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Implementação de uma metodologia analitica para a análise conjunta de pesticidas organoclorados e

bifenilos policlorados em matrizes sólidas por cromatografia gasosa

Punil Sanatcumar

Dissertação para obtenção do Grau de

Mestre em

Engenharia Quimica

Orientadores

Prof.ª Margarida Maria Portela Correia dos Santos Romão,

Eng.ª Maria Paula Machado de Barros Viana

Júri

Presidente: Prof. Sebastião Manuel Tavares da Silva Alves Orientador: Prof.ª Margarida Maria Portela Correia dos Santos Romão,

Vogal:Doutor Pedro Manuel da Fonseca Antunes

Abril 2014

https://fenix.ist.utl.pt/publico/finalDegreeWorks.do?method=viewFinalDegreeWorkProposal&finalDegreeWorkProposalOID=2396592256517&contentContextPath_PATH=/estudante/estudante&_request_checksum_=6ba82cdb86ada9b334d25c59b7bf24bb4b42b90b




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Agradecimentos:

Agradeço às minhas Orientadoras, Engenheira Paula Viana e Professora Margarida Santos, pela ajuda e disponibilidade em orientar este trabalho. Agradeço à Doutora Vanda Reis da Agência Portuguesa do Ambiente pela autorização dada para elaborar este relatório. Agradeço à Doutora Claudia Gama e ao Doutor Pedro Antunes, pela ajuda dada na elaboração deste relatório. Agradeço a todos os meus antigos colegas e amigos da Agência Portuguesa do Ambiente por toda ajuda dada durante o meu periodo no Laboratório.

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Resumo

Neste trabalho estudou-se e implementou-se uma metodologia analítica para análise de 11

PCBs e 13 pesticidas organoclorados em sedimentos. Devido à persistência, bioacumulação e

toxicidade destes compostos é necessária a sua análise e controlo em diversos compartimentos

ambientais.

A quantificação dos compostos foi realizada por cromatografia gasosa capilar com detector de

captura de electrões (GC-ECD) após extracção por Soxhlet. Na figura 1 apresenta-se a

metodologia analítica desenvolvida.

Figura 1- Resumo da metodologia desenvolvida.

Foram estudados vários factores tais como: a dimensão das partículas de sedimento, o tempo de

extracção, as colunas de purificação, a velocidade de concentração dos extractos, identificação,

linearidade, gama de trabalho, limiares analíticos, brancos, cartas de controlo, precisão e

exactidão.

A validação do método foi baseado nos critérios da norma internacional ISO/IEC 17025, no Guia

da Relacre (associação de laboratórios acreditados de Portugal) e no “Guia para a Acreditação

de laboratórios Quimicos” do Instituto Português de Acreditação. [1][2][3]

Os pesticidas organoclorados foram estudados recorrendo aos Materiais de Referência

Certificados (MRC´s) e a amostras fortificadas. Os PCB´s foram estudados recorrendo aos

MRC´s e pela participação nos ensaios interlaboratoriais.

As percentagens de recuperação para os pesticidas organoclorados foram de 88% a 101 %, com

coeficiente de variação menor que 15% o que permite garantir que o método é robusto e

preciso.

Secagem (Liofilização)

Peneiração,

(x<106m) 2 gramas

Extracção por Soxhlet durante 20 horas, 200ml da mistura

hexano/diclorometano(1:1)

Concentração do extracto

até 1ml.

Purificação nos cartuchos de Alumina Neutra, 20 ml solução

Hexano/Diclorometano (15:5)

Concentração da solução obtida até

1 ml

Análise e quantificação dos compostos por GC-ECD.

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O -endossulfão, no entanto, apresenta 60 % de percentagem de recuperação, mas verifica-se

através do desvio padrão (6%) que o método é preciso.

Os PCB´s apresentam percentagens de recuperações de 75 % a 104 %, com o coeficiente de

variação menor que 15%.

Os resultados de Z-score obtidos nas participações interlaboratoriais foram menores que1,2

(i.e. resultados satisfatorios). Os resultados permitem concluir que o método é preciso e

robusto.

Abstrate

The purpose of this work is to study and implement an analytical methodology for the analysis of

13 organochlorine pesticides and 11 congeners Polychlorinated Biphenyls (PCBs) in sediments.

The quantitation of the compounds was performed by gas chromatography with electron capture

detector (GC- ECD) and using Soxhlet as extraction technique.

Due to the persistence, bioaccumulation and toxicity of these compounds its required their

analysis and control in various environmental compartments.

Various factors were studied, such as: particle size , time of extraction, purification step,

concentration rate of the extracts, selectivity, linearity, range of application, limits of detection and

quantification, blank samples, precision and accuracy.

The method validation was based on the criteria of the international standard ISO/IEC17025, the

RELACRE Guide (association of accredited laboratories Portugal) and the "Guide for the

Accreditation of Laboratories Chemicals" from the Portuguese Accreditation Institute.

The organochlorine pesticides were tested using the Certified Reference Materials (CRM's) and

with fortified samples. The PCBs were studied using the MRC's and the proficiency testing

schemes (PT-schemes).

The organochlorine pesticides recovery rates vary between 88 % and 101 %, with standard

deviation less than 15%; thereby ensuring that the method is robust and accurate.

The -endosulfan has 60% recovery, however, the standard deviation (6%) ensure the method

is accuracy.

The PCBs recovery rates vary between 75% to 104 % with the coefficient of variation less than

15%.The PT-schemes performances were all satisfactory ( Z-score less than 1.2 ). The results

indicate that the method is accurate and robust.

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Indice

Agradecimentos Página 1

Resumo Página 2

Abstrate Página 3

Indice Página 4

Lista de figuras, quadros e acrónimos Página 5

Agência Portuguesa do Ambiente Página 7

1- Introdução Página 8

i- Analitos Página 10

ii- Técnicas de extracção das amostras Página 12

iii- Cromatografia gasosa com detector de captura de electrões Página 16

iv- Validação do método Página 17

v- Plano de trabalho Página 22

2- Parte Experimental Página 23

2.1- Material e reagentes Página 23

2.2- Secagem Página 23

2.3- Escolha da dimensão das partículas Página 24

2.4- Extracção Página 25

2.4.1- Solventes orgânicos Página 25

2.4.2- Extracção por soxhlet Página 26

2.5- Concentração Página 27

2.6- Remoção de enxofre Página 27

2.7- Purificação Página 28

2.7.1- Interferências no detector Página 29

2.7.2- Liner Página 29

2.7.3- “Tailing” na coluna Página 29

2.8- Ensaios de purificação Página 30

2.9- Concentração Final Página 30

2.10- Análise e quantificação Página 31

2.11- Esquema da metodologia desenvolvida Página 32

3- Resultados e discussão Página 33

3.1- Ensaio de concentracao das amostras Página 33

3.2- Ensaio nas colunas de Alumina Página 34

3.3- Ensaios em colunas de Florisil Página 37

3.4 - Comparação das colunas de purificação testadas Página 39

3.5 - Validação do método Página 40

3.5.1- Identificação e selectividade Página 40

3.5.2- Gama de linearidade Página 40

3.5.3- Gama de trabalho Página 41

3.5.4- Limiares analíticos Página 42

3.5.5- Ensaios em brancos Página 44

3.5.6- Cartas de controlo Shewhart Página 44

3.5.7- Precisão e exactidão dos PCBs Página 45

3.5.8- Precisão e exactidão dos pesticidas organoclorados. Página 46

4- Conclusão Página 48

5- Bibliografia Página 49

Anexo 1- Propriedades dos PCBs Página 51

Anexo 2- Propriedades pesticidas organoclorados. Página 54

Anexo 3- Linearidade da gama de trabalho no GC-ECD Página 58

Anexo 4- Cartas de controlo Shewhart Página 62

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Lista de figuras, quadros e acrónimos.

Figura 1- Resumo da metodologia desenvolvida. Página 2

Figura 2- Esquema da extracção por Soxhlet. Página 13

Figura 3- Aparelho de Soxhlet Automático. Página 13

Figura 4- Aparelho de ASE. Página 14

Figura 5- Aparelho de Ultra-sons. Página 15

Figura 6- Aparelho de EFS. Página 15

Figura 7- Variação da eficiência da coluna com a velocidade linear do gás de arraste. Página 17

Figura 8- Cromatogramas de GC-MS duma amostra em diferentes granulometrias. Página 25

Figura 9- Aparelho de Soxhlet Página 26

Figura 10- Cromatograma da amostra de sedimento X com enxofre. Página 27

Figura 11- Cromatograma da amostra de sedimento X sem enxofre. Página 27

Figura 12- Fotos de uma amostra extraída, sem purificação e com purificação. Página 28

Figura 13- Cromatograma da amostra de sedimento X sem purificação e com purificação. Página 29

Figura 14- Foto de liner limpo e contaminado. Página 29

Figura 15- Cromatograma de um composto sem tailing e com tailing. Página 30

Figura 16- Fluxograma da metodologia analítica desenvolvida. Página 32

Figura 17- Resultados dos PCB´s (Aquacheck e MRC). Página 46

Figura 18- Resultados dos pesticidas organoclorados no MRC. Página 47

Figura 19- Propriedades dos PCB28 e PCB31. Página 51





Figura 24- Propriedades do PCB128. Página 53

Figura 25- Propriedades do -HCH e Heptacloro. Página 54

Figura 26- Propriedades do Heptacloroepóxido e p,p-DDE. Página 54

Figura 27- Propriedades do Lindano e -HCH. Página 55

Figura 28- Propriedades da Endrina e Dieldrina. Página 55

Figura 29- Propriedades da Aldrina e -Endossulfão. Página 56

Figura 30- Propriedades da pp-DDD e -Endossulfão. Página 56

Figura 32- Gráficos da linearidade do pcb 105 e pcb 180 Página 58

Figura 33- Gráficos da linearidade do pcb 170 e pcb 153. Página 58




Figura 37- Gráficos da linearidade do pcb 31 e heptacloroepoxido. Página 59

Figura 38- Gráficos da linearidade da endrina e aldrina. Página 59

Figura 39- Gráficos da linearidade do heptacloro e lindano. Página 60

Figura 40- Gráficos da linearidade do hexaclorobenzeno e alfa-HCH. Página 60

Figura 41- Gráficos da linearidade do delta-HCH e beta-endossulfão. Página 60

Figura 42- Gráficos da linearidade do pp-ddd e pp-dde. Página 60

Figura 43- Gráficos da linearidade da dieldrina e alfa-endossulfão. Página 61

Figura 44- Cartas de controlo do pcb 28 e pcb 31. Página 62





Figura 49- Cartas de controlo do pcb 180 e alfa-HCH. Página 63

Figura 50- Cartas de controlo do hexaclorobenzeno e lindano. Página 63

Figura 51- Cartas de controlo do delta-HCH e heptacloro. Página 64

Figura 52- Cartas de controlo do aldrina e heptacloroepoxido. Página 64

Figura 53- Cartas de controlo do alfa-endossulfão e pp-dde. Página 64

Figura 54- Cartas de controlo do dieldrina e beta-endossulfão. Página 64

Figura 55- Cartas de controlo do pp-ddd e endrina. Página 65

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Quadro 1- Propriedades da Acetona e Acetonitrilo. Página 25

Quadro 2- Propriedades do Diclorometano e Hexano. Página 26

Quadro 3- Propriedades do Isoctano e Tolueno. Página 26

Quadro 4- Programa de temperatura no GC-ECD. Página 31

Quadro 5- Condições de operação do detector. Página 31

Quadro 6- Resultados dos ensaios dos compostos levado à secura. Página 33

Quadro 7- Resultados da purificação usando cartuchos de alumina (ensaio 1). Página 34

Quadro 8- Resultados da purificação usando cartuchos de alumina (ensaio 2). Página 35

Quadro 9- Resultados da purificação usando cartuchos de alumina (ensaio 3 e 4). Página 36

Quadro 10- Resultados da purificação usando cartuchos de florisil (ensaio 5). Página 37

Quadro 11- Resultados da purificação usando cartuchos de florisil (ensaio 6). Página 38

Quadro 12- Resultados da purificação usando cartuchos de florisil (ensaio 7 e 8). Página 39

Quadro13- Identificação e confirmação do organoclorados. Página 40

Quadro 14- Concentração das soluções de calibração dos organoclorados. Página 41

Quadro 15- Equações da curva de calibração dos organoclorados. Página 42

Quadro 16- Limites de detecção dos compostos. Página 43

Quadro 17- Limites de quantificação dos compostos. Página 44

Quadro 18- Resultados dos PCB´s obtidos pela partipação em ensaios interlaboratoriais. Página 45

Quadro 19- Compilação dos resultados dos PCB´s. Página 45

Quadro 20- Resultados dos pesticidas organoclorados obtidos pelo MRC. Página 46

Quadro 21- Resultados dos pesticidas organoclorados obtidos pela amostra fortificada. Página 47

APA: Agencia Portuguesa de Ambiente

LRA: Laboratório de Referência do Ambiente

PCB´s: Compostos Bifenilos Policlorados

MRC´s: Materiais de Referencia Certificados

GC-ECD: Cromatografia gasosa capilar com detector de captura de electrões

GC-MS: Cromatografia gasosa capilar acoplado à espectrometria de massa

POP´s: Poluentes Organicos Persistentes

Ko,a: Coeficiente de partição octanol-água

H: Constante de Henry

HCH: Hexaclorociclohexano

p,p´-DDE: 2,2-bis-p-clorofenil-1,1-dicloroetileno

p,p´-DDD: 2,2-bis-p-clorofenil-1,1-dicloroetano.

p,p´-DDT: 2,2-bis-p-clorofenil-1,1,1-tricloro-etano

ASE: Extracção Acelerada por Solventes

EFS: Extracção por Fluído Supercrítico

WHO: World Heath Organization,

EPA: United States Environmental Protection Agency

OSPAR: Protecting and Conserving the North East Atlantic and its Resources

RT Corp: Resource Techonology Center

LD: Limite de Detecção

LQ: Limite de Quantificação

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Agência Portuguesa do Ambiente

Este trabalho foi realizado em 2003, no Laboratório de Referência do Ambiente- Agência

Portuguesa de Ambiente (APA), no Sector dos Orgânicos.

O Laboratório de Referência do Ambiente faz parte da Rede Laboratorial da APA.

A Agência Portuguesa de Ambiente é um serviço de Ministério do Ambiente, do Ordenamento do

Território e Energia, encarregado do estudo, concepção, coordenação, planeamento e apoio

técnico e normativo na área da gestão do ambiente e da promoção do desenvolvimento

sustentável, da prossecução das políticas que visem a participação e informação dos cidadãos e

das organizações não governamentais de defesa dos valores e qualidade ambientais.

A actividade do Laboratório de Referência do Ambiente (LRA) cobre todas as atividades

laboratoriais; essas atividades abrangem a implementação, validação e otimização de métodos

analíticos, a execução de ensaios e a consultadoria técnico-científica, que é prestada a uma

diversificada carteira de clientes tanto do sector público como privado;

A Direcção de Serviços do Laboratório de Referência do Ambiente é formado por 5 sectores que

efectuam ensaios em amostras colhidas nas matrizes água, lama, solo, sedimento, resíduo

sólido, ar, óleo e biota. Os sectores que o compõem são Quimica Geral, Metais, Orgânicos e

Biologia e Qualidade do Ar.

