INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA - INPA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA,

CONSERVAÇÃO E BIOLOGIA EVOLUTIVA

CÓDIGO DE BARRAS DE DNA COMO FERRAMENTA PARA O

ESTUDO DA BIODIVERSIDADE DE PEIXES DA FAMÍLIA

CICHLIDAE NA BACIA AMAZÔNICA

ANA PAULA COSTA DE CARVALHO

Manaus, Amazonas

Junho 2014

i

Ana Paula Costa de Carvalho

CÓDIGO DE BARRAS DE DNA COMO FERRAMENTA PARA O

ESTUDO DA BIODIVERSIDADE DE PEIXES DA FAMÍLIA

CICHLIDAE NA BACIA AMAZÔNICA

Orientador: Ph.D. Tomas Hrbek

Dissertação apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Genética,

Conservação e Biologia Evolutiva do

Instituto Nacional de Pesquisas da

Amazônia como parte dos requisitos

para obtenção de título de Mestre em

Genética, Conservação e Biologia

Evolutiva.

Manaus, Amazonas

Junho 2014

ii

C331c Carvalho, Ana Paula Costa de

Código de barras de DNA como ferramenta para o estudo da

biodiversidade de peixes da família Cichlidae na bacia Amazônica /

Ana Paula Costa de Carvalho. --- Manaus: [s.n.], 2014.

xii, 86 f. : il. color.

Dissertação (Mestrado) --- INPA, Manaus, 2014.

Orientador: Tomas Hrbek.

Área de concentração: Genética, Conservação e Biologia

Evolutiva.

1. DNA Barcoding. 2. Conservação. 3. Ictiofauna. 4.

Neotropical. I.Título

CDD 597.58

Sinopse:

Estudou-se a metodologia do código de barras de DNA (gene

COI) para identificar e delimitar a ictiofauna diversificada de

ciclídeos em água doce da região Neotropical. O código de barras

de DNA conseguiu discriminar a maioria das espécies analisadas e

sinalizar espécies crípticas e complexos de espécies.

Palavras-chave: Citocromo oxidase I, espécies crípticas,

identificação.

iii

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus pela minha existência, pela dádiva de viver e por abençoar sempre o

meu caminho.

Aos meus Familiares, principalmente aos meus Avós (Raimundo Ferreira da Costa e

Maria Mendes da Costa) e aos meus Pais (Domingos Marques de Carvalho e Euzemar

Costa de Carvalho) que moram no meu coração, pelo afeto e carinho, pelos conselhos que

me ajudaram a vencer na estrada da vida e pelo incentivo na minha determinação, devo tudo

isso à vocês.

Ao Francisco Martins de Castro, meu esposo, pelo companheirismo, amor, carinho,

dedicação, apoio e compreensão nas fases difíceis da minha vida e pela vitória conquistada.

Ao Professor Dr. Tomas Hrbek pela orientação, confiança e ajuda durante a execução deste

trabalho.

A Profª. Dra. Izeni Pires Farias pelo apoio e ensinamentos durante o desenvolvimento da

minha dissertação.

Agradeço o Programa de Pós-graduação em Genética, Conservação e Biologia

Evolutiva/INPA pela oportunidade de mestrado. Os Professores do programa que se

dedicaram em repassar conhecimentos essenciais ao meu aprendizado e para a minha

formação profissional durante as disciplinas. E também a secretária Alessandra, sempre

disposta a atender nossas solicitações.

A Universidade de Federal do Amazonas (UFAM) pelo espaço utilizado do Laboratório de

Genética Animal (LEGAL) para execução das análises do meu mestrado.

A CAPES, pela concessão da bolsa de estudos e pelo financiamento deste projeto de pesquisa

juntamente com a CNPq e FAPEAM.

Aos colegas (José, Valéria, Deyla, Natasha, Sarah, Gabi, Mário, Adriano, Júlia, Olavo,

Concy, Elciomar, Fabrício, Fabinho e Emanuel) do Laboratório de Evolução e Genética

iv

Animal (LEGAL)/UFAM que voluntariamente me ajudaram a realizar este trabalho. Obrigada

pela colaboração, incentivo e atenção!

Aos pesquisadores e amigos do INPA e do LEGAL pela receptividade e colaboração em

realizar as coletas e identificar as amostras.

Enfim, agradeço a todos, que de alguma maneira, contribuíram para a realização deste

trabalho.

v

"Há homens que lutam um dia e são bons.

Há outros que lutam um ano e são melhores.

Há os que lutam muitos anos e são muito

bons. Porém, há os que lutam toda a vida.

Esses são os imprescindíveis."

Bertolt Brecht.

vi

RESUMO

Os ciclídeos neotropicais constituem um grupo variado, no qual compreendem cerca de 60

gêneros e pelo menos 1300 espécies são reconhecidas. São distribuídas na América Central e

do Sul, Texas, Índias Ocidentais, África, Madagascar, Síria, Israel, Irã, Sri Lanka, litoral do

sul da Índia. A diversidade encontrada na família Cichlidae abrange os mais diferentes

aspectos morfológicos e ecológicos, que facilitam na adaptação dos peixes desta família.

Além disso, evidências com base nos dados moleculares mostraram que a maior parte da

diversificação da ictiofauna Neotropical ocorreu recentemente. Estas características tornam

difícil a compreensão da taxonomia e identificação dessa fauna, tornando um grande desafio

para as ferramentas moleculares. Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo testar a

eficácia da metodologia do código de barras de DNA (gene COI) para identificar e delimitar a

ictiofauna diversificada de ciclídeos em água doce da região Neotropical. Para esta finalidade,

foram analisadas 59 espécies de peixes na bacia Amazônica, sendo amostrado por até cinco

espécimes, identificadas a priori morfologicamente, e obtidas 147 sequências de código de

barras de DNA. Foram combinados os dados morfológicos com os moleculares, onde apenas

nove espécies apresentaram concordância em ambos os métodos de identificação. Das 45

espécies analisadas, 40 (88,8%) foram corretamente identificadas pelas sequências de códigos

de barras. Os principais valores de divergência genética intraespecífica e interespecífica pelo

K2P nos agrupamentos moleculares foram 0% e 55%. E verificou-se sete espécies crípticas

(15,5%), sete complexos de espécies (15,5%) e aproximadamente cinco espécies (11,2%)

mostraram ausência de monofilia recíproca. Este estudo é o primeiro analisar um grande

número de espécies de peixes de água doce da região Neotropical, incluindo um grande

número de espécies estreitamente relacionadas. Os resultados confirmaram a eficácia do

código de barras para sinalizar espécies crípticas e complexos de espécies, que passaram

recentemente por um processo de irradiação, além de discriminar a maioria das espécies

analisadas. Os resultados também revelaram divergências genéticas sugestivas de isolamento

reprodutivo e especiação críptica em sete espécies. Enfim, os resultados obtidos contribuirão

significamente para o projeto Internacional do Código de Barras da Vida, e para a campanha

FISH-BOL fornecendo as sequências de código de barras para uso na identificação dessas

espécies por especialistas e não-especialistas, e permitindo-lhes estar disponível para uso em

outras aplicações.

vii

ABSTRACT

The Neotropical cichlids are a diverse group, which comprises about 60 genera and at least

1300 species are recognized. They are distributed in Central and South America, Texas, West

Indies, Africa, Madagascar, Syria, Israel, Iran, Sri Lanka, southern coast of India. The

diversity found in the Cichlid family covers the most different morphological and ecological

aspects that facilitate the adaptation of this fish family. In addition, evidence based on

molecular data showed that most of the diversification of the Neotropical fish fauna occurred

recently. These features make it difficult to understand the taxonomy and identification of this

fauna, becoming a major challenge for molecular tools. In this context, this study aimed to

test the effectiveness of DNA barcode methodology (COI gene) to identify and delineate the

diverse ictiofauna of freshwater cichlids in the Neotropics. For this purpose, 59 species of

Amazon basin fish were analyzed, being sampled by up to five specimens, morphologically

identified beforehand, and 147 DNA barcode sequences obtained. Morphological data were

combined with the molecular where only nine species showed agreement in both methods of

identification. Of the 45 species analyzed, 40 (88.8%) were correctly identified by the barcode

sequencing. The main values of intraspecific and interspecific genetic divergence by K2P in

molecular clusters were 0% and 55%. Seven cryptic species (15.5%) as well as seven

complexes of species (15.5%) were verified and approximately five species (11.2%) showed

absence of mutual monophyly. This study is the first to analyze a large number of freshwater

fish species in South America, including a large number of closely related species. The results

confirmed the effectiveness of barcode to signal cryptic species and species complexes, which

have recently undergone a process of irradiation, in addition to discriminate most species

analyzed. The results also revealed genetic differences suggesting reproductive isolation and

cryptic speciation in seven species. Finally, the results will contribute significantly for the

Life Barcode International Project, and for the FISH-BOL campaign providing sequences of

barcodes on the identification of these species by specialists and non-specialists, as well as

allowing them to be available for use in other applications.

viii

SUMÁRIO

Pág.

RESUMO……………………………………………………………………….. vi

ABSTRACT..…………………………………………………………………… vii

1. INTRODUÇÃO GERAL……………………………………………………. 13

1.1 Biologia e Ecologia dos Ciclídeos................................................................... 13

1.2 História Biogeográfica dos Ciclídeos.............................................................. 18

1.3 Código de Barras de DNA............................................................................... 19

CAPÍTULO I........................................................................................................ 23

Artigo I................................................................................................................... 24

2. CONSIDERAÇÕES GERAIS........................................................................ 47

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................... 47

ix

LISTA DE TABELAS

Pág.

Tabela 1. Nomes das espécies, baseadas nas identificações morfológicas, que

foram analisadas no presente estudo. 59

Tabela 2. Nome e referências das seqüências dos primers usados na

amplificação e seqüenciamento. 67

Tabela 3. Número de espécies que foram identificadas pelo banco de dados

online BOLD (Barcode of life) e NCBI (National Center Biotechnology

Information).

71

Tabela 4. Valores médios das divergências intraespecífica e interespecífica do

gene COI (divergência mínima, média, máxima e desvio padrão) das 147

sequências obtidas pelo método de Kimura-2-parâmetros.

71

Tabela 5. Porcentagem média da distância intraespecífica (K2P) entre os

genêros de Ciclídeos amazônicos representados por mais que uma espécie. 72

Tabela 6. Porcentagem média da distância intraespecífica (K2P) para as espécies

de ciclídeos classificados morfologicamente e representados por mais de um

espécime.

72

Tabela 7. Porcentagem média da distância intraespecífica (K2P) para as espécies

de ciclídeos classificados molecularmente e representados por mais de um

espécime.

74

Tabela 8. Número de linhagens biológicas encontradas para cada espécie de

ciclídeos na Bacia Amazônica. 75

Tabela 9. Distância média da distância interespecífica (K2P) para as espécies de

ciclídeos delimitados molecularmente pelo modelo Generalized Mixed Yule

Coalescent (GMYC).

77

Tabela 10. Distância média da distância interespecífica (K2P) para as espécies

de ciclídeos classificados morfologicamente.

82

x

LISTA DE FIGURAS

Pág.

Figura 1. Representação da morfologia externa de um Ciclídeo. 14

Figura 2. Placas dentígeras faringianas em Cichlasoma minckleyi e Crenicichla chicha. 14

Figura 3. Mapa do genoma mitocondrial de Arapaima gigas representando os principais

genes. O citocromo c oxidase é mostrada em vermelho. 18

Figura 4. Esquema do barcoding gap. Em vermelho mostra a distribuição da variação

intraespecífica e em amarelo a variação interespecífica. 20

Capítulo I.

Figura 1. Localidades onde foram realizadas as amostragens das espécies de ciclídeos

realizados na bacia hidrográfica da Amazônia. Os números correspondem aos locais

de amostragem: 1 – Rio Araguaia; 2 – Rio Xingu; 3 – Rio Tapajós; 4 – Rio Purus; 5 –

Rio Jatapu; 6 – Rio Negro.

28

Figura 2. Árvore com as espécies delimitadas pelo modelo GMYC, construídas a

partir de 147 sequências de código de barras de DNA. 68

13

1. INTRODUÇÃO GERAL

1.1 Biologia e Ecologia dos Ciclídeos

Os primeiros estudos com a família Cichlidae foram realizados por Heckel em 1840, e

posteriormente por Jardine em 1843. Em 1904, Pellegrin conseguiu revisar todos os gêneros e

espécies da família conhecidas por ele com base em diagnósticos morfológicos. Entre 1905 a

1906 Regan fez uma série de revisões taxonômicas nas espécies e gêneros da família, o que

melhorou significativamente as classificações dos táxons Neotropicais (Kullander, 2003).

Porém, a primeira revisão filogenética para o grupo dos ciclídeos neotropicais foi feita apenas

em 1976 por Cichocki (Kullander, 2003). Mais recentemente, revisões taxonômicas com base

em dados morfológicos e moleculares foram feitos por Kullander (1998), Farias et al. (1999),

Farias et al. (2000), Sparks e Smith (2004), Kocher (2004), López-Fernandez et al. (2005),

Smith et al. (2008), López-Fernández et al. (2010), Hulsey et al. (2010), Hulsey et al. (2011) e

McMahan et al. (2013) proporcionando hipóteses filogenéticas com base na morfologia e

dados moleculares respectivamente.

Os peixes ciclídeos são conhecidos pela sua rápida especiação simpátrica e radiação

adaptativa - processos biológicos - nos quais permitiram a colonização dos lagos africano

(Malawi, Victoria e Tanganyika) e das regiões neotropicais (Genner et al., 2007; López-

Fernández et al. 2013; Hilary e López-Fernández, 2013). Somente nesses lagos, nos últimos

milhões de anos, surgiram mais de 1.000 espécies de peixes de água doce (Allender et al.,

2003).

Dessa forma, os ciclídeos formam um dos grupos mais diversos de peixes de água

doce do mundo, com aproximadamente 1900 espécies descritas (Kullander, 1998, 2003). A

diversidade encontrada neste grupo abrange os mais diferentes aspectos que variam desde as

características morfológicas e ecológicas, que facilitam na adaptação dos peixes desta família

(Kullander, 2003). Os ciclídeos neotropicais também constituem um grupo variado, no qual

compreendem cerca de 60 gêneros e estima-se que mais de 1300 espécies são reconhecidas

(López-Fernandez et al., 2010, Kullander, 2003). Apresentam 7-24 espinhos na nadadeira

dorsal e 2-12 na nadadeira anal, uma única narina em cada lado da cabeça e corpo

comprimido lateralmente. A linha lateral é geralmente dividida em uma porção anterior-

superior terminando abaixo da extremidade da base da nadadeira dorsal, e uma porção

posterior-inferior correndo ao longo do meio do pedúnculo caudal (Figura 1) (Kullander,

14

2003; Froese e Pauly, 2012).

As maxilas são geralmente móveis e apresentam protrusão (Froese e Pauly, 2012;

Sampaio e Guolart, 2011). Há uma variação considerável na forma da placa dentária

associada à dieta especializada. Também possuem placas dentígeras faringianas (Varela et al.,

2012) (Figura 2) utilizadas na mastigação que sustentam a monofilia do grupo (Kullander,

2003). Esse complexo maxilar da faringe que se localiza atrás da cavidade bucal é

funcionalmente dissociado das maxilas, e apresenta grande diversificação de formas e funções

entre as espécies desta família (Meyer 1993 apud Sampaio e Goulart, 2011).

De um modo geral, os ciclídeos possuem cuidado parental (incubação oral ou depósito

de ovos em superfícies) e o seu comprimento do corpo varia de 25-30 mm para as espécies

dos gêneros Apistogramma e Taeniacara a aproximadamente um metro em Cichla temensis

(Kullander, 2003).

