INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISA DA AMAZÔNIA-INPA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA, CONSERVAÇÃO E

BIOLOGIA EVOLUTIVA

CLONAGEM E EXPRESSÃO DO HORMÔNIO DE CRESCIMENTO DE

COLOSSOMA MACROPOMUM EM ESCHERICHIA COLI

SUELEN DIAS DA SILVA

Manaus, Amazonas

Julho, 2012

ii

SUELEN DIAS DA SILVA

CLONAGEM E EXPRESSÃO DO HORMÔNIO DE CRESCIMENTO DE

COLOSSOMA MACROPOMUM EM ESCHERICHIA COLI

ORIENTADOR: DR. JORGE IVAN REBELO PORTO

COORIENTADOR: DR. SPARTACO ASTOLFI FILHO

Manaus, Amazonas

Julho, 2012

Dissertação apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em

Genética, Conservação e Biologia

Evolutiva do Instituto Nacional de

Pesquisas da Amazônia como parte

dos requisitos para obtenção do

título de Mestre em Genética,

Conservação e Biologia Evolutiva.

iii

FICHA CATALOGRÁFICA

Sinopse:

O tambaqui (Colossoma macropomum), um peixe de grande valor comercial para a região

amazônica, teve seu hormônio de crescimento (tGH) clonado e expresso de forma satisfatória

em Escherichia coli. O uso deste produto biotecnológico (tGH) pode tornar-se um grande

atrativo na piscicultura nacional considerando-se a aplicabilidade já constatada em outras

espécies de peixes exóticos.

Palavras-chave: hormônio de crescimento recombinante, tambaqui, expressão heteróloga.

S 355 Silva, Suelen Dias

Clonagem e expressão do hormônio de crescimento de Colossoma macropomum

em Escherichia coli.

Dissertação (mestrado)- INPA, Manaus, 2012

Orientador: Jorge Ivan Rebelo Porto

Co-orientadora: Spartaco Astolfi Filho

Área de concentração: Genética, Conservação e Biologia Evolutiva

1. Tambaqui. 2. GH. 3. Proteina heteróloga. 4. Biotecnologia. 5. Piscicultura. I. Título.

CDD.19.ed.597.580415

iv

Dedico este trabalho a Deus, pela sua imensurável

graça e força; Aos meus pais, irmãos e sobrinhos

pelo apoio e amor incondicional.

v

AGRADECIMENTOS

Ao grande Deus, por revigorar minha fé, reacender minha esperança, fazer-me vencer

todos os obstáculos.

Aos meus pais pelo amor, incentivo e por serem os pilares da minha vida.

Aos meus irmãos e cunhados pela união, carinho, apoio e companheirismo. E aos

meus sobrinhos, João Gabriel e Ana Hadassa, por serem a luz da minha vida e a força para

vencer a cada dia. Amo vocês.

A Conceição, por desempenhar o papel de mãe e amiga, para mim e meus irmãos.

Aos meus orientadores Prof. Jorge Porto e Prof. Spartaco Astolfi pela orientação,

estímulo, conhecimentos, amizade e carinho.

“Ser mestre não é apenas lecionar. Ensinar não é só transmitir a matéria. É também

transmitir seus conhecimentos e experiências profissionais e de vida, com dedicação e

carinho. É ser instrutor e amigo, guia e companheiro.” A você Prof. Edmar Andrade pela

orientação sempre sensata e precisa, pela paciência e pelas palavras de conforto nos

momentos de quase desespero.

Ao Edson do Carmo, excelente mestre, paciente, amigo e dedicado.

“Amigo é coisa pra se guardar do lado esquerdo do peito, dentro do coração!” Eliane,

obrigada pela grande amizade e por sempre estar ao meu lado.

Ao Elson Sadala, amigo, companheiro de luta de laboratório, fins de semanas e

feriados e ainda de discussão de artigos sobre o GH.

“Verdadeiros amigos são aqueles que estão ao nosso lado quando coisas boas

acontecem. Eles torcem pela gente e se alegram com nossas vitórias.” A Mirna Myamoto,

Henriette Soares, Luciana Viana, e em especial a Anita Souza. Vocês são muito especiais, são

pessoas muito prestativas e não vacilam na hora de ajudar quem precisa, muito obrigada.

Ao grupo de biotecnologia da UFAM e ao pessoal do Laboratório de DNA e

Proteoma, que tornam o ambiente de trabalho mais agradável, pelo carinho, amizade,

preocupação e pela ótima convivência durante esse período: Erika Izumi, Bruna Lovizutto,

Paulo Henrique Saumiskat, Julio, Dina, Helber Astolfo, Vanessa, Elza, Patrícia Soares, Hugo

e Prof. Gustavo.