A coordenação do Sector dos Orgânicos, durante a elaboração deste trabalho, era do cargo da

Engenheira Paula Viana.

Actualmente, a chefia está ao cargo do Doutor Pedro Antunes.

Rua da Murgueira, Bairro do Zambujal – Alfragide

2721-865 Alfragide

http://www.apambiente.pt

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1- Introdução

O crescente desenvolvimento industrial e tecnológico torna hoje imperativo a preservação do

meio ambiente. Existe hoje maior preocupação dos países, tanto pelas autoridades como pela

opinião pública, no sentido da conservação da fauna e flora e também das consequências

negativas que os poluentes possam criar para o ser humano.

Entre os vários poluentes encontram-se estes 13 pesticidas organoclorados e 11 bifenilos

policlorados (PCB´s). Pertencem à Lista I da Directiva da Comunidade Europeia – 76/464/CEE

sobre substancias perigosas no meio aquatico , formando um grupo substâncias prioritárias pelo

seu grau de risco para a saúde humana e ambiente.

Fazem parte dos Poluentes Orgânicos Persistentes (POPs) definidos pela convenção� OSPAR

como compostos que apresentam persistência, toxicidade e bioacumulação. [4]

Actualmente estes compostos são proibidos no País.

As propriedades físico-químicas dos analitos em estudo que melhor definem a sua interacção no

meio ambiente são a solubilidade na água, a pressão de vapor, constante de Henry, coeficiente

de partição octanol-água.[3]

A pressão de vapor indica a distribuição entre a fase liquida e gasosa .

A constante de Henry, H, reflecte a tendência de um composto para volatilizar.

O coeficiente de partição octanol-água, Ko,a , obtém-se do coeficiente da concentração do analito

no octanol e da concentração do mesmo na água. Valores elevados de Ko,a entre 5-6 indicam

clara afinidade para as matrizes de sedimento e biota. Este coeficiente indica também o caracter

lipofílico e a afinidade para a matéria orgânica visto que os sistemas lípido-água e orgânico-água

são semelhantes ao sistema octanol-água. O Ko,a reflecte ainda a polaridade do composto, pois

valores de 1-1.5 indicam compostos polares e valores de 4-5 apolares. [5]

Estas características hidrofóbicas, lipofílicas e apolares ou moderadamente polares influenciam

na afinidade ao biota e às partículas do sedimento pelas suas elevadas áreas superficiais, daí

que estes compostos no meio aquático tendem a adsorver-se nestas matrizes.

O sedimento actua como um depósito destes compostos, e consequentemente funciona como

um importante alvo de estudo destes compostos.[6]

Os organismos que se alimentam por filtração de sedimento (como os bivalves), ou peixes de

fundo em contacto com partículas em suspensão são os mais expostos a estes contaminantes. A

elevada massa lípida do biota na época de reprodução, nomeadamente dos peixes, confere

riscos acrescidos. [7]

A afinidade às micropartículas do ar confere mobilidade aos poluentes, permitindo atingir zonas

remotas e contaminar ambientes muito longe das fontes de poluição.

Os indivíduos sobreviventes às contaminações toleram mais este tipo de compostos e verifica-se

um aumento de contaminação ao longo da cadeia trófica pois são transmitidos poluentes de

indivíduos da base da cadeia até ao topo.[7]

Este aumento ao longo da cadeia trófica deve-se ao facto dos compostos em estudo serem

persistentes e bioacumuláveis e para compostos com elevada massa molecular não ser possível

a metabolização.

A degradação realiza-se em condições especiais e pode ser biotica ou abiotica.

A degradação biotica pode ser efectuada por bactérias (anaeróbicas e aeróbicas) ou por outro

tipo de microorganismos.

A degradação abiotica efectua-se por fotodegradação (pela radiação ultra-violeta) ou por

combustão. [8]

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Devido à persistência, bioacumulação e toxicidade dos PCB´s e pesticidas organoclorados no

meio ambiente foram considerados como fazendo parte de um grupo de subtâncias prioritárias,

pelo que se foram desenvolvidos vários métodos analíticos para a análise em diversas matrizes

ambientais.

As metodologias analíticas para as matrizes sólidas, nomeadamente sedimentos, implicam a

extracção por um solvente que possa ser analisado posteriormente por cromatografia.

A extracção de poluentes orgânicos em matrizes sólidas tem tido uma relevância considerável

nos últimos anos. Técnicas novas, como a extracção com fluído pressurizado (ASE) ou

extracção por fluído supercrítico (EFS), têm sido desenvolvidas com vista a introdução de maior

automatismo, à redução do tempo de extracção e do consumo de solventes. O automatismo

permite que as amostras depois de colocadas no carrossel sejam extraídas sem a interferência

do analista, deixando-o livre para outras tarefas.

Embora haja cada vez mais laboratórios com estes novos métodos de extracção, o método

tradicional de extracção por Soxhlet continua a ser o método de eleição e é usado como

referência sempre que se testam novos métodos.[9]

No entanto, os diversos métodos de extracção não são selectivos relativamente aos vários

analitos, sendo extraídos compostos não pretendidos que possuem afinidade aos solventes

orgânicos usados.

Os compostos interferentes podem ser ácidos orgânicos, fenóis, açúcares, óleos, lípidos,

pigmentos com diferente coloração. Estas impurezas possuem normalmente características que

permitem ser detectados por cromatografia e conduzir, não só a presença de picos susceptíveis

de interferir na análise, mas também a contaminação do aparelho, em particular, a coluna e o

detector.

Deste modo, o extracto obtido necessita de purificação. O processo de purificação a selecionar

varia consoante o tipo de amostra, compostos pretendidos, método de extracção, sensibilidade

requerida e tipo de detector usado. As colunas de enchimento de Sílica, Alumina e Florisil são

recomendadas para a purificação dos extractos provenientes das amostras sólidas.[10]

Após o desenvolvimento duma metodologia, a validação implica o cumprimento de determinados

requisitos que dependem do tipo de método em causa e compreendem o estudo e conhecimento

dos seguintes parâmetros: identificação, linearidade, gama de trabalho, limiares analíticos,

brancos, cartas de controlo, precisão e exactidão.

O processo de avaliar a exactidão de um metodologia é essencialmente obtida utilizando

materiais de referência certificados (MRC) e pela participação em ensaios interlaboratoriais.[2]

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i- Analitos

A metodologia analítica incide sobre 11 PCB´s e 13 pesticidas organoclorados.

Os PCB´s são: PCB 28, PCB 31, PCB 52, PCB 101, PCB 118, PCB 153, PCB 105, PCB 128,

PCB 156, PCB 180, PCB 170.

Os pesticidas organoloclorados são: -HCH, Hexaclorobenzeno, Lindano, -HCH, Heptacloro,

Aldrina, Heptacloroepóxido, -endossulfão, p,p´-DDE, Dieldrina, -endossulfão, p,p´-DDD e

Endrina.

Bifenilos Policlorados - PCB´s

Os Bifenilos Policlorados (PCB´s) são compostos orgânicos de origem industrial muito estáveis

obtidos pela cloração de bifenilos e tendo como catalisador cloreto de ferro.

São uma classe de compostos em que 1 a 10 átomos de cloro podem combinar-se e preencher

os núcleos do grupo bifenilo formando 209 isómeros. As fórmulações industriais são conhecidas

como por Aroclors, Clorphens, Phenclors que contêm misturas destes isómeros com diferentes

percentagens de cloro.[6]

Estão presentes nos equipamentos electrónicos (como transformadores e condensadores), nos

plastificantes, em tintas e colas, nos óleos lubrificantes e diluentes orgânicos.

Tais aplicações devem-se às suas propriedades físicas e químicas como por exemplo: boa

condutividade térmica, elevada constante dieléctrica, estabilidade térmica e química, baixa

solubilidade em água e miscibilidade com solventes orgânicos.[8]

O potencial tóxico e cancerígeno dos PCB´s está directamente relacionado com a configuração

espacial da molécula. Ao contrário das dioxinas ou dibenzofuranos os anéis fenílicos dos PCB´s

não são rigidamente ligados no mesmo plano e a conformação preferêncial é não coplanar.

Os PCB´s mais tóxicos são os que tem cloro nas posições para, 4 e 4´, e pelo menos 2 metas, 3

3´ 5 5´, mas não em orto, 2 2´6 6´, visto que a não existência de orto substituição pode levar a

configuração coplanar. Sendo a toxicidade realçada pela coplanaridade leva os 4 mais tóxicos

são: 77, 126,169 e 81.[8]

Os PCB´s mais clorados estão menos disponíveis para organismos vivos, porque estão mais

ligados ao solo e sedimento e estão presentes em baixa quantidade no ambiente. Os menos

clorados, até 4 cloros, são mais facilmente metabolizados e eliminados, não tendo tendência

para bioacumulação, sendo à excepção do PCB 77, considerados não tóxicos. Os que tem o

número de cloros moderados (penta , hexa, hepta) prefazem 112 dos 209 isómeros existentes e

tem mais tendência a bioacumulação.[8]

Dos 209 isómeros só cerca de 120 foram detectados no meio ambiente. A análise de rotina tem

como critério o potencial tóxico, persistência ambiental, abundância no tecido animal e legislação

em vigor.[6]

Actualmente não são permitidos equipamentos contendo PCB´s. A directiva europeia 96/56/EC

obriga os estados membros a criar legislação de modo a efectuar a eliminação completa e

controlada dos PCBs.

A entrada destes compostos no meio ambiente ocorre por acidentes ou negligência no

armazenamento de antigos equipamentos contendo os PCB´s. As fugas por derrame em antigos

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condensadores e/ou transformadores mal conservados são um exemplo destes contaminações.

[8]

Um dos exemplos de contaminação dos PCB´s foi o aumento de cancro entre os esquimós

apesar de viverem longe de qualquer centro contaminante.

Estas substâncias semi-voláteis foram arrastadas pelos ventos desde as industrias químicas da

América do Norte até à Antárctica, onde se incorporaram nas algas e plâncton, sendo

transmitidas ao longo da cadeia trofica: a população de esquimos alimenta predominantemente

de focas e os PCBs encontram acumulados na gordura das focas. [11]

Em Outubro de 1999, Lisboa presenciou um derrame no rio aquando dum carregamento de

equipamentos contendo PCB´s. As contaminações atingiram solos, água e biota.[12]

No anexo 1 apresentam-se as propriedades e estruturas dos PCBs.

Pesticidas Organoclorados

Os pesticidas organoclorados foram das maiores descobertas do século XX. Com o seu

desenvolvimento salvaram-se milhões de vida através do combate aos insectos portadores de

malária, febre amarela ou doença do sono. Constituíram um importante marco para a agricultura

moderna no combate às pestes.

No entanto, o uso excessivo e impróprio dos pesticidas ao longo dos anos acarretou problemas

nefastos ao ambiente e ao Homem. Na década de 60 tornou-se público as consequências

neurotóxicas que o DDT e outros insecticidas organoclorados da mesma classe traziam para a

saúde pública e ambiental. Motivados pelas consequências nefastas e pela opinião pública

muitos países começaram a abolir o uso de certos pesticidas organoclorados.[13]

A Aldrina, Dieldrina, Endrina, Hexaclorobenzenos, DDT (do qual o pp-DDD e pp-DDE são

produtos metabólicos), Heptacloro, Heptacloro epóxido, lindano e endossulfão são atualmente

proibidos no País.

São proibidos de acordo com a Convenção de Estocolmo (POPs) e também em termos da

legislação Europeia (pesticidas).

A venda dos pesticidas foi feita como misturas de vários compostos ou como único composto. O

produto comercial de HCH é uma mistura dos vários isómeros -HCH, -HCH, -HCH e -HCH.

O Lindano é essencialmente -HCH com pureza acima de 99%.

O produto comercial do DDT é uma mistura de 85% do isómero pp’-DDT e do isómero 15% op’-

DDT.[5]

A degradação dos pesticidas pode levar a formação de intermediários mais perigosos ou

simplesmente à formação de outros pesticidas. A degradação da Aldrina leva a formação

intermediária de Dieldrina, mais tóxica e persistente. O Heptacloro origina Heptacloro epóxido. A

degradação do pp’-DDT pode levar à formação dos pesticidas pp´-DDD e pp´-DDE.[5]

Os pesticidas após aplicação podem ser arrastados pelas águas da chuva para os lençóis de

água subterrâneas que chegam aos rios e lagos. A entrada dos pesticidas no meio aquático

pode também ser feita por transporte aéreo desde os locais de aplicação. Uma vez na água as

características lipofilicas destes pesticidas conduzem à adsorção nas micropartículas do

sedimento ou ao biota. A persistência, toxicidade e bioacumulação destes compostos tornam o

seu controlo fundamental, quer para a saúde pública, quer para a fauna e flora local.[4]

de 65

Estudo efectuado em Clear Lake, na Califórnia demostrou que a acumulação de pesticidas nos

tecidos não tem como única fonte a existência destes compostos na água e solo, também se

transmite ao longo da cadeia alimentar. Quanto maior for o posicionamento do indivíduo na

cadeia trofica maior será a acumulação. Verificou-se que o plâncton acumula 250 vezes o DDD,

peixes 12 000, pequenas aves que consomem estes peixes 80 000 e aves no topo da cadeia

aquática valores na ordem dos 100 000.

Os indivíduos sobreviventes toleram maior as quantidades de pesticidas, o que permite

acumulações em elevadas proporções sem causar a morte, sendo transmitida ao longo da

cadeia trófica até ao Homem.[11]

No anexo 2 apresentam-se as propriedades e estruturas dos pesticidas organoclorados.

ii- Técnicas de Extracção das Amostras

A análise por cromatografia gasosa não permite a injecção directa de matrizes sólidas.

A extracção das amostras consiste na transferência dos analitos da matriz sólida (neste caso

sedimentos) para um solvente onde os analitos sejam solúveis e que permita a injecção nos

aparelhos de identificação e quantificação.

Técnicas de extracção recentes como a extracção com fluído pressurizado (ASE) ou extracção

por fluído supercrítico (EFS) foram desenvolvidas face a relevância que esta área tem ganho nos

últimos anos.

Em seguida são referidos os métodos de extracção por Soxhlet, Soxhlet Automático, Acelerada

por Solventes (ASE), Ultra-Sons e Fluído Supercrítico (EFS).

Método de Soxhlet.

Neste método pesam-se entre 2 a 10 gramas de amostra sólida para um cartucho de celulose e

coloca-se no aparelho de Soxhlet.

Junta-se à amostra sulfato de sódio anidro para impedir que os vestígios de água criem

barreiras de contacto entre a fase orgânica e a matriz sólida.

Adiciona-se no balão de Soxhlet o solvente apropriado e aquece-se lentamente numa manta de

aquecimento. O volume de solvente é cerca de 200 ml, variando consoante o volume do

aparelho de Soxhlet.

Na figura 2 apresenta-se um esquema da extracção por Soxhlet.

