Identificação de Bactérias com Potencial de Degradação do ... · Aluno do Curso de Ciências...

Trabalho de Conclusão de Curso

Identificação de Bactérias com Potencial de Degrada ção do Herbicida 2,4-D com o Auxílio da Bioinformática

Angel Silva Gomes

Rio de Janeiro Julho de 2012

ANGEL SILVA GOMES

Aluno do Curso de Ciências Biológicas – Produção Químico-biológica

Matrícula: 0823800146


Trabalho de Conclusão de Curso, apresentado ao curso de graduação em Ciências Biológicas – Produção Químico-biológica da UEZO como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Biólogo, sob a orientação da Dra. Ida Carolina N. Direito – Realizado pelo aluno Angel Silva Gomes.


GOMES, Angel Silva Identificação de Bactérias com Potencial de Degradação do Herbicida 2,4-D com o Auxílio da Bioinformática / Angel Silva Gomes. – Rio de Janeiro: Centro Universitário Estadual da Zona Oeste, 2012. ix, 41 f. : il. ; 31 cm Orientadora: Ida Carolina Neves Direito Monografia de graduação em Ciências Biológicas – Produção Químico- biológica – UEZO, 2012. Referências bibliográficas: f. 26 - 28.

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Elaborado por Angel Silva Gomes

Aluno do Curso de Ciências Biológicas Produção Químico-biológica da UEZO

Este trabalho de Graduação foi analisado e aprovado com

Grau: 9,0 (nove)

Rio de Janeiro, 09 de Julho de 2012.

_______________________________________ Professor Andrew Macrae Doutor em Microbiologia (Examinador)

_______________________________________ Adriana Machado Fróes Mestre em Biotecnologia Vegetal (Examinadora)

_______________________________________ Professora Ida Carolina Neves Direito Doutora em Biotecnologia Vegetal (Orientadora)


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DEDICATÓRIA

Dedico esta monografia primeiramente a DEUS, pela concessão de minha vida, e à minha família. À minha esposa Andréia que caminha sempre ao meu lado e me ampara em todos os momentos. Ao meu filho amado que é o maior presente que eu poderia merecer. Aos meus pais que desde sempre, no meu existir, tem sido meu porto seguro, me incentivando a buscar mais e me desenvolver. À minha irmã e meu cunhado que são amigos de todas as horas. À minha avó, tios e demais familiares pelas condições que me forneceram para que eu concluísse mais essa etapa de minha vida. Aos amigos pelos incentivos e pela compreensão por eu não poder estar sempre presente. Aos professores que me apoiaram e aconselharam nesta trajetória acadêmica. Aos amigos “irmãos” de classe e de bancada que sempre ajudaram e colaboraram muito na elaboração deste trabalho, e a todas as pessoas que, de maneira direta ou indireta, tornaram possível este momento. Vocês são minha inspiração.

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AGRADECIMENTO

À minha orientadora, Dra. Ida Carolina N. Direito, pelo apoio, paciência, credibilidade e ensinamentos oferecidos. À minha colaboradora e amiga Juliana Succar, que acrescentou muito no conteúdo e na realização deste trabalho. À minha família – que sempre esteve ao meu lado me incentivando em todos os momentos e decisões; Aos meus professores pelos conhecimentos fornecidos. Aos meus amigos que fizeram dessa jornada um caminho menos árduo.

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EPÍGRAFE

“Para conhecermos os amigos é necessário passar pelo sucesso e pela desgraça. No sucesso, verificamos a quantidade, e, na desgraça, a qualidade”. “Mil dias não bastam para aprender o bem; mas para aprender o mal, uma hora é demais”.

Confúcio (A Sabedoria de Confúcio, 551-479AC)

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RESUMO O herbicida ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) é muito utilizado nas lavouras brasileiras. A bactéria Cupriavidus necator JMP134 (Ralstonia eutropha JMP134) é usada como modelo em estudos de degradação do 2,4-D, sendo sua rota de degradação constituída pelos genes tfdABCDEF. Pesquisas preliminares de bioprospecção em solos agrícolas relataram espécimes com capacidade de crescimento na presença de 2,4-D como única fonte de carbono. O avanço da genômica faz possível a utilização de bancos de dados para a identificação de microrganismos com interesse agrícola. O objetivo deste trabalho foi identificar através da ferramenta BLAST, contra o banco RefSeq de genomas montados, os genes presentes nos genomas de Achromobacter spp., Pseudomonas spp., Burkholderia spp., Ochrobactrum spp. e Tetrathiobacter spp. com homologia aos genes tfdABCDEF. Os genes tfd foram obtidos através do banco de nucleotídeos do National Center for Biotechnology Information (NCBI). As análises foram realizadas empregando BLAST Assembled RefSeq Genomes. Também foi realizada a localização destes genes e sua organização na estrutura genômica das estirpes selecionadas. Foram identificadas as estirpes Achromobacter xylosoxidans A8 e Burkholderia xenovorans LB400 com grande potencial de degradação do 2,4-D por apresentarem genes em seu genoma com altos índices de sobreposição aos genes tfd. A presença destes genes não significa que estas estirpes são capazes de expressá-los, sendo necessários ensaios laboratoriais. O uso da bioinformática pode otimizar o tempo em pesquisas laboratoriais, tornando o enfoque mais incisivo e específico por viabilizar um estudo prévio de baixo custo em organismos disponíveis em coleções de cultura.

PALAVRAS-CHAVE: pesticida, ácido 2,4-diclorofenoxiacético, biodegradação, genes tfd, Achromobacter, Burkholderia, bioinformática.

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ABSTRACT The herbicide 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) is widely used in Brazilian crops. The bacterium Cupriavidus necator JMP134 (Ralstonia eutropha JMP134) is used as a model in studies of degradation of 2,4-D, and its degradation pathway consists of the genes tfdABCDEF. Preliminary research biopanning specimens reported in agricultural soils capable of growth in the presence of 2,4-D as sole carbon source. The advancement of the genome makes possible the use of databases to identify microorganisms with agricultural interest. The objective of this study was to identify through the tool BLAST against the RefSeq database assembled genomes, genes present in the genomes of Achromobacter spp., Pseudomonas spp., Burkholderia spp., Ochrobactrum spp. and Tetrathiobacter spp. with homology to genes tfdABCDEF. The tfd genes were obtained from the nucleotide database of the National Center for Biotechnology Information (NCBI). Analyses were performed using BLAST Assembled Genomes RefSeq. We also carried out the location of these genes and their organization in the genomic structure of the selected strains. We identified the strains Achromobacter xylosoxidans A8 and Burkholderia xenovorans LB400 with great potential for degradation of 2,4-D because they have genes in its genome with high rates of overlapping tfd genes. The presence of these genes would not mean that these strains are capable of expressing them, requiring laboratory tests. The use of bioinformatics can optimize the time in research laboratories, making it more focused and specific focus on making a previous study of low-cost organisms available in culture collections. KEYWORDS: pesticide, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, biodegradation, genes tfd, Achromobacter, Burkholderia, bioinformatics.

