INMOVILIZACIÓN Y DETERMINACIÓN DE LA V IDA UTIL DE LA LIPASA B DE LA CANDIDA ANTARCTICA PARA LA EXPOXIDACIÓN DEL ACEITE DE

PALMA

MARÍA ALEJANDRA TINJACÁ CARRILLO

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERIA, DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA

BOGOTÁ 2006

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INMOVILIZACIÓN Y DETERMINACIÓN DE LA V IDA UTIL DE LA LIPASA B DE LA CANDIDA ANTARCTICA PARA LA EXPOXIDACIÓN DEL ACEITE DE

PALMA

MARÍA ALEJANDRA TINJACÁ CARRILLO

Proyecto de grado

Asesora: Isabel Cris tina Jiménez Useche Ingeniera Química M.Sc. Ingenier ía

Departamento de Ingenier ía Química

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERÍA, DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA

BOGOTÁ 2006

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CONTENIDO

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INTRODUCCIÓN 1. OBJETIVOS 1 1.1 OBJETIVO GENERAL 1 1.2 OBJETIVO ESPECIFICO 1 2. MARCO TEÓRICO 2 2.1 ESTRUCTURA, CLASIFICACION Y NOMENCLATURA DE 2 LAS ENZIMAS 2.2 CATALISIS ENZIMATICA Y SU APLICACIÓN A PROCESOS BIOCATALIZADOS 4 2.2.1 Cinética enzimática 6 2.3 LIPASAS 7 2.3.1 Estruc tura y mecanismo de acción de las lipasas. 5 2.3.2 Aplicac ión de las lipasas microbianas 9 2.3.3 Lipasa B de la Candida Antarc tica 11 2.4 INMOVILIZACION DE LIPASAS 12 3. MATERIALES Y MÉTODOS 15 3.1 METODO 15 3.1.1 Fabr icación del soporte hidrofóbico para la adsorción de Lipasa B 15 3.1.2 Inmovilización la enz ima por medio de adsorción en el soporte hidrofóbico y determinación de la inmov ilizac ión 15 3.1.3 Determinar la vida útil de la enz ima en el sopor te por medio de la reutilización 15 4. DISEÑO EXPERIMENTAL 17

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5. RESULTADOS 18 5.1 HIDROFOBIZACION DEL SOPORTE 18 5.2 INMOVILIZACION DE LA CALB 18 5.3 VIDA UTIL DEL CATALIZADOR 19 6. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS 18 7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 21 BIBLIOGRAFÍA 22 ANEXOS 1 25

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LISTA DE TABLAS

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Tabla 1 Sistema de clas ificación de enz imas 4 Tabla 2 Diseño experimental 17 Tabla 3 Resultados área BET 18 Tabla 4 Adsorción de enz ima 19 Tabla 5 Actividad específica del catalizador 19

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LISTA DE FIGURAS

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Figura 1 Estructura pr imaria de las enzimas 2 Figura 2 Estructura secundar ia de las enzimas 2 Figura 3 Estructura terciar ia de las enzimas 3 Figura 4 Estructura cuaternar ia de las enzimas 3 Figura 5 Hidrólisis del enlace éster del sustrato 9 Figura 6 Estructura tridimens ional de la CaLB 12 Figura 7 Montaje del exper imento en el laboratorio 16 Figura 8 Actividad específica del catalizador 20

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LISTA DE ANEXOS

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Anexo 1. Método de determinación de perác ido y peróxido 25

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INTRODUCCIÓN

El poliuretano es uno de los polímeros más versátiles, combina la elasticidad del caucho con la dureza y durabilidad de los metales [1], contando con una mejor res istencia a la abrasión y rompimiento que los cauchos y, comparados con los plásticos , ofrece mayor res istencia al desgaste y memor ia elástica. Sus aplicac iones van desde las espumas, pasando por el spandex (lycra), has ta neumáticos [2]. El poliuretano es produc ido a partir de polioles y di- isoc ianatos. His tór icamente los polioles han sido producidos a partir de de petróleo, pero debido a que este recurso se es ta agotando y al crec iente interés por métodos alternativos de fabr icac ión, se ha inves tigado la obtenc ión de polioles a par tir de aceites, entre estos, el aceite de palma, del que Colombia e el pr incipal productor en América latina y el cuar to en el mundo. La obtenc ión del poliol a partir del aceite de palma se lleva a cabo a través de una reacción de epoxidac ión, en presencia de un perác ido, y posteriormente una hidrox ilac ión. La Lipasa B de la Candida Antarctica cataliza la reacción (es el biocatalizador más activo y estable para este propós ito [15]), de la que se obtiene un perác ido a partir de un ácido y un agente oxidante, produciendo un perác ido y agua. La enzima se puede adquirir comercialmente en 2 formas; líquida e inmov ilizada. En su forma inmov ilizada la enzima puede llegar a costar más de 10 veces que en forma líquida. Por medio del presente proyecto se pretende desarrollar un biocatalizador, compuesto por la CaLB inmovilizada sobre un soporte hidrofóbico, mucho mas económico que el que se encuentra comerc ialmente.

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1. OBJETIVOS

1.1 OBJETIVO GENERAL Inmovilizar la lipasa B de la Candida Antarc tica en un soporte hidrofóbico, compuesto por s ílica gel recubierta con polipropileno, y determinar la vida útil del catalizador, usándolo repetidamente en la producc ión de perác ido. 1.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS • Encontrar condic iones adecuadas para la fabr icac ión del soporte hidrofóbico

para la adsorc ion de la lipasa B.

• Inmovilizar la enz ima por adsorción en el sopor te hidrofóbico y determinar si ocurrió la inmovilizac ión.

• Determinar la vida útil del catalizador por medio de su reutilización.