À medida que o solvente passa para o estado gasoso, atravessa o tubo A e passa ao estado

líquido no condensador de refluxo, acabando por cair no cartucho de celulose. Quando o

solvente atinge o topo do tubo B na camisa de Soxhlet, é sifonado para o balão juntamente com

o analitos extraídos da amostra no cartucho de celulose, terminando um ciclo. A temperatura da

manta de aquecimento recomendada pelas bibliografias deve ser tal que o número de ciclo por

hora seja quatro.

Os analitos extraídos têm normalmente a temperatura de ebulição superior ao solvente de

extracção, o que faz com que apenas o solvente seja recirculado, continuando os analitos no

balão.

A desvantagem deste método é o tempo tipico da extração: cerca de 16 horas.

Este método de extracção é moroso, consome muita energia e água, no entanto continua a ser

de referência nos laboratórios de química ambiental por ser muito eficiente para uma grande

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parte dos compostos; é usado como referência sempre que se comparam novos métodos de

extracção de amostras sólidas.[9]

Figura 2- Esquema da extracção por Soxhlet.

Método Soxhlet Automático

Neste método, também designado por Soxtec, a amostra inserida no cartucho, é colocado em

contacto com o solvente em ebulição durante 2 hora. De seguida, o extracto obtido é

concentrado directamente no Soxtec.

Tem a vantagem em relação ao método tradicional de consumir apenas 20 % solvente, ter a

duração de apenas 2 horas por amostra, e de a concentração poder ser feita directamente no

Soxtec.

No entanto o equipamento é relativamente caro, e não é eficiente para todos os compostos de

interesse ambiental.[9]

Na figura 3 apresenta-se um aparelho de Soxhlet Automático.

Figura 3- Aparelho de Soxhlet Automático

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Método de Extracção Acelerada por Solventes (ASE)

Este método usa a pressão e temperatura elevadas para extrair analitos de uma forma rápida e

eficiente da matriz sólida.

Temperaturas altas quebram as interacções fortes entre soluto-matriz causadas por forças de

Van der Waals, pontes de hidrogénio, ligações dipolo, o que origina melhor transferência de

massa e velocidade de difusão. Ocorre também a diminuição de viscosidade e tensão superficial

do solvente permitindo uma melhor penetração na matriz.

Como consequência, aumenta o poder extractivo do solvente.

Pressões elevadas mantém os solventes no estado líquido acima do seu ponto de ebulição,

permitindo que a extracção seja possível.

Esta técnica é a mais recente, e foi desenvolvida pela Dionex Corporation-USA, permitindo

extrair 24 amostras numa única sequência.

Na figura 4 apresenta-se um aparelho de ASE.

A amostra é colocada numa cápsula, que é posteriormente preenchida com o solvente

apropriado. Seguidamente a temperatura e pressão são elevadas entre 40-200ºC e 7-21 MPa,

respectivamente. Após um tempo pré-definido, normalmente 5 minutos, é introduzido solvente

fresco na cápsula, retirando o solvente anterior com os analitos para um colector. Esta limpeza

realiza-se com a passagem de uma corrente de azoto.

Este ciclo (de entrada e saida de solvente) é repetido 3 vezes.

O volume de solvente gasto é de cerca de 30 ml. O tempo total de extracção de cada amostra é

de cerca de 20 minutos.[9]

Figura 4- Aparelho de ASE.

Método de Extracção por Ultra-Sons

Este método usa a frequência na zona dos ultra-sons para quebrar as ligações de adsorção

analito-matriz.

Na figura 5 apresenta-se um aparelho de ultra-sons.

A amostra é colocada num recipiente de vidro apropriado juntamente com um volume de

solvente que cubra a amostra. Ao sistema é ligado uma sonda de ultra-sons, durante

aproximadamente 3 minutos. O solvente contendo os analitos extraídos é separado da amostra

por centrifugação e/ou filtração. Este ciclo é repetido 4 vezes para uma melhor extracção. O

aquecimento facilita a extracção.

A vantagem desta técnica é o uso de material de laboratório pouco complexo, a possibilidade de

várias extracções num único aparelho, o menor volume de solvente de extracção e um menor

tempo que o método de Soxhlet.

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A desvantagem deste método reside na eficiência da extracção ser baixa para muitos compostos

orgânicos de interesse ambiental.[9]

Figura 5- Aparelho de Ultra-sons.

Extracção por fluído supercrítico (EFS)

Este método utiliza as propriedades do fluído supercrítico para extrair selectivamente os analitos

em diversas matrizes.

Tal como se sabe, o termo fluído supercrítico é usado para descrever qualquer substância que

se encontra acima da sua temperatura e pressão crítica, desaparecendo a fronteira gás/líquido.

A semelhança com o líquido tem a haver com a solubilidade, enquanto que a semelhança com o

gás tem haver com a baixa viscosidade e tensão superficial que permite ao fluído penetrar nos

poros do sólido facilmente.

Um sistema de EFS utiliza como fluído supercrítico o dióxido de carbono. Esta escolha é devido

à baixa temperatura crítica (31ºC) e moderada Pressão crítica (74.8 atm), para além de ser

relativamente seguro de usar, do baixo custo e da não toxicidade. Apresenta a desvantagem do

CO2 não ter momento dipolar, restringindo a aplicação para os analitos não-polares ou

moderadamente polares. Para compensar esta desvantagem é adicionado um solvente orgânico

de modo a criar maior polaridade na mistura.

Na figura 6 apresenta-se um aparelho de extracção por fluído supercrítico.

A amostra é colocada num recipiente (extraction cell) por onde passa o fluxo de fluído. Após os

compostos de interesse terem sido extraídos o solvente pode ser recuperado baixando a

pressão. Os analitos podem ser transferidos directamente para um cromatógrafo gasoso ou ser

recolhido num solvente apropriado.

A baixa temperatura de extracção torna vantajoso para os compostos termicamente instáveis. O

tempo de extracção é cerca de 30 minutos. O caudal do fluído é de cerca de 2 ml/min e o volume

de solvente orgânico de recolha é cerca de 3 ml.[9]

Figura 6- Aparelho de EFS.

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Comparação das Técnicas de Extracção

O automatismo e menor tempo de extracção de técnicas recentes, como ASE, permitem que a

extracção das amostras seja claramente facilitada em comparação com o método tradicional de

Soxhlet. No entanto, os elevados custos de investimento tornam-no inacessíveis para

laboratórios de pequena escala.

Uma consideração importante a ter em conta com a extracção é a eficiência e eficácia. Estes

factores vão depender do analito, da matriz da amostra, dos solventes, bem como das condições

usadas durante a extracção.

Pela similaridade de características que diversos grupos de compostos possuem não é possível

ter uma extracção muito selectiva, embora possam ser feitos ajustes com a polaridade dos

solventes a usar; sendo aconselhável um passo de purificação dos extractos antes da análise

por cromatografia gasosa, conforme se explicará no capitulo 8.7.

A comparação dos diversos métodos de extracção permite ter a noção da eficiência, dos custos

e do tempo.

A escolha das técnicas de extracção actualmente existentes dependo do número de amostras a

analisar, custo de equipamento, custo do equipamento, do tipo de compostos orgânicos a

analisar.

Embora haja cada vez mais laboratórios com novos métodos de extracção, a técnica de Soxhlet

continua a ser um método eleição e é usado como referência sempre que se testam novos

métodos.

iii - Cromatografia gasosa com detector de captura de electrões (GC-ECD)

A cromatografia gasosa com colunas capilares permite uma elevada resolução, sensibilidade e reprodutividade da análise de um vasto campo de amostras. O uso de detectores selectivos e universais permite a obtenção de informação sobre os analíticos com uma elevada exactidão. As aplicações variam desde amostras ambientais, reconhecimento de doenças metabólicas a ciências forenses.[14] A escolha do equipamento cientifico depende das características dos compostos orgânicos que se pretende analisar. Os compostos halogenados possuem elevada afinidade electrónica. Os pesticidas organoclorados e os bifenilos policlorados ao possuírem estes elementos permitem ser detectados e analisados por cromatografia gasosa com detector de captura de electrões (GC-ECD). No entanto, é praticamente insensível a hidrocarbonetos, álcoois e cetonas. Gás de arraste Observando a figura 7 verifica-se que o aumento da velocidade linear média do hidrogénio não causa perdas na eficiência da coluna, ao contrário do hélio e do azoto (onde é mais significativa). A elevada velocidade linear do gás de arrastamento necessária à completa transferência da amostra é fornecida pelo uso de hidrogénio. O gás de arraste usado é o hidrogénio por permitir uma melhor resolução que o hélio. A presença de impurezas no gás de arrastamento, tais como água e oxigénio que competem com os solutos pelos electrões, fazem diminuir a resposta do detector. É necessário um gás de arraste com pureza elevada pois caso contrario existe o risco de danificar a coluna. [14]

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Figura 7- Variação da eficiência da coluna com a velocidade linear do gás de arraste.

Técnicas de injecção Existem várias técnicas de injecção de amostra que são usadas consoante as condições operatórias, o tipo, qualidade e concentração da amostra. As mais vulgares são o modo splitless e o modo split. A técnica de injecção usada neste trabalho é o modo splitless, pois estamos a analisar concentrações vestigiais. Neste modo o volume de amostra injectada é o volume que atravessa a coluna, não havendo purga da amostra. Estando a válvula de purga programada abrir por um tempo optimizado pelo operador para a limpeza do liner. Esta é uma técnica usada para amostra com concentrações baixas. Tem como principal vantagem um significativo aumento de sensibilidade. A transferência de todos os vapores da amostra volatilizada para a coluna demora algum tempo, pelo que é de esperar como desvantagem uma ligeira largura dos picos, que acaba por não ser relevante quando os compostos têm tempos de retenção distantes. O modo split é usado por analistas quando a amostra tem uma concentração elevada e não poder ser diluída, funcionado a válvula de purga para deixar escapar parte da amostra. [15] Detector de captura de electrões

O u-ECD tem uma fonte de 63Ni, que é um isótopo radiactivo. Este liberta partículas que colidem com as moléculas de gás de arraste para produzir electrões de baixa energia. Os electrões livres produzem uma corrente pequena (denominada de corrente de referência) que é recolhida e medida no circuito. Quando os componentes da amostra entram em contacto com os electrões livres dá-se a captura de electrões pelas molécula criando iões de carga negativa. Os electrões livres que sobram são recolhidos e comparados com a corrente de referência. Quando os compostos que capturam electrões passam o pulso aumenta. Os pulsos são convertidos em voltagem. Os iões passam sem efeito e escapam com o gás de arraste. O facto dos compostos halogenados possuírem elevada afinidade electrónica torna importante o detector de captura de electrões para a determinação de pesticidas organoclorados e bifenilos policíclicos. Este é um detector caracterizado pela sua elevada sensibilidade e baixa especificidade, o que torna necessário a purificação das amostras. A não realização da etapa de purificação pode originar o aparecimento de picos falsos e provocar a contaminação do detector. Utiliza-se azoto como gás de limpeza para o ECD depois da análise de cada uma das amostras. A temperatura do detector não deve ser inferior à da coluna para não provocar a condensação dos compostos no detector.[15]

iv- Validação do Método

A validação do método foi baseado nos critérios da norma internacional ISO/IEC 17025, do documento Guia Relacre e do documento “Guia para a Acreditação de laboratórios Quimicos” do Instituto Português de Acreditação (IPAC). [1][2][3]

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A norma internacional ISO/IEC 17025, é uma norma específica para laboratórios de ensaio e de calibração. A cláusula 5.4.5 desta norma, apresenta a “validação de métodos” como um dos requisitos técnicos importantes na qualidade assegurada dos laboratórios de ensaio, bem como a documentação do trabalho de validação. O documento da Relacre (associação de laboratórios acreditados de Portugal) fornece o guia para a validação de métodos internos de ensaios quimicos. O documento “Guia para a Acreditação de laboratórios Quimicos” estabece linhas de orientação a seguir pelos laboratórios acreditados ou canditados à acreditação. Como tal, são avaliados os seguintes parâmetros analiticos: seletividade, linearidade, gama de aplicação, limite de detecção e quantificação, brancos, cartas de controlo, precisão e exatidão. Identificação e selectividade A identificação dos organoclorados é feita de acordo com o seu tempo de retenção no GC-ECD. Para isso, é necessário injectar soluções padrão individuais dos diversos analitos. A possível presença nas amostras reais de compostos que eluem no mesmo tempo de retenção que os analitos a analisar torna necessário a confirmação dos picos positivos. A confirmação pode ser realizada com injecção no GC-MS ou num GC-ECD com uma coluna de polaridade diferente.

Gama de Linearidade A linearidade corresponde à capacidade do método em fornecer resultados diretamente proporcionais à concentração da substância em estudo, dentro de uma determinada faixa de aplicação. Devido à pequena gama de linearidade do GC-ECD é necessário estudá-la antes de traçar a curva de calibração. Este estudo consiste em determinar o intervalo da concentração da amostra em que a resposta do detector é constante. O intervalo de linearidade é definido como a alteração incremental da concentração da amostra detectada que produz uma alteração incremental do sinal dentro de uma gama de linearidade. A linearidade pode ser calculada usando a equação 1.

composto do centraçãoversus.concomposto do ãoconcentraç

1000x

interno padrão do sinal

composto do sinal do altura

(equação 1)

Os desvios superiores e inferiores de aceitabilidade são feitos pela média dos valores da ordenada com desvio de +20% e -20%.[2] Gama de trabalho A correlação entre o sinal medido (área ou altura do pico) e a massa ou concentração do composto a ser quantificado muito raramente é conhecida a priori. Na maior parte dos casos, a relação matemática entre o sinal e a concentração do composto deve ser determinada empiricamente, a partir de sinais medidos pelos padrões de calibração. Essa relação matemática pode ser expressa como uma equação de recta chamada de curva de calibração.

