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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

FELIPE EMMANUEL DO ESPÍRITO SANTO GOMES

Introns do grupo I no LSU rRNA mitocondrial de Cryptococcus

neoformans e Cryptococcus gattii e a sua relação com genótipos e

susceptibilidade a antifúngicos

NATAL

2017

FELIPE EMMANUEL DO ESPÍRITO SANTO GOMES

Introns do grupo I no LSU rRNA mitocondrial de Cryptococcus

neoformans e Cryptococcus gattii e a sua relação com genótipos e

susceptibilidade a antifúngicos

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande

do Norte como requisito parcial para obtenção do título de

Mestre em Bioquímica.

Orientadora: Raquel Cordeiro Theodoro

Coorientador: Thales Domingos Arantes

NATAL

2017

Gomes, Felipe Emmanuel do Espírito Santo. Introns do grupo I no LSU rRNA mitocondrial de

Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii e a sua relação

com genótipos e susceptibilidade a antifúngicos / Felipe

Emmanuel do Espírito Santo Gomes. - Natal, 2017. 94 f.: il.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio

Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-

Graduação em Bioquímica. Orientadora: Profa. Dra. Raquel Cordeiro Theodoro.

Coorientador: Prof. Dr. Thales Domingos Arantes.

1. Criptococose - Dissertação. 2. Genotipagem -

Dissertação. 3. Intron do grupo I - Dissertação. 4. Estrutura

secundária - Dissertação. 5. Filogenia - Dissertação. 6.

Susceptibilidade antifúngica - Dissertação. I. Theodoro, Raquel Cordeiro. II. Arantes, Thales Domingos. III.

Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 616.9

DEDICATÓRIA

A Deus por sempre me iluminar em

todos os passos da minha vida.

A minha família por sempre me motivar

perante todas as dificuldades e decisões importantes.

Aos meus amigos que caminharam

comigo durante todos esses anos de universidade.

AGRADECIMENTOS

• A minha orientadora Profa. Dra. Raquel Cordeiro Theodoro pelo inúmero conhecimento

adquirido com ela e pela sua paciência e dedicação durante todo o meu processo de

aprendizagem desde a graduação;

• Ao meu coorientador Dr. Thales Domingos Arantes pelo acompanhamento e

supervisionamento em minhas práticas laboratoriais;

• Às agências de fomento (CAPES e CNPq) que financiaram todo este projeto;

• Ao meu colega de laboratório José Alex que colaborou bastante em minhas análises

filogenéticas;

• Ao Instituto de Medicina Tropical, sob a direção da Profa. Dra. Selma Jerônimo, que

forneceu todo o espaço físico necessário;

• À fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) pelo envio dos isolados de referência;

• Às professoras Dra. Maria Tereza Barreto, Dra. Fernanda Fonseca, Dr. Marilene Henning

Vainstein e Dra. Gilda Maria Barbaro Del Negro por terem cedidos alguns de seus

isolados;

• Às professoras Dra. Eveline e Dra. Mônica e Dagoberto pelo envio de amostras de seus

pacientes do Hospital Giselda Trigueiro;

• E a todos os demais, que colaboraram direta ou indiretamente para a realização deste

estudo, meus sinceros agradecimentos.

Há muitas pessoas de visão perfeita que nada vêem...

O ato de ver não é coisa natural.

Precisa ser aprendido!"

(Rubem Alves)

RESUMO

A criptococose, causada pelas espécies fúngicas Cryptococcus neoformans e Cryptococcus

gattii, é uma das micoses oportunísticas e/ou sistêmicas mais importantes no mundo. Cada

espécie possui quatro genótipos, usualmente definidos pelo PCR-RFLP do gene URA5, os quais

apresentam diferenças em sua ecologia, epidemiologia, distribuição geográfica e

susceptibilidade a antifúngicos. Marcadores moleculares de acesso mais direto são atrativos

para um rápido reconhecimento de genótipos ou de caraterísticas relevantes como virulência e

susceptibilidade antifúngica. Neste sentido, introns autocatalíticos do grupo I, no rRNA LSU

mitocondrial foram aqui avaliados como potencial marcador molecular para os genótipos de C.

neoformans e C. gattii, bem como quanto a sua relação com a susceptibilidade a antifúngicos.