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2. MARCO TEÓRICO

2.1 ESTRUCTURA, CLASIFICACIÓN Y NOMENCLATURA DE LAS ENZIMAS Las enzimas son proteínas desarrolladas por las células de organismos vivos con la función específica de catalizar reacc iones químicas i nvivo. También son capaces de catalizar invitro reacc iones en las que intervienen tanto sus tratos naturales como no naturales. Como todas las proteínas, las enzimas poseen una estructura pr imaria, secundar ia y terciar ia. La estructura pr imar ia está constituida por la secuenc ia de aminoácidos unidos por enlace peptídico, mientras que la secundaria y la terc iar ia otorgan a la enzima su forma tr idimens ional. Figura 1. Estructura primar ia

Tomada de Life: The science of biology CD-ROM

La conformac ión que adopta la cadena polipeptídica debido a los enlaces de hidrógeno o estructura secundaria, puede ser de tipo α-helicoidal o de lámina β. Figura 2. Estruc tura secundaria

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La estructura terciar ia se refiere a la forma globular de la proteína, la cual se mantiene gracias a enlaces tipo disulfuro entre grupos tiol adyacentes y a enlaces iónicos entre grupos carboxílicos libres y grupos amino. Los enlaces de hidrógeno y las interacc iones hidrofóbicas son fundamentales en la estructura tridimens ional total de la enzima.

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Figura 3. Estructura terc iaria

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La estructura cuaternar ia solo aparece en aquellas enz imas constituidas por varias subunidades, las cuales establecen entre s i asociaciones de tipo no covalente. Figura 4 Estructura cuaternaria

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Debido a su estructura proteica, las enz imas son muy sens ibles a los cambios que se producen en su entorno. La presencia de disolventes orgánicos, una concentración alta de sales, pH o temperatura extremas, pueden provocar la desnaturalizac ión de la enzima, es dec ir, la pérdida de sus estructuras secundar ia, terciaria y cuaternar ia. Con pequeñas variaciones del pH o de la temperatura no se llega a la desnaturalizac ión, pero la enzima pierde actividad al haber cambios en su conformación. En general, la mayor ía de las enz imas desarrollan su ac tiv idad óptima a pH=7 y a una temperatura de 37oC [7]. Las enzimas se han clasificado s istemáticamente en 6 clases pr incipales, cada una de las cuales se divide a su vez en subclases, según el tipo de reacc ión que catalizan. Cada enzima se designa por un nombre recomendado, generalmente corto y apropiado para su uso habitual, por un nombre sistemático que identifica la reacc ión que cataliza y por un número de clas ificación que identifica a la enz ima [7].

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Tabla 1 Sistema de clas ificación de enzimas

Tomado de: Arroyo, M. (1995) Síntes is de ácidos 2ar il-propionicos

homoquirales mediante esterificación enantioselectiva catalizada por lipasas inmov ilizadas. http://www .ucm.es/BUCM/tesis/19911996/D/1/AD1019501.pdf

2.2 CATÁLISIS ENZIMATICA Y SU APLICACIÓN A PROCESOS BIOCATALIZADOS Las enzimas, como catalizadores , tienen las siguientes caracter ísticas principales [7]: • Como todo catalizador, aceleran el curso de las reacciones al disminuir la

energía de activación necesar ia para que se lleven a cabo. Las enz imas normalmente catalizan las reacc iones con mayor eficacia que los catalizadores inorgánicos.

• Lan enzimas son selectivas: la formac ión del complejo enzima sus trato sucede en una pequeña región de la enzima denominada centro activo, el cual suele estar localizado en un hueco o cavidad. La especificidad enz imática reside en este centro ac tivo, que posee las dimensiones correc tas , la topología adecuada y el alineamiento óptimo de grupos funcionales y regiones hidrófobicas para acomodar a un sustrato especifico. Solamente unos pocos aminoácidos dentro del centro activo están directamente involucrados en la catálisis enzimática y constituyen el centro de fijac ión. Estos aminoác idos no están localizados consecutivamente en la cadena polipeptídica, s ino que se encuentran juntos tras el plegamiento característico de la enzima. De todas formas, aquellos aminoácidos que no intervienen directamente en la catális is también son importantes, ya que son esenc iales en el mantenimiento de la conformación activa de la enzima. Se han propuesto varios modelos para explicar la selec tividad de las enz imas sobre un determinado sustrato. El modelo de la “llave cerradura”, que da

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una vers ión r ígida de las enzimas, ha sido superado por el modelo del “acoplamiento o encaje induc ido” . Según este modelo, el sustrato induce la orientación de los residuos en el centro activo para que se una al centro de fijac ión o suceda la catálisis. La selectividad de las enzimas es la base de muchas aplicaciones en síntes is orgánica.

• Las enzimas pueden ser objeto de regulación: su actividad catalítica puede estar influenc iada por la concentración de sustratos, productos y otras espec ies químicas presentes en solución. La regulac ión de las enz imas es de gran importanc ia en los sistemas metabólicos donde normalmente actúan, es un inconveniente cuando se emplean como catalizadores. Así cuando la concentración del producto de la reacc ión biocatalizada aumenta hasta c ier to valor, puede existir una inhibición de la enzima. Hay var ias formas de ev itar este problema: la eliminación del producto del medio de reacción a medida que se va formando (a veces un inconveniente) o el aumento de la cantidad de enz ima (aumento en el costo).

• Ciertas enzimas pueden requerir la presencia de cofactores para que sean activas . El aporte de es tos cofac tores y su regenerac ión significa un encarecimiento del proceso biocatalizado.

• La mayor ía de las enzimas son solubles en agua y presentan mayor actividad in vi vo a pH =7-8 y a temperatura ambiente.

• Se pueden utilizar var ias enzimas en combinación para realizar transformaciones que sucedan en varios pasos suces ivos.

• Las enzimas se degradan en condiciones relativamente suaves y por lo tanto requieren un manejo mucho más cuidadoso. Las enz imas se pueden desnaturalizar mediante diversos mecanismos como la acción de proteasas presentes como contaminantes en los preparados enz imáticos; la temperatura o los cambios del medio que pueden alterar la conformac ión de la proteína; la contaminación microbiana; la auto oxidación; etc. Por tanto la manipulación de las enzimas, tanto durante su utilización como durante su conservación, exige un manejo mas delicado que con otro tipo de catalizadores.