A família também é caracterizada por diversos padrões de cores entre as espécies do

mesmo gênero, que são explicados pela atuação da seleção divergente ou disruptiva nas suas

colorações, nos quais permitiram formar uma ampla variação no grupo de ciclídeos (Allender

Figura 1. Representação da morfologia externa de um Ciclídeo. Fonte: Fishbase.

Figura 2. Placas dentígeras faringianas em Cichlasoma minckleyi (A e B) e Crenicichla chicha (C). Fonte: Figura

adaptada de Trapani, 2003 in: Sampaio e Goulart 2012; Varela et al., 2012.

15

et al., 2003). Essas colorações auxiliam na escolha do parceiro, onde os machos, geralmente

têm cores mais evidentes do que as fêmeas (Dalton et al., 2010).

Os ciclídeos apresentam diferenças de diversificação entre os clados de espécies

“fenotipicamente crípticas” e radiações que muitas vezes contêm espécies “geneticamente

crípticas” (Hulsey, 2009; Perazzo, 2010; Martins-Santos et al., 2014). Esses complexos de

espécies muitas das vezes, dificultam na delimitação das espécies de um grupo, pois em

alguns grupos distintos aparentam pouca ou nenhuma diferença fenotípica, enquanto que em

outros casos, apresentam grandes diferenças fenotípicas que facilitam na delimitação das

diferentes linhagens (Hulsey, 2009).

Até a década de 90, estimava-se que cerca de 160 táxons não tinham sido descritos na

América do Sul (Kullander, 1998, 2003). Porém, recentemente diversas espécies de ciclídeos

foram descritas morfologicamente, na bacia amazônica, entre elas: Apistogramma angayuara

e Apistogramma salpinction no rio Trombetas (Kullander e Ferreira, 2005); Geophagus sveni

e G. neambi na drenagem do rio Tocantins (Lucinda et al., 2010); Dicrossus foirni e

Dicrossus warzeli nos rios Tapajós e rio Negro (Römer et al., 2010); Krobia xinguensis no rio

Xingu (Kullander, 2012) e Crenicichla chicha no rio Tapajós (Varella et al., 2012). Em outras

localidades do Brasil, também já foram descritas novas espécies de ciclídeos: Laetacara

araguaiae na cidade de Rio Verde no estado de Goiás (Ottoni e Costa, 2009); Australoheros

perdi no Vale do Rio Doce no sudeste do Brasil (Ottoni et al., 2011); Australoheros tavaresi,

Australoheros mattosi e Australoheros montanus nas bacias dos rios São Francisco, Paraná e

Paraíba do Sul, sudeste do Brasil (Ottoni, 2012); Laetacara flamannellus no estado do Amapá

(Ottoni et al., 2012).

Quanto à distribuição da família, podem ser encontrados na América Central e do Sul,

Texas, Índias Ocidentais, África, Madagascar, Síria, Israel, Irã, Sri Lanka, e no litoral do sul

da Índia (Kullander, 2003; Froese e Pauly, 2012). Na América do Sul, habitam locais lênticos

dentro de rios e córregos, e algumas espécies dos gêneros Crenicichla, Teleocichla e

Retroculus são considerados reofílicos (Kullander, 2003).

Na América do Sul, o sistema fluvial amazônico passou por grandes transformações

geológicas, destacando-se a mudança no sentido da drenagem dos rios de leste-oeste para

oeste-leste (Lundberg et al., 1998; Albert et al., 2006). Ocorreu a formação do Lago Pebas

(15-10 Ma) que ocupou a Amazônia Ocidental, no qual foi separada da Amazônia Central e

Leste pelo Arco Purus, promovendo possivelmente a diversificação alopátrica. Com o

surgimento da cordilheira andina venezuelana e depois o surgimento do arco Uapes (12 Ma)

ocorreu o rompimento do Arco Purus, possibilitando a reconexão entre a Amazônia Ocidental

16

e a Amazônia Central e Leste, permitindo uma colonização recíproca de faunas endêmicas

nessas bacias. Além desses eventos geomorfológicos, as incursões marinhas também

influenciaram na diversificação e colonização de vertebrados na Amazônia (Lovejoy et al.,

2006; Lundberg, 1998; Farias e Hrbek, 2008).

A bacia amazônica é composta por três estruturas geológicas diferentes: (i) a

Cordilheira dos Andes, à Oeste; os (ii) Escudos Cristalinos, da Guiana ao Norte e do Brasil ao

Sul; e (iii) a planície sedimentar (Ruffino, 2004). Os rios são classificados de acordo com suas

condições físico-químicas, no qual se diferencia nas cores de águas brancas, claras e pretas

(Sioli, 1950). Os rios de águas brancas possuem suas nascentes na região andina e os

tributários são os afluentes da margem direita, como os rios Juruá, Purus e Madeira e na

margem esquerda, o rio Içá e Japurá. Os de águas claras, são transparentes e esverdeadas

devido as baixas quantidades de sedimentos e de sólidos dissolvidos, entre eles estão os rios

Tapajós, Xingu, Trombetas, Branco, Nhamudá, Tocantins, Araguaia e Paru se originam nas

encostas dos escudos das Guianas e do Brasil. A bacia sedimentar Amazônica possui cerca de

2 milhões de km2 e possui sedimentos dos Escudos Cristalinos e dos Andes que se

depositaram no vale Amazônico, durante o Terciário e Quaternário. Ela drena águas escuras

do rio Negro, Jutaí, Tefé e Coari (Junk et al., 2011; Junk et al., 2012; Ruffino, 2004).

Apesar dos diferentes processos geológicos e climáticos terem influenciados na

distribuição e diversificação dos ciclídeos amazônicos, estimativas a cerca da biodiversidade

do grupo ainda são incertas e muitas espécies necessitam ser identificadas e descritas (Farias

et al., 2001). Até o momento, a maioria das espécies foi identificada por meio de análises

morfológicas utilizando chaves de identificações (www.barcoding.si.edu), porém, caracteres

morfológicos podem não ser eficientes para diagnosticar as espécies de ciclídeos (Colatreli et

al., 2012). Pois, existem evidências de compartilhamento de haplótipos entre os diferentes

grupos fenotípicos e espécies (Farias e Hrbek, 2008; Colatreli et al., 2012; Willis et al., 2007;

Willis et al., 2012).

Os ciclídeos além de apresentarem rápido tempo de geração e idade reprodutiva,

possuem alta diversidade e adaptação, ampla distribuição, ocorrência de espécies crípticas,

podendo levar a subestimação de suas espécies. Também sofrem com a influência das

variações sazonais e fatores geológicos, no aspecto biológico, ecológico e genético do grupo,

o que pode afetar as suas populações (Crampton, 2008). Portanto, torna-se importante

entender a organização, distribuição e diferenciação genética das espécies deste grupo de

peixes numa determinada bacia hidrográfica, como a bacia Amazônica, de modo, que

posteriormente possam ser definidas melhores estratégias conservacionistas (Frankham et al.,

17

2008).

1.2 História Biogeográfica dos Ciclídeos

Os fósseis mais antigos dessa família datam do Eoceno na América do Sul e do

Oligoceno da África (Murray, 2001). Assim, acredita-se que surgiram ainda no Cretáceo e sua

a filogenia molecular e morfológica demonstra que os ciclídeos são monofiléticos (Stiassny,

1991; Farias et al., 1999; Chakrabarty 2004; Sparks e Smith, 2004, 2005).

Existem duas abordagens a cerca da distribuição disjunta dos ciclídeos nos

continentes, uma está relacionada com a dispersão que ocorreu pela transposição de uma

barreira geográfica, que colaborou na exploração de novas áreas e no processo de especiação.

Esta hipótese pode ser mais provável, devido à evidência do registro fóssil, estimativas de

divergência do relógio molecular e a tolerância ao sal de alguns ciclídeos (Murray, 2001;

Vences et al 2001; Briggs 2003).

De acordo com Murray (2001), com a fragmentação da Gondwanna (entre 135 a 65

milhões de anos), dois grupos teriam se formado distintamente: os ciclídeos africanos (Velho

Mundo) e os ciclídeos sulamericanos. A linhagem africana migrou para a América do Sul e

depois se espalhou facilmente para a América Central e Norte (Murray, 2001). Segundo esse

mesmo autor, existem muitos exemplos de espécies de ciclídeos que toleram a salinidade o

qual não seria uma barreira à dispersão desses ciclídeos no passado, e, portanto, a distribuição

desse grupo não é estritamente Gondwana.

E a outra abordagem se atribui ao evento vicariante que separou as populações por

uma fragmentação (separação do supercontinente da Gondwana), determinando assim, a

distribuição da fauna de ciclídeos (Farias et al., 2000; Chakrabarty, 2004; Sparks e Smith,

2005). Segundo essa hipótese, os estudos realizados com filogenia dos ciclídeos mostram

coerências com a hipótese da fragmentação da Gondwana. Como por exemplo, Farias et al.

(1999), mostraram que os ciclídeos de Madagascar e Indianos formavam linhagens basais,

além de serem grupo irmãos com os clados africanos e neotropicais, cuja relação coincide

com a separação do continente Madagáscar e Indiano. Os ciclídeos neotropicais e africanos

divergiram posteriormente após a abertura do Oceano Atlântico Sul. Já Spark e Smith (2004),

verificaram que o ancestral comum sofreu divisão, formando dois clados: o Etroplinae no

continente Madagáscar-Índia, e o clado Ptychochrominae formado Madagáscar e África +

América do Sul. O grupo formado por Madagáscar e Índia (Etroplinae) foi separado no

18

Cretáceo, dessa forma, baseado nessas relações e nas evidências geológicas de peixes

ciclídeos, eles argumentaram que a atual distribuição de Cichlidae é congruente com

vicariância Gondwana (Spark e Smith, 2004).

1.3 Código de Barras de DNA

Atualmente existem limitações em estudos taxonômicos que são baseados apenas em

análises morfológicas, sendo assim, a inclusão de dados moleculares torna-se oportuno e

necessário para discriminar e identificar os táxons (Moritz e Cicero, 2004), como por

exemplo, os ciclídeos (Ribeiro, 2007).

Em 2003, pesquisadores da Universidade de Guelph, em Ontário, Canadá, propuseram

um "código de barras de DNA", que poderia auxiliar no processo de identificação e

delimitação das espécies (Savolainen et al., 2005). Esse código de barras se baseia num

pequeno fragmento padronizado, com apenas 648 pares de bases, do genoma mitocondrial

(DNAmt), o citocromo c oxidase subunidade I (COI) (figura 3) (Hebert et al., 2003a; Hebert

et al., 2003b; Stoeckle, 2003).

A escolha pelo DNAmt para distinguir as espécies visou pelas suas maiores diferenças

nas sequências dos ácidos nucléicos entre as espécies e pela abundância de cópias em relação

ao DNA nuclear, tornando-o bastante informativo e fácil de ser recuperado a partir de

amostras pequenas ou parcialmente degradas (Stoeckle e Hebert, 2008). Ele é compartilhado

entre táxons variados, possui elevadas substituições neutras na terceira posição do nucleotídeo

Figura 3. Mapa do genoma mitocondrial de Arapaima gigas representando os principais genes. O citocromo c

oxidase é mostrada em vermelho (Hrbek e Farias, 2008).

19

e não contêm íntrons, os quais podem dificultar a amplificação usando a reação em cadeia da

polimerase (PCR) (Stoeckle, 2003; Hebert et al., 2003a).

O código de barras de DNA é caracterizado pela presença de primers universais de

uma região específica que flanqueiam regiões das sequências conservadas; codifica parte da

enzima terminal da cadeia respiratória mitocondrial e gera sinais filogenéticos (Hebert et al.,

2003b; Hebert e Gregory, 2005). Entre os fatores que determinam a efetividade deste sistema

taxonômico estão: baixa divergência intraespecífica, estruturação populacional e o tamanho

efetivo populacional (Meyer e Paulay, 2005; Ortiz, 2010).

A variação intraespecífica consiste nas diferenças genéticas comuns entre indivíduos

da mesma espécie. A divergência interespecífica são as diferenças que se acumulam entre as

espécies (Hartl, 2008). A sobreposição entre as distâncias genéticas entre espécies

estreitamente relacionadas (divergência interespecífica) e maior variação intraespecífica

originam espécies geneticamente polifiléticas e parafiléticas, dificultando a delimitação dos

organismos pelo marcador COI (Meyer e Paulay, 2005; Tofolli et al., 2008). Assim, as

variações intraespecíficas devem ser sempre menores que as divergências interespecíficas

para que as espécies sejam reconhecidas através deste método (Figura 4) (Hebert 2003b;

Stoeckle, 2003; Ortiz, 2010).

Dessa forma, a variação intraespecífica é inversamente proporcional ao tamanho do

barcoding gap. E a estrutura populacional também pode afetar o barcoding gap na medida em

que ele irá afetar a variação intraespecífica (Ortiz, 2010). Por isso, é importante a amostragem

para melhor desempenho do código de barras, uma vez que o número amostral e dos pontos

de coletas forem insuficientes, pode-se interferir nos resultados e acabar subestimando as

variações intraespecíficas e superestimar as divergências interespecíficas e facilitar na

visualização do barcoding gap (Meyer e Paulay, 2005; Ortiz, 2010).

Assim, o barcoding gap é uma diferença clara entre as distâncias genéticas

interespecíficas e intraespecíficas que facilita a delimitação dos táxons. O critério consiste em

que a distância genética interespecífica deve ser 10 vezes maior do que a distância

intraespecífica (Hebert et al., 2004b; Wiemers e Fiedler, 2007). Em casos de alta variação

intraespecífica o barcoding gap torna-se ausente (Ortiz, 2010). Para Barret e Hebert (2005) é

fundamental determinar esses intervalos de variação intra e interespecífica entre os diferentes

grupos taxonômicos.

Outro critério importante para a existência do barcoding gap é o tamanho efetivo

populacional (Ne). Pois, em casos que existam Ne grande necessita-se de mais tempo para a

separação total e diferenciação entre as populações, além de aumentar a probabilidade de se

20

encontrar alta variação intraespecífica, e consequentemente, a não visualização do barcoding

gap (Ortiz, 2010; Toffoli et al., 2008).

Desde o início da descoberta e utilização do código de barras de DNA em diversas

pesquisas, essa metodologia vem sofrendo algumas críticas. Os críticos argumentam algumas

falhas nesse novo método molecular, entre elas, o uso de distâncias genéticas para a

construção de árvores e utilizar árvores a partir de um único gene para inferir filogenias

(DeSalle et al. 2005); divergência genética interespecífica para delimitar as espécies (Moritz e

Cicero 2004; Wiemers e Fiedler 2007); além do baixo desempenho numa amostragem

insuficiente (Meyer e Paulay, 2005). Outros autores afirmam que um pequeno segmento do

DNA mitocondrial como uma única fonte de dados, não pode representar o genoma completo

para estudo da biodiversidade e substituir a taxonomia clássica (Dunn, 2003; Lipscomb et al.,

2003; Mallet e Willmott, 2003; Will e Rubinoff, 2004; Ebach e Holdrege, 2005; Will et al.,

2005).

Porém, os defensores afirmam que o código de barras de DNA está cada vez mais

refinado e a caminho de tornar-se uma ferramenta essencial para identificação e delimitação

das espécies (Hajibabaei et al. 2006; Kress e Erickson 2008; Janzen et al., 2009). A

abordagem permite delimitar grupos geneticamente distintos, principalmente espécies

crípticas (Hebert et al. 2004a), de forma rápida e precisa (Hebert e Gregory, 2005; Gómez et

al., 2007), que são espécies indistinguíveis morfologicamente que vivem em localidades

A

A

B

Distância Genética

Figura 4. Esquema do barcoding gap. Em vermelho mostra a distribuição da variação intraespecífica e

em amarelo a variação interespecífica. (A) Para efetividade do DNA Barcoding, com distribuições discretas e sem

sobreposição. (B) Uma versão alternativa do mundo com significativa sobreposição e sem gap (Fonte: Meyer e

Paulay, 2005).