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O coeficiente de correlação da curva de calibração, r, permite uma estimativa da qualidade da curva obtida, pois quanto mais próximo de 1.0, menor a dispersão do conjunto de pontos experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regressão estimados. As amostras necessitam de ser diluidas caso a concentração seja superior ao padrão mais alto da curva de calibração. Método de Padrão Interno (PCB 198) O método de padrão interno consiste na preparação das soluções padrão de concentrações conhecidas, às quais se adiciona a mesma quantidade conhecida de um composto chamado padrão interno. Após a análise dessas soluções, constrói-se um gráfico, relacionando a razão de áreas (área da substância/área do padrão interno que tem concentração constante) com a concentração (variada) da substância. Às amostras também é adicionada a mesma quantidade conhecida do padrão interno. Através da razão de áreas obtidas no cromatograma tem-se a concentração da substância na amostra. O método de padrão interno é o mais aconselhado para a quantificação no GC-ECD. A construção do gráfico é realizada de acordo com a equação 2.

interno padrao do aoconcentrac

composto do aoconcentrac versus

interno padrao do altura

composto do altura

(equação 2)

sabendo que a concentração do padrão interno é constante teremos uma regressão linear, dada pela equação 3

B X x M Y (equação 3)

onde

interno padrao do altura

composto do altura Y e composto do aoconcentracX

os valores de M e X são constantes da regressão, e o valor de Y é dado pelo cromatograma. A escolha do padrão interno é baseada em:

não coluir com os compostos a analisar

ter o mesmo comportamento físico-químico que os compostos a analisar

não existir na mistura em análise (ou amostras ambientais)

Limiares Analíticos Os limiares analíticos são dados pelo limite de detecção (LD) e pelo limite de quantificação (LQ). O limite de detecção é o teor mínimo a partir do qual é possível detectar a presença do analito com uma certeza estatística razoável. Este limiar analítico corresponde ao inicio do intervalo em que é possivel distinguir com uma dada confiaca estatistica (normalmente 95%), o sinal do branco do sinal da amostra; e como tal indicar se o analito em questão está ausente ou presente. Uma leitura inferior ao LD não significa a ausência do analito a medir. Existem diversas fórmulas para o cálculo do limite de detecção, mas a que melhor se adapta para métodos cromatográficos, nas matrizes de sedimento é dada pela equação 4:

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x 3.3 LD (equação 4)

onde representa o desvio padrão associado à uma concentração vestigial e injectada ao longo de vários dias (n>10

O limite de quantificação (LQ) corresponde à menor concentração medida a partir do qual é possível a quantificação do analitos com uma determinada exactidão e precisão. Existem diversas fórmulas para o cálculo do limite de quantificação, mas a que melhor se adapta para métodos cromatográficos, nas matrizes de sedimento é dada pela equação 5:

x 10 LQ (equação 5)

onde representa o desvio padrão associado à uma concentração vestigial e injectada ao longo de vários dias (n>10). Na práctica deve usar-se o LQ como inicio da zona em que se reportam valores numéricos. Ensaios em brancos Trata-se de um controlo de qualidade interno. A análise de brancos em paralelo com as amostras é importante no caso de metodologias propicias a contaminação e fundamental na gama baixa de concentração. Deve ser reforçada caso haja alteração nos reagentes, materiais de lavagem usados ou outros factores susceptiveis de introduzir contaminações. Sendo assim, uma amostra sem contaminantes (previamente analisada) deve ser analisada seguindo a mesma a metodologia. Cartas de Controlo Shewhart As cartas de controlo Shewhart destinam-se ao controlo e evolução da resposta do equipamento ou do método. A carta de controlo é um tipo de gráfico utilizado para o acompanhamento durante um processo, determina uma faixa chamada de tolerância limitada pela linha superior (limite superior de controle) e uma linha inferior (limite inferior de controle) e uma linha média do processo(limite central), que foram estatisticamente determinadas. Trata-se de uma ferramenta poderosa para Controlo e Melhoria do Processo. O objetivo é verificar se o processo está sob controle. Este controle é feito através do gráfico. Permitem visualizar os pontos fora do limite de aceitação; mas também com a distribuição dos pontos pode-se a prever a futura performance. Uma investigação deve ser feita quando os pontos estão continuamente a descer ou a subir; mas também quando se encontram consecutivamente apenas num lado (superior ou inferior ao valor teorico). Mesmo num sistema controlado, existe uma probabilidade de 0.27% de encontrar pontos fora dos critérios de aceitação. Precisão e Exactidão A precisão é um termo geral que permite avaliar a dispersão de resultados entre ensaios independentes, repetidos sobre a mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões, em condições definidas. No entanto para minimizar os efeitos da matriz será mais realista estudar a precisão sobre amostras.

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A repetibilidade é umas das medidas para avaliar esta dispersão feitas no mesmo laboratório, com mesmos equipamentos, mesmo tipo de reagentes. O coeficiente de variação associada ao resultado final obtido avalia a precisão do método. A exactidão é definida como a concordância entre um resultado de ensaio e o valor de referência aceite como verdadeiro. Quando aplicado a uma série de resultados de ensaio, implica uma combinação de componentes de erros aleatórios e componentes de erros sistemáticos. Este parâmetro é avaliado essencialmente recorrendo a Materiais de Referência Certificados e a Ensaios Interlaboratoriais. Materiais de Referência Certificados (MRC) . Um Material de Referência Certificado (MRC) é um material com concentrações dos analitos considerados de referência para serem usados na avaliação de métodos de análise e na calibração química de aparelhos. Estes materiais constituem uma excelente ferramenta no controlo externo de qualidade de uma análise quimica. Nos MRC´s os valores das concentrações são acompanhados dum certificado emitido por um organismo de certificação. Um MRC possui um valor de concentração para cada analito e uma incerteza associada. A aquisição de um MRC terá que ser feita a um organismo fornecedor reconhecido e credível. Deve para isso ser acreditada com a norma ISO Guide 34:2009 (Produtor de Material de Referência Certificado). O RT-corp, o National Institute of Standard and Technology (NIST) ou o Community Bureau of Reference (BCR) são 3 exemplos dessas organizações. O valor obtido na análise de um MRC deve ser comparado com o valor certificado, determinando-se o erro e exactidão da análise. A percentagem de recuperação e o Z-score dão-nos a avaliação dos resultados obtidos da análise de um MRC.

Cabe ao laboratório definir qual o seu grau de exigência em termos de exactidão de método em estudo. Ensaios Interlaboratoriais de aptidão A participação em ensaios interlaboratoriais destina-se a avaliar o desempenho dos laboratórios participantes podendo funcionar como uma condição para a acreditação de um método analítico. Os ensaios interlaboratoriais, tal como os MRC, constituem uma excelente ferramenta no controlo externo de qualidade de uma análise quimica. A entidade organizadora deve ser acreditada segundo a norma ISO/IEC 17043:2010 (fornecedores de ensaios interlaboratoriais). A avaliação do desempenho do laboratório participante é apresentada pela entidade organizadora. Geralmente a avaliação é feita recorrendo ao Z-score. O factor de desempenho de Z (Z-score) é dado pela equação 6:

S

Xv- XlabZ (equação 6)

Em que Xlab é o valor obtido experimentalmente e Xv o valor certificado. Onde o S é a unidade de desvio que pode ser a incerteza do MRC.

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A avaliação pode ser feita, por exemplo, segundo a escala de pontuação: Z2 Satisfatório,

2Z3questionável, Z3 incorrecto.

Ensaios com soluções fortificadas em amostras reais Quando os compostos não estão disponiveis em MRC´s ou em ensaios interlaboratoriais, torna-se necessário realizar ensaios com soluções fortificadas em amostras reais. Trata-se de um controlo de qualidade interno. Estes ensaios implicam o uso de soluções de compostos de um lote diferente do usado para a solução de calibração. Nestes casos, avaliam-se os resultados pela percentagem de recuperação e pelo desvio padrão dos diferentes ensaios de recuperação. v – Plano de Trabalho

Este trabalho consiste no estudo e implementação de uma metodologia analítica que permite a

análise conjunta de 13 Pesticidas Organoclorados e 11 congéneres de compostos Bifenilos

Policlorados (PCB´s) em matrizes sólidas, nomeadamente sedimentos, utilizando a técnica de

extracção por Soxhlet.

Pretende-se estudar a secagem do sedimento, a dimensão das partículas, os solventes de extracção, as etapas de purificação e a concentração. A quantificação será realizada por cromatografia gasosa com detector de captura de electrões. Após o desenvolvimento da metodologia pretende-se efectuar a validação do método. Para isso serão estudados os seguintes parâmetros: identificação, linearidade, gama de trabalho, limiares analíticos, brancos, cartas de controlo, precisão e exactidão.

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2 - Parte Experimental

Organizações como a United States Environmental Protection Agency (EPA) e a comissão OSPAR fornecem importantes ferramentas para o desenvolvimento de metodologias. [16][4] No entanto, a metodologia pretendida deve ser estudada consoante os compostos, solventes, disponibilidade de instrumentos no laboratório e niveis de detecção. Como regra geral de uma metodologia, o sedimento deve ser isento de água, a dimensão das partículas em análise deve ser a mais apropriada para o tipo de compostos, a extracção por Soxhlet deve ter cerca de 20 horas de duração e o extracto obtido deve ser sujeito a um tratamento de purificação antes da análise por cromatografia gasosa. Neste trabalho foram estudadas as seguintes etapas: a secagem das particulas, a dimensão das

partículas de sedimento, o tempo e solvente de extracção, as colunas de purificação, a velocidade

de concentração dos extractos.

A metodologia analítica desenvolvida foi testada recorrendo às amostras fortificadas, aos materiais de referência certificados (MRCs) e pela participação em ensaios interlaboratorias do Aquacheck. As várias etapas da metodologia serão explicadas nos capítulos seguintes. A metodologia desenvolvida foi esquematizada na figura 16. 2.1- Material e Reagentes Para além de material corrente de laboratório foram usados os seguintes materiais: Solventes e Padrões Usou-se Hexano (da J.T.Baker), Diclorometano (da Riedel-deHaën), Isoctano (da Riedel-deHaën) e Acetonitrilo (da Riedel-deHaën). Usaram-se padrões de referência certificados do “Institute of Organic Industrial Chemistry- Anmopal Warsaw”, com pureza superior a 99.5%. Usou-se sedimentos certificados da RT Corp (Resource Techonology Center) Material A extracção das amostras foi efectuada no equipamento de Soxhlet, para a purificação foi usada o sistema de purificação da J.T.Baker. A quantificação dos compostos foi obtida no cromatógrafo gasoso com detector de captura de electrões (GC-ECD) da Agilente e com a confirmação a ser feita no cromatógrafo gasoso acoplado a um espectrómetro de massa (GC-MS) da ThermoFinningan. A secagem do sedimento foi realizada no liofilizador da marca Labconco. Cartuchos de Florisil (Solid Phase Extration) da VARIAN ( 5 mg 20 ml). Cartuchos de Alumina (Solid Phase Extration) da SUPELCO (6 ml). 2.2- Secagem A secagem permite remover a água que os sedimentos possuem, eliminando a interferência água-solventes orgânicos. A eliminação da água facilita a extracção por solventes orgânicos. Durante a etapa de extracção por Soxhlet, a amostra entra em contacto com o solvente orgânico de modo a poder ocorrer a transferência dos compostos adsorvidos nas superfícies das partículas de sedimento para o solvente. A existência de água no sedimento cria forças de tensão entre a superfície da partícula e o solvente orgânico impedindo o contacto e a transferência dos compostos da amostra para o solvente.

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A secagem deve ser feita sem que os analitos se volatilizem. Isto é particularmente evidente para compostos de baixo peso molecular. Temperatura elevadas não devem ser praticadas. Para este trabalho a remoção de água é feita no liofilizador. Trata-se de um processo de eliminar a água por sublimação a vácuo, ou seja, a água passa diretamente do estado sólido para o estado gasoso. Para isso a amostra é congelada previamente antes de ser colocada no liofilizador. As alternativas a este processo são [4]:

a secagem a temperatura ambiente sem contaminantes. No entanto, é um processo mais moroso que o anterior e não é possível garantir um ambiente ausente de contaminação pois as próprias salas do laboratório podem conter analitos perdidos por volatilização.

Contacto e agitação com Na2SO4 anidro ou MgSO4. Deve-se ter o cuidado do perigo da inclusão de partículas hidratadas que não podem aproximar-se de solventes de extracção orgânicos.

Amostras húmidas A alternativa à secagem do sedimento é a extracção da amostra húmida, no entanto é um processo inviável como se vai explicar de seguida. Quando se usa o método de Soxhlet para amostras húmidas são acrescidas várias etapas. Primeiro começa-se por extrair o sedimento usando solventes polares como acetona, metanol ou acetonitrilo para retirar a água. A eficiência desta extracção será pequena devido à presença da água. A solução obtida é substituida e é feita uma nova extracção com solventes menos polar ou mistura de solventes (hexano/acetona). Os dois extractos obtidos são misturados e adicionados com água para ser feita uma nova extracção, desta vez ao extracto obtido por extracção líquido-líquido. Comparando este método de extracção com o método de extracção para sedimentos secos nota-se claramente um processo muito pouco prático, mais moroso e o maior número de passos levará a menor percentagens de recuperação.[4] 2.3- Escolha da Dimensão das Partículas Os compostos orgânicos persistentes são caracterizados por terem afinidade às partículas e serem lipofílicos. Uma análise credível deve também ter em atenção a dimensão das partículas da amostra. Quanto maior a área especifica do sólido maior é a capacidade para adsorver estes compostos.

A análise deve ser realizada nas partículas com dimensão aproximadamente de 100m ou menores, pois como se sabe a área especifica será maior.[17] Foi realizada uma análise qualitativa ao sedimento duma região poluída para as dimensões

x<106 m e 160m x<150m. A análise por cromatografia gasosa acoplado à espectrometria de massa revelou o cromatograma da figura 8. Como se pode ver no cromatograma, na

granumetria das partículas menores que 106m os picos de compostos aparecem em maior quantidade e intensidade, para além de haver compostos detectados nesta gama não aparecerem na dimensão maior. Quanto menor a dimensão das particulas de sedimento, maior a área especifica e consequentemente maior será a capacidade de adsorção das partículas.

Neste trabalho foi decidido fazer análises às partículas menores que 106m pois garantem maior fiabilidade dos resultados .

A dimensão pretendida é obtida por peneiração do sedimento. A utilização de peneiros é importante para haver comparabilidade de resultados.

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Figura 8 – Cromatogramas obtidos no GC-MS duma amostra com diferentes granulometrias. A figura da

esquerda corresponde à dimensão menor que 106 m. A figura da direita corresponde à dimensão 160m

x<150m.

Observando a figura 8, verifica-se que a dimensão menor que 106 m apresentou compostos com maior intensidade.

2.4- Extracção 2.4.1- Solventes Orgânicos Estes analitos devem ser extraídos do sedimento usando solventes orgânicos por terem maior solubilidade.[16] Nos Quadros 1, 2 e 3 apresentam-se as propriedades e estruturas dos solventes tipicos de extracção. A extracção dos PCB´s pode ser realizada com um solvente apolar devido à não-polaridade dos PCB´s. O solvente apolar referido nas bibliografias é o hexano.[16] Todavia, é recomendado uma mistura de solvente polar e apolar para garantir maior eficiência na remoção dos compostos com polaridade distintas, como é o caso dos pesticidas organoclorados. O solvente polar varia entre acetona, tolueno e diclorometano. O tolueno tem a desvantagem do seu ponto de ebulição ser alto e é referido pelos autores como um solvente para as dioxinas.[16] A escolha do diclorometano face à acetona deve-se ao seu ponto de ebulição ser mais baixo, o que permite não atingir temperaturas altas que poderiam evaporar os analitos durante a concentração. Sendo assim, a escolha recai na mistura de solvente hexano/diclorometano (1:1).

Solvente Acetona

Acetonitrilo

Fórmula C3H6O C2H3N

Peso molecular 58.0798 41.0524

Ponto ebulição, ºC 56.2 81.6

Ponto fusão, ºC -94.3 -48 Quadro 1- Propriedades da Acetona e Acetonitrilo.

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Solvente Diclorometano

Hexano

Fórmula CH2Cl2 C6H14


Ponto ebulição, ºC 39.8 69

Ponto fusão, ºC -96.7 -95 Quadro 2- Propriedades do Diclorometano e Hexano.

.

