPNAM2 SINE.100

GPNAM3 SINE.100

GPZ1 50.00 %

GPZ2 30.00 %GPZ3 40.10 %

P16 1000.00 usec

F1 - Acquisition parameters

TD 256SFO1 125.7716 MHz

FIDRES 127.655228 Hz

SW 259.834 ppm

FnMODE QF


SI 2048

SF 500.1300087 MHz

WDW SINESSB 0

LB 0 Hz

GB 0

PC 1.40


SI 512

MC2 QF

SF 125.7577426 MHz

WDW echo-antiechoSSB 0

LB 0 Hz

GB 0

OH-5/C-6 H-8/C-6 OCH3/C-6

OCH3/C-7 H-8/C-7

O

O

O

OH

OH

H3CO

H3CO

H8

6

2

4

1'3'

5'


Figura 63. Mapa de contorno do experimento 2D NOESY de 8 (ampliação na região de 7,5 a 3,5 ppm em F1 e F2).

A substância 8 (Figura 64), de estrutura inédita, foi caracterizada como sendo

a flavanona 2,3-di-hidro-5-hidroxi-2-(1’-hidroxi-4’-oxo-2’-cicloexen-1’-il)-6,7-dimetoxi-

4H-1-benzopiran-4-ona, os deslocamentos químicos de RMN de 1H e de 13C e as

correlações observadas nos experimentos de RMN 2D (Tabela 14).

O

OOH

H3CO

H3CO

OH

O

8

2

45

71'

4'

2'


ppm

4.04.55.05.56.06.57.07.5 ppm

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5


NAME Sub 08

EXPNO 2

PROCNO 1


Date_ 20110412

Time 0.13

INSTRUM spect

PROBHD 5 mm TBI 1H-13

PULPROG noesygpph

TD 2048

SOLVENT CDCl3

NS 16

DS 16

SWH 6983.240 Hz

FIDRES 3.409785 HzAQ 0.1466868 sec

RG 812.7

DW 71.600 usec

DE 6.00 usec

TE 300.0 K

d0 0.00005772 sec

D1 2.00000000 sec

D8 0.75000000 sec

D16 0.00030000 sec

IN0 0.00014320 sec

ST1CNT 0

TAU 0.37369999 sec

======== CHANNEL f1 ========

NUC1 1H

P1 10.90 usec

p2 21.80 usec

PL1 -1.00 dBSFO1 500.1330008 MHz


GPNAM1 SINE.100

GPNAM2 SINE.100

GPZ1 80.00 %

GPZ2 40.00 %

P16 1000.00 usec


TD 512

SFO1 500.133 MHz

FIDRES 13.639141 Hz

SW 13.963 ppm

FnMODE States-TPPI

F2 - Processing parametersSI 1024

SF 500.1300093 MHz

WDW QSINE

SSB 2

LB 0 Hz

GB 0

PC 1.00


SI 1024

MC2 States-TPPI

SF 500.1300086 MHz

WDW SINE

SSB 2

LB 0 Hz

GB 0

OCH3-7 / H-8

O

O

O

OH

OH

H3CO

H3CO

H8

6

2

4

1'3'

5'


Tabela 14. Dados de RMN de 1H e13C de 8 (500 e 125 MHz, DMSO-d6).

Posição 1H

13C HMBC COSY

2 4,44 (dd , 2,8, 13,8, 1H) 81,8 C4, C2’ H3a, H3b

3 -Ha

3-Hb

3,09 (dd, 13,8, 17,2, 1H)

2,68 (dd, 2,8, 17,2, 1H)

35,8 C2, C4, C1’

C4a, C4,

H2, H3b

H2, H3a

4 - 196,0 - -

4 a - 102,8 - -

5 - 154,8 - -

6 - 130,7 - -

7 - 160,8 - -

8 6,09 (s, 1H) 91,5 C4, C4a, C6, C7, C8a -

8 a - 157,8 - -

1’ - 69,7 - -

2’ 7,10 (dd, 1,4 e 10,3, 1H) 147,7 C2, C1’, C4’ e C6’ H3’

3’ 6,11 (dd, 0,5 e 10,3, 1H) 130,3 C1’ e C5’ H2’

4’ - 198,3 - -

5’-Ha

5’-Hb

2,79 (ddd, 5,3, 10,2, 17,3, 1H)

2,50 (dddd, 0,5, 4,8, 6,3, 17,3, 1H)

33,2 C1’, C4’, C6’

C1’, C4’, C6’

H6’b, H5’b

H6’a, H5’a

6’-Ha

6’-Hb

2,16 (dddd, 1,4, 5,3, 6,3,13,5, 1H)

2,08 (ddd, 4,8, 10,2, 13,5, 1H)

30,9 C2, C1’, C2’, C4’, C5’

C2, C1’, C2’, C4’, C5’

H6’b, H5’b

H6’a, H5’a

-OCH3 -6 3,83 (s, 3H) 60,8 C6 -

-OCH3-7 3,90 (s, 3H) 56,2 C7 -

-OH – 5 11,76 (s, 1H) - C4, C4a , C5, C6 e C7 -

-OH – 1’ 2,4 (s, 1H) - - -

J em Hertz; em ppm;

Substância 9

A fórmula molecular da substância 9 (Figura 65), isolada de P.

carniconnectivum, foi estabelecida como C17H20O8 baseada no espectro de HRESI-

MS ([M+H]+ 353,1236, calcd. 353,1236) (Figura 66) e dados de RMN.


O

OOH

H3CO

H3CO

OH

O

OH

2

45

71'

4'

2'



O espectro de absorção na região do infravermelho de 9 (Figura 67)

apresentou bandas de absorção em frequências semelhantes às observadas para 8,

sendo possível sugerir novamente a presença de grupos hidroxílicos devido à

presença das bandas em 3380 e 3309 cm-1 proveniente da deformação axial de O-H

e com a banda em 1296 cm-1 proveniente da deformação axial da ligação C-O de

grupo fenol. Foram observadas também bandas de absorção em 1717, 1644 e 1632

cm-1 referentes à deformação axial de C=O dos grupos carbonilícos. As bandas

referentes às deformações axiais simétricas e assimétricas da ligação C-H dos

grupos metilícos e metilênicos foram observadas na região entre 2969 e 2829 cm-1.

Figura 67. Espectro de absorção na região do Infravermelhor de 9 (KBr).

349.1803351.1733

353.1236

354.1266

355.1396

+MS, 4.5-4.6min #(266-275)

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.254x10

Intens.

350 352 354 356 358 360 m/z

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

60

70

80

90

100

2829

29112969

3380

3309

3709

Absorb

ance (

%)

Wavenumber (cm-1)

[M+H]+


De acordo com os espectros de RMN de 1H e 13C, a substância 9 apresentou

um padrão de substituição similar ao da substância 8, com um simpleto em 6,15

(H-8) correspondente a um hidrogênio em um sistema aromático

pentassubstitituído, com duas metoxilas em 3,64 (s, 3H) e 3,84 (s, 3H) localizadas

nas posições C-6 e C-7, respectivamente (Figura 68, Figura 69 e Figura 70).

Figura 68. Espectro de RMN de 1H de 9 (DMSO-d6, 500 MHz).

Três duplos dupletos com padrão de acoplamento ABX do anel C da

flavanona foram observados em 4,62 (1H, J 13,7 e 3,0, H-2), 3,02 (1H, J 17,3 e

13,7, H-3a) e 2,57 (1H, J 17,3 e 3,0, H-3b). Os anéis A e C de 9 apresentaram a

mesma substituição observada para 8, no entanto os sinais correspondentes aos

hidrogênios da dupla ligação da enona no anel B de 8 não apareceram no espectro

de 9.

12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

1.6

91

.87

1.8

82

.01

2.0

42

.05

2.0

82

.14

2.1

42

.15

2.1

72

.17

2.1

82

.49

2.5

02

.50

2.5

02

.51

2.5

32

.54

2.5

52

.56

2.5

72

.86

2.8

62

.88

2.8

92

.99

3.0

23

.02

3.0

53

.30

3.3

43

.42

3.6

33

.84

3.8

54

.42

4.6

04

.61

4.6

34

.64

5.3

25

.33

6.1

51

1.9

3

1.0

11

.02

1.0

41

.05

2.0

80

.99

0.9

5

2.9

02

.99

1.0

61

.07

1.9

9

1.0

0

0.8

9


F2 - Acquisition ParametersDate_ 20110902Time 18.54INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 1H-13PULPROG zgTD 65536SOLVENT DMSONS 32DS 2SWH 8278.146 HzFIDRES 0.126314 HzAQ 3.9584243 secRG 114DW 60.400 usecDE 6.00 usecTE 297.0 KD1 3.00000000 secTD0 1


F2 - Processing parametersSI 32768SF 500.1300050 MHzWDW EMSSB 0LB 0 HzGB 0PC 1.00

OH-5

O

O

O

OH

H3CO

H3CO

H

OH

OH8

6

2

4

1'3'

5'


Figura 69. Ampliação do espectro de RMN de 1H de 9 de 6,5 a 1,5 ppm (DMSO-d6, 500 MHz).

Figura 70. Ampliação do espectro de RMN de 1H de 9 de 3,2 a 1,5 ppm (DMSO-d6, 500 MHz).

2.02.53.03.54.04.55.05.56.0 ppm

1.6

91

.70

1.8

71

.88

2.0

12

.04

2.0

52

.08

2.1

42

.14

2.1

52

.17

2.1

72

.18

2.4

92

.50

2.5

02

.50

2.5

12

.53

2.5

42

.55

2.5

62

.57

2.8

62

.86

2.8

82

.89

2.9

93

.02

3.0

23

.05

3.3

03

.34

3.4

23

.63

3.8

43

.85

4.4

24

.60

4.6

14

.63

4.6

45

.32

5.3

36

.15

1.0

1

1.0

2

1.0

4

1.0

5

2.0

8

0.9

9

0.9

5

2.9

0

2.9

9

1.0

6

1.0

7

1.9

9

1.0

0


F2 - Acquisition ParametersDate_ 20110902Time 18.54INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 1H-13PULPROG zgTD 65536SOLVENT DMSONS 32DS 2SWH 8278.146 HzFIDRES 0.126314 HzAQ 3.9584243 secRG 114DW 60.400 usecDE 6.00 usecTE 297.0 KD1 3.00000000 secTD0 1



4.54.6 ppm

1.71.81.92.02.12.22.32.42.52.62.72.82.93.03.1 ppm

1.6

81.6

91.7

11.8

51.8

61.8

81.8

91.9

11.9

21.9

92.0

22.0

22.0

32.0

52.0

52.0

62.1

42.1

52.1

52.1

72.1

82.1

82.4

92.5

02.5

02.5

02.5

12.5

32.5

42.5

52.5

72.5

72.5

92.6

1

2.8

62.8

72.8

92.9

0

2.9

93.0

23.0

33.0

6

1.0

0

1.0

2

1.0

3

1.0

2

2.3

0

1.0

1

1.0

2


F2 - Acquisition ParametersDate_ 20110829Time 14.03INSTRUM spectPROBHD 5 mm Dual 13C/PULPROG zg30TD 65536SOLVENT DMSONS 128DS 4SWH 8012.820 HzFIDRES 0.122266 HzAQ 4.0894966 secRG 406.4DW 62.400 usecDE 6.00 usecTE 303.0 KD1 3.00000000 secTD0 1



H-8 OH-1’ OH-2’

H-2 dd. 13,7 e 3,0 H-2’

OCH3-7

OCH3-6

H-3a dd, 17,3 e 13,7

H-3’b dd, 14,5 e 3,3 H-3’a

dt,14,5, 3,0

H-5’b td, 14,1 e 7,0

H-3b dd, 17,3 e 3,0

H-6’b td, 13,2 e 5,4

H-6’a ddd,13,2, 7,0

e 2,0

H-5’a ddd, 14,1, 5,4

e 2,0

O

O

O

OH

H3CO

H3CO

H

OH

OH8

6

2

4

1'3'

5'


No espectro de RMN de 13C foi possível observar a presença de dois

carbonos carbinólicos, sugerindo a hidratação da dupla ligação e mantendo a

hidroxila observada em C-1’ (72,2) , foi observada também uma cetona em C-4’

(210,2) (Figura 71).

Figura 71. Espectro de RMN de 13C de 9 (DMSO-d6, 125 MHz).

O experimento de HMBC (Figura 72 e Figura 74) mostrou uma correlação

entre OH-1’ com C-2’ e de OH-2’ com C-1’, C-3’ e C-4’. A conexão do anel B ao anel

C foi também confirmada com as correlações HMBC observadas entre H-2 com C-1’,

C-2’ e C-6’. As posições dos grupos metoxilícos foram confirmadas através do

espectro de NOESY (Figura 72), no qual foi observada uma correlação entre H-8 e

OCH3-7.

90100110120130140150160170180190200210 ppm

91

.76

10

2.3

3

12

9.3

9

15

3.8

6

15

8.5

51

60

.45

19

8.0

0

21

0.1

6


F2 - Acquisition ParametersDate_ 20110826Time 8.19INSTRUM spectPROBHD 5 mm Dual 13C/PULPROG zgpg30TD 65536SOLVENT CDCl3NS 10847DS 16SWH 19607.844 HzFIDRES 0.299192 HzAQ 1.6712180 secRG 8192DW 25.500 usecDE 10.00 usecTE 300.0 KD1 2.00000000 secd11 0.03000000 secDELTA 1.89999998 secTD0 1

======== CHANNEL f1 ========NUC1 13CP1 10.50 usecPL1 4.00 dBSFO1 75.4760505 MHz

======== CHANNEL f2 ========CPDPRG2 waltz16NUC2 1HPCPD2 100.00 usecPL2 0 dBPL12 20.92 dBPL13 120.00 dBSFO2 300.1312005 MHz


80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 ppm

27

.27

35

.54

35

.73

38

.68

38

.95

39

.23

39

.51

39

.79

40

.07

40

.35

44

.90

56

.20

60

.05

69

.77

72

.16

79

.23

C-4 C-4’

C-7

C-8a C-5

C-6 C-4a

C-8

C-2

C-1’

C-2’

OCH3-6

C-3’

C-3 e C-5’ C-6’

OCH3-7


Figura 72. Principais correlações NOE (----) e HMBC (____) observadas para 9.

Figura 73. Mapa de contorno HSQC de 9 (DMSO-d6, 500 MHz).

O

O

O

OH

OH

H3CO

H3CO

H

OH

8

6

2

4

1' 3'

5'

ppm

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm

160

140

120

100

80

60

40

20

0

Current Data ParametersNAME Sub 09 - Proto 2EXPNO 4PROCNO 1

F2 - Acquisition ParametersDate_ 20110831Time 17.12INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 1H-13PULPROG hsqcetgpsi2TD 2048SOLVENT DMSONS 16DS 16SWH 8012.820 HzFIDRES 3.912510 HzAQ 0.1278452 secRG 1024DW 62.400 usecDE 6.00 usecTE 303.1 KCNST2 145.0000000d0 0.00000300 secD1 1.50000000 secd4 0.00172414 secd11 0.03000000 secd13 0.00000400 secD16 0.00010000 secD24 0.00086207 secDELTA 0.00117340 secDELTA1 0.00110800 secDELTA2 0.00016207 secDELTA3 0.00062414 secIN0 0.00001530 secST1CNT 0ZGOPTNS

======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 8.70 usecp2 17.40 usecP28 1000.00 usecPL1 -2.00 dBSFO1 500.1335009 MHz

======== CHANNEL f2 ========CPDPRG2 garpNUC2 13CP3 12.90 usecp4 25.80 usecPCPD2 68.00 usecPL2 -2.50 dBPL12 11.94 dBSFO2 125.7716224 MHz

====== GRADIENT CHANNEL =====GPNAM1 SINE.100GPNAM2 SINE.100GPNAM3 SINE.100GPNAM4 SINE.100GPZ1 80.00 %GPZ2 20.10 %GPZ3 11.00 %GPZ4 -5.00 %P16 1000.00 usecP19 600.00 usec

F1 - Acquisition parametersTD 512SFO1 125.7716 MHzFIDRES 63.827614 HzSW 259.834 ppmFnMODE Echo-Antiecho

F2 - Processing parametersSI 1024SF 500.1300011 MHzWDW QSINESSB 2LB 0 HzGB 0PC 1.40

F1 - Processing parametersSI 1024MC2 echo-antiechoSF 125.7578679 MHzWDW GMSSB 2LB 0 HzGB 0


Figura 74. Mapa de contorno HMBC de 9 (DMSO-d6, 500 MHz)

Figura 75. Mapa de contorno COSY de 9 (DMSO-d6, 500 MHz).

ppm

13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm

220

200

180

160

140

120

100

80

60

40

20

0


F2 - Acquisition ParametersDate_ 20110831Time 20.59INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 1H-13PULPROG hmbcgplpndqfTD 4096SOLVENT DMSONS 32DS 16SWH 8012.820 HzFIDRES 1.956255 HzAQ 0.2556404 secRG 1024DW 62.400 usecDE 6.00 usecTE 303.0 KCNST2 145.0000000CNST13 8.0000000d0 0.00000300 secD1 1.50000000 secd2 0.00344828 secd6 0.06250000 secD16 0.00020000 secIN0 0.00001530 sec

======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 8.70 usecp2 17.40 usecPL1 -2.00 dBSFO1 500.1335009 MHz

======== CHANNEL f2 ========NUC2 13CP3 12.90 usecPL2 -2.50 dBSFO2 125.7716224 MHz

====== GRADIENT CHANNEL =====GPNAM1 SINE.100GPNAM2 SINE.100GPNAM3 SINE.100GPZ1 50.00 %GPZ2 30.00 %GPZ3 40.10 %P16 1000.00 usec

F1 - Acquisition parametersTD 512SFO1 125.7716 MHzFIDRES 63.827614 HzSW 259.834 ppmFnMODE QF

F2 - Processing parametersSI 4096SF 500.1299978 MHzWDW SINESSB 0LB 0 HzGB 0PC 1.40

F1 - Processing parametersSI 1024MC2 QFSF 125.7578478 MHzWDW GMSSB 0LB 0 HzGB 0

ppm

8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm

8

7

6

5

4

3

2

1

0


F2 - Acquisition ParametersDate_ 20110831Time 15.52INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 1H-13PULPROG cosygpqfTD 4096SOLVENT DMSONS 8DS 8SWH 8012.820 HzFIDRES 1.956255 HzAQ 0.2556404 secRG 362DW 62.400 usecDE 6.00 usecTE 303.0 Kd0 0.00000300 secD1 1.50000000 secd13 0.00000400 secD16 0.00010000 secIN0 0.00012480 sec

======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP0 8.70 usecP1 8.70 usecPL1 -2.00 dBSFO1 500.1335009 MHz

====== GRADIENT CHANNEL =====GPNAM1 SINE.100GPZ1 10.00 %P16 1000.00 usec



F1 - Processing parametersSI 1024MC2 QFSF 500.1300016 MHzWDWSSB 0LB 0 HzGB 0


A substância 9 (Figura 76), de estrutura inédita foi caracterizada como sendo

a flavanona 2,3-di-hidro-5-hidroxi-2-(1’,2’-dihidroxi-4’-oxocicloexil)-6,7-dimetoxi-4H-1-

benzopiran-4-ona, com base nos deslocamentos químicos de RMN de 1H e de 13C e

nas correlações observadas nos experimentos de RMN 2D (Figura 73, Figura 74 e

Figura 75) (Tabela 15).