La inestabilidad, el prec io elevado y la espec ific idad respecto al sustrato son los principales inconvenientes que presentan los procesos catalizados por enz imas. Sin embargo, muchos de estos problemas se han superado por las s iguientes razones: • Un gran número de reacciones enzimáticas transforman sus tratos

estereoselectivamente y originan intermedios o productos de mucho interés en s íntesis .

• Con el objetivo de utilizar los biocatalizadores en procesos industriales a gran escala, se han desarrollado técnicas que mejoran la estabilidad de las enz imas y que facilitan su recuperac ión y reutilizac ión.

• Los avances de la biología molecular y los nuevos métodos del DNA recombinante han permitido la manipulación del mater ial genético, el ais lamiento de genes y su expresión con el fin de obtener determinadas proteínas en grandes cantidades. Como consecuencia, el prec io de las

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enz imas ha bajado. Estas técnicas también permiten la alteraciones estudiadas de las propiedades de las enzimas

• La limitación que supone la insolubilidad de cier tos sus tratos en agua, sobre los que las enzimas no son realmente activas, se ha visto en parte superada por la pos ibilidad de realizar reacciones en fases heterogéneas en las que una pequeña parte del sustrato esta presente en una disolución donde se suspende la enz ima. Algunas enzimas pueden tolerar pequeñas concentraciones de un solvente orgánico como el etilenglicol, el glicerol, el dimetil sulfóx ido (DMSO) o la dimetilformamida (DMF).

2.2.1 Cinética enz imática. La activ idad enz imática se expresa en unidades que indican los micromoles de sustrato transformado o de producto formado, por minuto, en el curso de la reacción. Una unidad enz imática (UE) se define como la cantidad de enzima que cataliza la transformac ión de un micromol de sustrato por minuto en unas determinadas condiciones de pH y temperatura [5]. La actividad enz imática específica se expresa como el número de UE/mg de proteína [8]. En una reacc ión enz imática simple en la que un sustrato S se transforma en un producto P por acc ión de una enz ima E en un proceso que sigue una cinética de Michaelis-Menten y sin inhibic iones por producto o por otras especies, la velocidad de aparic ión del producto v iene dada por la ecuación (1)

][1

][ max

Sk

VdtPdv

m+== (1)

Para una cantidad fija de enzima, un aumento en la concentración de sustrato da lugar a un aumento de la velocidad de reacción hasta que todos los sitios activos de la enzima se encuentran ocupados. Entonces un aumento en la concentración de sus trato no produce un verdadero aumento en la velocidad de reacción. Si se aumenta mucho esta concentración, la mayoría de las enz imas se desactivan. La máx ima eficac ia en el empleo de la enzima viene establecida por su velocidad máxima, maxV . La constante de Michaelis, mk , indica la mínima concentración de sustrato que debe haber en la soluc ión para conseguir un empleo eficaz de la enzima [5]. Los parámetros maxV y mk se calculan realizando ensayos de ac tiv idad a diferentes concentraciones de sustrato y aplicando los métodos gráficos de Linew eaver-Burk o Edie-Hofstee. A par tir de la maxV se puede calcular la constante catalítica, mk , o número de recambio de una enzima, que es el número máx imo de moléculas de sustrato transformadas en producto por unidad de tiempo y por molécula de enzima totalmente saturada de sustrato, y que v iene dada por la ecuación (2):

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Tcat E

Vk

][max= (2)

2.3 LIPASAS Las lipasas (glicerol ester hidrolasas EC 3.1.1.3) son un grupo de enz imas que catalizan la hidrólis is reversible de triacilglicér idos de grasas animales y de aceites vegetales para originar ácidos grasos y glicerol. Esta hidrólisis tiene lugar a través de los pasos intermedios de formac ión de diacilglicéridos y monoacilglicéridos [4]. Las lipasas se encuentran ampliamente distr ibuidas en la naturaleza y cumplen un rol importante en la transformación de lípidos. Se requieren como enz imas digestivas para facilitar, no solo, la transferencia de lípidos de un organismo a otro sino también para depos itar y movilizar grasa que se usa como reserva de energía en el organismo. También están involucradas en el metabolismo de lípidos intracelulares y por lo tanto en el func ionamiento de me mbranas biológicas [17]. Las lipasas han sido investigadas por sus propiedades bioquímicas y fisiológicas y, recientemente, por sus aplicac iones industr iales y médicas. Se pueden encontrar en bacter ias , levaduras, hongos, y la mayoría son lipasas exocelulares , es dec ir, atraviesan la me mbrana celular una vez s intetizadas y pasan al medio externo. Muchas de es tas lipasas microbianas han s ido pur ificadas y secuenc iadas. Es frecuente que un mismo microorganismo produzca var ias isoenz imas. Estas isoenz imas actúan en algunas ocasiones sobre sus tratos diferentes y en la mayor ía de los casos presentan diferenc ias en sus parámetros cinéticos y condiciones óptimas de reacc ión. La mayor ía de las lipasas de origen microbiano presentan su actividad máxima a intervalos amplios de pH que van de 5,6 a 8,5 y presentan máxima estabilidad a pH neutro. Por otro lado, las lipasas son ac tivas en intervalos amplios de temperatura, que var ían de -20oC a 45oC, sin embargo, el intervalo óptimo es de 30 a 45oC. Por enc ima de los 40oC muchas lipasas microbianas pierden rápidamente su actividad, a excepción de las produc idas por Aspergillus Níger, Rhizopus Japonicus, Chromobacterium Viscosum y Geotrichum Candidum; que son estables a temperaturas super iores a 50oC [9]. El interés en estas enz imas se debe principalmente las s iguientes razones [12]. • Relacionado con la base molecular de la func ión catalítica de la lipasa, ya

que aunque son solubles en agua, catalizan reacc iones que involucran sustratos lípidos insolubles en agua, en la interfase lípido-agua.

• Por su relevanc ia medica, particularmente en arterioscleros is e hiperlipidemia y su importancia en la regulac ión del metabolismo, ya que los

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productos de la lipólis is juegan papeles importantes como mediadores en activac ión celular y transducción de señales.

• Son herramientas poderosas para catalizar no solo la hidrólisis s ino también varias reacc iones reversibles como es terificación, trasesterificac ión y aminólisis en solventes orgánicos.