Foram utilizados 77 isolados brasileiros, sendo a maioria do genótipo VNI (39 cepas), seguido

de 20 VGII, 5 VNIV, 4 VNII, 3 VNIII, 2 VGI, 2 VGIII e 2 VGIV. Os introns Cne.mL2449 e

Cne.mL2504 foram amplificados em um só PCR com primers complementares a região do gene

rRNA LSU flanqueadora dos introns. Os produtos de PCR mostraram um polimorfismo de

comprimento significativo entre genótipos de C. neoformans e C. gattii. O sequenciamento

destes produtos indicou que algumas cepas apresentaram nenhum, um, dois, três ou quatro

introns em série. Estes dois novos introns, não descritos anteriormente, foram nomeados de

Cne.mL2439 e Cne.mL2584 em C. neoformans e Cga.mL2439 e Cga.mL2584 em C. gattii. Os

introns Cne.mL2439/Cga.mL2439 foram classificados como pertences a subclasse IB2 ao

passo que Cne.mL2584/Cga.mL2584, pertencentes a subclasse IA1. Curiosamente, os

genótipos com isolados sem introns, VNI, VGII, VGI e VNIV, são aqueles conhecidos como

mais virulentos e menos susceptíveis a agentes antifúngicos. De fato, tais isolados apresentaram

MICs significativamente superiores para 5-flucitosina. Estes achados sugerem que estes

elementos podem ser utilizados como potenciais marcadores moleculares para a resistência

deste antifúngico. Por fim, análises filogenéticas sugeriram alta similaridade de sequência entre

os introns Cne.mL2449, Cne.mL2504, Cne.mL2439/Cga.mL2439 e Cne.mL2584/Cga.mL2584

com outros introns mitocondriais presentes nos genes COX1, COX2, COX3, NAD5, ATP9,

COB, LSU de fungos distintos, sustentando a hipótese de origem antiga dos introns (hipótese

“introns early”), além da dispersão destes elementos em sítios heterólogos, via splicing reverso.

Palavras-chave: Criptococose, genotipagem, intron do grupo I, estrutura secundária, filogenia,

susceptibilidade antifúngica.

ABSTRACT

Cryptococcosis, caused by the fungal species Cryptococcus neoformans or Cryptococcus gattii,

is one of the most important systemic and/or opportunistic diseases in the world. Each species

has four genotypes, usually accessed by PCR-RFLP of the URA5 gene, which present

differences in their ecology, epidemiology, geographical distribution and antifungal

susceptibility. Easier accessible molecular markers are attractive for rapid recognition of

genotypes or relevant characteristics such as virulence and antifungal susceptibility. In this way,

group I autocatalytic introns in the mitochondrial LSU rRNA were evaluated as potential

molecular marker for the genotypes of C. neoformans and C. gatti, as well as their relationship

to antifungal susceptibility. Seventy-seven Brazilian isolates were used, most of the genotype

VNI (39 strains) followed by 20 VGII, 5 VNIV, 4 VNII, 3 VNIII, 2 VGI, 2 VGIII and 2 VGIV.

The introns Cne.mL2449 and Cne.mL2504 were amplified in a single PCR with

complementary primers to the flanking region of the introns LSU rRNA gene. PCR products

showed a significant polymorphism between C. neoformans and C. gattii genotypes.

Sequencing of the PCR products indicated that some strains had none, one, two, three or four

introns followed. This new two introns, not previously described in the mitochondrial genome

of Cryptococcus, were named Cne.mL2439 and Cne.mL2584 in C. neoformans and

Cga.mL2439 and Cga.mL2584 in C. gattii. Cne.mL2439/Cga.mL2439 introns were classified

as belonging to IB2, whereas Cne.mL2584/Cga.mL2584, as belonging IA1 subclass.

