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INSTITUTO AGRONÔMICO PÓS-GRADUAÇÃO AGRICULTURA TROPICAL E SUBTROPICAL Exsudação radicular e sua utilização por rizobactérias ELAINE RODRIGUES DA SILVA Orientadora: Dra. Sueli dos Santos Freitas Dissertação submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Agricultura Tropical e Subtropical, na área de Gestão de Recursos Agroambientais. Campinas, SP Abril de 2011
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INSTITUTO AGRONÔMICO
PÓS-GRADUAÇÃO
AGRICULTURA TROPICAL E SUBTROPICAL
Exsudação radicular e sua utilização por rizobactérias
ELAINE RODRIGUES DA SILVA
Orientadora: Dra. Sueli dos Santos Freitas
Dissertação submetida como requisito
parcial para obtenção do grau de
Mestre em Agricultura Tropical e
Subtropical, na área de Gestão de
Recursos Agroambientais.
Campinas, SP
Abril de 2011
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À minha família
DEDICO
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AGRADECIMENTOS
A Deus, fonte da minha vida
À Dra. Sueli dos Santos Freitas pela orientação, pelos valiosos ensinamentos e amizade
À Dra. Terezinha de Jesus Garcia Salva pelo apoio nas análises com o HPLC e ensinamentos
À Dra. Adriana Parada Dias da Silveira pelos conhecimentos e amizade
À Dra. Mônica Ferreira de Abreu pela permissão do uso de seu laboratório nas análises com o
espectrofotômetro
À Rosana pelos inúmeros auxílios a mim concedidos e pela paciência
Aos meus pais, Isaac e Márcia, pelo apoio incondicional e carinho não só neste momento, mas
em todos da minha vida
Aos meus irmãos Cláudia e Fábio e ao meu noivo Rodrigo, pessoas muito importantes para
mim, sem as quais eu não teria chegado até aqui
Aos colegas de laboratório pelo auxílio na realização de experimentos e momentos de
descontração
Aos amigos e colegas que fizeram os dias serem mais agradáveis: Raquel, Fernanda, Júlia,
Matheus, Ana Olívia, Daniel, Giseli, Jhonny, Kelly, Daniela, Thais, Eliezer e Leonardo
A todos os funcionários da Pós-Graduação do Instituto Agronômico
À Capes pela bolsa concedida
iv
SUMÁRIO
RESUMO......................................................................................................................... v
ABSTRACT.................................................................................................................... vi
1 INTRODUÇÃO............................................................................................................ 1
2 REVISÃO DE LITERATURA.................................................................................... 2
2.1 As Bactérias do Gênero Pseudomonas...................................................................... 2
2.2 As RPCPs e suas Interações com Plantas.................................................................. 3
2.3 Exsudação Radicular................................................................................................. 11
3 MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................................... 13
3.1 Montagem do Sistema Gnotobiótico......................................................................... 13
3.2 Experimentos de Coleta e Análise de Exsudatos....................................................... 14
3.2.1 Liberação e coleta dos exsudatos.......................................................................... 14
3.2.2 Identificação e quantificação de carboidratos....................................................... 16
3.2.3 Análise do teor de proteínas................................................................................... 16
3.3 Experimento de Utilização, pelos Isolados, dos Açúcares Contidos nos Exsudatos. 17
3.4 Experimento de Avaliação de Colonização das Raízes pelos Isolados..................... 19
3.5 Análises de Variância................................................................................................ 20
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................. 20
4.1 Construção do Sistema Gnotobiótico........................................................................ 20
4.2 Composição de Açúcares dos Exsudatos................................................................... 21
4.3 Concentração de Proteínas dos Exsudatos................................................................. 25
4.4 Utilização, pelos Isolados Bacterianos, dos Açúcares Contidos nos Exsudatos....... 27
4.5 Colonização das Raízes pelos Isolados..................................................................... 30
4.6 Considerações Finais.......................................................................................... 33
5 CONCLUSÕES............................................................................................................ 36
6 REFERÊNCIAS........................................................................................................... 37
v
Exsudação radicular e sua utilização por rizobactérias
RESUMO
Sabe-se que as plantas são capazes de influenciar a composição da comunidade microbiana ao
redor de seu sistema radicular pela exsudação de carboidratos e outros compostos. A rizosfera
de alface (Lactuca sativa) é habitada por rizobactérias promotoras de crescimento de plantas
(RPCPs), inclusive as fluorescentes de Pseudomonas sp. No entanto, a produção de
inoculantes com essas bactérias tem sido dificultada por resultados ainda variáveis. Dessa
forma, o principal objetivo deste trabalho foi realizar uma análise mais detalhada do ambiente
rizosférico que permitisse determinar qual a influência da exsudação radicular de açúcares e
proteínas por alface, sobre a colonização radicular por essas bactérias rizosféricas,
comparando com os resultados encontrados em chicória e rúcula. Para isso cultivaram-se
plantas de alface, rúcula e chicória em sistema gnotobiótico, sendo analisados os exsudatos
quanto ao teor de açúcar, por cromatografia líquida de alto desempenho, e de proteínas, por
espectrofotometria, 7 e 21 dias após emergência da radícula. Também se testou a utilização,
em meio de cultura, dos açúcares encontrados, por isolados de Pseudomonas, e
posteriormente a colonização das raízes das plantas pelos mesmos isolados. Detectou-se a
presença de uma certa variedade de açúcares: galactose, xilose, manose e sacarose, em
quantidades traço, e arabinose, frutose e glicose + manose em maiores concentrações. A
exsudação desses açúcares apresentou diferenças em concentração entre as três espécies
vegetais e entre os dois períodos amostrados. Não houve diferenças na exsudação de proteínas
entre as plantas ou períodos. Assim, os açúcares e proteínas parecem não serem os únicos
componentes dos exsudatos responsáveis pela colonização aparentemente preferencial de
espécies fluorescente do gênero Pseudomonas em plantas de alface. Todos os isolados de
Pseudomonas utilizaram pelo menos um dos três açúcares encontrados em maior
concentração (glicose, frutose e arabinose), como única fonte de energia, além de terem
colonizado as raízes das três espécies vegetais.
Palavras-chave: Lactuca sativa, promoção de crescimento, RPCPs.
vi
Root exudation and its use by rhizobacteria
ABSTRACT
The plants can influence the composition of microbial communities around their roots
by exudation of carbohydrates and other compounds. The rhizosphere of lettuce (Lactuca
sativa) is inhabited by plant growth promoting rhizobacteria (PGPRs), including fluorescent
Pseudomonas sp. However, the production of inoculants with these bacteria has been
impaired due to unstable results. Thus, the main objective of this study was to realize a more
detailed analysis of the rhizosphere environment to determine the influence of the root
exudation of sugars and proteins from lettuce, concerning the rhizospheric colonization by
these bacteria, and comparing it with endive and arugula. So, lettuce, endive and arugula were
cultivated in gnotobiotic systems, and the exudates were analyzed on the sugar content in
high-performance liquid chromatography, and protein in a spectrophotometer, 7 and 21 days
after the shoot emergence. The use of sugars by Pseudomonas isolates and colonization of
plant roots by these isolates were tested. The presence of a variety of sugars: galactose,
xylose, mannose and sucrose in trace amounts, and arabinose, glucose + maltose and fructose
at higher concentrations was detected. The exudation of these sugars presented concentrations
differences between the three plant species and between the two periods. There were no
differences in the exudation of proteins between plants or periods. Thus, the sugars and
proteins were not the only components of the exudates responsible for the colonization
species of fluorescent Pseudomonas in lettuce. All strains of Pseudomonas used at least one
of the three sugars found in higher concentrations (glucose + maltose, fructose and arabinose)
as the only energy source, and have colonized the roots of three plant species.
Key-words: PGPR, Lactuca sativa, grown promoting
1
1 INTRODUÇÃO
Rizobactérias promotoras de crescimento de plantas (RPCPs) são bactérias que
colonizam raízes de plantas e promovem seu crescimento quando inoculadas em sementes,
raízes ou tubérculos. Esse grupo de bactérias vem sendo pesquisado há décadas em todo o
mundo, com vários relatos de sucesso e de insucesso, em diversas situações. Os principais
gêneros de bactérias que têm sido usados como promotores de crescimento, em estudos, são
Pseudomonas spp., Azospirillum spp., Bacillus spp., Burkholderia spp. e Azotobacter spp.
Espécies de Pseudomonas têm sido benéficas em cereais e leguminosas, entre outros grupos
vegetais.
Acredita-se que as RPCPs produzam substâncias promotoras de crescimento, como os
fitormônios auxina, citocinina e giberelina, e previnam o estabelecimento de patógenos na
rizosfera por produzirem antibióticos, sideróforos ou enzimas hidrolíticas, além de poderem
induzir a resistência sistêmica. Mas, apesar do conhecimento de seus benefícios às plantas, as
RPCPs ainda não são usadas na produção de inoculantes porque os resultados obtidos em
estudos ainda são variáveis, ou seja, são resultados que não se repetem, ou testes in vitro cujos
resultados não são alcançados no campo.
Entre as espécies de RPCPs estão algumas das fluorescentes do gênero Pseudomonas,
que habitam a rizosfera de algumas plantas, como a alface (Lactuca sativa), favorecendo seu
crescimento. Como o local onde vivem e atuam é o ambiente rizosférico, é aí que se devem
buscar os fatores que determinam o sucesso de seu estabelecimento, o que poderia explicar a
instabilidade nos resultados dos trabalhos com as RPCPs. Assim, seria importante entender se
os exsudatos da alface têm influência sobre as bactérias rizosféricas e como isso ocorre,
podendo significar a colonização ou não do ambiente rizosférico, já que vários estudos têm
indicado que a composição e a quantidade dos exsudatos liberados pelas raízes influenciam
diretamente o ambiente rizosférico, beneficiando a colonização de certas comunidades.
Assim, as raízes das plantas liberam vários compostos como açúcares, ácidos
orgânicos, aminoácidos, entre outros, e tanto este conteúdo como a quantidade em que são
liberados são influenciados por diversos fatores, como espécie da planta e estádio de
desenvolvimento da planta, e também influenciam diferentemente a microbiota rizosférica,
podendo levar a diferentes resultados quanto à colonização radicular.
2
Sabe-se, por exemplo, que a rizosfera de alface favorece a colonização de bactérias
fluorescentes do gênero Pseudomonas, em comparação com outras plantas e com outra
bactéria rizosférica do gênero Bacillus, independentemente do ambiente de cultivo ou das
características do solo, e que este fato deve ser devido à composição e quantidade de
exsudatos liberados pelas diferentes plantas. Assim, a composição e as quantidades das
substâncias liberadas pela alface favoreceriam as bactérias fluorescentes do gênero
Pseudomonas.
Dessa forma, comprovada a influência da espécie vegetal na colonização da região
rizosférica e tendo em mente que os exsudatos liberados podem exercer grande influência
sobre essa característica, seria importante descobrir qual a composição dos exsudatos de
Lactuca sativa (alface), em pelo menos algumas substâncias, e se alguma delas tem efeito
sobre o crescimento de Pseudomonas spp. do grupo fluorescente.