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SUMÁRIO

RESUMO........................................................................................................................ vi ABSTRACT ....................................................................................................................vii LISTA DE FIGURAS ...................................................................................................... ix LISTA DE TABELAS ....................................................................................................... x LISTAS DE SIGLAS E ABREVIATURAS ....................................................................... xi 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 1

1.1. JUSTIFICATIVA .................................................................................................... 8 1.2. OBJETIVO ............................................................................................................ 9

2. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................... 10 2.1. DESCRIÇÃO DO PASSO A PASSO PARA IDENTIFICAÇÃO DE GENES EM GENOMAS EMPREGANDO BIOINFORMÁTICA ............................................... 10 2.2. AQUISIÇÃO DE GENES ATRAVÉS DO NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION (NCBI) .............................................................. 10 2.3. PASSO A PASSO DE COMO UTILIZAR A FERRAMENTA BLAST Assembled RefSeq Genomes .................................................................................... 13

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................. 20 4. CONCLUSÕES ......................................................................................................... 25 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 26

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LISTA DE FIGURAS Figura 1. Taxas de crescimento das vendas de pesticidas no Brasil e no mundo entre 2000 e 2009 (ANVISA, 2012). .................................................................................................... 1 Figura 2. Distribuição percentual dos ingredientes ativos de pesticidas no Brasil – 2005 (IBGE, 2010). ....................................................................................................................... 2 Figura 3. Estrutura química do ácido 2,4-diclorofenoxiacético (XAVIER e VIEIRA, 2001). .............................................................................................................................................. 3 Figura 4. Árvore filogenética de Proteobactérias empregando análise de DNA ribossomal de estirpes isoladas do solo capazes de crescerem em meio contendo o herbicida 2,4-D como única fonte de carbono (DIREITO, 2009). ......................................... 6 Figura 5. Tela inicial do NCBI. ................................................................................................. 11 Figura 6. Tela do NCBI com resultados para a consulta de R. eutropha JMP134. ........ 12 Figura 7. Tela do NCBI com parte do genoma do plasmídeo pJP4 de R. eutropha JMP134. ....................................................................................................................................... 12 Figura 8 . Tela do NCBI com o gene tfdA do plasmídeo pJP4 de R. eutropha JMP134.13 Figura 9. Tela do BLAST Assembled RefSeq Genomes. ................................................... 14 Figura 10. Tela do BLAST onde se insere a sequência FASTA do gene de interesse. 15 Figura 11. Tela do BLAST para selecionar o genoma do organismo desejado. ............ 16 Figura 12. Tela do BLAST após ser feita a busca. .............................................................. 16 Figura 13. Tela do BLAST com resultados de similaridade genômica. ............................ 17 Figura 14. Tela do BLAST com detalhamento da proteína escolhida. .............................. 18 Figura 15. Tela do BLAST demonstrando a localização do gene similar ao tfdA em Achromobacter xylosoxidans A8. ............................................................................................. 19 Figura 16. Tela do NCBI com o resultado da identificação de cromossomos e plasmídeos no genoma de Achromobacter xylosoxidans A8. ............................................. 19 Figura 17. Tela do NCBI com o resultado da identificação de cromossomos e plasmídeos no genoma de Achromobacter xylosoxidans A8. ............................................. 22 Figura 18. Localização dos genes similares aos genes tfd no DNA da Achromobacter xylosoxidans A8 conforme resultados gerados pelo BLAST contra o banco RefSeq de genomas ....................................................................................................................................... 23

x

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Proteínas codificadas pelos genes tfd de Cupriavidus necator JMP134 (Adaptado de DIREITO, 2009)........................................................................................ 5 Tabela 2. Similaridade apresentada entre as proteínas codificadas pelos genes tfd de Cupriavidus necator JMP134 e as proteínas de Burkholderia xenovorans LB400............................................................................................................................ 21

Tabela 3. Similaridade apresentada entre as proteínas codificadas pelos genes tfd de Cupriavidus necator JMP134 e as proteínas de Achromobacter xylosoxidans A8....... 21

xi

LISTAS DE SIGLAS E ABREVIATURAS

2,4-D Ácido 2,4-diclorofenoxiacético

ABNT Associação Brasileira de Normas e Técnicas

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

DDBJ DNA Data Bank of Japan

DNA Ácido desoxirribonucleico

EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

NCBI National Center for Biotechnology Information

SIA Sistema de Informações sobre Pesticidas

TFD Transcription factors database

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1. INTRODUÇÃO Pesticidas são produtos químicos utilizados em lavouras, na pecuária ou mesmo

em ambientes domésticos empregados comumente no controle de pragas, doenças e

plantas daninhas (ABREU, 2007). Exemplos de pesticidas incluem inseticidas,

fungicidas, acaricidas, nematicidas e herbicidas. Em nosso país, a cada ano, há um

aumento considerável na utilização destes produtos (ANVISA, 2012), em especial dos

herbicidas que são os mais aplicados na agricultura brasileira (IBGE, 2010;

CONCEIÇÃO, 2000). Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA

(2012), o Brasil possui um destaque negativo no cenário mundial como o maior

consumidor de pesticidas, sendo responsável, na América Latina, por 86% do emprego

destes produtos nas lavouras agrícolas. No período de 2000 a 2009, conforme

demonstra a Figura 1, as vendas de pesticidas no Brasil e no mundo sofreram taxas de

crescimento consideráveis (ANVISA, 2012). Segundo o Sindicato Nacional da Indústria

de Produtos para a Defesa Agrícola – SINDAG (2010), em 2010 foram utilizados nas

lavouras do Brasil mais de 1 bilhão de litros de pesticidas, o que equivale a mais ou

menos 5 kg.ano-1 por brasileiro. É notório que o crescimento das vendas em nosso

país foi maior que no mundo, assumindo valores superiores a 100% a partir de 2007

(Figura 1).