Interestingly, genotypes with some intronless strains, VNI, VGII, VGI and VNIV, are those

known to be more virulent and less susceptible to antifungal agents. Here, we observed that

those intronless isolates had significant higher MICs values for 5-flucytosine. The findings

suggest that these elements can be used as potential molecular markers for antifungal resistance.

Finally, phylogenetic analyzes suggested high sequence similarity between the introns

Cne.mL2449, Cne.mL2504, Cne.mL2439/Cga.mL2439 and Cne.mL2584/Cga.mL2584 with

other mitochondrial introns present in the genes COX1, COX2, COX3, NAD5, ATP9, COB, LSU

of fungi supporting the “introns early” hypothesis, as well as its dispersion to heterologous sites

by reverse splicing.

Key-words: Cryptococcosis, genotyping, Group I intron, secondary structure, phylogeny,

antifungal susceptibility.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Isolados utilizados no studo.....................................................................................34

Tabela 2- Genes de homing endonuclease (HEG) estão associados a alguns introns do grupo I

do gene LSU RNA de C. neoformans e C. gattii......................................................................48

Tabela 3- Teste para associação entre intron e genótipos virulentos e não-virulentos.............56

Tabela 4- Teste para associação entre intron e espécie.............................................................57

Tabela 5- Modelos logísticos ordenados utilizados para estimar o efeito do intron e espécie

sobre o MIC..............................................................................................................................58

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Rota da criptococose meningoencefálica .................................................................16

Figura 2- Modelo de estrutura secundária dos introns do grupo I ...........................................23

Figura 3- Representação esquemática do processo de auto-splicing dos introns do grupo

I.................................................................................................................................................25

Figura 4- Introns descritos no gene mitocondrial 23S..............................................................30

Figura 5- Predição da estrutura secundária para os introns Cne.ml2449 e Cne.mL2504............31

Figura 6- Método de genotipagem por PCR/RFLP do gene URA5..........................................38

Figura 7- Desenho dos primers.................................................................................................39

Figura 8- Distribuição dos isolados de C. neoformans e C. gattii segundo seu genótipo ........44

Figura 9- Os genótipos de C. neoformans e C. gattii apresentam polimorfismos entre os introns

do grupo I...................................................................................................................................45

Figura 10- Variação na amplificação dos introns do grupo I segundo o genótipo ..................46

Figura 11- Posição dos introns do grupo I no gene rRNA LSU de Cryptococcus neoformans e

Cryptococcus gattii...................................................................................................................47

Figura 12- Predição da estrutura secundária para o intron Cne.mL2439..................................49

Figura 13- Predição da estrutura secundária para o intron Cne.mL2584..................................50

Figura 14- Análise molecular filogenética para os três introns utilizando a inferência

bayesiana...................................................................................................................................51

Figura 15- Análise molecular filogenética para os introns Cne.mL2439 e Cga.mL2439

utilizando a inferência bayesiana..............................................................................................52

Figura 16- Análise molecular filogenética para o intron Cne.mL2504 utilizando a inferência

bayesiana...................................................................................................................................53

Figura 17- Análise molecular filogenética para os introns Cne.mL2584/Cga.mL2584 utilizando

a inferência Bayesiana...............................................................................................................54

Figura 18- Análise molecular filogenética para o intron Cne.mL2449 utilizando a inferência

bayesiana...................................................................................................................................55

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AFLP Polimorfismo de tamanho de fragmentos amplificados – Amplified fragment lengh

polymorphism

AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida - Acquired immunodeficiency syndrome