Estos biocatalizadores presentan var ias ventajas sobre los catalizadores clás icos. Su espec ificidad (regioselectiv idad y enantioselectiv idad) le permite catalizar reacciones con pocos productos secundarios lo que implica una baja en los cos tos de tratamiento de desechos y suaves condiciones de temperatura y presión. Sin embargo, el costo de la enz ima es bastante alto, lo que constituye un obstáculo para la expansión a nivel industrial de la tecnología a gran escala. Por lo tanto el adecuamiento de las lipasas f ísica, química y genéticamente busca mejorar sus propiedades catalíticas. 2.3.1 Estructura y mecanismo de acc ión de las lipasas. Una concentrac ión elevada de glicér idos y otros compuestos orgánicos en agua, conduce a fases heterogéneas, con la cons iguiente formación de una interfase. Las lipasas tienen la capacidad de catalizar la hidrólis is del enlace éster en esta interfase situada entre una fase lipoide (que constituye el sustrato) y una fase acuosa donde la enzima esta disuelta [9]. Desde 1990 se han descr ito las estructuras tr idimensionales de diez lipasas. Estas es truc turas, a pesar de que poseen diferentes secuencias de aminoácidos y difieren en tamaño (22-60kDa), se pliegan de una forma similar y poseen centros activos parec idos. El plegamiento de todas estas lipasas corresponde al modelo de α,β-hidrolasa en el que es carac ter ístico un núc leo de laminas β (en su mayor ía dispuestas paralelamente) rodeadas por α-hélices. Este plegamiento incluye la tr iada catalítica típica de las lipasas (serina, his tidina y glutámico o aspártico), as í como un hueco donde encaja un ox ianión. La acc ión catalítica de las lipasas se divide en dos etapas [9]: 1. Activación interfacial: En solución acuosa, un segmento helicoidal de la

cadena proteica denominado “tapadera” cubre el centro activo de la lipasa. En presencia de una interfase o en un medio orgánico la tapadera se abre. La apertura de la tapadera provoca un cambio total en la superfic ie de la entrada al centro activo, de manera que se vuelve más hidrofóbica y favorece la interacc ión de la enzima con el sustrato.

2. Hidrólis is del enlace éster del sustrato: La hidrólisis sucede mediante los siguientes pasos:

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• El sus trato se sitúa en el centro activo de la lipasa de tal manera que el carbono carbonílico toma contacto con el grupo OH de la serina. El protón de grupo hidroxilo de la serina se transfiere al N de la histidina de la tr iada catalítica y el O con carga negativa ataca nuc leof ílicamente al grupo carbonilo del sustrato con lo que se produce un intermedio tetraédr ico.

Figura 5. Hidrólisis del enlace éster del sustrato

1Arroyo, M. (1995) Síntesis de ác idos 2aril-propionicos homoquirales mediante esterificac ión enantioselectiva catalizada por lipasas inmovilizadas. http://www .ucm.es/BUCM/tes is/19911996/D/1/AD1019501.pdf

• La carga negativa, en un pr inc ipio situada en el O de la serina, sufre una translocación hacia el oxigeno del grupo carbonilo, originando un oxianión. Es te ox ianión encaja en un hueco que se forma tras la apertura de la tapadera.

• El intermedio tetraédrico se rompe cuando el protón cedido a la histidina se transfiere al oxigeno del alcohol. El alcohol se libera y se forma el complejo acil-enzima.

• Se produce un segundo ataque nuc leof ílico, esta vez de una molécula de agua sobre el carbono carbonílico del complejo ac il-enzima. Se forma un nuevo intermedio tetraédr ico, que, a continuación se rompe, liberando un ácido graso y regenerando el –OH de la ser ina.

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La func ión del ac ido glutámico/aspártico, presente en la triada catalítica, es la estabilización de la carga positiva generada sobre la histidina en los intermedios tetraédricos.

2.3.2 Aplicac ión de las lipasas microbianas. La oferta comercial de lipasas microbianas por par te de laboratorios japoneses, europeos y amer icanos, se ha incrementado debido a su gran número de aplicac iones y su bajo precio. Las aplicaciones más importantes de las lipasas de or igen microbiano son: 1. hidrólis is de aceites y grasas (industrias de detergentes, textil y de

alimentac ión [4]): a. para la obtención de ácidos grasos y glicerol a escala industrial. El

proceso enzimático es mas barato que el convencional y se obtienen productos con mejor olor y color.

b. Última mente han aparecido en el mercado detergentes para prendas de vestir que contienen lipasas microbianas en su formulac ión. Esos detergentes de acc ión enz imática permiten disminuir la temperatura de lavado, así como reduc ir la cantidad de surfactante y evitar la contaminación ambiental.

c. La aparición del aroma en muchos productos lác teos de debe, en gran medida, a la acc ión de las enzimas sobre la grasa de la leche. De es ta forma, mediante el empleo de lipasas, se puede potenc iar el aroma de los quesos y las mantequillas.

2. Interesterificación de aceites y grasas (industr ia alimentar ia) [9]: Las interester ificaciones, o intercambio de grupos ac ilo entere és teres se han utilizado predominantemente en la industr ia de los aceites y grasas para modificar la compos ición y propiedades f ís icas de los triglicér idos. La industr ia alimentar ia se ha benefic iado de estos métodos de interes ter ificación con triglicéridos. De esta forma, se han conseguido margarinas que no funden hasta los 30oC mediante el intercambio de cadenas de acilo saturadas por insaturadas. En todos estos procesos el control del contenido en agua es muy importante. La interesterificación también se ha empleado en la obtenc ión de lípidos “estructurados” de gran utilidad en nutric ión parenteral. Estos tr iglicéridos modificados contienen ácidos grasos de cadena media (de 8 a 12 átomos de carbono) en las posic iones 1 y 3 del glicerol, que son hidrolizados más efectivamente por la lipoproteinlipasa y la lipasa pancreática humana. Es tas enz imas presentes en la sangre e intestino respectivamente, hidrolizan con mas dificultad ésteres de ácidos grasos de cadena larga que de cadena media. Este hecho supone un gran avance en nutr ición parenteral, ya que se pueden utilizar aceite de soya (con ácidos grasos de cadena media incorporados) como fuente de energía, en sustitución de aceites naturales. Estos últimos