Solvente Isoctano

Tolueno

Fórmula C8H18 C7H8


Ponto ebulição, ºC 99.2 110.6

Ponto fusão, ºC -107 -93 Quadro 3- Propriedades do Isoctano e Tolueno.

2.4.2- Extracção por Soxhlet Nesta metodologia, o método de extracção usado foi o de Soxhlet. Na figura 9 apresenta-se o aparelho de Soxhlet. Nesta metodologia analítica pesam-se 2 gramas de amostra de sedimento com a granulometria pretendida. A amostra é colocada no cartucho de celulose que é inserido na camisa de Soxhlet. 200ml da mistura de solvente hexano/diclorometano (1:1) são colocados no balão que é aquecido lentamente por uma manta de aquecimento. O tempo de extracção é de cerca de 20 horas. Ensaios realizados na segunda extracção feita na mesma amostra permitem concluir que os analitos foram extraídos eficazmente na primeira extracção.

Figura 9– Aparelho de Soxhlet

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2.5- Concentração Após a extracção o extracto orgânico obtido necessita de ser concentrado. Esta etapa é motivada pelos analitos estarem diluídos nos 200ml de solvente não tendo os equipamentos científicos sensibilidade para os detectarem ou quantificarem na concentração pretendida. Neste trabalho a concentração dos 200ml de extracto é realizada no evaporador rotativo até a um volume de 10-20ml, seguindo o resto da concentração nos concentradores por corrente de azoto. Esta etapa é crítica pois concentrações muito rápidas ou levadas a secura levam a perdas dos analitos por volatilização. Os resultados do ensaio de concentração encontram-se no capitulo 3.1.

2.6- Remoção de Enxofre Os extractos de sedimento possuem regularmente enxofre, originário de fontes industriais ou naturais. O enxofre é extraído das amostras juntamente com os analitos pela sua afinidade com os solventes orgânicos. É necessário o extracto estar isento de enxofre antes da injecção, visto que no GC-ECD provoca a alteração do sinal do detector e interfere com os picos dos compostos orgânicos a analisar. Este facto é visível nas figuras 10 e 11.

Figura 10- Cromatograma da amostra de sedimento X com enxofre.

Figura 11- Cromatograma da amostra de sedimento X sem enxofre (após adição de tiras de cobre metálico).

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A remoção do enxofre nas amostras é feita pela adição de tiras de cobre metálico formando o sulfureto metálico. A adição de cobre pode ser feito durante a extracção Soxhlet e/ou no extracto orgânico obtido durante as etapas seguintes à extracção. Para concentrações muito elevadas de enxofre é usado um tratamento de ultra-sons durante 2 minutos. Apesar de o cobre usado não ser novamente aproveitado, pode-se recuperá-lo com a lavagem em ácido nítrico, seguido de água e metanol.[16] Foi escolhido este processo de remoção pelo baixo custo e de fácil execução; visto que o contacto com o cobre efectua-se durante o processo de extracção e concentração dos analitos, não necessitando de atenção especial. Não se recorreu ao mercúrio ou à prata por razões ambientais e financeiras. As alternativas a este método de remoção são referidas a seguir:

A remoção pode ser feita numa coluna copolimerica de poliestireno-divenilbenzeno. Nestas condições a eluição do contaminante é tardia comparada com os resto dos compostos pretendidos. Tem a desvantagem de haver uma etapa extra, a coluna referida ser relativamente cara e poder originar perdas dos analitos. [16]

Outra alternativa é a adição de uma solução saturada de Na2SO4 no extracto orgânico. Para a transferência dos iões HSO4 para a fase orgânica ocorrer adiciona-se sal de tetrabutilamonia (TBA) e isopropanol. Durante a agitação os iões de TBA formam um par iónico com os iões sulfito que é introduzido na fase orgânica à medida que ocorre a reacção SO3

2- + S => S2O32-.

O isopropanol é retirado com a adição de água e a fases são separadas por decantação. Tem as mesmas desvantagens que a alternativa anterior. [16]

2.7- Purificação O extracto obtido necessita de purificação. Este passo é importante visto que durante a etapa da extracção são também extraídos compostos não pretendidos que possuem afinidade pelos solventes orgânicos. As substâncias interferentes podem ser ácidos orgânicos, fenóis, açúcares, óleos, lípidos e pigmentos com diferente coloração. Estes compostos possuem normalmente características que permitem ser detectados pelo detector de captura de electrões e conduzir não só a presença de picos susceptíveis de interferir na análise mas também a contaminação do aparelho, em particular a coluna e o detector.[10] Na figura 12 apresentam-se as fotos de uma amostra extraída sem purificação e com purificação. Como se pode verificar a cor e turvação da amostra devido às substâncias interferentes é bem visível para o exemplo sem purificação.

Figura 12 – Fotos de uma amostra extraída, sem purificação (esquerda) e com purificação (direita).

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2.7.1- Interferências no detector Na figura 13 apresentam-se os cromatogramas duma mesma amostra com purificação e sem purificação obtidos pelo GC-ECD. Como se pode verificar a amostra sem purificação apresenta maior ruido de fundo (visualizada em termos de mais picos).

Figura 13- Cromatograma da amostra de sedimento X sem purificação (esquerda) e com purificação

(direita)

2.7.2- Liner Um extracto sem purificação, ao apresentar mais compostos indesejados contribui também para o desgaste e contaminação do liner. O liner é um tubo de vidro ou quartzo onde a amostra é volatilizada. Os compostos interferentes (essencialmente matérias orgânicas, lípidos, ácidos gordos de elevada massa) ao entrarem no liner são carbonizados ficando aderidos nas paredes do mesmo. Esta matéria carbonizada tem a capacidade de adsorver os analitos, que por sua vez, não chegam ao detector para serem quantificados. Na figura 14 é visivel a diferença entre um liner limpo e um liner contaminado. Embora o liner seja recuperado por lavagem com uma solução de hexametildisilano/tolueno, os residuos provocam a diminuição de resposta e sensibilidade do instrumento.

Figura 14- foto de liner limpo e contaminado.

2.7.3 “Tailing” na coluna O tailing corresponde ao arrastamento dos compostos no cromatograma. Uma amostra (extracto) contendo uma elevada percentagem de substâncias interferentes, contribui para as interações com o filme da coluna. 1um de volume de injecção de uma amostra suja pode ser arrastada até 1 metro na coluna. Na figura 15 é visivel a diferença de um composto sem tailing e com tailing.

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Normalmente o corte na parte inicial da coluna corrige esta anomalia.

Figura 15- Cromatograma de um composto sem tailing e com tailing.

2.8- Ensaios de Purificação O processo de purificação varia consoante o tipo de amostra, compostos pretendidos, método de extracção, sensibilidade requerida, tipo de detector usado. As colunas de enchimento de Sílica, Alumina e Florisil são recomendadas para a limpeza de extractos de amostras de sedimento. Não foram testadas para este trabalho colunas de Sílica por não haverem disponiveis no laboratório. Foram testadas eluições nas colunas de Alumina e Florisil. Estas colunas testadas foram preparadas industrialmente, embora também pudessem ser preparadas no laboratório em colunas de vidro. Foram testados eluições nos cartuchos de Florisil (Solid Phase Extration) da VARIAN (5 mg 20 ml) e nos cartuchos de Alumina (Solid Phase Extration) da SUPELCO (6 ml). As colunas de Alumina, Al2O3, fornecem uma limpeza de extracto suficiente para a análise em GC-ECD. Embora estas colunas removam lípidos não são aconselhadas para amostras contendo quantidades elevadas de gordura como é o caso de matrizes de biota (bivalves, fígado de peixes). Para essas matrizes são referidas as colunas de Florisil.[16] As colunas de Florisil são dos materiais mais antigos para a limpeza de PCB´s e pesticidas organoclorados. Trata-se de uma mistura de diversos óxidos inorgânicos com SiO2 e MgO.[16] Estas colunas são de natureza polar. Os PCB´s e alguns pesticidas organoclorados devido a sua apolaridade são eluidos facilmente usando solventes apolares como o hexano. Para a eluição

dos pesticidas mais polares, como o -Endossulfão, é necessário um solvente ou mistura de solventes mais polares como diclorometano/hexano, acetona/hexano ou dietileter.[16] A etapa de purificação estudada tem como objectivo a eliminação de interferentes na análise e contaminantes no GC (coluna cromatografica, liner, detector,...), mas também tendo em conta também a eluição conjunta de todos os compostos. Os resultados de etapa de purificação encontram-se no capitulo 3.2. 2.9- Concentração Final O passo de concentração antes da amostra ser injectada no GC-ECD é realizada num concentrador de corrente de azoto com um caudal reduzido. Se o caudal do azoto for elevado levará a perdas dos analitos por volatilização.

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O volume final a concentrar é de 1 ml. Existe a necessidade de remover o solvente polar, diclorometano, antes da amostra ser injectada porque interfere com o detector de captura de electrões visto este analisar compostos halogenados. No entanto, como as amostras contém todas hexano este risco é eliminado pois o hexano é menos volátil.

2.10- Análise e quantificação

A análise das amostras é realizada por cromatografia gasosa com detector de captura de electrões. As condições de operação do instrumento foram definidas pelo laboratório.

As especificações da coluna cromatográfica apresentam-se em seguida: Tipo de coluna: WCOT Fused Sílica Fase estacionária: CP-Sil 19 CB; Comprimento 60m; diâmetro interno 0.25mm; diâmetro externo 0.39mm; espessura do filme

0.2m O programa da temperatura do forno permite uma melhor separação dos analitos a analisar. Este programa foi desenvolvido pelo laboratório. No quadro 4 apresenta-se o programa de temperatura para esta análise.

Rampa do forno ºC/min Seguinte, ºC Águardar, min Run Time

Início ---- 90 1 1

Rampa 1 20 200 10 16.5

Rampa 2 3 255 25 59.8

Rampa 3 0

Post Run 90 10 69.8 Quadro 4- Programa de temperatura no GC-ECD.

As condições de funcionamento do detector apresentam-se no quadro 5:

Temperatura do detector, ºC 300

Makeup-flow de N2, mL/min 60

Quadro 5- Condições de operação do detector.

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2.11- Esquema da Metodologia Desenvolvida Os ensaios experimentais permitiram elaborar um fluxograma da metodologia desenvolvida. Este fluxograma encontra-se na figura 16. F

Figura 16- Fluxograma da metodologia analítica desenvolvida.

Amostra

(Sedimento)

Concentração

Purificação

colunas de Alumina

Remoção de Enxofre

Concentração

Extracção

por Soxhlet

Peneiração

Secagem

por Liofilização

GC-ECD

2 gramas de partículas

menores que 106 m.

200 ml da solução Hexano/Diclorometano (1:1/v:v)

20 horas de extracção

200 ml até 10 ml evaporador rotativo

10 ml até 1 ml no concentrador de corrente de azoto

Adição de tiras de cobre metálico

20 ml da solução Hexano/Diclorometano (15:5/v:v)

20 ml até 1 ml no concentrador de corrente azoto

Análise e quantificação

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3 - Resultados e discussão

Pretende-se neste capitulo fazer a análise dos ensaios de concentração de amostras, da etapa de purificação e da validação do método (identificação, linearidade, gama de trabalho, limiares analíticos, brancos, cartas de controlo, precisão e exactidão) 3.1- Ensaio de concentração de amostras Foi realizado um ensaio para estudar as percentagens de recuperação dos PCB´s e pesticidas organoclorados nas amostras levadas a secura no evaporador rotativo e no concentrador por corrente de azoto. No ensaio com o evaporador rotativo foi injectada uma solução de calibração dos organoclorados em 200 ml da mistura de solventes Hexano/Diclorometano(1:1), tendo a solução sido concentrada até a secura. No ensaio com o concentrador por corrente de azoto, 1 ml da solução de calibração dos organoclorados em isoctano foi levada à secura. Ambos os ensaios foram realizados com uma solução de calibração com a concentração de 50 ng/g para todos os compostos. As amostras depois de levadas a secura foram adicionadas com padrão interno num volume total de 1ml solvente hexano e injectados no GC-ECD. No quadro 6 apresentam-se os resultados obtidos destes dois ensaios, em termos de percentagem de recuperação.

Compostos % recuperação evaporador rotativo

% recuperação concentrador por corrente azoto

Hexaclorobenzeno 53 27

-HCH 60 40

Lindano 68 52

PCB 31 64 55

PCB 28 66 55

Heptacloro 94 53

PCB 52 69 61

Aldrina 55 53

-HCH 70 61

Heptacloroepóxido 74 63

PCB 101 73 63

-endossulfao 73 63

pp-dde 75 66

Dieldrina 76 63

PCB 118 78 65

Endrina 94 64

PCB 153 78 69

PCB 105 80 63

pp-ddd 83 65

PCB 138 78 65

-endossulfão 77 66

PCB 128 78 66

PCB 156 79 65

PCB 180 80 66

PCB 170 80 64 Quadro 6- Percentagens de recuperação dos ensaios compostos levado à secura.

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Como se pode verificar pelo quadro 6, as recuperações obtidas são muito críticas para os compostos que eluem primeiro no GC-ECD devido à maior facilidade em volatilizarem, especialmente para o caso do concentrador por corrente de azoto. Sendo assim, as amostras levadas à secura devem ser repetidas. 3.2- Ensaio de purificação nos cartuchos de Alumina Para testar os cartuchos de alumina foram feitos ensaios de recuperação com soluções de picagem. A concentração dos PCB´s e pesticidas organoclorados na solução usada foi de 50 ng/g para cada composto. Foram testadas diferentes fracções de mistura Hexano/Diclorometano. Ensaio 1 O ensaio 1 foi realizada com a 1ª eluição de 20 ml da solução hexano/diclorometano (19:1), e a 2ª eluição de 20 ml da solução hexano/diclorometano (1:2). Como se pode ver pelo quadro 7, os resultados mostram que todos estes analitos são eluidos

logo com a 1ª solução, à excepção do -HCH e do -Endossulfão que necessitam de uma solução de eluição mais polar.

Ensaio 1 duplicado

Compostos 1ª eluição 2ª eluição 1ª eluição 2ª eluição

Hexaclorobenzeno 100% 0 100% 0

-HCH 100% 0 100% 0

Lindano 100% 0 100% 0

PCB 31 100% 0 100% 0

PCB 28 100% 0 100% 0

Heptacloro 100% 0 100% 0

PCB 52 100% 0 100% 0

Aldrina 100% 0 100% 0

-HCH 50% 50% 50% 50%

Heptacloroepóxido 100% 0 100% 0

PCB 101 100% 0 100% 0

-endossulfao 100% 0 100% 0

pp-dde 100% 0 100% 0

Dieldrina 100% 0 100% 0

PCB 118 100% 0 100% 0

Endrina 100% 0 100% 0

PCB 153 100% 0 100% 0

PCB 105 100% 0 100% 0

pp-ddd 100% 0 100% 0

PCB 138 100% 0 100% 0

-endossulfão 45% 55% 45% 55%

PCB 128 100% 0 100% 0

PCB 156 100% 0 100% 0

PCB 180 100% 0 100% 0

PCB 170 100% 0 100% 0 Quadro 7- Ensaios de purificação com 1ª eluição com 20 ml da solução hexano/diclorometano (19:1) e a 2ª

eluição com 20 ml da solução hexano/diclorometano (1:2).