BamHI Enzima de restrição obtida de Bacillus amyloliquefaciens

CGB Meio de cultura de cavanina-glicina-azul de bromotimol

DMSO Dimetilsulfóxido

DNA Ácido desoxirribonucléico

dNTP Desoxirribonucleotídeo trifosfato

DSB Double Strand Break

EDTA Ácido etileno-diamino-tetra-acético

FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz

HEG Homing Endonuclease Gene

HhaI Enzima de restrição obtida de Haemophilus haemolyticus

HindIII Enzima de restrição obtida de Haemophilus influenzae

HIV Vírus da imunodeficiência humana – Human immunodeficiency virus

KCl Cloreto de Potássio

MgCl2 Cloreto de Magnésio

NaCl Cloreto de sódio

NaOH Hidróxido de Sódio

http://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Bacillus_amyloliquefaciens&action=edit&redlink=1http://pt.wikipedia.org/wiki/Haemophilus_influenzae

ORF Quadros abertos de leitura - Open reading frames

PCR Reação em cadeia da polimerase – polymerase chain reaction

PH Potencial hidrogeniônico

RAPD Análise por DNA polimórfico amplificado ao acaso – randomly amplified

polymorphic DNA analysis

RFLP Análise de fragmentos de DNA gerados por enzimas de restrição - restriction

fragment length polymorphisms

RNA Ácido ribonucleico

Sau96I Enzima de restrição obtida de Staphylococcus aureus PS96

SDS Dodecil sulfato de sódio - sodium dodecyl sulfate

TAE Tampão Tris-Acetato-EDTA

TRIS-HCl Trisaminometano – hydroxymethyl aminomethane hydrochloride

UNESP Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho

URA5 Gene codificador da enzima ortidina monofosfato pirofosforilase

LSU Grande subunidade ribossomal - Large subunit

COX Cyclooxygenase gene

COB Cytochrome b gene

NAD NAD(P)H dehydrogenase gene

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................................ 15

2 OBJETIVOS ................................................................................................................................... 33

2.1 Objetivo geral .............................................................................................................................. 33

2.2 Objetivos específicos ................................................................................................................... 33

3 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................................ 34

3.1 Isolados fúngicos utilizados ........................................................................................................ 34

3.2 Extração de DNA ........................................................................................................................ 37

3.3 PCR e RFLP do gene URA5 ....................................................................................................... 37

3.4 PCR do intron do grupo I e eletroforese ..................................................................................... 39

3.5 Sequenciamento e alinhamento do intron ................................................................................... 40

3.6 Estrutura secundária .................................................................................................................... 40

3.7 Análise filogenética ..................................................................................................................... 40

3.8 Testes de susceptibilidade a antifúngicos .................................................................................... 41

3.9 Análises Estatísticas .................................................................................................................... 42

4 RESULTADOS ................................................................................................................................. 44

4.1 PCR e RFLP do gene URA5 ....................................................................................................... 44

4.2 PCR e sequenciamento do intron do grupo I ............................................................................... 44

4.3 Predição da estrutura secundária para os novos introns .............................................................. 48

4.4 Análises filogenéticas .................................................................................................................. 50

4.5 Relação entre presença de introns do grupo I no gene LSU rRNA mitocondrial, susceptibilidade

antifúngica e genótipos de C. neoformans e C. gattii ........................................................................ 56

5 DISCUSSÃO ..................................................................................................................................... 59

6 CONCLUSÕES ................................................................................................................................ 67

REFERÊNCIAS .................................................................................................................................. 68

APÊNDICE .......................................................................................................................................... 77

APÊNDICE A- Genotipagem de todos os isolados pelo método PCR-RFLP URA5. ...................... 77

APÊNDICE B- Produtos de PCR obtidos para o intron do grupo I em todos os isolados ................ 80

APÊNDICE C- Alinhamento global da sequência do gene LSU rRNA. .......................................... 84

APÊNDICE D – Polimorfismos entre os introns LSU rRNA ........................................................... 91

APÊNDICE E - Concentrações inibitória mínimas para os isolados fúngicos testados. .................. 94