Figura 76. Estrutura da substância 9. Tabela 15. Dados de RMN de 1H e13C de 9 (500 e 125 MHz, DMSO-d6).

1H 13C HMBC COSY

2 4,62 (dd, 3,0, 13,7, 1H) 79,2 C3, C4, C8a, C1’, C2’, C6’

H3a, H3b

3 -Ha

3-Hb

3,02 (dd, 13,7, 17,3, 1H)

2,57 (dd, 3,0, 17,3, 1H)

35,5 C2, C4, C1’

C4, C4a

H3b

H3a

4 - 198,0 - -

4 a - 102,3 - -

5 - 153,9 - -

6 - 129,4 - -

7 - 160,5 - -

8 6,15 (s, 1H) 91,8 C4, C4a, C5, C6, C7, C8a

-

8 a - 158,5 - -

1’ - 72,2 - -

2’ 4,42 (m, 1H) 69,8 H3’a, H3’b

3’Ha

3’Hb

2,16 (dt, 3,0, 14,5, 1H)

2,88 (dd, 3,3, 14,5, 1H)

44,9 C1’, C2’, C4’, C5’, C6’

C2’, C4’, C5’

H3’b, H2’

H3’a, H2’

4’ - 210,2 - -

5’-Ha

5’-Hb

2,04 (ddd, 2,0, 5,4, 14,1, 1H)

2,56 (td, 7,0, 14,1, 1H)

35,7 C1’, C2’, C3’, C4’, C6’

C1’, C4’, C6’

H5’b, H6’a ,H6’b

H5’a, H6’a ,H6’b

6’-Ha

6’-Hb

1,70 (ddd, 2,0, 7,0, 13,2, 1H)

1,87 (td, 5,4, 13,2, 1H)

27,3 C1’, C2’, C4’, C5’

C2, C1’, C4’, C5’

H6’b, H5’a ,H5’b

H6’a, H5’a ,H5’b

-OCH3-6 3,64 (s, 3H) 60,0 C6 -

-OCH3-7 3,84 (s, 3H) 56,2 C7 -

-OH – 5 11,92 (s, 1H) - C4, C4a, C5, C6, C7 -

-OH – 1’ 5,32 (s, 1H) - C2’, C6’ -

-OH – 2’ 5,31 (s, 1H) - C1’, C3’,C4’ -

J em Hertz; em ppm;

O

OOH

H3CO

H3CO

OH

O

OH

9

2

45

71'

4'

2'


Configuração absoluta de 8 e 9

As substâncias 8 e 9 foram dissolvidas em metanol na concentração 0,01

g/ml, o valor do ângulo de [α]D medido foi +115,5º e +92º, respectivamente. O ângulo

positivo medido significa que há um desvio da luz plano polarizada para a direita,

indicando que tratam-se de substâncias dextrogiras.

As curvas de DC (dicroísmo circular) foram medidas para ambas as

substâncias e os resultados foram comparados aos das curvas teóricas de DC

calculadas por TDDFT (Time-dependent density functional theory). Para a

substância 8 os cálculos foram realizados considerando todos os estereoisômeros

possíveis: 2S,1’R; 2S,1’S; 2R,1’S e 2R,1’R. Após as etapas de analise

conformacional apenas dois confôrmeros foram constatados na temperatura

investigada: (2S,1’R)-8 e (2S,1’S)-8.

A configuração pôde então ser determinada através da comparação entre os

espectros de DC calculados e o experimental (Figura 78). Para (2S,1’R)-8 foram

observados EC (Efeito Cotton) positivo em ~325 nm e ~250 nm, e EC negativo em

~280 nm. Estes resultados foram consistentes com os dados experimentais. Para

(2S,1’S)-8 foram observados EC (Efeito Cotton) positivo em ~325 nm e EC negativo

em ~280 nm e ~250 nm, sendo este último com sinal contrário ao observado

experimentalmente. Essas observações permitiram determinar de forma inequívoca

a configuração absoluta de (+)-8 como sendo 2S, 1’R (Figura 77).

Figura 77. Estrutura da substância 8 com estereoquímica definida.

O

O

O

OH

H3CO

H3CO

OH

H

8

S

R


Figura 78. a) Espectro DC calculado para (2S,1’S)-8; b) Espectro DC experimental obtido para 8; c) Espectro DC calculado para (2S,1’R)-8.

O espectro de DC obtido para a substância 9 (Figura 79) foi muito similar ao

da substância (+)-8 permitindo sugerir a configuração absoluta também como

2S,1’R, o que foi confirmado por cálculos de TDDFT. No entanto nestes cálculos não

foi possível obter informações sobre a configuração absoluta do terceiro centro

estereogênico em C-2’. Os espectros teóricos de ambos diastereômeros

(2S,1’R,2’R)-9 e (2S,1’R,2’S)-9 apresentaram-se indistinguíveis, isto ocorreu

principalmente devido ao fato de que nenhuma das transições do cromóforo principal

benzoila nem do grupo carbonilíco em C-4 terem sido suficientemente perturbadas

pela introdução de um novo centro estereogênico (Figura 80).

a)

b)

c)


O

O

O

OH

H3CO

H3CO

OHOH

H

9

Figura 79. Estrutura da substância 9 com estereoquímica definida.

Figura 80. a) Espectro DC calculado para (2S,1’S,2’S)-9; b) Espectro DC experimental obtido para 9; c) Espectro DC calculado para (2S,1’R,2’R)-9.


Substância 8a

A substância 8a (Figura 81) obtida através da reação hidrogenação da

substância 8, foi caracterizada a partir dos espectros de RMN de 1H, RMN de 13C,

HSQC, HMBC e por ESIMS.

Figura 81. Estrutura da substância 8a.

No espectro de massas (ESI+) de alta resolução da substância 8a (Figura 82)

observou-se um sinal em m/z 337,1286 Da correspondente ao íon quasimolecular

[M+H]+ e um sinal em m/z 359,1091 Da correspondente ao aduto de sódio [M+Na]+,

compatível com a fórmula molecular C17H20O7, esperada como produto da reação de

hidrogenação de 2 (valor calculado: [M+H]+ 337,1287 Da e [M+Na]+ 359,1107 Da).

Figura 82. Espectro de massas de alta resolução de 8a (ESI-TOF).

No espectro de RMN de 1H de 8a (Figura 83 e Figura 84) os sinais de

ressonância mais importantes para a confirmação da formação do produto são o

O

OOH

H3CO

H3CO

OH

O

8a

337.1286

359.1091

+MS, 9.82-10.02min #(587-599)

0

2

4

6

5x10

Intens.

335 340 345 350 355 360 365 m/z

[M+H]+

[M+Na]+


desaparecimento dos sinais olefínicos conjugados à carbonila do anel B (J 10 Hz) e

o aparecimento de sinais metilênicos adicionais.

Além destes sinais foi observada no espectro de RMN de 13C (Figura 85) a

presença de dois carbonos metilênicos adicionais. A atribuição dos sinais de RMN

(Tabela 16) foi realizada através das correlações COSY, HSQC e HMBC, permitindo

assim a determinação de 8a como sendo 2,3-di-hidro-5-hidroxi-2-(1’-hidroxi-4’-

oxocicloexil)-6,7-dimetoxi-4H-1-benzopiran-4-ona, de estrutura inédita.

Figura 83. Espectro de RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) da substância 8a.

12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm

-0.0

01

.25

1.8

11

.82

1.8

41

.85

1.8

81

.90

1.9

01

.92

1.9

32

.04

2.3

32

.34

2.3

42

.35

2.3

52

.36

2.3

62

.37

2.3

72

.38

2.3

92

.62

2.6

22

.65

2.6

62

.77

2.7

82

.79

2.8

12

.82

2.8

32

.99

3.0

23

.03

3.0

63

.83

3.9

04

.26

4.2

74

.29

4.2

96

.06

7.2

71

1.8

0

1.2

91.1

91.1

23.2

21.0

52.0

01.0

0

2.9

83.0

30.9

5

0.9

4

0.8

3

Current Data ParametersNAME Sub 08aEXPNO 1PROCNO 1




4.3 ppm

H-2 dd, 2,7 e 14,0

OH-5

H-8

OCH3-6

OCH3-7

O

O

O

OH

H3CO

H3CO

OH

H

S

8

6

2

4

1'3'

5'


Figura 84. Ampliação do espectro de RMN de 1H de 8a (500 MHz, CDCl3) na região de 3,1 a 1,7 ppm.

Figura 85. Espectro de RMN de 13C (125 MHz, CDCl3) da substância 8a.

1.92.02.12.22.32.42.52.62.72.82.93.0 ppm

1.7

81

.79

1.8

11

.82

1.8

41

.85

1.8

81

.90

1.9

01

.92

1.9

32

.03

2.0

42

.04

2.0

52

.06

2.0

62

.33

2.3

42

.34

2.3

52

.35

2.3

62

.36

2.3

72

.37

2.3

82

.39

2.3

92

.40

2.4

22

.42

2.6

22

.62

2.6

52

.66

2.7

72

.78

2.7

92

.81

2.8

22

.83

2.9

93

.02

3.0

33

.06

1.2

9

1.1

9

1.1

2

3.2

2

1.0

5

2.0

0

1.0

0





90100110120130140150160170180190200210 ppm

82.9

8

91.4

0

102.9

4

130.7

4

154.9

4157.8

7160.8

4

196.3

4

210.7

4


F2 - Acquisition ParametersDate_ 20120423Time 17.08INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 13C ZPULPROG zgpg30TD 65536SOLVENT CDCl3NS 20480DS 0SWH 29761.904 HzFIDRES 0.454131 HzAQ 1.1010548 secRG 203DW 16.800 usecDE 6.50 usecTE 293.1 KD1 1.00000000 secD11 0.03000000 secTD0 1

======== CHANNEL f1 ========NUC1 13CP1 11.55 usecPLW1 131.22000122 WSFO1 125.7716224 MHz

======== CHANNEL f2 ========CPDPRG2 waltz16NUC2 1HPCPD2 80.00 usecPLW2 13.69999981 WPLW12 0.13699999 WPLW13 0.08768000 WSFO2 500.1320005 MHz


70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 ppm

-0.0

0

31.9

933.7

036.1

036.2

2

36.3

8

56.2

5

60.9

3

70.9

3

H-3b dd, 14,0 e 17,0

H-2’ td 6,1 e

14,0 H-3’b/ H-6’

m

H-5’b dq, 3,3 e

13,6

H-3a dd, 2,7 e

17,0

H-3’a

td, 5,0 e 14,2

H-5’a td, 5,0 e

13,6

C-4 C-4’

C-7

C-8a

C-5

C-6 C-4a

C-8

C-2

C-1’

C-2’ C-3 C-6’ e OCH3-6 C-3’

C-5’

OCH3-7

O

O

O

OH

H3CO

H3CO

OH

H

S

8

6

2

4

1'3'

5'


Tabela 16. Dados de RMN de 1H e 13C de 8a (500 e 125 MHz, CDCl3).

Posição

1H

13C

2 4,28 (dd, 2,7 e 14,0 Hz, 1H) 83,0

3 -Ha

3-Hb

2,64 (dd, 2,7 e 17,0 Hz, 1H)

3,02 (dd, 14,0 e 17,0 Hz, 1H)

36,4

4 - 196,3

4 a - 102,9

5 - 157,9

6 - 130,7

7 - 160,9

8 6,06 (s, 1H) 91,4

8 a - 154,9

1’ - 70,9

2’ 2,80 (td, 6,1 e 14,0 Hz, 2H) 36,2

3’Ha

3’Hb

1,90 (td, 5,0 e 14,0 Hz, 1H)

2,43 (m, 1H)

33,7

4’ - 210,7

5’-Ha

5’-Hb

1,84 (td, 5,0 e 13,6, 1H)

2,05 (td, 3,3 e 13,6, 1H)

32,0

6’ 2,38 (m, 2H) 36,1

-OCH3-6 3,83 (s, 1H) 60,9

-OCH3-7 3,90 (s, 1H) 56,3

-OH – 5 11,80 (s, 1H) -

em ppm; J em Hz.

O

O

O

OH

H3CO

H3CO

OH

H

S

8

6

2

4

1'3'

5'


4.7 Identificação das substâncias 10 e 11

As substâncias 10 e 11 (Figura 86) foram isoladas e identificadas a partir da

partição orgânica (CHCl3) do extrato das folhas de P. carniconnectivum (código: K-

1600 FC) e tiveram suas estruturas determinadas a partir dos dados de RMN de 1H,

13C, HSQC, HMBC e EM.


Substância 10


estabelecida de acordo com o espectro de massas de alta resolução (ESI-TOF), no

qual se observou um pico em m/z 331,0820 Da correspondente ao íon

quasimolecular [M+H]+, levando à fórmula molecular C17H14O7 (valor calculado para

[M+H]+: 331,0818 Da) (Figura 88).


O

OOH

H3CO

H3CO

OH

O

10

O

OOH

H3CO

H3CO

OH

OH

11

O

OOH

H3CO

H3CO

OH

O

2

45

71'

4'


Figura 88. Espectro de massas de alta resolução (HRESIMS-TOF) de 10.

No espectro de RMN de 1H de 10 (Figura 89) observou-se sinais referentes a

treze hidrogênios, sendo um simpleto em 12,30 (1H, OH-5) correspondente ao

grupo hidroxila em C-5, dois simpletos em 3,92 (3H) e 3,88 (3H) referentes aos

grupos metoxilícos em C-6 e C-7. Observou-se também um simpleto em 6,59 (1H)

correspondente ao sinal do hidrogênio olefínico do anel C em C-3, e um simpleto em

6,33 referente ao hidrogênio aromático em C-8 (anel A). Os hidrogênios do anel B

foram observados com dois dupletos e 6,92 e 6,40 com constante de acoplamento

J=9,9 Hz e com integração para dois hidrogênios cada sinal, sugerindo a presença

de um anel B não aromático, similar aos observados em 8 e 9, mas agora com a

presença de duas ligações duplas simétricas e conjugadas à uma carbonila.

331.0820

+MS, 10.3min #615

0

1

2

5x10

Intens.

320 325 330 335 340 345 m/z

[M+H]+

O

OOH

H3CO

H3CO

OH

O

2

45

71'

4'


Figura 89. Espectro de RMN de 1H de 10 (CDCl3, 500 MHz).

No espectro de RMN de 13C (Figura 90) (CDCl3, 125 MHz) observou-se 15

sinais correspondentes a 17 átomos de carbono, os quais foram atribuídos de

acordo com os dados de HSQC e HMBC. Observou-se a presença de dois carbonos

carbonílicos, sendo um correspondente a C-4 em 182,7 e o segundo em 184,9

referente ao C-4’. O sinal referente aos carbonos simétricos C-2’ e C-6’ foi

observado em 145,8 e o dos carbonos C-3’ e C-5’ em 130,3. O carbono

carbinólico em 69,8 corresponde à C-1’.

A substância 10, de estrutura inédita, foi caracterizada como sendo a flavona

5-hidroxi-2-(1’-hidroxi-4’-oxo-2’,5’-cicloexadien-1’-il)-6,7-dimetoxi-4H-1-benzopiran-4-

ona.

12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

-0.0

0

3.8

83

.92

6.3

46

.40

6.4

26

.59

6.9

16

.93

7.2

6

12

.30

2.9

43

.08

0.9

42

.04

1.0

01

.98

0.9

9

Current Data ParametersNAME 167 P2EXPNO 1PROCNO 1




6.46.56.66.76.86.97.0 ppm

H-2’/H-6’ d, 9,9 Hz

O

OOH

H3CO

H3CO

OH

O

2

45

71'

4'

H-3’/H-5’ d, 9,9 Hz

H-3

H-8

OH-5

OCH3-6

OCH3-7


Figura 90. Espectro de RMN de 13C de 10 (CDCl3, 125 MHz).

Substância 11


estabelecida de acordo com o espectro de massas de alta resolução (ESI-TOF)

(Figura 92), no qual se observou um pico em m/z 333,0975 Da, correspondente ao

íon quasimolecular [M+H]+, levando à fórmula molecular C17H16O7 (valor calculado

para [M+H]+: 333,0975 Da).


