INTERAÇÃO ENTRE A PROTEÍNA PRECURSORA AMILÓIDE …livros01.livrosgratis.com.br/cp108203.pdf ·...
100
Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde Instituto de Bioquímica Médica PAULO JOSÉ BELTRÃO INTERAÇÃO ENTRE A PROTEÍNA PRECURSORA AMILÓIDE SECRETADA (sAPP) HUMANA E SEMAFORINA 3A: CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA E FUNCIONAL DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA AO INSTITUTO DE BIOQUÍMICA MÉDICA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS (QUÍMICA BIOLÓGICA) Rio de Janeiro 2009
Transcript of INTERAÇÃO ENTRE A PROTEÍNA PRECURSORA AMILÓIDE …livros01.livrosgratis.com.br/cp108203.pdf ·...
Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Bioquímica Médica
PAULO JOSÉ BELTRÃO
INTERAÇÃO ENTRE A PROTEÍNA PRECURSORA
AMILÓIDE SECRETADA (sAPP) HUMANA E
SEMAFORINA 3A: CARACTERIZAÇÃO
BIOQUÍMICA E FUNCIONAL
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA AO INSTITUTO DE BIOQUÍMICA MÉDICA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO
DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS (QUÍMICA BIOLÓGICA)
Rio de Janeiro
2009
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
ii
iii
Paulo José Beltrão
Interação entre a Proteína Precursora Amilóide secretada (sAPP) humana e
Semaforina 3A: Caracterização bioquímica e funcional
Dissertação de mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Química Biológica do Instituto de Bioquímica Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências (Química Biológica)
Orientadora: Profa Margaret Haiganouch Magdesian
Orientador: Prof Sérgio T. Ferreira
Rio de Janeiro
2009
iv
Ficha Catalográfica
Beltrão, Paulo José Miranda da Silva Iwakami
Interação entre a Proteína Precursora Amilóide Secretada (sAPP) humana e Semaforina 3A: Caracterização bioquímica e funcional/ Paulo José Miranda da Silva Iwakami Beltrão. – Rio de Janeiro: UFRJ / Instituto de Bioquímica Médica, 2009.
xii, 84 f. : il. ; 31 cm
Orientadores: Margaret Haiganouch Magdesian e Sérgio Teixeira Ferreira
Dissertação (mestrado) – UFRJ / Instituto de Bioquímica Médica / Programa de Pós-graduação em Química Biológica, 2009.
Referências bibliográficas: f. 72-83
1. Proteína Precursora Amilóide - APP. 2. Semaforinas e Sema3A. 3. Neurônios do Gânglio da
Raiz Dorsal. 4. Doença de Alzheimer - Dissertação. I. Magdesian, Margaret Haiganouch. II. Ferreira,
Sérgio Teixeira. III. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Bioquímica Médica, Programa de
Pós-Graduação em Química Biológica. IV. Título.
v
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Doenças Neurodegenerativas do Instituto de Bioquímica Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) sob orientação dos professores Margaret Haiganouch Magdesian e Sérgio T. Ferreira, na vigência de auxílios financeiros concedidos pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e pelo Howard Hughes Medical Institute (HHMI)
vi
INTERAÇÃO ENTRE A PROTEÍNA PRECURSORA AMILÓIDE SECRETADA (sAPP) HUMANA E SEMAFORINA 3A: CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA E
FUNCIONAL
PAULO JOSÉ BELTRÃO
Tese submetida ao Instituto de Bioquímica Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários para obtenção do grau
de Doutor em Ciências (Química Biológica).
Banca examinadora:
______________________________________________
Prof. Marcus Fernandes de Oliveira
(Presidente da Banca, Prof. Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica – UFRJ)
______________________________________________
Profa. Daniela Uziel Rozental
(Profa. Adjunta do Instituto de Ciências Biomédicas – UFRJ)
______________________________________________
Profa. Patrícia Franca Gardino
(Profa. Associada nível II do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho – UFRJ)
______________________________________________
Prof. Jean Christophe Houzel
(Suplente Externo, Prof. Adjunto do Instituto de Ciências Biomédicas – UFRJ)
______________________________________________
Prof. Pedro Lagerblad de Oliveira
(Revisor e Suplente Interno, Prof. Titular do Instituto de Bioquímica Médica – UFRJ)
______________________________________________
Profa. Margaret Haiganouch Magdesian
(Orientadora, Profa Adjunta do Instituto de Bioquímica Médica – UFRJ)
______________________________________________
Prof. Sérgio T. Ferreira
(Orientador, Prof. Titular do Instituto de Bioquímica Médica – UFRJ)
vii
Agradeço
À professora Margaret Magdesian;
Ao professor Sérgio Ferreira;
Ao revisor da minha dissertação, professor Pedro Lagerblad;
Aos Professores Membros da Banca;
Aos Professores Ricardo Reis, Daniela Uziel e Gilberto Weissmüller;
Aos inegrantes do Laboratório de Doenças Degenerativas e do IBqM;
Aos meus amigos;
À minha família, principalmente minha mãe;
À Talita, minha namorada.
viii
RESUMO
Beltrão, Paulo José Miranda da Silva Iwakami. Interação entre a Proteína Precursora Amilóide Secretada (sAPP) humana e Semaforina 3A: Caracterização Bioquímica e Funcional. Rio de Janeiro. Dissertação (Mestrado em Química Biológica). Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2009.
A Proteína Precursora Amilóide (APP) é uma proteína transmembranar
amplamente expressa em mamíferos, bem conhecida por sua importância na doença de Alzheimer pois pode ser clivada, dando origem ao peptídeo neurotóxico amilóide-β (Aβ). No entanto, pouco se sabe sobre as funções fisiológicas da APP, especialmente no sistema nervoso central. A importância da APP tem sido correlacionada à formação das sinapses, ao crescimento dendrítico e axonal, além da sobrevivência neuronal. Estudos recentes sugerem que a APP seja parte de um complexo protéico com importância na migração neuronal e transmissão sináptica. Com o objetivo de identificar novos ligantes para APP, utilizamos uma biblioteca de peptídeos apresentados em fagos (phage display library) e identificamos peptídeos com alta afinidade pela sAPP695α (principal isoforma neuronal da APP, secretada e solúvel). Dois dos heptapeptídeos selecionados apresentaram similaridade a proteínas da classe 3 da família das semaforinas, proteínas reconhecidas por sua função no direcionamento neurítico. Na presente dissertação, mostramos por ELISA, co-imunoprecipitação e por experimentos com ressonância plasmônica de superfície (SPR) que sAPP695α se liga à Semaforina 3A (Sema3A) recombinante purificada e também à Sema3A secretada por células HEK transfectadas. Além disso, mostramos que concentrações nano molares de sAPP695α inibem a retração neurítica promovida por Sema3A em culturas de neurônios de gânglio da raiz dorsal. É interessante observar que os dois peptídeos selecionados por phage display impedem a interação Sema3A-sAPP695α e permitem a retração neurítica induzida pela Sema3A. Nossos resultados indicam que sAPP695α se liga à Sema3A e modula o crescimento e direcionamento neurítico, sugerindo o envolvimento da sAPP695α no desenvolvimento e plasticidade do sistema nervoso central.
ix
ABSTRACT
Beltrão, Paulo José Miranda da Silva Iwakami. Interação entre a Proteína Precursora Amilóide Secretada (sAPP) humana e Semaforina 3A: Caracterização Bioquímica e Funcional. Rio de Janeiro. Dissertação (Mestrado em Química Biológica). Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2009.
The amyloid precursor protein (APP) is a transmembrane protein widely
expressed in mammals that plays a major role in Alzheimer’s disease by giving rise, after cleavage by secretases, to the neurotoxic amyloid-β peptide (Aβ). However, much less is known about the physiological role(s) of APP, especially in the central nervous system (CNS). APP has been implicated in synapse formation, axonal and dendritic outgrowth and neuronal survival. Recent findings suggest that APP is part of a protein complex with important functions in neuronal migration and synaptic transmission. In order to identify new ligands of APP, we screened a phage display peptide library and identified high-affinity ligands for the purified recombinant human sAPP695α (the soluble, secreted ectodomain from the main neuronal isoform of APP). Two of the selected heptapeptides were highly similar to several class 3 members of the semaphorins family, proteins implicated in neurite guidance. In the present study, we show through ELISA, co-immunoprecipitation and surface plasmon resonance (SPR) that sAPP695α binds to both purified recombinant semaphorin 3A (Sema3A) and to Sema3A secreted by HEK293 cells transfected with the Sema3A gene. Furthermore, we show that nanomolar concentrations of sAPP695α inhibit neurite retraction promoted by semaphorin in cultures of dorsal root ganglion neurons. Interestingly, the two peptides selected by phage display inhibit sAPPα binding to Sema3A and block the inhibition of neurite retraction. Our findings suggest that sAPP695α binds Sema3A and modulates neurite guidance and outgrowth, suggesting a role for the sAPP695α in the development and plasticity of the central nervous system.
x
Índice
1 - Introdução: ______________________________________________________________ 1
1.1-O do Sistema Nervoso____________________________________________________1
1.2 – Doenças Neurodegenerativas_____________________________________________ 2
1.2.1-Doença de Alzheimer_________________________________________________3
1.2.2-A Proteína Precursora Amilóide na Doença de Alzheimer_____________________5
1.3 – A Proteína Precursora Amilóide___________________________________________5
1.3.1- A Proteína Precursora Amilóide em condições Fisiológicas__________________11
1.3.2-Busca de Ligantes para a Proteína Precursora Amilóide _____________________15
1.4 – Semaforinas__________________________________________________________16
1.4.1- Semaforina3A______________________________________________________18
1.4.2- Receptores de Semaforina3A__________________________________________19
2-Objetivos________________________________________________________________22
3- Material e Métodos________________________________________________________23
3.1 Apresentação de Bibliotecas de Peptídeos em Fagos____________________________23
3.2 Expressão e Purificação de sAPPα695_______________________________________24
3.3-Biotinilação de sAPP695_________________________________________________29
3.4 – Semaforina 3A________________________________________________________30
3.5 –Peptídeos_____________________________________________________________30
3.6 -Ensaio de Ligação de sAPP695a Semaforina3A_____________________________31
3.7 -Co-imuno precipitação de sAPP695 e Semaforina3A em placas de ELISA_________32
3.8 Cultura Dissociada de neurônios de Gânglios da Raiz Dorsal_____________________34
xi
3.9- Ensaio de retração de neuritos_____________________________________________37
3.10 -Cultura de Explantes de Gânglios da Raiz Dorsal e Córtex Cerebral______________37
3.11 –Ressonância Plasmônica de Superfície_____________________________________38
4 – Resultados: _____________________________________________________________41
4.1 – Busca de ligantes da sAPP695α através da apresentação de bibliotecas de peptideos em
fagos____________________________________________________________________41
4.2 – sAPP695 interage com Semaforina3A in vitro _______________________________44
4.3 – Ensaios de ligação entre sAPP695α e Semaforina3A por co-imunoprecipitação_____48
4.4 – Ressonância Plasmônica de Superficie_____________________________________51
4.5 – Ensaios em cultura dissociada de neurônios de Gânglios da Raiz Dorsal __________54
4.6 – Ensaios em Culturas de Explantes_________________________________________60
5 – Discussão: ______________________________________________________________62
6 – Conclusões: _____________________________________________________________68
7-Referências: ______________________________________________________________69
Anexo I (Artigo submetido ao Journal of Biological Chemistry)_______________________81
xii
Lista De Abreviações:
APP – Proteína Precursora Amilóide
sAPP695α – forma secretada da Proteína Precursora Amilóide isoforma 695
bAPP695 α – forma secretada da Proteína Precursora Amilóide isoforma 695
biotinilada
Ctlr – Controle do experimento
DA – Doença de Alzheimer
GRD – Gânglio da Raiz Dorsal
pNPP – p-nitrofenil fosfato
Sema3A- Semaforina 3A
Sema3A-AP – Semaforina 3A quimérica conjugada à Fosfatase Alcalina
SPR – Ressonância Plasmônica de Superfície
TF - Peptídeo identificado por phage display com seqüência de amino acidos
TFASVMT
LR - Peptídeo identificado por phage display com seqüência de amino acidos
LRSHPLG
1
1 - Introdução:
1.1-O Sistema Nervoso
O Sistema Nervoso é constituído basicamente por dois tipos celulares:
neurônios e gliócitos.
Os neurônios recebem sinais de outros neurônios pelos dendritos,
prolongamentos próximos ao corpo celular, e os transmitem para sítios
distantes por um prolongamento mais longo, o axônio. Esta transmissão de
sinais é realizada por estruturas denominadas sinapses (Foster, 1897),
constituídas por uma zona de contato entre dois neurônios, ou entre um
neurônio e uma célula muscular (Lopez-Munoz e cols, 2006; Lopez-Munoz e
Alamo, 2009; Berlucchi e Buchtel, 2009 para revisões).
Os gliócitos, células não-neuronais, foram tradicionalmente descritos
como células de apoio aos neurônios, envolvidos na nutrição, sustentação
mecânica, controle do metabolismo dos neurônios, resposta imunitária e
formação do tecido nervoso durante o desenvolvimento. No entanto, diversos
trabalhos já mostraram a importância de células da glia em diferentes
processos como é o caso da sinapse tripartite (Araque e cols, 1999) e
excitabilidade dependente de Ca++ (Bezzi e Volterra, 2001). Foi mostrado que a
excitabilidade da glia está correlacionada à estimulação sensorial (Wang e cols,
2006; Volterra e Meldolesi, 2005; Kettenmann e Verkhratsky, 2008 para
revisões).
2
Também era descrito que os gliócitos eram encontrados no sistema
nervoso dez vezes em maior número que os neurônios. No entanto, um
trabalho recente indica que estes estão em proporções muito semelhantes no
sistema nervoso central como um todo, variando a proporção entre os dois
tipos celulares nos diferentes tecidos (Azevedo e cols, 2008).
Os neurônios comunicam-se por meio de uma complexa rede de células
interligadas de maneira específica. Sendo assim, os mecanismos de
sinalização para o direcionamento axonal correto, principalmente durante o
desenvolvimento, são extremamente refinados e elaborados, envolvendo
diferentes vias de sinalização em diversos tipos neuronais (Colón-Ramos,
2009). Diferentes moléculas direcionam, por atração ou repulsão, os
prolongamentos axonais aos seus alvos futuros. Essas moléculas podem estar
difundidas no meio extracelular ou associadas às membranas das células.
Além disso, são altamente específicas para diferentes tipos celulares, podendo
uma mesma molécula sinalizar ações opostas em neurônios distintos ou
mesmo não atuar em alguns neurônios (Colón-Ramos, 2009). Através desse
sistema, os axônios são capazes de atravessar grandes distâncias para
chegarem a seus alvos, possibilitando a interconexão das diversas regiões do
sistema nervoso e a interação deste com as demais estruturas do corpo.
1.2 – Doenças Neurodegenerativas
Doenças neurodegenerativas afetam células do sistema nervoso,
causando perda de função e, posteriormente, morte celular. Essas doenças
3
podem ter diferentes origens, como mutações genéticas (doença de
Huntington), alterações no aporte de oxigênio e nutrientes (doenças cérebro-
vasculares), ou ainda serem multifatoriais, como no caso da doença de
Parkinson ou de Alzheimer.
I.2.1- Doença de Alzheimer
A doença de Alzheimer (DA) é a principal causa de demência em idosos,
acometendo cerca de 30 milhões de pessoas em todo o planeta (Alzheimer's
Association; 2009). Foi descrita pela primeira vez pelo médico alemão Alois
Alzheimer em 1907 (Alzheimer, 1907).
A doença de Alzheimer acomete cerca de 8% dos idosos com mais de
65 anos e 30% dos acima de 85 anos (Alzheimer's Association; 2009). O
paciente vive, em média, cerca de 10 anos depois do diagnóstico clínico e a
estimativa de custo anual nos Estados Unidos com estes pacientes é de 100
bilhões de dólares. Com a maior expectativa de vida da população, espera-se
que estes números aumentem (Alzheimer's Association; 2009).
A primeira paciente diagnosticada com a DA, Auguste D., apresentava
marcante déficit cognitivo e progressiva perda de memória. Outros sintomas
incluíam delírios, alterações no comportamento e progressiva perda da
linguagem (Alzheimer e cols 1907 - tradução para o inglês de 1995). Através da
análise de cortes histológicos do cérebro de Auguste D., foram identificados os
marcadores histopatológicos da DA: as placas senis, localizadas no meio
4
extracelular, e os emaranhados neurofibrilares, encontrados no interior das
células (Alzheimer e cols 1907 – tradução para o inglês de 1995).
Após a descrição da doença, muito pouco progresso e pesquisa foram
realizados, uma vez que se pensava que a DA era uma forma pouco comum de
demência. As pesquisas na área começaram a reaparecer na década de 60,
quando, utilizando técnicas de microscopia eletrônica, Terry e colaboradores
publicaram um trabalho descrevendo com detalhes estruturais os marcadores
histopatológicos da doença (Terry e cols.,1964).
Os emaranhados neurofibrilares são compostos pela proteína tau,
importante para a estabilização dos microtúbulos, em forma hiperfosforilada;
nas placas senis são principalmente encontrados depósitos de um peptídeo na
forma de agregados fibrilares. Este peptídeo é chamado β-amilóide (Aβ).
Atualmente, Aβ é conhecido como o principal agente neurotóxico da AD,
principalmente quando forma pequenos agregados oligoméricos (para revisões,
veja Klein, 2006; Haass e Selkoe, 2007; Ferreira e cols., 2007). Aβ foi
caracterizado em 1985 (Masters e cols 1985), e a pesquisa na área foi
aumentando consideravelmente, junto com a estimativa de vida da população e
a prevalência de Alzheimer em idosos.