21

diferentes, porém não se intercruzam (Futuyma, 2002). E também os complexos de espécies

que são morfologicamente semelhantes e vivem numa mesma área, mas não se intercruzam.

Para Rach et al. (2008), a utilização dos códigos de barras de DNA baseado em

presença ou ausência de substituições de nucleotídeos distintos, mostrou-se ser uma

ferramenta eficaz para a identificação, discriminação e delimitação dos grupos em qualquer

nível taxonômico.

Essa nova ferramenta já foi utilizada em diversos trabalhos com grupos de

invertebrados e vertebrados, tais como: insetos (Hebert et al., 2004a; Hajibabaei et al., 2006;

Rach et al., 2008; Janzen et al., 2009; Silva-Brandão et al., 2009; Dincã et al., 2011; Park et

al., 2011; Webb et al., 2012); anelídeos (Oceguera-Figueroa et al., 2010); aves (Hebert et al.,

2004b); morcegos (Clare et al., 2011) e principalmente para o grupo dos peixes (Ward et al.,

2005, 2009; Frederico et al. 2012; Chakrabarty, 2006). Pereira et al. (2011a) observaram que a

espécie de Piabina argentea é formada por mais de uma unidade biológica. Colatreli et al.

(2012), verificaram a existência de cinco espécies hipotéticas para o ciclídeo do gênero

Astronotus. Pereira et al. (2011b) utilizaram o código de barras de DNA em peixes de água

doce da bacia Paraíba do Sul no estado de São Paulo e conseguiram discriminar todas as 58

espécies analisadas, entre elas a espécie Geophagus proximus. León-Romero et al. (2012)

utilizaram o código de barras de DNA no grupo de espécies Herichthys bartoni para testar a

monofilia e eficência desta ferramenta para discriminar as espécies. Nwani et al. (2011)

aplicaram o código de barras em 38 gêneros de famílias diferentes em peixes de água doce na

Nigéria e verificaram que o COI conseguiu separar a maioria das espécies de ciclídeos, com

exceção para as espécies Oreochromis niloticus e Sarothrodon boulengeri que houve

compartilhamento de haplótipos.

As ferramentas moleculares vêm contribuindo cada vez mais para a identificação das

espécies crípticas e a utilização das sequências das diversas pesquisas conservacionistas com

o código de barras de DNA, são atualmente, inseridas no banco de dados de código de barras

da vida (BOLD, www.barcodinglife.org), juntamente com uma imagem e informação de

garantia para cada espécime voucher (Hajibabaei et al., 2006). O Banco de Dados do Código

de Barras da Vida (em BOLD) consiste numa plataforma de informática que auxilia na

aquisição, armazenamento, análise e publicação de códigos de barras de DNA (Ratnasingham

e Hebert, 2007).

A análise dos dados, do projeto código de barras da vida é realizada pelo CBOL

(Consórcio para o Código de Barras da Vida), que é uma colaboração internacional de 170

organizações com membros de 50 países. O objetivo é estabelecer uma biblioteca pública de

22

sequências de DNA ligadas aos espécimes nomeados (www.barcoding.si.edu).

Existe uma necessidade de estabelecer e fazer cumprir as normas dos dados e para

isso, a CBOL iniciou diálogo com os grandes repositórios genômicos, como por exemplo,

National Center for Biotechnology Information – NCBI. Esse sistema estabelece orientações

formais que devem ser cumpridas para os registros obter a designação de código de barras de

DNA.

Este trabalho constitui-se então num aporte importante para consolidação da base de

dados no projeto universal Barcode da Vida, não só para a delimitação e identificação de

espécies no nível mundial, mas, também para o conhecimento do estado local da nossa

subestimada biodiversidade de ciclídeos no Amazonas, aspecto que limita a execução de

políticas protecionistas para as espécies, especialmente os peixes, fonte importante de renda e

alimento.

2. OBJETIVO

2.1. Objetivo geral:

Analisar a diversidade dos peixes da família Cichlidae oriundos de oito rios da bacia

Amazônica por meio do gene mitocondrial CO1.

2.2. Objetivos específicos:

- Gerar códigos de barras de DNA para as espécies de peixes da família Cichlidae

amostradas em seis rios amazônicos (Rio Negro, Purus, Jatapu, Tapajós, Xingu e

Araguaia/Tocantins);

- Verificar a hipótese da ferramenta de código de barras de DNA para delimitar e

identificar espécies de ciclídeos;

- Identificar presença de espécies crípticas e complexos de espécies nos ciclídeos;

- Observar casos de não monofilia nas espécies de ciclídeos amostrados.

23

CAPÍTULO I1

1 Manuscrito formatado de acordo com as normas da revista Mitochondrial DNA. Manuscrito a ser

submetido.

24

Código de barras de DNA para identificar espécies de ciclídeos da bacia Amazônica, 1

Brasil. 2

ANA PAULA C. CARVALHO 1, JOSÉ G. MARTÍNEZ 1, IZENI P. FARIAS 1 & TOMAS 3

HRBEK 1 4

1 Laboratório de Evolução e Genética Animal, Departamento de Biologia, Universidade 5

Federal do Amazonas, Av. Rodrigo Octávio Jordão Ramos, 3000, 69077-000, Manaus, AM, 6

Brasil. 2 7

Resumo 8

Nesse estudo foram analisadas 45 espécies de peixes de água doce da família Cichlidae em 9

seis localidades da bacia Amazônica, Brasil, por meio do código de barras de DNA. As 10

delimitações moleculares apresentaram distâncias genéticas médias interespecíficas que 11

variaram de 0%-55% e distância média intraespecífica com variação de 0%-1%. Dentre os 12

táxons analisados molecularmente foi possível identificar sete espécies crípticas (15,5%) e 13

sete complexos de espécies (15,5%) e aproximadamente cinco espécies (11,2%) mostraram 14

ausência de monofilia recíproca. Os dados demonstram que a taxonomia dos ciclídeos 15

Amazônicos ainda não está totalmente resolvida, sendo necessária a inclusão da taxonomia 16

integrativa para a resolução dos complexos de espécies aqui encontrados. 17

18

Palavras-chave: taxonomia, peixes de água doce, mtDNA, Cichlidae. 19

20

Correspondência: A. P. C de Carvalho, Laboratório de Evolução e Genética Animal, Departamento de Biologia,

Universidade Federal do Amazonas, Av. Rodrigo Octávio Jordão Ramos, 3000, 69077-000, Manaus, AM,

Brasil. Tel: +55 92 981057917. E-mail: anapaula-bio@hotmail.com

25

Introdução 21

A família Cichlidae é composta por aproximadamente 1900 espécies (Kullander, 22

2003), com variadas características morfológicas e ecológicas que permitem a fácil adaptação 23

nos mais diferentes hábitats (Kullander 2003; Genner et al. 2007). Os grupos desta família 24

podem ser encontrados desde a América Central e Sul até o litoral sul da Índia (Kullander 25

2003; Froese e Pauly 2012). 26

Cerca de 60 gêneros e pelo menos 600 espécies são encontradas na região Neotropical 27

(López-Fernandez et al. 2010). Destas, 257 espécies são encontradas na bacia Amazônica 28

(Thompson 2010), com ampla distribuição contemplando toda a calha principal do rio 29

Amazonas e em seus afluentes (Kullander 2003). 30

As espécies dessa família sofrem pressão de pesca significativa em decorrência de sua 31

importância econômica (Chao 2001; Fernandez Acosta et al. 2008), que coloca em risco as 32

suas populações. Porém poucos estudos têm sido realizados para descrever diversas espécies 33

na Amazônia (Lewinsohn e Prado 2005). 34

Dessa forma, a alta diversidade morfológica e genética, favorece a presença espécies 35

crípticas e complexo de espécies, tornando a taxonomia instável e proporcionando diversas 36

mudanças na nomenclatura e na indefinição entre as espécies (Hulsey 2009; Amado et al. 37

2011; Anseeuw et al. 2012; Colatreli et al. 2012, Mejía et al. 2015). Além dessa grande 38

riqueza, o compartilhamento de haplótipos entre os diferentes grupos fenotípicos das espécies 39

(Willis et al. 2007; Farias e Hrbek 2008; Colatreli et al. 2012; Willis et al. 2012a) e a pouca 40

amostragem em diversas localidades dos diferentes rios amazônicos, acabam subestimando o 41

número evidente de espécies existentes (Kullander 1998). Isto faz com que se torne difícil à 42

aplicação de práticas conservacionistas das suas populações (Crampton 2008). Vários estudos 43

filogeográficos têm sido realizados para distinguir espécies crípticas e elucidar os casos de 44

polimorfismos intraespecíficos em ciclídeos (Willis et al. 2012a; 2012b; Musilová et al. 45

26

2008). Desta maneira, trabalhos adicionais são necessários com o fim de determinar não só 46

novas metodologias para o reconhecimento das espécies, como também a sua aplicabilidade e 47

eficiência na delimitação de espécies de ciclídeos como base para a sua conservação e 48

manejo. 49

Considerando as limitações da taxonomia tradicional para a delimitação de espécies, 50

torna-se necessário a inclusão de dados do código de barras de DNA para detectar as unidades 51

geneticamente distintas e facilitar na descoberta de novas espécies (Ward et al. 2009; Mejía et 52

al. 2015), especialmente em ambientes cada vez mais vulneráveis à pressão antrópica na bacia 53

Amazônica. 54

O código de barras tem surgido com sucesso na aplicação em várias espécies de peixes 55

ao redor do mundo (Ward et al. 2005; Ward et al. 2009), permitindo criar grandes bases de 56

dados como FISH-BOL (Campanha do Código de Barras da Vida para Peixes) 57

(http://www.fishbol.org), envolvendo dados de referência para sequências de DNA para 58

espécies do grupo (Becker et al. 2011; Léon-Romero et al. 2012, Bhattacharya et al. 2015). 59

Aliado a isso, esse novo método de identificação (COI) tem facilitado no controle (Steinke et 60

al. 2009) e regulamentação de práticas conservacionistas de peixes da bacia amazônica 61

(Ardura et al. 2010; Aquilino et al. 2011). 62

Uma região padronizada e curta com apenas 648 pares de base do gene mitocondrial, 63

citocromo oxidase I (COI), denominado código de barras de DNA, é utilizada atualmente para 64

delimitações rápidas e precisas de espécies de animais (Hebert et al. 2003a; Hebert et al. 65

2004; Hebert e Gregory 2005; Stoeckle e Hebert 2008). 66

Essa metodologia se baseia em dois principais pressupostos que mostram a eficácia do 67

código de barras de DNA: i) monofilia recíproca das espécies (Meyer e Paulay 2005) e ii) as 68

diferenças genéticas intraespecíficas que são sempre menores do que as diferenças genéticas 69

entre as espécies (divergência intraespecífica 10x maior do que a divergência interespecífica) 70

27

(Hebert et al 2003b; Stoeckle 2003). 71

Neste sentido, o presente estudo teve como objetivo, gerar códigos de barras de DNA 72

para as espécies e verificar a hipótese que ferramenta molecular (COI) pode discriminar e 73

delimitar as espécies de ciclídeos na bacia Amazônica. 74

75

Material e métodos 76

Amostragem 77

Foram obtidas 147 sequências do código de barras de DNA (COI) de 16 gêneros, 45 78

espécies da família Cichlidae (Tabela 1) de seis rios da bacia amazônica (Figura 1), com 79

amostragem de até cinco espécimes por espécies. Os espécimes foram coletados por meio da 80

licença do IBAMA n° 11325-1. 81

Para cada exemplar amostrado, coletou-se uma pequena amostra de tecido do 82

pedúnculo caudal ou da nadadeira peitoral esquerda. Os tecidos foram armazenados em etanol 83

a 95% até o processamento em laboratório e os vouchers foram preservados em formaldeído a 84

10% e conservados em etanol a 70%. 85

Todos os tecidos foram depositados na Coleção de Tecidos de Genética 86

Animal/CTGA–ICB/UFAM (CGEN) do Laboratório de Evolução e Genética Animal, 87

Universidade Federal do Amazonas (LEGAL/UFAM) e os vouchers foram depositados na 88

coleção de peixes do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA). 89

28

90

Figura 1. Localidades das amostragens das espécies de ciclídeos da bacia Amazônica. Os 91

números correspondem aos locais de amostragem: 1 – rio Araguaia; 2 – rio Xingu; 3 – rio 92

Tapajós; 4 – rio Purus; 5 – rio Jatapu; 6 – rio Negro. 93

94

Extração, PCR e Sequenciamento 95

O DNA foi isolado por meio do método fenol-clorofórmio (Sambrook e Russel, 2001). 96

Uma região parcial do gene mitocondrial citocromo oxidase subunidade 1 (COI) foi 97

amplificado via reação em cadeia da polimerase (PCR) com um volume final de 15 μL 98

contendo: 6,8 μL de H2O ultrapura; 1,5 μL de MgCl2 (25 mM); 1,5 μL de dNTPs (10 mM); 99

1,5 μL de tampão 10x (100mM Tris-HCl, 500mM KCl); 1,2 μL de cada primer (2 μM) 100

(Tabela 2); 0,3 μL de Taq DNA Polymerase (1 U/μL) e 1 μL de DNA (concentração variando 101

de 30 a 60 ng) em termociclador Veriti® Thermal Cycler (Applied Biosystems). 102

As condições da PCR consistiram em 35 ciclos de desnaturação a 93°C por 10 103

29

segundos, anelamento a 50°C por 35 segundos e extensão a 68°C por 1 minuto e 30 segundos. 104

A amplificação foi verificada em gel de agarose 1%, acrescido de gel red (Biotium) e 105

marcador (GeneRuler 1kb DNA Ladder). 106

Os produtos de PCR foram purificados com o kit ExoSap de acordo com as 107

recomendações do fabricante e submetido as reações de sequenciamento foi utilizado o Kit 108

Big Dye Terminator Cycle Sequencing Standart Version 3.1 (Applied Biosystems, Inc), para 109

um volume final de 10 µL por amostra, composta por: 4,4 µL de água ultrapura; 1,3 µL de 110

tampão de sequenciamento 5X; 2,0 µL primers forward (M13F -21) (2 μM) e/ou reverse 111

(M13R -27) (2 μM) (Tabela 2); 0,3 µL de BigDye Terminator v 3.1 (Applied Biosystems, 112

Foster City, CA, USA) e 2 µL de DNA purificado. 113

Os produtos resultantes dessa reação foram precipitados com etanol (100% e 70%) e 114

EDTA (125mM), em seguida ressuspendidas com 10 µL Hi-Di formamida e submetidas ao 115

sequenciador automático ABI 3130xl (Applied Biosystems Inc.). 116

117

Análises dos dados 118

As sequências foram editadas, alinhadas e traduzidas no programa Geneious v. 5.4 119

(Drummond et al. 2011). Posteriormente foram submetidas ao programa BLAST (Altschul et 120

al. 1997) para confirmação e comparação da região sequenciada com os dados disponíveis no 121

National Center for Biotechnology Information (Genbank) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) e 122

do Barcoding of Life Database (BOLD) (Ratnasingham e Hebert 2007). 123

A delimitação das espécies foi realizada pelo modelo Generalized Mixed Yule 124

Coalescent (GMYC) (Fujisawa e Barraclough 2013), no programa estatístico R versão 3.0.2 125

(R Development Core Team 2013). As espécies delimitadas pelo GMYC e as espécies 126

identificadas morfologicamente foram obtidos valores de distâncias médias intraespecíficas e 127

interespecíficas e distância par-a-par pelo método de Kimura-2-parâmetros no programa 128

