HPLC-CHIP-MS versus HPLC-MS aplicado a análise de esteróides
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Universidade Federal de Goiás Programa de Pós-Graduação – Instituto de Química Seminário de Microfluídica Msc. Kelly da Silva Bezerra Goiânia 2013 HPLC-CHIP-MS aplicado a análise de esteróides
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Universidade Federal de Goiás
Programa de Pós-Graduação – Instituto de Química
Seminário de Microfluídica
Msc. Kelly da Silva Bezerra
Goiânia
2013
HPLC-CHIP-MS aplicado a análise
de esteróides
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Esteróides
Derivados do anel tetracíclico ciclopentanoperidrofenantreno
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São sintetizados a partir do colesterol, na mitocôndria e retículo endoplasmático
liso de células do córtex adrenal, gónadas, e pela placenta, através de uma
série de reações enzimáticas, principalmente, nas glândulas supra-renais.
Glicocorticóides
mineralocorticóides
sexuais (andrógenos e estrógenos)
vitamina D
Estão envolvidos no regulamento de várias vias metabólicas:
funções de reprodução,
metabolismo energético,
equilíbrio de água e sal
funções comportamentais e cognitivas.
Seus efeitos positivos sobre a força muscular e ações anabolizantes, servem
como agentes dopantes.
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Uma abordagem que permite a detecção e quantificação de esteróides e seus metabólitos em
concentrações biologicamente relevantes aumentará o estudo desses compostos e ajudará a
entender melhor as múltiplas funções biológicas em que estão envolvidos.
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As concentrações de muitos esteróides pode variar consideravelmente durante as
diferentes fases da vida, incluindo a idade, estágio da gravidez, ciclo menstrual,
doenças e tratamentos com drogas diversas.
A determinação quantitativa desses componentes é um instrumento valioso,
por exemplo, em estudos clínicos, diagnóstico de doenças endócrinas e
controle de doping.
No entanto, a análise de esteróides em amostras biológicas é um desafio
devido à complexidade das matrizes biológicas e as concentrações baixas
dos mesmos.
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Imunoensaios: são geralmente rápidos e sensíveis, mas a reatividade cruzada
com os compostos estruturalmente relacionados, bem como efeitos de matriz
muitas vezes compromete a sensibilidade, especificidade e precisão do método.
ANÁLISE DE ESTERÓIDES
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Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC-MS): muitas
vezes requer procedimentos de pré-tratamento de amostras complexas incluindo
a hidrólise dos esteróides conjugados e derivatização. Além disso, o processo de
ionização conduz a uma fragmentação extensa de esteróides diminuindo a
especificidade do método.
ANÁLISE DE ESTERÓIDES
O processo de
derivatização oferece
maior
termoestabilidade,
polaridade mais baixa
e pico bem definido.
Amostras com grupos
funcionais hidroxila,
ácido carboxílico,
amina, fosfato e tiol,
passam pelo processo
de derivatização.
HPLC-MS tem sido cada vez mais utilizado para a análise quantitativa de
esteróides livres e conjugados a partir de fluidos biológicos, com o
desenvolvimento de diversos métodos.
A ionização por ESI, APCI e APPI têm sido aplicada a análise de
esteróides. Embora estas técnicas de ionização possam proporcionar alta
eficiência, sua sensibilidade pode ser melhorada através da derivatização
dos mesmos.
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ANÁLISE DE ESTERÓIDES
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HPLC-Chip/MS
A microfluídica combina fluidos, transportes térmicos, mecânicos, eletrônicos
e ópticos com química, termodinâmica, biologia e reações cinéticas.
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ELETROFORESE E MASSAS
Eletroforese é utilizado para separar, quantificar, enriquecer e purificar
biomoléculas que diferem na sua carga eléctrica ou polaridade
Espectrometria de massas é utilizada para identificar, quantificar e elucidar estruturas
de compostos com alta especificidade e confiabilidade
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Em CE-MS, o circuito elétrico envolvido na separação eletroforética, a
baixa velocidade do fluxo eletrosmótico e a natureza do eletrólito de
separação são parâmetros importantes para o acoplamento dessas
técnicas.