Aβ é um produto da clivagem proteolítica da Proteína Precursora
Amilóide (APP) e possui entre 38 e 43 aminoácidos. Peptídeos com 40
aminoácidos correspondem a cerca de 90% das isoformas; no entanto, a
isoforma com maior capacidade de agregação e mais encontrada nas placas
senis é a de 42 aminoácidos (Selkoe, 2002). Em 1987, Kang e cols,
conhecendo a seqüência de Aβ descrita por Glenner e Wong em 1984,
clonaram o cDNA da principal isoforma neuronal da APP
5
I.2.2 - A Proteína Precursora Amilóide na Doença de Alzheimer
A APP dá origem ao peptídeo Aβ, considerado o principal fator
neurotóxico na DA. Desta forma, a regulação tanto da expressão da APP como
de seu processamento são fatores importantes para o desenvolvimento da DA
(Gralle e Ferreira, 2007 para uma revisão).
A DA pode afetar de maneira aleatória indivíduos com mais de 65 anos
(mais de 90% dos casos), ou pode se manifestar precocemente (antes de 65
anos) em famílias que apresentam mutações no gene da APP ou das
presenilinas (enzimas que clivam APP), geralmente referida como DA familiar
(Selkoe, 1996). Pacientes de ambas as formas da doença apresentam
sintomas semelhantes.
I.3 – A Proteína Precursora Amilóide
A Proteína Precursora Amilóide (APP) é uma glicoproteína
transmembranar do tipo I e possui uma grande porção extracelular e uma
pequena cauda intracelular (Kang e cols, 1987; Dyrks e cols, 1988). Essa
proteína tem massa molecular em torno de 120 kDa e é encontrada em três
isoformas principais, de 695, 751 e 770 aminoácidos (Kang e cols, 1987;
Kitaguchi e cols, 1988; Ponte e cols, 1988; Tanzi e cols, 1988; Gralle e Ferreira
, 2007 para uma revisão).
6
O gene que codifica para a APP está localizado no cromossomo 21 em
humanos (Patterson e cols, 1988) e possui 18 exons, dando origem a diversas
isoformas formadas por splicing alternativo. A isoforma que é majoritariamente
expressa no sistema nervoso é a APP695, que difere das outras duas
isoformas por não possuir o exon 7, que codifica uma região de 56
aminoácidos homóloga a um tipo de inibidor de serino-proteases, chamada
região KPI da APP. As isoformas não-neuronais não apresentam o exon 15,
encontrado na APP 695 (Kang e Muller-hill, 1990; Yoshikai e cols, 1990;
Coulson e cols, 2000 para uma revisão). (figura 1)
A APP é uma proteína transmembranar e pode funcionar como um
receptor, mas também pode ser clivada proteoliticamente, originando diferentes
fragmentos com funções fisiológicas distintas (Turner e cols, 2003 para uma
revisão). As enzimas responsáveis pelo processamento proteolítico da APP
são denominadas genericamente secretases.
A clivagem da APP ocorre primeiro com a liberação da porção
extracelular através da atuação de α-secretases ou β-secretases, mantendo
ancorados à membrana plasmática o fragmentos C-terminais, respectivamente
αCTF e βCTF. Esses fragmentos são então reconhecidos e clivados pelo
complexo protéico γ-secretase, que cliva αCTF e βCTF na região
transmembranar, gerando respectivamente os peptídeos p3 e Aβ. Além disso,
essa clivagem libera o domínio intracelular da APP (AICD) no citoplasma (Esler
e Wolfe, 2001) (Figura 1B, C).
As α-secretases são metaloproteases transmembranares dependentes
de zinco, membros da família de proteínas ADAM (“A Disintegrin And
7
Metalloproteinase”), que inclui ADAM 9, ADAM 10 e ADAM 17 (Allinson e cols,
2003). A via de processamento da APP, quando iniciado por uma α-secretase,
é chamada de via não amiloidogênica. A β-secretase ou BACE (“Beta-site APP
Cleaving Enzyme”) é também uma proteína transmembranar e é responsável
pela clivagem da APP no sítio β (Venugopal e cols, 2008). A via de
processamento da APP, quando iniciado pela β -secretase, é chamada de via
amiloidogênica.
A γ-secretase é um complexo protéico formado por quatro proteínas
transmembranares: Presenilina, existindo duas isoformas, PSEN1 e PSEN2
(De Strooper e cols, 1998; Herreman e cols, 2000; Zhang e cols, 2000),
Nicastrina (Yu e cols, 2000), APH-1 e PEN-2 (Francis e cols, 2002). O
complexo γ-secretase é responsável pela clivagem de mais de 30 outras
proteínas transmembranares tipo I, sendo o que o único pré-requisito aparente
é a prévia remoção da porção extracelular destas proteínas. A γ-secretase
ainda possui importância na DA, pois a clivagem entre diferentes aminoácidos
no seu sítio de atuação está relacionada à formação de isoformas do peptídeo
Aβ mais tóxicas (Aβ 42) ou menos tóxicas (Aβ 40) (Tolia e De Strooper, 2009
para uma revisão).
A via amiloidogênica (de clivagem da APP pela -secretase) é a que
possui maior importância para a DA por dar origem ao peptídeo Aβ, enquanto
que na via não-amiloidogênica a α-secretase cliva a APP em uma região 16
aminoácidos na direção c-terminal da proteína (em relação ao ponto de
clivagem pela -secretase), clivando dentro da região que corresponde ao
peptídeo Aβ. A via não-amiloidogênica é a predominante não só no sistema
nervoso como no organismo de uma maneira geral, mas ambas as vias
8
ocorrem em situações fisiológicas, o que sugere que o peptídeo Aβ também
possua função fisiológica. Por exemplo, foi recentemente mostrado que o
peptídeo Aβ, em concentrações picomolares, é capaz de modular a
plasticidade sináptica, provavelmente num mecanismo envolvendo receptores
de receptores nicotínicos de acetilcolina (Puzzo e cols, 2008). Também foi
mostrado por outro trabalho que a forma monomérica do peptídeo Aβ tem
efeito neuroprotetor em culturas neuronais (Giuffrida e cols, 2009; Zheng e Koo
2006 para uma revisão).
A APP é encontrada em diversos grupos de vertebrados como
mamíferos (homem, macaco, rato, camundongo), aves (galinha), anfíbios
(Xenopus), peixes (baiacu, zebrafish). Além disso, existem homólogos dessa
proteína em invertebrados, identificados em drosófila, a APPL (Rosen e cols,
1989), e em C. elegans, a APL-1 (Daigle e Li, 1993). Tanto APPL como APL- 1
sofrem clivagem proteolítica e tem a sua porção extracelular secretada (Luo e
cols, 1990; Hornsten e cols, 2007), mas não apresentam a seqüência
correspondente ao peptídeo Aβ (Jacobsen, e Iverfeldt, 2009 para uma
revisão). Além disso, tanto drosófila como C. elegans apresentam proteínas
homólogas à enzimas importantes para o processamento de APP (Rooke e
cols, 1996; Hong e Koo , 1997; Boulianne e cols, 1997; Carmine-Simmen e
cols, 2008; Hornsten e cols, 2007).
A APP faz parte de uma família que incluem as proteínas APP like
protein 1 (APLP1) e APP like protein 2 (APLP2), também encontradas em
mamíferos (Wasco e cols, 1992, 1993). A APLP2, assim como a APP, é
encontrada em diversos tecidos, enquanto que a APLP1 só foi identificada no
sistema nervoso (Lambert e cols, 1995). Assim como a APP, ambas as APLPs
9
sofrem processamento proteolítico (Eggert e cols, 2004), mas não dão origem
ao peptídeo Aβ (Jacobsen, e Iverfeldt, 2009 para uma revisão).
A APP é expressa na grande maioria das células de mamíferos, com
diferentes isoformas predominantes em tecidos diferentes (Selkoe e cols, 1988;
Tanaka e cols, 1989).
10
Figura 1: A Proteína Precursora Amilóide. (A) Representação esquemática da proteína
precursora amilóide. Com indicação do exon 7, não encontrado na principal isoforma neuronal
APP695. (B) Representação da região da APP clivada pelas α-secretase ou β-secretase e γ-
secretase. Figuras A e B modificadas de Turner e cols, 2003. (C) Representação esquemática
do processamento da APP e as diferentes porções resultantes das vias amiloidogênica (direita)
e não amiloidogênica (esquerda) (Zheng e Koo, 2006)
A B
C
Exon 7
11
I.3.2 - A Proteína Precursora Amilóide em Condições Fisiológicas
Apesar da grande ênfase dada ao estudo da APP pela produção de Aβ e
seu envolvimento na DA, trabalhos estudando as funções fisiológicas dessa
proteína são bem menos numerosos. Além disso, muitos dos trabalhos sobre a
importância fisiológica da APP estão relacionados à ação das secretases na
APP, visando entender a sinalização para as vias amiloidogênica ou não
amiloidogênica. No presente trabalho, será dada ênfase à função da APP e,
especialmente, da principal isoforma neuronal da APP, a APP695, no sistema
nervoso.
Foi sugerida, a partir da sequência de aminoácidos da APP, uma função
como um receptor de membrana (Kang e cols, 1987). Experimentos mostraram
que a APP poderia funcionar como um receptor de membrana acoplado à
proteína G, um importante mensageiro secundário na sinalização celular. Esse
mecanismo atuaria ativando a proteína G heterotrimérica G0 (Nishimoto e cols,
1993; Okamoto e cols, 1995;) e resultados semelhantes também foram
relatados para o homólogo da APP em drosófila, APPL (Swanson e cols, 2005).
Um estudo mostrou que a toxicidade do peptídeo Aβ poderia ser mediada pela
APP através de proteína G0 (Sola Vigo e cols, 2009). Este trabalho mostrou
que, no modelo utilizado, deleções da porção intracelular e da porção
correspondente ao peptídeo Aβ da APP foram capazes de inibir a toxicidade do
peptídeo Aβ.
Trabalhos subseqüentes mostraram que essa função poderia estar
relacionada à atividade de canais de cálcio (Shaked e cols, 2009) e apoptose
12
(Giambella e cols, 1997). Outros estudos ainda mostraram que TAG1, uma
proteína importante na adesão celular no sistema nervoso e no crescimento
neuronal, é capaz de se ligar à porção extracelular da APP e induzir a liberação
da porção intracelular AICD e sinalização através de Fe65 (Ma e cols, 2008).
Esta é uma via de sinalização bem conhecida para a porção intracelular da
APP quando clivada, que pode atuar na transcrição gênica (Muller e cols, 2008;
Muller e cols, 2008 para uma revisão). Apesar dessas evidências, a atuação da
APP como um receptor celular ainda não foi bem estabelecida.
Muitos efeitos da APP são observados no sistema nervoso, no qual a
APP parece ter importância como um fator neurotrófico e sinaptogênico (Turner
e cols, 2003 para uma revisão). Neste contexto, moléculas de adesão vêm se
mostrando importantes na formação sináptica e crescimento neuronal (Goda e
cols, 2002; Washbourne e cols, 2004). Diversos trabalhos indicam a APP como
uma molécula de adesão (Small e cols, 1999; Gralle e Ferreira, 2007 para
revisões), e diversos trabalhos mostraram a sua interação com proteínas da
matriz extracelular (Small e cols, 1992; Small e cols, 1994; Cáceres e Brandan,
1997). Além disso, a APP é capaz de formar heterodímeros e isto poderia
mediar uma adesão trans-celular (Soba e cols, 2005; Gralle e cols, 2009)
Foi mostrado que há aumento de expressão de APP durante a
maturação neuronal em cultura de células embrionárias (Hung e cols, 1992), e
o envolvimento de APP na sinaptogênese, estando localizada nas
extremidades de fibras nervosas (Moya e cols, 1994). Ainda, houve a
demonstração de que há grande expressão de APP695 na glia radial, que
possui grande importância na migração neuronal no córtex embrionário (Trapp
e Hauer, 1994). Na fase adulta ocorre expressão constitutiva de APP no
13
cérebro e há níveis mais elevados de APP nas regiões de maior modificação
sináptica (Lorent e cols 1995).
Muitos trabalhos também mostraram que a APP é mais expressa após
lesão cerebral (Itoh e cols, 2009), o que reforça a importância desta molécula
no crescimento neuronal e formação de sinapses (Chen e Tang, 2006 para
uma revisão).
Estudos iniciais com camundongos cujo gene da APP havia sido
removido observaram que os animais gerados eram viáveis e férteis (Zheng e
cols, 1995; Muller e cols, 1994; 1996), o que não era esperado, dada a grande
conservação desta proteína durante a evolução e a sua presença em diversos
tipos celulares. Esses estudos indicaram, dentre outros efeitos, diminuição do
peso corporal e cerebral, enfraquecimento dos membros, alterações na
atividade motora, dificuldades na memória espacial, diminuição da exploração
em campo aberto, entre outros (Senechal e cols, 2006; Anliker e Muller, 2006
para revisão).
Como já mencionado, a APP possui, em mamíferos, dois homólogos,
APLP1 e APLP2. Sendo assim, uma redundância funcional entre essas
proteínas poderia explicar a ausência de letalidade na deleção de uma proteína
aparentemente tão importante (Coulson e cols, 2000). De fato, foi mostrado
que camundongos removidos tanto para os genes de APP e APLP2 (Von Koch
e cols, 1997; Heber e cols, 2000) como para APLP1 e APLP2 (Heber e cols,
2000), além de camundongos sem os três genes APP, APLP1 e APLP2 (Herms
e cols, 2000) morrem logo após o nascimento. Ainda, ensaios de hibridação in
situ e PCR quantitativo indicaram que APLP2 é expressa nas mesmas regiões
que a APP e em níveis semelhantes (Slunt e cols, 1994), reforçando a
14
possibilidade de redundância, ao menos parcial, entre as funções destas
proteínas. Camundongos sem os genes APLP 1 ou APLP 2, além daqueles
sem os genes APP e APLP 1, eram viáveis e férteis, de maneira semelhante
aos camundongos não expressando a APP (Von Koch e cols, 1997; Heber e
cols, 2000).
Analisando os camundongos mutantes com letalidade perinatal, foi
observado que estes apresentavam anomalias cranianas e posicionamento
ectópico de neurônios corticais. Esses erros levaram a falhas na transmissão
de impulsos nervosos no dia do nascimento e ao óbito desses animais pouco
depois. No entanto, alguns desses animais apresentavam desenvolvimento
cerebral aparentemente normal, sugerindo que a letalidade possa ter outra
origem (Heber e cols, 2000; Herms e cols, 2004; Wang e cols.,2005; Yang e
cols, 2005).
Dentre os trabalhos sobre mecanismos fisiológicos envolvendo os
diversos fragmentos da APP695, a maioria está relacionado à função da cauda
citoplasmática da APP, o fragmento AICD (cujas vias de sinalização são mais
conhecidas). Este fragmento se liga, após ser clivado e liberado, às proteínas
reguladoras Fe65 e Mena, que atuam nos sítios de adesão de cones de
crescimento (Sabo e cols 2003).
A porção extracelular secretada da APP (sAPP), apesar de possuir
grande relevância fisiológica demonstrada por diversos trabalhos, ainda tem
vias de sinalização pouco compreendidas. O fragmento p3, embora seja muito
pouco estudado, não teve relevância fisiológica ainda descrita (Gralle e
Ferreira, 2007 para uma revisão).
15
Já foi demonstrado que a expressão de sAPP em camundongos com o
gene da APP removido foi suficiente para resgatar o fenótipo controle (Ring e
cols, 2007). Em C. elegans, a letalidade gerada pela deleção de APL-1 foi
resgatada pela expressão da porção extracelular destra proteína. A porção
extracelular da APP humana também foi capaz de reverter o déficit de
aprendizado em drosófilas sem o gene da APPL.
Alguns estudos indicam que a porção secretada extracelular da APP
pode agir como fator proliferativo para precursores neuronais (Caille e cols
2004) e estimular a mobilidade de queratinócitos (Kirfel e cols 2002). Há
trabalhos indicando o aumento, na presença de sAPP695, da neuritogênese
(Milward e cols 1992), e da formação e modulação sináptica (Morimoto e cols
1998; 1998). Estudos mostraram também que a forma secretada da APL-1,
homólogo da APP em C. elegans, foi capaz de reverter a letalidade do nocaute
deste gene (Hornsten e cols.; 2006).
Diversos trabalhos já propuseram possíveis ligantes para a porção
extracelular da APP, incluindo heparina (Small e cols 1994), Apolipoproteina E
(Haas e cols, 1998), reelina (Hoe e cols, 2006), albumina, CRMP-2 (Pawlik e
cols 2007), integrina β1 (Young-Perse e cols, 2008), NgCAM (Osterfield e cols,
2008). Muitos desses trabalhos são recentes, o que mostra o aumento de
atenção que vem sendo dado a essa área.
I.3.3-Busca de Ligantes para a Proteína Precursora Amilóide
Com o objetivo de identificar possíveis ligantes para a APP, a Professora
Margaret Magdesian utilizou a técnica de apresentação de bibliotecas de
peptideos em fagos (ou “phage display of peptide libraries”). A técnica de
16
phage display foi desenvolvida em 1985 por George Smith e consiste na
apresentação de bibliotecas peptídicas (na presente dissertação utilizamos
uma biblioteca de heptapeptídeos) expressos na superfície de bacteriófagos
filamentosos do tipo M13 (Smith, 1985).