30

MEGA 5.05 (Tamura et al. 2011). 129

130

Resultados 131

Foram obtidas sequências do código de barras de DNA (COI) de 16 gêneros e 45 132

espécies da família Cichlidae. Sendo que Crenicichla foi o gênero que apresentou maior 133

número de espécies (11) e os gêneros Acarichthys, Acaronia, Biotodoma, Caquetaia, Heros, 134

Laetacara, Mesonauta e Symphysodon apresentaram menores números de espécies (1) 135

analisadas (Tabela 5). 136

Foram encontradas sequências de COI no Genbank e BOLD para apenas 13 espécies, 137

sendo elas: Apistogramma agassizi, Geophagus argyrostictus, Geophagus altifrons, Heros 138

efasciatus, Symphysodon aequafasciatus, Acaronia nassa, Cichla piquiti, Acarichthys 139

heckelii, Retroculus lapidifer, Retroculus xinguensis, Satanoperca lilith, Teleocichla sp., 140

Crenicichla percna (Tabela 3). 141

Cerca de 40 espécies apresentaram monofilia, com exceção de duas espécies do gênero 142

Teleocichla (T. preta e T. cf. gephyrogramma) do rio Xingu e três espécies de Crenicichla (C. 143

jegui, C. lugubris e C. aff. strigata) do rio Araguaia, que apresentaram parafilia (Figura 2). 144

As divergências genéticas interespecíficas variaram de 0% a 17%, com média de 7% 145

entre os gêneros representados por mais de uma espécie (Tabela 5). As divergências genéticas 146

médias intraespecíficas para as espécies identificadas morfologicamente variaram de 0% a 147

8%, com média de 2%. De acordo com as identificações morfológicas, foram identificadas 45 148

espécies, sendo que 24 espécies (53,3%) apresentaram distâncias médias intraespecíficas ≤ 149

2% e 7 espécies (15,5%) tanto da mesma localidade quanto de locais diferentes foram 150

encontrados valores de divergências genéticas médias intraespecíficas >2% e separados em 151

clados pela árvore GMYC (Tabela 6 e Figura 2). 152

Para os indivíduos amostrados dentro das mesmas localidades, tem-se o exemplo da 153

31

espécie Teleocichla cinderela, amostradas nos pedrais de São Miguel e São Bento, 154

localizados no rio Araguaia, apresentaram distância média intraespecífica de 6% e pelas 155

análises GMYC apresentaram-se em diferentes clados. A espécie Geophagus argyrostictus da 156

localidade Xingu, também apresentaram distância média intraespecífica >2% e foram 157

separados em dois clados pelas análises moleculares. 158

E as espécies Apistogramma agassizi (3%), Acaronia nassa (3%), Crenicichla regani 159

(3%), Geophagus altifrons (7%) e Geophagus sp. (3%), amostrados de diferentes localidades 160

(Purus, Jatapu, Tapajós, Xingu) e com tipos de águas diferentes (branca, preta e clara), 161

também apresentaram valores de divergências genéticas médias intraespecíficas maiores que 162

2% e foram delimitados em clados de acordo com a respectiva localidade pelo modelo 163

GMYC (Figura 2). 164

Observou-se que algumas espécies identificadas pela taxonomia morfológica como 165

espécies diferentes, apresentaram valores de distâncias par-a-par menores que 2%. Como por 166

exemplo, as espécies de Cichla temensis do rio Jatapu e Cichla melaniae do rio Xingu; 167

Crenicichla lugubris, C. jegui, C. strigata do rio Araguaia; Teleocichla cf. gephyrogramma e 168

T. n sp. preta do rio Xingu, identificadas morfologicamente como duas ou mais espécies e 169

delimitadas pelo GMYC também como espécies diferentes (Figura 2), porém a distância 170

interespecífica foi de 0-2% para as duas delimitações (Tabela 9 e 10). Em outras situações o 171

modelo GMYC delimitou algumas espécies com maior número de linhagens (Tabela 8 e 9) do 172

que identificadas morfologicamente (Tabela 10), porém os valores de divergências 173

interespecíficos foram < 2%. 174

Comparando as duas ferramentas (taxonomia tradicional e molecular) neste estudo 175

para delimitar as espécies de ciclídeos, apenas nove espécies apresentaram congruência pelas 176

técnicas utilizadas na delimitação, havendo, portanto, concordância entre elas. 177

As divergências médias intra (0%) e interespecíficas (32%) foram encontradas para as 178

32

espécies identificadas molecularmente (Tabela 4), apresentando um gap cerca de 30 vezes 179

maior entre espécies do que dentro das espécies. 180

Foram identificadas de 1 a 4 linhagens biológicas entre as 45 espécies analisadas neste 181

estudo, sendo as espécies Apistogramma agassizi, Aequidens pallidus e Crenicichla regani 182

com maiores números de linhagens (4) (Tabela 8). 183

184

Discussão 185

A ictiofauna Amazônica é bastante diversa e por isso é importante conhecer essa 186

riqueza, para que seja realizado o monitoramento dos peixes comercializados que sofrem 187

riscos de extinção. Para isso é necessário práticas conservacionistas que visem uma gestão nos 188

recursos pesqueiros da região. E a técnica do código de barras de DNA pode ser utilizada para 189

identificar com precisão as espécies ameaçadas comercialmente e na descrição das espécies 190

subestimadas (Benzaquem et al. 2015; Kress et al. 2015). 191

Os ciclídeos apresentam ampla distribuição geográfica e uma grande diversidade de 192

espécies que se adaptam rapidamente em diferentes habitats, onde muitas delas ainda não 193

foram descritas (Reis et al. 2003). Além disso, o compartilhamento de haplótipos entre os 194

diferentes grupos fenotípicos das espécies (Willis et al. 2007; Farias e Hrbek 2008; Colatreli 195

et al. 2012; Willis et al. 2012a) e os complexos de espécies podem levar a subestimação dessa 196

diversidade (Albert et al. 2006; Kullander et al. 2003; Farias e Hrbek 2008). A utilização 197

somente da morfometria tradicional e contagens merísticas não é possível separar algumas 198

espécies de ciclídeos, devido aos altos níveis de sobreposição entre caracteres taxonômicos 199

(McMahan et al. 2011; Soria-Barreto et al. 2011; Mejía et al. 2015). 200

Nas análises moleculares foi possível identificar 14 espécies a mais em relação às 201

identificações morfológicas. O que corrobora com o estudo de Winterbottom et al. (2014) que 202

33

identificaram 42 espécies a mais através do código de barras de DNA em peixes do gênero 203

Trimma. 204

Os valores de distâncias para as espécies identificadas morfologicamente que 205

apresentaram valores intraespecíficos > 2% também foram delimitados em diferentes clados, 206

indicando possíveis novas espécies, tais como Apistogramma agassizi, Aequidens pallidus, 207

Acaronia nassa, Crenicichla regani, Geophaugs altifrons, Geophagus sp., Teleocichla 208

cinderela (Tabela 6 e Figura 2). 209

Para essas mesmas espécies juntamente com Mesonauta festivus, e com exceção da 210

espécie Teleocichla cinderela, provenientes de localidades diferentes (Purus, Jatapu, Tapajós 211

e Xingu) e com tipos de água diferentes (branca, preta e clara) foram delimitados em 212

diferentes clados pelo modelo GMYC (Figura 2), formando mais de uma linhagem biológica. 213

Segundo Hulsey (2009) os complexos de espécies muitas das vezes, dificultam na delimitação 214

das espécies de um grupo, pois em alguns grupos distintos aparentam pouca ou nenhuma 215

diferença fenotípica. Pereira et al. (2011a; 2011b) e Pazian et al. (2012) identificaram 216

complexos de espécies de Piabina argentea (Characidae) em águas doce neotropicais. Mejía 217

et al. (2015) utilizaram o código de barras de DNA no complexo de espécies de ciclídeos 218

Herichthys bartoni e verificaram a existência de três grupos genéticos composto por seis 219

espécies. 220

Neste estudo as espécies Apistogramma agassizi, Aequidens pallidus, Geophagus 221

argyrostictus, Cichla melaniae, Crenicichla n sp. preta e Teleocichla cinderela da mesma 222

localidade (Jatapu, Xingu e Araguaia) foram delimitados em mais de um clado (Figura 2). A 223

presença de espécies crípticas pode subestimar o número evidente de espécies existentes em 224

uma mesma localidade (Colatreli et al. 2012, Kadarusman et al. 2012). Winterbottom et al. 225

(2014) utilizaram a ferramenta molecular do código de barras de DNA e descobriram uma 226

grande diversidade oculta de peixes do Canadá. Enquanto que na região Amazônica, 227

34

Benzaquem et al. (2015) verificaram a diversidade críptica em Nannostomus (Lebiasinidae). 228

Na Amazônia, a alta diversidade críptica dentro de áreas alagadas que não apresentam 229

barreiras, proporcionam a divergência da população e o processo de especiação (Crampton 230

2008; Piggoti et al. 2011), propiciando grandes desafios para o reconhecimento das espécies 231

pelas ferramentas moleculares. 232

A bacia Amazônica é um mosaico com diferentes tipos de água conectados pelo rio 233

Amazonas. As condições hidrográficas (variáveis físicas e químicas) podem agir como 234

barreiras para o fluxo gênico para a dispersão de peixes atuando como forças seletivas que 235

propiciam a especiação alopátrica (Lovejoy e Araújo 2000; Toffoli et al. 2008; Ducan e 236

Fernandes 2010). 237

Foram observadas as distâncias médias interespecíficas, nas análises moleculares < 238

2% entre espécies diferentes, sinalizando compartilhamento de haplótipos. Os resultados 239

apontaram que duas espécies dos gêneros Teleocichla (Teleocichla preta e Teleocichla cf. 240

gephyrogramma) e três espécies de Crenicichla (Crenicichla jegui, Crenicichla lugubris e 241

Crenicichla lugubris) apresentaram parafilia. Para Meyer e Paulay (2005) as espécies 242

parafiléticas são aspectos limitantes para a ferramenta molecular discriminar as espécies. 243

Resultados semelhantes de parafilia foram encontrados por Musilová et al. (2008) para os 244

gêneros de ciclídeos Aequidens e Cichlasoma e por Toffoli et al. (2008) nas espécies de 245

arraias de água doce. 246

Quando o processo de coalescência não é suficiente para separar as espécies, ocorrem 247

às sobreposições da variação intraespecífica com a interespecífica originando espécies 248

parafiléticas, causadas pela retenção do polimorfismo ancestral ou introgressão após o 249

processo de hibridação (Hickerson et al. 2010; Avise 2004; Moritz e Cícero 2004). Esses 250

fatores podem explicar o compartilhamento de haplótipos entre as espécies de Teleocichla e 251

Crenicichla, observados neste trabalho, como também pode ter havido erro no processo de 252

35

identificação baseados em caracteres morfológicos para estas espécies. 253

Hubert et al. (2012) observaram compartilhamento de haplótipos em 8% das 190 254

espécies de peixes canadenses, suspeitando-se de que as espécies não poderiam ser separadas 255

devido à radiação recente e hibridação, ou até mesmo alguns pares de espécies com 256

sobreposição de haplótipos seriam talvez uma única espécie. 257

Para Ward et al. (2009) e Pereira et al. (2013) a radiação recente na ictiofauna 258

neotropical para diversas espécies de peixes e a hibridação podem interferir no uso correto do 259

código de barras de DNA. A delimitação das espécies de alguns gêneros da família Cichlidae 260

também tem sido problemática, devido ao compartilhamento de haplótipos de DNA 261

mitocondrial entre as espécies (Farias e Hrbek 2008; Willis et al. 2012a; Willis et al. 2012b). 262

A metodologia do código de barras de DNA é simples, cujas seqüências são obtidas a 263

partir de vários indivíduos. Os indivíduos semelhantes e relacionados são agrupados e existe 264

uma variação genética dentro e entre as espécies, no qual as distâncias genéticas entre as 265

espécies são maiores do que dentro das espécies (Damasphatra e Mallet 2006). O modelo de 266

distância Kimura-2-Parâmetros (K2P) é utilizado no nível de espécie e é o melhor modelo 267

utilizado, quando as distâncias intraespecíficas são baixas (Miyaki et al. 2001). 268

Hebert et al. 2004, propôs um limiar de 2% para delimitar as espécies através do 269

código de barras de DNA, este limite baseia-se na distribuição de valores de distância 270

genética (K2P) intra e inter-específicos. De acordo com Hebert et al. (2003), Johns e Avise 271

(1998) as divergências intraespecíficas raramente são maiores que 2%, e as divergências 272

interespecíficas para a maioria dos vertebrados são superiores a 2%. Assim, para as espécies 273

com distâncias menores que 2% podem consideradas a mesma espécie, e acima de 2% 274

consideradas como espécies diferentes. Mesmo assim, o limiar proposto por Hebert et al. 275

2004 deve ser cuidadosamente analisado para cada grupo (Ward et al. 2009). 276

O valor de 2% foi o mais utilizado para delimitar as espécies de peixes por alguns 277

36

pesquisadores (Pereira et al. 2013; Hubert et al. 2008; Ward et al. 2009; Carvalho et al. 2011), 278

portanto, para algumas espécies de ciclídeos esse limiar não foi tão eficiente, como por 279

exemplo, para as espécies de Cichla temensis do rio Jatapu e Cichla melaniae do rio Xingu 280

identificadas morfologicamente como duas espécies e delimitadas pelo GMYC também como 281

espécies diferentes, porém a distância interespecífica foi de 2%. Em outras situações o modelo 282

GMYC delimitou alguns gêneros com maior número de espécies do que identificadas 283

morfologicamente, porém os valores de divergências interespecíficos foram < 2%. Isso 284

significa que para as análises que abrange uma grande diversidade de espécies, a utilização de 285

um limiar padrão para todas elas não seja muito adequado. 286

A maioria das espécies (88,8%), foi discriminada pela ferramenta do código de barras 287

de DNA, apresentando divergência média (K2P) intraespecífica de 0% e interespecífica de 288

32%, estabelecendo um gap cerca de 30 vezes entre a variação intra e interespecífica. 289

Resultados semelhantes foram encontrados por Hubert et al. (2012) que verificaram em 290

espécies de peixes de água doce da fauna canadense uma divergência média de 27 vezes 291

maior entre as espécies do que dentro de cada espécie, com estimativas de distância (K2P) 292

média de 0,3% entre as espécies e 8,3% entre os gêneros. Ward et al. (2005) encontraram 293

0,39% e 9,93%, respectivamente para espécies de peixes australianos. Ward et al. (2009) 294

estudaram espécies de peixes marinhos e de água doce, encontraram distância média 295

intraespecífica para as 294 espécies no valor de 0,35%, enquanto que a média interespecífica 296

foi 8,11%. 297

Como a monofilia recíproca é um critério para a efetividade do código de barras de 298

DNA (Meyer e Paulay, 2005), as espécies que formaram clados reciprocamente monofiléticos 299

puderam ser identificadas utilizando esta ferramenta, no qual se pôde verificar a sua eficiência 300

em quase 90% das espécies utilizadas neste estudo. Peixes de água doce e salgada têm sido 301

facilmente identificados usando o código de barras, com 60-98% das espécies exibindo clados 302

37

monofiléticos (Hubert et al. 2008; Steinke et al. 2009; Mccusker et al. 2012; Young et al. 303

2013; Paz et al. 2014) 304

De acordo com Hebert et al. (2002) o código de barras de DNA atribui corretamente 305

até mesmo os táxons poucos amostrados aos seus respectivos filo ou ordem, e também 306

demonstra as atribuições a nível de espécie. Atualmente, com a aplicação dessa ferramenta em 307

diversos trabalhos, construiu-se uma biblioteca para o armazenamento dos resultados dos 308

códigos de barras para facilitar no conhecimento da biodiversidade (Savolainen et al. 2005; 309