Ao professor Jorge Luiz Lopes Lozano e ao hospital tropical.

vi

Aos professores do PPG-GCVEv, pelos ensinamentos que contribuíram na minha

formação.

À Secretaria da Genética, em especial a Elci, Alessandra e as coordenadoras do

GCBEV, pelo apoio durante o curso.

Ao CNPq pela bolsa concedida e pelo financiamento ao projeto.

Aos amigos da turma do GCBEV.

A todos aqueles que de alguma forma me ajudaram e incentivaram.

vii

RESUMO

O hormônio do crescimento é um polipeptídio essencial para o crescimento e

desenvolvimento dos vertebrados. O tambaqui (Colossoma macropomum) é uma espécie de

peixe amplamente distribuída na bacia amazônica, considerada como promissora para a

piscicultura. Visando aplicações futuras na suplementação alimentar de peixes, este trabalho

clonou e expressou o hormônio de crescimento de tambaqui (tGH), utilizando a bactéria

Escherichia coli linhagem BL21 DE3 como hospedeira. Para expressão da proteína

heteróloga, o gene tgh sintético (611pb) foi inicialmente clonado no vetor pUC19 e

posteriormente inserido no vetor pGSM-1, construído especificamente para este trabalho,

dando origem ao plasmídeo pGSM-tGH. A indução do tGH foi obtida cultivando-se células

de E. coli/pGSM-tGH na presença do indutor IPTG (1 mM), sendo que o pico de expressão

foi observado após 4h de indução. Os clones recombinantes expressaram uma proteína de

aproximadamente 24 kDa, tamanho similar ao de outros trabalhos com GH de peixes. A

obtenção do tGH recombinante foi confirmada por eletroforese em gel de poliacrilamida

SDS-PAGE 15%. O tGH recombinante expresso em E. coli descrito nesse trabalho será

utilizado para estudos posteriores, possibilitando a sua melhor caracterização. Por fim, o tGH

recombinante deverá ser posteriormente avaliado como suplemento alimentar em ração de

peixes, com intuito de proporcionar maior valor econômico à piscicultura do tambaqui.

Palavras chave: Piscicultura, Tambaqui, Hormônio de crescimento, Escherichia coli,

proteína heteróloga.

viii

ABSTRACT

Growth hormone is a polypeptide essential for growth and development of vertebrates. The

tambaqui (Colossoma macropomum) is a widely distributed fish species in the Amazon basin,

considered as promising for farming. Aiming future applications in dietary supplementation

of fish, this work has cloned and expressed the growth hormone from tambaqui (tGH), using

the bacterium Escherichia coli strain BL21 DE3 as a host. For expression of heterologous

protein, the synthetic gene tGH (611pb) was initially cloned into pUC19 vector and

subsequently inserted into the vector PGSM-1, constructed specifically for this work, giving

rise to plasmid PGSM-TGH. Induction of HGT was obtained by cultivating cells of E. coli /

PGSM-GHT in the presence of the inducer IPTG (1 mM), where the peak of expression was

observed after 4h of induction. Recombinant clones expressed a protein of approximately 24

kDa, similar in size to other works with fish GH. The recombinant tGH was confirmed by

polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE 15%. The recombinant tGH coli described in

this work will be used in ongoing studies, allowing additional characterization. Finally, the

recombinant TGH should be further evaluated as a food supplement in the diet of fish, in

order to provide greater economic value to the fish farming of tambaqui.

Key words: Fish farming, tambaqui, growth hormone, Escherichia coli, heterologous protein

Sumário

1-Introdução Geral

1.1-Aquicultura e o potencial brasileiro................................................................ 10

1.2-Hormônio de crescimento (GH).......................................................................

1.3-Expressão heteróloga em Escherichia coli.......................................................

11

12

1-Introdução.............................................................................................................. 16

2-Material e métodos................................................................................................ 17

2.1- Linhagens celulares e síntese química do tGH.............................................. 17

2.2-Construção do plasmídeo para expressão....................................................... 18

2.3-Indução e expressão do tGH........................................................................... 18

2.4- Eletroforese em SDS-PAGE.......................................................................... 19

3-Resultados.............................................................................................................. 19

3.1- Construção do plasmídeo de expressão.......................................................... 19

3.2- Expressão do tGH recombinante em E. coli.................................................. 19

4-Discussão.............................................................................................................. 21

5-Agradecimentos..................................................................................................... 24

6-Referências Bibliográficas..................................................................................... 24

10

1-Introdução

1.1- Aquicultura e o potencial brasileiro

Aqüicultura brasileira deve se tornar cada vez mais competitiva nos mercados

internacionais, a produção continua a aumentar em escala industrial, acompanhado de uma

melhoria constante na qualidade do produto. De 2003 a 2009, a produção na atividade que era

de 278 mil toneladas, passou para 415 mil toneladas (MPA, 2012).