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adminis trados continuadamente, superan las neces idades diarias de ácidos grasos poliinsaturados, con riesgo de tox icidad. 3. Esterificac iones e hidrólisis de esteres (industria alimentaria farmacéutica y

química) a. Esterificac ión de ác idos grasos: los alcoholes terpénicos y sus ésteres

son componentes mayoritar ios de los aceites esenciales y son conoc idos por su aroma y sabor. Al s intetizar químicamente es tos ésteres , sus propiedades organolépticas diminuyen a diferencia de los obtenidos de fuentes naturales. Mediante métodos enz imáticos se pueden obtener estos ésteres con una calidad semejante a los naturales.

b. Esterificac iones e hidrólisis enantioselectivas: en química orgánica, el mayor interés de las lipasas radica en su aplicación a la síntes is de compuestos óptima mente activos mediante la hidrólis is o la s íntesis enantioespecífica de ésteres.

c. Esterificac iones regioselec tivas: las lipasas también se es tán empleando en las s íntesis de nuevos compuestos que son difíc iles de obtener mediante los métodos químicos tradicionales. Por ejemplo se han conseguido llevar a cabo acilaciones regioselectivas en esterioides, hidratos de carbono y glicoles.

2.3.3 Lipasa B de la Candida Antarc tica. Candida Antarctica es una levadura que produce 2 formas isoenzimáticas de lipasa: la lipasa A con un peso molecular de 45kDa y un punto isoelectrónico pI=7,5 y la lipasa B con un peso de 33 kDa y un pI=6 [9]. Estas enzimas fueron ais ladas debido a su aplicac ión potenc ial en muchos procesos industr iales. La lipasa B es una de las isoformas más interesantes dentro del campo de la síntes is orgánica. As í esta enzima inmovilizada ha sido empleada en la síntes is de tr iglicér idos y de esteres de alcoholes terpénicos, así como en esterificac iones regioselectivas de azúcares, nucleós idos y esteroides [14]. La estructura de la lipasa B de la Candida Antarctica (CaLB) consiste 7 láminas β rodeadas por 10 α-hélices con una dimensión de 30 * 40 *40 armstrongs. La secuencia común, Gly-X-Ser-X-Gly, exis tente en la mayoría de las lipasas, no aparece en esta enzima. En su lugar aparece la secuencia treonina-X-serina-X-glic ina. La tr íada catalítica está compuesta por ser ina 105, aspártico 187 e his tidina 221. La serina se encuentra rodeada por la treonina 40, glutamina 157 y el ácido aspártico 134, aminoácidos unidos por enlace de hidrógeno [9]. Estos res iduos que están expuestos al disolvente tienen una función importante en la especific idad el sustrato.

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Figura 6. Estructura tr idimensional de la CaLB

El entorno del centro activo esta formado por una cavidad de 12 armstrongs de profundidad desde el O de la ser ina hasta la superficie de la proteína y una anchura de 10 por 4 armstrongs. Esta cav idad esta delimitada por 3 regiones de la proteína: la espiral comprometida entre los aminoácidos 242 y 268; la hélice α10(del res iduo 268 al 287, cerca del extremo C.-terminal) y la hélice α5. Esta última α-hélice es de pequeño tamaño y posee gran movilidad, por lo que pudiera desempeñar la func ión de tapadera. La entrada a la cav idad del centro activo se sitúa en el centro de una gran superfic ie plana de 450 Armstrongs, con forma tr iangular ligeramente cóncava. En es ta superficie hay muchas cadenas alifáticas de aminoác idos que pueden interacc ionar con la interfase durante la hidrólisis de lípidos, as í como tres residuos cargados (aspár tico 223, glutámico188 y lis ina 290) cercanos a la entrada de la cav idad [15]. 2.4 INMOVILIZACIÓN DE LIPASAS La inmovilizac ión de enzimas es un proceso de modificación f ísica, en el que se confina o localiza a la enzima en una región definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su activ idad catalítica y que pueden ser reutilizadas repetidamente [17].

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Dentro de las ventajas del empleo de enzimas se destaca el aumento de la estabilidad de la enz ima, la posible reutilización del catalizador (reduciendo los costos del proceso) y la pos ibilidad de diseñar un reactor enz imático de fácil manejo y control, adaptado a la aplicación de la enzima inmovilizada [16]. Los princ ipales inconvenientes que se pueden presentar en el proceso de inmov ilización son la alteración de la conformación de la enzima respecto de su estado nativo, la heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden exis tir distintas fracc iones de proteínas inmov ilizadas con un diferente número de uniones al soporte. La selecc ión de c ierto procedimiento de inmovilizac ión se basa en las espec ificac iones del proceso para el biocatalizador , que incluye parámetros como ac tiv idad enz imática, efectividad en la utilización del catalizador, características de desactivación y regenerac ión, costo del procedimiento de inmov ilización, toxicidad de los reactivos del procedimiento y las propiedades finales deseadas de la lipasa inmovilizada [11]. Los métodos de inmovilizac ión de enzimas son numerosos y muy variados y pueden ser c lasificados en 3 grupos [17]:

• Adsorc ión en un material de soporte Los procedimientos involucrados en la adsorc ión fís ica son muy fáciles, hac iéndolos los más utilizados en inmovilizac ión de enz imas. La enzima se inmov iliza en un sopor te por fuerzas débiles como interacc iones de Van der Waals , uniones hidrofóbicas , puentes de hidrógeno, uniones iónicas, etc. Ex isten muchos mater iales de sopor te, s in embargo, la escogencia depende de las propiedades que son importantes para aplicaciones industr iales: for taleza mecánica, estabilidad fís ica y química, carácter hidrofóbico o hidrofílico, capac idad de carga de la enzima y cos to. El éx ito y la efic ienc ia de la adsorc ion de la enz ima en un sopote sólido depende de var ios parámetros: tamaño de la proteína a adsorber, área específica del soporte y la naturaleza de su superficie (poros idad y tamaño de poro) son cruc iales.