Utilizamos uma biblioteca de phage display (PhD-C7C, New England
Biolabs) com o intuito de identificar peptídeos ligantes da sAPP695α. Após a
seleção e caracterização de peptídeos que ligassem com alta afinidade à
sAPP695α, a seqüência desses peptídeos foi comparada com seqüências de
proteínas depositadas em banco de dados. Essa busca levou à identificação de
semaforinas, mais especificamente semaforinas da classe 3, como possíveis
ligantes para a sAPP695α.
I.4 – Semaforinas
As semaforinas são proteínas relacionadas à navegação de axônios,
sendo classicamente consideradas inibitórias devido a sua capacidade de
direcionar o crescimento axonal, (Tamagnone e Comoglio., 2004),
desempenhando função quimiorepulsiva (He e cols,2002; Fiore & Puschell.,
2003; Polleux e cols, 2000; Giordano e cols, 20002; Moreno-Flores e cols,
2003; Pasterkamp e cols, 2003). As família das semaforinas é caracterizada
pela presença do domínio SEMA, uma seqüência conservada de
aproximadamente 400 aminoácidos (Kruger e cols, 2005).
Além da função inibitória clássica, a Sema3A, assim como alguns outros
membros da família das semaforinas, mostrou capacidade de induzir o
17
crescimento e quimioatração axonal em certas condições (Hong-jun e
cols.;1998). Mais recentemente, vem sendo observada a importância das
semaforinas não apenas no sistema nervoso, como também no sistema
vascular, tendo grande importância na angiogênese (Carmeliet e Tessier-
Lavigne; 2005) e no sistema imune (Mizui e cols, 2009 para uma revisão).
As semaforinas são encontradas tanto na forma transmembranar, como
na forma de proteína secretada. A família das semaforinas atualmente
apresenta mais de 30 membros descritos, os quais, de acordo com suas
características estruturais, estão agrupados em oito subclasses (He e cols,
2002). A estrutura característica da semaforina compreende um domínio Sema,
que é uma seqüência conservada de cerca de 500 aminoácidos presente em
todas as moléculas dessa família, um domínio rico em cisteínas e um domínio
simples, do tipo imunoglobulina IgG-like (Figura. 2)
18
Figura 2: Esquema dos membros da família das Semaforinas. Classes 1 2
pertencem à invertebrados, classes 3-7 pertencem à vertebrados e classe 8 (ou V) pertence à
vírus. As Plexinas, principais receptores de Semaforinas, fazem parte da superfamília das
Semaforinas e possuem um domínio SEMA (em roxo), característico do grupo. Modificado de
Gherardi e cols 2004
As subclasses 1 e 2 são encontradas exclusivamente em invertebrados,
enquanto que as classes 3-7 estão apenas presentes em vertebrados. A classe
8 é codificada apenas por vírus. Das oito subclasses descritas, cinco são
compostas por semaforinas transmembranares (subclasses 1, 4, 5, 6 e 7), e as
demais são secretadas (Goodman e cols, 1999).
19
I.4.1- Semaforina 3A
Dentre os membros da família das semaforinas, a Semaforina 3A
(Sema3A) (anteriormente também chamada de Semaforina III, semaforina D ou
colapsina) é a mais pesquisada e foi a primeira a ser descrita em vertebrados.
A Sema3A foi inicialmente caracterizada pelo seu efeito de colabamento de
cones de crescimento em gânglios da raiz dorsal de embriões de galinha (Luo
e cols, 1993; Wright e cols, 1995)
Sema3A é também encontrada em diversos outros tecidos como tecido
adiposo, coração, ossos, músculos, rins, pulmões. Diversas funções também já
foram sugeridas para a Sema3A, como migração no sistema nervoso (Marin e
Rubenstein 2003; Yu & Moens, 2005), adesão celular, e desenvolvimento de
órgãos como o coração e o pulmão. Trabalhos recentes indicam que a
sinalização para o desenvolvimento e ramificação da vasculatura compartilha
semelhanças com a do sistema nervoso, estando a Sema3A e algumas
plexinas entre essas moléculas (Carmeliet, 2003; Yazdani e Terman, 2006;
Tran e cols, 2007 para revisões).
Camundongos mutantes para o gene da Sema3A morriam poucos dias
após o nascimento e apresentavam uma grande diversidade de alterações
morfológicas (Behar e cols, 1996). Alterações incluíam a projeção inadequada
de neurônios sensoriais na medula vertebral, alterações na orientação de
neurônios no córtex cerebral, deformidades ósseas como fusão de vértebras e
costelas ramificadas e hipertrofia do ventrículo direito, indicando a importância
da Sema3A no desenvolvimento de diversos órgãos. Resultados semelhantes
20
foram obtidos em drosófilas com a deleção do gene da semaforina secretada
de invertebrados, Semaforina 2. Estes animais morriam logo após a eclosão
das pupas, embora nenhuma mudança morfológica tenha sido detectada (Dodd
e Schuchardt, 1995).
I.4.2- Receptores de Semaforina 3A
Os principais receptores para as semaforinas são as plexinas. As
plexinas são proteínas transmembranares que transduzem, tanto em
invertebrados como vertebrados, a sinalização através de semaforinas (Kruger
e cols, 2005). As plexinas também possuem um domínio SEMA, embora
evolutivamente distanciado do domínio SEMA das semaforinas e um domínio
citoplasmático exclusivo das plexinas, fundamental para a transdução do sinal
(Yoshida e cols, 2006) As plexinas são classificadas em 4 classes (A, B, C e D)
e as classes A e D são receptores descritos para as Sema3A (Tran e cols,
2007 para uma revisão). (figura 3a).
O primeiro ligante descoberto para a Sema3A, no entanto, foi a
neuropilina, uma proteína transmembranar que apresenta uma curta cauda
citoplasmática (He e Tessier-Lavigne, 1997). Foram descritas duas
Neuropilinas (1 e 2), mas nenhuma é capaz de transduzir o sinal de Sema3A e
as caudas citoplasmáticas destas proteínas não são necessárias para função.
As neuropilinas são importantes na ligação entre Sema3A e Plexinas da família
A, que é dependente da atuação da neuropilina como coreceptor para
sinalização (Huber e cols, 2003 Yazdani e Terman, 2006; Eickholt, 2008; Roth
21
e cols, 2008). Sema3A também apresenta outros co-receptores como as
proteínas de adesão celular L1CAM e NrCAM (“Cell Adhesion Molecule”)
(Castellani e cols, 2000; Julien e cols, 2005), que também podem atuar
mediando a ligação entre Sema3A e plexinas. (figura 3b)
22
A
B
Figura 3: Os ligantes de Semaforinas. A) Semaforinas e seus principais ligantes, as
plexinas. Sema3A se liga às plexinas da família A e à plexina D1. Retirado de Kruger, 2005. B)
Os receptores e co-receptores da Semaforina3A, Plexinas das famílias A e D, Neuropilinas 1 e
2, L1CAM e NrCAM. Modificado de Tran e cols, 2007.
O objetivo deste trabalho foi avaliar esta possível ligação entre
sAPP695α e Sema3A, a principal semaforina de classe 3 de vertebrados,
utilizando métodos bioquímicos, biofísicos e análise em cultura de células.
23
2 - Objetivos:
Os objetivos do presente trabalho são:
A partir da indicação, obtida através do uso da metodologia de “phage
display”, de que as semaforinas são possíveis ligantes para sAPP695α,
investigar bioquimicamente a ligação entre essas duas proteínas;
De maneira complementar, investigar o efeito dos peptídeos
selecionados por “phage display” e sua interferência na ligação entre
sAPP695α e Sema3A;
Analisar os efeitos de sAPP695 e dos peptídeos selecionados por
“phage display” sobre a retração neurítica promovida por Sema3A.
24
3 – Material e Métodos
3.1 – Apresentação de Bibliotecas de Peptideos em Fagos:
Esta etapa inicial do trabalho foi realizada pela Profa. Margaret
Magdesian, que já havia, com sucesso, utilizado essa técnica para a
identificação de ligantes para o peptídeo amilóide beta (Magdesian e cols 2005;
Magdesian e cols 2008). 50 μl de uma solução de sAPP695α (100ng/ml em
PBS) foram incubados em poços de placa de ELISA por 16 horas a 4 ºC. Os
poços foram bloqueados com 0,5% de albumina bovina (BSA) em PBS por 1
hora a 4ºC e, após a lavagem com PBS, foram adicionados a cada poço 10 μl
da biblioteca de peptideos apresentados em fagos (PhD-C7C, New England
Biolabs) e incubados segundo recomendações do fabricante.
Após cinco ciclos de seleção, 28 clones foram isolados, amplificados e o
DNA dos fagos foi seqüenciado. As seqüências correspondentes aos peptídeos
expressos na superfície dos fagos foram, então, comparadas com as
seqüências de proteínas depositadas em banco de dados (NCBI) usando o
programa BLAST (Altschul, e cols, 1997). Foram apenas consideradas na
pesquisa proteínas expressas no sistema nervoso e que fossem encontradas
na membrana ou no meio extracelular.
25
Figura 4: Representação das etapas do phage display. Após a Incubação da
sAPP695α ( { ) com a biblioteca de fagos e a lavagem para retirar ligações menos específicas,
os fagos selecionados foram eluídos, amplificados em E. coli e o ciclo foi repetido mais cinco
vezes para selecionar apenas os fagos com maior afinidade pela sAPP695α. Os clones
selecionados foram seqüenciados para identificação dos heptapeptídeos com afinidade pela
3.2 – Expressão e Purificação sAPPα695
Quando ingressei no mestrado, já havia sido bem estabelecida no
laboratório a cultura de três diferentes linhagens de Pichia pastoris, cada uma
expressando a forma secretada de uma das três principais isoformas da APP
humana (sAPP695α, sAPP751α e sAPP770 α) (Gralle e cols, 2002; Botelho e
cols, 2003; Gralle e cols, 2006). Essas três linhagens de Pichia pastoris foram
26
cedidas ao laboratório pelo grupo do professor Roberto Cappai do
Departamento de Patologia da Universidade de Melbourne, Austrália (Henry e
cols, 1997). Apenas a linhagem expressando sAPP695α foi utilizada no
presente trabalho.a
A Pichia pastoris é uma levedura metilotrófica muito usada para a
expressão de proteínas, em pequena ou larga escala, de proteínas (Daly e
Hearn, 2005; Cregg, 2007; Anumanthan e cols, 2007). A expressão em Pichia
pastoris se baseia na indução da expressão do gene de interesse com o uso de
uma região promotora do gene da Álcool Oxidase (AOX1), importante para o
metabolismo do metanol, sendo induzida por este. Isso permite um melhor
controle da expressão, além de uma grande eficiência na produção da proteína
recombinante. Adicionalmente, a proteína pode ser secretada diretamente no
meio de cultura, facilitando a purificação, uma vez que evita a necessidade de
lise das células de levedura.
A expressão e purificação da sAPP695 foi realizada como descrito por
Gralle e cols, 2002. Resumidamente, leveduras do estoque a -80 ºC foram
descongeladas e plaqueadas em meio YPD (1% de extrato de levedura, 2% de
triptona, 2% de glicose) sólido e crescidas por 48 horas a 30ºC. Em seguida,
culturas isoladas foram amplificadas em 4 frascos de Erlenmeyer contendo 100
ml de meio YPD. As leveduras foram incubadas a 30ºC sob agitação a 200
rotações por minuto (RPM) até que a absorbância a 600 nm do meio diluído 20
vezes fosse igual ou superior a 0,250. As leveduras foram, então, centrifugadas
a 1.500 x g por 10 minutos a 25ºC, transferidas para 4 frascos contendo 500 ml
de meio BMMY (1% de extrato de levedura, 2% de triptona, 1,34% de base
27
nitrogenada sem aminoácidos (DIFCO), tampão fosfato de sódio 100 mM) e
crescidas a 30ºC, 200 RPM por 48 horas.
Após este período, a solução foi centrifugada por 30 minutos a 4ºC,
11.000 RPM. O sobrenadante foi recolhido, acrescido de 20% de Tampão A
concentrado 5 vezes (solução estoque concentrada 5 vezes – 100 mM
Imidazol, 50 mg/ml PMSF, 25 mM EDTA, pH 5,5), filtrado e aplicado numa
coluna Hiload 26/10 (GE Healthcare) contendo 60 ml de Q Sepharose Fast
Flow (GE Healthcare). A coluna havia sido previamente equilibrada com 60 ml
de tampão A (1X) com fluxo de 2,5 ml/min seguidos de 300 ml de tampão A a
10 ml/min. Em seguida, foi aplicado o meio de cultura com sAPP695α já em
tampão A a 10 ml/min e, logo depois, 1.200 ml de tampão B (solução estoque
concentrada 5 vezes -20 mM Imidazol, 10 mg/ml PMSF, 5 mM EDTA, 0,25M
NaCl, pH 5,5).
A sAPP695α foi eluída da coluna usando-se 70 ml de tampão C (20 mM
Tris, 10 mg/ml PMSF, 5 mM EDTA, 1 M NaCl, pH 7,4) a um fluxo de 2,5
ml/min. Os primeiros 30 ml e os últimos 20 ml foram recolhidos em tubos de
polipropileno de 50 ml e os 20 ml intermediários foram recolhidos em alíquotas
de 1ml em tubos de polipropileno de 1,5ml. A coluna, então, foi lavada a um
fluxo de 5 ml/min com 50 ml de 20mM Tris, 1M NaCl e, a 2,5 ml/min com 80 ml
de uma solução de 20 mM Tris pH 7,4 em 20% Etanol.
As alíquotas recolhidas na eluição da coluna foram analisadas em géis
de 8% de poliacrilamida contendo SDS e coradas com Comassie Blue. As
alíquotas contendo sAPP695 apresentavam uma forte banda com massa
molecular aparente de cerca de 70 kDa. As alíquotas contendo sAPP695
28
foram colocadas num mesmo frasco, acrescidas de 3 vezes seu volume com
uma solução de 50 mM Tris pH 7,4 e aplicadas em uma coluna de afinidade
Hitrap Heparin HP de 5 ml (GE Healthcare), pois a sAPP695α possui um
domínio de ligação à heparina (Mok e cols., 1997, Turner e cols, 2003).
A coluna de heparina foi equilibrada com 50 ml de solução Tris 50 mM,
pH 7,4 (tampão A2) antes de ser utilizada e a amostra foi diluída 4 vezes em
tampão A2. Utilizando uma bomba peristáltica, a amostra foi passada na coluna
de heparina com um fluxo de 0,6 ml/min. Então, passou-se mais 15 ml de
tampão A2 e a bomba peristáltica foi desligada. A coluna foi, então, transferida
para o aparelho de cromatografia líquida de alto desempenho (High
Performance Liquid Chormatography – HPLC - Shimadzu Bombas LC-10AV,
leitores SPD 10AV e RF 10Axl). Antes de transferir a coluna para o HPLC, as
duas bombas do aparelho, A e B, foram purgadas com água MilliQ 2 vezes,
intercaladas por fluxos contínuos a 1 ml por minuto por cerca de cinco minutos.
O processo foi, em seguida, repetido utilizando-se o tampão A2 na bomba A e
o tampão B2 (Tris 50 mM, pH 7,4, 1M NaCl) na bomba B. Depois, utilizando
somente a bomba A, passou-se, por cerca de 5 minutos num fluxo de 1 ml por
minuto, tampão A2 no HPLC, com o objetivo de retirar quaisquer vestígios de
NaCl nas tubulações do aparelho. Feito isso, foi ligado o fluxo contínuo da
bomba A (0,6 ml por minuto) e a coluna de heparina foi conectada ao HPLC. É
importante que o fluxo seja lento para que a sAPP695α se solte num menor
volume de tampão e para que a pressão na coluna não exceda 10 atm,
pressão máxima indicada pelo fabricante.
Enquanto o tampão A2 passava pela coluna, os leitores de absorbância
(280 nm ou 220 nm) e fluorescência (excitação a 280 nm e emissão a 330 nm)
29
foram ligados e a purificação só foi reiniciada quando os dois leitores estavam
estabilizados. A absorbância a 220 nm detecta a ligação peptídica e a
absorbância a 280 nm detecta basicamente aminoácidos aromáticos. A
excitação a 280 nm e emissão de fluorescência a 330 nm (proveniente de
aminoácidos como o triptofano e a tirosina) também foi adotada como outro
parâmetro para detectar sAPPα695.
A sAPP695α foi eluída da coluna de heparina através do aumento da
concentração de NaCl no tampão. Para isso, foi utilizado um programa que, ao
longo da corrida, mistura os tampões A2 (sem NaCl) e B2 (1M NaCl),
aumentando gradativamente a proporção de tampão B2 na coluna de heparina
(Figura 6).
Figura 5: Concentração de NaCl na coluna de heparina ao longo do tempo. O
gráfico representa a alteração na concentração de NaCl na coluna de heparina através da
mistura entre tampão A2 e B2 ao longo do tempo no HPLC. A sAPP695α era recolhida entre as
concentrações 0,3 M e 0,55 M de NaCl.
30
A sAPP695α foi recolhida quando os detectores indicaram um pico
intenso de proteína entre 0,3 e 0,55 M de NaCl. As frações foram recolhidas
em tubos de 1,5 ml para posterior análise por géis de poliacrilamida e detecção
de proteínas no gel por Coomassie Blue.
As alíquotas contendo sAPP695 e que não apresentavam
contaminantes protéicos foram misturadas e aplicadas numa coluna de
dessalinização. De maneira resumida, a coluna foi, primeiro, equilibrada com
25 ml de tampão A2. Em seguida, foram aplicados 2,5 ml de amostra e mais 25
ml de tampão A2. Assim que esse volume foi adicionado, os primeiros 3,5 ml
eluídos da coluna foram recolhidos e o resto foi descartado.