130135140145150155160165170175180185 ppm

130.3

0

132.6

7

145.9

3

152.9

5153.5

0

159.3

7

166.2

4

182.7

1

184.9

5


F2 - Acquisition ParametersDate_ 20121212Time 14.28INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 13C ZPULPROG zgpg30TD 32768SOLVENT CDCl3NS 3572DS 0SWH 32894.738 HzFIDRES 1.003868 HzAQ 0.4981236 secRG 64DW 15.200 usecDE 6.50 usecTE 298.1 KD1 0.50000000 secd11 0.03000000 secDELTA 0.40000001 secTD0 1NUC1 13CP1 11.55 usecPLW1 131.22000122 WSFO1 125.7728799 MHzCPDPRG2NUC2 1HPLW2 13.69999981 WPLW12 0.13699999 WPLW13 0.08768000 WSFO2 500.1320005 MHz


556065707580859095100105110 ppm

56.7

2

61.1

5

69.7

6

76.9

877.2

377.4

8

91.1

4

106.1

7107.3

6

O

OOH

H3CO

H3CO

OH

OH

2

45

71'

4'

O

OOH

H3CO

H3CO

OH

O

2

45

71'

4'

C-4a

C-8

C-2

C-1’

OCH3-7 C-3

C-4’ C-4 C-6

C-5

C-2’/C-6’ C-3’/C-5’

OCH3-6

C-8a

C-7



A substância 11 apresentou sinais de RMN de 1H (Figura 93) muito

semelhantes aos de 10, sendo os anéis A e C idênticos. No anel B, os duplos

dupletos observados em 5,94 (1,8 e 10,1 Hz, 2H) e 6,23 (3,3 e 10,1 Hz, 2H)

indicaram a presença de um anel B não aromático com duplas simétricas, no

entanto, com presença de um hidrogênio adicional em 4,55 (m, 1H). Também foi

observado no espectro de RMN de 13C (Figura 94) um carbono carbinólico adicional

em 62,5, com a ausência de uma segunda carbonila, como observado para 8, 9 e

10, na posição C-4’ do anel B. Os sinais observados indicaram a presença de uma

hidroxila adicional posicionada em C-4’. O simpleto correspondente ao hidrogênio

olefínico H-3 foi observado em 6,51 e o correspondente ao hidrogênio aromático

H-8 em 6,77. As metoxilas OCH3-6 e OCH3-7 foram observadas em 3,80 e 3,92,

respectivamente.

A substância 11, de estrutura inédita, foi caracterizada como sendo a flavona

5-hidroxi-2-(1’,4’-dihidroxi-4’-oxo-2’,5’-cicloexadien-1’-il)-6,7-dimetoxi-4H-1-

benzopiran-4-ona.

333.0975

1. +MS, 4.9-5.7min #(293-340)

0.0

0.5

1.0

1.5

5x10

Intens.

320 325 330 335 340 345 m/z

[M+H]+

O

OOH

H3CO

H3CO

OH

OH

2

45

71'

4'


Figura 93. Espectro de RMN de 1H de 11 (MeOD, 500 MHz).

Figura 94. Espectro de RMN de 13C de 11 (MeOD, 125 MHz)

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm

3.3

13.3

53.8

03.9

24.5

3

4.5

44.5

44.5

44.5

54.5

54.5

54.8

55.9

35.9

35.9

55.9

56.2

16.2

16.2

36.2

36.5

16.7

7

3.0

6

3.0

3

0.8

7

1.8

8

1.8

1

0.8

9

1.0

0

Current Data ParametersNAME K1600FC Prep1EXPNO 1PROCNO 1

F2 - Acquisition ParametersDate_ 20121229Time 19.51INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 13C ZPULPROG zgTD 65536SOLVENT MeODNS 32DS 4SWH 4504.504 HzFIDRES 0.068733 HzAQ 7.2745461 secRG 128DW 111.000 usecDE 6.50 usecTE 298.2 KD1 1.00000000 secTD0 1



6.06.26.46.66.8 ppm

4.04.24.44.6 ppm

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 ppm

56.2

857.0

257.5

458.3

761.0

962.4

662.9

868.9

9

92.5

0

106.6

9

130.5

6133.4

8133.7

3

153.6

4155.3

1160.7

9

172.9

3

184.7

2

H-2’/H-6’ d, 10,1 Hz

H-3’/H-5’ d, 10,1 Hz

H-3 H-8

OCH3-6 OCH3-7

H-4’

O

OOH

H3CO

H3CO

OH

OH

2

45

71'

4'

C-4a

C-8

C-2 C-1’

C-3

C-4’

C-4 C-6

C-5 C-8a

C-2’/C-6’

C-3’/C-5’

C-7

O

OOH

H3CO

H3CO

OH

OH

2

45

71'

4'


Os valores de RMN de 1H e 13C das substâncias 10 e 11 (Tabela 17) foram

atribuídos de acordo com as correlações observadas nos experimentos de RMN 2D,

HSQC e HMBC.


Posição 1H * 13C * 1H ** 13C **

2 - 166,2 - 172,9

3 6,59 (s, 1H) 107,4 6,77 (s, 1H) 106,7

4 - 182,7 - 184,7

4 a - 106,2 - 106,7

5 - 153,0 - 155,3

6 - 132,7 - 133,7

7 - 159,4 - 160,8

8 6,33 (s, 1H) 91,1 6,51 (s, 1H) 92,5

8 a - 153,5 - 153,6

1' - 69,8 - 69,0

2' 6,92 (d, 9,9, 1H) 145,8 5,94 (dd, 1,8 e 10,1, 1H) 130,6

3' 6,40 (d, 9,9, 1H) 130,3 6,23 (dd, 3,3 e 10,1, 1H) 133,5

4' - 184,9 4,55 (m, 1H) 62,5

5' 6,40 (d, 9,9, 1H) 130,3 6,23 (dd, 3,3 e 10,1, 1H) 133,5

6' 6,92 (d, 9,9, 1H) 145,8 5,94 (dd, 1,8 e 9,9, 1H) 130,6

-OCH3-6 3,88 (s, 3H) 61,2 3,80 (s, 3H) 61,1

-OCH3-7 3,92 (s, 3H) 56,7 3,92 (s, 3H) 57,0

-OH-5 12,30 (s, 1H) - *** -

*CDCl3;** MeOD; *** não observado; em ppm; J em Hz.

O

OOH

H3CO

H3CO

OH

O

10

2

45

71'

4'

O

OOH

H3CO

H3CO

OH

OH

11

2

45

71'

4'


4.8 Identificação das substâncias 12, 13 e derivados

As substâncias 12 e 13 (Figura 95) foram isoladas e identificadas a partir

extrato das folhas de P. caldense e dos frutos de P. carniconnectivum (código: K-

1441 FrA) e tiveram suas estruturas determinadas a partir dos espectros de RMN de

1H, 13C, HSQC, HMBC e EM.

COOH

OH

OH

COOH 12

COOHOCH3

COOH 13


Substância 12

A fórmula molecular de 12 (Figura 96), isolada de P. caldense, foi

estabelecida de acordo com o espectro de massas de alta resolução (ESI-TOF)

(Figura 97), no qual foi observado um pico em m/z 457,2596 Da, correspondente ao

íon quasimolecular [M+H]+, levando à fórmula molecular C27H36O6 (valor calculado

para [M+H]+: 457,2590 Da).




O espectro de absorção na região do IV de 12 (Figura 98) indicou a presença

de grupo hidroxila com a banda em 3380 cm-1 proveniente da deformação axial de

O-H e com a banda em1299 cm-1 proveniente da deformação axial da ligação C-O

de grupo fenol. A banda de deformação axial de C=O de grupo carbonílico foi

observada em 1682 cm-1 e a banda proveniente da deformação axial de C=C do

anel aromático foi observada em1602 cm-1.

COOH

OH

COOH

OH

1

3 5

1' 5' 9'

13'

16'17' 18'

19'

20'

455.2422

457.2596

477.2371

479.2422

+MS, 14.2-14.3min #(847-851)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

5x10

Intens.

450 455 460 465 470 475 480 m/z

[M+H]+

[M+Na]+


Figura 98. Espectro de absorção na região do infravermelho de 12.

No espectro de RMN de 1H de 12 (Figura 99 e Figura 100) (MeOD, 500 MHz)

observou-se dois dupletos correspondentes a H-2 em 7,35 (J 2,0 Hz, 1H) e H-6 em

7,31 (J 2,0 Hz, 1H), sinais indicativos de um sistema aromático 1,3,4,5-

tetrassubstituído.

Foram observados na região de 1,75 a 1,60 ppm quatro dupletos

correspondentes às metilas H-16’ em 1,65 (1,4 Hz, 3H), H-17’ em 1,72 (1,2 Hz,

3H), H-18’ em 1,61 (1,2 Hz, 3H) e H-20’ em 1,57 (1,4 Hz, 3H), cujas constantes de

acoplamento correspondem ao acoplamento alílico a quatro ligações (J4) com os

hidrogênios H-2’ (tq, 1,2 e 7,4 Hz, 1H), H-6’ (tq, 1,2 e 7,4 Hz, 1H) e H-14’ (tqt, 1,4 e

7,4 Hz, 1H). O hidrogênio alílico H-9’ foi observado como um tripleto (J 7,5 Hz, 1H)

devido ao acoplamento deste com o dupleto H-8’ (J 7,5 Hz, 2H), o deslocamento

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

78

80

82

84

86

88

90

92

94

96

98

100

776999

1103

1299

1442

1602

1682

2853

2920

2970

Ab

so

rban

ce (

%)

Wavenumber (cm-1)

3380


químico e multiplicidade observados sugerem a oxidação da metila da unidade

prenila correspondente a um grupo carboxílico.

O conjunto de sinais observados confirma a presença de um grupo geranil-

geranila na cadeia lateral de um derivado de ácido benzoico.

Figura 99. Espectro de RMN de 1H de 12 (500 MHz, MeOD).

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm

-0.0

01

.57

1.5

7

1.6

11

.61

1.6

11

.65

1.6

51

.72

1.7

21

.72

2.0

52

.06

2.0

6

2.0

82

.14

2.1

62

.22

2.2

32

.25

2.2

62

.26

2.2

72

.29

2.6

53

.30

3.3

03

.31

3.3

13

.31

3.3

34

.86

5.1

15

.34

5.3

4

5.4

86

.73

6.7

46

.76

7.3

17

.31

7.3

47

.35

7.3

57

.35

7.3

5

4.2

64

.12

4.4

14

.22

8.4

93

.17

5.6

1

2.6

8

1.5

71

.49

1.4

0

1.3

9

1.3

01

.39


NAME Sub 02- ac cald

EXPNO 1PROCNO 1


Date_ 20120419Time 11.43

INSTRUM spect

PROBHD 5 mm TXI 13C Z

PULPROG zg30TD 65536

SOLVENT MeOD

NS 32DS 2

SWH 6756.757 Hz

FIDRES 0.103100 Hz

AQ 4.8497138 secRG 114

DW 74.000 usec

DE 6.50 usec

TE 298.1 KD1 1.00000000 sec

TD0 1

======== CHANNEL f1 ========

NUC1 1H

P1 7.64 usec

PLW1 13.69999981 WSFO1 500.1327848 MHz


SI 65536SF 500.1300118 MHz

WDW GM

SSB 0LB -0.50 Hz

GB 0.1

PC 1.00

7.35 ppm 6.8 ppm

2.12.22.3 ppm

H2 d, 2,0 Hz

H6 d, 2,0 Hz

H10’ t, 7,5 Hz

H12’/ H9’ t, 7,6 e q, 7,5 Hz

H5’

q, 7,1 Hz

H4’/ H8’/ H13’ m

COOH

OH

COOH

OH

1

3 5

1' 5' 9'

13'

16'17' 18'

19'

20'


Figura 100. Espectro de RMN de 1H de 12 (500 MHz, MeOD), ampliação de 5,38 a 5,05 ppm e de 1,76 a 1,53 ppm.

O espectro de RMN de 13C de 12 (Figura 101 e Figura 102) apresentou sinais

referentes a vinte e sete átomos de carbono. O anel aromático foi determinado como

ácido 3-alquil-4,5-di-hidroxibenzoico, sendo os sinais em 122,4, 124,3, 129,2,

149,5, 146,6 e 115,2 atribuídos aos carbonos C-1 a C-6, respectivamente, e um

carbono carboxílico em 170,9 ligado ao carbono C-1.

Os vinte carbonos restantes foram associados à unidade geranil-geranila

com a presença de quatro metilas em 26,1 (C-16’),16,3 (C-17’),16,4 (C-18’), 17,9

(C-20’), um grupo carboxílico em 171,8 (C-19), oito carbonos olefínicos em 123,9

(C-2’), 137,1 (C-3’), 126,4 (C-6’), 135,3 (C-7’), 144,3 (C-10’), 133,3 (C-11’), 125,1 (C-

14’), 131,1 (C-15’) e sete carbonos metilênicos em 29,1 (C-1’), 40,9 (C-4’), 27,7

(C-5’), 39,8 (C-8’), 28,0 (C-9’), 28,6 (C-12’) e 28,9 (C-13’).

5.105.155.205.255.305.35 ppm

5.1

05

.11

5.1

1

5.1

85

.18

5.3

45

.34

1.601.651.701.75 ppm

1.5

71

.57

1.6

11

.61

1.6

1

1.6

5

1.6

5

1.7

21

.72

1.7

2

COOH

OH

OH

COOH

1

35

1'

3'

5'

7'

9'

11'

19'

13'

16'

20'

17' 18'

H2’ tq, 7,4 e 1,2 Hz H6’

tq, 6,9 e 1,2 Hz

H14’ tst, 7,4 e 1,4 Hz

H17’

d, 1,2 Hz H16’

d, 1,4 Hz

H18’ d, 1,2 Hz

H20’ d, 1,4 Hz


Figura 101. Espectro de RMN de 13C de 12 (125 MHz, MeOD).

Figura 102. Espectro de RMN de 13C de 12 (125 MHz, MeOD), ampliação de 42 a 15 ppm e de 175 a 113 ppm.

220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 ppm

16

.29

16

.39

17

.90

26

.09

27

.65

28

.00

28

.61

28

.89

29

.08

39

.78

40

.89

48

.64

48

.81

48

.98

49

.15

49

.32

49

.49

49

.66

11

5.2

21

22

.40

12

3.8

41

24

.31

12

5.0

41

26

.33

12

9.2

11

33

.11

13

3.3

31

35

.32

13

7.0

51

44

.29

14

5.5

51

49

.52

17

0.8

91

71

.77 Current Data Parameters

NAME Sub 02- ac cald

EXPNO 5

PROCNO 1


Date_ 20080806Time 8.03

INSTRUM spect

PROBHD 5 mm TXI 1H-13

PULPROG zgpg30

TD 65536

SOLVENT MeOD

NS 13990

DS 4

SWH 32679.738 Hz

FIDRES 0.498653 Hz

AQ 1.0027508 sec

RG 32768

DW 15.300 usec

DE 6.00 usec

TE 298.0 K

D1 1.00000000 secd11 0.03000000 sec

DELTA 0.89999998 sec

TD0 1

======== CHANNEL f1 ========

NUC1 13C

P1 12.75 usec

PL1 -2.50 dBSFO1 125.7716224 MHz

======== CHANNEL f2 ========

CPDPRG2 waltz16

NUC2 1H

PCPD2 86.00 usec

PL2 0 dB

PL12 16.82 dBPL13 21.00 dB

SFO2 500.1320005 MHz


SI 65536

SF 125.7575957 MHz

WDW EM

SSB 0LB 3.00 Hz

GB 0

PC 1.40

120125130135140145150155160165170 ppm

115.2

2

122.4

0123.8

4124.3

1125.0

4126.3

3

129.2

1

133.1

1133.3

3

135.3

2

137.0

5

144.2

9

145.5

5

149.5

2

170.8

9171.7

7

17181920212223242526272829303132333435363738394041 ppm

16.2

916.3

9

17.9

0

26.0

9

27.6

528.0

028.6

128.8

929.0

8

39.7

8

40.8

9

COOH

OH

OH

COOH

1

35

1'

3'

5'

7'

9'

11'

19'

13'

16'

20'

17' 18'

C4’ C8’ C1’

C13’

C12’

C9’ C5’

C16’ C20’ C18’ / C17’

C19’ COOH

C4 C5

C10’

C3’

C7’ C3

C20’

C11’/C15’

C20’

C1

C20’

C6

C20’

C6’/C14’/C2/C2’


Figura 103. Mapa de contorno de HSQC de 12 (125 MHz, MeOD), ampliação 8,0 a 1,2 ppm em F1 e de 160,0 a 0,0 ppm em F2.

As posições dos substituintes no ácido benzoico e do grupo carboxílico na

cadeia lateral foram definidas através da análise dos dados de HSQC (Figura 103),

HMBC (Figura 103, Figura 104, Figura 105 e Figura 106) e COSY (Figura 107).

As correlações observadas no experimento de HMBC entre H-2 com C-4, C-6,

C-1’ e COOH e entre H-6 com C-4, C-5 e COOH permitiram confirmar o

posicionamento das hidroxilas nos carbonos C-4 e do grupo carboxílico no C-1 do

anel aromático.