• Inc lus ión o encapsulamiento Este procedimiento cons iste en la inc lus ión de la lipasa en un polímero insoluble o micro-capsula. En la inc lusión, la lipasa se lleva en una soluc ión en fase monomérica, que, una vez polimer izada, la atrapa dentro de s í. Los geles de poliacr ilamida son las más utilizadas. En la micro-encapsulación, que es probablemente la técnica de inmovilización menos desarrollada, es muy similar a la inc lus ión, sin embargo, en este caso la enzima y su medio se inmovilizan. La microencapsulación crea células artificiales delimitadas por una membrana. Moléculas grandes como enzimas no se pueden difundir a través de la me mbrana sintética, mientras que las pequeñas (sustratos y productos) pueden pasar a través. La ventaja de es ta inmovilización es que la enzima no interacciona químicamente con el polímero, por lo tanto se evita la desnaturalizac ión. Sin embargo, el fenómeno de transferenc ia de masa

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alrededor de la membrana es un problema. La veloc idad de difus ión a través de la membrana del sus trato y del producto son generalmente parámetros limitantes. Generalmente, concentraciones altas de sustrato son necesar ias para limitar su influenc ia. Finalmente, enzimas incluidas son mejor usadas con sustratos pequeños, ya que los grandes no podrán pasar por la me mbrana y alcanzar el s itio activo del biocatalizador.

• Unión covalente en una matriz activada Este método de inmov ilización es una modificación f ís ica y química. No es tan común como la adsorcion f ísica pero su mayor ventaja es que ev ita el fenómeno de deserción. La principal preocupación en este procedimiento es llevar a cabo la unión covalente en aminoác idos que no están en la “maquinar ia catalítica” . Esto puede ser dif ícil de alcanzar, y, usualmente las enz imas inmov ilizadas por esta técnica pierden parte de su activ idad inicial. La unión covalente se lleva a cabo en grupos de cadenas laterales de los aminoác idos, por ejemplo, aminas primar ias para lisinas; funciones carboxílicas para ácidos aspártico y glutámico; grupos hidrox ilo para tiros ina, serina y treonina; y tiol para la cis teína. Muchos soportes orgánicos o minerales pueden usarse, pero anterior a la unión covalente este soporte debe activarse. Esta activac ión corresponde a la incorporación de grupos químicos capaces de reacc ionar con los grupos laterales de la proteína. Hay diferentes métodos de activac ión, el más común es el uso de glutaraldehido.

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3. MATERIALES Y MÉTODOS Los mater iales utilizados en el proyecto son: s ílica gel comercial, polipropileno (copolímero random, Ref 02R01CA-1), n-pentano, CaLB en forma libre (Novozym 525) , tolueno, ác ido sulfúrico concentrado (96%), peróxido de hidrógeno (35%), ác ido es teár ico comerc ial, etanol puro, Buffer Fosfato pH 7 25 mM, reactivo de Biuret, sulfato de cerio (0.001N), tiosulfato de sodio (0.1N), ioduro de potasio (2.5N). 3.1 MÉTODO La inmovilización de la CaLB sobre un sopor te hidrofóbico y la poster ior determinac ión de la vida útil del catalizador , consta de 3 pasos pr incipalmente; fabricación del sopor te hidrofóbico, inmovilizac ión de la enz ima y, la utilizac ión y reutilización del sopor te. 3.1.1 Fabricación del soporte hidrofóbico para la adsorción de Lipasa B. En este procedimiento el soporte hidrof ílico (sílica gel) y hidrofobiza impregnándolo con polipropileno (PP). Se toman 2 g de pellets de polipropileno y se diluyen en 100 ml de n-pentano, después del tiempo establec ido en el diseño exper imental se introducen 2 g de s ílica gel y se evapora el volumen de solvente, también establec ido en el diseño experimental. Una vez evaporado el n-pentano, se procede a retirar la soluc ión res tante, dejando el soporte que será caracterizado por medio de una prueba de área BET, por medio de dicha prueba se determinará el área superficial de la muestra y su dis tribución de tamaño de poro. 3.1.2 Inmov ilización la enz ima por medio de adsorc ión en el sopor te hidrofóbico y determinación de la inmovilización. Una vez obtenido el sopor te se sumerge en 50 ml de etanol por 30 minutos, poster iormente se lava con una solución etanol-agua y finalmente 2 lavados más con agua destilada. Para inmov ilizar la enz ima, se toman 2.4 ml CaLB líquida y se disuelve en 1.6 ml de buffer fosfato de 25nM y pH7; a esta solución se agregan 0.5 g de pellets de sílica hidrofobizada. Se mantiene en suspens ión con agitación a 30oC por 48 horas, en una cámara húmeda para prevenir la evaporac ión de la solución. Una vez transcurrido el tiempo se lava el soporte con buffer fosfato. Para determinar con cual soporte se obtienen mejores resultados, se compara la concentración inicial y final de CaLB en la solución para cada experimento por medio de la prueba de Biuret.

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3.1.3 Determinar la v ida útil de la enzima en el soporte por medio de la reutilización. Al sopor te se le realizan pruebas de determinac ión de actividad enz imática a través del tiempo. Estas pruebas cons isten en comprobar la presencia de acido peresteárico y peroxido de hidrógeno (por medio de la titulac ión de una muestra con tiosoulfato de sodio y sulfato de cer io respectivamente [18]), a partir de ác ido es teár ico y peróxido de hidrógeno, en presencia del biocatalizador. Un erlenmeyer con 5.7 g de ácido esteárico y 200 ml de tolueno se incuba a 40oC. Al disolverse el ác ido se adicionan2.13 ml de H2O2 y finalmente 0.2 g del catalizador , lo que da inicio a la reacc ión. Figura 7. Montaje del exper imento en el laborator io

Se toman muestras de la superficie del medio por 2 horas. Durante la pr imera hora se toman muestras cada 10 minutos, al comenzar la segunda hora las muestras se toman cada 20 minutos . A cada muestra se le mide la concentración de peróx ido de hidrógeno y de ác ido peresteárico, de acuerdo con el método en el anexo 1.