Por fim, a concentração de sAPP695α purificada foi estimada por
absorbância a 280 nm. Feito isso, a proteína foi filtrada num filtro de 0,45 μm,
aliquotada e armazenada a -80ºC até o uso.
3.3 -Biotinilação de sAPP695α
A biotinilação é uma técnica muito utilizada para marcação e fácil
detecção de proteínas. A biotinilação foi feita usando o kit “EZ-Link Sulfo-NHS-
LC-Biotinylation” da Pierce de acordo com as recomendações do fabricante:
100 ng de sAPP695a (1,5 pmol) foram incubados a 4ºC por 2 horas com 20
vezes de excesso molar (30 pmol) de Sulfo-NHS-LC-Biotin. Após esse período,
o excesso de biotina foi inativado com 300 pmol de glicina a 4ºC por mais 2
horas. Em seguida, a sAPP695α biotinilada (bsAPP695α) foi passada em um
31
Centricon Ultracel YM-30 e centrifugada a 4.000 X g por 20 minutos a 4ºC,
quando o volume da solução foi reduzido a cerca de 200 μl. O volume foi
completado para 1,5 ml e o processo foi repetido 4 vezes. Em seguida, o
Centricon foi invertido e centrifugado por 2 minutos a 1.000 x g, 4ºC, sendo a
amostra de 200 μl recolhida num tubo e armazenada a 4 ºC por até uma
semana.
3.4 - Semaforina3A
Sema3A purificada foi comprada da R&D systems (Recombinant Human
Semaphorin 3A Fc Chimera, Nº de catálogo 1250-S3). Por ser uma das mais
estudadas, a Sema3A possuia maior disponibilidade comercial, tanto de
proteínas recombinantes como de anticorpos, e isso foi levado em
consideração na escolha da Sema3A nos experimentos.
A Professora Daniela Uziel (Instituto de Ciências Biomédicas, UFRJ)
gentilmente nos cedeu a linhagem celular HEK293 (Graham e cols, 1977)
transfectada com um gene de Sema3A conjugado à fosfatase alcalina bovina
(Sema3A-AP) (Püschel e cols, 1995). As células foram cultivadas em DMEM
10% BFS e o meio de cultura foi trocado a intervalos de 3 dias. O meio
recolhido, contendo a Sema3A-AP secretada pela linhagem celular, foi filtrado,
acrescido do inibidor de protease PMSF (fluoreto de fenilmetil sulfonila – USB
Corporation) para uma concentração final de 1 μg/ml, aliquotado em pequenos
tubos e congelado até o uso.
32
3.5 – Peptídeos
Os peptídeos sintéticos com seqüências TFASVMT e LRSHPLG foram
sintetizados pela empresa New England Peptides (MA, Estados Unidos).
3.6 - Ensaios de ligação entre sAPP695α e Semaforina 3A em placas de ELISA
Nos ensaios de ligação entre sAPP695 e Sema3A, uma das proteínas foi
imobilizada enquanto a outra foi adicionada em solução. Para os experimentos
com sAPP695 imobilizada, 50 μl de sAPP695 2 μg/ml (100 ng) diluída em PBS
foram incubados durante a noite a 4ºC sob agitação em cada poço de uma
placa de 96 poços. Quando Sema3A foi imobilizada, foram incubados 50 l de
1 g/ml de Sema3A nas mesmas condições.
Após esse tempo, os poços foram lavados 3 vezes por cinco minutos
com 200 μl de PBS e bloqueados com uma solução de 1% de lisozima de clara
de ovo de galinha (Sigma) em PBS por 1 hora. Apesar de a BSA ser a proteína
mais utilizada para bloqueio em ensaios deste tipo, um trabalho anterior
sugeriu que a sAPP695α pode se ligar à albumina de soro (Pawlik M. e cols,
2007), motivando nosso uso de lisozima. Em seguida, os poços foram
incubados com diferentes concentrações de Sema3A ou bsAPP695α (entre 10
ng e 200 ng) ou meio condicionado de células HEK293 capazes de secretar
Sema3A-AP (entre 10 e 400 μl) durante a noite a 4ºC sob agitação.
33
No dia seguinte, os poços foram lavados 5 vezes com 200 μl PBS por 5
minutos e incubados com anticorpo primário de cabra anti-Sema3A (Sigma) ou,
no caso do emprego de proteínas biotiniladas no passo anterior, estreptavidina
conjugada à peroxidase de raiz-forte (Horseradish peroxidase, HRP) por 2
horas nas mesmas condições descritas. Por fim, os poços foram lavados 5
vezes com 200 μl de PBS por 5 minutos e as placas incubadas com o anticorpo
primário anti-Sema3A foram incubadas com o anticorpo secundário conjugado
à HRP (Santa Cruz) por 2 horas. As placas incubadas com b sAPP695α foram
incubadas por 2 horas com estreptavidina conjugada à HRP (MP
Biochemicals). A detecção nas duas condições foi realizada utilizando o kit
Super Signal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Pierce) segundo as
indicações do fabricante e revelado com filmes Kodak T-MAT G/RA. A
quantificação foi feita usando-se o programa Image J (Rasband, WS., 1997 -
http://rsbweb.nih.gov/ij/) e avaliando a intensidade dos pontos numa escala de
cinza na área correspondente a cada poço.
A detecção de Sema3A-AP ligada à sAPP695 foi feita utilizando p-
nitrofenil fosfato (pNPP) como um substrato para a fosfatase alcalina. A
fosfatase alcalina catalisa a hidrólise desse substrato a p-nitrofenol, que pode
ser detectado por sua absorbância a 405 nm. De maneira resumida, após a
incubação com meio condicionado durante a noite a 4ºC sob agitação, os
poços foram lavados com PBS como indicado acima e incubados com 120 μl
de uma solução contendo Tris 100 mM, 20 mM MgCl2, pH 7.4, acrescidos de
30 μl de pNPP 10 mM por 1 hora a 37ºC. O sobrenadante foi transferido para
uma nova placa de 96 poços e a quantidade de p-nitrofenol em solução foi
34
detectada num leitor de ELISA a 405 nm (Spectra Max 190 – Molecular
Devices).
3.4 -Co-imunoprecipitação de sAPP695α e Semaforina 3A
Foram realizadas tanto a precipitação de bsAPP695α e co-
imunoprecipitação de Sema3A quanto a precipitação de Sema3A e co-
imunoprecipitação de bsAPP695α. Para o experimento com bsAPP695α
imobilizada, foram usados, em cada condição, 15 µl de Dynabeads ligadas à
streptavidina (Invitrogen). As dynabeads foram lavadas 3 vezes com 500 µl de
PBS (foram adicionados 500 µl de PBS ao tubo, este foi invertido 5 vezes,
submetido a uma rápida centrifugação e o sobrenadante foi recolhido com uma
micropipeta) e incubadas com 300 ng de bsAPP695 num volume final de 100
µl de PBS por 1 hora a 4ºC sob agitação leve. Em seguida, as beads foram
lavadas 3x com 200 µl de PBS e incubadas com 120 µl de meio condicionado
contendo Sema3A-AP por 16 horas a 4ºC sob agitação leve.
Os experimentos foram realizados tanto na ausência quanto na
presença dos peptideos identificados por “phage display” (ver “Resultados”),
adicionados em excesso de 3 vezes a concentração molar de sAPP695a. As
dynabeads foram então lavadas 3 vezes com 200 µl de solução de Kessler
0,05% NP40 (50mM Tris pH 8,6; 5mM EDTA; 150mM NaCl; 100mg/L Azida;
0,05% NP 40) e 1 vez com 200 µl de PBS. Então, as dynabeads foram
incubadas com 30 µl solução de pNPP 10 mM em 120 µl de 100 mM Tris (pH
35
8); 20 mM MgCl2 por 2 horas a 37ºC. Os tubos foram centrifugados e os
sobrenadantes transferidos para uma placa de 96 poços e lidos em um leitor de
ELISA a 405 nm.
Para o experimento com Sema3A imobilizada, foram usados 15 µl por
condição de Proteína-A ligada à resina de Sepharose (“Sepharose beads”,
AmershamGE). A Proteína-A é uma proteína encontrada na superfície de
Staphylococcus aureus e é capaz de se ligar à porção Fc da IgG. A resina foi
lavada 3 vezes com 200 µl de PBS e incubada com 300 ng de anticorpo anti-
Sema3A por 1 hora a 4ºC sob agitação leve. Em seguida, as contas foram
lavadas 3 vezes com 200 µl de PBS e incubadas com 120 µl de meio
condicionado contendo Sema3A-AP por 2 horas a 4ºC sob agitação leve.
Então, as contas foram novamente lavadas 3 vezes com 200 µl de PBS e
incubadas com 300 ng de b sAPP695α (na presença ou ausência dos
peptídeos LR e TF, ver “Resultados”) por 16 horas a 4ºC sob agitação leve. Em
seguida, as contas foram lavadas 3 vezes com 200µl de solução Kessler 0,05%
NP40, 1 vez com 200 µl de PBS e ressuspensas em 24 µl de PBS e 6 µl de
tampão de corrida 5x concentrado.
A resina foi fervida por 2 minutos e 25 µl do sobrenadante foram
analisados por SDS-PAGE 8%. As proteínas foram transferidas para uma
membrana de nitrocelulose Hybond (Amersham). A membrana foi lavada com 5
ml de TBS-T (50 mM Tris, pH 7,4; 150 mM NaCl; 0.1% Tween 20) e bloqueada
com 5 ml de solução 1% de BSA em TBS-T por 2 horas a 4ºC sob agitação,
quando 2 µl de estreptavidina conjugada à HRP (MP Biochemicals) foram
adicionados à solução de bloqueio, sendo incubado por 1 hora a 4ºC sob
agitação.
36
3.8 -Cultura Dissociada de neurônios de Gânglios da Raiz Dorsal (GRD)
A cultura de explantes de gânglios da raiz dorsal (GRD) de embriões de
galinha de sete dias é um modelo clássico para o efeito da semaforina tanto de
retração neurítica como de colabamento de cones de crescimento (Luo e cols,
1993). Além disso, a APP é uma proteína encontrada em galinhas e em GRD
(Nishimura e cols, 2003) Por estas razões, este modelo foi adotado.
Os experimentos com culturas de GRD foram realizados no laboratório
de Neuroquímica, chefiado pelo professor Fernando Mello, no Instituto de
Biofísica da UFRJ. Os experimentos foram realizados segundo o protocolo e
com o auxílio do professor Ricardo Reis, do mesmo laboratório (de Melo Reis e
cols, 2008).
Placas de cultura com poços de 35 mm de diâmetro foram incubadas
com 250 μl de uma solução de poli-L-lisina 10 μg/ml por 16 horas. Em seguida,
os poços foram lavados 3 vezes com 500 μl de PBS e as placas foram secas
por 30 minutos. Foram adicionados, então, 50 μl de uma solução de laminina
20 μg/ml em Meio basal de Eagle modificado por Dulbecco (Dulbecco's
Modified Eagle Medium - DMEM) no centro desses poços, que foram deixados
por cerca de 2 horas na estufa a 37ºC. O excesso de laminina foi removido
pouco antes de plaquear as células
Ovos embrionados de galinha White Leghorn foram obtidos de uma
granja local (Tolomei) e mantidos a 38ºC em uma atmosfera úmida. Embriões
de 7 dias (E7) foram sacrificados por decapitação e os gânglios da raiz dorsal
(GRD) da região lombar foram dissecados em uma placa de Petri contendo
37
solução salina de Hank livre de Ca2+ e Mg2+ (“calcium magnesium free Hank´s
buffer salt solution”, CMF-HBSS, contendo 130 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM
Na2HPO4, 0,5 mM KH2PO4, 10 mM NaHCO3 e 10 mM glicose). Toda a
dissecção foi realizada utilizando pinças e agulhas de tungstênio afinadas por
eletrólise, com o auxilio de uma lupa.
De maneira resumida, os embriões foram abertos ventralmente e
eviscerados. Em seguida, utilizando uma pipeta Pasteur, a região dissecada foi
lavada cuidadosamente com jatos de solução CMF-HBSS, tomando-se o
cuidado de não danificar as regiões mais profundas, onde estão localizados os
gânglios.
Utilizando agulhas de tungstênio e pinças, os gânglios foram retirados da
espinha dorsal, limpos e transferidos para outro recipiente. Em seguida, todos
os gânglios dissecados e limpos foram transferidos para um tubo de 15 ml
contendo CMF-HBSS com tripsina 0,05% e foram incubados por 12 minutos a
37ºC.
Os gânglios foram, então, lavados com DMEM contendo 10% de soro
fetal bovino (BFS) e 3 vezes com CMF-HBSS, centrifugados, re-suspensos em
cerca de 2 ml de CMF e dissociados mecanicamente com uma pipeta Pasteur
de ponta fina. Essa suspensão de células foi, então, cuidadosamente colocada
em uma coluna de sedimentação contendo 60 ml de DMEM 10% BFS
preparada pelo menos 12 horas antes e mantida a 4ºC e isolada de vibrações.
A coluna separa, por sedimentação diferencial, neurônios de diferentes origens,
grumos de células e pedaços de células gerados pela dissociação (de Melo
Reis e cols, 2008). O meio de cultura DMEM acrescido de 10% de BFS a 4ºC
38
permite que as células mais pesadas, os neurônios, atravessem mais
rapidamente a coluna.
Após a sedimentação por 1 hora, 12 frações de 5 ml cada, foram
coletadas e analisadas por microscopia ótica para a identificação das frações
ricas em neurônios e pobres em outros tipos celulares. As melhores alíquotas
foram reunidas num tubo e plaqueadas nos poços previamente preparados. O
total de meio em cada poço foi de 300 μl e as culturas foram mantidas por 24
horas em estufa a 37ºC, 5% CO2 até o início dos ensaios de colabamento de
neuritos.
3.9 - Ensaios de retração de neuritos
Os ensaios de retração neurítica foram realizados com culturas
dissociadas de GRD de embriões de galinha mantidas por 24 horas em cultura.
Num microscópio Nikon Eclipse 300 com a objetiva de 40 vezes de aumento,
um grupo de neuritos foram focalizados e, então, foram adicionados à cultura
0,8 nM de Semaforina 3A, 75 nM de sAPP695α, 75nM dos peptídeos TF e LR
ou 100 μl de meio condicionado contendo Sema3A-AP. Como controle, foram
adicionados de igual maneira 100 μl de meio condicionado de células HEK293
não transfectadas com Sema3A-AP. Os neuritos foram fotografados antes da
adição das moléculas e depois a cada 5 minutos, totalizando 35 minutos de
experimento para cada condição.
39
3.10 -Cultura de Explantes de Gânglios da Raiz Dorsal ou de Córtex Cerebral
Foram feitas culturas com dois tipos de explantes: gânglios da raiz
dorsal de embriões de galinha ou córtex cerebral de embriões de camundongos
ou ratos. Placas de cultura foram preparadas e os gânglios dissecados como
descrito anteriormente. Após a dissecção, os gânglios foram colocados no
centro de poços e cobertos com 180 μl de meio DMEM, volume mínimo para
cobrir os explantes, pois em grandes quantidades de meio os explantes
poderiam boiar, não se fixando no substrato. Após cerca de uma hora, para a
fixação dos explantes, foram adicionados aos poços mais 100 μl de meio
DMEM. O meio utilizado para esses explantes possuía fator de crescimento
neuronal (nerve growth factor - NGF) 2.5S numa concentração de 20 ng/ml.
No caso da cultura de fatias de córtex de embrião de camundongo ou de
rato, a cabeça dos embriões foi aberta e os cérebros retirados. O córtex foi
separado das demais regiões, limpo e cortado em um “tissue chopper”
(McIllwain) em quadrados com áreas entre 200 cm2 e 300 cm2. Os pedaços de
tecido foram plaqueados de maneira semelhante aos gânglios, mas sem a
adição de NGF 2.5S. Córtices de camundongos foram, muitas vezes,
gentilmente cedidos pela professora Daniel Uziel, do Instituto de Ciências
Biomédicas - UFRJ
40
3.11 – Ressonância Plasmônica de Superfície
A Ressonância Plasmônica de Superfície é uma técnica que se baseia
na medição em alterações no índice de refração a cerca de 300nm da
superfície de um sensor (Jonsson e cols, 1991; 1992; 1993). No sistema
BIAcore, essa superfície forma a base de um canal por onde passa uma
solução em fluxo contínuo. Um acúmulo de material (como proteínas) nesta
superfície resulta num aumento do índice de refração, que é medido em
unidades de ressonância (UR).
A Ressonância Plasmônica de Superfície (RPS) vem sendo muito
utilizada na detecção de ligação entre proteínas, uma imobilizada em uma
matriz (ou “chip”) e outra em solução, que é exposta à primeira. As vantagens
desse método incluem grande sensibilidade, detecção de interações
moleculares em tempo real e a não necessidade de uso de marcadores
secundários.
41
A
C
B
Figura 6: Representação esquemática da análise através de ressonância
plasmonica de superfície. (A) A luz polarizada incide na superfície do chip de ouro e é
parcialmente refletida. Alterações no ângulo de incidência alteram a quantidade de luz refletida,
e essa quantidade é mínima num dado ângulo, quando ocorre o efeito de ressonância
plasmônica de superfície. Este ângulo é denominado ângulo crítico. O aumento de massa na
superfície oposta do chip implica um aumento deste ângulo crítico. Deste modo, se o ângulo
crítico for medido com uma proteína imobilizada no chip e, após a exposição a uma outra
proteína, houver aumento do ângulo crítico, isto indica aumento de massa na superfície do
chip, implicando em ligação entre as duas proteínas. (B) Esquema do aparelho utilizado,
indicando o feixe de luz polarizada focalizado através de um prisma na superfície do chip
contendo a amostra. A quantidade de luz refletida para cada ângulo de incidência é detectada.