Portanto, os objetivos deste trabalho foram a verificação da importância da exsudação
radicular de açúcares e proteínas por alface sobre a colonização rizosférica por bactérias
rizosféricas fluorescentes do gênero Pseudomonas e a avaliação, in vivo, do estabelecimento
de espécies de Pseudomonas fluorescentes na rizosfera de alface em comparação com outras
espécies vegetais.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 As Bactérias do Gênero Pseudomonas
As bactérias do gênero Pseudomonas são Gram-negativas, habitam normalmente o
solo e a água, onde suas atividades são importantes na mineralização da matéria orgânica.
Algumas espécies causam doenças em plantas e exibem variados graus de especificidade com
hospedeiros (BUCHANAN & GIBBONS, 1974).
A maioria das espécies estudadas, incluindo as parasitas, não requerem nenhum fator
de crescimento e podem se desenvolver em meio mineral com um composto orgânico como
única fonte de carbono e energia. Poucas espécies requerem aminoácidos ou vitaminas. O
acetato pode ser usado como principal nutriente por todas as espécies que têm sido
caracterizadas. O lactato, o succinato e a glicose podem ser usados pela maioria, mas não por
todas as espécies. Uma característica marcante de muitos membros do gênero é sua habilidade
3
em usar uma grande variedade de compostos orgânicos como única ou principal fonte de
crescimento: alguns isolados utilizam mais de 100 diferentes substratos (BUCHANAN &
GIBBONS, 1974).
O grupo fluorescente produz pigmentos amarelo-esverdeados, que fluorescem em luz
ultravioleta (comprimento de onda abaixo de 260 nm), particularmente em meios deficientes
em ferro (por exemplo: meio B de KING et al., 1954). Algumas espécies de Pseudomonas
fluorescentes também produzem pigmentos denominados fenazinas, que podem ser azuis,
alaranjados ou verdes, particularmente no meio A de KING et al. (1954).
Muitos estudos vêm indicando que as bactérias do gênero Pseudomonas
frequentemente dominam a rizosfera, onde têm papel fundamental na ciclagem de nutrientes e
na fertilidade do solo (ROSALES et al., 1995; PICARD et al., 2000) e como rizobactérias
promotoras do crescimento de plantas (RPCPs) (PICARD et al., 2000; ROSS et al., 2000;
BERGSMA-VLAMI et al., 2005).
Dentre as RPCPs, as Pseudomonas, principalmente as do grupo fluorescente, são as
bactérias mais bem estudadas, devido a suas características como presença em diversos
ambientes e em elevadas populações, versatilidade nutricional, antagonismo a diversos
patógenos e produção de antibióticos, sideróforos e hormônios de crescimento vegetal
(MELO & AZEVEDO, 1998).
2.2 As RPCPs e suas Interações com Plantas
A rizosfera abriga uma variedade de microrganismos, que podem ser benéficos,
prejudiciais ou neutros ao crescimento da planta. Entre os benéficos estão as RPCPs, cuja
ação tem sido mostrada em diferentes condições de clima, solo e temperatura e em diferentes
espécies de plantas (arroz, trigo, alface, milho, leguminosas etc.), como mostram os estudos
de FREITAS & GERMIDA (1992a); SINDHU et al. (2002); EGAMBERDIYEVA &
HÖFLICH (2003); FREITAS et al. (2003); CONG et al. (2009); entre muitos outros.
Os efeitos benéficos das RPCPs têm sido observados tanto no aumento da
produtividade das culturas como na redução de comunidades de microrganismos patogênicos.
EGAMBERDIYEVA & HÖFLICH (2003), por exemplo, perceberam que algumas espécies
de Pseudomonas causaram um aumento significativo na absorção de P e K em trigo e que
espécies de Mycobacterium também tiveram efeito positivo em trigo, causando maior
absorção de N, P e K. Todas as espécies promoveram aumento da massa de matéria seca das
raízes e da parte aérea. Posteriormente, EGAMBERDIEVA (2007) novamente detectou os
4
mesmos benefícios proporcionados por essas bactérias em milho. ROSAS et al. (2009)
obtiveram resultados semelhantes com as mesmas espécies vegetais (trigo e milho) que
receberam o inóculo de Pseudomonas aurantiaca. Além disso, aplicaram também
fertilizantes, demonstrando que o inóculo reduziu a necessidade de fertilizantes à base de
uréia, o que concorda com o trabalho de CONG et al. (2009), que conseguiram economizar 43
kg ha-1
de N em arroz, com aumento da produção de 270 kg ha-1
, em duas estações chuvosas
subsequentes, ajudando, além da economia, a mitigar a poluição por nitrogênio inorgânico de
águas superficiais e subterrâneas.
NAIMAN et al. (2009) relataram para trigo um aumento na massa de matéria seca na
fase de preenchimento de grãos, em plantas que receberam inoculantes comerciais, um com P.
fluorescens e dois com Azospirillum brasiliense. As plantas que receberam P. fluorescens
apresentaram um aumento de 23% na biomassa da parte aérea, de 46% na massa de matéria
seca da raiz e de 19% na produção de grãos em comparação com o controle.
Efeitos semelhantes foram observados por outros pesquisadores, com o inóculo de
várias bactérias consideradas promotoras de crescimento, como a elongação de raízes e parte
aérea de canola, alface e tomate (GLICK et al., 1997; FREITAS et al., 2003); aumento da
concentração de nutrientes na parte aérea e raízes de plantas e melhor eficiência na utilização
na utilização destes (EGAMBERDIYEVA & HÖFLICH, 2003; EGAMBERDIYEVA, 2007;
BARRETTI et al., 2008; REIS-JÚNIOR et al., 2008;); aumento da área foliar e massa de
matéria seca e/ou fresca da parte aérea e/ou raízes (FREITAS, 1989; SINDHU et al., 1999,
2002; GOMES et al., 2003; FREITAS & AGUILAR-VILDOSO, 2004; BARRETI et al.,
2008; REIS-JÚNIOR et al., 2008); além de promover a germinação de sementes de grão de
bico e soja (DILEEP KUMAR & DUBE, 1992); aumento do conteúdo de açúcar em beterraba
(ÇAKMAKÇI et al., 2006) e aumento do número de nódulos de feijão mungo (Vigna radiata)
(SINDHU et al., 1999). Mesmo em condições extremas (estresse salino ou de temperatura), os
isolados de canola (colonizadores efetivos de canola) promoveram o crescimento das plantas,
enquanto os introduzidos não apresentaram o mesmo desempenho (GLICK et al., 1997).
ÇAKMAKÇI et al. (2006), além de observarem maior crescimento de beterraba,
comprovando os efeitos benéficos da RPCPs, ainda observaram que os maiores benefícios
ocorreram logo nos estádios iniciais de desenvolvimento da planta, ou seja, a rápida resposta
inicial às bactérias inoculadas fez com que as folhas se expandissem antes que o esperado e
que as raízes alcançassem rapidamente seu pico de desenvolvimento.
Assim, muitos estudos têm comprovado a ação benéfica das RPCPs a muitas culturas e
por mecanismos variados, muitos dos quais estão descritos na literatura, e cujo conhecimento
5
é imprescindível para a exploração dos diferentes potenciais de cada uma das bactérias, nas
várias culturas e condições ambientais.
Um bom exemplo de um mecanismo foi a produção de enzimas por bactérias do
gênero Pseudomonas, em trabalho realizado por SHAHAROONA et al. (2006). Em seus
experimentos com milho, percebeu que muitas linhagens de Pseudomonas causaram
crescimento da planta, das raízes e a biomassa geral, mesmo em níveis ótimos de N, visto que
altos níveis de NO3- na região da raiz levam ao aumento da produção de etileno, que é
inibitório ao crescimento de raízes, além de ser provável que reduzam a eficiência das RPCPs.
O autor chegou à conclusão de que esse resultado se deveu à atividade da ACC-deaminase
produzido pelas bactérias, que baixaram os níveis de etileno, pelo “seqüestro” do ACC, um
precursor do etileno, promovendo o crescimento das raízes. A linhagem de P. fluorescens foi
a mais eficaz, o que pode ter sido devido à alta capacidade de colonização dessa bactéria,
segundo o autor, e pela atividade das enzimas quitinase e ACC-deaminase.
EGAMBERDIYEVA (2007) detectou a produção de outras enzimas (amilase, lipase,
celulase e protease) por diferentes isolados de Pseudomonas e Mycobacterium, sendo que os
isolados que produziram essas enzimas também inibiram o crescimento de fungos patogênicos
do gênero Fusarium.
Outros trabalhos relataram a produção de fitormônios por RPCPs, como
DUBEIKOVSKY et al. (1993), em que dois isolados de Pseudomonas, cuja produção de
ácido indol acético (AIA) foi detectada, foram inoculados em árvores de groselha. Houve um
efeito estimulante no desenvolvimento radicular dessas plantas, tendo o tamanho da
população do isolado inoculado na superfície radicular se correlacionado com o efeito
observado. Fato semelhante foi relatado por EGAMBERDIYEVA & HÖFLICH (2003), em
que todos os isolados que promoveram o aumento do conteúdo de nutrientes nas plantas
produziram auxinas, servindo provavelmente como um regulador que estimulou o
desenvolvimento das raízes, resultando em uma melhor absorção de nutrientes e de água.
Além das auxinas, a produção de citocininas foi detectada em Paenibacillus polymyxa durante
sua fase estacionária de crescimento (TIMMUSK et al., 1999).
Além da promoção direta de crescimento, há também vários estudos que comprovam a
ação das RPCPs na supressão de microrganismos deletérios, como os estudos feitos por
SINDHU et al. (1999, 2002), em que espécies de Pseudomonas isoladas da rizosfera de grama
foram inoculadas em solos infestados com potenciais patógenos (Aspergillus sp., Curvularia
sp., Fusarium oxysporum e Rhizoctonia solani), inibindo o crescimento desses fungos; de
maneira semelhante, em resultados relatados por EGAMBERDIYEVA (2007), espécies de
6
Mycobacterium, Pseudomonas e Bacillus apresentaram reação antagônica contra fungo
patogênico do gênero Fusarium. No Brasil, AGNANI et al. (2005) e FREITAS &
PIZZINATTO (1997), entre outros, observaram também a inibição da manifestação de
patógenos em plantas cítricas e em algodoeiro, respectivamente.
A atividade de promoção de crescimento também pode ocorrer pela produção de
sideróforos, quelantes de ferro de baixo peso molecular, excretados sob condições de
deficiência de ferro. Assim, os sideróforos são ligantes específicos de Fe(III), e desempenham
a função de seqüestrar e transportar esse íon, incorporando-o ao metabolismo celular
(BENITE et al., 2002). Dessa forma, os sideróforos produzidos pelas bactérias complexam o
ferro do ambiente, tornando-o menos disponível a certos microrganismos do solo
(KLOEPPER et al., 1980). No trabalho conduzido por SINDHU et al. (2002), isolados de
Pseudomonas produtores de sideróforos e de antibióticos foram os responsáveis pelo
antagonismo, inibindo o crescimento de vários fungos patogênicos (Aspergillus sp.,
Curvularia sp., Fusarium sp. e Rhizoctonia sp.). Também se relatou a ação supressora do
antibiótico fenazina-1-ácido-carboxílico produzido por Pseudomonas fluorescens contra o
microrganismo patogênico Gaeumannomyces graminis (BULL et al., 1991).