Os ensaios realizados com as amostras reais demostravam que a eluição com a solução hexano/diclorometano (1:2) tornava a injecção no GC-ECD problemática, pois eram eluidos nesta solução polar compostos indesejados que danificavam o liner como foi explicado no capitulo 2.7.2. Este facto era visível com a 2ª eluição apresentar uma coloração forte, embora menor que o extracto sem o passo de purificação.

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Tornou-se então necessário que eluição de -HCH e -endossulfão fosse menos problemática para a injecção no GC- ECD. Para isso, foram estudadas novas fracções de mistura hexano/diclorometano. Ensaio 2 No ensaio 2 a 1ª eluição foi realizada com 20 ml da solução hexano/diclorometano (19:1), a 2ª com 5 ml da solução hexano/diclorometano (1:2) e 3ª com 5ml da solução hexano/diclorometano (1:2) . Como se pode ver pela quadro 8, o ensaio demostrou que os dois compostos saíram nos primeiros 5 ml da solução hexano/diclorometano (1:2), não sendo necessário a adição de mais volume de solvente polar que iria eluir mais compostos indesejados.

ensaio 2

Compostos 1ª eluição 2ª eluição 2ª eluição

Hexaclorobenzeno 100% 0 0

-HCH 100% 0 0

Lindano 100% 0 0

PCB 31 100% 0 0

PCB 28 100% 0 0

Heptacloro 100% 0 0

PCB 52 100% 0 0

Aldrina 100% 0 0

-HCH 40% 60% 0

Heptacloroepóxido 100% 0 0

PCB 101 100% 0 0

-endossulfao 100% 0 0

pp-dde 100% 0 0

Dieldrina 100% 0 0

PCB 118 100% 0 0

Endrina 100% 0 0

PCB 153 100% 0 0

PCB 105 100% 0 0

pp-ddd 100% 0 0

PCB 138 100% 0 0

-endossulfão 30% 70% 0

PCB 128 100% 0 0

PCB 156 100% 0 0

PCB 180 100% 0 0

PCB 170 100% 0 0 Quadro 8- Ensaio de purificação com 1ª eluição com 20 ml da solução hexano/diclorometano (19:1), a 2ª com 5 ml da solução hexano/diclorometano (1:2) e 3ª com 5ml da solução hexano/diclorometano (1:2).

O facto de neste ensaio a percentagem de recuperação -HCH e -endossulfão na primeira eluição ser menor que os ensaio 1 é explicado por não ser possível controlar uma velocidade de eluição constante de amostra para amostra na plataforma de purificação. Isto é mais crítico para os compostos que saem no fim e início de cada eluição.

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Ensaios 3 e 4. No ensaio 3, a 1ª eluição foi realizada com 20ml solução hexano/diclorometano (15:5), a 2ª de 20ml da mesma mistura. No ensaio 4, 1ª eluição foi realizada com 20ml da solução hexano/diclorometano (19:1) e a 2ª de 20ml da mesma mistura. Os resultados dos ensaios 3 e 4 são apresentados no quadro 9.

Ensaio 3 Ensaio 4



-HCH 100% 0 100% 0

Lindano 100% 0 100% 0

PCB 31 100% 0 100% 0

PCB 28 100% 0 100% 0


PCB 52 100% 0 100% 0

Aldrina 100% 0 100% 0

-HCH 100% 0 65% 25%

Heptacloroepóxido 100% 0 100% 0

PCB 101 100% 0 100% 0

-endossulfao 100% 0 100% 0

pp-dde 100% 0 100% 0

Dieldrina 100% 0 100% 0

PCB 118 100% 0 100% 0

Endrina 100% 0 100% 0

PCB 153 100% 0 100% 0

PCB 105 100% 0 100% 0

pp-ddd 100% 0 100% 0

PCB 138 100% 0 100% 0

-endossulfão 100% 0 55% 38%

PCB 128 100% 0 100% 0

PCB 156 100% 0 100% 0

PCB 180 100% 0 100% 0

PCB 170 100% 0 100% 0 Quadro 9- Ensaios de purificação. No ensaio 3, a 1ª eluição com 20ml da solução hexano/diclorometano

(15:5), a 2ª com 20ml da mesma mistura. No ensaio 4, 1ª eluição com de 20ml da solução hexano/diclorometano (19:1) e a 2ª com 20ml da mesma mistura.

Os resultados do quadro 9 demostram que a solução hexano/diclorometano (15:5) é eficiente, garantindo a eluição completa numa mesma eluição, não sendo necessária despender mais tempo, nem solventes para a purificação.

No ensaio 4, verifica-se que o -HCH é eluido totalmente no conjunto das 2 eluições. Para o -Endossulfão no conjunto das 2 eluição a recuperação não é completa.

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3.3 Ensaios em cartuchos de Florisil Para além dos ensaios da etapa de purificação realizados nos cartuchos de Alumina foram também testados os cartuchos de Florisil. Começou-se por efectuar os mesmos ensaios já realizados para os cartuchos de Alumina. A concentração dos PCB´s e pesticidas organoclorados na solução usada foi também de 50 ng/g para cada composto. Os resultados não são os mesmos como seria de esperar pelas diferentes polaridades da Alumina e Florisil, mas também porque o volume de enchimento é maior nos cartuchos de Florisil. Ensaio 5 Sendo assim, o ensaio 5 tem como 1ª eluição 20ml da solução hexano/diclorometano (19:1) e a 2ª eluição 20 ml da solução hexano/diclorometano (1:2). Os resultados são apresentados no quadro 10. Como se pode verificar, os resultados mostram que todos os PCB´s são eluidos logo com a 1ª

solução devido à sua apolaridade, para os pesticidas verifica-se que para além do -HCH e do -Endossulfão (verificado nas colunas de Alumina) outros pesticidas necessitam de uma solução mais polar para a sua eluição. Os compostos que saem no início e fim de cada eluição têm, como se explicou nos ensaios de Alumina, percentagens de saída nas duas eluições diferentes de ensaio para ensaio devido à velocidade de eluição que não pode ser constante de amostra para amostra.

Ensaio 5 duplicado



-HCH 80% 20% 70% 30%

Lindano 70% 30% 60% 40%

PCB 31 100% 0 100% 0

PCB 28 100% 0 100% 0


PCB 52 100% 0 100% 0

Aldrina 85% 15% 85% 15%

-HCH 0 100% 0 100%

Heptacloroepóxido 0% 100% 5 95%

PCB 101 100% 0 100% 0

-endossulfao 0 100% 0 100%

pp-dde 100% 0 100% 0

Dieldrina 15% 85% 15% 85%

PCB 118 100% 0 100% 0

Endrina 0 100% 0 100%

PCB 153 100% 0 100% 0

PCB 105 100% 0 100% 0

pp-ddd 80% 10% 70% 30%

PCB 138 100% 0 100% 0

-endossulfão 0 100% 0 100%

PCB 128 100% 0 100% 0

PCB 156 100% 0 100% 0

PCB 180 100% 0 100% 0

PCB 170 100% 0 100% 0 Quadro 10- Ensaios de purificação com 1ª eluição com 20 ml da solução hexano/diclorometano (19:1) e a

2ª eluição com 20 ml da solução hexano/diclorometano (1:2).

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Ensaio 6 No ensaio 6, a 1ª eluição foi realizada com 20 ml da solução hexano/diclorometano (19:1), a 2ª eluição com 5 ml da solução hexano/diclorometano (1:2) e a 3ª eluição novamente com 5 ml da solução hexano/diclorometano (1:2). As recuperações foram colocadas no quadro 11.

Ensaio 6

Compostos 1ª eluição 2ª eluição 3ª eluição

Hexaclorobenzeno 100% 0 0

-HCH 80% 10% 10%

Lindano 75% 15% 10%

PCB 31 100% 0 0

PCB 28 100% 0 0

Heptacloro 100% 0 0

PCB 52 100% 0 0

Aldrina 80% 15% 5%

-HCH 0 40% 60%

Heptacloroepóxido 35% 45% 20%

PCB 101 100% 0 0

-endossulfao 25% 50% 25%

pp-dde 100% 0 0

Dieldrina 10% 40% 50%

PCB 118 100% 0 0

Endrina 0 25% 75%

PCB 153 100% 0 0

PCB 105 100% 0 0

pp-ddd 100% 0 0

PCB 138 100% 0 0

-endossulfão 0 10% 90%

PCB 128 100% 0 0

PCB 156 100% 0 0

PCB 180 100% 0 0

PCB 170 100% 0 0 Quadro 11- Ensaio de purificação com 1ª eluição com 20 ml da solução hexano/diclorometano (19:1), a 2ª com 5 ml da solução hexano/diclorometano (1:2) e 3ª com 5ml da solução hexano/diclorometano (1:2) .

Observando o quadro 11, verifica-se que os analitos continuam a sair na 3ª eluição, o que difere dos ensaios de Alumina onde a 3ª eluição já não apresentava valores. Ensaio 7 e 8 No quadro 12 apresentam-se os ensaios realizados em soluções de eluição com diferentes polaridades. No ensaio 7, a 1ª eluição foi realizada com 20ml solução hexano/diclorometano (15:5) seguido de mais 20ml da mesma solução. No ensaio 8, a eluição foi realizada com 20ml da solução hexano/diclorometano (19:1), seguido novamente da 20ml da mesma mistura.

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Ensaio 7 Ensaio 8


Hexaclorobenzeno 100% 0 100% 1,2

-HCH 100% 0 90% 10%

Lindano 100% 0 85% 15%

PCB 31 100% 0 100% 0

PCB 28 100% 0 100% 0


PCB 52 100% 0 100% 0

Aldrina 100% 0 90% 10%

-HCH 85% 15% 0 40%

Heptacloroepóxido 100% 0 40% 60%

PCB 101 100% 0 100% 0

-endossulfao 100% 0 25% 75%

pp-dde 100% 0 100% 0

Dieldrina 85% 15% 0 40%

PCB 118 100% 0 100% 0

Endrina 100% 0 0 80%

PCB 153 100% 0 100% 0

PCB 105 100% 0 100% 0

pp-ddd 100% 0 95% 5%

PCB 138 100% 0 100% 0

-endossulfão 0 95% 0 0

PCB 128 100% 0 100% 0

PCB 156 100% 0 100% 0

PCB 180 100% 0 100% 0

PCB 170 100% 0 100% 0 Quadro 12- Ensaios de purificação. No ensaio 7, a 1ª eluição com 20ml da solução hexano/diclorometano

(15:5), a 2ª com 20ml da mesma mistura. No ensaio 8, 1ª eluição com de 20ml da solução hexano/diclorometano (19:1) e a 2ª com 20ml da mesma mistura.

No ensaio 7, verifica-se que há compostos que necessitam de 2ª eluição, ao contrário do mesmo ensaio para Alumina onde já não haviam analitos.

Para o ensaio 8, os resultados não são bons para o -Endossulfão com percentagens de

recuperação de 0% para as duas eluições. Não se recupera a totalidade de -HCH, Dieldrina e Endrina. 3.4 - Comparação das Colunas de Purificação Testadas Pela observação dos resultados dos ensaios de purificação, a coluna de Alumina demostrou ser mais eficiente que a coluna de Florisil para a eluição de compostos. A eficiência traduz-se na melhor recuperação dos analitos e no menor volume (e tempo) necessário para eluir os compostos. Com 20ml da solução hexano/diclorometano (15:5) obteve-se a totalidade dos pesticidas organolcorados e dos PCB´s. Uma situação ideal seria a eluição de todos os compostos com 20 ml de hexano, evitando assim

a eluição dos compostos polares indesejados. No entanto como se viu, para o -HCH e -Endossulfão, é necessário uma maior polaridade. Uma nota para amostras reais é ter sido observado que a coluna de Florisil tinha maior tendência de reter a coloração das amostras que a coluna de Alumina, embora não fosse significativo.

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3.5 - Validação do Método 3.5.1- Identificação e selectividade Com a injecção dos compostos individualmente no GC-ECD obteve-se os tempos de retenção indicados no quadro 13. A confirmação dos picos pode ser feita no GC-MS, neste caso existem software que permitem identificar os picos não sendo necessário injectar indivualmente. No quadro 13, encontra-se os tempos de retenção e os iões de referência do GC-MS. Alternativamente a confirmação dos picos pode ser feita no GC-ECD mas com uma coluna cromatográfica de diferente polaridade.

GC-ECD GC-MS

Compostos Tempo de retenção, min

Tempo de retenção, min

iões de referência

Hexaclorobenzeno 13.5 22.9 142,249,284

-HCH 15.7 22.8 111,181,219

Lindano 18.3 24.7 111,181,219,254

PCB 31 18.7 28.6 150,186,256

PCB 28 18.8 28.6 150,186,256

Heptacloro 19.6 29.2 100,135,272

PCB 52 21.1 30.9 150,220,292

Aldrina 21.4 31.5 66,91,263

-HCH 25.0 26.7 111,181,219

Heptacloroepóxido 26.3 34.4 81,183,253

PCB 101 27.0 36.4 184,256,326

-endossulfao 28.2 36.5 207,239,277

pp-DDE 29.5 38.1 176,246,316

Dieldrina 30.7 38.2 79,263,277

PCB 118 31.8 40.4 184,256,326

Endrina 32.1 39.6 147,263,281

PCB 153 32.8 41.7 218,290,325

PCB 105 34.1 41.9 184,256,326

pp-DDD 34.9 38.5 165,199,235

-endossulfão 35.4 40.3 195,207,237

PCB 128 37.7 45.0 218,290,235

PCB 156 39.5 46.6 218,290,360

PCB 180 40.2 47.8 252,324

PCB 170 43.7 49.9 252,324 Quadro 13- Identificação e confirmação do organoclorados.

Pelo quadro 13, verifica-se que todos os compostos apresentam tempos de retenção diferente. No entanto, os picos positivos no GC-ECD devem ser confirmados, pois existem outros compostos que apresentam o mesmo tempo de retenção (falsos positivos).

3.5.2- Gama de Linearidade Neste trabalho a linearidade foi calculada usando a equação 1.


1000x



(equação 1)

Os gráficos da linearidade obtidos apresentam-se no anexo 3.

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De acordo com os gráficos da linearidade efectuados, verifica-se a linearidade no intervalo de concentração de 5 a 60 ng/g. No entanto, verifica-se que a Endrina apresenta o primeiro ponto da curva de calibração fora do intervalo de linearidade; deste modo para este composto é aconselhável aumentar o limite de quantificação ou aumentar o valor de concentração do primeiro ponto da curva de calibração. 3.5.3- Gama de trabalho Após a verifição da lineridade no intervalo de concentração de 5 a 60 ng/g, foram preparadas 6 soluções padrão no mesmo intervalo (soluções de calibração). As concentrações dessas soluções estão colocadas no quadro 14.