15

1 INTRODUÇÃO

O gênero Cryptococcus é composto por basidiomicetos da ordem Tremellales

caracterizados por leveduras capsuladas mundialmente disseminadas e reconhecidas como

importantes patógenos fúngicos, altamente frequentes em indivíduos imunodeprimidos

(CHEN; MEYER; SORRELL, 2014; MITCHELL; PERFECT, 1995). Leveduras desse gênero

são cosmopolitas e abrigam-se em diversos substratos orgânicos associados às excretas de aves,

tanto em ambientes urbanos quanto domiciliares (KWON-CHUNG; BENNETT, 1984;

LAZÉRA et al., 1996; SWINNE et al., 1989). Muitos já foram os achados destes

microrganismos associados a ocos de árvores em decomposição, como Eucaliptus

camaldulensis, Moliquea tomentosa, Cassia grandis, Ficus microcaprae e Terminali acatappa

(CALLEJAS et al., 1998; LAZERA et al., 2000; LAZÉRA et al., 1998; SORRELL, 2001).

A infecção em humanos tem início pela inalação de propágulos infecciosos (leveduras)

encontrados no ambiente, os quais colonizam os pulmões e causam o primeiro ponto de

infecção. Em indivíduos imunocompetentes, o fungo normalmente não é disseminado e o

quadro clínico é assintomático. Já em indivíduos imunodeprimidos, o patógeno tende a se

disseminar rapidamente dos pulmões para o sistema nervoso central (após cruzar a barreira

hematoencefálica) onde causa o quadro clínico de meningite ou meningoencefalite. De forma

geral, os principais sítios de infecção e diagnóstico são: pulmões, sistema nervoso central,

sangue, urina, pele, próstata e olhos. Os imunodeprimidos tendem a apresentar um amplo

espectro de sintomas, que incluem febre, mal-estar, dor no peito, perda de peso, dispnéia, tosse,

além de lesões na pele, como úlceras, tumores e granulomas (CHEN; MEYER; SORRELL,

2014; MITCHELL; PERFECT, 1995) (Figura 1).

A criptococose é causada por duas diferentes espécies do gênero Cryptococcus:

Cryptococcus neoformans (Cryptococcus neoformans var. neoformans e Cryptococcus

neoformans var. grubii) e Cryptococcus gattii (FRANZOT et al., 1998; KWON-CHUNG et al.,

2014). Segundo análises de Xu, Vilgalys & Mitchell (2000), a divergência entre C. neoformans

var. neoformans e C. neoformans var. grubii ocorreu a cerca de 18.5 milhões de anos atrás, mas

essas linhagens têm sofrido dispersões e hibridizações recentes. As dispersões, que são

facilitadas pelos humanos bem como por outros hospedeiros, podem favorecer o aparecimento

de gerações híbridas pela simples aproximação de linhagens divergentes que podem vir a se

cruzarem.

16

Figura 1- Rota da criptococose meningoencefálica. Leveduras dessecadas e outros propágulos infecciosos de

Cryptococcus sp. são inaladas pelo hospedeiro e formam o primeiro sítio de infecção no pulmão. A

levedura tende a se disseminar pela corrente sanguínea deste órgão até o sistema nervoso central, onde

causam o quadro clínico de meningoencefalite. Fonte: Modificado de KWON-CHUNG et al. (2014).

Enquanto as infecções por C. neoformans ocorrem mundialmente e são uma importante

causa de morbidade e mortalidade em pacientes imunodeprimidos (especialmente em pacientes

com AIDS), C. gattii usualmente infecta portadores imunocompetentes (D’SOUZA et al.,

2011). Embora seja relatado na literatura que C. gattii está geograficamente mais associado a

áreas tropicais e subtropicais (SORRELL, 2001), Kidd et al. (2004) sugerem que C. gattii pode

se adaptar a novos ambientes, visto que ele já foi encontrado em região de clima temperado em

um surto de criptococose na ilha de Vancouver (Vancouver Island), Canadá. De modo geral,

apesar dos diferentes padrões de distribuição geográfica, cepas dessas três variedades (C.

neoformans var. neoformans, C. neoformans var. grubii e C. gattii) já foram isoladas em todos

os continentes, exceto na Antártica (XU; VILGALYS; MITCHELL, 2000).