As RPCPS podem ainda estimular a indução de resistência sistêmica (IRS) na planta,
ou seja, um aumento da capacidade defensiva das plantas contra um amplo espectro de
patógenos, que é adquirida após um estímulo apropriado (RAMAMOORTHY et al., 2001).
Em um estudo em que se aplicou Pseudomonas em plantas de arroz contaminadas com
Rhizoctonia solani, NANDAKUMAR et al. (2001) detectaram a redução da severidade da
doença causada pelo fungo e a promoção do crescimento da planta sob condições de casa de
vegetação e de campo. Assim, chegou-se à conclusão que a redução da doença ocorreu pela
IRS, provavelmente pela indução de enzimas de defesa, ou diretamente pela inibição do
crescimento do fungo pela produção de quitinases ou antibióticos.
Semelhantemente, DUTTA et al. (2008) testaram o efeito de dois isolados de RPCPs
(Bacillus cereus e Pseudomonas aeruginosa), na indução de resistência sistêmica contra
Fusarium udum em ervilhas-de-angola. Concluiu-se que essas bactérias foram capazes de
induzir a resistência sistêmica na planta. Duas enzimas líticas produzidas pelo fungo,
responsáveis pela superação da resistência natural das plantas hospedeiras e pela solubilização
de produtos que podem ser absorvidos e usados como alimento, foram fortemente reduzidas
na presença das bactérias. Além disso, os autores acharam não só que as bactérias foram
capazes de induzir resistência sistêmica em ervilha-de-angola, como demonstraram que a
combinação desses isolados mostrou ser ainda mais eficiente.
7
Há evidências que sugerem que Pseudomonas spp. agiram sinergisticamente com
espécies de Mesorhizobium sp., como os resultados obtidos por STURZ et al. (1997). Esses
autores demonstraram que a inoculação conjunta de linhagens bacterianas, que
individualmente inibiam o crescimento da planta, pode estimular o crescimento. Fato
semelhante foi relatado nos estudos realizados por SINDHU et al. (2002), em que tanto a
inoculação somente com Pseudomonas quanto a inoculação somente com Mesorhizobium
resultaram em aumento da biomassa e teor de N da planta, mas uma co-inoculação de
Mesorhizobium e Pseudomonas resultou em um aumento ainda maior na massa de matéria
fresca do nódulo e da raiz e na massa de matéria seca da parte aérea, além de um aumento
significativo do N total da planta.
Estudando a ação de microrganismos – incluindo algumas espécies de Pseudomonas –
quanto ao efeito de crescimento em plantas de tomate infectadas com Pythium, GRAVEL et
al. (2007) mostraram o efeito estimulante de P. putida na produção de frutos e no
crescimento de plantas de tomate cultivadas em sistemas hidropônicos, ou seja, uma possível
reação antagonística a esse fungo patogênico. Esse estudo também mostrou que P. putida é
capaz de sintetizar AIA in vitro a partir de diversos precursores, o que suporta a teoria de que
o AIA microbiano pode estar envolvido no estímulo de crescimento observado nos
experimentos. Assim, chegaram à conclusão de que a capacidade de P. putida de promover
crescimento deve ser um efeito sinérgico de vários modos de ação exibidos por cada
microrganismo testado, incluindo a regulação de concentrações de AIA na rizosfera e a
regulação da concentração de etileno dentro das raízes.
Assim, de acordo com os relatos descritos na literatura, os mecanismos ou modos de
ação das RPCPs podem ser sintetizados em:
Mobilização de nutrientes insolúveis e consequente aumento de sua absorção pelas
plantas (GOMES et al., 2003; ÇAKMAKÇI et al., 2006; BARRETTI et al., 2008);
Estimulação de crescimento pela produção de fitormônios como auxinas, citocininas e
giberelinas (DUBEIKOVSKY et al., 1993; TIMMUSK et al., 1999;
EGAMBERDIYEVA & HÖFLICH, 2003; EGAMBERDIYEVA, 2007);
Antagonismo a patógenos de plantas (SINDHU et al., 2002; FREITAS & AGUILAR-
VILDOSO, 2004; AGNANI et al., 2005; COSTA et al., 2006);
Produção de sideróforos e antibióticos (KLOEPPER et al., 1980; BULL et al., 1991;
SINDHU et al., 2002);
8
Produção de enzimas hidrolíticas (FRIDLENDER et al., 1993; EGAMBERDIYEVA
& HÖFLICH, 2003; EGAMBERDIYEVA, 2007);
Indução de resistência sistêmica (NANDAKUMAR et al., 2001; DUTTA et al., 2008)
Apesar de os efeitos benéficos das RPCPs serem conhecidos há muito tempo, com a
maioria dos trabalhos apresentando resultados positivos, nem sempre esses resultados se
repetem (STURTZ & CHRISTIE, 2003), e por isso não são conhecidos muitos casos do uso
dessas bactérias para a produção de inoculantes.
De fato, REIS-JUNIOR et al. (2008) também encontraram inconsistência em seu
trabalho, pois, apesar de outros trabalhos citarem o efeito da inoculação com Azospirillum na
atividade das enzimas nitrato redutase e glutamina sintetase, em seu estudo não se observou
esse efeito. Essa inconsistência também pode se expressar pela obtenção de resultados in
vitro que não se repetem no campo (GOMES et al., 2003).
Face aos inúmeros fatores que influenciam a interação planta-bactéria, diversas podem
ser as causas dessa instabilidade nos resultados. Entre as hipóteses do porquê dessas
variações está a de que os isolados bacterianos não estejam colonizando a rizosfera e
consequentemente não há manutenção de uma comunidade viável na zona radicular (STURZ
& CHRISTIE, 2003), não havendo interação com a planta.
SOTTERO et al. (2006), por exemplo, verificaram que 10 de 64 isolados de
Pseudomonas testados não colonizaram a rizosfera, e que um entre eles ainda assim
promoveu o crescimento. Os autores chegaram à conclusão de que se tratava de uma bactéria
endofítica. As outras que não colonizaram também não promoveram o crescimento. Além
disso, detectaram que a maioria das bactérias colonizou a região do colo, chegando à
conclusão de que a colonização do colo já é suficiente para demonstrar que houve interação
de bactérias e plantas.
Já os autores KUMAR et al. (2007) relataram aumento de 144,9% na produção de
milho, comparado ao controle, quando as plantas receberam inóculo de Pseudomonas
corrugata, atribuindo os bons resultados ao fato de que houve o estabelecimento, na rizosfera,
da bactéria inoculada, ou seja, sobreviveu em número suficiente e colonizou as raízes. Esses
resultados podem, então, ser atribuídos ao fato de que, segundo os autores, Pseudomonas
corrugata tem uma alta e rápida capacidade de colonização da raiz de milho.
Assim, além de ser necessária uma colonização eficiente, EGAMBERDIYEVA &
HÖFLICH (2003), pela análise de seus resultados e em concordância com o trabalho de
FREITAS & GERMIDA (1992b), chegaram à conclusão de que para obtenção de bons
9
resultados com RPCPs é necessário que as bactérias colonizem rapidamente o sistema
radicular, processo influenciado pela temperatura e pelo tipo de solo, e que para aplicações
práticas o sistema planta-RPCPs deve ser estabelecido para cada tipo de ambiente, já que as
bactérias oriundas de uma região de clima semi-continental foram mais eficientes em
temperaturas relativamente baixas, enquanto que as oriundas de regiões de clima semi-árido
apresentaram resultados mais efetivos em climas relativamente mais quentes. Da mesma
forma KUMAR et al. (2007) relataram que as bactérias com maior sucesso e que
apresentaram maiores benefícios para o milho foram aquelas isoladas do próprio milho e de
regiões com clima igual ao do local onde foram isoladas. As outras bactérias, isoladas de
outras plantas, também foram inoculadas em milho, mas apresentaram benefícios menores.
Há outros relatos de que os resultados provenientes da inoculação desses
microrganismos podem ser grandemente influenciados pelo conteúdo de nutrientes (PAULA
et al., 1992) e tipo de solo, como observados por ÇAKMAKÇI et al. (2006),
EGAMBERDIYEVA & HÖFLICH (2003), EGAMBERDIYEVA (2007) e FREITAS &
GERMIDA (1992b), que obtiveram seus melhores resultados em solos com baixos teores de
nutrientes. A deficiência de nutrientes do solo teria sido compensada pela produção
microbiana de substâncias reguladoras na interface solo-raiz, o que, por sua vez, teria
estimulado um melhor desenvolvimento das raízes, resultando numa melhor absorção de água
e nutrientes do solo (EGAMBERDIYEVA, 2007). No Brasil, FREITAS et al. (2003)
detectaram respostas diferentes no crescimento de alface de acordo com a fertilidade de
diferentes substratos testados.
Da mesma forma, dois diferentes tipos de substratos influenciaram a exsudação,
qualitativa e quantitativamente, sendo que um deles estimulou a exsudação de ácidos e
açúcares, enquanto que o outro não alterou substancialmente os padrões de exsudação
(KAMILOVA et al., 2006).
Assim, outros fatores podem influenciar a ação das RPCPs, pela flutuação dos fatores
edáficos como temperatura (LOPER et al., 1984; SEONG et al., 1991), variação da umidade
do solo (PARKE et al., 1986; HOWIE et al., 1987), do pH (HÖPER et al., 1995), tipo de solo
e histórico de cultura (LATOUR et al., 1999), diferentes interações com a microbiota
rizosférica predominante de determinada cultura (MILLER et al., 1989; SEONG et al., 1991;
SINDHU et al., 1999), ou mais especificamente, diferentes tipos de interação com rizóbios
predominantes na rizosfera de algumas leguminosas (PARMAR & DADARWAL, 1999;
SINDHU et al., 1999). Sabe-se inclusive que diferentes pCO2 alteram o comportamento de
Pseudomonas spp. quanto à produção de sideróforos e quanto à frequência de produtores de
10
HCN e redutores de nitrato, sendo esses fatores também alterados pelo estádio de vida da
planta amostrada e fração do solo (rizosférico, não rizosférico ou raiz propriamente dita)
(TARNAWSKI et al., 2006).
Outra hipótese do porquê das variações nos resultados é o fato de que diferentes
quantidades e composição dos exsudatos radiculares liberados pelas raízes poderiam levar a
diferentes resultados, já que a exsudação radicular influencia diretamente o ambiente
rizosférico. Há muito se sabe que plantas liberam pelas raízes uma grande variedade de
substâncias orgânicas, como açúcares, aminoácidos, ácidos graxos e outros (BOWEN &
ROVIRA, 1987).