Figura 1. Taxas de crescimento das vendas de pesticidas no Brasil e no mundo entre 2000 e 2009 (ANVISA, 2012).

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Crescimento que pode ser explicado devido ao fortalecimento do agronegócio no

Brasil e ao aumento do capital financeiro para grandes proprietários de terras, uma

rede de pressão de influências (SILVA, 2012).

Larissa Mies Bombardi, professora do Departamento de Geografia da USP, faz a

seguinte colocação:

“Somando as receitas das principais empresas estrangeiras

produtoras de agrotóxicos no Brasil, segundo o balanço de

2009, temos um total de R$ 14 bilhões. Este dado é muito

significativo, já que revela que, do PIB agrícola como um todo,

o setor de agrotóxicos abocanhou, sozinho, cerca de 10%, isso

lembrando que não estão computados os dados da Monsanto.

Isto significa que estamos, literalmente, comendo veneno,

monopolizado pelo capital estrangeiro.” (BOMBARDI, 2011)

No ano de 2008, o mercado de pesticidas movimentou R$ 7 bilhões no País,

mais que o dobro em relação ao ano de 2003, fazendo com que o Brasil assumisse a

posição de líder no consumo de pesticidas no mundo, posição anteriormente ocupada

pelos Estados Unidos (SILVA, 2012). Dentre os ingredientes ativos de herbicidas, o

ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) é um dos mais consumidos no Brasil (Figura 2)

(IBGE, 2010).

Figura 2. Distribuição percentual dos ingredientes ativos de pesticidas no Brasil – 2005 (IBGE, 2010).

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O controle químico de plantas daninhas obedece ao princípio de que certos

produtos químicos são capazes de matar plantas infestantes e, o mais importante, é

que muitos deles podem matar apenas alguns tipos de plantas, sem causar injúrias a

outras (LORENZI, 2000). Conforme Direito (2009), o herbicida 2,4-D (Figura 3) é um

pesticida análogo ao hormônio vegetal auxina, usado no controle de plantas daninhas

de folhas largas conhecidas como eudicotiledôneas. Este herbicida apresenta

classificação toxicológica nível I (altamente tóxico) e um alto potencial para lixiviação

(ANVISA/SIA, 2004; apud DIREITO, 2005). Os pesticidas classificados neste nível

requerem maiores cuidados no seu manuseio pelo trabalhador rural que deve utilizar o

equipamento de proteção individual completo (ANVISA/SIA, 2004; apud DIREITO,

2005).

Figura 3. Estrutura química do ácido 2,4-diclorofenoxiacético (XAVIER e VIEIRA, 2001).

O alto potencial para lixiviação propicia a distribuição do 2,4-D no ambiente e,

em função das características da molécula, contribui para a persistência do mesmo

mantendo uma atividade residual na água e nos solos, tendo seu aumento relacionado

diretamente proporcional ao pH do meio em que se encontra (TOMITA, 2002).

Segundo Prata (2000), no momento em que a molécula do herbicida atinge o solo, ela

pode ser absorvida pelas plantas, sofrer lixiviação para camadas subsuperficiais do

solo podendo resultar na contaminação dos cursos de água subterrâneos ou formar

resíduos pela junção do pesticida ao solo, dentre outros. Em função destas

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características do 2,4-D, a Resolução Nº 396 de 03 de Abril de 2008 do Conselho

Nacional de Meio Ambiente - CONAMA, que dispõe sobre a classificação e as

diretrizes ambientais para prevenção e controle da poluição de águas subterrâneas,

determina o limite máximo de 0,03 ppm de 2,4-D na água destinada ao consumo

humano. E a Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT) através da NBR

10004/2004 determina o limite de 3 ppm do herbicida em resíduos sólidos como

suficiente para a denominação de resíduo perigoso.

Outro destino que pode ser dado naturalmente nos solos aos pesticidas é a

biodegradação. A capacidade de degradação de compostos orgânicos por

microrganismos é reconhecida cientificamente e vem tomando grandes proporções ao

longo do tempo em processos de tratamento biológico de efluentes líquidos e de

resíduos em solo (CASTILHOS JÚNIOR, 2003). Esses microrganismos podem ser

encontrados no próprio ambiente impactado, sendo os mesmos, na maioria das vezes,

responsáveis pelo desaparecimento dos contaminantes (HAO et al., 2002). Sabe-se,

como é citado em Direito (2009), que a microbiota do solo apresenta uma importante

função nos processos de degradação de pesticidas, e que a diversidade desses

microrganismos está diretamente relacionada ao manejo do solo em que se encontram.

Por ser muito utilizado na agricultura brasileira e servir como fonte de carbono e

energia para bactérias presentes no solo, o herbicida 2,4-D é amplamente estudado e

usado como modelo para a compreensão dos mecanismos de degradação de

compostos aromáticos contendo cloro (HOFFMANN et al., 2003; DIREITO, 2009).

Neste estudo, utilizou-se o herbicida 2,4-D como modelo para um melhor

conhecimento sobre bactérias com potencial para degradação de pesticidas realizando

inferências em bancos de dados genômicos através dos recursos da bioinformática.

Este herbicida, assim como outros, pode ser utilizado como fonte de carbono sendo

degradado por enzimas microbianas (HOFFMANN et al., 2003). A bactéria Cupriavidus

necator JMP134 (Ralstonia eutropha JMP134), isolada primeiramente na Austrália, é

conhecida como excelente degradadora de 2,4-D e é utilizada em vários estudos de

biodegradação deste herbicida (VIANEZ JÚNIOR, 2007). Hoffmann et al. (2003) citam

que a rota de degradação do 2,4-D é catalisada sequencialmente por seis enzimas

codificadas pelos genes tfdA, tfdB, tfdC, tfdD, tfdE e tfdF (Tabela 1).

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Tabela 1. Proteínas codificadas pelos genes tfd de Cupriavidus necator JMP134 (Adaptado de DIREITO, 2009).

Gene Proteína codificada tfdA alfa-cetoglutarato dioxigenase tfdB 2,4-diclorofenol hidrolase tfdC clorocatecol 1,2-dioxigenase tfdD cloromuconato cicloisomerase tfdE dienolactona hidrolase

tfdF maleilacetato redutase

É válido destacar que na bactéria Cupriavidus necator JMP134 todos os genes

tfd localizam-se no plasmídeo catabólico pJP4, que revela os mecanismos de

adaptação aos poluentes cloroaromáticos e a evolução de processos de degradação

conforme citado por Trefault et al. (2004). Isto direciona nossa pesquisa para que, além

da identificação dos genes, seja também obtida sua localização no genoma no intuito

de inferirmos a estabilidade desta atividade funcional na bactéria.