(C) gráfico representando a alteração da quantidade de luz refletida de acordo com o ângulo de
incidência, sendo A uma superfície sem moléculas aderidas e B uma superfície na qual houve
aumento de massa.
42
O equipamento utilizado foi o Biacore X (BIAcore Life Sciences – GE
Healthcare). Este aparelho possui duas “flow cells” (FC), que são duas
câmaras, localizadas sob o chip em que o experimento é realizado, nas quais
podem ser detectadas alterações no aumento de massa na região da matriz,
que refletem a ligação entre as proteínas. Em todos os experimentos a FC I foi
utilizada como controle e a FC II utilizada para o experimento.
O experimento foi realizado imobilizando-se sAPP695α (ligante) no chip
e testando a ligação desta à Sema3A recombinante purificada (R&D ) (analito).
O chip utilizado foi o CM5 e as analises foram feitas usando o tampão HBS-EP
(Hepes Buffer Saline, 3mM EDTA, 0,005% surfactante P20, pH 7,4 ) comprado
da BIAcore, num fluxo de 10 μl/minuto.
A imobilização de sAPP695α no chip foi feita segundo instruções da
BIAcore, produtora do chip e do aparelho para SPR. De maneira resumida,
para a ativação da matriz foram injetados 70 μl de uma solução 1:1 de etil-3-
(3-dimetil aminopropil) cloridrato de carbodiimida (EDC) e N-hidroxi succinimida
(NHS), fornecidas pelo fabricante (BIAcore, Amine Coupling Kit). A sAPP695α,
numa concentração de 20 μg/ml em tampão acetato 10 mM (pH 4), foi
adicionada à matriz para ligação covalente. Esse pH foi utilizado pois o pH do
tampão tem de estar acima de pH 3,5, para que a matriz esteja negativamente
carregada, e abaixo do pH 4,5 ponto isoelétrico da sAPP695α. Para evitar que
outras proteínas possam se aderir ao chip, foram adicionados 70 μl de
etalonamina, fornecida pelo fabricante, que funciona retirando os domínios no
chip responsáveis pela ligação da proteína (figura 5).
43
UR
Início da ativação
da matiz
Início bloqueio com etanolamina
Término da injeção
Início injeção
APP
Término da injeção Término da injeção
∆UR
Tempo (s)
U
ni
da
de
s
de
R
es
so
nâ
nc
ia
Fig. 7: Ligação da sAPP695α à matriz do chip CM5. O primeiro aumento em UR
representa a injeção da solução 1:1 EDC e NHS, ativadora da matriz do chip. A segundo
aumento em UR representa a injeção de sAPP695α, e o terceiro aumento em UR representa a
injeção de etanolamina, com o fim de impedir a matiz que não se ligou à APP de se ligar
covalentemente a outro ligante.
Para o ensaio de ligação, foram injetados 40 μl de tampão HBS-EP com
duas concentrações diferentes de Sema3A (5 μg/ml e 10 μg/ml) nos dois
canais do chip num fluxo de 5 μl por minuto. A medida da ligação foi avaliada
pelo aumento em Unidades de Ressonância (RU) nos canais Flow Cell I (FC I),
Flow Cell II (FC II) e na subtração do RU do canal contendo sAPP695α (FC I)
da RU do canal controle (FC II). Foram utilizados 5 μl de NaOH 0,5 M para
soltar Sema3A da sAPP695α imobilizada.
44
4 – Resultados:
4.1 – Busca de ligantes da sAPP695α através da apresentação de bibliotecas
de peptideos em fagos.
Antes do início de meu trabalho no laboratório, a Profª Margaret
Magdesian, em colaboração com os então alunos de graduação Milena Mouta
Verdan França de Carvalho e Luiz Henrique Guerreiro Rosado, iniciaram o
projeto de identificação de novos ligantes para sAPP695α empregando a
metodologia de apresentação de bibliotecas de peptideos em fagos (ou “phage
display”; ver “Material e Métodos”).
A busca por “phage display” de ligantes para sAPP695α resultou numa
tabela contendo a seqüência dos peptídeos obtidos. Dentre eles, dois se
destacaram, o peptídeo LRSHPLG, encontrado em cinco dos 28 clones
identificados, e o peptídeo TFASVMT, encontrado em 2 clones. Quando
comparados com seqüências de proteínas depositadas em diferentes bancos
de dados, ambos os peptídeos apresentaram homologia com a família das
Semaforinas (figura 6).
45
Figura 6: Os peptídeos LRSHPLG e TFASVMT apresentam homologia à Semaforinas. O
alinhamento dos peptídeos LRSHPLG e TFASVMT (selecionados por “phage display” como
ligantes da sAPP695α) com diferentes proteínas humanas da família das Semaforinas. Em
vermelho, aminoácidos conservados e em azul aminoácidos substituídos conservativamente. O
alinhamento foi feito usando o programa Clustal W (Larkin e cols 2007)
De maneira também interessante, outros dois peptídeos (RPAASDR e
NLANSFV) selecionados por “phage display” como ligantes da sAPP695a,
apresentaram homologia a plexinas, receptores de semaforinas (Figura 7)
46
Figura 7: Os peptídeos RPAASDR e NLANSFV apresentam homologia à Plexinas.
Alinhamento dos peptídeos RPAASDR e NLANSFV, ligantes da sAPP695α, com diferentes
Plexinas. Em vermelho, aminoácidos conservados, e em azul, aminoácidos substituídos
conservativamente. O alinhamento foi feito usando o programa Clustal W (Larkin e cols 2007)
A seqüência da Sema3A foi, então, comparada à seqüência dos
peptídeos com homologia às semaforinas de classe 3 e foi identificada a região
da Sema3A com a qual os peptídeos possuíam homologia. Os peptídeos
LRSHPLG (em azul) e TFASVMT (em vermelho) são mostrados na projeção da
estrutura tridimensional da Sema3A (Figura 8). De maneira interessante, a
região em amarelo e vermelho corresponde a resíduos envolvidos no
reconhecimento de receptores. A imagem foi gerada usando o programa
RasMol e a seqüência da Sema3A foi obtida do Protein Data Bank (código de
acesso 1Q47; 37) (Antipenko; 2003).
47
Figura 8: Representação tridimensional da estrutura da Sema3A. Representados estão os
peptídeos LRSHPLG (em azul) e TFASVMT (em vermelho). A região em amarelo e vermelho
corresponde a resíduos envolvidos no reconhecimento de receptores (Antipenko e cols, 2003).
A figura foi gerada usando o programa RasMol (Sayle e Milner-White, 1995) e as coordenadas
atômicas para a proteína Sema3A (código de acesso 1q47;37 no “Protein Data Bank”;
Antipenko e cols 2003)
4.2 – sAPP695 interage com Semaforina 3A in vitro:
Para investigar diretamente a ligação entre sAPP695α e Sema3A,
sugerida pelos resultados de phage display, poços de uma placa de 96 poços
foram recobertos com sAPP695α, bloqueados e expostos a diferentes
concentrações de Sema3A em solução. Após diferentes lavagens, a
48
quantidade de Sema3A que se ligou à sAPP695α imobilizada foi detectada
com anticorpos anti-sema3A, seguido pela incubação com anticorpo
secundário conjugado a HRP e revelação. O sinal emitido por cada poço foi
captado com o auxílio de um filme de raios-X (Figura 9). Esse primeiro
resultado sugere que Sema3A se liga à sAPP695α de maneira dose-
dependente (Figura 9). É importante observar que Sema3A não foi detectada
nos poços nos quais BSA estava adsorvido e que poços não incubados com
Sema3A não apresentaram reatividade no ensaio.
.
49
Figura. 9: Sema3A se liga à sAPP695α adsorvida à placas de ELISA de modo
dose dependente. Poços de placas de 96 poços foram forrados com 50 ng de Sema3A, 50 ng
de sAPP695α (APP) ou 1 μg de BSA. Os poços foram bloqueados com 1% BSA e expostos a
diferentes concentrações de Sema3A. Após lavagem, a ligação foi avaliada com anticorpo
primário anti-Sema3A e o correspondente anticorpo secundário, e revelação com o uso do kit
Super Signal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate. A quantificação foi feita com o uso
do programa Image J. Este gráfico representa a média de 3 experimentos independentes
realizados em triplicata.
Sema3A 30ng 50ng 100ng 200ng - - 50ng
50ng APP + + + + + - -
50
Repetimos o experimento de ligação entre sAPP695α e Sema3A
usando, desta vez, o meio condicionado pelas células HEK293 contendo
Sema3A-AP (Figura 10). De maneira semelhante à Sema3A comercial, a
Sema3A-AP secretada pelas células HEK293 ligou-se à sAPP695α imobilizada
de maneira dose-dependente.
Fig. 10: Sema3A conjugada à fosfatase alcalina (Sema3A-AP) se liga à sAPP695α
adsorvida à placas de ELISA de modo dose dependente. Poços de placas de 96 poços
foram forrados com 50ng sAPP695α (APP). Os poços foram bloqueados com 1% BSA e
expostos a diferentes volumes de meio condicionado por células HEK293 transformadas para
secretar Sema3A-AP. Após lavagem, a ligação foi avaliada pela atividade da fosfatase alcalina
com o uso do substrato pNPP. O sobrenadante foi colocado, após 1 hora, em placas de 96
poços e a amostra foi lida a 405 nm num leitor de placa. Este gráfico representa a média de 3
experimentos independentes realizados em triplicata.
51
4.3 – Ensaios de ligação entre sAPP695α e Semaforina 3A por co-
imunoprecipitação:
Além de analisar a interação entre sAPP695α e Sema3A pelos ensaios
descritos acima, testamos essa hipótese através de outro método, com o intuito
de melhor avaliar a afinidade entra as duas proteínas em outras condições.
Ensaios de co-imunoprecipitação foram feitos usando estreptavidina,
que possui grande afinidade por biotina, ligada à resina de Sepharose. Para o
experimento, sAPP695α foi biotinilada e imobilizada pela beads, sendo, em
seguida, incubada na presença de meio condicionado contendo Sema3A-AP
(Figura 11). Como controle, foi utilizado o meio condicionado por células não
transfectadas.
52
Fig. 11: Sema3A conjugado à fosfatase alcalina (Sema3A-AP) se liga à sAPP695α
biotinilada (bsAPP695α) imobilizada em resina Sepharose. Dynabeads ligadas à
estreptavidina foram lavadas e incubadas com 300 ng de bsAPP695α. Após serem lavadas,
foram incubadas com 120 µl de meio condicionado por células HEK293 contendo Sema3A-AP.
Após lavagem, a atividade da fosfatase alcalina na resina de Sepharose foi medida com o uso
do substrato pNPP. O sobrenadante foi colocado, após 1 hora, em placas de 96 poços lidas a
405nm num leitor de placa. Este gráfico representa a média de 3 experimentos independentes
realizados em triplicata.
De maneira alternativa, o ensaio de co-imunoprecipitação foi realizado
utilizando beads de Sepharose com anti-Sema3A imobilizado. Neste
experimento, foram usados sAPP695α biotinilada e meio condicionado
contendo Sema3A-AP, e a revelação fez uso de estreptavidina (Figura 12). É
possível observar que os peptídeos LRSHPLG e TFASVMT inibem a ligação de
sAPP695α à Sema3A.
53
Fig. 12: Sema3A conjugada à fosfatase alcalina (Sema3A-AP) imobilizada em
resina Sepharose se liga à sAPP695α biotinilada (b sAPP695α). Anticorpo anti-Sema3A foi
imobilizado em contas de Sepharose ligadas à proteína-A. Em seguida, as contas foram
lavadas e incubadas com 120 µl de meio condicionado contendo Sema3A-AP. Após nova
lavagem, as contas foram incubadas com 300 ng de bsAPP695α, na ausência ou presença de
concentração 3 vezes molar (em relação à bsAPP695α) dos peptídeos LRSHPLG (LR) e
TFASVMT (TF). As contas foram transferidas para tampão de amostra para SDS-PAGE,
fervidas, e corridas em um gel de poliacrilamida 8%. As proteínas do gel foram transferidas
para uma membrana de nitrocelulose Hybond que foi bloqueada com 1% BSA. bsAPP695α foi
detectada com estreptavidina conjugada à HRP e a detecção foi realizada com o kit Super
Signal West Femto Maximum Sensitivity Substrate. A quantificação foi realizada usando o
programa Image J. Este filme mostra um de 3 experimentos independentes, nos quais
obtivemos resultados semelhantes.
54
4.4 – Ressonância Plasmônica de Superfície (RPS)
Os ensaios bioquímicos acima utilizados foram capazes de confirmar a
ligação entre sAPP695a e Sema3A. No entanto, aqueles métodos não são
sensíveis o suficiente para permitir uma análise quantitativa mais fina. Para
investigar de forma mais quantitativa a interação entre sAPP695a e Sema3A,
realizamos experimentos de RPS, em colaboração com o Professor Gilberto
Weissmüller.
O experimento foi realizado imobilizando-se sAPP695α na matriz de um
chip CM5 e avaliando a ligação com Sema3A num fluxo contínuo em duas
concentrações (5 µg/ml e 10 µg/ml). Os experimentos ainda não foram
concluídos, mas os resultados obtidos até o momento confirmam claramente a
interação entre sAPP695a e Sema3A, sugerindo uma ligação de alta afinidade
entre as duas proteínas. Sema3A interage com sAPP695α imobilizada no chip
(Figura13 A), mas não ao chip sem sAPP695α (Figura 13 B). Realizando a
subtração do canal 1 (B) do canal 2 (A), pode-se perceber melhor a ligação que
ocorreu no canal 2 (Figura 13 C).
55
Figura. 13: Ligação de Sema3A à sAPP695α revelada por Ressonância Plasmônica de
Superfície. Foram utilizadas soluções de Sema3A nas concentrações de 5 μg/ml e 10 μg/ml.
Sema3A se ligou à superfície com sAPP695α imobilizada na Flow Cell II As injeções e os
términos das injeções estão representados na figura. As regenerações do chip retiravam a
Sema3A, mantendo apenas a sAPP695α, ligada covalentemente ao chip. A abscissa
representa o tempo, marcado a cada 500 segundos e a ordenada indica as unidades de
ressonância (UR), marcadas a cada 50 unidades.Os gráficos representam resultados obtidos
em um experimento.
20100
20150
20200
20250
20300
20350
20400
3000 3500 4000 4500 5000 5500 6000 6500 7000 7500 8000
Time s
Resp
on
se
RU
3000 4000 5000 6000 7000
UR
Tempo (s)
20400
20350
20150
20300
20200
20250
20100
Início injeção Início injeção
Término injeção
Término injeção Regeneração
Regeneração
56
Figura. 14: Ligação de Sema3A à sAPP695α revelada por Ressonância Plasmônica de
Superfície. A superfície do chip foi ativada com uma solução 1:1 EDC – NHS, sAPP695α em
tampão acetato foi imobilizada na superfície deste e etanolamina foi utilizada para retirar
proteína adsorvida ao chip por ligações não específicas. Foram utilizadas soluções de Sema3A
nas concentrações de 5 μg/ml e 10 μg/ml. Sema3A se ligou à superfície com sAPP695α
imobilizada na Flow Cell II (A)., enquanto que não se ligou ao chip sem a proteína imobilizada
na Flow Cell I (B). Na subtração do Flow Cell I da Flow Cell II (C), a ligação entre Sema3A e
sAPP695α é evidenciada (setas pretas), assim como a lenta dissociação entre essas moléculas
(setas azuis). A abscissa representa o tempo, marcado a cada 500 segundos e a ordenada
indica as unidades de ressonância (UR), marcadas a cada 50 unidades.Os gráficos
representam resultados obtidos em um experimento.
57
Analisando-se detalhadamente as curvas da subtração do canal 1 do
canal 2 (Figura 14), foi possível calcular a constante de dissociação das duas
proteínas, na ordem de 10-11M. Este experimento foi realizado uma vez. Para
melhor análise, serão realizados experimentos em duplicata com pelo menos
quatro concentrações diferentes de Sema3A.
Fig. 14: Análise dos resultados da ressonância plasmônica de superfície. As curvas
obtidas pela subtração da Flow Cell I da Flow Cell II (modificado do gráfico da fig.12 C). As
curvas indicam a ligação entre sAPP695α imobilizada e Sema3A. A Sema3A foi exposta ao
chip em duas diferentes concentrações, 5 μg/ml (curva menor) e 10 μg/ml (curva maior). A
abscissa representa o tempo, marcado a cada 100 segundos e a ordenada indica as unidades
de ressonância (UR), marcadas a cada 20 unidades. As curvas foram analisadas através do
programa de análise Biaevaluation 4.1 (BIAcore) e a constante de dissociação estimada na
ordem de 10-11
M pelo mesmo programa. O programa tenta ajustar equações às curvas que
representam a associação (Aumento de UR) e a dissociação (Diminuição da UR). O método
utilizado foi o de Langmuir, que é o mais simples modelo cinético. Ainda são necessários mais
experimentos e uma maior faixa de concentrações de Sema3A para confirmar o valor de KD.
58
4.5 – Ensaios em cultura dissociada de neurônios de Gânglios da Raiz
Dorsal de embrião
Após a avaliação, através de ensaios bioquímicos e biofísicos, da
interação entre sAPP695α e Sema3A, foram feitos experimentos buscando
elucidar quais seriam os possíveis efeitos dessa interação sobre o crescimento
neurítico, uma vez que a função de Sema3A no direcionamento do crescimento
axonal já foi bem estabelecida (Kruger e cols, 2005 para uma revisão).