Segundo os estudos realizados, a quantidade e a qualidade dos exsudatos liberados
pelas plantas são diretamente influenciadas por vários fatores como espécie da planta
hospedeira (GRAYSTON et al., 1998; COELHO et al., 2007), estádio de desenvolvimento da
planta (PILET et al., 1979), seu estado fisiológico (SANDNES et al., 2005) e por outros
fatores como condições ambientais (HASSINK et al., 1991) e concentração de nutrientes,
como observaram KRAFFCZYIK et al. (1984), que demonstraram que, sob diferentes
concentrações de potássio, a exsudação radicular de milho foi alterada. Por isso NEHL et al.
(1996) comentam que a classificação entre rizobactérias benéficas, prejudiciais e neutras pode
induzir ao erro, já que o efeito das bactérias pode ser alterado de acordo com esses vários
fatores.
Com relação à alface, COELHO et al. (2007) verificaram que sua rizosfera favorece o
estabelecimento de bactérias fluorescentes do gênero Pseudomonas, em comparação com
outras plantas (salsa, rúcula, chicória e tiririca) e outra bactéria rizosférica do gênero Bacillus.
Na maior parte dos resultados, as quantidades de Pseudomonas em alface, tanto crespa como
lisa, foram bem maiores, em relação às outras plantas, mesmo no caso da chicória, que
pertence à mesma família da alface. E esses resultados foram detectados independentemente
do ambiente, ou seja, das características do solo ou condições de cultivo. Dessa forma, as
autoras chegaram à conclusão de que pode ter havido uma diferença entre as exsudações das
plantas, tanto na composição quanto na quantidade liberada; a composição e as quantidades
das substâncias liberadas pela alface favoreceram as bactérias fluorescentes do gênero
Pseudomonas, em relação à Bacillus.
Em concordância com esses dados, LUGTENBERG et al. (1999) também
demonstraram que nos diferentes estádios de tomateiro a composição e a quantidade dos
exsudatos variavam e por isso as comunidades colonizadoras também deveriam variar. De
fato, MALONEY et al. (1997), comparando a abundância e a distribuição espacial de
11
comunidades de bactérias fisiologicamente diferentes que existem em diferentes porções da
raiz de tomateiro e alface, encontraram distribuições muito diferentes nas várias regiões da
raiz e entre as duas culturas também, indicando diferenças qualitativas e quantitativas nas
exsudações radiculares entre tomate e alface, com diferenças no desenvolvimento das plantas
e diferentes morfologias radiculares.
Semelhantemente, a inoculação de Pseudomonas spp. isoladas de feijão mungo (Vigna
radiata) teve efeito inibitório na elongação da radícula em sementes de grão-de-bico
ocorrendo parada de crescimento das plântulas após 5 dias de observação; no entanto, depois
do 9º dia observou-se crescimento, mostrando que os efeitos são variados, dependendo da
planta e de seu estádio de desenvolvimento (SINDHU et al., 2002). Já FREITAS &
AGUILAR-VILDOSO (2004), apesar de acharem um grande número de bactérias,
principalmente do gênero Pseudomonas, que promoveram o crescimento de plantas cítricas,
verificaram diferentes capacidades de promoção de crescimento das plantas, dependendo das
condições como espécie vegetal, estádio de desenvolvimento e ambiente (campo ou
citropotes).
2.3 Exsudação Radicular
A exsudação de compostos orgânicos variados, pelas raízes das plantas, é um fato
conhecido há muitas décadas (BOWEN & ROVIRA, 1987). Esses compostos são liberados,
ativa ou passivamente, durante todas as fases do desenvolvimento das plantas, em quantidades
e composições diversas, dependendo de vários fatores, como a espécie da planta e as
condições de estresse às quais são submetidas (JONES, 1998). Os principais compostos
exsudados são os carboidratos, os ácidos orgânicos e os aminoácidos, que são liberados
passivamente, ao longo de um gradiente de concentração (BOWEN & ROVIRA, 1987;
LYNCH & WHIPPS, 1990; GRAYSTON et al., 1998).
Dentre os carboidratos têm sido relatados como componentes dos exsudatos glicose,
frutose, maltose, ribose, xilose, arabinose, ramnose e sacarose, além de oligossacarídeos
(ROVIRA, 1969; SMITH, 1970; LUGTENBERG et al., 1999; KAMILOVA et al., 2006). As
quantidades variam com as espécies de plantas, fase de desenvolvimento e inclusive com o
método de coleta. LUGTENBERG et al. (1999), por exemplo, detectaram, para tomate, que
os açúcares glicose e frutose estavam presentes na proporção de 37% e 10% do total de
carboidratos, respectivamente, enquanto KAMILOVA et al. (2006), detectaram esses mesmos
açúcares, também em tomate, na proporção de 33% e 60%, respectivamente, quando os
12
exsudatos foram coletados em lã de rocha (stonewool) e 37% e 58%, respectivamente, quando
coletados em esferas de vidro (glass beads). Nesse mesmo trabalho as concentrações de
ácidos orgânicos também variaram de acordo com o método de coleta, mas em uma proporção
ainda maior.
Os ácidos mais comumente encontrados nos exsudatos são o cítrico, acético, pirúvico,
málico, malônico, butírico, lático, oxalacético, t-aconítico, succínico, fumárico e
piroglutâmico (SMITH, 1970; JONES, 1998; KAMILOVA et al., 2006).
Os aminoácidos parecem ser menos estudados nos exsudatos, e dentre esses
compostos SMITH (1970) e ROVIRA (1969) relataram a presença de alanina, glutamina,
ácido glutâmico, ácido aspártico, glicina, homoserina, leucina, isoleucina, metionina,
fenilalanina, serina, treonina, tirosina, asparagina e valina.
Sabe-se que as plantas são capazes de influenciar a composição de sua comunidade
rizosférica pela liberação justamente dessa variedade de compostos orgânicos (GRAYSTON
et al., 1998) e que esses microrganismos podem apresentar alguma especificidade, inclusive
para cultivares de uma mesma espécie (CHANWAY et al., 1988; SICILIANO et al., 1998),
ou ainda iniciar mudanças na bioquímica radicular (PARMAR & DARDAWAL, 1999),
apoiando a hipótese de que a parceria rizobactéria-planta tem uma longa história de uma bem
sucedida co-evolução (STURZ & CHRISTIE, 2003).
Dessa forma, muitos estudos têm mostrado que rizosferas diferentes possuem
comunidades microbianas diferentes, provavelmente devido aos diferentes padrões de
exsudação (ZAK et al., 1994; GRAYSTON & CAMPBELL, 1996; GRAYSTON et al., 1998;
YANG & CROWLEY, 2000).
Em um estudo com exsudatos e sua influência nas comunidades rizosféricas, LANDI
et al. (2006) concluíram que, dos compostos exsudados, o ácido oxálico induziu maior
número de mudanças nos grupos de bactérias que habitam o ambiente rizosférico, comparado
à glicose. Isso seria devido ao fato de que a glicose é decomposta por um maior número de
microrganismos, em oposição ao ácido oxálico, que, por ser utilizado por um número mais
restrito de espécies microbianas, modificou os grupos de microrganismos presentes na
rizosfera.
LUGTENBERG et al. (1999), por sua vez, trabalharam com espécies selvagens e
mutantes de Pseudomonas com objetivo de desvendar a característica dos exsudatos de
tomateiro e de entender seu papel na colonização radicular pelas bactérias. Assim, utilizando-
se de uma espécie mutante, que era incapaz de utilizar a glicose como única fonte de carbono,
chegaram à conclusão de que a habilidade de usar os açúcares exsudados não desempenha um
13
papel tão importante na colonização radicular, havendo, portanto, outros fatores que
influenciam a colonização, como os ácidos orgânicos e polímeros, por exemplo.
LANDI et al. (2006) observaram que a glicose – e não o ácido oxálico – é usada pela
maioria das comunidades bacterianas do solo. Constataram também que a atividade
microbiana e a composição da comunidade dependem do “pool” de compostos orgânicos de
baixo peso molecular, principalmente na rizosfera.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Montagem do Sistema Gnotobiótico
Montou-se um sistema gnotobiótico baseado em modelo proposto por SIMONS et al.
(1996), de modo que as sementes fossem colocadas no interior de tubos de vidro vedados e
esterilizados, permitindo o desenvolvimento das plântulas sem que os exsudatos liberados por
elas fossem decompostos por microrganismos.
Nesse sistema, um tubo de vidro aberto em ambas as extremidades foi fechado com
uma gaze em sua extremidade inferior, para suportar as plântulas em crescimento. Esse tubo
foi encaixado em um tubo de ensaio de maior diâmetro, sendo vedado primeiramente por uma
camada de algodão entre as paredes do tubo interno e externo e posteriormente pela aplicação
de silicone no topo do tubo de ensaio. O tubo interno foi então tapado em sua extremidade
superior com um tampão de algodão (Figura 1). Todo o sistema foi esterilizado antes de
receber as sementes superficialmente desinfetadas e pré-germinadas.
14
Figura 1 - Esquema de sistema gnotobiótico para coleta de exsudatos radiculares
3.2 Experimentos de Coleta e Análise de Exsudatos
3.2.1 Liberação e coleta dos exsudatos
Neste experimento cultivaram-se plantas de alface (“Elisabeth”), chicória (“Barbarela
Gigante”) e rúcula (“Lisa Mariana Gigante”), sendo que as duas últimas serviram como base
para comprovar se havia diferenças significativas entre os exsudatos das três espécies.
A solução nutritiva foi preparada a partir das soluções estoque a seguir, armazenadas
em geladeira a 5°C:
Solução A: Ca(NO3)2.4H2O ................... 270,0 g
NH4NO3............................... 33,8 g
Solução B: KCl....................................... 18,6 g
K2SO4................................... 44,0 g
KNO3.................................... 24,6 g
Solução C: Mg(NO3)2.6H2O................... 142,4 g
Solução D: KH2PO4................................ 17,6 g
15
Solução E: MnCl2.4H2O......................... 2,34 g
H3BO3.................................. 2,04 g
ZnSO4.7H2O......................... 0,88 g
CuSO4.5H2O........................ 0,20 g
Na2MoO4.2H2O.................... 0,26 g
Cada uma das soluções de A a E teve seu volume completado para 1L com água
destilada.
A solução nutritiva foi preparada pela adição de 3,3 mL da solução A; 2,3 mL da
solução B; 1,4 mL da solução C; 4,0 mL da solução D e 0,75 mL da solução E, a 1L de água
destilada. Essa solução foi transferida para dois frascos de Erlenmeyer de 500 mL; um deles
recebeu 7g de ágar, para ser posteriormente vertido em placas de Petri para pré-germinação
das sementes, e o outro foi colocado nos sistemas gnotobióticos para desenvolvimento das
plântulas, sendo ambos esterilizados.
A desinfecção superficial das sementes foi feita com uma solução de água sanitária na
proporção de 1:3 (água sanitária:água destilada), onde as sementes foram colocadas e agitadas
por 5 minutos.