As correlações HMBC permitiram também definir a posição do segundo grupo

carboxílico no C-19’ devido às correlações observadas entre H-10’ com C-8’, C-9’, C-

11’, C-12’ e C-19’, H-12’ com C-11’, C-14’ e C-19’, H-16’ com C-14’ e C-20’ e de H-

20’ com C-14’, C-15’ e C-16’ (Figura 104).

ppm

1.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.0 ppm

140

120

100

80

60

40

20


F2 - Acquisition ParametersDate_ 20080806Time 0.12INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 1H-13PULPROG hsqcetgpsi2TD 1024SOLVENT MeODNS 88DS 16SWH 6720.430 HzFIDRES 6.562920 HzAQ 0.0762356 secRG 18390.4DW 74.400 usecDE 6.00 usecTE 298.0 KCNST2 145.0000000d0 0.00000300 secD1 1.50000000 secd4 0.00172414 secd11 0.03000000 secd13 0.00000400 secD16 0.00010000 secD24 0.00086207 secDELTA 0.00117520 secDELTA1 0.00110800 secDELTA2 0.00016207 secDELTA3 0.00062414 secIN0 0.00001530 secST1CNT 0ZGOPTNS

======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 9.60 usecp2 19.20 usecP28 1000.00 usecPL1 0 dBSFO1 500.1329328 MHz

======== CHANNEL f2 ========CPDPRG2 garpNUC2 13CP3 12.80 usecp4 25.60 usecPCPD2 68.00 usecPL2 -2.50 dBPL12 12.01 dBSFO2 125.7716224 MHz

====== GRADIENT CHANNEL =====GPNAM1 SINE.100GPNAM2 SINE.100GPNAM3 SINE.100GPNAM4 SINE.100GPZ1 80.00 %GPZ2 20.10 %GPZ3 11.00 %GPZ4 -5.00 %P16 1000.00 usecP19 600.00 usec

F1 - Acquisition parametersTD 200SFO1 125.7716 MHzFIDRES 163.398697 HzSW 259.834 ppmFnMODE Echo-Antiecho


F1 - Processing parametersSI 512MC2 echo-antiechoSF 125.7576207 MHzWDW GMSSB 2LB 0 HzGB 0

ppm

1.82.02.22.4 ppm

20

25

30

35

40

2

6

10’

2’

6’

14’

1’

9’/12’ 5’

13’

4’/8’

16’

17’

20’ 18’

COOH

OH

OH

COOH

1

35

1'

3'

5'

7'

9'

11'

19'

13'

16'

20'

17' 18'


Figura 104. Correlações HMBC selecionadas para a substância 12.


F1 e de 10,0 a 190,0 ppm em F2)

ppm

5.05.25.45.65.86.06.26.46.66.87.07.27.47.6 ppm

20

40

60

80

100

120

140

160

180


F2 - Acquisition ParametersDate_ 20080806Time 16.18INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 1H-13PULPROG hmbcgplpndqfTD 4096SOLVENT MeODNS 92DS 16SWH 6720.430 HzFIDRES 1.640730 HzAQ 0.3047924 secRG 16384DW 74.400 usecDE 6.00 usecTE 298.0 KCNST2 145.0000000CNST13 10.0000000d0 0.00000300 secD1 1.50000000 secd2 0.00344828 secd6 0.05000000 secD16 0.00010000 secIN0 0.00001530 sec

======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 9.60 usecp2 19.20 usecPL1 0 dBSFO1 500.1329328 MHz






ppm

5.15.25.35.4 ppm

20

25

30

35

40

45

H2 H6 H10’

H2’ H6’ H14

’

C1’

C6

COOH

C4 C5

C1/C2

C19’

C11’

C8’

C12’

C17’

C1’

C4’ C8’

C6’

C18’

C12’

C16’

C20’

COOH

OH

OH

COOH

1

35

1'

3'

5'

7'

9'

11'

19'

13'

16'

20'

17' 18'



F1 e de 10,0 a 180,0 ppm em F2).

Para determinar as configurações das duplas foram realizados os

experimentos de COSY (Figura 107) e NOESY (Figura 109). Através das

correlações observadas no COSY foi possível confirmar as posições das duplas

ligações.

As configurações das duplas ligações foram determinadas como E através do

experimento NOESY. As correlações observadas entre os hidrogênios H-1’ e H-5’

com os hidrogênios da metila H-17’, e do hidrogênio olefínico H-2’ com H-4’, são

possíveis apenas com a configuração E da dupla. Do mesmo modo que as

correlações entre H-5’ e H-9’ com os hidrogênios da metila H-18’ e dos hidrogênios

olefínicos H-6’ e H-10’ com H-8’, determinam as duplas ligações com as

configurações 6’E e 10’E.

ppm

1.61.82.02.22.42.62.83.03.23.4 ppm

20

40

60

80

100

120

140

160

180


F2 - Acquisition ParametersDate_ 20080806Time 16.18INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 1H-13PULPROG hmbcgplpndqfTD 4096SOLVENT MeODNS 92DS 16SWH 6720.430 HzFIDRES 1.640730 HzAQ 0.3047924 secRG 16384DW 74.400 usecDE 6.00 usecTE 298.0 KCNST2 145.0000000CNST13 10.0000000d0 0.00000300 secD1 1.50000000 secd2 0.00344828 secd6 0.05000000 secD16 0.00010000 secIN0 0.00001530 sec

======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 9.60 usecp2 19.20 usecPL1 0 dBSFO1 500.1329328 MHz






H1’

H17’ H16’ H20’

H18’

C4’ C8’

C16’

C20’

C2’

C3’

C14’

C15’

C7’

C6’

C19’

C10’

C11’

C14’

C13’

C8’ C4’

C3’

C3’

C6’/C2' C6’

C3’/C7’

H12’/H9’ H5’

H4’ H8’ H13’

COOH

OH

OH

COOH

1

35

1'

3'

5'

7'

9'

11'

19'

13'

16'

20'

17' 18'


Figura 107. Mapa de contorno 1H-1H COSY de 12 (500 MHz, MeOD).

O experimento de NOESY de 12 (Figura 108) permitiu também determinar as

posições das metilas H-16’ e H-20’, através da correlação NOE observada entre o

hidrogênio olefínico H-14’ com o hidrogênio da metila H-16’.

Figura 108. Correlações NOE observadas para 12.

ppm

9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

9

8

7

6

5

4

3

2

1


F2 - Acquisition ParametersDate_ 20080805Time 16.27INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 1H-13PULPROG cosygpqfTD 2048SOLVENT MeODNS 84DS 16SWH 6720.430 HzFIDRES 3.281460 HzAQ 0.1524212 secRG 64DW 74.400 usecDE 6.00 usecTE 298.0 Kd0 0.00000300 secD1 1.48689198 secd13 0.00000400 secD16 0.00010000 secIN0 0.00014880 sec

======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP0 9.60 usecP1 9.60 usecPL1 0 dBSFO1 500.1329328 MHz

====== GRADIENT CHANNEL =====GPNAM1 SINE.100GPNAM2 SINE.100GPZ1 10.00 %GPZ2 10.00 %P16 1000.00 usec




COOH

OH

OH

COOH

1

35

1'

3'

5'

7'

9'

11'

19'

13'

16'17' 18'


Figura 109. Mapa de contorno 1H-1H NOESY de 12 (500 MHz, MeOD).

Os dados de RMN de 12 (Tabela 18), de estrutura inédita, foram comparados

aos da literatura para substâncias similares, confirmando a identificação de 12 como

o ácido-3-[(2’E,6’E,10’E)-11’-carboxi-3’,7’,15’-trimetil-2’,6’,10’,14’-hexadecatetraen-1’-

il]-4,5-di-hidroxibenzoico, de estrutura inédita, denominado ácido caldensínico

(Freitas, 2009).

ppm

0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.0 ppm

1

2

3

4

5

6

7

8

Current Data ParametersNAME Sub 02 NoesyEXPNO 2PROCNO 1

F2 - Acquisition ParametersDate_ 20120704Time 12.11INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 13C ZPULPROG noesygpphppTD 2048SOLVENT MeODNS 16DS 16SWH 6493.506 HzFIDRES 3.170657 HzAQ 0.1577460 secRG 203DW 77.000 usecDE 6.50 usecTE 298.2 KD0 0.00006727 secD1 2.00000000 secD8 0.75000000 secD11 0.03000000 secD12 0.00002000 secD16 0.00020000 secIN0 0.00015400 sec

======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 7.64 usecP2 15.28 usecP17 2500.00 usecPLW1 13.69999981 WPLW10 1.18289995 WSFO1 500.1327507 MHz

====== GRADIENT CHANNEL =====GPNAM1 SMSQ10.100GPZ1 40.00 %P16 1000.00 usec

F1 - Acquisition parametersTD 208SFO1 500.1328 MHzFIDRES 31.218779 HzSW 12.984 ppmFnMODE States-TPPI


F1 - Processing parametersSI 1024MC2 States-TPPISF 500.1300100 MHzWDW GMSSB 2LB 0 HzGB 0


Substância 13


estabelecida de acordo com o espectro de massas obtido por HR-ESI-TOF (Figura

111), no qual foi observado um pico em m/z 453,2647 Da, correspondente ao íon

quasimolecular [M+H]+, levando à fórmula molecular C28H38O5 (valor calculado para

[M+H]+: 453,2641 Da).



A substância 13, também um derivado de ácido benzoico prenilado,

apresentou sinais de RMN de 1H referentes a um sistema aromático 1,3,4-

trissubstituído, sendo um duplo dupleto em 7,95 (2,1 e 8,5 Hz, 1H) e dois dupletos,

um em 6,86 (8,5, 1H) e outro em 7,88 (2,1, 1H) (Figura 112).

COOHOCH3

COOH1

355' 9'

19'

13'16'

20'17' 18'

453.2647

-MS, 28.5-28.6min #(1701-1712)

0

1

2

3

4

5x10

Intens.

430 435 440 445 450 455 460 m/z

[M+H]+


Os sinais de RMN de 1H e 13C (Figura 113 e Figura 114) indicaram

novamente a presença de um substituinte geranil-geranila em C-3, com a presença

de quatro metilas em 15,8 (C-18’), 16,1 (C-17’), 17,7 (C-20’) e 25,6 (C-16’) e dois

ácidos carboxílicos em 172,4 (COOH) e 173,8 (C-19).

Diferentemente de 12, foi observada a presença de uma metoxila em 55,5

como substituinte na posição C-4. As posições dos ácidos carboxílicos e da metoxila

foram determinadas através dos espectros de HSQC, HMBC e COSY.


9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm

1.5

71.5

71.6

01.6

01.6

61.6

61.7

01.7

02.0

52.0

72.0

82.1

12.1

12.1

22.1

32.2

32.2

52.2

62.5

62.5

82.5

92.6

13.3

33.3

43.8

95.0

65.0

75.0

85.0

85.0

95.1

65.1

65.1

7

5.3

15.3

15.9

85.9

96.0

16.8

56.8

77.2

67.8

77.8

87.9

47.9

47.9

5

7.9

6

3.0

9

2.8

23.0

32.9

57.6

82.0

1

1.8

8

1.9

2

2.8

9

1.0

30.9

90.9

0

0.9

3

1.0

0

0.9

31.0

1

Current Data ParametersNAME K1441FrA 5b.2 f 23EXPNO 1PROCNO 1



F2 - Processing parametersSI 65536SF 500.1300138 MHzWDW EMSSB 0LB 0.10 HzGB 0PC 1.006.97.07.17.27.37.47.57.67.77.87.98.08.1 ppm

COOH

OCH3

COOH

1

35

1' 5' 9'

13'

16'17' 18'

19'

20'



Figura 114. Espectro de RMN de 13C de 13 (125 MHz, CDCl3) (Ampliação).

As configurações das duplas ligações foram determinadas através dos

experimentos COSY (Figura 116) e NOESY (Figura 117). As correlações NOE

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 ppm

15

.81

15

.87

16

.07

17

.65

25

.62

26

.33

26

.50

27

.88

28

.04

28

.14

34

.48

39

.04

39

.67

55

.50

76

.75

77

.00

77

.26

10

9.5

01

21

.26

12

1.5

51

23

.48

12

4.8

91

30

.17

13

0.1

91

30

.54

13

1.2

71

31

.32

13

2.1

41

34

.17

13

6.6

91

45

.82

16

1.7

9

17

2.3

51

73

.76






110115120125130135140145150155160165170175 ppm

10

9.5

0

12

1.2

61

21

.55

12

3.4

81

24

.89

13

0.1

71

30

.19

13

0.5

41

31

.27

13

1.3

21

32

.14

13

4.1

71

36

.69

14

5.8

2

16

1.7

9

17

2.3

51

73

.76






152025303540455055 ppm

15

.81

15

.87

16

.07

17

.65

25

.62

26

.33

26

.50

27

.88

28

.04

28

.14

34

.48

39

.04

39

.67

55

.50

OCH3-4 C4’

C8’ C12’

C-19’ COOH C4 C10’

C5

C1’/C5’/C9’

C13’/C16’ C17’/C18’C20’

C2/C3/C6/C3’ C7’/C11’/C15’

C1/C2’/C6’/C14’


observadas entre os hidrogênios H-1’ e H-5’ com os hidrogênios da metila H-17’, e

do hidrogênio olefínico H-2’ com H-4’, são possíveis apenas com a configuração E

da dupla. Assim como as correlações observadas entre H-5’ e H-9’ com os

hidrogênios da metila H-18’ e dos hidrogênios olefínicos H-6’ e H-10’ com H-8’,

determinam dupla ligação com configuração 6’E, e diferentemente do observado

para a substância 12, em 13 observou-se a correlação entre os hidrogênios H-10’ e

H-12’, possível apenas com configuração da dupla sendo 10’Z (Figura 115).

O experimento de NOESY de 13 permitiu também determinar as posições das

metilas H-16’ e H-20’, através da correlação NOE observada entre o hidrogênio

olefínico H-14’ com os hidrogênios da metila H-16’ e dos hidrogênios H-13’ com os

da metila H-20’.

Figura 115. Correlações NOE observadas para 13.

Os dados de RMN de 13 (Tabela 18), de estrutura inédita, foram comparados

aos da literatura para substâncias similares, confirmando sua identificação como o

ácido-3-[(2’E,6’E,10’Z)-11’-carboxi-3’,7’,15’-trimetil-2’,6’,10’,14’-hexadecatetraen-1’-

il]-4-metoxibenzoico.

COOHOCH3

COOH1

355' 9'

19'

13'16'

20'17' 18'


Figura 116. Mapa de contorno 1H-1H COSY de 13 (500 MHz, MeOD).

Figura 117. Mapa de contorno 1H-1H NOESY de 13 (500 MHz, MeOD).

ppm

8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm

8

7

6

5

4

3

2

1

0


NAME Sub 10

EXPNO 3

PROCNO 1


Date_ 20120328

Time 11.20

INSTRUM spect

PROBHD 5 mm BBO BB-1H

PULPROG cosygpppqf

TD 2048

SOLVENT CDCl3

NS 16

DS 16

SWH 3898.129 Hz

FIDRES 1.903383 Hz

AQ 0.2627401 sec

RG 64DW 128.267 usec

DE 6.50 usec

TE 296.1 K

D0 0.00000300 sec

D1 2.00000000 sec

D11 0.03000000 sec

D12 0.00002000 sec

D13 0.00000400 sec

D16 0.00020000 sec

IN0 0.00025655 sec

======== CHANNEL f1 ========

NUC1 1H

P0 9.75 usec

P1 9.75 usec

P17 2500.00 usec

PLW1 16.50000000 W

PLW10 2.32030010 W

SFO1 300.1316507 MHz


GPNAM1 SMSQ10.100

GPZ1 10.00 %

P16 1000.00 usec


TD 256

SFO1 300.1317 MHz

FIDRES 15.227066 Hz

SW 12.988 ppm

FnMODE QF


SI 2048

SF 300.1300053 MHz

WDW QSINE

SSB 0

LB 0 Hz

GB 0

PC 1.40


SI 1024

MC2 QF

SF 300.1300048 MHz

WDW States-TPPI

SSB 0

LB 0 Hz

GB 0

ppm

8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm

8

7

6

5

4

3

2

1

0


NAME K1441FrA 5.2 b

EXPNO 3

PROCNO 1


Date_ 20120403

Time 10.59

INSTRUM spect

PROBHD 5 mm TXI 13C Z

PULPROG noesygpphpp

TD 2048

SOLVENT CDCl3

NS 32

DS 16

SWH 6493.506 Hz

FIDRES 3.170657 Hz

AQ 0.1577460 sec

RG 1820

DW 77.000 usec

DE 6.50 usec

TE 298.1 K

D0 0.00006672 sec

D1 2.00000000 sec

D8 0.75000000 sec

D11 0.03000000 sec

D12 0.00002000 sec

D16 0.00020000 sec

IN0 0.00015380 sec

======== CHANNEL f1 ========

NUC1 1H

P1 8.00 usec

P2 16.00 usec

P17 2500.00 usec

PLW1 13.69999981 W

PLW10 1.29700005 W

SFO1 500.1327507 MHz


GPNAM1 SMSQ10.100

GPZ1 40.00 %

P16 1000.00 usec


TD 207

SFO1 500.1328 MHz

FIDRES 31.409275 Hz

SW 13.000 ppm

FnMODE States-TPPI

F2 - Processing parametersSI 2048

SF 500.1300119 MHz

WDW QSINE

SSB 2

LB 0 Hz

GB 0

PC 1.00


SI 1024

MC2 States-TPPI

SF 500.1300103 MHz

WDW SINE

SSB 2

LB 0 Hz

GB 0



Posição 1H 13C 1H 13C

1 - 122,4 - 121,1 2 7,35 (d, 2,0, 1H) 124,3 7,88 (d, 2,1, 1H) 131,3 3 - 129,2 - 130,5 4 - 149,5 - 161,8 5 - 145,6 6,86 (d, 8,5, 1H) 109,5 6 7,31 (d, 2,0 , 1H) 115,2 7,95 (dd, 8,5 e 2,1, 1H) 130,2 1’ 3,31 (d, 7,4, 2H) 29,1 3,33 (d, 7,3, 2H) 28,2 2’ 5,34 (tq, 7,4 e 1,2, 1H) 123,9 5,31 (t, 7,5, 1H) 121,5 3’ - 137,1 - 136,7 4’ 2,04-2,08 (m, 6H) 40,9 2,10 (m, 2H) 39,7 5’ 2,14 (q, 7,1, 2H) 27,7 2,10 (m, 2H) 26,5 6’ 5,18 (tq, 6,9 e 1,2, 1H) 126,4 5,16 (t, 6,0, 1H) 124,9 7’ - 135,3 - 134,2 8’ 2,04-2,08 (m, 6H) 39,8 2,10 (m, 2H) 39,1 9’ 2,24 (q, 7,5, 2H) 28,0 2,60 (q, 7,4, 2H) 28,1 10’ 6,74 (t, 7,5, 1H) 144,3 6,01 (t, 7,4, 1H) 145,9 11’ - 133,3 - 130,5 12’ 2,27 (t, 7,6, 2H) 28,6 2,25 (m, 2H) 34,5 13’ 2,04-2,08 (m, 6H) 28,9 2,10 (m, 2H) 27,9 14’ 5,11 (tsep, 7,4 e 1,4, 1H) 125,1 5,08 (tqt, 7,1 e 1,4, 1H) 123,5 15’ - 131,1 - 132,2 16’ 1,65 (d, 1,4, 3H) 26,1 1,66 (sl, 3H) 25,6 17’ 1,72 (d, 1,2, 3H) 16,3 1,71 (sl, 3H) 16,1 18’ 1,61 (d, 1,2, 3H) 16,4 1,60 (sl, 3H) 15,8 19’ - 171,8 - 173,8 20’ 1,57 (d, 1,4, 3H) 17,9 1,58 (sl, 3H) 17,7

COOH - 170,9 - 172,4 OCH3-4 3,88 (s, 3H) 55,5

em ppm; J em Hz.