Padrão 1 Padrão 2 Padrão 3 Padrão 4 Padrão 5 Padrão 6

-HCH 5,4 10,8 16,2 27,0 43,3 64,9

Hexaclorobenzeno 5,1 10,3 15,4 25,7 41,1 61,6

Lindano 5,5 10,9 16,4 27,3 43,6 65,4

-HCH 5,9 11,8 17,7 29,5 47,3 70,9

Heptacloro 5,1 10,2 15,3 25,5 40,8 61,2

Aldrina 4,9 9,8 14,7 24,4 39,1 58,6

Heptacloroepóxido 4,9 9,8 14,7 24,5 39,2 58,8

-endossulfão 5,3 10,6 15,9 26,6 42,5 63,8

p,p´-DDE 4,9 9,8 14,7 24,5 39,2 58,7

Dieldrina 4,9 9,8 14,6 24,4 39,0 58,6

-endossulfão 5,5 11,0 16,5 27,5 44,0 66,0

p,p´-DDD 5,0 10,1 15,1 25,2 40,3 60,5

Endrina 5,3 10,5 15,8 26,3 42,0 63,0

PCB 28 5,0 10,1 15,1 25,2 40,4 60,5

PCB 31 5,4 10,7 16,1 26,8 42,9 64,4

PCB 52 5,1 10,1 15,2 25,3 40,4 60,6

PCB 101 5,1 10,1 15,2 25,3 40,5 60,7

PCB 105 5,6 11,3 16,9 28,1 45,0 67,5

PCB 118 5,2 10,4 15,6 26,0 41,6 62,5

PCB 128 4,9 9,9 14,8 24,7 39,5 59,3

PCB 153 5,0 10,1 15,1 25,2 40,3 60,5

PCB 156 5,4 10,7 16,1 26,8 42,9 64,3

PCB 170 5,1 10,1 15,2 25,3 40,6 60,8

PCB 180 5,0 10,1 15,1 25,2 40,3 60,4 Quadro 14- Concentração das soluções de calibração dos organoclorados (expressas em ng/g).

No quadro 15, apresentam-se as curvas de calibração obtidas pela injecção das soluções de calibração obtidas num dia de análise. A calibração deve ser realizada antes de cada sequência de amostras ou em alternativa deve ser injectado um padrão de verificação da curva de calibração (inicio da sequência de amostras) de modo a verificar que a calibração ainda está válida.

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Compostos Equação Y=m*X+b R2

Hexaclorobenzeno 2.906*X+3.616E-3 0.999

-HCH 1.420*X-4.280E-3 0.998

Lindano 1.199*X-2.006E-3 0.998

PCB 31 0.612*X+3.165E-3 0.998

PCB 28 1.191*X+4.159E-3 0.999

Heptacloro 0.277*X+3.932E-3 0.999

PCB 52 0.625*X+3.445E-3 0.997

Aldrina 2.050*X-1.152E-3 0.999

-HCH 1.189*X-2.609E-3 0.999

Heptacloroepóxido 1.211*X+1.011*E-3 0.999

PCB 101 0.741*X+4.017E-3 0.998

-endossulfao 1.140*X+1.653E-3 0.999

pp-DDE 1.536*X-6.997E-4 0.999

Dieldrina 1.151*X+1.139E-4 0.999

PCB 118 0.766*X+3.794E-3 0.997

Endrina 0.300*X-0.109E-1 0.998

PCB 153 0.791*X+4.382E-3 0.998

PCB 105 0.917*X+2.822E-3 0.999

pp-DDD 0.521*X+1.185E-3 0.998

PCB 138 0.804*X+3.253E-3 0.999

-endossulfão 0.717*X+2.001E-3 0.999

PCB 128 0.842*X+3.682E-3 0.999

PCB 156 0.766*X+5.164E-3 0.999

PCB 180 0.840*X+2.723E-3 0.999

PCB 170 0.910*X+2.708E-3 0.997 Quadro 15- Equações da curva de calibração dos organoclorados e respectivo coeficiente de correlação.

Pelo quadro 15, verifica-se que o coeficiente de correlação é maior que 0.995, o que garante uma menor dispersão do conjunto de pontos experimentais e menor incerteza dos coeficientes de regressão estimados. A quantificação é realizada recorrendo às curvas de calibração obtidas, tendo em conta a altura do sinal do pico. Sendo assim, a gama de trabalho será de 5 a 60ng/g, sendo necessário diluir as amostras caso a concentração obtida nas amostras seja superior ao padrão mais alto da curva de calibração. Método de Padrão Interno (PCB 198) O composto escolhido para ser usado como padrão interno foi o PCB 198.

Isto deve-se ao facto deste composto não apresentar o mesmo tempo de retenção que os compostos a analisar, ter o mesmo comportamento físico-químico dos compostos e não ser detectado nas amostras reais (amostras ambientais).

3.5.4- Limiares Analíticos O cálculo do limite de detecção (LD) foi obtido através da equação 4.

x 3.3 LD (equação 4)

onde representa o desvio padrão associado à uma concentração vestigial e injectada ao longo de 10 dias. Os valores obtidos do limite de detecção estão apresentados no quadro 16.

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Organoclorados LD, ng/g

Hexaclorobenzeno 1.5

-HCH 1.8

Lindano 2.1

PCB 31 1.5

PCB 28 1.5

Heptacloro 2.1

PCB 52 1.5

Aldrina 1.5

-HCH 1.8

Heptacloroepóxido 1.8

PCB 101 1.5

-endossulfao 2.1

pp-DDE 1.8

Dieldrina 1.8

PCB 118 1.8

Endrina 1.5

PCB 153 1.8

PCB 105 1.8

pp-DDD 1.5

-endossulfão 2.4

PCB 128 1.8

PCB 156 1.8

PCB 180 2.1

PCB 170 1.8

Quadro 16- Limites de detecção dos compostos, calculados a partir de injeccões de uma concentração

vestigial e usando a equação 4.

O cálculo do limite de quantificação (LQ) foi obtido através da equação 5.

x 10 LQ (equação 5)

onde representa o desvio padrão associado à uma concentração vestigial e injectada ao longo de 10 dias. Os valores obtidos do limite de quantificação estão apresentados no quadro 17.

de 65

Organoclorados LQ, ng/g

Hexaclorobenzeno 5.1

-HCH 6.4

Lindano 6.9

PCB 31 5.2

PCB 28 5.5

Heptacloro 7.4

PCB 52 5.4

Aldrina 5.2

-HCH 6.3

Heptacloroepóxido 6.4

PCB 101 4.8

-endossulfao 7.0

pp-DDE 6.2

Dieldrina 6.1

PCB 118 5.8

Endrina 4.9

PCB 153 6.4

PCB 105 6.0

pp-DDD 4.7

-endossulfão 7.7

PCB 128 6.2

PCB 156 6.4

PCB 180 6.5

PCB 170 6.2

Quadro 17- Limites de Quantificação dos compostos, calculados a partir de injeccões de uma concentração

vestigial e usando a equação 5. O LQ corresponde ao inicio da zona em que se reportam valores numéricos. O limite de quantificação aceite para este trabalho é o valor do padrão mais baixo da curva de calibração. Com os dados obtidos verifica-se que o valor de LQ é semelhante ao valor do padrão mais baixo da curva de calibração. Desde modo tem-se a validação estatistica do valor usado como limite de quantificação. 3.5.5- Ensaios em brancos Todas as análises de brancos realizados em paralelo com os amostras não detectaram nenhum dos composto estudados. Os resultados indicam que não houve contaminação durante a análise das amostras. No caso de haver contaminações, deve ser iniciada uma investigação e as amostras devem ser repetidas após a investigação ser concluida. 3.5.6- Cartas de Controlo Shewhart Neste trabalho as cartas de controlo foram obtidas através do padrão de controlo injectado em cada sequência de amostras, de modo a controlar a resposta do equipamento (GC-ECD). O padrão de controlo usado foi uma solução de concentração aproximada de 25 ng/g, preparada independentemente da solução de calibração. No anexo 4 encontram-se as cartas de controlo deste trabalho. A linha verde no gráfico corresponde ao valor exacto do padrão de controlo. Os desvios 20 % (correspondem às duas linhas a vermelho) são os limites estabelecidos pelo laboratório para aceitar a conformidade da sequência das amostras injectadas. Observando as cartas de controlo verifica-se que os pontos se encontram dentro dos limites estabelecidos e não se verifica nenhuma tendência (pontos continuamente a subir ou descer).

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Deste modo, pode-se afirmar que o processo está sob controle. 3.5.7- Precisão e Exactidão dos PCBs Os PCB´s foram avaliados através da participação em ensaios interlaboratoriais da Aquacheck e com materiais de referência certificados da RT Corp. A Aquacheck é uma entidade acreditada com a norma ISO/IEC 17043:2010 (fornecedores de ensaios interlaboratoriais) A RT Corp é uma entidade acreditada com a norma ISO Guide 34:2009 (Produtor de Material de Referência Certificado) Foram analisados 6 PCB´s dos 11 em estudo. Não é necessário a verificação das recuperações de todos os PCB´s porque as propriedades/características destes 6 compostos seleccionados pela Aquacheck abrangem todos os compostos em estudo. Sendo assim, por exemplo, a recuperação do PCB 28 será semelhante à do PCB 31 pelas características/propriedades semelhantes que estes dois compostos apresentam. Os compostos foram analisados segundo a metodologia analítica desenvolvida. Os resultados dos PCB´s obtidos pela participação nos ensaios interlaboratórial estão apresentados no quadro 18.

Compostos Z-scores, média

Desvio Padrão

N.º de ensaios

PCB 28 -1,2 0,4 4

PCB 52 -1.1 0,3 4

PCB 101 -1,1 0,3 4

PCB 118 +0.5 0,4 4

PCB 153 -0,5 0,3 4 Quadro 18 – Resultados dos PCB´s em termos de Z-score, obtidos pela partipação em ensaios da

Aquacheck.

A avaliação é segundo a escala de pontuação: Z2 Satisfatório, 2Z3questionável, Z3 incorrecto. Os resultados obtidos da participação nos ensaio interlaboratórial são todos satisfatórios, garantindo a robustez do método. Os resultados compilados obtidos nos ensaios de recuperação do MRC e pela participação nos ensaios interlaboratórial estão apresentados no quadro 19 e figura 17.

Compostos Percentagem de recuperação,média

Desvio Padrão

N.º de ensaios

PCB 28 75 15 14

PCB 52 82 13 14

PCB 101 80 12 14

PCB 118 104 13 14

PCB 153 91 8 14

PCB 180 96 8 14 Quadro 19 - Compilação dos resultados dos PCB´s; obtidos pela partipação em ensaios da Aquacheck e

recorrendo aos materias de referência certificados.

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Figura 17- Resultados dos PCB´s com coeficiente de variação, obtidos pela partipação em ensaios da Aquacheck e pelos ensaios de recuperação usando MRC.

Como se verifica pelo quadro 19, as recuperações estão entre 75 % a 104 %. As menores recuperação correspondem aos analitos com maior facilidade em volatilizar.

Os resultados de Z-score (menores que 1,2) dos ensaios interlaboratoriais e as percentagens de recuperação do MRC superiores a 75% (com o coeficiente de variação menores que 15%) permite concluir que o método é preciso e robusto. 3.5.8- Precisão e Exactidão dos Pesticidas Organoclorados. Os pesticidas organoclorados foram avaliados através de materiais de referência certificados da RT Corp e pelos ensaios de recuperação em amostras fortificadas. A RT Corp é uma entidade acreditada com a norma ISO Guide 34:2009 (Produtor de Material de Referência Certificado)

Não foi possível a compra de MRC com os compostos pp-DDD, -HCH, Heptacloro, Endrina, Hexaclorobenzeno e Heptacloroepóxido na matriz em estudo. Sendo assim, recorreu-se às amostras fortificadas para estes compostos. Para isso, extraiu-se uma amostra de solo sem os compostos pretendidos (previamente analisada). A amostra foi fortificada com uma solução independente da solução de calibração (diferente lote) e com a concentração de 50 ng/g para cada compostos. Os compostos foram analisados segundo a metodologia analítica desenvolvida. Os resultados obtidos no MRC, em termos de percentagens de recuperação, são apresentados no quadro 20 e figura 18.

Compostos Percentagem de recuperação (média)

Desvio Padrão

Concentração do MRC

N.º de ensaios

Aldrina 97 7 25,5 10

-BCH 95 15 25,1 10

pp-DDE 101 10 104 10

Dieldrina 88 14 116 10

-endossulfao 60 6 48,3 10

-endossulfao 93 12 50,3 10

Lindano 98 14 72,6 10 Quadro 20- Resultados dos pesticidas organoclorados obtidos pelo MRC.

Percentagem de Recuperação dos PCB´s

0

20

40

60

80

100

120

PCB 28

PCB 52

PCB 101

PCB 118

PCB 153

PCB 180

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Figura 18- Resultados dos pesticidas organoclorados no MRC, com coeficiente de variação.

A amostra fortificada foi analisada seguindo a metodologia analítica desenvolvida. Os resultados obtidos na amostra fortificada, em termos de percentagens de recuperação, são apresentados no quadro 21.

Compostos Percentagem de recuperação,média

Desvio Padrão

N.º de ensaios

pp-DDD 85 15 12

-HCH 90 11 12

Heptacloro 89 14 12

Endrina 83 14 12

Hexaclorobenzeno 82 9 12

Heptacloroepóxido 107 12 12 Quadro 21- Resultados dos pesticidas organoclorados obtidos pela amostra fortificada.

Como se pode verificar pelos resultados obtidos do MRC, as recuperações estão situadas acima

de 88%, à excepção do -Endossulfão que apresenta uma recuperação de 60 %.

Apesar da percentagem de recuperação do -Endossulfão ser de 60 %, verifica-se através do desvio padrão (6%) que o método é preciso. Sendo assim, este resultado é satisfatório podendo ser necessário haver uma correcção no valor obtido nas amostras de clientes. No entanto, torna-se necessário garantir que esta percentagem de recuperação e o desvio padrão se mantenham ao longo do tempo. Em relação aos ensaios com a amostra fortificada, verifica-se que as percentagem de recuperação situam-se acima de 82% com um desvio padrão menor que 15%. Tendo em conta os resultados, verifica-se que o método é robusto e preciso; embora seja

necessário que os resultados do -Endossulfão se mantenham constante ao longo do tempo.

Percentagem de Recuperação dos Pesticidas

0

20

40

60

80

100

120

Aldrina

alfa-BCH

pp-DDE

Dieldrina

alfa-Endossulfão

beta-Endossulfão

Lindano

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4- Conclusão

Este estudo demostrou que a de análise conjunta de 11 PCBs e 13 pesticidas organoclorados pode ser implementada em rotina no laboratório, usando a técnica de extracção por Soxhlet e analisando por cromatografia gasosa com detector de captura de electrões.

Pelos ensaios realizados com os MRC, ensaios interlaboratoriais e amostras fortificadas verifica-se que o método é robusto e preciso. As percentagem de recuperação situam-se entre 75 a 104% com um desvio padrão a variar de 6

a 15%; com a excepção do -Endossulfão que tem uma percentagem de recuperação de 60 %.