As plântulas foram cultivadas no sistema gnotobiótico descrito. Para isso o conjunto
todo foi esterilizado, recebendo uma alíquota (3mL) da solução nutritiva também esterilizada.
As sementes que sofreram desinfecção superficial como descrito anteriormente foram pré-
germinadas em placas de Petri contendo a mesma solução nutritiva adicionada ao sistema
gnotobiótico, no entanto com adição de ágar, até o início da emissão da radícula. Foram
posteriormente colocadas no interior do sistema, em câmara de fluxo laminar, e foi mantido
com adição água esterilizada, de modo que os exsudatos não fossem decompostos por
microrganismos.
Aos 7 e 21 dias após emergência da radícula, os exsudatos foram coletados e
analisados quanto a seu teor total em açúcares e proteínas. Para possibilitar as duas coletas –
uma vez que o experimento é destrutivo – prepararam-se sistemas em dobro, de modo a
permitir que metade fosse coletada na primeira semana e a outra metade, no final do
experimento (21 dias), mantendo três repetições de cada tratamento, nas duas coletas, para
cada componente do exsudato a ser analisado (açúcares e proteínas).
16
3.2.2 Identificação e quantificação de carboidratos
As quantidades dos principais açúcares presentes nos exsudatos foram avaliadas pelo
uso de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE, ou, na sigla em inglês, mais
conhecida, HPLC).
As amostras foram passadas por filtros de membrana de porosidade 0,33µm sendo
então imediatamente analisadas. Utilizou-se um detector amperométrico pulsado, coluna de
troca aniônica CarboPac PA 1 de 4x25 mm e pré coluna CarboPac PA1 de 4x50 mm, ambas
da marca Dionex, loop de 20 µL e sistema de injeção automático. Como eluente empregou-se
água ultrapura 18,2Ω, na vazão de 1 mL min-1
. Apenas para separação da glicose, sacarose e
maltose usou-se como eluente uma solução de NaOH 200 mmol L-1
. (HORWITZ, 2002;
ROGERS et al, 1999).
Assim, os carboidratos encontrados nos exsudatos de alface, chicória e rúcula puderam
ser analisados e comparados pelos cromatogramas obtidos, pela comparação dos tempos de
retenção dos açúcares dos exsudatos com os açúcares dos padrões previamente preparados.
A concentração de cada carboidrato foi calculada pela área do pico usando como
padrões soluções de mistura de D(-)arabinose, D(+)galactose, D(+)glicose, sacarose, D(-)
frutose, D(+)xilose, D(+)manose e maltose.
3.2.3 Análise do teor de proteínas
A análise de proteínas totais foi realizada pelo uso de espectrofotômetro, pelo método
proposto pela Embrapa (GUEDES et al., 2007), uma adaptação do método de Lowry às
condições de análise.
Assim, para a análise de proteínas nos exsudatos coletados adicionou-se uma alíquota
de 100 µL de cada amostra homogeneizada a tubos de ensaio contendo 400 µL de água
destilada esterilizada e 500 µL de NaOH 1 mol L-1
. Os tubos foram então agitados em vórtex
e aquecidos a 100°C durante 5 minutos.
Passado esse período adicionaram-se a cada tubo 2,5 mL do reagente de Lowry, que
contém a mistura dos seguintes reagentes nas proporções descritas a seguir: 50 mL de solução
de carbonato de sódio (50g de Na2CO3 em 1L de água), 1 mL de solução de tartarato de sódio
e potássio (20g de KNaC4H406.4H2O em 1L de água) e 1 mL de solução de sulfato de cobre
(10g de CuSO4.5H2O em 1L de água). Os tubos foram novamente agitados e incubados no
escuro por um período de 10 minutos.
17
A seguir adicionaram-se 500 µL do reagente de Folin-Ciocalteau 1M diluído na
proporção de 1:2 (reagente:água destilada), e as amostras foram novamente incubadas no
escuro por um período de 30 minutos.
Após esses procedimentos, as amostras foram submetidas à avaliação pela leitura da
absorbância em espectrofotômetro, a um comprimento de onda de 750 nm.
Para calibrar o aparelho foi utilizada como branco uma amostra da solução nutritiva
utilizada para suportar o crescimento das plântulas, submetida ao mesmo tratamento descrito.
Para determinação da concentração das proteínas, usou-se uma curva padrão obtida
pelos valores de absorbância de soluções submetidas ao mesmo tratamento descrito, contendo
a proteína albumina bovina (BSA), nas seguintes concentrações (em µg mL-1
): 7,5; 15; 22,5;
30; 45; 60; 75; 90; 120 e 150.
3.3 Experimento de Utilização, Pelos Isolados, dos Açúcares Contidos nos Exsudatos
Neste experimento, foram selecionados os isolados de Pseudomonas sp. sobre os quais
havia informações de serem favorecidos em rizosfera de alface, rúcula ou chicória (COELHO
et al., 2007; CIPRIANO, 2009).
Esses isolados pertencem à coleção de microrganismos do Laboratório de
Microbiologia do Solo do Instituto Agronômico (Tabela 1).
Prepararam-se meios de cultura aos quais foram adicionados os principais açúcares
detectados, no experimento anterior, nos exsudatos radiculares de alface, chicória e rúcula.
Os meios de cultura utilizados foram o meio B de King (King et al., 1954) e um meio
mineral mínimo (LARPENT & LARPENT-GOURGAUD, 1975), descritos a seguir.
18
Tabela 1 - Origem dos isolados de Pseudomonas utilizados nos experimentos
Isolado Origem
LP10 alface
LP12 alface
LP13 alface
LP16 rúcula
LP17 alface
LP22 chicória
LP25 alface
LP28 alface
LP44 alface
LP47 rúcula
Ps852c alface
Ps864c alface
Ps866b alface
Ps871b alface
Meio B de King:
Proteose-peptona............................................. 20,0 g
Glicerol............................................................ 10,0 g
K2HPO4........................................................... 1,5 g
MgSO4............................................................. 1,5 g
Ágar................................................................. 18,0 g
Água destilada................................................. 1000 mL
Meio mineral mínimo:
K2HPO4.............................................................. 3,0 g
Na2HPO4............................................................ 6,0 g
NaCl................................................................... 5,0 g
NH4Cl................................................................ 2,0 g
MgSO4............................................................... 0,1 g
19
Açúcar*.............................................................. 8,0 g
Ágar................................................................... 15,0 g
Água destilada................................................... 1000 mL
*Obs: Os açúcares adicionados foram os encontrados no experimento anterior, separadamente, em diferentes
frascos.
Tanto o meio B de King como o meio mineral mínimo foram preparados com a adição
dos açúcares na concentração de 8 g L-1
, que é a concentração de açúcar recomendada na
literatura consultada, e no dobro da concentração em que ele foi encontrado nos exsudatos.
Os açúcares e suas concentrações foram os seguintes: 2 mg L-1
para a arabinose, 3 mg L-1
para
a glicose e 5 mg L-1
para a frutose.
Assim, os isolados foram repicados para placas de Petri contendo os meios de cultura
preparados como descrito, para avaliação de utilização de cada açúcar. O meio B de King foi
utilizado apenas como um controle do crescimento dos isolados.
3.4 Experimento de Avaliação de Colonização das Raízes pelos Isolados
Os isolados (Tabela 1) foram repicados a partir das culturas-estoque mantidas em meio
B de KING et al. (1954), cobertas com óleo mineral, a 5°C, e usados para preparo de
suspensões. Assim, transferiram-se duas “alçadas” de cada isolado cultivado em meio B de
King, em tubo inclinado, para frascos de Erlenmeyer com volume de 25 mL contendo 18 mL
de solução de MgSO4 a 0,01 mol L-1
, sendo agitados em agitador mecânico por 30 minutos.
As sementes foram pré germinadas em placas de Petri contendo a mesma solução
nutritiva adicionada ao sistema gnotobiótico, no entanto com adição de agar, até o início da
emergência da radícula. Assim, 15 sementes pré-germinadas de cada espécie vegetal (alface,
chicória e rúcula) foram imersas em frascos de Erlenmeyer contendo as suspensões dos 14
isolados separadamente, sendo ali mantidas por cerca de 30 minutos.
Decorrido esse tempo as sementes foram transferidas para o sistema gnotobiótico,
cada um recebendo 5 sementes que haviam sido imersas nas suspensões dos diferentes
isolados. Foram montados 3 tubos para cada sistema planta-isolado, ou seja, 2 para avaliação
visual da colonização, medição das raízes e para obtenção da massa de matéria fresca, e um
para plaqueamento das raízes. Foram colocados em incubadora (BOD) com fotoperíodo de 12
horas a 26+2°C, por um período de 10 dias.
20
Após dez dias, as plântulas foram analisadas quanto à colonização, pelo plaqueamento
das raízes e pela análise visual dos sistemas gnotobióticos. Avaliou-se a colonização pela
coleta das plântulas, separação asséptica das raízes e posterior plaqueamento em meio B de
King. Nas placas com raízes colonizadas deveria haver crescimento bacteriano.
O número de unidades formadoras de colônias (UFCs) nas suspensões das bactérias
inoculadas foi estimado. A partir das suspensões bacterianas usadas na bacterização das
sementes, prepararam-se diluições seriadas, em solução de MgSO4 a 0,01 mol L-1
.
Posteriormente, procedeu-se o plaqueamento de 0,1 mL de algumas diluições em meio B de
King, incubação a 28°C por 24 horas e contagem do número de UFCs/mL. As plântulas
também foram avaliadas quanto ao comprimento e massa de matéria seca das raízes.
3.5 Análise de Variância
Os resultados da composição dos exsudatos em açúcares e proteínas foram submetidos
ao cálculo de média e desvio padrão.
Os resultados obtidos da massa de matéria seca das plantas que receberam os
diferentes isolados foram submetidos à análise de variância e posteriormente ao teste de Scott-
Knott ao nível de 5%.
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Construção do Sistema Gnotobiótico
O silicone e o algodão de vedação fecharam muito bem o sistema, de forma que pôde
ser esterilizado e mantido nessa condição durante todo o experimento. No entanto, o sistema
tem uma limitação de tempo, para as condições dos experimentos realizados, em torno de 21
dias, e uma evaporação de água que pôde ser solucionada com adição de água destilada e
esterilizada.
O sistema foi construído de modo a ter a vantagem da ausência de microrganismos,
impedindo a decomposição dos exsudatos, pois os microrganismos podem agir como drenos
(BOWEN & ROVIRA, 1976; VAN HEES et al., 2002) ou fontes (RÓZYCKI, 1985; WELCH
et al., 2002) dos compostos orgânicos liberados, ou podem ainda estimular as raízes a
21
aumentar sua exsudação (MEHARG & KILLHAM, 1991, 1995). Assim, para o objetivo
proposto, a ausência de microrganismos foi fundamental.