Hebert et al. 2010), esse banco de dados, denominado Sistema de Dados do Código de Barras 310

da Vida (BOLD) auxilia na aquisição, armazenamento, análise e publicação de códigos de 311

barras de DNA (Ratnasingham e Hebert 2007). 312

Do total (59) de espécies identificadas pela ferramenta molecular, apenas 28,8% 313

apresentaram sequências de código de barras de DNA depositadas no banco de dados do 314

BOLD e Genbank (Tabela 3), o que significa que existem poucas sequências do código de 315

barras de DNA de ciclídeos depositadas nesses bancos de dados, podendo está relacionado 316

com a falta de estudos moleculares com as espécies de peixes da Amazônia. 317

Comparando os resultados morfológicos e moleculares, observou-se que apenas nove 318

espécies foram identificadas corretamente por ambas as metodologias. Baldwin et al. (2011) 319

combinaram dados moleculares de COI e morfológicos para analisar espécimes de Starksia no 320

Atlântico ocidental e verificaram que existe incongruência entre as duas ferramentas de 321

identificação, porém as linhagens genéticas são reconhecidos como espécies se forem 322

suportado pela morfologia. Ping et al. (2015) utilizaram as ferramentas morfológicas e 323

moleculares (COI) e observaram duas linhagens separadas de Nemipterus japonicus, isolados 324

geograficamente no sul da China. 325

326

327

38

Conclusão 328

Esse estudo foi o primeiro a examinar um grande número de gêneros (15) 329

representados por diversas espécies de ciclídeos em seis rios da bacia Amazônica. 330

Pôde-se verificar a eficiência da técnica do código de barras de DNA em discriminar 331

aproximadamente 90% das espécies analisadas, revelando uma diversidade oculta relacionada 332

à presença de complexo de espécies e espécies crípticas. A descoberta das diferentes espécies 333

crípticas é possível conhecer as principais espécies de ciclídeos que podem estar sendo 334

comercializados sem ao menos serem descritas, além de auxiliar novas pesquisas 335

morfológicas, verificando as diferenças sutis que as espécies apresentam. 336

A obtenção dos códigos de barras de DNA para as espécies da família Cichlidae 337

proporcionará contribuições importante sobre a ictiofauna Amazônica, para os bancos de 338

dados do BOLD e na Campanha FISH-BOL. 339

340

Agradecimentos 341

Esta pesquisa faz parte do projeto da rede SISBIOTA/Rede BIOPHAM (Sistema 342

Nacional de Pesquisa em Biodiversidade/Rede de pesquisa para ampliação do conhecimento 343

sobre a biodiversidade de vertebrados da Amazônia brasileira com aplicações sobre seu uso e 344

conservação) com apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do 345

Amazonas (FAPEAM) e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico 346

(CNPq), sob a coordenação de I. P. Farias. A permissão para realizar o trabalho de campo e 347

para a coleta de amostras de tecido foi concedida pelo IBAMA (Licença nº 11325-1). 348

Agradecemos os especialistas Ph. D. Lúcia Helena Rapp Py-Daniel e D. Jansen Alfredo 349

Sampaio Zuanon, do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia e os demais colaboradores 350

que auxiliaram no processo de coleta e identificações morfológicas. Aos colegas de 351

Laboratório de Genética Animal da Universidade Federal do Amazonas (UFAM) que 352

39

ajudaram nas análises laboratoriais e nas correções do manuscrito. Este artigo constitui uma 353

parte da Dissertação de Mestrado do Programa de Genética, Conservação e Biologia 354

Evolutiva do INPA / UFAM. 355

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CONSIDERAÇÕES FINAIS 554

555

Os fatores ecológicos e históricos que ocorreram na bacia Amazônica proporcionaram 556

a especiação, onde atualmente ainda não é possível saber a verdadeira diversidade de peixes 557

existentes nos rios amazônicos por causa espécies crípticos. 558

As espécies crípticas de ciclídeos foram descobertas nesta pesquisa pelo código de 559

barras de DNA, no qual estavam sendo negligenciadas, porque não era possível separá-las 560

baseadas apenas em caracteres morfológicos. 561

Algumas espécies da família Cichlidae não são monofiléticas e apresentam taxonomia 562

mal resolvida. E o compartilhamento de haplótipos para algumas espécies está relacionado 563

aos processos de irradiação recente que ocasionam a retenção do polimorfismo ancestral ou 564

introgressão após o processo de hibridação. Essas características dificultam na eficácia do 565

código de barras de DNA na identificação e delimitação das espécies de maneira precisa. 566

As sequências obtidas, a partir do código de barras de DNA de várias espécies de 567

ciclídeos, irão contribuir positivamente no banco de dados do BOLD e FISH-BOL, auxiliando 568

na identificação dessas espécies por pesquisadores e não-especialistas em todo o mundo. 569

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R. E.; Baird, D. J.; Richard, B.; Phillips, I.; Hebert, P. D. N. 2012. A DNA Barcode Library 848

for North American Ephemeroptera: Progress and Prospects. PLoS ONE, 7 (5): 1-6. 849

850

Website for the Consortium for the Barcode of Life (CBOL) (www.barcoding.si.edu). 851

Acesso: 20/09/2012. 852

853

Wiemers, M.; Fiedler, K. 2007. Does the DNA barcoding gap exist? – a case study in blue 854

butterflies (Lepidoptera: Lycaenidae). Frontiers in Zoology, 4(8): 1-16. 855

856

Will, K. W.; D. Rubinoff. 2004. Myth of the molecule: DNA barcodes for species cannot 857

replace morphology for identification and classification. Cladistics, 20:47–55. 858

859

Will, K. W.; Mishler, B. D.; Wheeler, Q. D. 2005. The Perils of DNA Barcoding and the 860

Need for Integrative Taxonomy. Syst. Biol. 54(5):844–851. 861

862

Willis S. C., Macrander J., Farias I. P. & Ortí G. 2012. Simultaneous delimitation of species 863

and quantification of interspecific hybridization in Amazonian peacock cichlids (genus 864

Cichla) using multi-locus data. BMC Evolutionary Biology, 12: 96. 865

866

Willis S. C., Nuñes M. S., Montaña C. G., Farias I. P. & Lovejoy N. R. 2007. Systematics, 867

biogeography, and evolution of the Neotropical peacock basses Cichla (Perciformes: 868

Cichlidae). Molecular Phylogenetics and Evolution, 44: 291–307. 869

870

Junk, W. J.; Piedade, M. T. F.; Schöngart, J.; Wittmann, F. A classification of major natural 871

habitatis of Amazonian white-water river floodplains (várzeas). Wetlands Ecology and 872

Management (2012) 20:461–475. 873

874

57

Junk, W. J.; Piedade, M. T. F.; Schöngart, J.; Wittmann, F, Cohn-Haft, M.; Adeney, J. M.; 875

Wittmann, F. A Classification of Major Naturally-Occurring Amazonian Lowland Wetlands. 876

Wetlands (2011) 31:623–640. 877

878

879

880

59

ANEXO A 881

882

Tabela 1. Nomes das 148 espécies, baseadas nas identificações morfológicas, que foram analisadas no presente estudo. 883

Espécie Localidade ID Número

CTGA

ID Número

do Voucher

Aequidens michaeli Arara, banco direito do Iriri, Rio Iriri, Xingu CTGA_1754 30954

Aequidens michaeli Cachoeira do Jericoá, Xingu CTGA_11191

Aequidens pallidus Pedral, borda da ressaca, Jatapu CTGA_100496 37196

Aequidens pallidus Igarapé do Santo Amaro, margem direita do rio Jatapu CTGA_100513 37166

Aequidens pallidus Igarapé do Santo Amaro, margem direita do rio Jatapu CTGA_100514 37166

Aequidens pallidus Igarapé 2, na margem esquerda do rio Jatapu CTGA_100240 37105

Aequidens pallidus Igarapé extra, próx. igarapé Central, Trilha central (Aiuanã), Rio Negro CTGA_105155 42363

Aequidens pallidus Igarapé extra, próx. igarapé Central, Trilha central (Aiuanã), Rio Negro CTGA_105156 42363

Aequidens cf. eape Igarapé Barreirinha, margem esquerda do rio Tapajós CTGA_104548 41457

Apistogramma sp. Rio Iriri, com 4 horas baixo boca do Rio Novo, Xingu CTGA_2031 31132

Apistogramma aff. Staecki Igarape 2, km 4 da trilha da esquerda, Lago da Velha, margem direita do rio

Jatapu

Apistogramma agassizi Igarapé dos Mutuns, Ipixuna, rio Purus CTGA_103206 42054

Apistogramma agassizi Igarapé dos Mutuns, Ipixuna, rio Purus CTGA_103207 42054

Apistogramma agassizi Igarapé dos Mutuns, Ipixuna, rio Purus CTGA_103208 42054

60

Apistogramma agassizi Igarapé dos Mutuns, Ipixuna, rio Purus CTGA_103209 42054

Apistogramma agassizi Igarapé dos Mutuns, Ipixuna, rio Purus CTGA_103210 42054

Apistogramma agassizi Igarapé Barreirinha, margem esquerda do rio Tapajós CTGA_104507 41464

Apistogramma agassizi Igarape 4, 300m da trilha da esquerda, Lago da Velha, margem direita do rio

Jatapu, bacia do baixo rio Uatumã

CTGA_100264 37404

Apistogramma agassizi Igarape 4, 300m da trilha da esquerda, Lago da Velha, margem direita do rio

Jatapu, bacia do baixo rio Uatumã

CTGA_100265 37404

Apistogramma agassizi Igarape do Monte Negro (Ig. 3 margem direita), afluente do rio Jatapu. CTGA_100539 37293

Apistogramma agassizi Igarape 2 acima do Tabocal, margem esquerda do rio Jatapu CTGA_100608 39064

Apistogramma agassizi Margem direita a montante da Vila de Sao Jose do Jabote CTGA_100581 39049

Apistogramma agassizi Igarape 4, 300m da trilha da esquerda, Lago da Velha, margem direita do rio

Jatapu, bacia do baixo rio Uatumã

CTGA_100263 37404

Apistogramma agassizi Igarape 4, 300m da trilha da esquerda, Lago da Velha, margem direita do rio

Jatapu, bacia do baixo rio Uatumã

CTGA_100266 37404

Apistogramma agassizi Igarape 4, 300m da trilha da esquerda, Lago da Velha, margem direita do rio

Jatapu, bacia do baixo rio Uatumã

CTGA_100256 37404

Apisotgramma pertensis Igarapé 2, na margem esquerda do rio Jatapu CTGA_100550 37116

Apisotgramma pertensis Igarape do Monte Negro (Ig. 3 margem direita), afluente do rio Jatapu CTGA_100538 37301

Apisotgramma pertensis Igarapé 2, na margem esquerda do rio Jatapu CTGA_100551 37116

Apisotgramma pertensis Igarapé 2, na margem esquerda do rio Jatapu CTGA_100552 37116

Apisotgramma pertensis Igarapé do Monte Negro (Ig. 3 margem direita), afluente do rio Jatapu CTGA_100527 37293

61

Apisotgramma pertensis Igarapé do Monte Negro (Ig. 3 margem direita), afluente do rio Jatapu CTGA_100526 37293

Apistogramma gr. Brevis Igarapé do Espinho, Trilha esquerda CTGA_105145 38866

Apistogramma gr. Brevis Igarapé do Espinho, Trilha esquerda CTGA_105147 38866

Apistogramma pulchra Igarapé dos Mutuns, Ipixuna, rio Purus CTGA_103261 42055

Apistogramma pulchra Igarapé dos Mutuns, Ipixuna, rio Purus CTGA_103262 42055

Apistogramma pulchra Igarapé dos Mutuns, Ipixuna, rio Purus CTGA_103259 42055

Apistogramma pulchra Igarapé dos caetanos, Ipixuna, rio Purus CTGA_103591 42096

Apistogramma pulchra Igarapé dos caetanos, Ipixuna, rio Purus CTGA_103594 42096

Acarichthys heckelii Pedral próximo ao lago da Velha, rio Jatapu CTGA_100690 37322

Acarichthys heckelii Pedral próximo ao lago da Velha, rio Jatapu CTGA_100706 37322

Acarichthys heckelii Pedral próximo ao lago da Velha, rio Jatapu CTGA_100689 37322

Acarichthys heckelii Igarapé Cotó, comunidade de Cametá CTGA_104304 41369

Acaronia nassa Igarapés dos Mutuns, Ipixuna, rio Purus CTGA_103246 42053

Acaronia nassa Igarapé Barreirinha, rio Tapajós CTGA_104553

Biotodoma cupido Flona Ipixuna, rio Ipixuna, boca do lago Gaivota, rio Purus CTGA_104096 42244

Caquetaia spectabilis Rio Xingu (Santo Antônio) CTGA_11394

Caquetaia spectabilis Rio Xingu (Santo Antônio) CTGA_11435

Crenicichla n. sp. Laranja Ilha do Curapé, rio Iriri, Xingu CTGA_1844 30780

Crenicichla n. sp. Laranja Praia rochosa no banco esquerdo, rio Iriri, Xingu CTGA_1788 30902

Crenicichla n. sp. Laranja Praia rochosa no banco esquerdo, rio Iriri, Xingu CTGA_1802 30902

Crenicichla n. sp. Laranja Ilha do Curapé, rio Iriri, Xingu CTGA_1843 30780

62

Crenicichla percna Barinha, cachoeiras no meio do canal, rio Iriri, Xingu CTGA_1889 30929

Crenicichla aff. Inpa Boca do rio Novo, Xingu CTGA_1958 31034

Crenicichla sp.1 Vila de Sta. Izabel, rio Araguaia, Pará CTGA_2852

Crencichla jegui Vila de Sta. Izabel, rio Araguaia, Pará CTGA_2853

Crenicichla lugubris Vila de Sta. Izabel, rio Araguaia, Pará CTGA_2862

Crenicichla lugubris Vila de Sta. Izabel, rio Araguaia, Pará CTGA_2863

Crenicichla astroblepa Pedral São Miguel, rio Araguaia CTGA_2970

Crenicichla astroblepa Pedral São Miguel, rio Araguaia CTGA_3069

Crenicichla astroblepa Pedral Rebojo, rio Araguaia CTGA_3417

Crenicichla astroblepa Araguatins, Tocantins CTGA_3093

Crenicichla aff strigata Pedral Rebojo, rio Araguaia CTGA_3409

Crenicichla n. sp. Preta Rio Xingu (área 03) CTGA_11096

Crenicichla n. sp. Preta Rio Xingu (área 03) CTGA_11097

Crenicichla n. sp. Preta Cachoeira do Jericoá, rio Xingu CTGA_11189

Crenicichla n. sp. Preta Cachoeira do Jericoá, rio Xingu CTGA_11197

Crenicichla n. sp. Preta Cachoeira do Espelho, rio Xingu CTGA_2100 31003

Crenicichla n. sp. Xingu Rio Xingu (área 04) CTGA_11136

Crenicichla sp. Xingu Rio Xingu (área 04) CTGA_11137

Crenicichla sp. Xingu Rio Xingu (área 04) CTGA_11138

Crenicichla sp. Xingu Rio Xingu (área 04) CTGA_11139

Crenicichla sp. Xingu Rio Xingu (Praia do caju) CTGA_11233

63

Crenicichla sp. Xingu Rio Xingu (Corredeira a jusante da Cachoeira de Belo Monte) CTGA_11425

Crenicichla regani Igarapé 4, 300m da trilha da esquerda, Lago da Velha, margem direita do rio

Jatapu

CTGA_100258 37401

Crenicichla regani Rio Jatapu. Braço do Igarapé 2 CTGA_100350

Crenicichla regani Flona Ipixuna, rio Ipixuna, comunidade Mutum, tonco CTGA_104101 41923

Crenicichla regani Flona Ipixuna, rio Ipixuna, comunidade Mutum, tonco CTGA_104100 41923

Crenicichla regani Igarapé no acesso para as trilhas da comunidade de Cametá CTGA_104256