Estudos de bioprospecção e diversidade geram muitos dados de sequências

gênicas depositadas em bancos de dados, assim como os estudos genômicos são

realizados, cada vez mais, com maior rapidez em função do avanço nas técnicas de

sequenciamento de ácidos nucléicos. Os depósitos, as análises, os acessos aos dados

presentes nestes bancos de dados são dependentes do uso da bioinformática. Direito

(2009) obteve, através da bioprospecção de solos agrícolas, uma coleção de culturas

de bactérias capazes de crescer em meio contendo 2,4-D como única fonte de

carbono, como exemplificado na Figura 4. Alguns dos gêneros identificados dentre

seus isolados foram Achromobacter, Pseudomonas, Burkholderia, Ochrobactrum e

Tetrathiobacter.

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. Distância P e neighbour-joining baseada no alinhamento de aproximadamente 200pb. A escala de distância indica 0,02 substituições por sítio, números situados nas ramificações da árvore indicam porcentagem de recuperação de bootstrap baseado em 1000 amostragens de dados. Estirpes padrão são identificadas por (T) após o nome do microrganismo. Código entre colchetes indicam o número de acesso da sequência usada nas análises no Genbank.

Com a bioinformática podemos explorar dados referentes a organismos já

isolados e identificados taxonomicamente de maneira a otimizar a identificação de

organismos com potencial biotecnológico para uso agrícola. Podemos classificar a

bioinformática como uma forte aliada que fornece ferramentas que permitem realizar

inferências que podem auxiliar na realização de ensaios laboratoriais, na seleção de

organismos modelos e na descoberta de organismos de interesse (VIANEZ JÚNIOR,

2007).

Figura 4. Árvore filogenética de Proteobactérias empregando análise de DNA ribossomal de estirpes isoladas do solo capazes de crescerem em meio contendo o herbicida 2,4-D como única fonte de carbono (DIREITO, 2009).

7

Construir árvores filogenéticas, avaliar estruturas tridimensionais de moléculas,

analisar imagens e sinais biológicos, montar ou modificar estruturas metabólicas,

comparar e até mesmo evidenciar a função biológica de determinada sequência

genética são umas das várias possibilidades que a bioinformática pode nos oferecer

(BANSAL, 2005). Esta ciência tem se mostrado muito eficaz no auxílio à pesquisa, se

apresentando como uma matéria multidisciplinar que se destacou a partir do momento

que se fez necessária a compreensão das funções biológicas, mais especificamente os

genes (VIANEZ JÚNIOR, 2007). Por isso é considerada um campo das ciências

biológicas que está em rápido crescimento e vem sendo desenvolvida para atender à

necessidade de manipular grandes quantidades de dados genéticos e bioquímicos com

o auxílio de sistemas computacionais e algoritmos matemáticos (QUEIROZ, 2002),

reconhecendo e evidenciando padrões que provavelmente seriam impossíveis de

serem analisados sem a ajuda de suas ferramentas.

Pode se dizer que a bioinformática surgiu a partir do momento em que se deu

um “boom” no processo de sequenciamento de DNA, proposto por Frederick Sanger na

década de 70, o que gerou um enorme volume de dados que precisavam ser

analisados para gerar informações úteis (FERREIRA, 2005). Foram criados vários

bancos de dados de fácil acesso e pesquisa, dentre eles, está o National Center for

Biotechnology Information (NCBI). O NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) é responsável por

armazenar sequências genômicas de pesquisadores de todo o mundo.

Um recurso da bioinformática que se mostrou de grande valia para a realização

deste estudo foi a busca em bancos de dados, mais especificamente no BLAST

Assembled RefSeq Genome, pois através dele podemos realizar inferências pontuais

em genomas previamente selecionados. Vianez Júnior (2007) destaca que a busca em

bancos de dados genômicos por microrganismos com similaridades de interesse se

mostra uma ferramenta eficaz e muito promissora, capaz de detectar, no ambiente,

genes relacionados com a sequência alvo que executem a mesma função

biotecnológica. Podemos ressaltar a bioinformática por fornecer ferramentas tanto para

a análise dos dados obtidos pela biologia molecular quanto por direcionar de maneira

racional as pesquisas nesta área (BANSAL, 2005).

8

O BLAST, cuja sigla em inglês significa Basic Local Alignment Search Tool, nada

mais é que um algoritmo utilizado em comparações de informações de sequências

biológicas primárias, dentre as quais, podemos citar aminoácidos de diferentes

proteínas ou nucleotídeos de sequências de DNA.

A pesquisa BLAST se resume em compararmos uma sequência de interesse em

uma consulta a uma biblioteca/base de dados, ou banco de dados, de sequências e

identificarmos sequências que estejam acima de um certo grau de semelhança da

sequência consultada. Em uma situação hipotética, podemos elaborar uma pesquisa

no BLAST do genoma humano, na busca por um gene de interesse descoberto em um

camundongo. Por estas razões, o emprego da bioinformática é crescente e seu

potencial na descoberta de genes funcionais uma grande ferramenta na otimização de

tempo de análises.

1.1. JUSTIFICATIVA

A contaminação ambiental causada pelo uso indiscriminado de pesticidas, em

especial os herbicidas, tem gerado preocupações quanto ao lançamento inadequado

desses compostos no ambiente (UETA, 2005). Também é sabido que os

microrganismos, pela sua capacidade degradadora, participam de forma significativa na

eliminação ou redução acentuada dos níveis de pesticidas empregados na

agropecuária (EMBRAPA, 2011). Um dos campos mais promissores da biotecnologia

que visa o emprego dos microrganismos direciona-se para a remediação de locais

contaminados devido ao uso de pesticidas (UETA, 2005). Consideramos que a

descoberta de novos microrganismos capazes de degradarem herbicidas pode ser

alavancada pela bioinformática através da busca por similaridade em bancos de dados

genômicos. Esta busca em bancos de dados por microrganismos que apresentem

genes com similaridade a genes de interesse já caracterizados se mostra uma

ferramenta eficaz e muito promissora, capaz de detectar genes relacionados,

evolutivos, homólogos, genes de interesse que executem a mesma função

biotecnológica. A bioinformática pode ser vista como uma forte aliada, fornecendo

ferramentas tanto para a análise dos dados obtidos com a biologia molecular quanto

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para direcionar racionalmente as pesquisas nesta área (BANSAL, 2005). Pode ser

considerada uma utopia a idéia de um planeta menos agredido por agentes poluentes,

mas essa idéia deveria ser uma obrigação geral que merece surgir naturalmente em

cada ser humano. É dever de todos, principalmente da área acadêmica, a busca

incessante por soluções que melhorem ou que, pelo menos, diminuam as taxas de

contaminação de nossas fontes naturais.