Este sistema, em especial, tem a vantagem de coletar os exsudatos em meio líquido,
visto que, segundo NEUMANN & ROMHELD (2001), quando se usam meios sólidos para
estudar exsudatos radiculares, ocorrem interações – adsorção dos exsudatos ao substrato –, o
que pode ser um problema, principalmente na quantificação de seus componentes. Este
método, por sua vez, é simples e reprodutível, pode ser feito em grande escala, e foi criado
para que os exsudatos fossem liberados em solução nutritiva, facilitando a análise, pois não
foi necessária a lavagem de substrato para coleta dos exsudatos.
CASPERSEN et al. (2004) também construíram um sistema gnotobiótico para estudar
exsudação de carbono dissolvido (COD) por alface, destacando como principal problema a
perda de água do sistema por evaporação da solução nutritiva, o que afetaria a concentração
de compostos orgânicos e inorgânicos na solução nutritiva. No entanto também resolveram o
problema pela substituição ou adição de solução nutritiva.
Em dois diferentes sistemas gnotobióticos montados (CASPERSEN et al., 2004;
SANDNES et al., 2005), percebeu-se que o pH da solução nutritiva diminui com o passar do
tempo (até 21 dias). CASPERSEN et al. (2004) ainda alertam que as quantidades de carbono
orgânico dissolvido encontradas podem ter sido subestimadas devido à água aderida ao
sistema radicular. No entanto, seus resultados condizem com outros encontrados na literatura
(HAGGQUIST et al., 1984; DOUSSET et al., 2001 apud CASPERSEN et al., 2004). Além
disso, segundo JONES & DARRAH (1992; 1993a, b), ocorre um equilíbrio de concentração
de compostos orgânicos entre a solução e a raiz, em um volume finito de solução nutritiva
axênica, devido à absorção radicular de compostos orgânicos de baixo peso molecular, como
açúcares e aminoácidos. Portanto, na solução nutritiva ao redor das raízes, a concentração de
compostos que são liberados e reabsorvidos pelas raízes pode refletir a quantidade real
liberada no momento da amostragem.
4.2 Composição de Açúcares dos Exsudatos
Pela análise dos exsudatos no HPLC, detectou-se a presença de uma grande variedade
de açúcares em diferentes concentrações. Foram identificados apenas aqueles que possuíam
padrões já utilizados no laboratório, ou seja, arabinose, galactose, xilose, manose, frutose e
uma provável mistura dos açúcares glicose, sacarose e maltose. Estes três últimos
apresentaram um tempo de retenção muito próximo, sendo difícil separá-los. No entanto, com
22
a realização de um teste utilizando como eluente uma solução de NaOH 200 mM, apenas com
esses três açúcares, constatou-se que, quando presente, a quantidade de sacarose era
desprezível, e a presença de maltose não pôde ser confirmada, não podendo também ser
desprezada. Por isso, os dados referem-se à quantidade de glicose somada à maltose
(glicose+maltose). Os açúcares presentes em maiores quantidades foram a arabinose, a
glicose+maltose e a frutose. Os demais açúcares encontrados, mas em quantidades muito
baixas foram a galactose, a xilose, a manose e a sacarose.
Pode-se perceber que houve diferenças nas exsudações dos açúcares entre as plantas e
em cada planta nos diferentes períodos de amostragem, como pode ser observado na figura 2.
De maneira geral, observa-se que a exsudação de arabinose aos 7 dias foi maior do que
aos 21, para as três espécies de plantas. Comparando-se a exsudação aos sete dias entre as
três plantas, nota-se que a rúcula exsudou esse açúcar em concentração significativamente
maior do que as outras duas, que não diferiram entre si. Aos 21 dias, a alface exsudou menos
e a rúcula, mais, tendo as três diferido entre si.
Para a mistura glicose + maltose, dentro de cada espécie vegetal, a exsudação foi
também maior aos sete dias que aos 21, para todas as espécies. Aos sete dias, a exsudação da
chicória foi significativamente menor do que a das outras duas plantas, que não diferiram
entre si. Já aos 21 dias todas as plantas diferiram entre si, vindo em ordem decrescente:
rúcula, alface e chicória.
Quanto à frutose, sua presença nos exsudatos de alface e chicória foi maior, dentro de
cada espécie, aos sete que aos 21 dias, enquanto que na rúcula não se observou nenhuma
diferença. Comparando-se as plantas entre si, aos sete dias a exsudação não diferiu, mas aos
21 dias foi significativamente maior na rúcula, depois na alface e, finalmente, na chicória.
23
Figura 2 - Concentração de arabinose, glicose+maltose e frutose em exsudatos de
alface, rúcula e chicória aos sete e vinte e um dias após emergência da radícula, em condições
gnotobióticas. Cada valor é a média de 3 repetições. Os dados foram expressos em µg do
açúcar por mg de massa de matéria seca da planta.
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
Arabinose
Co
nce
ntr
ação
(µg.
mg-1
)
Arabinose
Alface 7 dias
Alface 21 dias
Rúcula 7 dias
Rúcula 21 dias
Chicória 7 dias
Chicória 21 dias
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
Glicose+ Maltose
Co
nce
ntr
ação
(µg.
mg-1
)
Glicose + Maltose
Alface 7 dias
Alface 21 dias
Rúcula 7 dias
Rúcula 21 dias
Chicória 7 dias
Chicória 21 dias
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
Frutose
Co
nce
ntr
ação
(µg.
mg-1
)
Frutose
Alface 7 dias
Alface 21 dias
Rúcula 7 dias
Rúcula 21 dias
Chicória 7 dias
Chicória 21 dias
24
Além disso, a chicória diferenciou-se por ser a única a exsudar sacarose em
quantidades traço na avaliação feita aos sete dias, enquanto que xilose e manose e a galactose
estavam presentes em todas as plantas, também em quantidades traço. A rúcula, diferenciou-
se por ser a única a exsudar galactose em quantidades traço, aos 21 dias, enquanto nenhuma
das plantas exsudou sacarose, xilose e manose neste período (dados não mostrados).
De maneira geral, a glicose+maltose e a arabinose tiveram exsudações estatisticamente
diferentes nas plantas na comparação entre os dois períodos amostrados. Além disso, o açúcar
presente em maiores concentrações em todas as plantas foi a frutose. Estes dados concordam,
em parte, com o trabalho de KAMILOVA et al. (2006), que também encontraram a frutose
como o principal constituinte dos exsudatos de tomate, pepino e pimenta, além da
glicose+maltose, embora em diferentes quantidades entre as plantas, como no presente
trabalho, e como foi visto também por LUGTENBERG et al. (1999).
Todavia, KAMILOVA et al. (2006) encontraram diferentes concentrações dos
mesmos açúcares, nas diferentes culturas, assim como nos diferentes períodos, sendo que a
quantidade total de açúcares aumentou com o passar do tempo (14 para 21 dias), o que difere
dos resultados aqui apresentados, pois quando houve diferenças entre os períodos amostrados,
a maior exsudação ocorreu sempre aos 7 dias.
Essa alteração na concentração de substâncias componentes dos exsudatos vegetais
também foi detectada por GRAYSTON et al. (1996), que observou uma mudança da
composição de ácidos orgânicos encontrados nos exsudatos de árvores, assim como um
aumento do carbono orgânico dissolvido, com o passar do tempo, comprovando o papel do
estádio de desenvolvimento e da biomassa da muda nos aspectos quantitativo e qualitativo da
exsudação radicular.
Assim, tanto a composição quanto a concentração de açúcares exsudados variou de
acordo com a espécie e com a idade da planta, e essas diferenças devem influenciar a
composição da microbiota rizosférica e a colonização radicular ao longo do desenvolvimento
da planta, como observado por LUGTENBERG et al. (1999), em plantas de tomate, e por
BAUDOIN et al. (2003), que encontraram diferentes estruturas das comunidades bacterianas,
quantitativa e qualitativamente, de acordo com o estádio de desenvolvimento da planta de
milho e com a região da raiz. MALONEY et al. (1997) obteve resultados semelhantes ao
estudar as diferentes comunidades presentes em diferentes porções das raízes de plantas de
tomate e alface, encontrando também diferenças na composição e quantidade de exsudatos
liberados pelas diferentes plantas.
25
Sabe-se, por exemplo, que as espécies fluorescentes de Pseudomonas são favorecidas
em rizosfera de alface em comparação com as outras duas espécies (rúcula e chicória)
(COELHO et al., 2007). Sabe-se também, pelo amplo estudo realizado por STANIER et al.
(1966), que a maioria das espécies fluorescentes de Pseudomonas sp. são capazes de utilizar a
glicose e a frutose como única fonte de carbono e energia, mas não possuem a mesma
capacidade com relação aos outros açúcares estudados (arabinose, maltose, sacarose, xilose e
manose). Neste mesmo estudo, por exemplo, dos 274 isolados estudados, 99% usaram glicose
e 91% utilizaram frutose, enquanto nenhum utilizou a arabinose e apenas 1% utilizou a
maltose como única fonte de carbono e energia.
Dessa forma, os açúcares estudados presentes nos exsudatos de alface em maior
concentração parecem não serem os únicos responsáveis pela aparente “preferência” das
bactérias do grupo fluorescente do gênero Pseudomonas pela rizosfera de alface, conforme
observaram COELHO et al. (2007). De fato, LUGTENBERG (1999) concluiu que a
habilidade em usar os açúcares exsudados não desempenha um papel tão importante na
colonização radicular, concluindo que outros fatores parecem influenciar a colonização, como
os ácidos orgânicos e polímeros.
Adicionalmente, KAMILOVA et al. (2006) mostraram que os exsudatos de tomate,
pepino e pimenta continham muito mais ácidos orgânicos que açúcares, e que o ácido cítrico
predomina completamente sobre os outros encontrados, sendo a maior fonte de carbono
encontrada nos exsudatos. No entanto não se sabe se essa alta concentração de ácidos é um
fator importante na rápida colonização radicular inicial, necessária para o estabelecimento do
isolado. Essa possível importância não foi avaliada neste trabalho.
4.3 Concentração de Proteínas dos Exsudatos
Os valores médios da concentração de proteínas encontrados nos exsudatos de alface,
chicória e rúcula, nos diferentes períodos de coleta, podem ser vistos na figura 3. Os dados
foram transformados de mg/mL para µg/mg, devido à massa de matéria seca das plantas.
26
Figura 3 - Valores médios do conteúdo de proteína nos exsudatos de alface, chicória e rúcula,
aos 7 e 21 dias de coleta. Dados expressos em µg de proteínas por mg de massa de matéria
seca da planta.
Não houve diferenças significativas no teor de proteínas presentes no exsudato entre
os diferentes períodos em cada planta, e também entre as plantas. Não foi objetivo deste
trabalho identificar as proteínas exsudadas e, portanto, não se conhece a composição de
proteínas e de aminoácidos. Podem ser proteínas diferentes, que influenciariam de diversas
maneiras a microbiota que se utiliza dos exsudatos. No entanto, se se considerar apenas a
quantidade total de proteínas, não foi possível detectar diferenças entre as exsudações das três
espécies vegetais que pudessem explicar diferenças de colonização.