Apesar da percentagem de recuperação do -Endossulfão ser de 60 %, verifica-se através do desvio padrão (6%) que o método é preciso. Sendo assim, este resultado é satisfatório podendo ser necessário haver uma correcção no valor obtido nas amostras de clientes. No entanto, torna-se necessário garantir que esta percentagem de recuperação e o desvio padrão se mantenham ao longo do tempo. Para além disto, os compostos testados com amostras fortificadas devem ser também analisados usando MRC e/ou ensaios interlaboratoriais de modo a confirmar a exactidão.

Durante o desenvolvimento da metodologia identificaram-se 3 etapas criticas: a dimensão das particulas, a velocidade de concentração do extracto e a purificação do extracto. Os ensaios de granulometria de amostras evidenciaram a afinidade dos compostos às particulas de menor dimensão devido à sua area especifica.

Neste trabalho foi decidido fazer análises às partículas menores que 106 m pois garantem maior fiabilidade dos resultados. A utilização de peneiros é importante para haver comparabilidade de resultados. Pelos ensaios de concentração do extracto verificou-se que as amostras levadas à secura no concentrador de azoto originam perdas de 25 a 70%. Sendo assim, as amostras levadas à secura devem ser repetidas. A purificação é uma etapa inevitável, tendo em conta a eliminação de interferentes na análise e contaminantes no GC (coluna cromatográfica, liner, detector,...). Esta etapa foi estudada também tendo em conta a eluição conjunta de todos os compostos. Estes requisitos foram obtidos através da eluição com 20ml da solução hexano/diclorometano (15:5, v/v) nos cartuchos de alumina.

Os testes de linearidade demostraram a linearidade dos compostos na gama de trabalho de 5 a

60 ng/g. O Limite de Quantificação foi validado estatisticamente como sendo o valor do padrão

mais baixo da curva de calibração.

Sendo assim, a gama de trabalho será de 5 a 60ng/g, sendo necessário diluir as amostras caso a concentração obtida nas amostras seja superior ao padrão mais alto da curva de calibração. A inexistência de contaminantes ao longo do processo foi verificada com os brancos, no entanto isto deve ser verificado sempre com uma sequência de amostras. Observando as cartas de controlo verifica-se que os pontos se encontram dentro dos limites estabelecidos e não se verifica nenhuma tendência (pontos continuamente a subir ou descer). Deste modo, pode-se afirmar que o processo está sob controle.

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4- Bibliografia

[1] ISO/IEC 17025, “General Requirements for the Competence of Testing and Calibration Laboratories, 2005” [2] F. Rodrigues (2003) “Guia Relacre- Validação de métodos internos de ensaios em análise química” Relacre [3] Instituto Português de Acreditação (2011) “Guia para a Acreditação de laboratórios Quimicos” IPAC [4] OSPAR Commission (1999). “Guidelines for Monitoring Contaminants in Sediments- Ref.No:1999-1”-OSPAR [5] D.Barceló, M. Hennion (1997). “Trace Determination of Pesticides and Their Degradation Products in Water”, Elsevier [6] F.Smedes, J.Boer (1994). “Guidelines for the Determination of Chlorobiphenyls in Sediments”-Química analitica, pp S100-S108 [7] A.W.A. Brown (1997). “Ecology of Pesticides” ” John Wiley & sons,Inc. [8] V.A. McFarland, J.U.Clarke (1989). “Environmental Ocurrence, Abundance, and Potencial Toxicity of Polychlorinated Biphenyl Congeners: Considerations for a Congener-Specific Analysis”-Environmental Health Perspectives Vol 81, pp 225-239 [9] J.R.Dean (2003). “Methods for environmental trace analysis”, Wiley [10] J.R.Ferreira (1984). “Problemas Relacionados com a Análise de Resíduos de Pesticidas por Cromatografia Gás-Líquido” –Faculdade de Ciências Médicas, pp 1-20 [11] J.Miralles (2002). “Ecologia-Manual de Sensibilização Ambiental”, Ministério de Ambiente [12] A.M.Ferreira, C.Vale (2000). “Aumento dos Níveis de PCB nas Partículas em Suspensão, Peixes e Moluscos do Estuário do Tejo e Zona Costeira Adjacente Após um Derrame Acidental - Estudos de Biogeoquímica, Universidade de Aveiro, pp 55-60 [13] E.Ferreira, E.Rodrigues (2002). “Fontes de Informação em Ambiente”, Centro Atlântico [14] H.J. Chaves das Neves (1991). “Introdução à Intromatografia Gás-Líquido de Alta Resolução”, Dias da Sousa Lda. [15] Agilent (2000).“Agilent 6890 Series Gas Chromatograph –operating manual” Agilent Technologies [16] EPA method 1699 (2007) “Pesticide in water, soil, sediment, biosolids and tissue by HRGC/HRMS”, U.S.�Environmental�Protection�Agency [17] K.M.Evans, R.A. Gill, W.J.Robotham (1990). “The PAH and Organic Content of Sediment Particle Size Fractions”- Water, Air and Soil Pollution Vol 51, pp 13-31 [18] R. Reeve (2002). “Environmental analysis”, Wiley [19] C.I.Albino, L.Barreira, M.J.Bebianno, A.M.Ferreira (2000). “Níveis de Bifenilos Policlorados em Matéria Particulada em Suspensão e Sedimentos da Ria Formosa” - Estudos de Biogeoquímica, Universidade de Aveiro, pp 47-53

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[20] O.Gil, C.Vale (2000). “Distribuição Vertical de Congéneres de PCB em Sedimentos da Zona Costeira Adjacente ao Estuário do Sado”- Estudos de Biogeoquímica, Universidade de Aveiro, pp 43-46 [21] OSPAR Commission (2000). “International Pilot Study for the Determination of Riverine Inputs of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons to the Maritime Area on the Basis of a Harmonised Methodology”, OSPAR Commission, Meeting of the Working Group on Inputs to the Marine Environmental [22] OSPAR Commisions (2001). “Polycyclic Aromatic Hydrocarbons- Priority Substances Series”, OSPAR [23] L.V.Diégues, M.A.Hernándes, J.J.Fernández (2000). “Contaminación por PAHs en los Sedimentos Superficiales de la Ria de Vigo”- Estudos de Biogeoquímica Universidade de Aveiro , pp 69-73 [24] L.Veriato, L.Barreira, M.J. Bebianno (2000). “Avaliação da Contaminação por Hidrocarbonetos Aromáticos Polocíclicos na Ria Formosa” - Estudos de Biogeoquímica, Universidade de Aveiro , pp 461-67 [25] P.Viana, J.S.Matos (1992). “Determinação de PCB´s em Óleo de Peixe, Lama Residual e Óleo Mineral”- Direcção Geral da Qualidade do Ambiente. [26] OSPAR Commission (1998). “Draft monitoring guidelines for the analysis of PAH´s in sediments”, OSPAR [27] L.S.Campos (1999). “Nomenclatura dos Compostos Orgânicos”, Escolar Editora [28] R. Ciola (1973). “Introdução à Cromatografia em Fase Gasosa”, Edgard Blucher Lda [29] E.G. Azevedo (1995). “Termodinâmica Aplicada”, Escolar Editora [30] T.W.Graham Solomons (1996). “Solomons-Organic Chemistry sixth edition” John Wiley & sons,Inc, pp 633-636

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Anexo 1- Propriedades dos PCBs

Composto PCB 28 Composto PCB 31

Fórmula C12H7Cl3 Fórmula C12H7Cl3

Peso molecular 257.5463 Peso molecular 257.5463

Ponto de ebulição, C - Ponto de ebulição, C -

Ponto de fusão, ºC - Ponto de fusão, ºC -

Pressão de vapor, Pa 2.6E-2 Pressão de vapor, Pa -

H, Pa m3 mol -1 33 H, Pa m3 mol -1 -

Log Ko,a 5.67 Log Ko,a -

Figura 19- Propriedades dos PCB28 e PCB31.





Ponto de fusão, ºC 87 Ponto de fusão, ºC 77

Pressão de vapor, Pa 1.3E-2 Pressão de vapor, Pa 2.6E-3

H, Pa m3 mol -1 160 H, Pa m3 mol -1 217

Log Ko,a 5.84 Log Ko,a 6.38


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Pressão de vapor, Pa - Pressão de vapor, Pa 8.4E-4

H, Pa m3 mol -1 - H, Pa m3 mol -1 18







Ponto de fusão, ºC - Ponto de fusão, ºC 103


H, Pa m3 mol -1 - H, Pa m3 mol -1 224

Log Ko,a - Log Ko,a 6.92


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H, Pa m3 mol -1 102 H, Pa m3 mol -1 -



Composto PCB 128

Fórmula C12H4Cl6

Peso molecular 360.8816

Ponto de ebulição, C -

Ponto de fusão, ºC 151.9

Pressão de vapor, Pa -

H, Pa m3 mol -1 -

Log Ko,a 6.74

Figura 24- Propriedades do PCB128.

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Anexo 2- Propriedades dos Pesticidas Organoclorados

Composto -HCH Composto Heptacloro



Ponto de ebulição, C 288 Ponto de ebulição, C 135



H, Pa m3 mol -1 0.10 H, Pa m3 mol -1 112


Figura 25- Propriedades do -HCH e Heptacloro .

Composto Heptacloroepóxido Composto p,p-DDE

Fórmula C10H5Cl7O Fórmula C14H8Cl4


Ponto de ebulição, C 200 Ponto de ebulição, C -

Ponto de fusão, ºC 160 Ponto de fusão, ºC -


H, Pa m3 mol -1 - H, Pa m3 mol -1 34


Figura 26- Propriedades do Heptacloroepóxido e p,p-DDE.

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Composto Lindano Composto -HCH



Ponto de ebulição, C 323.4 Ponto de ebulição, C 60

Ponto de fusão, ºC 112.9 Ponto de fusão, ºC -


H, Pa m3 mol -1 0.13 H, Pa m3 mol -1 -


Figura 27- Propriedades do Lindano e -HCH.

Composto Endrina Composto Dieldrina

Fórmula C12H8Cl6O Fórmula C12H8Cl6O


Ponto de ebulição, C 245 (dec) Ponto de ebulição, C 385

Ponto de fusão, ºC 200 (dec) Ponto de fusão, ºC 176

Pressão de vapor, Pa - Pressão de vapor, Pa -

H, Pa m3 mol -1 - H, Pa m3 mol -1 1.12


Figura 28- Propriedades da Endrina e Dieldrina.

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Composto Aldrina Composto -Endossulfão

Fórmula C12H8Cl6 Fórmula C9H6Cl6O3S





H, Pa m3 mol -1 91.2 H, Pa m3 mol -1 1.07


Figura 29- Propriedades da Aldrina e -Endossulfão.

Composto pp-DDD Composto -Endossulfão

Fórmula C14H10Cl4 Fórmula C9H6Cl6O3S





H, Pa m3 mol -1 - H, Pa m3 mol -1 0.04


Figura 30- Propriedades da pp-DDD e -Endossulfão.

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Composto Hexaclorobenzeno

Fórmula C6Cl6

Peso molecular 284.784

Ponto de ebulição, C 332

Ponto de fusão, ºC 230

Pressão de vapor, Pa 2.4E-3

H, Pa m3 mol -1 9

Log Ko,a 5.9

Figura 31- Propriedades do Hexaclorobenzeno.

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Anexo 3- Linearidade da gama de trabalho no GC-ECD A linearidade foi calculada usando a equação 1.


1000x



(equação 1)

Os desvios superiores e inferiores de aceitabilidade são feitos pela média dos valores da ordenada com desvio de +20% e -20%. De acordo com os gráficos da linearidade efectuados, verifica-se a linearidade no intervalo de concentração de 5 a 60 ng/g. No entanto, verifica-se que a Endrina apresenta o primeiro ponto da curva de calibração fora do intervalo de linearidade; deste modo para este composto é aconselhável aumentar o limite de quantificação ou aumentar o valor de concentração do primeiro ponto da curva de calibração.

Figura 32- Gráficos da linearidade do pcb 105 e pcb 180.



PCB 105

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 10 20 30 40 50 60 70

PCB 180

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 10 20 30 40 50 60 70

PCB 170

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 10 20 30 40 50 60 70

PCB 156

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 10 20 30 40 50 60 70

PCB 128

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 10 20 30 40 50 60 70

PCB 153

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 10 20 30 40 50 60 70

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Figura 37- Gráficos da linearidade do pcb 31 e heptacloroepoxido.

Figura 38- Gráficos da linearidade da endrina e aldrina.

PCB 118

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 10 20 30 40 50 60 70

PCB 101

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 10 20 30 40 50 60 70

PCB 52

0 0,2 0,4 0,6 0,8

1 1,2 1,4 1,6 1,8

2

0 10 20 30 40 50 60 70

PCB 28

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 10 20 30 40 50 60 70

PCB 31

0 0,2 0,4 0,6 0,8

1 1,2 1,4 1,6 1,8

2

0 10 20 30 40 50 60 70

heptacloroepoxido

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 10 20 30 40 50 60 70

endrina

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 10 20 30 40 50 60 70

aldrina

0 0,5

1 1,5

2 2,5

3 3,5

4 4,5

0 10 20 30 40 50 60 70

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Figura 39- Gráficos da linearidade do heptacloro e lindano.

Figura 40- Gráficos da linearidade do hexaclorobenzeno e alfa-HCH.

Figura 41- Gráficos da linearidade do delta-HCH e beta-endossulfão.

Figura 42- Gráficos da linearidade do pp-ddd e pp-dde.

heptacloro

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

0 10 20 30 40 50 60 70

lindano

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 10 20 30 40 50 60 70

hexaclorobenzeno

0

1

2

3

4

5

6

7

0 10 20 30 40 50 60 70

alfa-HCH

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 10 20 30 40 50 60 70

delta-HCH

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 10 20 30 40 50 60 70

beta-endossulfão

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 10 20 30 40 50 60 70

pp-DDD

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 10 20 30 40 50 60 70

pp-DDE

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 10 20 30 40 50 60 70

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Figura 43- Gráficos da linearidade da dieldrina e alfa-endossulfão.

Dieldrina

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 10 20 30 40 50 60 70

alfa-endossulfão

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 10 20 30 40 50 60 70

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Anexo 4- Cartas de Controlo Shewhart

Neste trabalho as cartas de controlo foram obtidas através do padrão de controlo injectado em cada sequência de amostras, de modo a controlar a resposta do equipamento (GC-ECD). O padrão de controlo usado foi uma solução de concentracão aproximada de 25 ng/g, preparada independentemente da solução de calibração. A linha verde no gráfico corresponde ao valor exacto do padrão de controlo. Os desvios 20 % (correspondem as duas linhas a vermelho) são os limites estabelecidos pelo laboratório para aceitar a conformidade da sequência de amostra injectada.

Figura 44- cartas de controlo do pcb 28 e pcb 31.



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Figura 49- cartas de controlo do pcb 180 e alfa-HCH.

Figura 50- cartas de controlo do hexaclorobenzeno e lindano.

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Figura 51- cartas de controlo do delta-HCH e heptacloro.

Figura 52- cartas de controlo do aldrina e heptacloroepoxido.

Figura 53- cartas de controlo do alfa-endossulfão e pp-dde.

Figura 54- cartas de controlo do dieldrina e beta-endossulfão .

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Figura 55- cartas de controlo do pp-ddd e endrina.

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