Existem mais de 64 espécies de organismos aquáticos cultivados no Brasil. As

espécies de peixes mais cultivadas no país variam entres as regiões, sendo que no norte do

país as espécies mais cultivadas são o tambaqui (Colossoma macropomum) e o pirarucu

(Arapaima gigas) (MPA, 2010). O tambaqui é a espécie com maior importância comercial na

pesca e na piscicultura da região amazônica e devido a isso é o peixe mais cultivado no

Estado do Amazonas, com produções oriundas de piscicultura de 3.000 e 3.500 toneladas

anuais (Santos et al., 2006). O potencial de produção do tambaqui foi estimado em 15.500

toneladas e sua produção concentra-se na Amazônia Central, que representa 91% do total

(Barthem e Goulding, 2007).

A piscicultura tem se tornado um dos mais economicamente importantes setores.

Aliado ao crescimento da piscicultura houve um desenvolvimento da Biotecnologia Aquática

com aplicações de técnicas experimentais para manipular o crescimento dos peixes, como

dietas enriquecidas com nutrientes protéicos específicos e administração de hormônios, como

o hormônio de crescimento (GH). Para acelerar a taxa de crescimento em peixes, o hormônio

do crescimento tem sido explorado pela indústria da aquicultura como um potencial agente de

aceleração do crescimento. O crescimento de peixes em menor tempo é o objetivo da indústria

da aquicultura. Numerosos estudos têm mostrado que a administração nativa ou por meio do

hormônio de crescimento recombinante de peixe tem acelerado a taxa de crescimento de

diversas espécies de peixes (Tsai et al., 1997; Venugopal e Pandian, 2002; Funkenstein et al.,

2005; Acosta et al., 2007; Funkenstein et al., 2005). Estes estudos indicam que a terapia de

hormônio de crescimento tem o potencial para ser utilizado como um agente acelerador de

crescimento em peixe.

11

1.2-Hormônio de crescimento (GH)

O hormônio do crescimento (GH) é um dos hormônios polipeptídicos secretados pela

glândula pituitária na porção anterior da hipófise dos vertebrados. É composto por 188

aminoácidos com 5 resíduos de cisteína. É liberado na corrente sanguínea, onde vai atuar a

partir da sua associação com receptores específicos (receptor do hormônio de crescimento-

GHR) presente na membrana celular de células alvo, sendo que mais de 400 ações são

iniciadas, e a maioria delas está envolvida com o crescimento (Waters et al., 2006).

O GH e seu mediador, o fator de crescimento insulínico (IGF-I), são os principais

promotores do crescimento pós-natal e têm um papel importante no metabolismo (Reginato e

Coutinho, 2001; Moriyama et al., 2006). É envolvido na regulação do crescimento somático,

desenvolvimento, apetite, osmorregulação, maturação, imunidade, manutenção de proteínas,

lipídeos, carboidratos e metabolismo mineral em peixes (Agellon et al., 1988; Zohar, 1989;

Tsai et al., 1993; Farmanfarmaian e Sun, 1999; Silverstein et al., 2000). O fígado é o principal

órgão produtor do IGF nos vertebrados e peixes (Reinecke et al., 2005).

A síntese do GH ocorre na glândula pituitária e em outros tecidos extra-pituitários,

sendo possível identificar o mRNA do GH de peixes em gônadas de truta e cérebro de

dourado (Biga et al., 2004; Li et al., 2005; Canosa et al., 2007).

Existem vários fatores envolvidos no controle da secreção de GH, dentre eles, o estado

nutricional do animal, as condições de estresse, a salinidade e a temperatura (Li et al., 2005).

O GH melhora a eficiência de conversão alimentar e estimula o transporte intestinal de

alimentos e aminoácidos, mecanismos estes que podem ser responsáveis pela melhora nos

valores de conversão alimentar (Cavari et al., 1993; Moriyama et al., 1993; Tsai et al., 1994;

Melamed et al., 2002). Vários fatores influenciam o número de receptores do GH, incluindo o

próprio hormônio, a condição nutricional e outros hormônios (Peter e Marchant, 1995).

A quantidade de GH natural é extremamente baixa e a sua disponibilidade é limitada,

por isso é difícil estabelecer alguns métodos úteis para investigar a fisiologia do crescimento

dos peixes. O GH recombinante (rGH) de peixes, tem sido demonstrado que têm a mesma

função do GH natural, e pode ser empregado em vez do GH natural para estudar a fisiologia

dos peixes (Li et al., 2003).

12

Quase todas as seqüências descritas de GH são para os peixes da Europa e dos países

ocidentais, mas pouca informação se tem para os peixes da região amazônica. No Brasil, as

espécies de characideos que tiveram o gene do GH clonado e sequenciado foram o Piaractus

mesopotamicus (Pinheiro et al., 2008) e o Colossoma macropomum (Sousa, 2009).