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4. DISEÑO EXPERIMENTAL Para encontrar condic iones adecuadas para la fabricac ión de un sopor te hidrofóbico con la mayor área superficial pos ible se llevo a cabo un diseño exper imental dos factor ial, con dos factores y dos niveles ; s iendo los factores el tiempo de contacto entre el polipropileno y el n-pentano (dos niveles : 45 y 90 minutos) y el volumen a evaporar de n-pentano (dos niveles: ½ y 3/10 del volumen), como se puede observar en la tabla 2. Tabla 2. Diseño experimental

t V

45” 90”

1/2 45” ½ V

90” ½ V

3/10 45” 3/10 V

90” 3/10 V

Donde la primera fila corresponde a los tiempos de contacto de PP y n-pentano y la primera columna al volumen de n-pentano de la solución a evaporar. En experimentos anter iores el tiempo de contacto fue de 2 horas y el volumen de solvente evaporado fue de mas de la mitad. Con estas condic iones se obtuvo un sopor te con un área superfic ial de alrededor de 450 m2/g, que es, al menos, 200 m2/g menor que el área superficial de la s ílica gel s in tratar. Por tal motivo se escogieron tiempos de contacto y volumen a evaporar menores.

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5. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS 5.1 HIDROFOBIZACIÓN DEL SOPORTE Los resultados de la prueba de caracter izac ión del área BET se obtuv ieron los resultados que se muestran en la Tabla 3 Tabla 3: Resultados área BET

t V 45” 90”

1/2 648 m2/g 603 m2/g

3/10 650 m2/g 608 m2/g

Se esperaba que entre mayor tiempo de contacto entre el solvente y el PP, se lograra disolver mayor cantidad de polipropileno; al igual que entre mayor cantidad de volumen de solvente se evaporara, mayor cantidad de PP se prec ipitar ía sobre la superficie de la s ílica, disminuyendo as í el área superfic ial original. Se observa que, de los resultados obtenidos de la prueba de área BET, el factor más importante al determinar la cantidad de PP en n-pentano que se precipitara sobre el soporte, es el tiempo de contacto y no el volumen a evaporar . Se nota que para el mismo tiempo de contac to y diferente volumen de solvente evaporado, el área superfic ial cambia muy poco; mientras que para diferente tiempo de contac to és ta cambia en al menos 40 m2/g. Por esta razón, las mejores condiciones para la hidrofobización son una disoluc ión de polipropileno en n-pentano por 45 minutos a 36oC y la evaporac ión de 3/10V. 5.2 INMOVILIZACION DE LA CALB De la parte prev ia de la experimentación se obtuvieron 4 muestras con altas áreas superficiales y distr ibución de tamaño de poro mesoporosa. Para determinar una correcta hidrofobización se llevó a cabo la inmov ilizac ión en las cuatro muestras. Se determinó, por medio de la prueba de cuantificación proteica de Biuret, que la concentrac ión de enz ima en la soluc ión inic ial de enz ima y buffer fosfato era de 38.78g/ml. Una vez terminada la inmov ilización, de nuevo, se midió la cantidad de proteína restante en la soluc ión, y finalmente en los líquidos de lavado del sopor te; determinando as í, la cantidad de enz ima absorbida en cada soporte hidrofobizado. De esta forma se puede determinar cual de los sopor tes adsorbió la mayor cantidad de enzima. Los resultados de este experimento se observan en la Tabla 4.

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En los líquidos del lavado no se encontró presenc ia de proteínas, lo que indica que la enz ima fue adsorbida por el soporte y no quedó simplemente puesta sobre el mismo. De haber sido as í se hubiera desprendido y hubiera quedado en los líquidos de lavado. Tabla 4. Adsorc ión de enzima _______________________________________________________________ Muestra Enz detec tada Enz adsorbida % adsorbido ___________ ____________ g/ml g/ml _______________________________________________________________ 1 21.7 17.1 44.1 2 22.9 15.8 40.7 3 24.5 14.3 36.9 4 24.9 13.8 35.6 Muestra 1 = 45” , 3/10V Muestra 2 = 45” , 1/2V Muestra 3 = 90” , 3/10V Muestra 4 = 90” , 1/2V De los resultados de las Tablas 3 y 4 se observa un patrón en la adsorción de enz ima y en el área superficial; para la muestra de mayor área se obtuvo una mayor adsorc ión (muestra 1 con 44.1% de adsorc ión) y para la de menor área se obtuvo la más baja adsorc ión (muestra 4 con 35.6%). Es te resultado era el esperado, ya que se sabe que entre mayor área superficial tenga el soporte, mayor cantidad de enzima se logrará inmov ilizar dentro de éste; por lo tanto se puede afirmar que las cuatro muestras fueron correctamente hidrofobizadas. De es ta parte del procedimiento se obtiene un catalizador compuesto por una enz ima (CaLB) “atrapada” en un soporte mesoporoso (sílica gel hidrofobizada) . 5.3 VIDA ÚTIL DEL CATALIZADOR Para es ta par te del experimento se escogió la muestra 1, que demostró tener la mayor cantidad de enz ima inmov ilizada. Tabla 5. Activ idad específica del catalizador ____________________________________________________________ Corr ida Peso catalizador Activ idad específ ica ____________ ___________________ g cat mol/L*min*g cat ____________________________________________________________

1 0.2 8.0*10-3

2 0.18 8.8*10-3 3 0.15 4.4*10-3

4 0.1 5.0*10-3

5 0.09 5.0*10-3 6 0.08 4.5*10-3

7 0.07 3.3*10-3 8 0.06 2.2*10-3 ____________________________________________________________