COOH

OH

OH

COOH

121

3 5

1' 5' 9'

13'

16'17' 18'

19'

20'

COOHOCH3

COOH1

355' 9'

19'

13'16'

20'17' 18'


Substâncias 12a, 12b e 12c e 13a

As substâncias 12a, 12b e 12c obtidas através das reações de metilação,

hidrogenação e acetilação da substância 12, respectivamente, e 13a obtida através

da reação de metilação de 13 (Figura 118), foram caracterizadas a partir dos dados

de RMN de 1H, RMN de 13C, DEPT 135º, HSQC, HMBC e por ESIMS.

Figura 118. Estruturas das substâncias 12a, 12b, 12c e 13a.

As fórmulas moleculares esperadas como produtos das reações realizadas

foram confirmadas através do espectro de massas de alta resolução, sendo 12a

C31H44O6 (m/z 513,3216 Da, calculado para [M+H]+: 513,3216 Da), 12b C31H40O8

(m/z 563,2621 Da, calculado para [M+Na]+: 563,2621 Da), 12c C27H44O6

(m/z 487,3035 Da, calculado para [M+Na]+: 487,3036 Da) (Figura 119).

COOCH3

OCH3

H3CO

COOCH3

12a

COOH

OAc

AcO

COOH

12b

COOH

OH

OH

COOH12c 13a

COOMeOMe

COOMe


Figura 119. Espectro de massas de alta resolução (ESI+) de a) 12a; b) 12b; c) 12c.

Para a substância 12a (Figura 120), o espectro de RMN de 1H (Figura 121 e

Figura 122) (CDCl3, 500 MHz) foram observados os simpletos referentes às

metoxilas provenientes da reação de metilação em 3,72 (-OCH3-20’), 3,86 (-OCH3-

4), 3,89 (-OCH3-17’) e 3,90 (-OCH3-5).

Figura 120. Estrutura do derivado 12a.

513.3216

522.6009

530.3480

535.3045

+MS, 0.7min #44

0

2

4

6

4x10

Intens.

510 515 520 525 530 535 m/z

562.2496

563.2621

564.2656

565.2603

+MS, 0.2-0.4min #(14-23)

0

1

2

3

4x10

Intens.

561.5 562.0 562.5 563.0 563.5 564.0 564.5 565.0 565.5 566.0 m/z

304.2618

360.3256

393.2989437.1970

487.3035

550.6337 585.5367

+MS, 0.9min #51

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

4x10

Intens.

150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z

a)

b)

c)


Figura 121. Espectro de RMN de 1H de 12a (500 MHz, CDCl3).

Figura 122. Espectro de RMN de 1H de 12a (500 MHz, CDCl3) ampliação de 4,2 a 1,4 ppm.

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm

1.5

81.6

01.6

71.6

71.7

42.0

42.0

42.0

62.0

82.0

92.1

02.1

22.2

22.2

32.2

52.2

62.2

92.3

02.3

23.3

63.3

83.7

23.8

63.8

83.9

05.1

25.1

25.1

35.1

35.1

35.1

45.1

45.1

45.1

45.1

55.2

75.2

86.7

06.7

26.7

37.2

77.4

57.4

57.5

17.5

1

3.1

23.1

33.1

63.1

28.4

12.0

92.0

1

2.0

42.9

03.0

02.9

83.0

7

2.0

41.0

3

0.9

5

1.0

01.0

0


NAME Sub 02a

EXPNO 3PROCNO 1


Date_ 20080617Time 10.00

INSTRUM spect

PROBHD 5 mm TXI 1H-13

PULPROG zgTD 65536

SOLVENT CDCl3

NS 24DS 0

SWH 7267.442 Hz

FIDRES 0.110892 Hz

AQ 4.5089269 secRG 14.3

DW 68.800 usec

DE 6.00 usec

TE 298.0 KD1 7.00000000 sec

TD0 1

======== CHANNEL f1 ========

NUC1 1H

P1 9.60 usec

PL1 0 dBSFO1 500.1329965 MHz


SI 65536SF 500.1300072 MHz

WDW EM

SSB 0LB 0.10 Hz

GB 0

PC 1.00

7.457.50 ppm 6.75 ppm

5.25.3 ppm

1.51.61.71.81.92.02.12.22.32.42.52.62.72.82.93.03.13.23.33.43.53.63.73.83.94.04.1 ppm

1.5

81

.60

1.6

21

.67

1.6

71

.70

1.7

42

.02

2.0

42

.04

2.0

62

.08

2.0

92

.10

2.1

22

.13

2.2

22

.23

2.2

52

.26

2.2

92

.30

2.3

2

3.3

6

3.3

8

3.7

23

.86

3.8

73

.87

3.8

83

.88

3.9

0

3.1

23

.13

3.1

6

3.1

2

8.4

1

2.0

9

2.0

1

2.0

4

2.9

0

3.0

02

.98

3.0

7

H2

d, 2,0 Hz

H6

d, 2,0 Hz H10’

d, 7,5 Hz

H2’ dq, 7,2 e 1.3 Hz

H6’ e H14’ m

H1’

d, 7,2 Hz

OCH3-20’

OCH3-4

OCH3-17’

OCH3-5

H12’

t, 7,5 Hz

H9’

q, 7,5 Hz

H4’, H5’, H8’ e H13’

m

H18’

H21’

H19’ H17’


O espectro de RMN de 13C (Figura 123) apresentou 31 sinais, sendo os sinais

correspondentes aos carbonos carboxílicos de éster foram observados em 166,9

(C-17’) e 168,4 (C-20’). Observou-se também os carbonos dos grupos metoxílicos

em 51,5 (OCH3-20’), 52,0 (OCH3-5), 55,8 (OCH3-17’) e 60,5 (OCH3-4).

Figura 123. Espectro de RMN de 13C de 12a (125 MHz, CDCl3) ampliação de 171 a 108 ppm e de 62 a 9 ppm.

Os dados obtidos (Tabela 19) confirmam a obtenção da substância 12a como

4,5-dimetoxi-3-[11’-metoxicarbonil-3’,7’,15’ trimetilexadeca 2’E, 6’E, 10’E tetraen-1’-il]

benzoato de metila.

.

115120125130135140145150155160165170 ppm

11

1.1

9

12

2.2

91

23

.65

12

3.7

11

24

.93

12

5.3

4

13

1.6

7

13

2.1

2

13

3.9

3

13

5.4

71

36

.24

14

2.6

3

15

1.0

4

15

2.3

4

16

6.8

5

16

8.3

4

202530354045505560 ppm

15

.91

16

.16

17

.53

25

.64

26

.52

26

.97

27

.23

27

.66

28

.43

38

.50

39

.58

51

.48

51

.97

55

.79

60

.46

C20’ C17’ C5

C4

C10’

C3’ C3

C7’ C15’

C11’ C1

C6’

C2/C14’

C2’ C6

OCH3-4 C8’

C4’

C1’/C13’/C9’ C12’/C5’

C16’

C21’ C18’/C19’

OCH3-17’

OCH3-5 OCH3-20’


Tabela 19. Dados de RMN de 1H e 13C (CDCl3, 500 e 125 MHz) obtidos para a substância 12a.

Posição 1H (J em Hz) 13C HMBC

1 - 125,3 -

2 7,51 (d, 2,0, 1H) 123,7 C4, C6, C1’, C17’

3 - 135,5 -

4 - 151,0 -

5 - 152,4 -

6 7,45 (d, 2,0, 1H) 111,2 C2, C4,C17’

1’ 3,37 (d, 7,2, 2H) 28,5 C2, C3, C4, C3’, C4’,

C18’

2’ 5,27 (t, 7,2, 1H) 122,3 C1’, C4’, C18’

3’ - 136,2 -

4’ 2,02-2,13 (m, 8H) 39,6 C3’, C5’ C18’

5’ 2,02-2,13 (m, 8H) 26,6 C4’, C6’, C7’

6’ 5,11-5,16 (m, 2H) 124,9 C5’, C8’, C19’

7’ - 133,9 -

8’ 2,02-2,13 (m, 8H) 38,5 C10’

9’ 2,24 (q, 7,5, 2H) 27,3 C7’, C8’, C10’, C11’

10’ 6,71 (t, 7,5, 1H) 142,6 C8’, C9’, C11’, C20’

11’ - 131,7 -

12’ 2,30 (t, 7,5, 2H) 27,0 C10’,C11’,C13’,C14’

13’ 2,02-2,13 (m, 8H) 27,7 C12’,C14’

14’ 5,11-5,16 (m, 2H) 123,6 C13’, C16’, C21’

15’ - 132,1 -

16’ 1,58 (d, 1,1, 3H) 17,6 C14’, C15’, C21’

17’ - 166,9 -

18’ 1,74 (d, 1,3, 3H) 16,2 C2’, C3’, C4’

19’ 1,60 (d, 1,2, 3H) 15,9 C6’, C7’, C8’

20’ - 168,4 -

21’ 1,67 (d, 1,3, 3H) 25,7 C13’, C14’, C15’, C16’

-OCH3 -4 3,86 (s, 3H) 60,5 C4

-OCH3 -5 3,90 (s, 3H) 52,0 C5, C6

-OCH3 -17’ 3,89 (s, 3H) 55,8 C1’, C17’

-OCH3 -20’ 3,72 (s, 3H) 51,5 C11’, C20’

em ppm; J em Hz.


Para a substância 12b (Figura 124), no espectro de RMN de 1H (Figura 125)

(CDCl3, 300 MHz) foram observados quatro simpletos em 1,71, 1,66, 1,61 e 1,58

referentes às metilas ligadas em C sp2 da cadeia lateral e dois simpletos em 2,31 e

2,28 provenientes do grupo acetílico, confirmando assim a obtenção do derivado

acetilado da substância 12.

Figura 124. Estrutura do derivado 12b.

Figura 125. Espectro de RMN de 1H de 12b (MeOD, 300 MHz).

O espectro de RMN de 13C (Figura 126) apresentou 31 sinais (CDCl3, 75

MHz), sendo dois sinais correspondentes aos carbonos carbonílicos dos ácidos

COOH

COOH

O

O

O

O1

2

34

5

6

1'

3'

5'

7'

9'

11'

13'

15'16'

18'

20'21' 22'

23'

24'

8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm

1.5

71.5

81.6

11.6

51.6

61.7

12.0

52.0

82.1

02.2

42.2

52.2

72.2

82.3

13.3

03.3

03.3

13.3

13.3

23.3

55.0

95.1

15.1

25.1

25.1

45.1

55.1

75.1

75.1

95.2

05.2

15.2

35.2

36.7

16.7

46.7

67.6

97.7

07.8

17.8

2

3.6

73.6

3

3.7

33.7

612.1

75.4

54.1

0

1.8

7

3.3

3

1.0

1

1.0

41.0

0

Current Data ParametersNAME Sub 02c_2EXPNO 2PROCNO 1


6.76.86.97.07.17.27.37.47.57.67.77.87.9 ppm

1.61.71.81.92.02.12.22.32.4 ppm

H20’ H18’

H21’, H24’, H22’, H16’

H6 H2 H10’


carboxílicos em 167,2 (COOH) e 170,2 (C-23’) e dois correspondentes aos

carbonos carbonílicos dos grupos ésteres em 168,5 (C-17’) e 168,2 (C-19’). As

atribuições foram realizadas pela análise dos espectros de RMN de 1H, RMN de 13C,

HSQC e HMBC (Tabela 20).

Figura 126. Espectro de RMN de 13C de 12b (MeOD, 75 MHz).

A substância 12b foi caracterizada como ácido ácido-3,4-bis-(acetiloxi)-5-

[(2’E,6’E,10’E)-11’-carboxi-3’,7’,15’-trimetil-2’,6’,10’,14’-hexadecatetraen-1-il]-

benzoico.

120125130135140145150155160165170175 ppm

122.2

6123.9

0125.0

3126.1

6

129.6

2130.3

8

133.1

4

133.2

7

135.5

0

137.4

7138.8

0

144.1

4144.3

1145.9

6

168.5

7169.4

9169.9

0171.5

1

Current Data ParametersNAME Sub 02c_2EXPNO 1PROCNO 1


1516171819202122232425262728293031323334353637383940414243 ppm

16.2

816.5

0

17.9

0

20.4

220.6

4

26.1

0

27.4

928.0

028.5

528.9

0

29.7

5

39.7

4

40.7

1


Tabela 20. Dados de RMN de 1H e 13C (MeOD, 300 e 75 MHz) obtidos para a substância 12b.

Carbono 1H 13C HMBC

1 - 129,1 -

2 7,69 (d, 1H, J 2,0) 122,6 C3, C4, C6, -COOH

3 - 142,8 -

4 - 144,6 -

5 - 136,1 -

6 7,81(d, 1H, J 2,0) 128,3 C2, C3, C4, C1’, -COOH

1’ 3,35 (sl, 2H) 28,4 C4, C5, C6, C2’, C3’

2’ 5,09-5,26 (m, 3H) 120,9 C1’, C4’, C21’

3’ - 137,5 -

4’ 2,05-2,25 (m, 12H) 39,4 *

5’ 2,05-2,25 (m, 12H) 26,2 *

6’ 5,09-5,26 (m, 3H) 124,8 C5’, C8’, C22’

7’ - 134,2 -

8’ 2,05-2,25 (m, 12H) 38,4 *

9’ 2,05-2,25 (m, 12H) 27,2ª *

10’ 6,74 (t, 1H, J 7,5) 143,0 C16’, C24’

11’ - 131,8b -

12’ 2,05-2,25 (m, 12H) 27,6ª *

13’ 2,05-2,25 (m, 12H) 26,7 *

14’ 5,09-5,26 (m, 3H) 123,7 C16’, C24’

15’ - 131,9b -

16’ 1,58 (s, 3H) 16,6 C14’, C15’, C24’

17’ - 168,5 -

18’ 2,28* (s, 3H) 19,1 C17’

19’ - 168,2 -

20’ 2,31* (s, 3H) 19,3 C19’

21’ 1,71 (s, 3H) 15,2 C2’, C3’, C4’

22’ 1,61 (s, 3H) 15,0 C6’, C7’, C8’

23’ - 170,2 -

24’ 1,66 (s, 3H) 24,8 C14’, C15’, C16’

COOH - 167,2 - a,

b Os sinais podem estar invertidos, * as correlações estavam sobrepostas; em ppm; J em Hz.

Para a substância 12c (Figura 127), no espectro de RMN de 1H (MeOD, 500

MHz) (Figura 128) foram observados dois dupletos em 7,34 (J 2,0 Hz, 1H) e 7,31

(J 2,0 Hz, 1H) referentes aos hidrogênios do anel aromático, quatro sinais em 0,85,

0,86, 0,87 e 0,94 referentes as metilas ligadas em carbono sp3. Observou-se

COOH

COOH

O

O

O

O1

2

34

5

6

1'

3'

5'

7'

9'

11'

13'

15'16'

18'

20'21' 22'

23'

24'


também três multipletos em 2,56-2,68 (2H), 2,25-2,32 (1H) e 1,06-1,63 (27H)

referentes aos hidrogênios ligados aos carbonos da cadeia lateral. Não foram

observados sinais referentes a hidrogênios ligados em carbono sp2, confirmando

assim a obtenção do derivado peridrogenado da substância 12.

Figura 127. Estrutura do derivado 12c.