Eficientes métodos para produção de GHs em larga-escala têm sido desenvolvidos,

sendo a produção em sistemas de expressão heteróloga um caminho promissor. Os cDNAs

codificadores do GH de várias espécies de peixes foram clonados e expressos utilizando a

bactéria Escherichia coli (Ho et al., 1991; Tsai et al., 1993, 1995, 1997; Bai et al., 1999;

Ayson et al., 2000; Deane e Woo, 2006), as leveduras Saccharomyces cerevisiae (Jin et al.,

1999) e Pichia pastoris (Wang et al., 2003; Acosta et al., 2007; Wei et al., 2008), a

cianobactéria Agmellum quadruplicatum (Kawata et al., 1991), as células de insetos

/baculovírus TnNPV (Lin et al., 1997) e BMNPV (Ho et al., 1998) e algas (Chen et al., 2008;

Liu et al., 2008).

GHs recombinantes produzidos em grandes quantidades em E.coli têm sido aplicados

para promover o crescimento em peixes, aumentando a eficiência de conversão alimentar sem

alterar a quantidade de consumo de alimentos (Farmanfarmaian e Sun, 1999). O rGH expresso

em E. coli tem desempenhado um importante papel na pesquisa básica da fisiologia dos

peixes e suas aplicações na aqüicultura. Tsai (1995) obteve um alto nível de expressão do

cDNA do GH de Acanthopagrus latus, representado 44% a 47% das proteínas totais expressas

por este microorganismo. Promdonkoy (2004) com o GH de Pangasianodon gigas alcançou

uma expressão de 20% das proteínas totais.

1.4- Expressão heteróloga em Escherichia coli

Um dos mais comumente sistemas utilizados para produção heteróloga de proteína é a

E. coli, uma bactéria gram-negativa que tem sido extensivamente caracterizada ao longo de

várias décadas. Essa bactéria tem atraído interesse, devido a habilidade de crescer

rapidamente, atingir altas concentrações celulares, permitir o uso de substratos baratos e

possuir várias cepas com genótipo conhecido (Choi et al., 2006).

E. coli é capaz produzir proteínas em níveis tão alto chegando a representar até 50%

da proteína celular total (Buchner e Kiefhaber, 2005). O uso da E. coli para obtenção de

proteínas em quantidade suficiente para o estudo da estrutura e função da mesma ou para

13

diversas aplicações clínicas ou industriais é hoje difundido constituindo um marco na história

do conhecimento de proteínas (Nascimento et al., 2003).

Diversas pesquisas utilizam primeiramente a expressão de proteínas heteróloga em E.

coli, sendo que sistemas alternativos podem vir a serem usados quando o produto expresso

não possuir atividade biológica devido a falta de modificações pós-traducionais essenciais

para o enovelamento correto da proteína, ou quando o rendimento da proteína nativa é muito

baixo (Jonasson et al., 2002). Outras limitações que a E. coli tem em seu sistema de expressão

inclui a ausência de um sistema de secreção para uma eficiente liberação da proteína

recombinante para o meio de cultura e limitada capacidade de produzir proteínas complexas

(Duílio et al., 2004). No entanto proteínas como os interferons, interleucina, hormônio de

crescimento, estão entre as proteínas recombinantes produzidas com sucesso neste sistema

(Lee, 1996)

Modificações nos vetores e linhagens de E. coli são frequentemente feitas no sentido

de aumentar a eficiência e versatilidade do sistema original. Atualmente existem diversas

linhagens de E. coli com capacidade de expressão em altos níveis. Uma boa hospedeira para

expressão deve possuir como características principais ser deficiente na expressão de

proteases, manter a estabilidade do plasmídeo e do mRNA e conferir elementos genéticos

relevantes para o sistema de expressão (Sorensen et al., 2005). Umas das linhagens mais

comumente utilizadas é a BL21 que é uma linhagem forte, capaz de crescer vigorosamente em

meio mínimo, é deficiente em ompT e lon que são proteases interferentes da expressão.

Um promotor para expressão em E. coli deve ter três características principais para

obtenção de altos níveis de uma proteína, deve ser forte, exibir uma expressão basal mínima, e

ser induzível de uma maneira simples e de baixo custo (Makrides, 1996). A E. coli tem sido

utilizado com sucesso como hospedeira para expressar genes heterólogos sob o controle do

forte T7 ou promotor lac, numerosos hormônios de crescimentos recombinantes de peixes

foram expressos em E. coli. A expressão das proteínas são normalmente induzidas pela adição

do tiogalactopiranosídeo de isopropila (IPTG). Embora a maioria dos hormônios de

crescimento formem corpos de inclusão insolúveis quando expresso, reagentes tais como

uréia e cloridrato de guanidina podem ser usados para solubilizar as proteínas e, em seguida

redobrar-las de volta às suas formas nativas (Singh e Panda, 2005).