Não se encontraram dados na literatura acerca da composição de proteínas dos
exsudatos radiculares. No entanto alguns pesquisadores (ROVIRA, 1969; SMITH, 1970)
citam sua composição em aminoácidos. Segundo esses autores, os aminoácidos juntamente
com os açúcares e ácidos orgânicos compreendem a maior parte dos exsudatos radiculares,
enquanto as proteínas e mucilagem compreendem a menor parte. As proteínas geralmente são
exsudadas juntamente com pequenas moléculas, como sinalizadores, ou seja, auxiliando na
comunicação entre raízes, entre raiz e microrganismos ou ainda entre microrganismos
(WALKER et al., 2003).
0
5
10
15
20
25
30
35
Co
nce
ntr
ação
(µg.
mg-1
)
Proteína
Proteína
Alface 7 dias
Alface 21 dias
Rúcula 7 dias
Rúcula 21 dias
Chicória 7 dias
Chicória 21 dias
27
4.4 Utilização, pelos Isolados Bacterianos, dos Açúcares Contidos nos Exsudatos
Pode-se observar pela tabela 3 que todos os isolados cresceram no meio B de King
(KING et al., 1954), um meio próprio para evidenciação do crescimento de Pseudomonas do
grupo fluorescente, pela emissão de fluorescência pelos isolados sob luz com comprimento de
onda próximo ao ultravioleta. O meio B é de composição complexa e tem outras substâncias
que podem fornecer energia às bactérias. Já no meio mínimo, os açúcares são a única forma
que os microrganismos têm de obter energia. No meio B, dada sua composição, outras
substâncias podem ter concorrido para permitir o crescimento das bactérias, não apenas o
açúcar, como, por exemplo, um eventual produto da decomposição da proteose peptona, que
serve como fonte principalmente de aminoácidos e nitrogênio, mas também como fonte de
carbono, enxofre, vitaminas e elementos traço.
Como houve crescimento de todos os isolados, em todas as concentrações de açúcares
no meio B, mas não no meio mínimo, considera-se que este último foi o meio de cultura
adequado para diferenciar a eventual utilização de açúcares pelas bactérias. No meio mineral
mínimo (M) com adição dos açúcares arabinose, glicose e frutose em alta concentração, ou
seja, 8 g L-1
(A8, G8 e F8), a maioria dos isolados cresceu, demonstrando a utilização dos
açúcares, principalmente da glicose (Tabela 3).
No entanto, no meio mineral mínimo com adição dos açúcares arabinose, glicose e
frutose nas concentrações encontradas nos exsudatos, ou seja, 2 mg L-1
, 3 mg L-1
e 5 mg L-1
,
respectivamente (A2, G3 e F5), nenhum dos isolados cresceu, mostrando que, pelo menos
com tais concentrações, nenhum deles utiliza esses açúcares como única fonte de carbono e
energia.
Já na concentração mais alta, 6 dos 14 isolados (LP16, LP17, LP25, LP28, LP44 e
Ps871b) utilizaram a arabinose como única fonte de energia, mas não nas concentrações
encontradas nos exsudatos; apenas 1 isolado não usou a frutose (Ps852c) e todos os isolados
usaram a glicose, mas novamente não nas concentrações utilizadas nos exsudatos.
Deve-se considerar que a planta está liberando uma grande variedade de compostos
orgânicos (BOWEN & ROVIRA, 1987; GRAYSTON et al., 1998), e, portanto, que as
bactérias irão colonizar a raiz pela utilização de vários compostos dos exsudatos mesmo que
as concentrações de açúcares encontradas nos exsudatos analisados neste trabalho sejam
consideradas baixas. A glicose foi o único açúcar utilizado, no meio mínimo, por todos os
isolados – seguida pela frutose, que apenas um isolado não utilizou. Como o crescimento
ocorreu no meio mínimo, pode-se definir a utilização da glicose realmente como fonte de
28
energia. Observou-se que, de maneira geral, este foi o segundo açúcar liberado em maiores
concentrações pelas plantas, ficando atrás apenas da frutose. Bioquimicamente, é o açúcar de
mais fácil decomposição, que pode ser utilizado pela maioria das bactérias como única fonte
de carbono e energia (STANIER et al., 1966).
Tabela 3 - Utilização, pelos isolados bacterianos, dos açúcares arabinose (A), glicose (G) e
frutose (F) contidos nos exsudatos e em concentrações adequadas.
K M
Isolados A2 A8 F5 F8 G3 G8 A2 A8 F5 F8 G3 G8
LP10 + + + + + + - - - + - +
LP12 + + + + + + - - - + - +
LP13 + + + + + + - - - + - +
LP16 + + + + + + - + - + - +
LP17 + + + + + + - + - + - +
LP22 + + + + + + - - - + - +
LP25 + + + + + + - + - + - +
LP28 + + + + + + - + - + - +
LP44 + + + + + + - + - + - +
LP47 + + + + + + - - - + - +
Ps852c + + + + + + - - - - - +
Ps864c + + + + + + - - - + - +
Ps866b + + + + + + - - - + - +
Ps871b + + + + + + - + - + - +
Obs.: K= meio B de King; M=meio mineral mínimo; A2=arabinose 2 mg/L; G3=glicose 3 mg/L; F5=frutose 5 mg/L; A8=arabinose 8g/L; G8=glicose 8g/L; F8=frutose 8g/L.
Crescimento simbolizado por + e não-crescimento, por - .
Nos registros de crescimento dos isolados no meio mínimo observa-se que houve
confirmação do que foi observado por GRAYSTON et al. (1998). Os autores relataram que
diferentes comunidades, de diferentes rizosferas, têm padrões característicos de utilização das
fontes de carbono. Isso leva ao fato de que diferentes plantas devem possuir diferentes
29
comunidades rizosféricas, tanto quanto ao número de microrganismos, quanto à presença das
populações. Neste trabalho, com Pseudomonas, observou-se que os isolados utilizaram todas
as fontes de carbono adicionadas, mas houve diferenças na utilização entre os isolados
estudados.
A utilização diferencial de fontes de carbono entre as culturas sugere que a
disponibilidade de variadas fontes de carbono nas rizosferas pode definir a proliferação de
comunidades particulares de microrganismos (GRAYSTON et al., 1998), conforme também
observado por COELHO et al. (2007). Nesse último trabalho sugeriu-se que a diversidade de
microrganismos encontrada nas diferentes espécies de plantas – entre as quais se incluíam as
espécies estudadas neste trabalho – poderia ser explicada pela variação de compostos de
carbono exsudados pelas plantas.
Neste trabalho, os isolados se comportaram de maneira diferente: seis deles foram
capazes de utilizar os três açúcares, sete utilizaram glicose e frutose mas não arabinose e
apenas um usou somente a glicose como única fonte de carbono e energia. Assim, devem
colonizar diferentes rizosferas, que os beneficiem com a exsudação dos compostos
preferencialmente utilizados. Os isolados que conseguem crescer na presença de maior
número de açúcares têm vantagem competitiva na rizosfera em comparação com outros
isolados que utilizam uma gama menor de açúcares.
Sendo assim, a estrutura da comunidade seria característica de cada ambiente
rizosférico. MALONEY et al. (1997), estudando a rizosfera de alface e tomate, verificaram
que dois importantes fatores que influenciam as populações bacterianas e a estrutura das
comunidades rizosféricas são: as interações competitivas entre os microrganismos e os
aspectos fisiológicos com respeito à afinidade por substratos. Assim, o crescimento de
diferentes populações em determinadas regiões da raiz dependeria das quantidades de carbono
liberados por essas regiões, característica que varia espacialmente na rizosfera e entre as
plantas, e da forma como os microrganismos utilizam essas fontes de carbono.
Utilizando métodos mais apurados como os moleculares, utilizando primers
específicos, BERG & SMALLA (2009), em sua revisão, relataram que as espécies de plantas
e suas posições filogenéticas podem influenciar na composição da comunidade rizosférica.
Por exemplo, espécies de gramíneas monocotiledôneas mostraram alta similaridade em suas
comunidades rizosféricas, como demonstrado também em outros estudos citados.
Assim existem muitos estudos que visam determinar a estrutura de comunidades
rizosféricas de diferentes plantas e o porquê da variação ou não, e têm apontado para fatores
30
como esses – espécie da planta e zona da raiz, compostos exsudados – ou ainda o tipo de solo,
além de alguns outros fatores (RIDDER-DUINE et al., 2005; MARSCHNER et al., 2001).
4.5 Colonização das Raízes pelos Isolados
Pela análise visual dos sistemas gnotobióticos contendo as plântulas de alface, chicória
e rúcula, cujas sementes haviam sido colocadas em suspensões de bactérias, foi possível
observar a colonização de todas as raízes, ou seja, em todos os casos havia uma fina película
branca translúcida ao redor das raízes. Apenas os controles, ou seja, as plantas que não
receberam o inóculo não apresentaram película e a solução nutritiva se encontrava totalmente
transparente.
Pelo plaqueamento das raízes também se constatou a colonização de todas as raízes,
como pode ser exemplificado pela figura 4. Sob luz com comprimento de onda visível,
observa-se a área imediatamente ao redor de cada raiz, totalmente colonizada. Sob luz com
comprimento de onda próximo ao ultravioleta essas colônias apresentaram-se fluorescentes,
em todos os casos, já que se tratava de espécies fluorescentes do gênero Pseudomonas.
O teste de observação da colonização no sistema gnotobiótico e o teste de
plaqueamento das raízes em meio B têm uma característica em comum: nos dois casos as
bactérias estavam na presença de exsudatos radiculares. De certa forma, a colonização de
todas as raízes por todos os isolados mostra que o ambiente tinha condições ideais de
temperatura, luminosidade, entre outras características, pois o ambiente era controlado. Além
disso, possuía compostos usados como fontes de energia pelos isolados, para crescimento e
consequente colonização de toda a raiz, vindos exclusivamente dos exsudatos radiculares, ou
seja, a composição dos exsudatos das três espécies de plantas foi satisfatória para manter o
crescimento dos isolados.
Assim, embora a composição observada dos exsudatos não seja idêntica para as três
plantas estudadas, os isolados puderam se beneficiar de todas, utilizando os exsudatos
liberados para seu crescimento.
Também há o fato de que os isolados vieram de diferentes plantas: 11 isolados de
alface, 2 de rúcula e 1 de chicória. No entanto, tiveram sucesso em colonizar todas as raízes,
mostrando que não são específicas das espécies de plantas de onde foram obtidos, como
mostram também os resultados obtidos por SOTTERO et al. (2006), em que isolados obtidos
de plantas variadas foram benéficas em alface, embora essa especificidade exista em alguns
casos, como mostram os trabalhos de CHANWAY et al. (1988) e SICILIANO et al. (1998).
31
Figura 4 - Raízes de alface colonizadas ou não (controle) por isolado de Pseudomonas. a. Sob
luz com comprimento de onda próximo ao ultravioleta, onde se observa a emissão de
fluorescência; b. Sob luz com comprimento de onda visível; neste caso pode-se ver com mais
detalhe as raízes e as colônias ao redor; c. Controle, raízes não colonizadas.