17

De fato, Cryptococcus spp. possuem alguns atributos que aumentam a capacidade de

sobrevivência tanto no ambiente saprobiótico como durante uma infecção. Tais adaptações

incluem padrões de transdução de sinais que otimizam o metabolismo a responder ao estado

nutricional do ambiente, condições de estresse e interações com outros sistemas biológicos.

Dentre estes atributos está a cápsula polissacarídica destes fungos, considerada um de seus

principais fatores de virulência (MCCLELLAND; BERNHARDT; CASADEVALL, 2006).

No ambiente, a cápsula fornece a função de proteção contra situações de estresse, como

a desidratação e contra predadores naturais, como nematoides e amebas (CHRISMAN et al.,

2011; STEENBERGEN; CASADEVALL, 2003). No hospedeiro vertebrado ela é um

importante fator de virulência, pois protege a levedura contra a resposta imune provocada pelas

citocinas pró-inflamatórias, que atuam na degradação de patógenos primários, seguida da

apresentação de antígenos para células do sistema imune (RETINI et al., 1998). A cápsula ainda

atua como uma estrutura protetora contra a fagocitose por macrófagos, mas se esta for

inevitável, ela se mantém funcional devido a sua ação protetora contra espécies reativas de

oxigênio no interior destas células de defesa (ZARAGOZA et al., 2008).

Estudos realizados inicialmente por Fromtling, Shadomy & Jacobson (1982) mostraram

que mutantes acapsulados de Cryptococcus neoformans foram capazes de produzir doença em

modelos murínicos. Esses mutantes foram capazes de sobreviver e replicar em condições

normais de laboratório, mas exibiram uma grande redução em sua virulência. Entretanto, essas

cepas acapsuladas podem ser patogênicas para muitos pacientes imunodeprimidos o que

implica que estas leveduras ainda mantêm um potencial patogênico (SALKOWSKI; BALISH,

1991). Como a cápsula demonstra um importante papel na interação com o hospedeiro, sua

estrutura tem sido o principal foco da atenção de muitos estudos experimentais.

Adicionalmente, estudos têm também mostrado que a cápsula polissacarídica tem uma forte

propriedade imunomodulatória, levando à evasão do sistema imune e, consequentemente, sua

sobrevivência dentro do hospedeiro (MONARI; BISTONI; VECCHIARELLI, 2006;

VECCHIARELLI, 2000). Os polissacarídeos são os principais fatores de virulência da cápsula

de Cryptococcus, sendo a glucuronoxilomanana (GXM) a substância que se encontra em maior

abundância nessas leveduras. Os estudos realizados por Monari, Bistoni & Vecchiarelli (2006)

revelaram um novo aspecto imunossupressor do polissacarídeo GXM, sugerindo que essa

substância é capaz de levar à inibição da diferenciação e proliferação das células T (Th1) que

geram uma resposta ao C. neoformans. O GXM também tem poder de influenciar

negativamente na eficiência da apresentação do antígeno do patógeno ao macrófago (MONARI

et al., 2005), levando ao seu não reconhecimento por essas células de defesa.

18

Entre outros fatores de virulência do Cryptococcus tem-se a capacidade de adesão, a

produção de enzimas como lacases (enzima produtora da melanina), fosfolipases (atua no

rompimento das ligações éster favorecendo a desestabilização e lise da célula hospedeira),

urease (promove ação anti-inflamatória mediada por células Th2) e superóxido desmutase

(protege a célula fúngica contra a ação antioxidante). A formação de melanina está associada

com a virulência, pois ela gera problemas aos indivíduos com o sistema imune comprometido,

ao passo que também protege a levedura da ação de antifúngicos e dos macrófagos alveolares,

levando à persistência da infecção no hospedeiro (CHEN; MEYER; SORRELL, 2014;

NOSANCHUK et al., 1999; ROSAS et al., 2000).