14

A purificação é o ultimo passo a ser realizado após a expressão e atualmente as

construções dos sistemas de expressão são feitas com o intuito de facilitar esse processo.

Entre o grande numero de sistemas existentes o mais utilizado são os que expressam a

proteínas de fusão, onde o gene da proteína alvo esta ligado a um gene de uma outra proteína

que ficara retida na fase estacionaria de uma coluna cromatográfica. Uma vantagem adicional

desses sistemas e que a fusão pode proteger a proteína de interesse do ataque de proteases

(Neiva, 2005).

As proteínas inseridas em E. coli podem ser facilmente purificadas se possuírem cauda

de histidina (His-Tag) em fusão. Isso porque existe uma grande afinidade entre a cauda e

alguns íons metálicos, como o Ni2+,

Cu2+

e Co2+,

permitindo que o produto em fusão seja

rapidamente separado de outras proteínas existentes no meio, pureza de 95% (Hengen, 1995).

Neste trabalho, o tambaqui (Colossoma macropomum), um peixe de grande valor

comercial para a região amazônica, teve seu hormônio de crescimento (tGH) clonado e

expresso de forma satisfatória em Escherichia coli. O uso deste produto biotecnológico (tGH)

pode torna-se um grande atrativo na piscicultura nacional considerando-se a aplicabilidade já

constatada em outras de espécies de peixes exóticos como demonstrado no capitulo a seguir.

15

Clonagem e expressão do hormônio de crescimento de Colossoma macropomum em

Escherichia coli *.

Silva, S.D1; Carmo, E.J.

2, Souza, A.L.

2; Pinto, E. S.

3; Andrade, E.V.

2; Astolfi-Filho, A.

2;

Porto, J.I.R4.

1 Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia, Programa de Pós-graduação em Genética

Conservação e Biologia Evolutiva, Manaus-AM, Brasil

2 Universidade Federal do Amazonas, Centro de Apoio Multidisciplinar, Manaus-AM, Brasil

3 Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Amazonas, Coari-AM, Brasil

4 Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia, Coordenação de Biodiversidade, Manaus-AM,

Brasil

* Trabalho a ser submetido ao periódico Brazilian Journal of Medical and Biological

Research

16

1-Introdução

Atualmente o Brasil produz aproximadamente 1,25 milhões de toneladas de pescado,

sendo 38% cultivados. A atividade gera um PIB pesqueiro de R$ 5 bilhões, mobiliza 800 mil

profissionais entre pescadores e aquicultores e proporciona 3,5 milhões de empregos diretos e

indiretos. O potencial brasileiro é enorme e o país pode se tornar um dos maiores produtores

mundiais de pescado, estando a aqüicultura brasileira cada vez mais competitiva no mercado

internacional. A produção tem aumentado em escala industrial, acompanhado de uma

melhoria constante na qualidade do produto (MPA, 2012).

As espécies de peixes mais cultivadas no país variam entres as regiões, sendo que no

Norte do país a espécie mais cultivada é o tambaqui (Colossoma macropomum). O potencial

de produção do tambaqui foi estimado em 15.500 toneladas e sua produção concentra-se na

Amazônia Central, que representa 91% do total (Barthem e Goulding, 2007).

O crescimento de peixes em menor tempo é o objetivo da indústria da aquicultura. O

hormônio do crescimento tem sido explorado pela indústria da aquicultura como um potencial

agente de aceleração do crescimento. Numerosos estudos têm mostrado que a administração

nativa ou por meio do hormônio de crescimento recombinante de peixe tem acelerado a taxa

de crescimento de diversas espécies de peixes (Funkenstein et al., 2005).

O hormônio do crescimento (GH) é um dos hormônios polipeptídicos secretados pela

glândula pituitária na porção anterior da hipófise dos vertebrados. Possui a massa molecular

de aproximadamente 22 kDa, em torno de 200 resíduos de aminoácidos e a presença de

resíduos de cisteína envolvidos na formação de duas pontes dissulfídicas no interior da

molécula. É liberado na corrente sanguínea, onde vai atuar a partir da sua associação com

receptores específicos (receptor do hormônio de crescimento-GHR) presentes na membrana

celular de células alvo, sendo que mais de 400 ações são iniciadas, e a maioria delas está

envolvida com o crescimento (Waters et al., 2006). O GH e seu mediador, o fator de

crescimento insulínico (IGF-I), são os principais promotores do crescimento pós-natal e têm

um papel importante no metabolismo dos vertebrados (Reginato e Coutinho, 2001; Moriyama

et al., 2006).