Figura 128. Espectro de RMN de 1H de 12c (MeOD, 400 MHz)

O espectro de RMN de 13C e DEPT 135º (CDCl3, 125 MHz) (Figura 129 e

Figura 130) apresentou 27 sinais, sendo dois correspondentes aos carbonos

carbonílicos do ácido carboxílico. As atribuições para os carbonos do anel aromático

foram realizadas pela análise dos espectros de HSQC e HMBC (Tabela 21). A

OH

OH

COOH

COOH

1

2

34

5

6

1'

3'

5'

7'

9'

11'

13'

15'16'

17' 18'

19'

20'

8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm

-0.0

00

.85

0.8

50

.86

0.8

80

.94

0.9

61

.14

1.1

61

.17

1.1

81

.28

1.3

01

.32

1.3

81

.39

1.4

01

.41

1.4

21

.43

1.4

41

.50

1.5

21

.54

1.5

52

.28

2.2

92

.30

2.3

12

.32

2.5

92

.60

2.6

12

.62

2.6

32

.64

2.6

63

.30

3.3

13

.31

3.3

13

.32

7.3

17

.32

7.3

4

7.3

4

9.0

12

.81

23

.20

1.1

1

2.0

0

1.0

60

.95

Current Data ParametersNAME acido cald. hidrogenado 1EXPNO 1PROCNO 1

F2 - Acquisition ParametersDate_ 20120804Time 12.37INSTRUM spectPROBHD 5 mm TBI 1H/13PULPROG zg30TD 32768SOLVENT MeODNS 1DS 0SWH 8223.685 HzFIDRES 0.250967 HzAQ 1.9923444 secRG 50.8DW 60.800 usecDE 6.50 usecTE 298.2 KD1 1.00000000 secTD0 1



7.35 ppm

COOH

OH

OH

COOH


substância 12c foi caracterizada como sendo o ácido 3-(11-carboxi-3’,7’,15’-

trimetilexadecil)-4,5-di-hidroxibenzoico.

Figura 129. Espectro de RMN de 13C de 12c (125 MHz, MeOD).

ppm (t1)

050100150200

18

1.2

1

17

1.1

7

14

9.3

9

14

5.4

1

13

0.3

1

12

4.5

2

12

2.7

1

12

2.6

9

11

5.0

1

47

.50

40

.10

38

.47

38

.42

38

.33

38

.31

38

.29

38

.18

38

.17

38

.08

38

.01

34

.15

34

.08

34

.01

33

.86

33

.84

33

.77

29

.06

28

.53

26

.45

26

.06

25

.43

23

.07

22

.95

20

.24

20

.18

20

.14

20

.08

COOH

OH

OH

COOH


Figura 130. Espectro de RMN de 13C/DEPT 135º de 12c (125 MHz, MeOD). Tabela 21. Dados de RMN de 1H e 13C (MeOD, 500 e 125 MHz) de 12c.

Posição 1H 13C HMBC

1 - 122,7 -

2 7,34 (sl) 124,5 C4,C6, C1’, COOH

3 - 130,3 -

4 - 149,4 -

5 - 145,4 -

6 7,31 (sl) 115,0 C1, C4, C5, COOH

1’ 2,60 (m) 28,5

2’-15’ 2,56-2,68 (2H), 2,25-2,32 (1H) e 1,06-1,63 (27H)

* -

16’-18’ e 20’

0,85-0,94 (12H) * -

19’ - 181,2 -

COOH - 171,2 -

* sinais sobrepostos, em ppm; J em Hz.

ppm (f1)

050100

12

4.5

2

11

5.0

1

49

.49

49

.32

49

.20

49

.15

49

.04

48

.86

47

.51

40

.11

38

.47

38

.43

38

.33

38

.30

38

.19

38

.09

38

.01

34

.16

34

.09

34

.02

33

.87

33

.85

33

.77

29

.06

28

.55

26

.45

26

.07

25

.44

23

.07

22

.95

20

.25

20

.19

20

.15

20

.09

OH

OH

COOH

COOH

1

2

34

5

6

1'

3'

5'

7'

9'

11'

13'

15'16'

17' 18'

19'

20'


Para a substância 13a (

Figura 131), no espectro de RMN de 1H (Figura 132) (CDCl3, 500 MHz) foram

observados dois simpletos adicionais referentes às metoxilas provenientes da

reação de metilação em 3,87 (-OCH3-17’) e 3,72 (-OCH3-20’).

Figura 131. Estrutura do derivado 13a.

Figura 132. Espectro de RMN de 1H de 13a (CDCl3, 500 MHz)

O espectro de RMN de 13C (Figura 133) apresentou 30 sinais, sendo os sinais

correspondentes aos carbonos carboxílicos de éster foram observados em 167,1

COOMeOMe

COOMe1

355' 9'

19'

13'16'

20'

17'

18' 21'

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm

1.5

71.5

9

1.6

71.6

71.7

11.7

12.0

42.0

52.0

62.0

82.0

92.2

22.2

4

2.2

52.4

72.4

82.5

02.5

13.3

23.3

43.7

33.8

73.8

85.0

7

5.0

85.0

85.0

95.1

35.1

45.1

45.2

85.2

95.3

05.3

05.3

15.3

25.8

25.8

45.8

56.8

46.8

67.2

67.8

27.8

27.8

87.8

87.9

0

7.9

0

2.9

43.1

63.2

23.2

18.6

72.1

6

2.1

2

2.1

1

2.9

52.8

83.3

5

0.9

61.0

41.0

3

1.0

0

1.0

2

0.9

20.9

1





3.753.803.853.90 ppm


(C-17’) e 168,5 (C-20’). Observou-se também os carbonos dos grupos metoxílicos

em 51,7 (OCH3-20’), 51,1 (OCH3-17’) e 55,5 (OCH3-4).

Figura 133. Espectro de RMN de 13C de 13a (CDCl3, 125 MHz)

Os dados obtidos (Tabela 22) confirmam a obtenção da substância 13a como

4-metoxi-3-[11’-metoxicarbonil-3’,7’,15’ trimetilexadeca-2’E, 6’E, 10’Z, 14’-tetraen-1’-

il]-benzoato de metila, de estrutura inédita.

190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm

15

.81

16

.12

17

.62

25

.64

26

.64

27

.85

28

.00

28

.24

34

.69

39

.16

39

.74

51

.07

51

.75

55

.47

10

9.4

51

21

.66

12

2.1

51

23

.50

12

4.8

41

29

.34

13

0.0

61

30

.75

13

1.3

51

32

.07

13

4.2

2

13

6.5

81

42

.13

16

1.0

9

16

7.1

21

68

.51


F2 - Acquisition ParametersDate_ 20120819Time 18.04INSTRUM spectPROBHD 5 mm TXI 13C ZPULPROG zgpg30TD 65536SOLVENT CDCl3NS 512DS 0SWH 32894.738 HzFIDRES 0.501934 HzAQ 0.9961972 secRG 80.6DW 15.200 usecDE 6.50 usecTE 298.2 KD1 1.00000000 secD11 0.03000000 secTD0 1





Tabela 22. Dados de RMN de 1H e 13C (CDCl3, 500 e 125 MHz) obtidos para a substância 13a.

Posição 1H (J em Hz) 13C

1 - 131,3

2 7,82 (d, 2,2, 1H) 130,7

3 - 130,1

4 - 161,1

5 6,85 (d, 8,5, 1H) 109,5

6 7,89 (d, 2,2 e 8,5, 1H) 129,3

1’ 3,33 (d, 7,3, 2H) 28,2

2’ 5,30 (tt, 1,3 e 7,3, 1H) 121,7

3’ - 136,6

4’ 2,08 (m, 2H) 26,6

5’ 2,08 (m, 2H) 39,7

6’ 5,14 (m, 2H) 124,8

7’ - 134,2

8’ 2,08 (m, 2H) 39,2

9’ 2,24 (q, 7,5, 2H) 34,7

10’ 5,84 (t, 7,5, 1H) 142,1

11’ - 122,1

12’ 2,49 (t, 7,5, 2H) 28,0

13’ 2,08 (m, 2H) 27,8

14’ 5,08 (m, 2H) 123,5

15’ - 132,1

16’ 1,59 (d, 1,1, 3H) 17,0

17’ - 167,1

18’ 1,71 (d, 1,3, 3H) 16,1

19’ 1,57 (d, 1,2, 3H) 15,8

20’ - 168,5

21’ 1,67 (d, 1,3, 3H) 25,6

-OCH3 -4 3,88 (s, 3H) 55,5

-OCH3 -17’ 3,87 (s, 3H) 51,7

-OCH3 -20’ 3,72 (s, 3H) 51,1

em ppm; J em Hz.

COOMeOMe

COOMe1

355' 9'

19'

13'16'

20'

17'

18' 21'


4.9 Ensaios de atividade biológica

4.9.1 Avaliação da atividade antifúngica contra Cladosporium

cladosporioides e Cladosporium sphaerospermum.

Os extratos brutos das plantas foram avaliados qualitativamente quanto ao

potencial antifúngico contra as espécies de fungo Cladosporium cladosporioides e C.

sphaerospermum, através do ensaio de bioautografia. Este ensaio consiste na

observação da ação inibitória de extratos ou substâncias potencialmente

antifúngicas sobre esporos de fungos (Homans; Fuchs, 1970).

O ensaio foi realizado utilizando como reveladores os esporos dos fungos C.

cladosporioides e C. sphaerospermum. Estes fungos foram selecionados por

produzirem uma grande quantidade de esporos e apresentarem crescimento

uniforme em condições de cultura in vitro.

Algumas substâncias purificadas e descritas neste trabalho foram submetidas

aos ensaios de atividade antifúngica quantitativa frente aos fungos Cladosporium

cladosporioides e C. sphaerospermum, de acordo com a disponibilidade de material

obtido no isolamento.

A Tabela 23 apresenta os resultados dos ensaios de limite de detecção das

amostras testadas e do padrão nistatina utilizado como controle positivo. O ensaio

de limite de detecção indica a quantidade mínima necessária de amostra que inibe o

crescimento dos fungos em placas cromatográficas de gel de sílica.

Os resultados observados para o ácido caldensínico (12) e seus derivados

(12a-12c) indicaram uma atividade moderada (Figura 134). As substâncias 12 e 12c

foram pouco ativas contra C. cladosporioides e apresentaram atividade moderada

contra C. sphaerospermum, sendo necessárias 10 e 25 g de amostra


respectivamente. As substâncias 12a e 12c também apresentaram atividade

moderada com 5 e 25 g de amostra respectivamente, contra o fungo C.

cladosporioides e 10 e 25 g contra C. sphaerospermum.

Os valores obtidos nesse ensaio de bioautografia indicam que os metabólitos

6 e 7 apresentaram maior potencial fungitóxico e a substância 8 apresentou

atividade moderada frente aos fungos C. cladosporioides e C. sphaerospermum.

De acordo com os valores observados a presença do anel B não aromático

causa uma diminuição do potencial apresentado por 6 e 7, que foram ativas com

apenas 1 g de amostra tanto contra C. cladosporioides quanto C. sphaerospermum

enquanto que para 8 foram necessários 5 e 25 g respectivamente.

Tabela 23. Atividade antifúngica contra C. cladosporioides e C. sphaerospermum.

Substâncias Atividade antigúngica (g)*

C. cladosporioides C. sphaerospermum

6 1 1

7 1 1

8 5 25

12 100 10

12a 5 10

12b 1 25

12c 25 5

Nistatina 1 1 *Quantidade mínima requerida para a inibição do crescimento do fungo na placa de CCDA.


UV

= 254

Cladosporium cladosporioides

Cladosporium shaerospermum

12

12a

12b

12c

Nistatina

100 50 25 10 5 1 g 100 50 25 10 5 1 g 100 50 25 10 5 1 g

6

7

Nistatina

100 50 25 10 5 1 g 100 50 25 10 5 1 g 100 50 25 10 5 1 g

8

Nistatina

100 50 25 10 5 1 g 100 50 25 10 5 1 g 100 50 25 10 5 1 g

Figura 134. Placas de CCDA reveladas com UV (=254 nm), esporos de C. cladosporioides e C. sphaerospermum.


4.9.2 Atividade antitumoral

Flavonoides são bastante conhecidos por apresentarem diversas atividades

biológicas, como antioxidante, anti-inflamatória e antifúngica e apresentam baixa

toxidade nos ensaios antitumorais. No entanto, a presença de anel B modificado

(oxidado e reduzido) tem potencializado a atividade antitumoral de flavonoides, um

exemplo é a substância protoapigenona (Figura 135) que apresentou uma potencial

atividade antitumoral frente a diversas linhagens de células tumorais: câncer de

fígado (Hep G2 e Hep 3B), câncer de pulmão (A459), câncer de mama (MCF-7 e

MDA-MB-231), câncer de próstata e câncer de ovário (MDAH-2774 e SKOV3)

(Chang; Su; et al., 2008; Chang; Wu; et al., 2008; Lin, A. S. et al., 2005).

O

O

O

OH

OH

OH

Figura 135. Estrutura da substância protoapigenona.

As flavanonas 6, 7 e 8 foram inicialmente submetidas ao ensaio de atividade

antitumoral contra as linhagens células leucêmicas K562 e Nalm-6. Os princípios

ativos Gleevec® e vincristina foram utilizados como controle positivo (Figura 136).


N

N

N

NH NH

O

N

N

O

O

O

OH

MeO

MeO

OH

O

OOH

OH

OMe

O

O

OH

OH

MeO

NH

N

H

OH

OO

O

N

N

O

O

OH

O

O

OHC HH

Vincristina

Gleevec

Sakuranetina (7)Diidrowogonina (6) Protoflavanona (8)

Figura 136. Substâncias submetidas ao ensaio de atividade antitumoral (5, 6 e 8) e controles positivos (Gleevec e vincristina)

A tabela 24 apresenta os valores de IC50 obtidos no ensaio inicial contra as

células leucêmicas K-562 e Nalm-6.

Tabela 24. Citotoxidade de 5, 6 e 8 para as linhagens de células leucêmicas K-562 e NALM-6.

Cell line

6 IC50 (µM)

7 IC50 (µM)

8 IC50 (µM)

Gleevec IC50 (µM)

Vincristina IC50 (µM)

K-562 91 281 14 10 - NALM-6 80 288 11 - 0,17

*linhagens: K-562 Leucemia mielóide, NALM-6 Leucemia linfoblástica aguda B.

De acordo com os valores observados a substância 8 apresentou um alto

potencial antitumoral frente às linhagens de células avaliadas com valor de IC50 = 14

M muito semelhante ao Gleevec® utilizado no ensaio contra K562. Para Nalm16 o

valor de IC50 apresentado pela substância 8 foi de 11 g/ml sendo 0,17 para o

controle vincristina. Apesar de a vincristina apresentar um potencial muito maior que

as amostras ensaiadas o valor observado para a substância 8 foi considerado


promissor, enquanto que as substâncias 6 e 7 apresentaram resultados

insatisfatórios.

Esses resultados revelam que a presença do anel B não aromático da

flavanona 8 tem um papel importante para a atividade antitumoral, resultando em

uma atividade citotóxica significante quando comparada com as de flavanonas com

anel B aromático (5 e 6).

Após a obtenção desses resultados iniciais, e com o posterior isolamento e

identificação da substância 9, foi realizado um novo ensaio onde as substâncias 8, 9

e o derivado 8a (Figura 137) foram testados contra doze linhagens de células

tumorais (Tabela 25).

O

O

O

OH

MeO

MeO

OH

O

O

O

OH

MeO

MeO

OHOH

O

O

O

OH

MeO

MeO

OH

8 9 8a

Figura 137. Substâncias submetidas ao ensaio de atividade antitumoral (8, 8a e 9)

Tabela 25. Citotoxidade de 8, 8a e 9 para as doze linhagens de células leucêmicas avaliadas.

Cell line

8 IC50 (µM)

9 IC50 (µM)

8a IC50 (µM)

Vincristina IC50 (µM)

K-562 12,8 234,0 > 300 0,164 HL-60 8,7 168,4 > 300 0,011 NB4 3,4 75,5 222,7 0,003 P39 10,9 205,0 > 300 0,01

Daudi 14,6 > 300 > 300 0,01 U-937 13,1 > 300 > 300 0,005

RAMOS 8,2 187,5 > 300 0,029 Jurkat 5,9 131,0 > 300 0,164

MOLT-4 11,4 214,8 > 300 0,009 B15 8,5 172,5 > 300 0,504

NAMALWA 9,6 214,6 > 300 0,077 NALM-6 8,9 197,0 > 300 1,707

K562, HL60, NB4: Leucemia mielóide; P39: Síndrome mielodisplásica (SMD); NAMALWA, DAUDI, RAMOS: Linfoma de Burkitt; JURKAT, MOUT4: Leucemia linfoblástica aguda T; U937: Linfoma histiocítico; NALM6, B15: Leucemia linfoblástica aguda B.


A substância 8 apresentou uma potencial atividade antileucêmica para as

doze linhagens de células avaliadas, com valores de IC50 na faixa entre 3 a 15 M. A

substância 9 apresentou uma diminuição drástica na atividade com valores de IC50

na faixa de 200 M com exceção de NB4 e Jurkat que foram de 75,5 e 131,0 M,

respectivamente. Já a substância 8a mostrou-se totalmente inativa nas

concentrações testadas, com valores de IC50 > 300 M, exceto para NB4 que foi de

222,7 M.

Os resultados observados revelam que em flavanonas a presença de anel B

totalmente reduzido torna a substância inativa para a atividade antitumoral, sendo

ativa apenas na presença de dupla ligação conjugada à carbonila.

Estes resultados estão de acordo com relatos da literatura para substâncias

similares, dentre os quais a protoapigenona vem apresentando resultados

promissores contra inúmeras linhagens de células tumorais e a combinação dessas

substâncias com as drogas atualmente utilizadas no tratamento do câncer tem

apresentado um aumento no potencial citotóxico (Lin, A.-S. et al., 2005; Liu et al.,

2011; Wei et al., 2011). Ensaios como este devem também serem realizados além

de uma avaliação da atividade das protoflavanonas 10 e 11.