O modelo de gânglio da raiz dorsal de embriões de galinha de sete dias
é um modelo clássico em que a Sema3A apresenta um efeito claro de
colabamento de cones de crescimento e retração de neuritos, sendo utilizado
para diversos experimentos com essa proteína, inclusive o que a descreveu
pela primeira vez (Luo 1993).
Os ensaios de retração de neuritos foram realizados com fotos
seqüenciais tiradas num intervalo de 30 minutos e com uma diferença de 5
minutos entre elas, totalizando 8 fotos por ensaio (Figura 15).
59
Fig. 15: A sAPP695α é capaz de modular a atividade biológica de Sema3A. Cultura dissociada de neurônios de gânglios da raiz dorsal de embriões de
galinha de 7 dias foram mantidas por 24 h até o início das incubações nas diferentes condições. O efeito da Sema3A foi a retração neurítica. Cada ensaio
tinha duração de 30 minutos com fotos tiradas num mesmo campo do microscópio de 5 em 5 minutos (7 fotos) após a adição das proteínas. Culturas
expostas a 0,8 nM de Sema3A apresentaram retração neurítica. Quando a cultura foi tratada com 0,8 nM de Sema3A e 75 nM de sAPP695α, a retração
neurítica foi reduzida. A incubação com Sema3A, sAPP695α e 75 nM de cada um dos peptídeos, LRSHPLG (LR) e TFASVMT (TF), foi capaz de reverter o
efeito inibitório de sAPP695α na ação de Sema3A.
60
As diferenças entre os comprimentos dos neuritos antes (tempo 0) e
depois (35 minutos) das diferentes adições ao meio de cultura foram
organizadas num gráfico de maneira que fosse possível observar os valores
individuais de todos os experimentos, além do valor de média. Os resultados
obtidos para as diferentes condições experimentais estão representados na
figura 16.
61
Fig. 16: A sAPP695α modula a atividade biológica de Sema3A. Quantificação dos ensaios
em cultura de DRG de embriões de galinha de 7 dias. O gráfico representa 5 experimentos
independentes e cada círculo representa um neurito analisado. As barras horizontais
representam as médias de todos os experimentos para cada condição experimental. Valores
positivos representam a retração neurítica e valores negativos, crescimento. Os asteriscos
representam diferenças estatísticas significativas pelo desvio padrão (*p<0,0001; **p<0,00005;
***p<0,005). Observa-se que a aplicação de 0,8 nM de Sema3A (R&D systems) aumenta
significativamente a retração neurítica e a co-incubação com 75 nM de sAPP695α reverte essa
retração, voltando para níveis semelhantes ao controle. Além disso, a incubação com Sema3A,
sAPP695α e 75 nM de cada um dos peptídeos, LRSHPLG (LR) e TFASVMT (TF), impediu a
ação de sAPP695α, permitindo a retração neurítica induzida por Sema3A.
62
De maneira semelhante, o experimento foi repetido substituindo-se a
Sema3A recombinante purificada pelo meio condicionado por células HEK293
transfectadas com o plastídio para Sema3A-AP. Nestes experimentos, o
procedimento foi semelhante ao descrito acima, com a diferença de que 100 µl
de meio dos poços eram retirados e 100 µl de meio condicionado contendo
Sema3A-AP ou meio condicionado controle (proveniente de culturas de
HEK293 não transfectadas com Sema3A) colocado nos poços de cultura
(Figura 17).
63
Fig. 17: A sAPP695α modular a atividade biológica de Sema3A-AP secretada pela
linhagem HEK293 transfectada. O gráfico representa 5 experimentos independentes e cada
círculo representa um neurito analisado. A barra representa a média de todos os experimentos
para aquela condição. Valores positivos representam a retração neurítica e valores negativos,
crescimento. Os asteriscos representam diferenças estatísticas significativas (*p<0,02;
**p<0,05). Após a adição de 100 μl de meio condicionado por células HEK 293 contendo
Sema3A-AP, há um aumento significativo na retração neurítica e a co-incubação com 75nM de
sAPP695α impede essa retração. Além disso, a incubação de meio condicionado com
Sema3A-AP, sAPP695α e 75nM de cada um dos peptídeos, LRSHPLG (LR) e TFASVMT (TF),
foi capaz de impedir a ação de sAPP695α, permitindo o colabamento neurítico por Sema3A.
64
4.6 – Ensaios em Culturas de Explantes
Foram feitos, inicialmente, experimentos-piloto nos quais culturas de
explantes de córtex de embriões de camundongo foram tratadas com Sema3A,
Sema3A e sAPP695α ou nada. Este primeiro resultado obtido é mostrado na
figura 18
Fig. 18: Ensaios em culturas de explantes de córtex de camundongo E14. A adição de
Sema3A foi capaz de bloquear o crescimento neurítico (B), e a co-incubação com a sAPP695α
reverteu esse bloqueio (C), apresentando aspecto semelhante ao controle (A). culturas foram
mantidas por 24 até o início do experimento, e foram fotografadas 120 horas após as diferentes
adições. Fotos representativas de um experimento piloto realizado. Apesar do resultado inicial
promissor, não foi possível reproduzir essa resposta em experimentos subseqüentes, tanto
com córtex de embriões de camundongo (E14 e E17) quanto de rato (E18), além de explantes
de DRG de embriões de galinha E7.
65
Apesar de, neste experimento inicial, ter havido muita migração celular e
não tanto crescimento neurítico, os resultados pareciam promissores. No
entanto, o experimento não pode ser reproduzido, nem em culturas de córtices
de embrião de camundongo ou rato, nem em culturas de DRG de embrião de
galinha. É importante ressaltar que esses experimentos foram feitos sem uma
imobilização dos explantes em uma matriz de colágeno e sem a co-cultura com
uma célula secretando Sema3A, diferente de Puschel e cols em 1995. O fato
de uma matiz de colágeno envolver o explante junto com uma fonte de
secreção contínua de Sema3A permitiria a formação de um gradiente de
sema3A dentro da matriz de colágeno, fazendo com que fosse visto não um
colabamento neurítico e sim um direcionamento axonal na direção das
menores concentrações de Sema3A.
66
5 – Discussão:
A proteína sinalizadora sema3A é uma forma secretada de semaforina
envolvida em diferentes processos no sistema nervoso, como colabamento de
cones de crescimento, quimiorepulsão e apoptose neuronal (Mann e cols,
2007).
Nossos experimentos mostraram que a sAPP695α e a sema3A se ligam
in vitro e que os peptídeos selecionados por “phage display” inibem essa
ligação. Os experimentos de ligação in vitro foram realizados por ensaios de
ligação do tipo ELISA, através de ensaios de co-imunoprecipitação e revelação
por western blot ou ainda por ressonância plasmônica de superfície.
De maneira complementar, os peptídeos LRSHPLG e TFASVMT foram
capazes de bloquear a ligação entre Sema3A e sAPP695α, sugerindo que LR e
TF correspondem ao sítio (ou a parte do sítio) da Sema3A que interage
diretamente com sAPP695α. Além disso, resultados preliminares obtidos em
experimentos de ressonância plasmônica de superfície (SPR) sugerem que a
ligação entre sAPP695α e Sema3A é bastante forte, com constante de
dissociação em torno de 10-11.
Recentemente, outros estudos identificaram proteínas que apresentam
interação com sAPP695 e relevância para o sistema nervoso central. Um
estudo por Pawlik e cols em 2007 buscou ligantes para a região de seqüência
de aminoácidos RERMS da APP (403-407), descrita por induzir o crescimento
neurítico e a sobrevivência neuronal (Yamamoto e cols, 1994). No trabalho de
Pawlik, imobilizou-se um peptídeo contendo essa seqüência em uma coluna e,
67
por cromatografia de afinidade, identificou-se a Collapsin response mediator
protein 2 (CRMP-2) como possível receptor para APP. A CRMP-2 é um
importante mediador downstream da atividade de sema3A, e essa forte ligação
entre CRMP-2 e APP indica uma atuação de APP na via da sema3A e sugere
uma ligação da APP com o complexo receptor para a sema3A. É possível que
a região RERMS possa ser importante para a ligação entre APP e sema3A,
mas tal conclusão necessitaria de maior embasamento experimental.
Outro estudo indicou também que a APP, tanto sob a forma secretada
como sob a forma transmembranar, interage bioquímica e funcionalmente com
a integrina beta 1, mediando o crescimento neuronal (Young-Perce e cols,
2008). É importante lembrar que as vias de sinalização das semaforinas e das
integrinas são intimamente correlacionadas e modulações da atividade de
integrinas são fundamentais para a atuação de diversos membros da família
das semaforinas (Zhou e cols, 2008).
Um trabalho recente também mostrou a interação de APP com
contactinas 3 e 4 associadas a Neuroglia Cell Adhesion Molecule (NgCAM) em
axônios retinianos crescendo em direção ao tecto do nervo óptico em cérebro
de embrião de galinha (Osterfeild e cols, 2008). Naquele trabalho, foram
revelados efeitos regulatórios no crescimento por NgCAM dependentes de APP
e contactina 4, mas mecanismos precisos de ligação de APP a esses ligantes
não ficaram claros, assim como a existência de outras proteínas que possam
estar participando ou mediando esse processo.
É interessante ressaltar que, embora nosso trabalho tenha realizado
experimentos com Sema3A, os peptídeos apresentaram homologia com outras
68
semaforinas, principalmente da classe 3 (figura 6), o que permite pensarmos
que, talvez, a APP tenha ação fisiológica através de mais de um tipo de
semaforina, podendo atuar em diversos aspectos do crescimento neuronal.
Além disso, a APP é descrita como um possível receptor celular que
poderia atuar através de uma proteína G e sinalização por GMP cíclico
(Mattson e Furtukawa, 1998). Alterações nas concentrações de GMP cíclico
são importantes na mediação de efeitos de crescimento axonal, inclusive na
sinalização por semaforinas (Dontchev e Letourneau, 2003). Desta forma, é
possível que a afinidade da Sema3A pela sAPP695α tenha importância na
sinalização através da APP965 transmembranar.
Apesar do grande número de estudos realizados com a Sema3A desde
a sua descoberta em 1993, houve uma grande ênfase no papel dessa proteína
no direcionamento axonal no desenvolvimento, ao passo que sua importância
para o indivíduo adulto, como no estabelecimento de novas sinapses ou
regeneração, continuam sendo bem menos compreendidas. Trabalhos
analisando a localização de semaforinas secretadas revelaram que a Sema3A
está em vesículas secretórias que são transportadas rapidamente por
microtúbulos em direção a terminais axonais e que essa secreção é regulada
por atividade neural (DeWit e cols, 2006). No entanto, em regiões dendríticas,
vesículas contendo Sema3A parecem relativamente inativas. Esses dados
indicam uma importância para a Sema3A no sistema nervoso adulto, sugerindo
a liberação atividade-dependente de Sema3A em sítios sinápticos in vivo. Essa
idéia poderia ainda ser extrapolada para outras formas secretadas de
semaforinas.
69
Um fato relevante que pode se relacionar aos trabalhos mencionados
acima é que a APP, de maneira semelhante, é transportada por vesículas
através de axônios por mecanismos rápidos dependentes de kinesinas
(proteínas importantes para um transporte ativo dependente de ATP através de
microtúbulos) (Kamale cols, 2001). Além disso, a super expressão de APP em
larvas de drosófila induz complicações no transporte axonal de vesículas, além
de anormalidades na plasticidade sináptica (Rusu e cols, 2007). Deste modo,
essas informações sustentam a idéia de que a interação entre APP e Sema3A
pode atuar na regulação da transmissão e na plasticidade sináptica.
De modo geral, os diversos experimentos e dados da literatura ajudam a
sustentar a idéia de que existe uma interação entre APP e Semaforinas, mais
especificamente Sema3A e que essa interação é fisiologicamente relevante,
podendo atuar de diversos modos no sistema nervoso.
Uma das questões importantes sobre esta sinalização seria pesquisar o
papel das plexinas na sinalização mediada por APP-Sema3A. É interessante
lembrar que os peptídeos RPAASDR e NLANSFV são homólogos a plexinas e
foram detectados pelo phage display, possuindo grande afinidade pela APP. A
presente análise da Sema3A como ligante da APP foi também baseada na
disponibilidade comercial de proteínas recombinantes e anticorpos disponíveis
para o trabalho. No entanto, seria interessante analisar também a importância
das plexinas numa sinalização mediada por APP-sema3A e seu possível papel
como receptor ou co-receptor.
Uma das questões relevantes a cerca da sinalização mediada por APP-
Sema3A é de como ocorre a transmissão desse sinal. A inibição do
70
colabamento neurítico visto na incubação com APP e Sema3A juntos poderia
ocorrer por diversas maneiras, incluindo a ligação de APP-Sema3A a plexinas
e sinalização para crescimento neuronal, ou a ligação de APP-Sema3A a
outros receptores neuronais com sinalização para crescimento neuronal ou
ainda a simples não ativação de plexinas, ou seja, o seqüestro de Sema3A por
APP, impedindo que essa induza o colabamento dos cones de crescimento em
cultura.
Também seria interessante analisar se, de maneira alternativa, a APP é
capaz de se ligar e sinalizar através de plexinas de maneira independente de
Sema3A, o que poderia revelar rede de sinalização entre essas proteínas ainda
não caracterizada.
Além disso, os peptídeos revelados por phage display LRSHPLG e
TFASVMT também possuíam homologia com outros membros da família das
semaforinas, principalmente da classe 3, e seria interessante também analisar
o comportamento de APP em relação a esses outros ligantes, através de
ensaios bioquímicos e funcionais semelhantes.
Outra abordagem interessante para aprofundamento na questão da
sinalização através de APP, semaforinas e plexinas seria por ensaios de imuno
citoquímica, buscando determinar se existe colocalização entre as moléculas
analisadas. Esses ensaios poderiam envolver a interação entre essas
moléculas endógenas (por exemplo, em vesículas) ou adicionadas ao meio de
cultura, ativando receptores neuronais.
Outra possível abordagem interessante sobre outros parceiros de APP-
Sema3A seria através da transferência de marcação de APP para possíveis
71
ligantes celulares. O kit sulfo-SBED Biotin label transfer da Pierce permite que,
a partir da biotinilação de APP, seja possível, posteriormente, transferir essa
marcação de biotina para proteínas que estejam muito próximas da APP,
possivelmente ligantes (Ilver e cols, 1998). Essa abordagem permitiria analisar
de outra forma ligantes fisiológicos de sAPP, incluindo potencialmente plexinas,
uma confirmação da ligação à semaforinas ou ainda a revelação de novos
ligantes. Uma terceira abordagem interessante seria através de FRET (Forster
Resonance Energy Transfer). A marcação da APP e de outras proteínas-alvo
com anticorpos carreando fluoróforos distintos desenhados para o experimento
permitiria inferir se as duas moléculas marcadas estão ou não muito próximas,
o que pode sugerir possíveis receptores.
A hibridação in situ é uma técnica que permite visualizar regiões, em
tecidos, em que há altos níveis de expressão de determinados genes, e seria
uma abordagem complementar para melhor compreender a importância da
interação entre estas proteínas no desenvolvimento. Uma abordagem por
hibridação in situ de cérebros de embriões de diferentes idades de ratos ou
camundongos marcando para RNAs de APP, semaforinas e plexinas indicaria
as regiões, em diferentes idades, de expressões desses genes. Análises
posteriores permitiriam explorar as possíveis relações entre essas proteínas e
as características morfológicas encontradas nas etapas correspondentes,
permitindo a construção de um paralelo entre a sinalização dessas proteínas e
o crescimento neuronal no desenvolvimento.
72
6 – Conclusões:
O presente trabalho demonstrou, por meio de ensaios bioquímicos,
biofísicos e funcionais, a interação entre APP e Sema3A, sugerida pela análise
de peptídeos obtidos por phage display para APP e que apresentaram, em
alguns casos, homologia com proteínas da família das semaforinas.
Foi visto também, nesse trabalho, que os peptídeos selecionados por
phage display apresentam a capacidade de bloquear a ligação entre APP e
Sema3A e o efeito fisiológico em resposta a essa ligação. Isso reforça a idéia
de que esses peptídeos correspondem, na Sema3A, a uma região importante,
possivelmente o sítio ativo, de ligação entre APP e Sema3A.
Por fim, a descoberta desse novo ligante para a Proteína Precursora
Amilóide ajuda a melhor compreender o papel da isoforma neuronal no sistema
nervoso, sugerindo possíveis vias de sinalização para a atuação dessa
proteína amplamente expressa, amplamente conservada e, no entanto, ainda
pouco estudada. Além disso, um melhor conhecimento sobre as funções da
APP poderá contribuir para uma melhor compreensão de mecanismos
importantes na Doença de Alzheimer.
73
7- Referências:
Allinson TM, Parkin ET, Turner AJ, Hooper NM, (2003). ADAMs family members as amyloid precursor protein alpha-secretases. J Neurosci Res. 2003 Nov 1;74(3):342-52. Altschul SF, Madden TL, Schäffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1;25(17):3389-402. Alzheimer A (1907) Uber eine eigenartige Erkrankung der Hirnrinde. Allgem Z Psychiatr-Gerich Med 64: 146–148
Alzheimer A, Stelzmann RA, Schnitzlein HN, Murtagh FR (1995) An English translation of Alzheimer's 1907 paper, "Uber eine eigenartige Erkankung der Hirnrinde".Clin Anat. ;8(6):429-31. Alzheimer's Association. (2009); 2009 Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimers Dement. May;5(3):234-70. Anliker B e Müller U.(2006) The functions of mammalian amyloid precursor protein and related amyloid precursor-like proteins. Neurodegener Dis.;3(4-5):239-46.