O GH está envolvido na regulação do crescimento somático, desenvolvimento, apetite,

osmorregulação, maturação, imunidade, manutenção de proteínas, lipídeos, carboidratos e

17

metabolismo mineral em peixes (Donaldson et al., 1979, Gill et al., 1985; Agellon et al.,

1988; Zohar, 1989; Tsai et al., 1993; Farmanfarmaian e Sun, 1999; Silverstein et al., 2000).

A importância do GH como um agente potencial de crescimento tem sido reconhecido

e a administração de GH tem mostrado acelerar a taxa de crescimento em um número de

animais, principalmente peixes (Barat et al., 1981; Agellon e Chen, 1986; Yamano et al.,

1988; Koren et al., 1989; Chiou et al., 1990; Funkenstein et al., 1991; Chang et al., 1992;

Cavari et al., 1993; McLean et al., 1993; Tang et al., 1993; Lemaire et al., 1994; Tsai et al.,

1994; Venugopal et al., 1998; Ayson et al., 2000; Anathy et al., 2001; Li et al., 2003). Assim

a clonagem, caracterização e expressão de GH de peixes tem sido objeto de muita pesquisa

durante a última década (Anathy et al., 2001; Wang et al., 2001; Venugopal et al., 2002; Chan

et al., 2003; Wang et al., 2003; Funkenstein et al., 2005; Deanne e Woo, 2006; Sciara et al.,

2006; Liu et al., 2008; Pinheiro et al., 2008; Wei et al., 2008).

GHs recombinantes (rGH) produzidos em grandes quantidades em Escherichia coli

têm sido aplicados para promover o crescimento em peixes, aumentando a eficiência de

conversão alimentar sem alterar a quantidade de consumo de alimentos (Farmanfarmaian e

Sun, 1999). O rGH expresso em E. coli tem desempenhado um importante papel na pesquisa

básica da fisiologia dos peixes e suas aplicações na aqüicultura.

Desta forma este trabalho teve como objetivo clonar e expressar o hormônio de

crescimento recombinante de tambaqui (tGHr) em E. coli com intuito de apresentar um

produto biotecnológico à piscicultura regional.

2- Material e Métodos

2.1- Linhagens celulares e síntese química do tGH

As linhagens celulares utilizadas nesse trabalho foram E.coli DH10b para

procedimentos de manipulação de genes e E. coli BL21 DE3 (Novagen) para expressão de

tGHr. O gene tgh foi otimizado para expressão em E. coli com base na seqüência de Souza

(2009) e sintetizado pela empresa GenOne. Foi construído por síntese química, de forma a

conter os códons mais utilizados pela E. coli. O gene sintetizado contém na extremidade 5’

sítios das endonucleases NdeI e EcoRI, seguido de uma região codificadora para seis resíduos

consecutivos de histidina para facilitar a purificação e detecção do tGHr, uma região

18

codificadora para uma região alvo reconhecida pela enzima enterokinase. Na extremidade 3’

possui sítios das endonucleases de restrição BamHI e NotI. O gene tgh sintético foi inserido

no vetor pUC19, a partir do qual foram realizados os procedimentos de manipulação gênica.

2.2- Construção do plasmídeo para expressão

Para que o gene tgh fosse inserido no plasmideo de expressão pGS-21a, necessitou-se

primeiramente inserir um polylinke contendo a seguinte sequência: 5’-

TATGACCATGGAATTCGGATCCAAGCTTGC-3’. O vetor pGS-21a passou a ser

chamado de pGSM-1 (Figura 1). Posteriormente, foi realizado uma digestão dupla tanto do

vetor pGSM-1, quanto do gene tgh com as enzimas de restrição EcoRI e NotI para promover a

ligação do gene ao vetor. Depois de ligado, o vetor passou a ser chamado de pGSM-tGH.

2.3- Indução e expressão do hormônio de crescimento do tambaqui recombinante

(tGHr)

E. coli BL21 DE3 contendo o plasmídeo recombinante pGSM-tGH foi cultivada a

37°C sob agitação em meio LB líquido suplementado com o agente de seleção ampicilina

(100 mg/mL) até atingir densidade ótica de 0,5 a 600nm (DO600 0,5). Em seguida, foi

adicionado 1mM de IPTG (Isopropil β -D-1-Tiogalactopiranosídeo) e a cultura mantida nas

mesmas condições descritas por 20h. O crescimento bacteriano (Abs600nm) e a taxa de indução

foram monitorados nos intervalos de 0h, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h e 20h de indução. As células

Figura 1: Mapa do Vetor pGSM-1, indicando os sítios de restrição EcoRI e NotI, utilizado para

expressão do tGH.

19

bacterianas foram coletadas por centrifugação a 15000 g por 3 minuto, homogeneizadas e

ressuspensas em tampão de amostra 2x (200mM Tris pH 6,8; 0,1% (p/v) azul de bromofenol;

4% (v/v) SDS; 5% β-mercaptoetanol; 20%(v/v) glicerol), e então utilizados para análise em

gel de poliacrilamida do tipo SDS-PAGE a 15% (Laemmli, 1970).