Crenicichla regani Igarapé Jutuarana CTGA_104806 41321

Crenicichla regani Rio Xingu (Santo Antônio) CTGA_11391

Cichla melaniae Rio Xingu (Praia do caju) CTGA_11230

Cichla melaniae Rio Xingu (Corredeira a jusante da Cachoeira de Belo Monte) CTGA_11430

Cichla melaniae Rio Xingu (Praia do caju) CTGA_11231

Cichla melaniae Rio Xingu (Praia do caju) CTGA_11232

Cichla melaniae Rio Xingu (Praia do caju) CTGA_11228

Cichla melaniae Rio Iriri, Xingu CTGA_11058

Cichla melaniae Rio Xingu (Praia do caju) CTGA_11229

Cichla mirianae pitanga Rio Xingu (jusante de Belo Monte) CTGA_11433

Cichla mirianae pitanga Rio Xingu (jusante de Belo Monte) CTGA_11434

Cichla temensis Igarapé 3, na margem esquerda do rio Jatapu CTGA_100336 37155

Cichla temensis Igarapé 3, na margem esquerda do rio Jatapu CTGA_100334 37155

Cichla temensis Igarapé 3, na margem esquerda do rio Jatapu CTGA_100335 37155

64

Cichla piquiti Pedral Remanso dos Botos CTGA_3060

Geophagus altifrons Pedral Cachoeira do Zé dos gatos CTGA_2744

Geophagus altifrons Flona Ipixuna, rio Ipixuna, boca do lago Gaivota, Purus CTGA_104036 42247

Geophagus argyrostictus Rio Xingu (Praia do caju) CTGA_11350

Geophagus argyrostictus Rio Xingu (Praia do caju) CTGA_11240

Geophagus argyrostictus Rio Xingu (Praia do caju) CTGA_11351

Geophagus argyrostictus Rio Bacajá, Xingu CTGA_11312

Geophagus argyrostictus Rio Iriri, Xingu CTGA_11059

Geophagus argyrostictus Rio Iriri, Xingu CTGA_11060

Geophagus argyrostictus Rio Iriri, Xingu CTGA_11061

Geophagus sp. Boca do Irirí, Rio Iriri na confluência com Rio Xingu CTGA_1651 30852

Geophagus sp. Praia em frente a comunidade de Cametá, Tapajós CTGA_104694 41518

Geophagus sp. Praia em frente a comunidade de Cametá, Tapajós CTGA_104696 41518

Geophagus sp. Praia em frente à com. Itapuama, Tapajós CTGA_104996 41526

Geophagus proximus Em frente à comunidade Cametá, Tapajós CTGA_104573 41272

Geophagus proximus Em frente à comunidade Cametá, Tapajós CTGA_104574 41272

Geophagus proximus Em frente à comunidade Cametá, Tapajós CTGA_104576 41272

Heros efasciatus Rio Xingu (Santo Antônio) CTGA_11397

Heros efasciatus Rio Xingu (Santo Antônio) CTGA_11398

Heros efasciatus Rio Xingu (Santo Antônio) CTGA_11399

Heros efasciatus Rio Xingu (Santo Antônio) CTGA_11400

65

Heros efasciatus Pedral próximo ao lago da Velha CTGA_100685 37323

Heros efasciatus Pedral próximo ao lago da Velha CTGA_100692 37323

Heros efasciatus Pedral próximo ao lago da Velha CTGA_100704 37323

Heros efasciatus Pedral próximo ao lago da Velha CTGA_100705 37323

Heros efasciatus Pedral próximo ao lago da Velha CTGA_100716 37323

Laetacara araguaiae Praia em frente à comunidade Cametá, margem esquerda do rio Tapajós CTGA_104891 41146

Mesonauta festivus Igarapé Barreirinha, Tapajós CTGA_104529

Mesonauta festivus Igarapé Anduru, margem esquerda do rio Tapajós CTGA_104595 41254

Mesonauta festivus Pedral próximo ao lago da Velha CTGA_100732 37324

Mesonauta festivus Ressaca do Jatapu CTGA_100680 37241

Mesonauta festivus Ressaca do Jatapu CTGA_100681 37241

Retroculus lapidifer Araguatins,Tocantins CTGA_3178

Retroculus lapidifer Araguatins,Tocantins CTGA_3179

Retroculus lapidifer Araguatins,Tocantins CTGA_3180

Retroculus xinguensis Barinha, cachoeiras no meio do canal, Rio Iriri, Xingu CTGA_1903 30948

Retroculus xinguensis Rio Xingu (Praia do caju) CTGA_11235

Satanoperca jurupari Araguatins,Tocantins CTGA_3174

Satnoperca sp. Boca do Irirí, Rio Iriri na confluência com Rio Xingu CTGA_1700 30887

Satnoperca sp. Boca do Irirí, Rio Iriri na confluência com Rio Xingu CTGA_1703 30887

Satanoperca lilith Ressaca do Jatapu CTGA_100670 37267

Satanoperca lilith Ressaca do Jatapu CTGA_100418 37211

66

884

885 886 887

888

889

890

891

892

Satanoperca lilith Pedral, borda da ressaca Jatapu CTGA_100485 37437

Symphysodon aequafasciatus Rio Xingu (Santo Antônio) CTGA_11437

Symphysodon aequafasciatus Rio Xingu (Santo Antônio) CTGA_11439

Symphysodon aequafasciatus Rio Xingu (Santo Antônio) CTGA_11440

Teleocichla sp. Pedral Remanso dos Botos CTGA_3000

Teleocichla n. sp. Preta Cachoeira do Espelho, Rio Xingu CTGA_2064 31019

Teleocichla n. sp. Preta Cachoeira do Espelho, Rio Xingu CTGA_2102 31019

Teleocichla n. sp. Preta Cachoeira do Espelho, Rio Xingu CTGA_2103 31019

Teleocichla n. sp. Preta Cachoeira do Espelho, Rio Xingu CTGA_2104 31019

Teleocichla cf. gephyrogramma Rio Xingu (Cachoeira do Jericoá) CTGA_11190

Teleocichla cinderela Pedral São Miguel, Araguaia CTGA_2975

Teleocichla cinderela Pedral São Miguel, Araguaia CTGA_2976

Teleocichla cinderela Pedral Rebojo, Araguaia CTGA_3094

67

Tabela 2. Nome e referências das sequencias dos primers usados na amplificação e sequenciamento no presente estudo. 893

894

Gene Primer Primer sequence 5’ - 3’ Referências

CO1

VF2 5’gtaaaacgacggccagtCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC3’

Ivanova et al., 2007 FishF2 5’gtaaaacgacggccagtCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC3’

FishR2 5’caggaaacagctatgacTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA3’

VR1d 5’caggaaacagctatgacCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA3’

CO1

M13F (-21) TGTAAAACGACGGCCAGT Messing, 1983

M13R (-27) CAGGAAACAGCTATGAC

895 896 897 898 899 900 901 902 903 904 905 906 907 908 909 910 911 912

68

913 914 915 916 917 918 919 920 921 922 923 924 925 926 927 928 929 930 931 932 933 934 935 936 937 938 939 940 941 942 943 944 945 946 947 948 949 950 951 952 953 954 955 956 957 958 959

69

960 961 962 963 964 965 966 967 968 969 970 971 972 973 974 975 976 977 978 979 980 981 982 983 984 985 986 987 988 989 990 991 992 993 994 995 996 997 998 999 1000 1001 1002 1003 1004 1005 1006 1007 1008 1009

70

1010 1011 1012 1013 1014 1015 1016 1017 1018 1019 1020 1021 1022 1023 1024 1025 1026 1027 1028 1029 1030 1031 1032 1033 Figura 2. Árvore com as espécies delimitadas pelo modelo GMYC, construídas a partir de 1034

147 sequências de código de barras de DNA. 1035

1036

1037 1038 1039 1040 1041 1042 1043 1044 1045 1046 1047 1048 1049 1050 1051 1052 1053 1054 1055 1056 1057 1058

71

Tabela 3. Número de espécies que foram identificadas pelo banco de dados online 1059

BOLD (Barcode of life) e NCBI (National Center Biotechnology Information). 1060

1061

1062

1063

1064

1065

1066

1067

1068

1069

1070

1071

1072

1073

1074

Tabela 4. Valores médios das divergências intraespecífica e interespecífica do gene COI 1075

(divergência mínima, média e máxima) das 147 sequências obtidas pelo método de Kimura-2-1076

parâmetros. 1077

Dados Moleculares N Div. mínima Div. média Div. máx.

Intraespecífica 147 0,0 0,0 0,01

Interespecífica 147 0,0 0,32 0,55

1078

1079

1080

1081

1082

1083

Família Espécies Número de

espécimes BOLD NCBI

Cichlidae Apistogramma agassizi 14 7

Cichlidae Geophagus argyrostictus 7 7

Cichlidae Geophagus altifrons 2 1

Cichlidae Heros efasciatus 9 9

Cichlidae Symphysodon aequafasciatus 3 3

Cichlidae Acaronia nassa 2 2

Cichlidae Cichla piquiti 1 1

Cichlidae Acarichthys heckelii 4 4

Cichlidae Retroculus lapidifer 3 3

Cichlidae Retroculus xinguensis 2 2

Cichlidae Satanoperca lilith 3 3

Cichlidae Teleocichla sp. 1 1

Cichlidae Crenicichla percna 1 1

TOTAL 13 52 38 8

72

Tabela 5. Porcentagem média da distância intraespecífica (K2P) entre os genêros de Ciclídeos 1084

amazônicos representados por mais que uma espécie. 1085

Gênero Número de

gêneros

% média da

distância

intraespecífica

Aequidens 3 11%

Apistogramma 6 17%

Acarichthys 1 0%

Acaronia 1 3%

Biotodoma 1 N/A

Caquetaia 1 0%

Crenicichla 11 17%

Cichla 4 3%

Geophagus 4 6%

Heros 1 0%

Laetacara 1 N/A

Mesonauta 1 1%

Retroculus 2 5%

Satanoperca 3 15%

Symphysodon 1 0%

Teleocichla 4 13%

1086 1087 1088

1089

1090

Tabela 6. Porcentagem média da distância intraespecífica (K2P) para as espécies de ciclídeos 1091

classificados morfologicamente e representados por mais de um espécime. 1092

Espécie

Número de

espécimens

analisadas

% média da

distância

intraespecífica

Aequidens michaeli 2 0%

Aequidens pallidus 6 8%

Aequidens cf. eape 1 N/A

Apistogramma sp. 1 N/A

Apistogramma aff. staecki 1 N/A

Apistogramma agassizi 14 3%

Apisotgramma pertensis 6 0%

Apistogramma gr. brevis 2 1%

73

Apistogramma pulchra 5 0%

Acarichthys heckelii 4 0%

Acaronia nassa 2 3%

Biotodoma cupido 1 N/A

Caquetaia spectabilis 2 0%

Crenicichla n. sp. laranja 4 0,2%

Crenicichla percna 1 N/A

Crenicichla aff. inpa 1 N/A

Crenicichla sp.1 1 N/A

Crencichla jegui 1 N/A

Crenicichla lugubris 2 0%

Crenicichla astroblepa 4 0%

Crenicichla aff strigata 1 N/A

Crenicichla n. sp. preta 5 1%

Crenicichla sp. xingu 6 0,2%

Crenicichla regani 7 3%

Cichla melaniae 7 1%

Cichla mirianae pitanga 2 0%

Cichla temensis 3 0%

Cichla piquiti 1 N/A

Geophagus altifrons 2 7%

Geophagus argyrostictus 7 0,3%

Geophagus sp. 4 3%

Geophagus proximus 3 0,5%

Heros efasciatus 9 0%

Laetacara araguaiae 1 N/A

Mesonauta festivus 5 1%

Retroculus lapidifer 3 0,2%

Retroculus xinguensis 2 0%

Satanoperca jurupari 1 N/A

Satnoperca sp. 2 0%

Satanoperca lilith 3 0,2%

Symphysodon aequafasciatus 3 0,2%

Teleocichla sp. 1 N/A

Teleocichla n. sp. preta 4 0,1%

Teleocichla cf. gephyrogramma 1 N/A

Teleocichla cinderela 3 6%

1093 1094 1095 1096 1097 1098 1099 1100

74

Tabela 7. Porcentagem média da distância intraespecífica (K2P) para as espécies de ciclídeos 1101

classificados molecularmente e representados por mais de um espécime. 1102

1103

Espécie

Número de

espécimens

analisadas

% média da

distância

intraespecífica

Aequidens michaeli 2 0%

Aequidens pallidus_JAT3 1 N/A

Aequidens pallidus_JAT1 2 0%

Aequidens pallidus_JAT2 1 N/A

Aequidens pallidus_RN 2 0%

Aequidens cf. eape 1 N/A

Apistogramma sp. 1 N/A

Apistogramma aff staecki 1 N/A

Apistogramma agassizi_JAT1 3 0%

Apistogramma agassizi_JAT2 5 0.3%

Apistogramma agassizi_PUR 5 0.3%

Apistogramma agassizi_TAP 1 N/A

Apistogramma pertensis_JAT 6 0%

Apistogramma gr brevis_RN 2 0.5%

Apistogramma pulchra_PUR 5 0%

Acarichthys heckelli_JAT_TAP 4 0%

Acaronia nassa_PUR 1 N/A

Acaronia nassa_TAP 1 N/A

Biotodoma cupido 1 N/A

Caquetaia spectabilis 2 0%

Crenicichla n. sp. laranja 4 0.2%

Crenicichla percna 1 N/A

Crenicichla aff. Inpa 1 N/A

Crenicichla sp1 1 N/A

Crenicichla lugubris 4 0%

Crenicichla astroblepa 4 0%

Crenicichla n sp preta 5 1%

Crenicichla sp xingu_XIN 6 0%

Crenicichla regani_XIN 1 N/A

Crenicichla regani_JAT 2 0%

Crenicichla regani_PUR 2 0.3%

Crenicichla regani_TAP 2 0.3%

Cichla melaniae_XIN2 3 0%

Cichla melaniae_XIN1 4 0%

Cichla mirianae pitanga 2 0%

Cichla temensis 3 0%

75

Cichla piquiti 1 N/A

Geophagus altifrons_ARA 1 N/A

Geophagus altifrons_PUR 1 N/A

Geophagus argyrostictus_XIN2 4 0%

Geophagus argyrostictus_XIN1 3 0%

Geophagus sp_TAP 3 0.5%

Geophagus sp_XIN 1 N/A

Geophagus proximus_TAP 2 0.5%

Heros efasciatus_XIN_JAT 9 0%

Laetacara araguaiae_TAP 1 N/A

Mesonauta festivus_TAP 2 0.3%

Mesonauta festivus_JAT 3 0.4%

Retroculus lapidifer 3 0.2%

Retroculus xinguensis 2 0%

Satanoperca jurupari 1 N/A

Satanoperca sp. 2 0%

Satanoperca lilith 3 0.2%

Symphysodon aequafasciatus 3 0.2%

Teleocichla sp. 1 N/A

Teleocichla n. sp. preta 5 0.3%

Teleocichla cinderela_ARA1 1 N/A

Teleocichla cinderela_ARA2 1 N/A

Teleocichla cinderela_ARA3 1 N/A

1104 1105 1106 Tabela 8. Número de linhagens biológicas encontradas para cada espécie de ciclídeos na Bacia 1107