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En la Tabla 5 se muestra la Actividad Específica del catalizador correspondiente a cada una de las corr idas ; siendo ésta la pendiente inicial de la gráfica de producto vs. tiempo para cada reacción. Para una cantidad fija de enz ima un aumento en la concentrac ión de sustrato no produce un aumento en la velocidad de reacción, por lo tanto se puede decir que és ta solo depende de la concentración de enz ima [17]. Es por es to que es importante determinar la Activ idad Enz imática Específica (Tabla 4), que determina la concentración de producto obtenido por cantidad de catalizador por minuto en el curso de la reacción. A medida que aumentan el número de corridas en las que se ha usado el catalizador, el sopor te se rompe en par tes cada vez más pequeñas, dificultando la pos ter ior recuperación del catalizador y presentando una disminuc ión en la producción de ác ido peresteár ico, en la Actividad Enz imática y en la Actividad Enzimática Específ ica Figura 8. Ac tiv idad especifica del catalizador En la Figura 8 se observa c laramente la disminución de la ac tiv idad específica a medida que se le da uso al catalizador. De experimentos anteriores se sabe que el agua residual de la enz ima o el bajo contenido de agua del medio no tienen un efec to adverso en la actividad de la enz ima [15] [17], por lo tanto se puede afirmar que el agua que pudiera quedar atrapada dentro del soporte, después del lavado con buffer fosfato y del pos ter ior secado en el desecador, no interfieren de manera negativa en la actividad del catalizador.

0.00E+00

2.00E-03

4.00E-03

6.00E-03

8.00E-03

1.00E-02

0 2 4 6 8

Corrida

mol

/L*m

in*g

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La disminución en la ac tiv idad, puede deberse a dos razones pr incipalmente. Como consecuencia de la oxidación de la enz ima debida al contac to directo de esta con el peróxido de hidrógeno, y al desprendimiento de enzima de la superficie del sopor te hidrofobizado por la pérdida del recubr imiento hidrofóbico, debido al contacto prolongado con tolueno. Estas son hipótes is que se deben comprobar en estudios posteriores.

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6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES Las condic iones que se encontraron apropiadas para la hidrofobización fueron una disolución de polipropileno en n-pentano por 45 minutos a 36oC y la evaporac ión de 3/10V. Para encontrar las condiciones óptimas para la hidrofobización debería aumentarse el número de niveles para cada factor y hacer replicas de cada uno. Se encontró una disminución en la activ idad enzimática específ ica. Puede ser provocado por efectos de la reacc ión, efectos de la hidrofobizac ión y el tipo de inmov ilización. Los efectos de la reacción no se pueden cambiar , como la oxidación de la enz ima en presenc ia del peróx ido de hidrógeno. Los efec tos de la hidrofobización se refieren a la perdida del recubrimiento hidrofóbico a medida que se usa el catalizador en un medio orgánico fuerte como el tolueno, permitiendo el desprendimiento de enz ima de la superficie del sopor te; para evitar es te inconveniente se puede buscar un soporte completamente hidrofóbico, por ejemplo polipropileno poroso o membranas cerámicas . Para determinar con certeza la v ida util y en cuanto se disminuye la actividad espec ifica del catalizador se debe repetir el exper imento, ya que, como se observa en la tabla 4 y la figura 8, los valores inic iales no son precisos. La actividad inicial, según los datos finales es tar entre 6*10-3 mol/L*min*g cat y 8*10-3 mol/L*min*g cat, y según los iniciales entre 8*10-3 mol/L*min*g cat y 1*10-2 mol/L*min*g cat. Al determinar el valor exacto de la activ idad específ ica inic ial, de igual forma, será posible tener certeza de la vida útil del catalizador .

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ANEXO 1. MÉTODO DE DETERMINACIÓN DE PERÁCIDO Y PERÓXIDO [18] Para la determinación de la presenc ia de peróxido de hidrógeno, se toma una muestra, se diluye en 250 ml de ácido sulfúrico 1N en baño de hielo. De acuerdo a la ecuación (2) se determina el contenido de peróxido de hidrógeno por medio de una titulac ión de ox ido reducc ión con sulfato de cerio 0.001N (N1) con ferroína como indicador, obteniendo un V1, que corresponde al volumen requerido en la titulación.

2423422422 )()(2 OSOHSOCeSOCeOH ++→+ (2) Para determinar la presenc ia de ácido peresteárico, a la muestra titulada anteriormente se le adiciona un exceso de ioduro de potasio, que reacciona con ác ido sulfúr ico formando ácido iodhídrico, de acuerdo a la ecuación (3),

4242 22 SOKHISOHKI +→+ (3) Éste ácido formado en un medio ácido reacciona con ac ido peracético liberando yodo, como lo muestra la ecuación (4)

OHCOOHCHIHICOOOHCH 2323 2 ++→+ (4) Posteriormente se adic iona almidón, que reacc iona con yodo, tornándose morado y actuando como indicador en la titulac ión final con tiosulfato de sodio 0.1N (N2), según la ecuación (4). El volumen necesario para la titulación (V2) determina la cantidad de ác ido peresteár ico produc ido.

−−− +→+ IOSOSI 22 264

2322 (4)

A partir de los volúmenes de sulfato de cer io y tiosulfato de sodio se obtienen los porcentajes de peróxido y perácido respectivamente. As í:

m

FOmeqHNVOH 100****% 221122 =

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mHmeqPANVPA 100****% 22=

Donde,

22% OH , es la concentración de H2O2 en porcentaje en peso. PA% , es la concentración de perácido en peso.

meq H2O2, son los miliequivalentes del peróx ido (peso molecular del peróx ido div idido por el número de electrones intercambiados en la reacción de oxido-reducc ión, div idido en 1000). meq PA, son los miliequivalentes del perácido (peso molecular del perác ido div idido por el número de electrones intercambiados en la reacción de oxido-reducc ión, div idido en 1000). F, es el factor de dilución (1 para muestras no diluidas) m, es la cantidad de muestra (g) De este procedimiento se obtendrá una gráfica de concentrac ión de ác ido peresteárico (mol/L) a través del tiempo, en la que se podrá observar la velocidad de reacción del catalizador. Finalmente, después de tratar el sopor te para su reutilización (con lavado de buffer fosfato y secado de al menos 12 horas) se repetirá la prueba, hasta observar que el soporte ha dejado de funcionar ( la enzima muestra muy poca o ninguna actividad), determinando así su v ida útil.