1.2. OBJETIVO

Buscar, identificar e analisar através do banco de dados BLAST contra o

Assembled RefSeq Genomes os genes presentes nos genomas de gêneros de

bactérias identificadas previamente por Direito (2009) com similaridade aos genes

tfdABCDEF que fazem parte da rota de degradação do 2,4-D presente na estirpe

padrão Cupriavidus necator JMP134, buscando sua possível localização e organização

na estrutura genômica das possíveis estirpes encontradas.

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2. MATERIAL E MÉTODOS

As sequências dos genes tfd relacionados à rota de degradação de Cupriavidus

necator JMP134 foram obtidos no formato FASTA através do banco de dados do

National Center for Biotechnology Information - NCBI (NCBI, 2011). O formato FASTA é

um arquivo simples e compacto, que apresenta a sequência genômica, que é

entendido pela maioria dos programas de análise de sequências de genes. Cada

sequência dos genes da rota de degradação do 2,4-D localizados no plasmídeo pJP4

(TREFAULT et al., 2004) de Cupriavidus necator JMP134 foi selecionada e copiada

para o bloco de notas para ser utilizada nas inferências de consulta realizadas no

BLAST. Os genes alvo foram utilizados como “query” (busca do BLAST) na busca por

genes similares através do algoritmo BLAST, utilizando a ferramenta BlastX, por se

tratar de uma busca por proteínas codificadas, contra a base de dados RefSeq de

genomas montados dos gêneros já citados por Direito (2009) como capazes de crescer

em meio contendo 2,4-D. Os gêneros analisados foram Achromobacter spp.,

Pseudomonas spp., Burkholderia spp., Ochrobactrum spp. e Tetrathiobacter spp.

Foram selecionadas sequências que apresentaram sobreposição “query coverage”

igual ou superior a 90% aos genes tfd e valor exponencial “E value” igual ou abaixo de

zero, o que evidencia grande probabilidade do resultado do alinhamento em questão

não tenha sido ao acaso. As sequências selecionadas com alta sobreposição foram

analisadas para obtenção da localização dos genes na estrutura genômica dos

microrganismos em questão.

2.1. DESCRIÇÃO DO PASSO A PASSO PARA IDENTIFICAÇÃO DE GENES

EM GENOMAS EMPREGANDO BIOINFORMÁTICA

2.2. Aquisição de genes através do National Center for Biotechnology

Information (NCBI)

Ao entrar no site do NCBI, escolha a opção “Genome” e, na janela ao lado, digite

o genoma desejado. No nosso exemplo, digite Ralstonia eutropha JMP134, e, em

seguida, clique na tecla “Search” (pesquisar). A Figura 5 ilustra este procedimento.

11

Figura 5. Tela inicial do NCBI.

Seta “a” indica a caixa na qual deve ser selecionada a opção “Genome”; Seta “b” indica o local em que deve ser digitado o genoma desejado; Seta “c” indica a tecla a ser pressionada para iniciar a busca.

A próxima tela (Figura 6) apresenta todas as informações do genoma. No nosso

exemplo, os genes procurados estão no DNA plasmidial (plasmídeo pJP4).

Selecionasse a aba “plasmids” e, em seguida, o plasmídeo desejado. Na tela a seguir,

abra a janela de localização (comando Ctrl+F) e digite o gene tfd (ex: tfdA). Ao localizar

o gene na página, também poderá obter o intervalo de nucleotídeos referentes ao gene

procurado. Em seguida, selecione os nucleotídeos no intervalo identificado e clique no

link “FASTA” (Figura 7).

a b c

12

Figura 6. Tela do NCBI com resultados para a consulta de R. eutropha JMP134.

Seta “d” indica a aba a ser selecionada; Seta “e” indica o plasmídeo desejado.

Figura 7. Tela do NCBI com parte do genoma do plasmídeo pJP4 de R. eutropha JMP134.

Seta “f” indica o local onde deve ser digitado o item a ser procurado; Seta “g” indica o link a ser pressionado para converter ao formato FASTA.

d

e

f

g

13

Na próxima tela (Figura 8), observamos o gene em formato FASTA. Esta

sequência deve ser copiada (Ctrl+C) e, posteriormente, colada (Ctrl+V) e salva no

bloco de notas para posterior utilização nas inferências realizadas no BLAST. Estes

procedimentos devem ser repetidos com todos os genes de interesse.

Figura 8. Tela do NCBI com o gene tfdA do plasmídeo pJP4 de R. eutropha JMP134.

2.3. Passo a passo de como utilizar a ferramenta BL AST Assembled RefSeq

Genomes

Através do BLAST Assembled RefSeq Genomes podemos realizar inferências

em busca de similaridades entre os genes desejados e genomas específicos.

Demonstra-se, a seguir, o passo a passo na busca por similaridade entre o gene tfdA e

genes presentes no genoma da bactéria A. xylosoxidans.

14

Primeiramente acesse a tela principal do BLAST através do endereço digital

www.blast.ncbi.nlm.nih.gov e clique no link do genoma desejado (Figura 9). Em nosso

exemplo, clique no link “Microbes”.

Figura 9. Tela do BLAST Assembled RefSeq Genomes.

Seta “h” indica o grupo de genomas a ser selecionado para execução do nosso exemplo.

Neste momento, acessamos a tela na qual iremos selecionar o genoma de

interesse e informar os dados para realizar a análise (Figura 10 e 11). A primeira coisa

a fazer é inserir a sequência do gene desejado em formato FASTA salva no bloco de

notas na caixa de entrada (sequência gravada no bloco de notas conforme ensinado no

item 1.2.1. Aquisição de genes através do National Center for Biotechnology

Information) (Figura 10). Para isso podem ser empregados os comandos “copiar”

(Ctrl+C) e “colar” (Crtl+V). Observe que o nome da sequência não foi inserido na caixa

de entrada. O passo seguinte é estabelecer os parâmetros da análise. Como em nosso

exemplo temos uma sequência de nucleotídeos na caixa de entrada, devemos

h

15

selecionar em “query” a opção “DNA” (Figura 10). Como desejamos analisar com

dados de proteínas, devemos selecionar em “database” a opção “Protein” (Figura 10).