Apesar da existência de drogas muito potentes no tratamento da leucemia,

como Gleveec (Novartis) e Sprycel (Bristol-Myers Squibb), a busca por novas drogas

continua sendo importante. Estes fármacos atuam na inibição da enzima tirosina

quinase, que se apresenta hiperativa nas células brancas do sangue de pessoas

com leucemia. No entanto essa enzima tem sido susceptível à mutação pelo uso

desses medicamentos, tornando-os inativos para o tratamento. Recentemente o

novo fármaco Ponatinib foi aprovado pela FDA (EUA, dezembro/2012) como uma


droga candidata para o tratamento de leucemia mielóide crônica e leucemia

linfoblástica aguda (Dolgin, 2013).

4.10 Análises quimiométricas

O estudo fitoquímico das quatro espécies de Piper permitiu a identificação de

seus metabólitos majoritários, sendo agora possível relacioná-los com o gráfico de

scores do PCA obtido inicialmente para os espécimes analisados (Tabela 26)

(Seção 4.1).

Tabela 26. Espécies de Piper analisadas por PCA.

Espécie Parte da planta Código Local de coleta

Piper bowiei Folhas K-364 F São Paulo – SP




P. caldense Frutos K-842 Fr Ubatuba – SP

















4.10.1 Espectrometria de massas com injeção direta

Para a realização desse estudo os extratos preparados foram analisados por

injeção direta no espectrômetro de massas, e os espectros obtidos submetidos ao

PCA.

No gráfico de scores (Figura 138) foi possível observar o agrupamento das

amostras de acordo com a espécie, baseado principalmente na similaridade da

composição química. A análise dos gráficos de scores e loadings (Figura 139)

juntamente com os resultados obtidos no estudo fitoquímico das plantas demonstrou

que nas amostras de P. carniconnectivum (grupo II) a variável de m/z 335 Da foi a

qual apresentou maior influência no agrupamento das amostras desta espécie, esta

variável corresponde ao metabólito majoritário identificado nos extratos das folhas, a

substância 8, uma protoflavanona.

Nos extratos das folhas de P. bowiei e P. permucronatum (grupo III) a maior

contribuição foi da variável m/z 287 Da, correspondente as flavanonas di-

hidrowogonina (6) e sakuranetina (7), identificadas como constituintes majoritários

nos respectivos extratos. Em função da presença de flavanonas isoméricas a análise

de PCA não permitiu a discriminação entre essas duas espécies.

No grupo I, constituído pelas amostras de P. caldense, observou-se a

presença de inúmeras variáveis na faixa de m/z 450 Da, sendo o metabólito

majoritário desses extratos o ácido caldensínico (12) de massa molecular 456 Da, há

indícios da presença de outros derivados de ácidos benzoicos prenilados no extrato

na faixa de m/z 400-470 Da (Espectros de EM-ESI nos apêndices A, B e C).


Figura 138. Gráfico de scores (PC1 v PC2) (61% de variância) com base nos dados de ESIMS, por injeção direta, dos extratos de espécies de Piper.

Figura 139. Gráfico de loadings (61% de variância) com base nos dados de ESIMS, por injeção direta, dos extratos de espécies de Piper.

Este estudo preliminar permitiu obter uma visão geral das similaridades entre

as espécies e serviu como base para os experimentos realizados a seguir com o

emprego das técnicas analíticas de CLAE-EM e RMN de 1H, seguidos das análises

dos dados por PCA e HCA.


4.10.2 Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria

de massas

Visando complementar os estudos quimiométricos os extratos de P. caldense,

P. permucronatum e P. carniconnectivum foram preparados em triplicada e

analisados por CLAE-EM (Tabela 27).

Tabela 27. Espécies de Piper analisadas por CLAE-EM e RMN de 1H.

Espécie Código Local coleta

P. caldense K1209A Ubatuba-SP

K1209B Ubatuba-SP

K1209C Ubatuba-SP

K1569A Cunha-SP

K1569B Cunha-SP

K1581A Cunha-SP

P. permucronatum K1210A Ubatuba-SP

K1210B Ubatuba-SP

K1210C Ubatuba-SP

K1220A Ubatuba-SP

K1220B Ubatuba-SP

P. carniconnectivum K1441A Belterra-PA

K1441B Belterra-PA

K1441C Belterra-PA

K1600A Manaus-AM

K1600B Manaus-AM

A seguir são mostrados alguns cromatogramas de CLAE obtidos com o

detector UV em 254 nm (Figura 140). Neles são possíveis observar que os perfis

cromatográficos são diferentes em cada uma das plantas.


Figura 140. Cromatogramas CLAE-UV de alguns extratos.

Os cromatogramas de íons obtidos nas análises de CLAE foram convertidos

em ASCII e os dados submetidos às análises pelos métodos quimiométricos de PCA

e HCA.

Na análise de PCA foi possível observar três agrupamentos no gráfico de

scores (Figura 141). No grupo I estão reunidas todas as amostras de P.

permucronatum (K1210A, B e C e K1220A e B), que segundo o gráfico de loadings

(Figura 142) esta separação foi influenciada pela presença dos íons com m/z 287 e

167 Da, ambos observados no tempo de retenção de 13,1 min. O íon m/z 287 Da

corresponde à massa molecular da sakuranetina (6), identificada como metabólito

majoritário nos extratos de P. permucronatum, enquanto que o íon m/z 167 Da

corresponde ao íon proveniente de uma fragmentação do tipo Retro-Diels-Alder no

anel C da sakuranetina (6).

No grupo II estão as amostras de P. carniconnectivum (K-1441A e C), espécie

na qual foram identificadas as protoflavanonas 8 e 9. De acordo com o gráfico de

254 nm

-20 -10

0 10

Intens. [mAU]

0

100

200

Intens. [mAU]

0

50

100

Intens. [mAU]

0 50

100 150

Intens. [mAU]

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Time [min]

P. carniconnectivum K-1441


P. permucronatum

K-1220

P. caldense K-1209

8

10

11

5

7

12


loadings, a discriminação foi influênciada pela presença do íon com m/z 223 Da no

tempo de retenção 7,9 min, que corresponde provavelmente ao íon fragmentário

proveniente da fragmentação das protoflavanonas 8 e 9 com a saída do anel B não

aromático, conforme constatado durante a elucidação estrutural realizada

anteriormente para as substâncias puras.

No grupo III foram agrupadas as amostras de P. caldense (K-1209A, B e C),

P. carniconnectivum (K-1600A e B, K-1441B) além de K-1569A e B e K-1581A.

Neste caso o PCA não possibilitou a discriminação entre as espécies, e não foi

possível encontrar uma correlação entre o agrupamento observado e os valores

observados no gráfico de loadings com os metabólitos secundários identificados.

Figura 141. Gráfico de scores (PC1 v PC2) (82% de variância) com base nos dados de CLAE-EM, dos extratos de espécies de Piper.


Figura 142. Gráfico de loadings (82% de variância) com base nos dados de CLAE-EM dos extratos de espécies de Piper.

Dando sequência à análise dos dados empregou-se o HCA, utilizando o

método Ward com distancia euclidiana. Os resultados observados no dendrograma

(Figura 143) permitiram uma melhor visualização das similaridades entre as

espécies quando comparado ao PCA. A região pontilhada destacada no

dendrograma apresenta as espécies que estão agrupadas no grupo III do PCA, pelo

qual não foi possível obter uma boa discriminação entre as espécies, sendo agora

possível observar as similaridades entre elas.

Foram observados cinco agrupamentos, sendo o grupo I composto por todas

as amostras de P. permucronatum e o grupo II pelas amostras de P.

carniconnectivum coletadas em Belterra-PA (K-1441A e C). No entanto o espécime

K-1441B (grupo IV ) coletado na mesma região foi agrupado próximo às amostras de

P. caldense coletadas em Cunha-SP (K-1569 e K-1581). As amostras de P.

carniconnectivum coletadas em Manaus-AM (K-1600) foram também agrupadas

separadamente no grupo III, apesar de apresentarem em sua composição química

metabólitos secundários de mesmo esqueleto raro identificados nas espécies de P.


carniconnectivum coletadas em Belterra-PA do grupo II (K-1441A e C). As espécies

de P. caldense foram agrupadas no grupo III.

Figura 143. Gráfico de HCA para análise de CLAE-EM.

4.10.3 Ressonância magnética nuclear da fase orgânica

Os espectros de RMN de 1H da fase orgânica CHCl3 dos extratos obtidos

foram integrados e os dados submetidos aos métodos quimiométricos de PCA e

HCA. Alguns espectros são apresentados no APÊNDICE B, nos quais é possível

observar a presença de muitos sinais na região dos aromáticos, os quais podem ser

correlacionados com os metabólitos secundários identificados no estudo fitoquímico.

A análise do PCA foi realizada em diferentes faixas dos espectros e os

resultados não permitiram observar uma boa distinção entre as espécies, sendo

P. p

erm

ucro

natu

m

P. carn

iconn

ectivu

m

P. carn

iconn

ectivu

m

P. cald

ense

(IV)

(V)

(I) (II)

(III)


apresentados a seguir os resultados obtidos para a região de 8,0 ppm a 5,0 ppm,

correspondente aos hidrogênios olefínicos e aromáticos.

No gráfico de scores (Figura 144), os grupos I e II agruparam diferentes

espécies, sendo identificadas no grupo I as amostras de P. permucronatum e P.

carniconnectivum (K-1600A e B), que segundo o gráfico de loadings (Figura 145)

essa separação foi influênciada pelas variáveis 7,33, 6,89, 6,87, 6,07 e 6,05,

correspondentes aos sinais dos hidrogênios aromáticos das flavonas e flavanonas

presentes nestas amostras. No grupo II, estão agrupadas as amostras de P.

caldense, P. carniconnectivum (K-1441B) e P. permucronatum (K-1569 e K-1581).

De acordo com o gráfico de loadings, esse agrupamento foi influênciado pelas

variáveis na região de 5,1 ppm, região correspondente as duplas ligações presentes

nas unidades de prenila dos metabólitos secundários identificados em P. caldense.

O grupo III, que ficou bem diferenciado das demais amostras apresentou as

amostras K-1441A e C de P. carniconnectivum, planta na qual foram identificadas

duas novas protoflavanonas, e a variável que teve maior influência neste

agrupamento foi 6,09 ppm.


Figura 144. Gráfico de scores (PC1 v PC2) (66% de variância) com base nos dados de RMN de 1H (CDCl3), dos extratos de espécies de Piper.

Figura 145. Gráfico de loadings (82% de variância) com base nos dados de RMN de 1H (CDCl3) dos extratos de espécies de Piper.

Devido ao resultado apresentado não ser satisfatório para a distinção entre as

espécies, foi realizado um novo cálculo removendo da matriz inicial as amostras de

P. carniconnectivum K1441A e C. No gráfico de scores (Figura 146) obtido foi

possível verificar uma melhor discriminação entre as espécies analisadas, onde

foram observados quatro agrupamentos. No grupo I observou-se o agrupamento das


amostras de P. caldense. No grupo II, encontram-se apenas as amostras de P.

carniconnectivum K-1441B, no grupo II, P. carniconnectivum K1600A e B e no grupo

IV, P. permucronatum.

No gráfico de loadings (Figura 147) pode-se verificar que as variáveis

responsáveis pela separação observada são as mesmas observadas na análise

anterior, sendo possível observar apenas as influências dos sinais na região de 5,1

ppm para o agrupamento I formado pelas amostras de P. caldense, e os sinais

correspondentes aos hidrogênios aromáticos das flavonas de P. permucronatum

que contribuem para a formação do agrupamento IV.

Figura 146. Gráfico de scores (PC1 v PC2) (71% de variância) com base nos dados de RMN de 1H (CDCl3), dos extratos de espécies de Piper.


Figura 147. Gráfico de loadings (PC1 v PC2) (71% de variância) com base nos dados de RMN de 1H (CDCl3), dos extratos de espécies de Piper.

Dando sequência a análise dos dados empregou-se o HCA, utilizando o

método Ward com distância euclidiana. Os resultados observados no dendrograma

(Figura 148) permitiram uma melhor visualização das semelhanças entre as

espécies quando comparado ao PCA total. No dendrograma observa-se a formação

de sete agrupamentos definidos de acordo com a espécie. Os agrupamentos

observados foram semelhantes aos observados no PCA, no entanto foi possível

visualizar que algumas replicatas de P. permucronatum foram agrupadas no grupo

VI próximas à P. caldense, o mesmo vem acontecendo com as triplicatas de K-

1441B, grupo V.


Figura 148. Gráfico de HCA para análise de RMN de 1H da fase orgânica.

4.10.4 Ressonância magnética nuclear da fase hidroalcoólica

Para a fase hidroalcoólica foi utilizado o espectro de RMN de 1H na região de

10,0 a 5,0 ppm e de 4,6 a 0,9 ppm, alguns espectros estão apresentados no

APÊNDICE C. O gráfico de scores (Figura 149) apresentou 3 grupos, sendo que o

grupo I agrupou as amostras de P. caldense, P. permucronatum, P.

carniconnectivum (K1441A) e P. caldense (K1569 e K1581). No grupo II observou-se

apenas as replicatas de P. carniconnectivum K-1441B, e no grupo III P.

carniconnectivum (K1441C, K1600A e B). De acordo com o gráfico de loadings

(Figura 150) não foi possível estabelecer uma correlação significativa para a

distribuição observada, sendo assim, nesta análise de PCA pode-se verificar que a

(IV)

(V) (I) (II)

(III)

(VI)

(VII) P. p

erm

ucro

natu

m

P. carn

iconn

ectivu

m

P. carn

iconn

ectivu

m

P. cald

ense

P. cald

ense


metodologia empregada não foi satisfatória, pois não permitiu a distinção entre as

espécies.

Figura 149. Gráfico de scores (PC1 v PC2) (55% de variância) com base nos dados de RMN de 1H (D2O) dos extratos de espécies de Piper.

Figura 150. Gráfico de loadings (PC1 v PC2) (55% de variância) com base nos dados de RMN de 1H (D2O) dos extratos de espécies de Piper.

Os resultados obtidos para o HCA (Figura 151) foram semelhantes aos do

PCA no grupo I estão agrupadas as amostras de P. carniconnectivum (K-1441A/C e

K-1600A/B). As amostras de P. caldense e P. permucronatum aparecem em 3


grupos dentro de um grupo principal, delimitado pela linha tracejada. No grupo III,

estão agrupadas as amostras de P. caldense coletadas em Cunha-SP, no entanto

as amostras de P. caldense e P. permucronatum coletadas em Ubatuba-SP não

puderam ser discriminadas através desta metodologia e aparecem em ambos os

grupos IV e V.

Figura 151. Gráfico de HCA para análise de RMN de 1H da fase hidroalcoólica.

(IV)

(I)

(II)

(III) P. cald

ense

P. carn

iconn

ectivu

m

P. cald

ense

P

. p

erm

ucro

natu

m

P. cald

ense

P

. p

erm

ucro

natu

m

(V)


Neste estudo baseado em análises quimiométricas foi possível obter algumas

conclusões sobre as espécies analisadas. Os espécimes de P. carniconnectivum

coletados em Manaus-AM e Belterra-PA, apresentaram-se em todos os momentos

em grupos distintos apesar de se tratarem da mesma espécie. Além disso, o

espécime K-1441B apesar de ser identificado como P. carniconnectivum se

assemelhou à P. caldense em todas as análises. Diversos fatores podem estar

relacionados a essa observação como, por exemplo, pode se tratar de outra espécie

ou variedade da mesma.

As espécies de P. permucronatum apresentaram-se no mesmo grupo ou

muito próximas ao longo de todo o estudo. As amostras de P. caldense foram

agrupadas na maioria das vezes, sendo que as amostras K-1569 e K-1581

apresentaram uma maior similaridade entre si do que com a K-1209, esse fato pode

estar associado ao local de coleta, que para K-1209 foi Ubatuba-SP e as demais

Cunha-SP.

Dentre as técnicas utilizadas o RMN de 1H da fase hidroalcoólica dos extratos

foi a qual apresentou resultados menos satisfatórios com a discriminação entre dois

grandes grupos, de um lado P. carniconnectivum e de outro P. caldense e P.

permucronatum, não sendo possível uma diferenciação entre essas últimas.


4.11 Vias biossintéticas envolvidas na formação dos metabólitos

secundários identificados

A ocorrência de derivados de ácidos benzoicos prenilados e flavonoides é

frequente em espécies de Piper (Flores et al., 2009; Freitas et al., 2009; Lago et al.,

2004; Yamaguchi et al., 2011). As rotas biossintéticas que levam a formação desses

metabólitos podem ser inferidas com base nas descritas na literatura e envolve as

vias do chiquimato e do MVA/MEP (Harborne, 1994; Kellogg; Poulter, 1997).

Os meroterpenos identificados neste estudo possuem rotas biossintéticas

bem conhecidas, sendo a parte aromática proveniente da via do chiquimato gerando

os substratos ácido p-hidroxibenzoico e ácido protocatecuico. As preniltransferases

aromáticas catalisam a transferência de unidades de IPP, GPP, FPP e GGPP para

moléculas aceptoras aromáticas, como os derivados de ácidos benzoicos, e são

responsáveis pela origem de uma enorme diversidade de metabólitos secundários

em plantas, fungos e bactérias (Heide, 2009; Lopez et al., 2010).

Nos flavonoides, o anel B e parte do anel heterocíclico (anel C) são

provenientes do ácido cinâmico e seus análogos, oriundos da via do chiquimato. A

formação do esqueleto carbônico de flavonoides é catalisada pelas chalcona

sintases através de reações de condensação e ciclização de três unidades de

malonil-CoA. Outras enzimas como chalcona isomerases e hidroxilases estão

envolvidas para obtenção do produto final (Harborne, 1994). No entanto, apesar da

biossíntese de flavonoides ser bem conhecida, a oxidação e redução do anel B dos

protoflavonoides é uma etapa de grande relevância sob o ponto de vista de reações

enzimáticas inusitadas. Fato bastante intrigante é a ocorrência dos protoflavonoides

em espécies primitivas de plantas e a sua detecção em espécies de Piper (Figura

152).