32
No entanto, sabe-se também que as bactérias do gênero Pseudomonas são conhecidas
por estarem presentes em ambientes variados, podendo se utilizar de um amplo espectro de
compostos orgânicos, além de poderem se desenvolver em meio com apenas um composto
orgânico como fonte de carbono e energia (STANIER et al., 1966; BUCHANAN &
GIBBONS, 1974).As plantas avaliadas quanto à presença de uma fina película ao redor das
raízes, como explicado anteriormente, também foram secas em estufa, de onde se obteve a
massa de matéria seca total, cujas médias podem ser vistas na tabela 4.
Em alface e rúcula observa-se que não houve diferença significativa entre os
tratamentos, ou seja, a massa de matéria seca alcançada por estas plantas foi semelhante,
independente do isolado inoculado e não diferiu do controle sem inoculação (Tabela 4).
Em chicória, no entanto, houve diferença entre os tratamentos. As plantas que
receberam os isolados LP10, LP17, LP22, LP28, LP47, Ps852c e Ps871b foram as que
apresentaram as maiores massas. Ressalta-se que entre estes isolados está o que foi isolado de
chicória (LP22). Ao mesmo grupo pertence o controle, mostrando que esses isolados não
beneficiaram as plântulas em seu crescimento. Semelhantemente, a maioria dos isolados
utilizados por SOTTERO et al. (2006) não promoveram crescimento. Há também dois grupos
intermediários, composto por quatro – LP13, LP16, Ps864c e Ps866c – e um – LP 25 –
isolados. Por fim houve dois tratamentos – LP12 e LP44 – em que as plantas praticamente não
se desenvolveram. Com exceção do primeiro grupo, que não diferiu do controle, em todos os
outros observou-se efeito deletério das bactérias sobre as plântulas. SINDHU et al. (2002)
também detectou efeito inibitório de Pseudomonas spp. na elongação de raízes de grão-de-
bico e interrupção do crescimento das plântulas. De forma semelhante, FREITAS et al (2003)
utilizou um isolado de Pseudomonas (Ps 91) em experimentos com alface, sendo que em
alguns casos este isolado comportou-se beneficamente, e em outros mostrou-se patogênico,
dependendo do substrato utilizado.
Em geral notou-se que não houve estímulo ao crescimento das plântulas pelos isolados
bacterianos. No entanto, notou-se um efeito patogênico de alguns isolados, como se sabe que
é possível ocorrer. Porém, deve-se considerar que a massa de matéria fresca foi obtida quando
as plântulas eram ainda muito jovens (10 dias), e pode ser que nesse período ainda não fosse
possível observar a promoção de crescimento. Pode acontecer, por exemplo, de ocorrer parada
de crescimento numa fase muito inicial do desenvolvimento da planta e sua retomada num
período posterior, como demonstrado por SINDHU et al. (2002). Além disso, um número
maior de repetições poderia resultar em dados mais homogêneos e em um menor coeficiente
de variação.
33
Tabela 4 - Valores médios de massa de matéria seca total (mg) de alface, chicória e rúcula
que receberam inóculo de diferentes isolados.
Isolado Espécie vegetal
Alface Chicória Rúcula
Controle 1,20 a 1,16 a 1,14 a
LP10 1,26 a 1,10 a 1,64 a
LP12 1,02 a 0,10 d 1,48 a
LP13 1,08 a 0,76 b 0,88 a
LP16 0,98 a 0,86 b 1,46 a
LP17 1,38 a 1,06 a 1,66 a
LP22 1,08 a 1,22 a 1,70 a
LP25 1,66 a 0,52 c 1,36 a
LP28 0,76 a 1,08 a 1,78 a
LP44 0,96 a 0,10 d 1,42 a
LP47 1,24 a 1,28 a 1,32 a
Ps852c 1,44 a 1,10 a 1,72 a
Ps864c 1,20 a 0,96 b 1,56 a
Ps866c 1,34 a 0,88 b 2,02 a
Ps871b 1,26 a 1,26 a 1,56 a
CV (%) 40,51 24,84 43,98
Médias seguidas de mesma letra minúsculas nas colunas não diferem entre si pelo teste de Scott-Knot ao nível
de 5%.
4.6 Considerações Finais
Dessa forma, em geral, com o sistema gnotobiótico proposto foi possível analisar a
composição dos exsudatos, pelo menos em açúcares, embora se saiba que na natureza essa
composição pode ser um pouco modificada devido à presença de microrganismos e outros
fatores, como o substrato ou a composição de nutrientes no solo (KAMILOVA et al., 2006;
GRAYSTON et al., 1996; ROVIRA, 1969).
34
A frutose, a glicose e a arabinose, nessa ordem, foram os açúcares encontrados em
maior concentração para as três espécies de plantas, resultado semelhante ao encontrado por
KAMILOVA et al. (2006) em seu trabalho, embora em concentrações frequentemente
diferentes entre as plantas e períodos de amostragem, ainda que em algumas ocasiões as
exsudações tenham sido estatisticamente semelhantes.
Todos os isolados colonizaram as raízes de alface, chicória e rúcula, independente de
serem oriundos de diferentes plantas, embora a maioria tenha sido originado de alface. Claro,
a visualização de crescimento abundante no meio de cultura deve ser principalmente resultado
do próprio meio, o B de King. No entanto, na visualização macroscópica do crescimento de
uma película ainda no interior do sistema gnotobiótico, a indicação de crescimento ocorreu
para todos os isolados. Não é possível, com os dados obtidos, concluir pela exsudação de
açúcares como o principal diferencial na colonização de raízes de alface por bactérias do
grupo fluorescente de Pseudomonas sp. em relação a chicória e rúcula.
No entanto, se se considerar a tabela 4, com os valores de matéria seca das plantas, a
coluna que apresenta os dados referentes à chicória, são os únicos em que os isolados tiverem
efeitos significativamente diferentes entre si, as bactérias provenientes de alface nem sempre
tiveram o melhor efeito na chicória; no entanto, a única bactéria obtida de chicória esteve no
grupo das maiores plântulas. Todavia, isso pode ser considerado apenas evidências, sendo
necessários mais estudos a respeito. RIDDER-DUINE et al. (2005) não encontraram uma
forte dependência entre comunidade rizosférica e a espécie da planta como também mostram
os resultados de GRAYSTON et al. (1998). Neste trabalho, quando se avaliou o crescimento
bacteriano em meios de cultura com os açúcares encontrados, houve algumas diferenças entre
os isolados. O efeito das bactérias sobre a chicória, especificamente, parece ter revelado
algumas evidências de que, ainda que não se tenham dados definitivos, estudos mais
detalhados, incluindo tanto outras substâncias na análise de exsudação como mais isolados
provenientes de cada planta, poderão trazer luz a esse aspecto. A concentração de proteínas de
maneira geral, também não apresentou diferenças. Mas também se sabe que a composição dos
exsudatos influencia diretamente a microbiota que colonizará a raiz (GRAYSTON et al.,
1998; LANDI et al, 2006). Portanto, há necessidade de aprofundar os estudos.
Seis isolados utilizaram os 3 açúcares presentes em maior quantidade (glicose, frutose
e arabinose) e 7 utilizaram os dois açúcares presentes em maior quantidade (frutose e glicose).
Ou seja, pelo menos quanto aos açúcares presentes, 13 dos 14 isolados utilizam pelo menos 2
dos 3 açúcares presentes em maiores quantidades. KAMILOVA et al. (2006) também
atestaram a utilização do ácido cítrico, a maior fonte de carbono encontrado nos exsudatos das
35
plantas avaliadas em seu trabalho (tomate, pepino e pimenta), pelos quatro isolados de
Pseudomonas selecionados por serem bons colonizadores das raízes das mesmas plantas. Esse
é um fato importante, visto que a utilização dos principais componentes exsudados seria uma
importante característica para uma colonização eficiente da rizosfera
Assim, embora os açúcares sozinhos pareçam explicar a colonização diferencial dos
isolados em algumas situações mas não em outras, podem ser um dos fatores que influencie,
visto que uma composição parecida resultou em uma colonização aparentemente semelhante.
Talvez se a composição de açúcares e proteínas apresentasse diferenças significativas entre as
plantas, a colonização fosse diferente. Pode ser, ainda, que no campo os mesmos isolados
colonizem diferentemente as mesmas plantas, devido a fatores como a presença de outros
organismos já existentes no solo, por si só um ambiente muito mais complexo
(DEVLIEGHER et al., 1995).
Embora a composição de exsudatos das plantas realmente tenha um efeito seletivo nas
bactérias que colonizam sua rizosfera, para RIDDER-DUINE et al. (2005) o que irá
determinar a colonização rizosférica, é o conjunto de bactérias competitivas que habitam o
solo não rizosférico, ou seja, as bactérias presentes no solo não rizosférico, mas que têm
capacidade de utilizar os compostos exsudados pelas plantas, tais como os açúcares,
aminoácidos e ácido orgânicos mais comuns.
Neste trabalho, os isolados colonizaram as raízes de todas as plantas, e influenciaram
na massa de matéria seca obtida. Na comparação feita entre os isolados, em alface e rúcula
todos obtiveram efeitos semelhantes, mas em chicória a influência foi diferente. Vários
isolados podem colonizar as raízes, mas os efeitos obtidos serão diferentes.
Assim, os açúcares ou proteínas sozinhos parecem não explicar a colonização
preferencial de Pseudomonas em raízes de alface, como relatado por COELHO et al. (2007),
embora esse efeito não tenha sido observado neste trabalho. Aqui, a composição parecida dos
exsudatos, parece ter favorecido uma colonização semelhante. É importante lembrar que
houve um número limitado de componentes analisados, o que pode levar a conclusões menos
fundamentadas.
36
5 CONCLUSÕES
Frutose, glicose+maltose e arabinose foram os açúcares encontrados em maiores
concentrações nos exsudatos de alface, chicória e rúcula
De maneira geral, a exsudação de açúcares foi maior no estádio inicial de
desenvolvimento, para as três plantas estudadas.
As proteínas estavam presentes em concentrações semelhantes nas diferentes plantas e
diferentes períodos.
Nenhum isolado utilizou os açúcares, em meio de cultura, nas concentrações
encontradas nos exsudatos.
As raízes de todas as plantas foram colonizadas por todos os isolados,
independentemente da planta de origem.
Os açúcares sozinhos, na quantidade e na composição em que foram avaliados, ou as
proteínas nas quantidades encontradas, não explicaram a colonização preferencial de
Pseudomonas em raízes de alface.
37
6 REFERÊNCIAS
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Seleção de bactérias antagônicas a Phytophthora parasitica em limoeiro cravo (Citrus
limonia). Summa Phytopathologica, v. 31, p. 119-124, 2005.
BARRETTI, P. B.; SOUZA, R. M; POZZA, A. A. A; POZZA, E. A.; CARVALHO, J. G;
SOUZA, J. T. Aumento da eficiência nutricional de tomateiros inoculados com bactérias
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