Em função dos parâmetros selecionados, na caixa “Blast-program” ficará selecionada a

opção “Blastx”. Em seguida, deve-se selecionar o genoma do microrganismo de

interesse. Para isso, utilizar as teclas de atalho Ctrl+F (que habilita a função localizar

na página) e digitar nome do organismo desejado (Figura 10 e 11). Em nosso exemplo,

localizamos o gênero Achromobacter e selecionamos o genoma de Achromobacter

xylosoxidans (Figura 11). O próximo passo é clicar na caixa “BLAST” e aguardar o final

do processamento da análise (Figura 10). Ao final do processamento surgirá uma nova

tela onde se deve clicar no link “View report” (Figura 12).

Figura 10. Tela do BLAST onde se insere a sequência FASTA do gene de interesse.

Seta “i” indica o local para inserção da sequência de busca; Seta “j” indica as caixas de seleção de “query” e “database”; Seta “k” indica a caixa de seleção do “Blast-program”; Seta “l” indica o local para digitação do gênero a ser localizado na página; Seta “m” indica a tecla a ser pressionada para realizar o Blast.

i

j

k

l

m

16

Figura 11. Tela do BLAST para selecionar o genoma do organismo desejado.

Seta “l” indica o genoma selecionado.

Figura 12. Tela do BLAST após ser feita a busca.

Seta “n” indica o link “View report” a ser pressionado.

l

n

17

A Figura 13 nos mostra a tela do BLAST com os resultados de proteínas

codificadas por genes de Achromobacter xylosoxidans com similaridade ao

pesquisado. Neste caso, podemos notar uma sobreposição de 98% dos nucleotídeos

entre o gene tfdA de Cupriavidus necator JMP134 utilizado neste exemplo e um gene

presente no genoma de Achromobacter xylosoxidans A8 (Figura 13). Estes

procedimentos devem ser repetidos com cada gene de interesse.

Figura 13. Tela do BLAST com resultados de similaridade genômica.

Seta “o” indica a coluna com as sobreposição observadas; Seta “p” indica o link para acesso ao genoma desejado.

2.3.1. Localização de genes em genomas

Para localizarmos o gene identificado pelo emprego da ferramenta BLAST no

genoma na estirpe Achromobacter xylosoxidans A8, devemos clicar no link presente na

coluna “Accession” (Figura 13). Este comando nos mostra a próxima tela com

detalhamento da proteína em questão (Figura 14). Ainda na tela da Figura 14, deve-se

o p

18

clicar no link “Gene ID” que nos guiará para a tela que demonstra a localização do gene

em questão, conforme mostra a Figura 15.

Figura 14. Tela do BLAST com detalhamento da proteína escolhida.

Seta “q” indica o link “Gene ID” que guiará para a tela que demonstra a localização do gene.

q

Figura 15. Tela do BLAST demonstrando a localização do gene similar ao tfdA em Achromobacter xylosoxidans

Seta “r” indica o código de identificação da localização do gene.

Observe na Figura 15 que a localização do gene

encontra no NC_014640. A seguir, podemos notar na Figura 16, que o genoma de

xylosoxidans A8 é constituído pelo cromossomo NC_014640, e por dois plasmídeos,

dentre eles o pA81, representado por NC_014641. A partir destas informaçõe

podemos tirar as conclusões em relação à localização dos genes presentes nesta

estirpe.

Figura 16. Tela do NCBI com o resultado da identificação de cromossomos e plasmídeos no genoma de

Tela do BLAST demonstrando a localização do gene similar ao tfdA em Achromobacter xylosoxidans A8.

Seta “r” indica o código de identificação da localização do gene.

Observe na Figura 15 que a localização do gene tfdA de nosso exemplo se

encontra no NC_014640. A seguir, podemos notar na Figura 16, que o genoma de

A8 é constituído pelo cromossomo NC_014640, e por dois plasmídeos,

dentre eles o pA81, representado por NC_014641. A partir destas informaçõe


Tela do NCBI com o resultado da identificação de cromossomos e plasmídeos no genoma de Achromobacter xylosoxidans A8.

r

19

Tela do BLAST demonstrando a localização do gene similar ao tfdA em

A de nosso exemplo se

encontra no NC_014640. A seguir, podemos notar na Figura 16, que o genoma de A.

A8 é constituído pelo cromossomo NC_014640, e por dois plasmídeos,

dentre eles o pA81, representado por NC_014641. A partir destas informações


Tela do NCBI com o resultado da identificação de cromossomos e

20

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A partir da rota de degradação do herbicida 2,4-D definida para Cupriavidus necator

JMP134, utilizou-se as enzimas codificadas pelos genes tfd como modelo neste

trabalho. As inferências foram feitas em gêneros de Proteobactérias relacionados aos

isolados da coleção de culturas de bactérias capazes de crescer em meio contendo

2,4-D como única fonte de carbono obtida por Direito (2009), dentre eles:

Pseudomonas spp., Burkholderia spp., Achromobacter spp., Ochrobactrum spp. e

Tetrathiobacter spp..

Após realizarmos as análises de mineração utilizando o algoritmo BLAST contra o

banco de dados RefSeq de genomas montados, identificamos no gênero Burkholderia

a estirpe Burkholderia xenovorans LB400, que apresentou proteínas com sobreposição

acima de 94% a todas as proteínas codificadas pelos genes tfd (Tabela 2). Dentre

estas enzimas, todas são idênticas na sua nomenclatura às da estirpe padrão. No

gênero Achromobacter foi identificada a estirpe Achromobacter xylosoxidans A8 com

proteínas apresentando sobreposição superior a 90% a todas as proteínas codificadas

pelos genes tfd (Tabela 3). As duas estirpes encontradas denotaram potenciais de

similaridade merecedores de atenção e de estudos mais detalhados. Os outros

gêneros analisadas não apresentaram genes com sobreposição superior a 90% com

todos os genes tfd e foram descartados.