Figura 152. Biossíntese de meroterpenos e flavonóides em espécies de Piper.

OH

OH

COOH

COOH

OCH3

COOH

COOH

OH

O

OH

OH

O

O

H3CO

OH

O

O

H3CO

OH

O

OH

O

OOH

R

RO

OH

R

R

O

OOH

H3CO

H3CO

O

OH

Via do

chiquimato

DMAPP

DMAPP

GGPP

GGPP

preniltransferases

preniltransferasespreniltransferases

preniltransferases

Chalcona sintases

Malonil-CoA

Via do

MVA/MEP

P. bowiei

P. bowieiP. caldense

P. permucronatumP. carniconnectivum

P. carniconnectivum

P. carniconnectivum

P. caldense

OH

COOH

ácido 4-hidroxibenzoico

OH

OH

COOH

ácido protocatecuico

OH

O

SCoA

O

OH

OH

O

OH

H3CO

Ácido cinâmico

4-cumaroil-CoA

Ácido ferrúlico

Conclusões 181

5. CONCLUSÕES

O estudo fitoquímico das espécies de Piper descritas abaixo resultou no

isolamento e identificação de treze substâncias. De P. bowiei foram identificados

dois cromenos (1 e 2) e uma flavanona (6), de P. permucronatum uma flavona (3) e

uma flavanona (7), de P. caldense uma flavona (4) e um derivado de ácido benzoico

prenilado (12) e de P. carniconnectivum uma flavona (5), um derivado de ácido

benzoico prenilado (13), duas protoflavanonas (8 e 9) e duas protoflavonas (10 e

11). As substâncias 8, 9, 10, 11, 12 e 13 são descritas pela primeira vez neste

trabalho.

Das substâncias isoladas, quatro delas apresentaram estruturas raras, sendo

que as protoflavanonas 8 e 9 foram avaliadas quanto à sua atividade antileucêmica

apresentando resultados promissores na buscas de substâncias antitumorais. As

protoflavonas 10 e 11 serão submetidas aos mesmos ensaios posteriormente.

Os resultados obtidos nas análises de PCA e HCA permitem concluir que as

técnicas analíticas EM, CLAE-EM e RMN de 1H em conjunto com a quimiometria

apresentam-se como uma potencial ferramenta na avaliação de dados provenientes

de matrizes complexas, como os extratos de plantas.

O teste de hipóteses no qual a química de espécies de Piper com frutos

pendentes e globosos foi avaliada quanto à composição química comparada aos

outros tipos de frutos indicou que não há relação aparente. As espécies de Piper

para os quais foram descritos ácidos benzoicos prenilados incluem Piper

crassinervium e P. gaudichaudianum (Lago et al., 2004). Uma avaliação das

relações entre essas espécies poderá ser realizada com a obtenção de sequências

de DNA.

Conclusões 182

A ocorrência de protoflavanonas é bastante limitada às Pteridofitas com cerca

de 20 ocorrências. O único relato em Angiospermas refere-se à ocorrência em

Ongokea e os dados aqui obtidos para Piper constituem-se em fatos inéditos. De

qualquer maneira, a perda de aromaticidade através de processos químicos ou

enzimáticos constitui-se num processo energeticamente desfavorável e a descrição

desse processo biossintético seria de grande relevância.

Referências 183

6. REFERÊNCIAS

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Apêndice 190

APÊNDICE A –Espectros de massas por injeção direta dos

extratos analisados por PCA

Figura A1. Espectros de massas obtidos por EM-ESI (Infusão direta) de K-484F, K-842F, K-842Fr, K-842S e K-842G.

Figura A2. Espectros de massas obtidos por EM-ESI (Infusão direta) de K-951F, K-951Fr, K-951S, K-951G, K-951R e K-951C.

Apêndice 191

Figura A3. Espectros de massas obtidos por EM-ESI (Infusão direta) de K-310F, K-364F, K-976F, K-978F e K-991F.

Apêndice 192

APÊNDICE B - Espectros de RMN de 1H dos extratos

analisados por PCA (fase orgânica)

Figura B1. Espectros de RMN de 1H, das espécies analisadas por PCA e HCA (500 MHz, CDCl3).

9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm



P. permucronatum K-1220

P. caldense K-1209

P. caldense K-1569

P. caldense

K-1581

Apêndice 193

APÊNDICE C - Espectros de RMN de 1H dos extratos

analisados por PCA (fase hidro alcoólica)

Figura C1. Espectros de RMN de 1H, das espécies analisadas por PCA e HCA (500 MHz, D2O).

9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm



P. permucronatum K-1220

P. caldense K-1209

P. caldense K-1569

P. caldense K-1581

Súmula curricular 194

SUMULA CURRICULAR

DADOS PESSOAIS

Nome: Giovana Cássia de Freitas Lemeszenski

Local de nascimento: Valinhos-SP

Data de nascimento: 21 de março de 1983

EDUCAÇÃO:

Ensino Médio: Fundação Bradesco – Campinas-SP

1998-2000

Ensino Técnico: Fundação Bradesco – Campinas-SP

Técnico em informática

2001-2002

Graduação: Universidade Federal de São Carlos – UFSCar

Bacharelado em Química

2003-2006

Doutorado direto: Universidade de São Paulo-USP

Instituto de Química

Doutorado em Química

2007-2013


FORMAÇÃO COMPLEMENTAR:

2011 Validação de Métodos em Espectrometria de Massas.

Sociedade Brasileira de Espectrometria de Massas

2009 Oficina de Filogenia. Universidade de São Paulo, USP, Brasil.

2007 Proteção Radiológica 2007. Universidade de São Paulo, USP, Brasil.

2006 Química de Materiais de Revestimento. Universidade de São Paulo, USP, Brasil.

2006 Descoberta de Novos Fármacos: Estratégias Clássicas. Universidade Federal de São Carlos, UFSCAR, Brasil.

2006 Macromoléculas como Alvos para Produção de Fármaco. Universidade Federal de São Carlos, UFSCAR, Brasil.

2005 RMN Aplicada a Alimentos. Universidade Federal de São Carlos, UFSCAR, Brasil.

2005 Análise Orgânica de Ambientes e Amostras Forenses. Universidade Federal de São Carlos, UFSCAR, Brasil.

2005 The Biology, Chemistry and Genetics of Endophytes. Universidade Federal de São Carlos, UFSCAR, Brasil.

2005 Planejamento Síntese e Avaliação Farmacológica. Universidade Federal de São Carlos, UFSCAR, Brasil.

OCUPAÇÃO PROFISSIONAL:

Universidade de São Paulo-USP

Instituto de Química – Central Analítica

Especialista de laboratório, 2010 – atual


BOLSAS:

Bolsista de mestrado: CNPQ – mar/2007 – ago/2007

Bolsista de mestrado: FAPESP – set/2007 – fev/2009

Bolsista de doutorado direto: FAPESP – mar/2009 – fev/2010

MONITORIAS:

Programa de Aperfeiçoamento de Ensino da USP:

1º sem/2008 – Química Orgânica III –Prof. Dr. Massuo Jorge Kato

2º sem/2008 – Química Geral – Profa. Dra. Denise Freitas S. Petri

2º sem/2009 – Química Geral – Prof. Dra. Dalva Lúcia de Farias

ARTIGOS COMPLETOS PUBLICADOS EM PERIÓDICOS

1. Yamaguchi, Lydia F.; Freitas, Giovana C.; Yoshida, Nidia C.; Silva, Renata A. ;

Gaia, Anderson M.; Silva, Adalberto M.; Scotti, Marcus T.; Emerenciano, Vicente

de P.; Guimarães, Elsie F. ; Floh, Eny I. S.; Colombo, Carlos A.; Siqueira, Walter

J.; Kato, Massuo J. Chemometric analysis of ESIMS and NMR data from Piper species. Journal of the Brazilian Chemical Society, v. 22, p. 2371-2382, 2011.

2. Freitas, Giovana C.; Kitamura, Rodrigo O. Saga; Lago, João Henrique G.; Young, Maria Claudia M.; Guimarães, Elsie F.; Kato, Massuo J. Caldensinic acid, a prenylated benzoic acid from Piper caldense. Phytochemistry Letters v. 2, p. 119-122, 2009.


TRABALHOS APRESENTADOS EM CONGRESSOS 1. FREITAS, G. C.; KATO, M. J. Occurence of protoflavanones in Piper

carniconnectivum. 2011. (Apresentação de Trabalho/Congresso).

2. KATO, M. J.; YAMAGUCHI, L. F.; FREITAS, G. C.; YOSHIDA, N. C.; SILVA, R.

A.; GAIA, A. M. Análisis Metabolomico de Espécies de Piperaceae

Empleando ESI-EM, RMN de 1H y Análisis Multivariado. 2010. (Apresentação

de Trabalho/Congresso).

3. FREITAS, G. C.; KATO, M. J. ; YAMAGUCHI, L. F.; SCOTTI, M.T. Multivariate

data analysis on ESIMS data of Piper species. 2009. (Apresentação de

Trabalho/Congresso).

4. FREITAS, G. C.; KATO, M. J. Carniconnectivone, a novel protoflavanone

from Piper carniconnectivum. 2009. (Apresentação de Trabalho/Congresso).

5. FREITAS, G. C.; KATO, M. J.; YAMAGUCHI, L. F. Análise multivariada por

ESIMS em espécies de Piper. 2009. (Apresentação de Trabalho/Conferência

ou palestra).

6. FREITAS, G. C.; KATO, M. J. Flavona em folhas de Piper caldense

(Piperaceae). 2008. (Apresentação de Trabalho/Congresso).

Anexos 198

ANEXO A - Cálculos de DFT das substâncias 8 e 9

Os cálculos de DFT dos espectros de dicroísmo circular das substâncias 8 e 9

foram realizados com a finalidade de determinar a configuração absoluta de ambas

substâncias. Esse trabalho foi realizado em colaboração com o Dr. João Marcos

Batista Junior, UNESP e faz parte do artigo em fase de submissão “Antileukemic

non-aromatic B-ring flavanones from Piper carniconnectivum C. DC”.

.

Methodology

All DFT and TDDFT calculations were carried out at 298 K in MeOH or EtOH

solution using the PCM solvent model incorporated in Gaussian 09 software.

Regarding compound 8, the calculations were performed for the arbitrarily chosen

(2S,1’R)- and (2S,1’S)-8. The theoretical spectra of their enantiomers were

generated by multiplying the obtained spectra by (-1). Conformational searches were

carried out at the molecular mechanics level of theory with the Monte Carlos

algorithm using the MMFF force field implemented in Spartan 08 software package.

For (2S,1’R)-8, eleven conformers with relative energy (rel E.) within 10 kcal/mol of

the lowest-energy conformer were selected and further geometry optimized at the

B3LYP/PCM/6-31G(d) level in EtOH. From these, the two conformers indentified

within an energy window of 2.0 kcal/mol, which corresponded to 96% of the total

Boltzmann distribution, were selected for EA and ECD spectral calculations. As for

(2S,1’S)-8, the nine conformers with rel E. within 10 kcal/mol identified at the

molecular mechanics level were selected and further geometry optimized at the

B3LYP/PCM/6-31G(d) level in EtOH. From these, two conformers were found within

an energy window of 2.0 kcal/mol (> 97% of the total Boltzmann distribution), which

Anexos 199

were selected for EA and ECD spectral calculations. The Boltzmann factor for each

conformer was calculated based on Gibbs free energy. Vibrational analysis at the

B3LYP/PCM/6-31G(d) in EtOH level resulted in no imaginary frequencies, confirming

the considered conformers as real minima. TDDFT was employed to calculate

excitation energy (in nm), oscillator strength (dimensionless), and rotatory strength R

in dipole velocity (Rvel in cgs units: 10–40 esu2 cm2) form, at the B3PW91/PCM/TZVP

level in EtOH. The calculated oscillator and rotatory strengths from the first 15 singlet

electronic transitions were simulated into an EA and ECD curve, respectively, using

Gaussian band shapes and 10 nm half-width at 1/e of peak height. Regarding

compound 9, the calculations were performed for the arbitrarily chosen (2S,1’R,2’R)-

and (2S,1’R,2’S)-9. Conformational searches were also run at the molecular

mechanics level using the same algorithm, force field, and software as described

above. For (2S,1’R,2’R)-9, 28 conformers with rel E. within 10 kcal/mol of the lowest-

energy conformer were selected and further geometry optimized at the

B3LYP/PCM/6-31G(d) level in MeOH. From these, the seven conformers indentified

within an energy window of 1.5 kcal/mol, which corresponded to 94% of the total

Boltzmann distribution, were selected for EA and ECD spectral calculations at the

B3PW91/PCM(MeOH)/TZVP level. As for (2S,1’R,2’S)-9, the 34 conformers with rel

E. within 10 kcal/mol identified at the molecular mechanics level were selected and

further geometry optimized at the B3LYP/PCM/6-31G(d) level in MeOH. From these,

eight conformers were found within an energy window of 1.5 kcal/mol (> 92% of the

total Boltzmann distribution), which were selected for EA and ECD spectral

calculations at the B3PW91/PCM(MeOH)/TZVP level. The Boltzmann factor for each

conformer was also calculated based on Gibbs free energy. Vibrational analysis at

the B3LYP/PCM(MeOH)/6-31G(d) level also resulted in no imaginary frequencies.

Anexos 200

The TDDFT theoretical EA and ECD spectra were simulated from the first 20 singlet

→ singlet electronic transitions using Gaussian band shapes and 10 nm half-width at

1/e of peak height. All the predicted wavelength transitions were used as such

without any scaling.

Results

The planar structures of compounds 8 and 9 were firmly established

elucidated but the free rotation of the non-aromatic B ring precluded the

determination of its relative configurations. Thus, the assignment of their absolute

configurations was attempted using TTDFT calculations of ECD spectra. The

calculations were performed considering all possible stereoisomers, namely, 2S,1’R;

2S,1’S; 2R,1’S and 2R,1’R. Nevertheless, the calculations were carried out only for

the diastereomers (2S,1’R)- and (2S,1’S)-8 while the spectra of their corresponding

enantiomers were generated by multiplying the obtained spectra by (-1). After

conformational analysis and geometry optimization steps only two conformers of

each configuration (2S,1’R)- and (2S,1’S)-8 were found to predominate (Figure D1).

These conformers, which differed mainly with respect to the relative positioning of the

rotatable aromatic OCH3 groups, were used to simulate the ECD curves at the

B3PW91/TZVP//B3LYP/6-31G(d) level in EtOH using PCM method.

Anexos 201

Figure D1. Optimized structures and relative energies [B3LYP/PCM(EtOH)/6-31G(d)] of the two lowest-energy conformers of (2S,1’R)-8 (upper frame) and (2S,1’S)-8 (lower frame) used for ECD calculations at the B3PW91/PCM/TZVP level in EtOH.

The overall pattern of the calculated weighted ECD spectrum for (2S,1’R)-8

was consistent with those of the experimental one, i.e., a positive Cotton effect (CE)

near 325 nm, a negative CE around 280, and a positive CE at around 250 nm (Figure

y). The predicted transition wavelengths were not scaled since a uniform scaling

factor may not be satisfactory for all electronic transition energies (Polavarapu et al.,

2011). Regarding the configuration (2S,1’S)-8, the calculated spectrum presented

basically the same sign and intensity for the first two CEs (~325 and 280 nm) as

those of (2S,1’R)-8. However, the CE for the highest-energy transition at around 250

nm was of opposite sign (Figure D2). The electronic transitions in question involved

mainly alkene and aromatic -* transitions (250 and 280 nm, respectively) with

some charge transfer (alkene to carbonyl) contribution as well as ketone n-*

transitions (325-350 nm). These findings allowed us to determined unambiguously

the absolute configuration of ()-8 as 2S,1’R.

Anexos 202

Figure D2. Center: experimental ECD spectrum of ()-8 in EtOH assigned as 2S,1’R. Lower frame: calculated ECD spectrum [B3PW91/TZVP//B3LYP/6-31G(d) in EtOH using PCM] of the Boltzmann average of the two lowest-energy conformers of the corresponding (2S,1’R)-8. Upper frame: calculated ECD spectrum [B3PW91/TZVP//B3LYP/6-31G(d) in EtOH using PCM] of the Boltzmann average of the two lowest-energy conformers of the corresponding (2S,1’S)-8. The bars represent the rotational strengths for the weighted ECD spectrum.

The experimental ECD spectrum of 9 was very similar to that of compound ()-

8 suggesting its absolute configuration also as 2S,1’R, which was confirmed by

TDDFT calculations at the B3PW91/TZVP//B3LYP/6-31G(d) level in MeOH using

PCM (Figure D2). Nevertheless, these calculations did not allow the determination of

absolute configuration of the stereogenic center at C-2’. The theoretical spectra for

both diastereomers (2S,1’R,2’S)- and (2S,1’R,2’R)-9 were indistinguishable (Figure

D3) possibly because the introduction of a new stereogenic center do not perturb

Anexos 203

significantly the transitions of the dominant benzoyl chromophore or those of the

carbonyl group at position C-4’.

Figure D3. Center: experimental ECD spectrum of ()-9 in MeOH. Lower frame: calculated ECD spectrum [B3PW91/TZVP//B3LYP/6-31G(d) in MeOH using PCM] of the Boltzmann average of the seven lowest-energy conformers of the corresponding (2S,1’R,2’S)-9. Upper frame: calculated ECD spectrum [B3PW91/TZVP//B3LYP/6-31G(d) in MeOH using PCM] of the Boltzmann average of the eight lowest-energy conformers of the corresponding (2S,1’R,2’R)-9. The bars represent the rotational strengths for the weighted ECD spectrum.

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