De fato, estes fatores de virulência apresentam importantes funções para a levedura

dentro do organismo, sendo fundamentais para sua implantação no hospedeiro. Entretanto,

Casadevall, Steenbergen & Nosanchuk (2003) sugerem que os fatores de virulência surgiram

nessas leveduras bem antes do seu primeiro contato com os hospedeiros vertebrados, ainda no

ambiente saprobiótico. Esses fatores apresentavam importantes funções que garantiam a

manutenção do fungo nesse tipo de ambiente, como a presença da melanina, que fornecia

proteção contra os raios ultravioletas. Porém, quando primordialmente houve a interação

patógeno-hospedeiro, esses fatores também passaram a se mostrar importantes para a

manutenção do Cryptococcus no organismo. Ainda segundo os autores, a virulência do C.

neoformans em vários hospedeiros animais é o resultado das pressões seletivas originadas da

relação vertebrado-hospedeiro-fungo, as quais foram essenciais ou altamente favoráveis para a

sobrevivência desse organismo. Adicionalmente, a existência de uma única estratégia parasítica

intracelular nos macrófagos de mamíferos sugere que a virulência desse fungo patogênico seja

resultado dos fatores de seleção no ambiente saprobiótico contra predadores ameboides.

O locus mating type também tem sido identificado como um importante fator de

virulência, e as cepas MATα têm se mostrado mais virulentas do que as cepas MATa. Como

em muitas outras espécies de Basidiomicetos, o locus mating type é altamente complexo e

contém uma variedade de genes essenciais para a reprodução sexuada e morfogênese, incluindo

genes de feromônios. O sistema mating type é controlado por um locus com dois alelos

alternativos funcionais, MATa e MATα (CLARKE et al., 2001; LENGELER et al., 2000;

MOORE; EDMAN, 1993). Em adição, os genes mating type podem mostrar importantes

funções na epidemiologia e evolução de patógenos. Alguns métodos foram utilizados para

determinar os alelos mating type. Um destes métodos utiliza primers mating type específicos

para realizar PCR (KWON-CHUNG; EDMAN; WICKES, 1992). Essas técnicas constituem

19

ferramentas úteis para serem utilizadas em estudos epidemiológicos, visto que favorecem o

entendimento da estrutura populacional e reprodutiva do patógeno.

Um dos métodos mais utilizados para a diferenciação entre as espécies C. neoformans

e C. gattii é o cultivo em meio CGB (ágar canavanina - glicina – azul de bromotimol). Isso é

possível visto que C. gattii é resistente a L-cavanina, um aminoácido não protéico produzido

por certas plantas, e quando cultivado em meio CGB esta espécie utiliza a glicina como fonte

de carbono e nitrogênio. Durante este processo metabólico haverá a produção de amônia,

gerando a alcalinização do meio e alterando sua cor de amarelo (que representa o pH inicial de

5.8±1) para azul cobalto (pH próximo de 7.0) (KWON-CHUNG; POLACHECK; BENNET,

1982). C. neoformans, entretanto, mantém o meio na coloração amarela (C. neoformans não

cresce no meio), possibilitando a diferenciação. Embora os autores supracitados tenham

relatado a ausência de resultados falso-positivos e falso-negativos para esse método, Mctaggart

et al. (2011) relataram uma especificidade menor para esse método, representando

aproximadamente 93%.

A sorotipagem também foi amplamente utilizada em estudos epidemiológicos para C.

gattii e C. neoformans, e a partir desta técnica foram identificados quatro sorotipos (A, B, C e

D) para estas espécies de acordo com a composição antigênica de sua cápsula polissacarídica.