21

Tabela 2. Similaridade apresentada entre as proteínas codificadas pelos genes tfd de Cupriavidus necator JMP134 e as proteínas de Burkholderia xenovorans LB400.

Cupriavidus necator JMP134 Burkholderia xenovorans LB400

Score

Query

E-value Gene* Proteína codificada Proteína com similaridade a de

C. necator JMP134 coverage tfdA alfa-cetoglutarato dioxigenase proteína indefinida 225 98% 7e-72

tfdA alfa-cetoglutarato dioxigenase taurina dioxigenase (alfa-cetoglutarato dioxigenase) 161 94% 2e-47

tfdB1 2,4-diclorofenol hidrolase proteína hipotética Bxe_C1006 178 94% 5e-49 tfdC2 clorocatecol 1,2-dioxigenase 3-clorocatecol 1,2-dioxigenase 347 98% 1e-120 tfdD1 cloromuconato cicloisomerase cloromuconato cicloisomerase 456 99% 5e-160 tfdD2 cloromuconato cicloisomerase muconato cicloisomerase 251 96% 6e-180 tfdE1 dienolactona hidrolase dienolactona hidrolase 259 98% 5e-87 tfdF1 maleilacetato redutase maleilacetato redutase 351 98% 2e-119

tfdF2 maleilacetato redutase maleilacetato redutase 248 97% 5e-79 * Os números identificam a cópia do gene presente no genoma.

Tabela 3. Similaridade apresentada entre as proteínas codificadas pelos genes tfd de Cupriavidus necator JMP134 e as proteínas de Achromobacter xylosoxidans A8.

Cupriavidus necator JMP134 Achromobacter xylosoxidans A8

Score

Query

E-value Gene* Proteína codificada Proteína com similaridade a de C.

necator JMP134 coverage

tfdA alfa-cetoglutarato dioxigenase taurina dioxigenase (alfa-cetoglutarato dioxigenase) 152 98% 8e-38

tfdB1 2,4-diclorofenol hidrolase 2,4-diclorofenol 6-monoxigenase 481 98% 2e-136 tfdB2 2,4-diclorofenol hidrolase 2,4-diclorofenol 6-monoxigenase 523 94% 3e-149 tfdC1 clorocatecol 1,2-dioxigenase clorocatecol 1,2-dioxigenase 293 90% 2e-80 tfdC2 clorocatecol 1,2-dioxigenase clorocatecol 1,2-dioxigenase 357 98% 1e-99 tfdD1 cloromuconato cicloisomerase cloromuconato cicloisomerase 472 99% 5e-134 tfdD2 cloromuconato cicloisomerase cloromuconato cicloisomerase 265 97% 9e-72 tfdE1 dienolactona hidrolase carboximetilenobutenolidase 268 98% 6e-73 tfdF1 maleilacetato redutase maleilacetato redutase # 340 98% 2e-94 tfdF2 maleilacetato redutase maleilacetato redutase # 272 95% 9e-74

* Os números identificam a cópia do gene presente no genoma. # Esta enzima é codificada por um gene do DNA cromossomal e um gene do DNA plasmidial, porém ambas apresentaram alta sobreposição com tfdF.

Os genes tfd de Cupriavidus necator JMP134 estão todos localizados em um

plasmídeo denominado pJP4 (TREFAULT et al., 2004). A estirpe Burkholderia

xenovorans LB400 apresenta todos os genes que codificam proteínas similares às

codificadas pelos genes

importante, pois poderia assegurar maior estabilidade na man

de degradação da estirpe, quando comparada com a presença destas rotas em DNA

plasmidial.

A estirpe Achromobacter xylosoxidans

proteínas com similaridades às codificadas pelos genes

casos, no DNA cromossomal

plasmidial (plasmídeo pA81

entre cromossomo e plasmídeo, nada impede que

tenha potencial de degradação, pois esta estirpe também apresentou enzimas

idênticas, quanto a sua nomenclatura, as da estirpe padrão, o que sugere sua potencial

capacidade de expressar as enzimas necessárias à rota de degradação do 2,4

Figura 17. Tela do NCBI com o resultado da identificação de cromossomos e plasmídeos no genoma de

LB400 apresenta todos os genes que codificam proteínas similares às

codificadas pelos genes tfd localizados no DNA cromossomal. Esta característica é

importante, pois poderia assegurar maior estabilidade na manutenção da capacidade


Achromobacter xylosoxidans A8 apresentou os genes que codificam as

proteínas com similaridades às codificadas pelos genes tfd

casos, no DNA cromossomal (cromossomo NC014640) e, em outros, no DNA

plasmídeo pA81 - NC014641) (Figura 5). Mesmo apresentando esta divisão

entre cromossomo e plasmídeo, nada impede que Achromobacter x

otencial de degradação, pois esta estirpe também apresentou enzimas


capacidade de expressar as enzimas necessárias à rota de degradação do 2,4

Tela do NCBI com o resultado da identificação de cromossomos e plasmídeos no genoma de Achromobacter xylosoxidans A8.

22

LB400 apresenta todos os genes que codificam proteínas similares às

localizados no DNA cromossomal. Esta característica é

utenção da capacidade


A8 apresentou os genes que codificam as

tfd presentes, em alguns

e, em outros, no DNA

Mesmo apresentando esta divisão

Achromobacter xylosoxidans A8

otencial de degradação, pois esta estirpe também apresentou enzimas


capacidade de expressar as enzimas necessárias à rota de degradação do 2,4-D.

Tela do NCBI com o resultado da identificação de cromossomos e

23

A proteína codificada pelo gene tfdA de Cupriavidus necator JMP134 apresentou

sobreposição de 98% com uma proteína codificada por um gene localizado no DNA

cromossomal, diferentemente da estirpe padrão que apresenta os genes tfd no DNA

plasmidial. A codificada pelo gene tfdB mostrou sobreposição também de 98% com a

proteína 2,4-diclorofenol 6-monoxigenase, mesma proteína encontrada na rota de

degradação do 2,4-D da estirpe padrão, codificada por gene do DNA cromossomal. A

proteína codificada pelo gene tfdC possui sobreposição de 98% com a proteína

clorocatecol 1,2-dioxigenase, mesma proteína resultante do tfdC e também codificada

por gene presente no DNA plasmidial. A proteína codificada pelo gene tfdD apresenta

sobreposição com a proteína cloromuconato cicloisomerase que é codificada por gene

localizado em DNA plasmidial. A proteína codificada pelo gene tfdE mostrou

sobreposição com uma proteína codificada por um gene presente no DNA plasmidial. A

proteína codificada pelo gene tfdF apresentou sobreposição com a proteína

maleilacetato redutase, sendo uma codificada por um gene presente no DNA plasmidial

e outra no DNA cromossomal, ambas apresentadas na Figura 6.