As três configurações comumente utilizadas para o acoplamento entre
CE e MS são:
com líquido auxiliar coaxial (coaxial sheath liquid);
com junção líquida (liquid junction);
sem líquido auxiliar (sheathless ou nanospray).
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Esta interface é, conceitualmente, a mais
simples e a mais adequada porém,
experimentalmente, é a mais difícil para o aco-
plamento CE-ESI-MS. A maior dificuldade
experimental é manter simultaneamente os
circuitos elétricos de CE e ESI.
Limitações: tempo curto de vida; a montagem
delicada da interface; necessidade de
recobrimentos de ótima qualidade para o
funcionamento adequado; formação de
espécies químicas em decorrência de reações
eletroquímicas nesta superfície.
Os limites de detecção atingidos com essa
técnica são os mais baixos dentre as interfaces
disponíveis, porque não ocorre diluição do
efluente eletroforético com o líquido auxiliar.
deposição de um filme
fino de material condutor
na extremidade do
capilar
A estabilidade do spray
é auxiliada
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Nanofluxo combina alta resolução cromatografia e
elevada sensibilidade, devido ao pequeno diâmetro
interno da coluna e fluxo baixo na análise.
Utilizando uma coluna de enriquecimento antes da
nano-coluna serve para concentrar a amostra e
permite que o carregamento da amostra.
HPLC E SISTEMAS NANO
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O sistema consiste:
bomba de HPLC binária ligado a uma coluna por união T usada para dividir o
fluxo entre CE e nanosplitter, respectivamente.
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Em cromatografia de nanofluxo pode ocorrer
dispersão de picos originados da ligação dos
capilares e acessórios.
Em um sistema convencional de nanospray a
contribuição relativa de todos os volumes
conectados ao capilar podem atingir até 45%
do volume do pico, causando grande
dispersão e alargamento.
Nanospray também pode gerar o entupimento
ou vazamento de colunas e agulhas, sendo
um agravante para a técnica.
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A pequena quantidade de amostra efetivamente
consumida por estes estudos sugerem que nano-LC/MS,
em conjunto com nano-ESI, pode aumentar ainda mais a
sensibilidade e eliminar efeitos de matriz
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Os dispositivos microfluídicos são circuitos de
minúsculos canais fechados e poços, gravados
em um corpo de plástico ou microchip.
Forças de pressão ou eletrocinéticas
empurram pequenos volumes de fluidos
através de caminhos selecionados de forma
controlada. Estes podem incluir elementos, tais
como bombas, válvulas, câmaras de mistura e
de reação e canais de separação.
A tecnologia elimina 50% dos acessórios e
ligações tradicionais tipicamente requeridas
num sistema nanofluxo, reduzindo
drasticamente a possibilidade de vazamentos
no sistema.
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O HPLC-Chip integra a preparação e
separação de analitos através de um único
chip o qual contém uma ponta de
eletrospray. Ele também inclui um
pulverizador que interage de forma eficiente
com o espectrômetro de massas, permitindo
que compostos separados, tais como
esteróides, possam ser identificados e
quantificados.
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A peça central é um micro chip de polímero reutilizável. Integra o
enriquecimento das amostras e de colunas de separação com as
conexões e ponta de pulverização utilizada em espectrometria de massa
diretamente sobre o chip de polímero.
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O HPLC-chip cube com interface MS contém:
mecanismo de carregamento para posicionamento do
chip;
microválvula para nano-LC;
conexões hidráulicas e comutação de fluxo;
fonte de nanospray com câmera para visualização do
spray.
Posiciona automaticamente e precisamente o chip
com a ponta de pulverização ortogonal à entrada MS
para assegurar o máximo de sensibilidade e robustez,
e faz todas as conexões elétricas e hidráulicas
necessárias com o chip.
É possível especificar um chip para cada tipo de
aplicação, devido a facilidade de manuseio do
sistema, reduzindo o risco de contaminação cruzada.