Antipenko A, Himanen JP, van Leyen K, Nardi-Dei V, Lesniak J, Barton WA, Rajashankar KR, Lu M, Hoemme C, Püschel AW, Nikolov DB. (2003). Structure of the semaphorin-3A receptor binding module. Neuron. Aug 14;39(4):589-98. Araque A, Parpura V, Sanzgiri RP, Haydon PG. (1999) Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partner. Trends Neurosci.;22(5):208-15.
Azevedo FA, Carvalho LR, Grinberg LT, Farfel JM, Ferretti RE, Leite RE, Jacob Filho W, Lent R, Herculano-Houzel S. (2009) Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. J Comp Neurol. 10;513(5):532-41.
Bandeira F, Lent R, Herculano-Houzel S. (2009) Changing numbers of neuronal and non-neuronal cells underlie postnatal brain growth in the rat. Proc Natl Acad Sci U S A. 18;106(33):14108-13
Behar O, Golden JA, Mashimo H, Schoen FJ, Fishman MC.(1996) Semaphorin III is needed for normal patterning and growth of nerves, bones and heart. Nature. 10;383(6600):525-8.
Berlucchi G e Buchtel HA (2009) Neuronal plasticity: historical roots and evolution of meaning Exp Brain Res 192:307–319
Bezzi, P. & Volterra, A. (2001) A neuron–glia signalling network in the active brain. Curr. Opin. Neurobiol. 11, 387–394.
Botelho MG, Gralle M, Oliveira CL, Torriani I, Ferreira ST. Folding and stability of the extracellular domain of the human amyloid precursor protein. J Biol Chem. 2003 Sep 5;278(36):34259-67. Epub 2003 Jun 9. PubMed PMID: 12796495.
74
Boulianne GL, Livine-Bar I, Humphreys JM, Liang Y, Lin C, Rogaev E, George-Hyslop PH (1997) Cloning and characterization of the Drosophila presenilin homologue. Neuroreport 8:1025–1029
Cáceres J, Brandan E. (1997) Interaction between Alzheimer's disease beta A4 precursor protein (APP) and the extracellular matrix: evidence for the participation of heparan sulfate proteoglycans. J Cell Biochem. ;65(2):145-58.
Caille, I., Allinquant, B., Dupont, E., Bouillot, C., Langer, A., Muller, U. e Prochiantz, A. (2004) Soluble form of amyloid precursor protein regulates proliferation of progenitors in the adult subventricular zone. Development, 131, 2173-2181 Carmeliet P. (2003) Blood vessels and nerves: common signals, pathways and diseases. Nat Rev Genet. 4(9):710-20. Carmeliet P, Tessier-Lavigne M. (2005). Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring. Nature. 2005 Jul 14;436(7048):193-200. Review
Carmine-Simmen K, Proctor T, Tscha¨pe J, Poeck B, Triphan T, Strauss R, Kretzschmar D (2008) Neurotoxic effects induced by the Drosophila amyloid-b peptide suggest a conserved toxic function. Neurobiol Dis 33:274–281
Chen Y, Tang BL. (2006) The amyloid precursor protein and postnatal neurogenesis/neuroregeneration. Biochem Biophys Res Commun. 3;341(1):1-5.
Colón-Ramos DA. (2009) Synapse formation in developing neural circuits. Curr Top Dev Biol.;87:53-79. Review. Coulson EJ, Paliga K, Beyreuther K, Masters CL. (2000). What the evolution of the amyloid protein precursor supergene family tells us about its function. Neurochem Int. ;36(3):175-84.
Cregg JM. (2007) Introduction: distinctions between Pichia pastoris and other expression systems. Methods Mol Biol. ;389:1-10.
Culvenor JG, Henry A, Hartmann T, Evin G, Galatis D, Friedhuber A, Jayasena UL, Underwood JR, Beyreuther K, Masters CL, Cappai R. (1998) Subcellular localization of the Alzheimer's disease amyloid precursor protein and derived polypeptides expressed in a recombinant yeast system. Amyloid.;5(2):79-89.
Daigle I, Li C (1993) apl-1, a Caenorhabditis elegans gene encoding a protein related to the human b-amyloid protein precursor. Proc Natl Acad Sci USA 90:12045–12049
75
Daly R, Hearn MT. Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production. J Mol Recognit. 2005 Mar-Apr;18(2):119-38. Review. PubMed PMID: 15565717.
de Wit J, Toonen RF, Verhaagen J, Verhage M.(2006) Vesicular trafficking of semaphorin 3A is activity-dependent and differs between axons and dendrites. Traffic. 2006 Aug;7(8):1060-77
Dodd J, Schuchardt A. (1995) Axon guidance: a compelling case for repelling growth cones. Cell. 1995 May 19;81(4):471-4.
Dontchev VD e Letourneau PC (2003) Growth Cones Integrate Signaling from Multiple Guidance Cues Journal of Histochemistry and Cytochemistry, Vol. 51, 435-444
Dyrks T, Weidemann A, Multhaup G, Salbaum JM, Lemaire HG, Kang J, Müller-Hill B, Masters CL, Beyreuther K. (1988) Identification, transmembrane orientation and biogenesis of the amyloid A4 precursor of Alzheimer's disease. EMBO J. ;7(4):949-57.
Eggert S, Paliga K, Soba P, Evin G, Masters CL, Weidemann A, Beyreuther K (2004) The proteolytic processing of the amyloid precursor protein gene family members APLP-1 and APLP-2 involves a-, b-, c-, and e-like cleavages: modulation of APLP-1 processing by N-glycosylation. J Biol Chem 279:18146–18156
Esler WP, Wolfe MS. (2001). A portrait of Alzheimer secretases--new features and familiar faces. Science. 24;293(5534):1449-54.
Foster M. (1897). A Textbook of Phisiology. Part three: The Central Nervous System, 7th ed., Macmillan and Co. Ltd., London
Francis R, McGrath G, Zhang J, Ruddy DA, Sym M, Apfeld J, (2002) aph-1 and pen-2 are required for Notch pathway signaling, gamma-secretase cleavage of betaAPP, and presenilin protein accumulation. Dev Cell ;3(1):85–97. Gherardi E, Love CA, Esnouf RM, Jones EY. (2004). The sema domain. Curr Opin Struct Biol. Dec;14(6):669-78. Review.
Giambarella U, Yamatsuji T, Okamoto T, Matsui T, Ikezu T, Murayama Y, Levine MA, Katz A, Gautam N, Nishimoto I. (1997) G protein betagamma complex-mediated apoptosis by familial Alzheimer's disease mutant of APP. EMBO J. 15;16(16):4897-907.
Giuffrida ML, Caraci F, Pignataro B, Cataldo S, De Bona P, Bruno V, Molinaro G, Pappalardo G, Messina A, Palmigiano A, Garozzo D, Nicoletti F, Rizzarelli E, Copani A. (2009) Beta-amyloid monomers are neuroprotective. J Neurosci. 26;29(34):10582-7.
76
Glenner, G.G. e Wong, C.W. (1984) Alzheimer's disease - initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Bioch. Biophys. Res. Comm., 120, 885-890. Goda, Y., 2002. Cadherins communicate structural plasticity of presynaptic and postsynaptic terminals. Neuron 35, 1–3
Graham FL, Smiley J, Russell WC, Nairn R. (1977) Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J Gen Virol.; 36(1):59-74.
Gralle M, Botelho MM, de Oliveira CL, Torriani I, Ferreira ST. (2002) Solution studies and structural model of the extracellular domain of the human amyloid precursor protein. Biophys J.;83(6):3513-24.
Gralle M, Botelho MG, Wouters FS. (2009) Neuroprotective secreted amyloid precursor protein acts by disrupting amyloid precursor protein dimers. J Biol Chem. 29;284(22):15016-25
Gralle M, Oliveira CL, Guerreiro LH, McKinstry WJ, Galatis D, Masters CL, Cappai R, Parker MW, Ramos CH, Torriani I, Ferreira ST. (2006) Solution conformation and heparin-induced dimerization of the full-length extracellular domain of the human amyloid precursor protein. J Mol Biol. 24;357(2):493-508.
He Z, Tessier-Lavigne M. (1997) Neuropilin is a receptor for the axonal chemorepellent Semaphorin III. Cell. 22;90(4):739-51. Heber, S., Herms, J., Gajic, V., Hainfellner, J., Aguzzi, A., Rulicke, T., Kretzschmar, H., von Koch, C., Sisodia, S., Tremml, P., Lipp, H.P., Wolfer, D.P. e Müller, U. (2000) Mice with combined gene knock-outs reveal essential and partially redundant functions of amyloid precursor protein family members. J. Neurosci., 20, 7951-7963. Henry A, Masters CL, Beyreuther K, Cappai R. (1997) Expression of human amyloid precursor protein ectodomains in Pichia pastoris: analysis of culture conditions, purification, and characterization. Protein Expr Purif.;10(2):283-91.
Herculano-Houzel S, Collins CE, Wong P, Kaas JH, Lent R. (2008) The basic nonuniformity of the cerebral cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 26;105(34):12593-8.
Herms, J., Anliker, B., Heber, S., Ring, S., Fuhrmann, M., Kretzschmar, H., Sisodia, S. e Müller, U. (2004) Cortical dysplasia resembling human type 2 lissencephaly in mice lacking all three APP family members. EMBO J., 23, 4106-4115. Herreman A, Serneels L, AnnaertW, Collen D, Schoonjans L,DeStrooper B. (2000) Total inactivation of gamma-secretase activity in presenilin-deficient embryonic stem cells. Nat Cell Biol ;2(7):461–2. Hoe HS, Tran TS, Matsuoka Y, Howell BW, Rebeck GW. (2006). DAB1 and Reelin effects on amyloid precursor protein and ApoE receptor 2 trafficking and processing. J Biol Chem. 17;281(46):35176-85.
77
Hong CS, Koo EH (1997) Isolation and characterization of Drosophila presenilin homolog. Neuroreport 8:665–668
Hornsten A, Lieberthal J, Fadia S, Malins R, Ha L, Xu X, Daigle I, Markowitz M, O’Connor G, Plasterk R, Li C (2007) APL-1, a Caenorhabditis elegans protein related to the human b-amyloid precursor protein, is essential for viability. Proc Natl Acad Sci USA 104:1971–1976
Hung AY, Koo EH, Haass C, Selkoe DJ. (1992) Increased expression of beta-amyloid precursor protein during neuronal differentiation is not accompanied by secretory cleavage. Proc Natl Acad Sci U S A. 15;89(20):9439-43.
Ilver D, Arnqvist A, Ogren J, Frick IM, Kersulyte D, Incecik ET, Berg DE, Covacci A, Engstrand L, Borén T. (1998) Helicobacter pylori adhesin binding fucosylated histo-blood group antigens revealed by retagging. Science. 16;279(5349):373-7.
Itoh T, Satou T, Nishida S, Tsubaki M, Hashimoto S, Ito H.(2009) Expression of amyloid precursor protein after rat traumatic brain injury. Neurol Res. 2009 Feb;31(1):103-9.
Jacobsen KT, Iverfeldt K. (2009) Amyloid precursor protein and its homologues: a family of proteolysis-dependent receptors.Cell Mol Life Sci. ;66(14):2299-318.
Jönsson, U., Fägerstam, L., Ivarsson, B., Johnsson, B., Karlsson, R., Lundh, K., Löfås, S., Persson, B., Roos, H., Rönnberg, I., Sjölander, S., Stenberg, E., Ståhlberg, R., Urbaniczky, C., Östlin, H., and Malmqvist, M. (1991) Real-time biospecific interaction analysis using surface plasmon resonance and a sensor chip technology. BioTechniques 11(5), 620-627
Jönsson U, Fägerstam L, Löfas S, Stenberg E, Karlsson R, Frostell A, Markey F, Schindler F. (1993). Introducing a biosensor based technology for real-time biospecific interaction analysis. Ann Biol Clin (Paris).;51(1):19-26
Kamal A, Almenar-Queralt A, LeBlanc JF, Roberts EA, Goldstein LS. (2001) Kinesin-mediated axonal transport of a membrane compartment containing beta-secretase and presenilin-1 requires APP. Nature. ;414(6864):643-8. Kamenetz, F., Tomita, T., Hsieh, H., Seabrook, G., Borchelt, D., Iwatsubo, T., Sisodia, S. e Malinow, R. (2003) APP processing and synaptic function. Neuron, 37, 925-937. Kang, J., Lemaire, H.G., Unterbeck, A., Salbaum, J.M., Masters, C.L., Grzeschik, K.H., Multhaup, G., Beyreuther,K. e Müller-Hill, B. (1987) The precursor of Alzheimer's disease amyloid-A4 protein resembles a cell surface receptor. Nature, 325, 733-736. Kang, J. e Müller-Hill, B. (1990) Differential splicing of Alzheimer's disease amyloid A4 precursor RNA in rat tissues - PreA4(695) messenger RNA is predominantly produced in rat and human brain. Bioch. Biophys. Res.Comm., 166, 1192-1200. Kettenmann H, Verkhratsky A. (2008) Neuroglia: the 150 years after. Trends Neurosci.;31(12):653-9.
78
Kirfel, G., Borm, B., Rigort, A. e Herzog, V. (2002) The secretory beta-amyloid precursor protein is a motogen for human epidermal keratinocytes. Eur. J. Cell Biol., 81, 664-676. Kitaguchi, N., Takahashi, Y., Tokushima, Y., Shiojiri, S. e Ito, H. (1988) Novel precursor of Alzheimer's disease amyloid protein shows protease inhibitory activity. Nature, 331, 530-532. Kolodkin AL, Matthes DJ, Goodman CS. (1993) The semaphorin genes encode a family of transmembrane and secreted growth cone guidance molecules. Cell. 31;75(7):1389-99. Kruger RP, Aurandt J, Guan KL. (2005) Semaphorins command cells to move. Nat Rev Mol Cell Biol.;6(10):789-800. Larkin M.A., Blackshields G., Brown N.P., Chenna R., McGettigan P.A., McWilliam H.*, Valentin F.*, Wallace I.M., Wilm A., Lopez R.*, Thompson J.D., Gibson T.J. and Higgins D.G. (2007) ClustalW and ClustalX version 2. Bioinformatics 2007 23(21): 2947-2948.
Lee JA, Cole GJ. (2007) Generation of transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under control of zebrafish amyloid precursor protein gene regulatory elements. Zebrafish. ;4(4):277-86.
Li P, Anumanthan A, Gao XG, Ilangovan K, Suzara VV, Düzgüneş N, Renugopalakrishnan V. Expression of recombinant proteins in Pichia pastoris. Appl Biochem Biotechnol. 2007 Aug;142(2):105-24. Review. PubMed PMID: 18025573.
Lieberburg, I., Fuller, F. e Cordell, B. (1988) A new A4-amyloid messenger RNA contains a domain homologousto serine proteinase inhibitors. Nature, 331, 525-527. Lopez-Munoz F e Alamo C (2009) Historical evolution of the neurotransmission concept J Neural Transm 116:515–533
Lopez-Munoz F, Boya J e Alamo C (2006) Neuron theory, the cornerstone of neuroscience, on the centenary of the Nobel Prize award to Santiago Ram´on y Cajal Brain Research Bulletin 70 (2006) 391–405
Lorent, K., Overbergh, L., Moechars, D., De Strooper, B., Van Leuven, F. e Van den Berghe, H. (1995) Expression in mouse embryos and in adult mouse brain of 3 members of the amyloid precursor protein family, of the alpha- 2-macroglobulin receptor low-density-lipoprotein receptor-related protein and of its ligands apolipoprotein E, lipoprotein lipase, alpha-2-macroglobulin and the 40,000-molecular-weight receptor-associated protein. Neuroscience, 65, 1009-1025. Lue, L.F., Kuo, Y.M., Roher, A.E., Brachova, L., Shen, Y., Sue, L., Beach, T., Kurth, J.H., Rydel, R.E. e Rogers, J. (1999) Soluble amyloid beta peptide concentration as a predictor of synaptic change in Alzheimer's disease. Am J. Pathol., 155, 853-862
Luo L, Martin-Morris L, White K (1990) Identification, secretion, and neural expression of APPL, a Drosophila protein similar to human amyloid protein precursor. J Neurosci 10:3849–3861
Luo Y, Raible D, Raper JA. (1993). Collapsin: a protein in brain that induces the collapse and paralysis of neuronal growth cones.Cell. 1993 Oct 22;75(2):217-27.
79
Magdesian MH, Nery AA, Martins AH, Juliano MA, Juliano L, Ulrich H, Ferreira ST. (2005) Peptide blockers of the inhibition of neuronal nicotinic acetylcholine receptors by amyloid beta. J Biol Chem. ;280(35):31085-90 Magdesian MH, Carvalho MM, Mendes FA, Saraiva LM, Juliano MA, Juliano L, Garcia-Abreu J, Ferreira ST. (2008) Amyloid-beta binds to the extracellular cysteine-rich domain of Frizzled and inhibits Wnt/beta-catenin signaling. J Biol Chem. ;283(14):9359-68 Malmqvist M. (1993) Biospecific interaction analysis using biosensor technology. Nature. 14;361(6408):186-7
Mann F, Chauvet S, Rougon G. (2007) Semaphorins in development and adult brain: Implication for neurological diseases. Prog Neurobiol. ;82(2):57-79.