Figura 18. Localização dos genes similares aos genes tfd no DNA da Achromobacter xylosoxidans A8 conforme resultados gerados pelo BLAST contra o banco RefSeq de genomas

24

Como dito anteriormente, a presença destes genes não significa que estas

estirpes são capazes de expressá-los, sendo necessários ensaios laboratoriais para

ratificar estas hipóteses. A análise de possíveis patogenicidades também se faz

necessária, pois, segundo Lucatelli et al. (2009), a bactéria Achromobacter

xylosoxidans é um bacilo gram-negativo pertencente à microbiota humana,

especialmente pele e trato gastrintestinal, possível causadora de conjuntivite no Rio

Grande do Sul. Ponezi et al. (2005) e Santos (2008) publicaram artigos relatando a

existência de A. xylosoxidans e B. xenovorans, respectivamente, em solos brasileiros

contaminados, evidenciando a possível biorremediação dada através destes

microrganismos. Podemos denotar que seria interessante uma análise mais apurada

destas espécies na busca por degradadoras de herbicida que já são encontradas em

território nacional.

25

4. CONCLUSÕES

Os resultados obtidos sugerem que Achromobacter xylosoxidans A8 e

Burkholderia xenovorans LB400 evidenciam potencial para degradar o 2,4-D em função

da similaridade encontrada entre genes presentes em seus genomas em relação aos

da rota de degradação de Cupriavidus necator JMP134. Estudos mais detalhados se

fazem necessários para caracterizá-las como verdadeiras biodegradadoras, bem como

para certificar a ausência de patogenicidade para determinação dos cuidados em sua

aplicação. Cabe ressaltar que as duas estirpes em questão já foram encontradas e

estudadas em solo brasileiro, conforme visto em literaturas. Como a estirpe

Cupriavidus necator JMP134 foi isolada primeiramente na Austrália, seria de grande

valor a descoberta de novos degradadores de herbicida encontrados em solo nacional,

ressaltando a importância desses microrganismos já estarem adaptados às condições

de clima, solo, pH, dentre outros. Comparações estruturais moleculares nos sítios de

reação das proteínas codificadas pelos genes das estirpes identificadas e da padrão

serão realizadas na sequência de nossas análises com intuito de ratificar os potenciais

em questão. O uso da bioinformática tem se mostrado eficaz otimizando o tempo em

pesquisas laboratoriais, tornando o enfoque mais incisivo e específico e viabilizando

um estudo prévio de baixo custo em organismos disponíveis em coleções de cultura,

aumentando as chances de obtermos bons resultados.

26

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABREU, J. M. Agrotóxicos: Sinônimo de Destruição e Morte , Monografia do curso de Pós-graduação Lato-Senso da FIJ – Faculdades Integradas de Jacarepaguá, 2007. 66p. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA – ANVISA - Sistema de Informações sobre Agrotóxicos (SIA) . Disponível em: <http://www.portal.anvisa.gov.br>. Acesso em: 12 de Junho de 2012. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS – ABNT - NBR 10004/2004 – NORMA BRASILEIRA - Resíduos Sólidos: Classificação – Rio de Janeiro, 2004. 71p. Disponível em: <http://www.aslaa.com.br/legislacoes/NBR10004-2004.pdf>. Acesso em: 28 de Novembro de 2011. BANSAL, A. K. Bioinformatics in microbial biotechnology – a mini review. Microbial Cell Factories , v.4, n.1, p.4-19, 2005. BOMBARDI, L. M. Intoxicação e Morte Por Agrotóxicos no Brasil: A Nova Versão do Capitalismo Oligopolizado, Professora do Programa de Pós Graduação em Geografia Humana – USP, Boletim da Taluta – Artigo do mês: Setembro de 2011, p21. CASTILHOS JÚNIOR, A. B. Resíduos Sólidos Urbanos: aterro sustentável para municípios de pequeno porte . Coordenador. Rio de Janeiro: ABES/RiMa, 2003, 294p. CONCEIÇÃO, M. Z. Segurança nas aplicações de herbicidas. CONGRESSO BRASILEIRO DA CIÊNCIA DAS PLANTAS DANINHAS, 23, Foz do Iguaçu, Anais ... Foz do Iguaçu: Sociedade Brasileira da Ciência das Plantas Daninhas, 2000. p:46-48. CONSELHO NACIONAL DO MEIO AMBIENTE - CONAMA. Resolução Nº 396 de 3 de Abril de 2008. Publicada no DOU nº 66, de 7 de abril de 2008, Seção 1, páginas 64-68 Disponível em: <http://mma.gov.br/port/conama/legiano.cfm?codlegitipo=3&ano=2008>. Acesso em: 07 de Novembro de 2011. DIREITO, I. C. N. Detecção de genes degradadores de compostos aromáti cos em solos de rizosfera sob manejo convencional e orgâni co , Dissertação de mestrado (Pós-Graduação em Biotecnologia Vegetal) – UFRJ, Rio de Janeiro, 2005 Orientadores: Andrew Macrae e Leda Cristina Santana Mendonça Hagler. 90p. Disponível em <http://www.lbsbm.microbiologia.ufrj.br>. Acesso em 25 de Novembro de 2011. DIREITO, I. C. N. Bioprospecção e interações de populações bacteriana s degradadoras do herbicida 2,4-D em solos agrícolas , Tese de Doutorado (Pós-Graduação em Biotecnologia Vegetal) – UFRJ, Rio de Janeiro, 2009 Orientadores:

27

Andrew Macrae e Leda Cristina Santana Mendonça Hagler. 190p. Disponível em <http://www.lbsbm.microbiologia.ufrj.br>. Acesso em 25 de Novembro de 2011. EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA E AGROPECUÁRIA – EMBRAPA - Disponível em <http://www.embrapa.gov.br/imprensa/artigos/2004> Acesso em 24 de Novembro de 2011. FERREIRA, R.R. Introdução à Bioinformática - Centro de Biologia Genômica e Molecular (PUCRS) Apostila do Instituto de Informática (UFRGS), Uberaba, 2005. 33p.

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