2.4- Eletroforese em SDS-PAGE

Para confirmar a expressão do tGHr, 5uL de extrato protéico foi utilizado para ser

analisado em SDS-PAGE 15%. Em seguida, seguiu-se as especificações do fabricante do kit

InVision™ His-tag In-gel Stain (Invitrogen®) para detectar a proteína recombinante contendo

a cauda de histidina N-terminal. O gel de poliacrilamida foi colocado em uma solução

fixadora por 1 hora, depois lavado com água ultrapura por 20 minutos, corado com a solução

corante InVision™ His-tag por 1 hora, lavado com tampão fosfato 20 mM, pH 7,8 por 10

minutos e procedido a visualização imediata do gel. A aquisição de imagem foi realizada com

o auxílio do Thyphoon (9400) Variable Mode Image Trio.

3- Resultados

3.1- Construção do plasmídeo de expressão pGSM-tGH

O novo plasmídeo pGSM-tGH foi construído com sucesso e validado por intermédio

de cortes com as enzimas de restrição EcoRI e NotI, liberando um fragmento de 611pb

correspondente ao fragmento gênico do hormônio de crescimento do tambaqui (Figura 2).

3.2- Expressão do hormônio de crescimento do tambaqui recombinante (tGHr) em E.

coli

O tGHr foi expresso em E. coli BL21 DE3 após 2 horas de indução com o IPTG,

sendo que a expressão máxima foi obtida à partir de 4h de indução (Figura 3, poço 4). A

corrida eletroforética em gel desnaturante de poliacrilamida revelou uma banda

correspondente a uma proteína expressa com aproximadamente 24 kDa. Esta banda esteve

ausente no extrato protéico que continha apenas a célula hospedeira com o vetor pGSM-1

(Figura 3). O tamanho previsto para a proteína recombinante é de 24 kDa, sendo que a porção

de GH compreende aproximadamente 20 kDa e os 4 kDas restantes referem-se a cauda de

histidina (6x his tag) mais a sequência de aminoácidos correspondente ao sítio de

reconhecimento da enzima enterokinase. A expressão da proteína recombinante foi

20

confirmada após a imunodetecção das caudas de histidinas presentes no N terminal da

proteína expressada (Figura 4).

Figura 2: Digestão dupla do plasmídeo pGSM-tGH com as endonucleases EcoRI e NotI: (M) marcador

de peso molecular 1kb (Promega), (1) fragmento correspondente ao hormônio de crescimento de

tambaqui. Gel de agarose 0,8%, corado com brometo de etídeo.

Figura 3: Análise da expressão do tGH recombinante em E.coli linhagem BL21 DE3/ pGSM-tGH em SDS-

PAGE 15% corado com Comassie Blue. 1- BL21 DE3 (C-), 20h de indução; 2-BL21 DE3/pGSM1 (C-), 20h de

indução; 3- BL21 DE3/pGSM-1, 0h de indução; 4 a 9- BL21 DE3/pGSM-tGH 0h, 2h, 4h 6h, 8h e 20h de

indução, respectivamente; 10- C: controle, GH humano, 22 kDa.

tgh(611pb)

4 C 1 8 9 7 6 5 2 3

tGH

recombinante

~24kDa

21

4- Discussão

Neste trabalho, o tambaqui (Colossoma macropomum), um peixe de grande valor

comercial para a região amazônica, teve seu hormônio de crescimento (tGH) clonado e

expressado de forma satisfatória em Escherichia coli. A utilização do vetor pGSM-1 para

Figura 4: tGH recombinante em SDS-PAGE 15% evidenciado com A) Comassie blue e B) InVision™ His-

tag. M: marcador de proteína BenchMark™ His-tag; 1- BL21 DE3/pGSM-tGH 0 h de indução; 2 a 5 BL21

DE3/pGSM-tGH 2 h, 4 h, 6 h e 20 h de indução, respectivamente.

M 1 2 3 4 5

A

M 1 2 3 4 5 B

22

expressão do hormônio em E.coli BL21 DE3, após indução com o IPTG, mostrou-se

plenamente factível.

Desde a década de 80 que os cDNAs codificadores do GH de várias espécies de peixes

vem sendo clonados e expressos utilizando a bactéria Escherichia coli (Sekine et al., 1985).