Amazônica. 1108

1109

Família Espécies Número de linhagens

Cichlidae Apistogramma agassizi 4

Cichlidae Apistogramma sp. 1

Cichlidae Apistogramma pertensis 1

Cichlidae Apistogramma pulchra 1

Cichlidae Apistogramma gr. brevis 1

Cichlidae Apistogramma aff. staecki 1

Cichlidae Biotodoma cupido 1

Cichlidae Geophagus argyrostictus 2

Cichlidae Geophagus altifrons 2

Cichlidae Geophagus proximus 1

Cichlidae Geophagus sp. 2

Cichlidae Caquetaia spectabilis 1

Cichlidae Heros efasciatus 1

76

Cichlidae Symphysodon aequafasciatus 1

Cichlidae Mesonauta festivus 2

Cichlidae Laetacara araguaiae 1

Cichlidae Acaronia nassa 2

Cichlidae Cichla melaniae 2

Cichlidae Cichla piquiti 1

Cichlidae Cichla temensis 1

Cichlidae Cichla mirianae pitanga 1

Cichlidae Acarichthys heckelii 1

Cichlidae Aequidens cf. epae 1

Cichlidae Aequidens pallidus 4

Cichlidae Aequidens michaeli 1

Cichlidae Retroculus lapidifer 1

Cichlidae Retroculus xinguensis 1

Cichlidae Satanoperca jurupari 1

Cichlidae Satanoperca sp. 1

Cichlidae Satanoperca lilith 1

Cichlidae Teleocichla cf. gephyrogramma 1

Cichlidae Teleocichla n. sp. preta -

Cichlidae Teleocichla sp. 1

Cichlidae Teleocichla cinderela 3

Cichlidae Crenicichla regani 4

Cichlidae Crenicichla aff. inpa 1

Cichlidae Crenicichla percna 1

Cichlidae Crenicichla sp. preta 2

Cichlidae Crenicichla sp. xingu 1

Cichlidae Crenicichla jegui 1

Cichlidae Crenicichla lugubris -

Cichlidae Crenicichla strigata -

Cichlidae Crenicichla n. sp. laranja 1

Cichlidae Crenicichla astroblepa 1

Cichlidae Crenicichla sp. 1 1

TOTAL 45 60

1110 1111 1112 1113 1114 1115 1116 1117 1118 1119

77

Tabela 9. Distância média da distância interespecífica (K2P) para as espécies de ciclídeos delimitados molecularmente pelo modelo Generalized Mixed 1120

Yule Coalescent (GMYC). 1121

1122

Aeq

_m

icha

eli_

XIN

Aeq

_p

all

idu

s_JA

T3

Aeq

_p

all

idu

s_JA

T1

Aeq

_p

all

idu

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T2

Aeq

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idu

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N

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TA

P

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XIN

Ap_

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T

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aga

ssiz

i_JA

T1

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aga

ssiz

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T2

Ap_

aga

ssiz

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aga

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Ap_

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ten

sis_

JAT

Ap_

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bre

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RN

Ap_

pu

lchra

_P

UR

Aca

_h

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lli_

JAT

_T

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Ac_

na

ssa_

PU

R

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na

ssa_

TA

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Bio

_cu

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o_P

UR

Caq_

spec

tab

ilis

_X

IN

Cr_

n_

sp_

lara

nja

_X

IN

Cr_

per

cna_

XIN

Cr_

aff

_in

pa_

XIN

Cr_

sp1

_A

RA

Cr_

lugu

bri

s_A

RA

Aeq_michaeli_XIN

Aeq_pallidus_JAT3 0.15

Aeq_pallidus_JAT1 0.10 0.12

Aeq_pallidus_JAT2 0.16 0.01 0.11

Aeq_pallidus_RN 0.15 0.06 0.11 0.07

Aeq_cf_eape_TAP 0.15 0.20 0.14 0.20 0.16

Ap_sp_XIN 0.34 0.32 0.35 0.32 0.30 0.37

Ap_aff_staecki_JAT 0.39 0.36 0.39 0.37 0.37 0.36 0.22

Ap_agassizi_JAT1 0.37 0.40 0.38 0.41 0.39 0.37 0.26 0.19

Ap_agassizi_JAT2 0.36 0.39 0.37 0.40 0.38 0.38 0.26 0.19 0.00

Ap_agassizi_PUR 0.34 0.35 0.36 0.37 0.33 0.33 0.25 0.21 0.06 0.06

Ap_agassizi_TAP 0.36 0.36 0.36 0.37 0.35 0.37 0.27 0.19 0.04 0.04 0.03

Ap_pertensis_JAT 0.36 0.39 0.40 0.41 0.38 0.39 0.24 0.20 0.22 0.23 0.24 0.22

Ap_gr_brevis_RN 0.37 0.34 0.35 0.35 0.35 0.37 0.29 0.20 0.24 0.24 0.21 0.21 0.25

Ap_pulchra_PUR 0.37 0.41 0.39 0.41 0.39 0.39 0.27 0.19 0.25 0.25 0.27 0.27 0.17 0.27

Aca_heckelli_JAT_TAP 0.24 0.29 0.25 0.27 0.27 0.24 0.31 0.31 0.31 0.32 0.36 0.35 0.32 0.35 0.35

Ac_nassa_PUR 0.22 0.24 0.21 0.24 0.23 0.23 0.34 0.37 0.37 0.38 0.36 0.36 0.44 0.44 0.46 0.27

Ac_nassa_TAP 0.21 0.24 0.22 0.24 0.21 0.22 0.33 0.34 0.35 0.36 0.35 0.35 0.42 0.43 0.42 0.24 0.03

Bio_cupido_PUR 0.35 0.37 0.37 0.39 0.38 0.37 0.36 0.42 0.37 0.38 0.39 0.37 0.44 0.43 0.41 0.41 0.39 0.40

Caq_spectabilis_XIN 0.26 0.26 0.28 0.26 0.24 0.26 0.35 0.36 0.36 0.37 0.35 0.37 0.38 0.38 0.41 0.19 0.21 0.18 0.42

Cr_n_sp_laranja_XIN 0.24 0.31 0.32 0.32 0.31 0.35 0.38 0.40 0.41 0.40 0.41 0.43 0.45 0.44 0.44 0.28 0.30 0.29 0.37 0.31

Cr_percna_XIN 0.26 0.32 0.32 0.32 0.31 0.33 0.37 0.34 0.41 0.41 0.42 0.42 0.42 0.40 0.42 0.31 0.31 0.31 0.34 0.34 0.08

78

Cr_aff_inpa_XIN 0.30 0.37 0.32 0.36 0.38 0.34 0.41 0.45 0.43 0.42 0.43 0.43 0.47 0.46 0.47 0.27 0.33 0.31 0.36 0.36 0.16 0.20

Cr_sp1_ARA 0.35 0.40 0.37 0.42 0.42 0.32 0.37 0.41 0.38 0.39 0.37 0.38 0.42 0.37 0.48 0.27 0.30 0.31 0.38 0.34 0.24 0.25 0.23

Cr_lugubris_ARA 0.29 0.33 0.38 0.35 0.29 0.34 0.36 0.39 0.41 0.42 0.41 0.40 0.45 0.41 0.45 0.31 0.28 0.27 0.37 0.33 0.11 0.10 0.20 0.23

Cr_astroblepa_ARA 0.38 0.40 0.39 0.41 0.41 0.33 0.37 0.37 0.35 0.36 0.34 0.35 0.41 0.36 0.47 0.30 0.29 0.28 0.35 0.32 0.26 0.26 0.26 0.08 0.22

Cr_n_sp_preta_XIN 0.29 0.36 0.34 0.36 0.34 0.37 0.37 0.38 0.38 0.38 0.43 0.41 0.42 0.43 0.42 0.30 0.26 0.26 0.36 0.29 0.08 0.07 0.16 0.27 0.12

Aeq

_m

icha

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XIN

Aeq

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Cr_

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XIN

Cr_

sp1

_A

RA

Cr_

lugu

bri

s_A

RA

Cr_sp_xingu_XIN 0.26 0.34 0.32 0.34 0.32 0.35 0.36 0.38 0.37 0.37 0.41 0.41 0.42 0.44 0.43 0.29 0.25 0.24 0.35 0.31 0.07 0.08 0.16 0.27 0.11

Cr_regani_XIN 0.35 0.38 0.40 0.39 0.40 0.31 0.50 0.42 0.40 0.39 0.40 0.40 0.51 0.47 0.44 0.33 0.35 0.32 0.35 0.35 0.23 0.23 0.24 0.28 0.28

Cr_regani_JAT 0.33 0.37 0.40 0.37 0.36 0.31 0.46 0.41 0.38 0.38 0.40 0.40 0.47 0.42 0.43 0.33 0.32 0.29 0.34 0.32 0.19 0.23 0.25 0.27 0.25

Cr_regani_PUR 0.33 0.36 0.40 0.36 0.35 0.32 0.47 0.39 0.38 0.37 0.41 0.39 0.46 0.42 0.41 0.33 0.32 0.29 0.33 0.32 0.20 0.22 0.24 0.28 0.23

Cr_regani_TAP 0.34 0.38 0.40 0.38 0.39 0.31 0.50 0.41 0.40 0.39 0.41 0.40 0.50 0.47 0.44 0.31 0.34 0.31 0.36 0.35 0.22 0.23 0.23 0.27 0.27

Ci_melaniae_XIN2 0.23 0.24 0.25 0.24 0.22 0.26 0.30 0.35 0.34 0.35 0.36 0.35 0.37 0.41 0.35 0.23 0.25 0.23 0.35 0.24 0.31 0.30 0.36 0.33 0.33

Ci_melaniae_XIN1 0.25 0.25 0.25 0.25 0.24 0.27 0.34 0.34 0.38 0.37 0.40 0.39 0.39 0.41 0.37 0.24 0.24 0.24 0.37 0.23 0.31 0.29 0.36 0.34 0.33

Ci_mirianae_pitanga_XIN 0.23 0.26 0.22 0.25 0.21 0.21 0.33 0.38 0.38 0.39 0.36 0.37 0.38 0.42 0.41 0.25 0.21 0.20 0.32 0.25 0.33 0.31 0.36 0.29 0.35

Ci_temensis_JAT 0.21 0.24 0.24 0.24 0.22 0.26 0.31 0.36 0.33 0.33 0.34 0.33 0.37 0.40 0.37 0.23 0.24 0.24 0.37 0.22 0.30 0.29 0.35 0.32 0.31

Ci_piquiti_ARA 0.23 0.24 0.24 0.24 0.22 0.29 0.30 0.36 0.32 0.33 0.34 0.33 0.36 0.39 0.35 0.25 0.25 0.25 0.36 0.24 0.30 0.31 0.38 0.34 0.32

Geo_altifrons_ARA 0.23 0.29 0.29 0.30 0.31 0.32 0.31 0.45 0.39 0.39 0.36 0.39 0.33 0.38 0.35 0.29 0.28 0.28 0.37 0.31 0.28 0.28 0.29 0.38 0.35

Geo_altifrons_PUR 0.27 0.30 0.32 0.30 0.31 0.37 0.31 0.46 0.39 0.39 0.36 0.37 0.34 0.38 0.35 0.27 0.32 0.32 0.35 0.32 0.30 0.31 0.31 0.38 0.34

Geo_argyrostictus_XIN2 0.22 0.29 0.29 0.29 0.29 0.28 0.34 0.39 0.34 0.35 0.34 0.34 0.33 0.36 0.38 0.25 0.28 0.28 0.35 0.32 0.28 0.29 0.30 0.38 0.33

Geo_argyrostictus_XIN1 0.22 0.29 0.27 0.29 0.29 0.26 0.36 0.41 0.36 0.36 0.34 0.34 0.33 0.37 0.38 0.25 0.28 0.29 0.35 0.32 0.30 0.30 0.31 0.38 0.34

Geo_sp_TAP 0.22 0.29 0.29 0.30 0.30 0.32 0.31 0.46 0.40 0.41 0.38 0.40 0.35 0.39 0.37 0.28 0.30 0.30 0.36 0.30 0.26 0.26 0.28 0.38 0.34

Geo_sp_XIN 0.24 0.32 0.31 0.33 0.32 0.34 0.30 0.43 0.38 0.39 0.37 0.39 0.33 0.36 0.36 0.23 0.29 0.29 0.35 0.28 0.29 0.29 0.31 0.37 0.37

Geo_proximus_TAP 0.24 0.29 0.30 0.29 0.29 0.34 0.29 0.44 0.38 0.39 0.36 0.37 0.33 0.38 0.35 0.24 0.30 0.30 0.38 0.29 0.27 0.29 0.30 0.33 0.32

He_efasciatus_XIN_JAT 0.23 0.22 0.21 0.23 0.22 0.22 0.39 0.34 0.37 0.37 0.36 0.36 0.37 0.36 0.40 0.25 0.23 0.23 0.43 0.19 0.36 0.31 0.37 0.36 0.36

Lae_araguaiae_TAP 0.21 0.23 0.24 0.24 0.24 0.22 0.37 0.37 0.43 0.43 0.39 0.41 0.40 0.40 0.46 0.25 0.17 0.19 0.37 0.25 0.31 0.31 0.28 0.30 0.29

Mes_festivus_TAP 0.25 0.23 0.25 0.23 0.22 0.25 0.37 0.41 0.42 0.41 0.37 0.41 0.49 0.37 0.50 0.30 0.25 0.24 0.42 0.20 0.31 0.30 0.38 0.33 0.32

79

Mes_festivus_JAT 0.23 0.23 0.23 0.23 0.21 0.25 0.35 0.40 0.39 0.39 0.36 0.39 0.46 0.38 0.47 0.29 0.22 0.22 0.39 0.19 0.30 0.30 0.38 0.31 0.31

Ret_lapidifer_ARA 0.28 0.26 0.27 0.26 0.25 0.30 0.32 0.41 0.35 0.36 0.37 0.40 0.38 0.38 0.41 0.29 0.23 0.22 0.38 0.23 0.34 0.36 0.35 0.38 0.35

Ret_xinguensis_XIN 0.28 0.31 0.27 0.31 0.27 0.32 0.35 0.40 0.36 0.37 0.37 0.40 0.41 0.41 0.46 0.29 0.24 0.23 0.42 0.23 0.35 0.38 0.35 0.41 0.40

Sat_jurupari_ARA 0.23 0.28 0.27 0.27 0.26 0.30 0.37 0.33 0.38 0.37 0.37 0.36 0.44 0.34 0.40 0.27 0.25 0.24 0.41 0.23 0.32 0.33 0.35 0.36 0.33

Sat_sp_XIN 0.26 0.27 0.27 0.27 0.28 0.31 0.32 0.34 0.37 0.36 0.36 0.35 0.42 0.30 0.38 0.27 0.28 0.26 0.40 0.23 0.32 0.31 0.35 0.34 0.35

Sat_lilith_JAT 0.26 0.28 0.30 0.29 0.30 0.24 0.33 0.39 0.38 0.39 0.36 0.40 0.42 0.36 0.41 0.26 0.24 0.22 0.40 0.25 0.32 0.32 0.34 0.32 0.31

Sym_aequafasciatus_XIN 0.25 0.21 0.21 0.23 0.23 0.26 0.37 0.40 0.40 0.41 0.36 0.38 0.40 0.41 0.46 0.29 0.22 0.25 0.42 0.22 0.31 0.33 0.33 0.36 0.37

Te_sp_ARA 0.29 0.30 0.34 0.31 0.33 0.38 0.40 0.44 0.42 0.41 0.38 0.40 0.44 0.44 0.43 0.37 0.34 0.33 0.40 0.39 0.23 0.26 0.25 0.36 0.29

Te_n_sp_preta_XIN 0.29 0.28 0.34 0.30 0.29 0.34 0.36 0.38 0.40 0.39 0.37 0.40 0.41 0.39 0.43 0.33 0.30 0.29 0.39 0.33 0.26 0.26 0.23 0.31 0.27

Te_cinderela_ARA1 0.38 0.40 0.43 0.42 0.42 0.43 0.53 0.48 0.51 0.50 0.49 0.49 0.53 0.49 0.55 0.41 0.39 0.37 0.43 0.39 0.30 0.31 0.34 0.38 0.34