Marin O e Rubenstein JL. (2003). Cell migration in the forebrain. Annu. Rev. Neurosci. 26:441–83
Margallo-Lana ML, Moore PB, Kay DW, Perry RH, Reid BE, Berney TP, Tyrer SP.(2007) Fifteen-year follow-up of 92 hospitalized adults with Down's syndrome: incidence of cognitive decline, its relationship to age and neuropathology. J Intellect Disabil Res. ;51(Pt. 6):463-77.
Masters, C.L., Simms, G., Weinman, N.A., Multhaup, G., McDonald, B.L. e Beyreuther, K. (1985) Amyloid plaque core protein in Alzheimer´s disease and Down Syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4245-4249. Mattson MP e Furukawa K. (1998) Signaling events regulating the neurodevelopmental triad. Glutamate and secreted forms of beta-amyloid precursor protein as examples. Perspect Dev Neurobiol. ;5(4):337-52.
de Melo Reis RA, Cabral-da-Silva MC, de Mello FG, Taylor JS. (2008) Müller glia fators induce survival and neuritogenesis of peripheral and central neurons.Brain Res. 18;1205:1-11. Milward, E.A., Papadopoulos, R., Fuller, S.J., Moir, R.D., Small, D., Beyreuther, K. e Masters, C.L. (1992) The amyloid protein precursor of Alzheimer's disease is a mediator of the effects of nerve growth factor on neurite outgrowth. Neuron, 9, 129-137. Mizui M, Kumanogoh A, Kikutani H. (2009) Immune semaphorins: novel features of neural guidance molecules. J Clin Immunol. Jan;29(1):1-11.
Mok, S.S., Sberna, G., Heffernan, D., Cappai, R., Galatis, D., Clarris, H.J., Sawyer, W.H., Beyreuther, K., Masters, C.L. e Small, D.H. (1997) Expression and analysis of heparin-binding regions of the amyloid precursor protein of Alzheimer's disease. FEBS Lett., 415, 303-307.
Morimoto T, Ohsawa I, Takamura C, Ishiguro M, Nakamura Y, Kohsaka S.(1998) Novel domain-specific actions of amyloid precursor protein on developing synapses. J Neurosci.;18(22):9386-93.
80
Morimoto T, Ohsawa I, Takamura C, Ishiguro M, Kohsaka S. (1998) Involvement of amyloid precursor protein in functional synapse formation in cultured hippocampal neurons. J Neurosci Res.;51(2):185-95.
Moya KL, Benowitz LI, Schneider GE, Allinquant B. (1994)The amyloid precursor protein is developmentally regulated and correlated with synaptogenesis. Dev Biol. ;161(2):597-603.
Mullan, M., Crawford, F., Axelman, K., Houlden, H., Lilius, L., Winblad, B. e Lannfelt, L. (1992) A pathogenic mutation for probable Alzheimer's disease in the APP gene at the N-terminus of beta-amyloid. Nat. Genet., 1, 345-347. Müller T, Concannon CG, Ward MW, Walsh CM, Tirniceriu AL, Tribl F, Kögel D, Prehn JH, Egensperger R. (2007) Modulation of gene expression and cytoskeletal dynamics by the amyloid precursor protein intracellular domain (AICD). Mol Biol Cell. ;18(1):201-10.
Müller T, Meyer HE, Egensperger R, Marcus K. (2008) The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) as modulator of gene expression, apoptosis, and cytoskeletal dynamics-relevance for Alzheimer's disease. Prog Neurobiol.;85(4):393-406.
Müller U, Cristina N, Li ZW, Wolfer DP, Lipp HP, Rülicke T, Brandner S, Aguzzi A, Weissmann C. (1994) Behavioral and anatomical deficits in mice homozygous for a modified beta-amyloid precursor protein gene. Cell. 2;79(5):755-65.
Müller U, Cristina N, Li ZW, Wolfer DP, Lipp HP, Rülicke T, Brandner S, Aguzzi A, Weissman C. (1996) Mice homozygous for a modified beta-amyloid precursor protein (beta APP) gene show impaired behavior and high incidence of agenesis of the corpus callosum. Ann N Y Acad Sci. 17;777:65-73.
Nishimoto I, Okamoto T, Matsuura Y, Takahashi S, Okamoto T, Murayama Y, Ogata E. (1993) Alzheimer amyloid protein precursor complexes with brain GTP-binding protein G(o). Nature. 4;362(6415):75-9.
Nishimura I, Takazaki R, Kuwako K, Enokido Y, Yoshikawa K. (2003) Upregulation and antiapoptotic role of endogenous Alzheimer amyloid precursor protein in dorsal root ganglion neurons. Exp Cell Res. 10;286(2):241-51.
Okamoto T, Takeda S, Murayama Y, Ogata E, Nishimoto I. (1995) Ligand-dependent G protein coupling function of amyloid transmembrane precursor. J Biol Chem. 3;270(9):4205-8.
Osterfield M, Egelund R, Young LM, Flanagan JG. (2008) Interaction of amyloid precursor protein with contactins and NgCAM in the retinotectal system. Development. ;135(6):1189-99.
Pawlik M, Otero DA, Park M, Fischer WH, Levy E, Saitoh T. (2007) Proteins that bind to the RERMS region of beta amyloid precursor protein. Biochem Biophys Res Commun. ;355(4):907-12.
81
Pike, C.J., Walencewicz, A.J., Glabe, C.G. e Cotman, C.W. (1991) In vitro aging of beta-amyloid protein causes peptide aggregation and neurotoxicity. Brain Res., 563, 311-314. Plant, L.D., Boyle, J.P., Smith, I.F., Peers, C. e Pearson, H.A. (2003) The production of amyloid beta peptide is a critical requirement for the viability of central neurons. J. Neurosci., 23, 5531-5535. Ponte P, Gonzalez-DeWhitt P, Schilling J, Miller J, Hsu D, Greenberg B, Davis K, Wallace W, Lieberburg I, Fuller F. (1988) A new A4 amyloid mRNA contains a domain homologous to serine proteinase inhibitors. Nature. ;331(6156):525-7. Püschel AW, Adams RH, Betz H. (1995). Murine semaphorin D/collapsin is a member of a diverse gene family and creates domains inhibitory for axonal extension. Neuron. May;14(5):941-8.
Puzzo D, Privitera L, Leznik E, Fà M, Staniszewski A, Palmeri A, Arancio O. (2008) Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus. J Neurosci. 31;28(53):14537-45.
Rasband, W.S., (1997); ImageJ, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/.
Rooke J, Pan D, Xu T, Rubin GM (1996) KUZ, a conserved metalloprotease-disintegrin protein with two roles in Drosophila neurogenesis. Science 273:1227–1231
Rosen DR, Martin-Morris L, Luo LQ, White K (1989) A Drosophila gene encoding a protein resembling the human beta amyloid protein precursor. Proc Natl Acad Sci USA 86:2478–2482
Sabo, S.L., Ikin, A.F., Buxbaum, J.D. e Greengard, P. (2001) The Alzheimer amyloid precursor protein (APP) and FE65, an APP-binding protein, regulate cell movement. J. Cell Biol., 153, 1403-1414. Sabo, S.L., Ikin, A.F., Buxbaum, J.D. e Greengard, P. (2003) The amyloid precursor protein and its regulatory protein, FE65, in growth cones and synapses in vitro and in vivo. J. Neurosci., 23, 5407-5415. Sayle R and Milner-White EJ. (1995) "RasMol: Biomolecular graphics for all", Trends in Biochemical Sciences (TIBS), Vol. 20, No. 9, p. 374.
Selkoe DJ. (2002) Deciphering the genesis and fate of amyloid beta-protein yields novel therapies for Alzheimer disease. J Clin Invest. 110:1375-81.
Selkoe DJ, Podlisny MB, Joachim CL, Vickers EA, Lee G, Fritz LC, Oltersdorf T. (1988) Beta-amyloid precursor protein of Alzheimer disease occurs as 110- to 135-kilodalton membrane-associated proteins in neural and nonneural tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. ;85(19):7341-5.
82
Senechal Y, Larmet Y, Dev KK.(2006) Unraveling in vivo functions of amyloid precursor protein: insights from knockout and knockdown studies. Neurodegenerative Diseases. 2006;3(3):134-47
Shaked GM, Chauv S, Ubhi K, Hansen LA, Masliah E. (2009) Interactions between the amyloid precursor protein C-terminal domain and G proteins mediate calcium dysregulation and amyloid beta toxicity in Alzheimer's disease. FEBS J. ;276(10):2736-51
Slunt HH, Thinakaran G, Von Koch C, Lo AC, Tanzi RE, Sisodia SS.Expression of a ubiquitous, cross-reactive homologue of the mouse beta-amyloid precursor protein (APP). J Biol Chem. 1994 Jan 28;269(4):2637-44.
Song H, Ming G, He Z, Lehmann M, McKerracher L, Tessier-Lavigne M, Poo M. (1998). Conversion of neuronal growth cone responses from repulsion to attraction by cyclic nucleotides.Science. 1998 Sep 4;281(5382):1515-8.
Soba P, Eggert S, Wagner K, Zentgraf H, Siehl K, Kreger S, Löwer A, Langer A, Merdes G, Paro R, Masters CL, Müller U, Kins S, Beyreuther K. (2005)Homo- and heterodimerization of APP family members promotes intercellular adhesion. EMBO J. 19;24(20):3624-34.
Sola Vigo F, Kedikian G, Heredia L, Heredia F, Añel AD, Rosa AL, Lorenzo A. (2009) Amyloid-beta precursor protein mediates neuronal toxicity of amyloid beta through Go protein activation. Neurobiol Aging. ;30(9):1379-92. Epub 2008 Jan 10.
Small DH, Clarris HL, Williamson TG, Reed G, Key B, Mok SS, Beyreuther K, Masters CL, Nurcombe V. (1999) Neurite-outgrowth regulating functions of the amyloid protein precursor of Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. ;1(4-5):275-85.
Small DH, Nurcombe V, Moir R, Michaelson S, Monard D, Beyreuther K, Masters CL. (1992) Association and release of the amyloid protein precursor of Alzheimer's disease from chick brain extracellular matrix. J Neurosci. ;12(11):4143-50.
Small DH, Nurcombe V, Reed G, Clarris H, Moir R, Beyreuther K, Masters CL. (1994)A heparin-binding domain in the amyloid protein precursor of Alzheimer's disease is involved in the regulation of neurite outgrowth. J Neurosci. ;14(4):2117-27.]
Smith GP. (1985) Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 228:1315–7
De Strooper B, Saftig P, Craessaerts K, Vanderstichele H, Guhde G, Annaert W, (1998) . Deficiency of presenilin-1 inhibits the normal cleavage of amyloid precursor protein. Nature ;391(6665):387–90.
83
Swanson TL, Knittel LM, Coate TM, Farley SM, Snyder MA, Copenhaver PF. (2005)The insect homologue of the amyloid precursor protein interacts with the heterotrimeric G protein Go alpha in an identified population of migratory neurons. Dev Biol. 1;288(1):160-78.
Tanaka S, Shiojiri S, Takahashi Y, Kitaguchi N, Ito H, Kameyama M, Kimura J, Nakamura S, Ueda K. (1989) Tissue-specific expression of three types of beta-protein precursor mRNA: enhancement of protease inhibitor-harboring types in Alzheimer's disease brain. Biochem Biophys Res Commun. 29;165(3):1406-14.
Tanzi, R.E., McClatchey, A.I., Lamperti, E.D., Villakomaroff, L., Gusella, J.F. e Neve, R.L. (1988) Protease inhibitor domain encoded by an amyloid protein precursor messenger RNA associated with Alzheimer's disease.Nature, 331, 528-530 Taylor CJ, Ireland DR, Ballagh I, Bourne K, Marechal NM, Turner PR, Bilkey DK, Tate WP, Abraham WC. (2008) Endogenous secreted amyloid precursor protein-alpha regulates hippocampal NMDA receptor function, long-term potentiation and spatial memory. Neurobiol Dis. ;31(2):250-60 Terry, R. D., Gonatas, N. K., Weiss, M. (1964) The ultrastructure of the cerebral cortex in Alzheimer’s disease. Trans. Am. Neurol. Assoc. 89:12. Tolia A e De Strooper B, (2009). Structure and function of gama-secretase. Seminars in Cell & Developmental Biology 20 211–218 Tran TS, Kolodkin AL, Bharadwaj R. (2007) Semaphorin regulation of cellular morphology. Annu Rev Cell Dev Biol.;23:263-92. Trapp, B.D. e Hauer, P.E. (1994) Amyloid precursor protein is enriched in radial glia - implications for neuronal development. J. Neurosci. Res., 37, 538-550
Venugopal C, Demos CM, Rao KS, Pappolla MA, Sambamurti K. (2008). Beta-secretase: structure, function, and evolution. CNS Neurol Disord Drug Targets. ;7(3):278-94.
Volterra A, Meldolesi J. (2005) Astrocytes, from brain glue to communication elements: the revolution continues. Nat Rev Neurosci.;6(8):626-40.
Wang, P., Yang, G., Mosier, D.R., Chang, P., Zaidi, T., Gong, Y.D., Zhao, N.M., Dominguez, B., Lee, K.F., Gan, W.B. e Zheng, H. (2005) Defective neuromuscular synapses in mice lacking amyloid precursor protein (APP) and APP-like protein 2. J. Neurosci., 25, 1219-1225 Wang, X. Lou N, Xu Q, Tian GF, Peng WG, Han X, Kang J, Takano T, Nedergaard M. (2006) Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo. Nat. Neurosci. 9, 816–823 Wasco W, Bupp K, Magendantz M, Gusella JF, Tanzi RE, Solomon F (1992) Identification of a mouse brain cDNA that encodes a protein related to the Alzheimer disease-associated amyloid beta protein precursor. Proc Natl Acad Sci USA 89:10758–10762
Wasco W, Gurubhagavatula S, Paradis MD, Romano DM, Sisodia SS, Hyman BT, Neve RL, Tanzi RE (1993) Isolation and characterization of APLP2 encoding a homologue of the Alzheimer’s associated amyloid beta protein precursor. Nat Genet 5:95–100
84
Washbourne, P., Dityatev, A., Scheiffele, P., Biederer, T., Weiner, J.A., Christopherson, K.S., El-Husseini, A., (2004) Cell adhesion molecules in synapse formation. J. Neurosci. 24, 9244–9249.
Whitson, J.S., Glabe, C.G., Shintani, E., Abcar, A. e Cotman, C.W. (1990) Beta-amyloid protein promotes neuritic branching in hippocampal cultures. Neurosci. Lett., 110, 319-324 Whitson, J.S., Selkoe, D.J. e Cotman, C.W. (1989) Amyloid-beta protein enhances the survival of hippocampal neurons in vitro. Science, 243, 1488-1490. Wright DE, White FA, Gerfen RW, Silos-Santiago I, Snider WD. (1995)The guidance molecule semaphorin III is expressed in regions of spinal cord and periphery avoided by growing sensory axons. J Comp Neurol. 16;361(2):321-33. Yamamoto K, Miyoshi T, Yae T, Kawashima K, Araki H, Hanada K, Otero DA, Roch JM, Saitoh T. (1994) The survival of rat cerebral cortical neurons in the presence of trophic APP peptides. J Neurobiol. ;25(5):585-94 Yang, G., Gong, Y.D., Gong, K., Jiang, W.L., Kwon, E., Wang, P., Zheng, H., Zhang, X.F., Gan, W.B. e Zhao, N.M.(2005) Reduced synaptic vesicle density and active zone size in mice lacking amyloid precursor protein (APP) and APP-like protein 2. Neurosci. Lett., 384, 66-71. Yankner, B.A., Duffy, L.K. e Kirschner, D.A. (1990) Neurotrophic and neurotoxic effects of amyloid beta protein - reversal by tachykinin neuropeptides. Science, 250, 279-282
Yoshida Y, Han B, Mendelsohn M, Jessell TM. (2006) PlexinA1 signaling directs the segregation of proprioceptive sensory axons in the developing spinal cord. Neuron. 7;52(5):775-88.
Yoshikai S, Sasaki H, Doh-ura K, Furuya H, Sakaki Y. (1990) Genomic organization of the human amyloid beta-protein precursor gene.Gene. 15;87(2):257-63.
Young-Pearse, T.L., Chen, A.C., Chang, R., Marquez, C. and Selkoe, D.J. (2008) A Critical Function for β0Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference. Neural Develop23, 3-15. Yu G, Nishimura M, Arawaka S, Levitan D, Zhang L, Tandon A, (2000) Nicastrin modulates presenilin-mediated notch/glp-1 signal transduction and betaAPP processing. Nature 2000;407(6800):48–54. Yu HH e Moens CB. (2005). Semaphorin signaling guides cranial neural crest cell migration in zebrafish. Dev. Biol. 280:373–85 Zhang Z, Nadeau P, SongW, Donoviel D, Yuan M, Bernstein A, (2000) Presenilins are required for gamma-secretase cleavage of beta-APP and transmembrane cleavage of Notch-1. Nat Cell Biol ;2(7):463–5
Zheng H, Jiang M, Trumbauer ME, Sirinathsinghji DJ, Hopkins R, Smith DW, Heavens RP, Dawson GR, Boyce S, Conner MW, Stevens KA, Slunt HH, Sisoda SS, Chen HY, Van der Ploeg LH. (1995) beta-Amyloid precursor protein-deficient mice show reactive gliosis and decreased locomotor activity. Cell. 19;81(4):525-31.
Zheng H, Koo EH (2006) The amyloid precursor protein: beyond amyloid. Mol Neurodegener 3;1:5.
85
Zhou Y, Gunput RA, Pasterkamp RJ. (2008) Semaphorin signaling: progress made and promises ahead. Trends Biochem Sci. ;33(4):161-70.
Anexo I – Artigo submetido à publicação
Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas
Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo