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Configurando a bomba de carregamento e de análise e especificando o
volume entre o auto-amostrador e a coluna de enriquecimento (volume de
descarga de injeção) é possível calcular automaticamente o tempo
necessário para eficazmente carregar a amostra. No tempo finalizado a
microválvula muda automaticamente do modo de enriquecimento para
modo de análise e o gradiente de bomba começa a funcionar.
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Processo de fabricação HPLC-Chip:
A ablação a laser do filme de poliimida é usado para criar estruturas de superfície
necessária para o layout do HPLC-Chip.
5) No passo final a superfície é
metalizada para alta tensão de
eletrospray.
1) O laser cria as
microestruturas diretamente
sobre a superfície de poliimida.
2) A superfície é limpa.
3) Uma ou várias camadas de
poliimida contendo
características diferentes, tais
como colunas analíticas, filtros
e orifícios de acesso de
fluidos, são laminadas em
conjunto.
4) O chip é recortado e a
ponta do eletrospray é inserida
diretamente no chip por
ablação a laser.
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Estruturas de superfície necessária para HPLC-Chip:
1) Ablação a laser da ponta de pulverização
2) Coluna enriquecimento
3) Coluna analítica com material de embalagem
4) Canais integrados
5) Microfiltros.
A laminação de várias camadas de poliimida em conjunto permite a criação
de multi-funções nos chips. A integração de componentes reduz a
complexidade e melhora a robustez.
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Um chip é inserido na interface, o qual é montado sobre o
espectrômetro de massas, e sua posição assegura que a
ponta de eletropulverização está na posição ideal para
análise de massa, quando a ficha é inserida.
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A segunda geração de tecnologia
de HPLC-Chip incorpora um filtro
de carbono para melhorar as
características de superfície, com
contato ótimo e selagem, bem
como a redução de fricção entre
o rotor e o chip. Estas melhorias
aumentam a vida útil do chip
diminuindo o custo por análise,
assim como melhora a
reprodutibilidade do método.
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A microválvula utiliza um stator fixo com rotores concêntricos para carregar os
solventes e amostra para as diferentes camadas do HPLC-Chip. Cada rotor
pode operar independentemente um do outro e podem girar 360°.
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ANÁLISE EXPERIMENTAL:
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"Os cientistas devem gastar seu tempo no laboratório fazendo experimentos
significativos para descoberta e análise de novos compostos importantes
para o conhecimento cientifico e não em busca de vazamentos, controle de
sistemas dentre outros ajustes experimentais”
Dr. Manfred Raida, Centro Terapêutico Experimental, Cingapura.
"A introdução da tecnologia de chip de HPLC representa um salto quântico
no desenvolvimento de nano-HPLC. O principal benefício para o nosso
laboratório tem sido o aumento significativo da produtividade já que as
pessoas que não têm experiência em técnicas de separações HPLC,
facilmente possam executar a técnica de análise em rotina“
Dr. Tasso Miliotis, Astra Zeneca, Suécia.
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Parte experimental
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Foi realizada a análise de 9 esteróides derivatizados e 8 esteróides não derivatizados no
plasma de rato. Solução de Ringer foi utilizada como matriz do plasma artificial.
Amostras para as experiências com esteróides derivatizados: foram preparadas por
dissolução da analitos em metanol. A curva de calibração com níveis de concentração de
0,075-75.0 nM variando em 0,75 nM, 180 nM e 40 µL com adição de 10 nM de padrão
interno, foi construída. As amostras foram então derivatizadas
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Amostras com os esteróides não derivatizados: foram preparadas por dissolução
dos analitos em acetonitrila. Diluições posteriores foram realizadas com uma
mistura de eluentes. Solução de Ringer com 4% (w/v) de BSA foi a matriz de
plasma artificial para a preparação da curva de calibração. A curva foi construída
com concentrações de 0,075 a 100,0 nM variando em 0,75 nM.
Sistema de HPLC convencional e as condições
cromatográficas:
- micro desgaseificador,
- bomba binária em uma configuração de baixo -
atraso de volume
- amortecedor
- misturador de bypass
- amostrador automático de alto desempenho
- termostato de coluna (operado a 48 °C)
Uma coluna Zorbax SB-C18 foi usada e ligada à
fonte de ESI do espectrômetro de massas (triplo
quadrupolo). A taxa de fluxo foi de 0,2 mL min-1 e o
volume de injeção foi de 40 µL.
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HPLC-Chip/MS e condições cromatográficas:
- cromatógrafo líquido com bomba capilar
- desgaseificador
- instrumento Nanopump com desgaseificador
- termostato
- amostrador automático com micropoços (mantido a
4°C)
- interface HPLC-Chip/MS integrado com coluna de
40 nL de enriquecimento de ZORBAX SB-C18 e
coluna analítica de separação ZORBAX SB-C18 e
um emissor de nanospray.
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Compound Precursor ion
(m/z)
Product ion
(m/z)
Collision energy (eV) Fragmentor voltage (eV)
HPLC-
Chip/MS
LC-ESI/MS HPLC-
Chip/MS
LC-ESI/MS
17-OH-PROG 361 112 35 35 190 110
17-OH-PREG 348 330 2 2 115 80
PREG 332 86 30 30 190 160
AN 317 112 30 30 190 170
d3-T 307 124 30 30 170 150
AND 306 255 15 20 165 160
DHT 306 81 40 35 200 200
DHEA 304 253 15 17 165 140
T 304 124 30 35 210 190
ES 286 253 10 12 160 130
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Na análise SRM, os íons dos produtos monitorados foram escolhidos a fim de
conseguir sensibilidade e seletividade máximas.
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O tamanho das partículas na coluna convencional foi muito menor (1,8 µm) do que
na coluna analítica no HPLC-chip-MS.
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LOD foram ligeiramente mais elevados para o sistema HPLC-Chip/MS em comparação com
HPLC-MS/MS. Com ambos os sistemas, os RSDs para os tempos de retenção foram
inferiores a 1,0% e inferior a 11% para as áreas de pico, indicando assim a repetibilidade
cromatográfica e quantitativa.
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LODs foram cerca de cinco a sete vezes maior do que as determinadas para os esteróides
derivatizados. Os RSDs foram inferiores a 0,5% para os tempos de retenção, e abaixo de
10% para as áreas de pico, indicando assim boa repetibilidade, comparáveis com os
obtidos para os esteróides derivatizados.
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8 amostras de plasma de rato do sexo
feminino e 7 masculino.
As concentrações de CORT foram seis vezes
maior em mulheres do que em homens.
Dos outros esteróides, A, T, e AN foram
detectados em alguns dos indivíduos do
sexo masculino, mas não nas amostras do
sexo feminino.
Nenhum dos compostos restantes foi
detectado em todas as amostras.
Conclusões
A sensibilidade do sistema HPLC-Chip/MS foi cerca de 50 vezes melhor do que com o sistema
HPLC-MS/MS quando os limites de detecção são apresentados como valores de volume de
amostra injetado, mas ligeiramente pior quando são apresentados como concentrações na amostra.
A utilização do sistema de HPLC-Chip/MS é vantajosa quando o volume de amostra é limitado, o
que é frequentemente o caso na análise de amostras biológicas.
O sistema integrado HPLC-Chip/MS é muito mais fácil de usar que o sistema HPLC-MS/MS.
Ambos os métodos mostraram boa linearidade e repetibilidade quantitativa.
A resolução dos picos no sistema HPLC-Chip/MS foi pior do que o HPLC-MS/MS, no entanto, esta
comparação não pode ser generalizada, devido às diferenças nos tamanhos de partículas das
colunas.
Ao comparar a análise de esteroides derivatizados e esteróides não derivatizados usando o sistema
HPLC-Chip/MS, os resultados mostraram que a sensibilidade com derivatizados é de
aproximadamente uma ordem de magnitude maior do que com os não derivatizados.
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REFERÊNCIAS
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OBRIGADA PELA ATENÇÃO
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