Te_cinderela_ARA2 0.39 0.39 0.44 0.42 0.41 0.43 0.53 0.47 0.54 0.53 0.52 0.52 0.51 0.50 0.53 0.44 0.40 0.38 0.44 0.42 0.31 0.30 0.34 0.39 0.35

Te_cinderela_ARA3 0.34 0.36 0.38 0.38 0.38 0.38 0.48 0.44 0.49 0.49 0.46 0.46 0.48 0.46 0.49 0.39 0.35 0.33 0.40 0.38 0.28 0.27 0.29 0.35 0.30

Cr_

ast

rob

lepa_

AR

A

Cr_

n_

sp_p

reta

_X

IN

Cr_

sp_

xingu

_X

IN

Cr_

regan

i_X

IN

Cr_

regan

i_JA

T

Cr_

regan

i_P

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Cr_

regan

i_T

AP

Ci_

mel

an

iae_

XIN

2

Ci_

mel

an

iae_

XIN

1

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mir

iana

e_pit

an

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XIN

Ci_

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T

Ci_

piq

uit

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RA

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AR

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ifro

ns_

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Geo

_a

rgyr

ost

ictu

s_X

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Geo

_sp

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AP

Geo

_sp

_X

IN

Geo

_p

roxi

mu

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efasc

iatu

s_X

IN_JA

T

La

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rag

uaia

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_fe

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P

Mes

_fe

stiv

us_

JAT

Ret

_la

pid

ifer

_A

RA

Ret

_xi

ngu

ensi

s_X

IN

Cr_n_sp_preta_XIN 0.28

Cr_sp_xingu_XIN 0.27 0.05

Cr_regani_XIN 0.31 0.23 0.26

Cr_regani_JAT 0.30 0.22 0.25 0.04

Cr_regani_PUR 0.30 0.21 0.24 0.04 0.01

Cr_regani_TAP 0.30 0.23 0.25 0.01 0.04 0.04

Ci_melaniae_XIN2 0.33 0.33 0.32 0.33 0.33 0.35 0.32

Ci_melaniae_XIN1 0.32 0.32 0.32 0.33 0.33 0.35 0.32 0.02

Ci_mirianae_pitanga_XIN 0.27 0.35 0.34 0.35 0.33 0.36 0.34 0.06 0.07

Ci_temensis_JAT 0.32 0.32 0.31 0.35 0.33 0.35 0.33 0.02 0.03 0.07

Ci_piquiti_ARA 0.32 0.33 0.31 0.35 0.35 0.36 0.33 0.02 0.04 0.07 0.03

Geo_altifrons_ARA 0.38 0.30 0.29 0.34 0.35 0.35 0.35 0.29 0.29 0.29 0.27 0.29

Geo_altifrons_PUR 0.40 0.32 0.31 0.33 0.33 0.33 0.34 0.28 0.30 0.29 0.28 0.27 0.07

Geo_argyrostictus_XIN2 0.37 0.29 0.27 0.30 0.30 0.32 0.31 0.27 0.27 0.26 0.25 0.26 0.10 0.09

80

Geo_argyrostictus_XIN1 0.37 0.31 0.28 0.30 0.32 0.33 0.31 0.27 0.27 0.25 0.25 0.26 0.10 0.10 0.01

Geo_sp_TAP 0.39 0.28 0.27 0.32 0.33 0.33 0.33 0.29 0.29 0.28 0.28 0.29 0.02 0.06 0.09 0.09

Geo_sp_XIN 0.39 0.29 0.28 0.34 0.34 0.33 0.35 0.29 0.29 0.27 0.27 0.27 0.06 0.04 0.10 0.10 0.05

Geo_proximus_TAP 0.35 0.30 0.28 0.31 0.33 0.33 0.32 0.26 0.28 0.26 0.25 0.25 0.06 0.03 0.10 0.10 0.05 0.04

He_efasciatus_XIN_JAT 0.35 0.34 0.36 0.35 0.33 0.33 0.34 0.24 0.23 0.24 0.23 0.26 0.33 0.32 0.32 0.32 0.32 0.29 0.29

Lae_araguaiae_TAP 0.31 0.30 0.31 0.33 0.30 0.31 0.31 0.24 0.24 0.22 0.24 0.25 0.31 0.32 0.31 0.33 0.32 0.31 0.32 0.20

Mes_festivus_TAP 0.34 0.32 0.32 0.41 0.37 0.38 0.40 0.22 0.22 0.23 0.23 0.24 0.34 0.34 0.32 0.34 0.33 0.32 0.32 0.22 0.25

Mes_festivus_JAT 0.33 0.30 0.29 0.39 0.35 0.36 0.38 0.21 0.20 0.21 0.21 0.22 0.33 0.32 0.31 0.32 0.32 0.30 0.31 0.22 0.24 0.02

Ret_lapidifer_ARA 0.35 0.33 0.32 0.39 0.37 0.37 0.38 0.24 0.27 0.23 0.24 0.24 0.25 0.27 0.28 0.28 0.26 0.24 0.26 0.28 0.28 0.32 0.30

Ret_xinguensis_XIN 0.41 0.34 0.33 0.45 0.41 0.41 0.42 0.29 0.29 0.27 0.27 0.27 0.28 0.30 0.30 0.31 0.29 0.26 0.30 0.28 0.28 0.31 0.29 0.09

Sat_jurupari_ARA 0.32 0.31 0.31 0.35 0.37 0.36 0.34 0.24 0.25 0.25 0.23 0.24 0.31 0.32 0.30 0.32 0.31 0.33 0.31 0.28 0.27 0.28 0.25 0.29 0.30

Sat_sp_XIN 0.33 0.31 0.32 0.35 0.35 0.36 0.36 0.23 0.24 0.26 0.23 0.22 0.31 0.29 0.30 0.31 0.30 0.29 0.29 0.29 0.26 0.28 0.26 0.32 0.32

Sat_lilith_JAT 0.31 0.32 0.31 0.35 0.34 0.36 0.34 0.24 0.25 0.21 0.25 0.24 0.30 0.27 0.29 0.30 0.30 0.29 0.28 0.30 0.25 0.27 0.26 0.22 0.29

Sym_aequafasciatus_XIN 0.37 0.34 0.30 0.44 0.39 0.42 0.42 0.24 0.25 0.21 0.22 0.23 0.30 0.27 0.29 0.29 0.28 0.27 0.25 0.17 0.24 0.21 0.18 0.31 0.33

Te_sp_ARA 0.37 0.24 0.22 0.31 0.30 0.29 0.28 0.32 0.33 0.35 0.31 0.30 0.33 0.35 0.35 0.36 0.34 0.36 0.35 0.39 0.34 0.31 0.29 0.39 0.39

Te_n_sp_preta_XIN 0.34 0.25 0.24 0.31 0.29 0.29 0.30 0.30 0.32 0.30 0.30 0.30 0.37 0.37 0.36 0.38 0.37 0.36 0.35 0.32 0.30 0.33 0.32 0.35 0.37

Te_cinderela_ARA1 0.35 0.31 0.31 0.32 0.30 0.31 0.30 0.33 0.35 0.33 0.33 0.34 0.43 0.47 0.40 0.40 0.42 0.43 0.43 0.38 0.36 0.37 0.36 0.41 0.42

Te_cinderela_ARA2 0.36 0.31 0.31 0.31 0.29 0.29 0.29 0.34 0.35 0.33 0.34 0.35 0.43 0.46 0.42 0.42 0.43 0.44 0.43 0.40 0.35 0.39 0.38 0.40 0.44

Te_cinderela_ARA3 0.31 0.27 0.28 0.27 0.25 0.26 0.25 0.30 0.31 0.30 0.29 0.31 0.38 0.41 0.37 0.37 0.38 0.38 0.38 0.34 0.31 0.35 0.33 0.36 0.38

Sat_

juru

pa

ri_

AR

A

Sat_

sp_

XIN

Sat_

lili

th_JA

T

Sym

_aeq

ua

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iatu

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IN

Te_

sp_A

RA

Te_

n_

sp_

pre

ta_

XIN

Te_

cin

der

ela_

AR

A1

Te_

cin

der

ela_

AR

A2

Te_

cin

der

ela_

AR

A3

Sat_jurupari_ARA

Sat_sp_XIN 0.04

Sat_lilith_JAT 0.24 0.23

Sym_aequafasciatus_XIN 0.28 0.26 0.26

Te_sp_ARA 0.34 0.38 0.32 0.37

Te_n_sp_preta_XIN 0.32 0.33 0.33 0.34 0.15

81

Te_cinderela_ARA1 0.40 0.40 0.33 0.44 0.16 0.22

Te_cinderela_ARA2 0.43 0.43 0.34 0.43 0.16 0.24 0.05

Te_cinderela_ARA3 0.38 0.38 0.31 0.39 0.12 0.21 0.08 0.05

1123 1124 1125 1126 1127 1128 1129 1130 1131 1132 1133 1134 1135 1136 1137 1138 1139 1140 1141 1142 1143 1144 1145 1146 1147 1148 1149 1150 1151

82

1152 Tabela 10. Distância média da distância interespecífica (K2P) para as espécies de ciclídeos classificados morfologicamente. 1153

Aeq

_m

icha

eli

Aeq

_p

all

idu

s

Aeq

_cf

_ea

pe

Ap_

sp.

Ap_

aff

_st

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ki

Ap_

aga

ssiz

i

Ap_

per

ten

sis

Ap_

gr_

bre

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Ap_

pu

lchra

Aca

_h

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lli

Ac_

na

ssa

Bio

_cu

pid

o

Caq_

spec

tab

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Cr_

n_

sp_

lara

nja

Cr_

per

cna

Cr_

aff

_in

pa

Cr_

sp1

Cr_

jeg

ui

Cr_

lugu

bri

s

Cr_

ast

rob

lepa

Cr_

aff

_st

riga

ta

Cr_

n_

sp_p

reta

Cr_

sp_

xingu

Cr_

regan

i

Ci_

mel

an

iae

Ci_

mir

iana

e_pit

an

ga

Ci_

tem

ensi

s

Ci_

piq

uit

i

Geo

_alt

ifro

ns

Aeq_michaeli

Aeq_pallidus 0.1

Aeq_cf_eape 0.2 0.2

Ap_sp. 0.3 0.3 0.4

Ap_aff_staecki 0.4 0.4 0.4 0.2

Ap_agassizi 0.4 0.4 0.4 0.3 0.2

Ap_pertensis 0.4 0.4 0.4 0.2 0.2 0.2

Ap_gr_brevis 0.4 0.3 0.4 0.3 0.2 0.2 0.2

Ap_pulchra 0.4 0.4 0.4 0.3 0.2 0.3 0.2 0.3

Aca_heckelli 0.2 0.3 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4

Ac_nassa 0.2 0.2 0.2 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3

Bio_cupido 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4

Caq_spectabilis 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.2 0.2 0.4

Cr_n_sp_laranja 0.2 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.5 0.4 0.4 0.3 0.3 0.4 0.3

Cr_percna 0.3 0.3 0.3 0.4 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.1

Cr_aff_inpa 0.3 0.4 0.3 0.4 0.4 0.4 0.5 0.5 0.5 0.3 0.3 0.4 0.4 0.2 0.2

Cr_sp1 0.3 0.4 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.5 0.3 0.3 0.4 0.3 0.2 0.2 0.2

Cr_jegui 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.4 0.5 0.4 0.5 0.3 0.3 0.4 0.3 0.1 0.1 0.2 0.2

Cr_lugubris 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.5 0.3 0.3 0.4 0.3 0.1 0.1 0.2 0.2 0.0

Cr_astroblepa 0.4 0.4 0.3 0.4 0.4 0.3 0.4 0.4 0.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.1 0.2 0.2

Cr_aff_strigata 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.5 0.3 0.3 0.4 0.3 0.1 0.1 0.2 0.2 0.0 0.0 0.2

Cr_n_sp_preta 0.3 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.3 0.4 0.3 0.1 0.1 0.2 0.3 0.1 0.1 0.3 0.1

Cr_sp_xingu 0.3 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.2 0.4 0.3 0.1 0.1 0.2 0.3 0.1 0.1 0.3 0.1 0.1

83

Cr_regani 0.3 0.4 0.3 0.5 0.4 0.4 0.5 0.4 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.2 0.2 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.2 0.3

Ci_melaniae 0.2 0.2 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.2 0.2 0.4 0.2 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3

Ci_mirianae_pitanga 0.2 0.2 0.2 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.2 0.2 0.3 0.2 0.3 0.3 0.4 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.1

Ci_temensis 0.2 0.2 0.3 0.3 0.4 0.3 0.4 0.4 0.4 0.2 0.2 0.4 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.02 0.1

Ci_piquiti 0.2 0.2 0.3 0.3 0.4 0.3 0.4 0.4 0.4 0.2 0.3 0.4 0.2 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.03 0.1 0.03

Geo_altifrons 0.2 0.3 0.3 0.3 0.5 0.4 0.3 0.4 0.4 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3

Geo_argysrostictus 0.2 0.3 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.4 0.4 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.1

Geo_sp 0.2 0.3 0.3 0.3 0.5 0.4 0.3 0.4 0.4 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.04

Geo_proximus 0.2 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.3 0.4 0.4 0.2 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.2 0.2 0.04

He_efasciatus 0.2 0.2 0.2 0.4 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.2 0.4 0.2 0.4 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.4 0.3 0.4 0.3 0.2 0.2 0.2 0.3 0.3

Lae_araguaiae 0.2 0.2 0.2 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.5 0.2 0.2 0.4 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.2 0.2 0.2 0.3 0.3

Mes_festivus 0.2 0.2 0.3 0.4 0.4 0.4 0.5 0.4 0.5 0.3 0.2 0.4 0.2 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 0.2 0.2 0.2 0.2 0.3

Ret_lapidifer 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.2 0.4 0.2 0.3 0.4 0.3 0.4 0.4 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.4 0.3 0.2 0.2 0.2 0.3

Ret_xinguensis 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.5 0.3 0.2 0.4 0.2 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3

Sat_jurupari 0.2 0.3 0.3 0.4 0.3 0.4 0.4 0.3 0.4 0.3 0.2 0.4 0.2 0.3 0.3 0.4 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 0.2 0.2 0.2 0.2 0.3

Sat_sp 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.3 0.4 0.3 0.3 0.4 0.2 0.3 0.3 0.4 0.3 0.4 0.4 0.3 0.4 0.3 0.3 0.4 0.2 0.2 0.2 0.2 0.3

Sat_lilith 0.3 0.3 0.2 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.2 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.2 0.2 0.2 0.2 0.3

Sym_aequafasciatus 0.2 0.2 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.5 0.3 0.2 0.4 0.2 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.3 0.4 0.2 0.2 0.2 0.2 0.3

Te_sp 0.3 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.4 0.4 0.2 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.4 0.3 0.2 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3

Te_n_sp_preta 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4

Te_cf_gephyrogramma 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4

Te_cinderela 0.4 0.4 0.4 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4

Geo

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Geo

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Geo

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Te_

cf_

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ma

Te_

cin

der

ela

Geo_argysrostictus

Geo_sp. 0.1

Geo_proximus 0.1 0.05

84

1154

He_efasciatus 0.3 0.3 0.3

Lae_araguaiae 0.3 0.3 0.3 0.2

Mes_festivus 0.3 0.3 0.3 0.2 0.2

Ret_lapidifer 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3

Ret_xinguensis 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.1

Sat_jurupari 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3

Sat_sp 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.03

Sat_lilith 0.3 0.3 0.3 0.3 0.2 0.3 0.2 0.3 0.2 0.2

Sym_aequafasciatus 0.3 0.3 0.2 0.2 0.2 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3

Te_sp 0.4 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.4 0.4 0.3 0.4 0.3 0.4

Te_n_sp_preta 0.4 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.2

Te_cf_gephyrogramma 0.4 0.4 0.4 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.2 0.0

Te_cinderela 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.4 0.1 0.2 0.2