GHs de peixes que foram expressos com êxito em E. coli incluem a truta arco-íris

(Oncorhynchus mykiss), enguia japonesa (Anguilla japonica), pargo negro (Acanthopagrus

schlegeli), carpa comum (Cyprinus carpio), carpa capim (Ctenopharyngodon idella),

“rabbitfish” (Siganus guttatus), “goldfish” (Carassius auratus auratus) , “indian major carp”

(Catla catla), “rohu” (Labeo rohita), “gilthead sea bream” (Sparus aurata), “dolphin fish”

(Coryphaena hippurus), “flounder” (Paralichtys olivaceus), “yellow porgy” (Acanthopagrus

latus), “striped bass” (Morone saxatilis) e salmão (Sekine et al., 1985; Agellon e Chen, 1986;

Saito et al., 1988; Ho et al., 1991; Tsai et al., 1993, 1995, 1997; Cheng et al., 1995; Jeh et al.,

1998; Mahmooud et al., 1998; Bai et al., 1999; Ben-Atia et al., 1999; Paduel et al., 1999;

Ayson et al., 2000, Chan et al., 2003; Venugopal et al., 2002; Funkenstein et al., 2005; Deane

e Woo, 2006).

Em se tratando de pesquisas brasileiras, a clonagem de hormônio de crescimento em

peixes vem sendo realizado há mais de 10 anos podendo ser destacado a clonagem do GH da

carpa prateada (Pedraça, 2000; Monteiro, 2011), pacu do pantanal (Pinheiro, 2008) e

tambaqui (Sousa, 2009).

Tradicionalmente, o método de escolha para a produção de proteínas simples como o

GH tem sido a expressão em células bacterianas, pois não necessita de modificações pós-

traducionais, é fácil, barato e rápido, já que as bactérias são cultivadas por apenas um dia e o

rendimento é elevado (Funkestein et al., 2005). Exceto para poucos casos em que a proteína

foi produzida em sistema de expressão eucariótico (Jin et al., 1999; Wang et al., 2003; Acosta

et al., 2007; Chen et al., 2008; Liu et al., 2008; Wei et al., 2008), a maioria dos GHs

recombinantes de peixes foram expressos em células bacterianas.

Como observado na Figura 3, a expressão de tGH em E. coli BL21 DE3 alcançou altos

níveis de concentração na indução realizada. Resultados similares foram encontrados em

outros trabalhos de expressão de GH de peixes por E. coli quando induzida com o IPTG. (Tsai

et al., 1995 e 1997; Anathy et al., 2001; Chan et al., 2003; Prondokoy et al., 2004; Sciara et

al., 2006). É importante ressaltar que o tGH foi obtido com a formação de corpos de inclusão

23

durante a expressão em E. coli. De acordo com estudos de outros GHs recombinantes de

peixes expressos em E. coli, o hormônio foi produzido na forma insolúvel, com corpos de

inclusão, como por exemplo: GH de tilápia (Rentier-Dulue et al., 1989), GH de atum (Sato et

al., 1989) e GH de “yellowfin porgy” (Tsai et al.,1995).

Os resultados obtidos claramente demonstram que a clonagem e a expressão do

hormônio de crescimento recombinante de tambaqui (tGH) foi obtida com sucesso em E. coli.

Tais resultados atinam a possibilidade de produção do GHs recombinantes de peixes

amazônicos de valor comercial, como é o caso do tambaqui, em sistemas de expressão

heterólogos. O tambaqui, por sua importância econômica, foi até o momento o primeiro peixe

amazônico cujo GH foi expresso.

Apesar de que neste trabalho não tenha sido possível purificar o tGH, esta etapa será

primordial para validação de nossos resultados pois a administração do GH em peixes

aumenta sensivelmente o crescimento, o peso e a conversão alimentar (Ishioka et al., 1992;

Cavari et al., 1993; Moriyama et al., 1993; Tsai et al., 1994; Melamed et al., 2002).

Dentre as várias maneiras pela qual o GH recombinante pode ser administrado ao

peixe, a administração oral por meio de rações parece ser a mais promissora na piscicultura,

com base no fato de que as células epiteliais do trato intestinal dos peixes absorvem o GH e o

mesmo logo é detectado no plasma sanguíneo (Moriyama et al., 1993). Além disso, a

administração oral evita o manuseio intensivo do peixe poupando de estressá-lo (Le Bail,

1989; Melamed et al., 2002). Outras formas de se administrar o GH recombinante para

promover o crescimento peixes são a imersão em água contendo este hormônio (Agellon et

al., 1988; Moriyama e Kawauchi, 1990; Acosta et al., 2007), ou através de injeção

intramuscular do GH .

A realização deste trabalho representa um passo inicial para a produção de GHs de

outras espécies importantes para aquicultura. Os posteriores ensaios biológicos do tGH com

vista a aceleração do crescimento do tambaqui, sem dúvida representarão um avanço e

inovação nas tecnologias de cultivos de peixes.

24

5- Agradecimentos

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo

financiamento do projeto e concessão de bolsa de mestrado à S.D. Silva. Ao Instituto

Nacional de Pesquisas da Amazônia e à Universidade Federal do Amazonas que

proporcionaram a infraestrutura necessária para a execução deste projeto.

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