Dessa forma, os sorotipos A e D, além do híbrido AD foram propostas para a espécie

Cryptococcus neoformans ao passo que os sorotipos B e C se mostraram associados a

Cryptococcus gattii. A identificação destes sorotipos pode ser realizada através de ensaios

imunológicos com a utilização de antígenos específicos que se ligam a constituintes de sua

cápsula polissacarídica (FRANZOT et al., 1998; STEENBERGEN; CASADEVALL, 2003).

Entretanto, foi a necessidade de técnicas mais precisas que levou ao aumento da

utilização das ferramentas moleculares. Desde os últimos anos, várias técnicas de tipagem

molecular têm sido aplicadas ao estudo epidemiológico da criptococose, incluindo

cariotipagem, RAPD (do inglês “Random Amplification of Polymorphic DNA” em tradução

livre “Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso”), RFLP (do inglês “Restriction Fragment

lenght Polymorphism” em tradução livre “Polimorfismo de comprimento no fragmento de

restrição”), AFLP ( do inglês “Amplifield Fragment length Polymorphism” em tradução livre

“Polimorfismo no comprimento de fragmentos amplificados”), MLST (do inglês “Multilocus

sequence typing” em tradução livre “tipagem por sequência de multilocus”) e PCR (do inglês

“Polymerase Chain reaction” em tradução livre “Reação em cadeia da polimerase”) utilizando

primers específicos de regiões de minissatélites ou microssatélites e PCR multiplex (BRANDT

et al., 1995; LEAL et al., 2008; MEYER et al., 2003, 2009; YAMAMOTO et al., 1995). Por

20

meio de técnicas moleculares via PCR fingerprinting com uma sequência de minissatélites

específicos do fago M13 (5′ GAGGGTGGCGGTTCT 3′) e de microssatélites [(GACA)4,

(GTC)5] foram identificados oito tipos moleculares principais. Estes ensaios usam as

sequências de sondas de DNA repetitivo como primers para a detecção de polimorfismos entre

diferentes isolados (MEYER et al., 1993). Desse modo, C. neoformans foi agrupado dentro dos

tipos VNI (sorotipo A), VNII (sorotipo A), VNIII (sorotipo AD) e VNIV (sorotipo D); C. gattii

foi agrupado dentro dos tipos VGI, VGII, VGIII e VGIV (sorotipos B e C) (MEYER et al.,

1999).

Outra região genômica mais amplamente utilizada para avaliação do polimorfismo e

diferenciação dos tipos moleculares de C. neoformans e C. gattii é o gene codificador da

orotidina monofosfato pirofosforilase (URA5 – orotidine monophosphate pyrophosphorylase

gene). Os oito tipos moleculares de C. gattii e C. neoformans identificados pelas técnicas acima

citadas foram confirmados através das análises de RFLP do gene URA5 (MEYER et al., 2003).

Segundo estes autores, o RFLP do gene URA5 pode ser realizado a partir de uma dupla digestão

com as enzimas de restrição HhaI e Sau96I. Apesar da precisão deste método, a interpretação

dos fragmentos de digestão em muitos momentos pode se tornar trabalhosa. Por se tratar de um

método que envolve distintas fases (PCR, digestão e eletroforese), a boa realização de todas as

etapas é fundamental para o êxito da técnica e interpretação correta dos resultados. Entretanto,

esta técnica continua sendo a mais usual para a identificação dos genótipos de C. neoformans e

C. gattii tanto na clínica quanto nos estudos epidemiológicos.

Por muitos anos, as infecções causadas por C. neoformans eram vistas como uma

importante causa de morbidade e mortalidade em pacientes imunodeprimidos (especialmente

pacientes com AIDS), enquanto que C. gattii usualmente infectava portadores

imunocompetentes, como já discutido. Entretanto, Farrer et al. (2015) mostraram que embora

todos os tipos moleculares de C. gattii sejam capazes de causar doença, os genótipos VGI e

VGII acometem imunocompetentes com maior frequência que os genótipos VGIII e VGIV.

Ecologicamente, as duas espécies também tendem a ocupar nichos distintos, uma vez

que C. neoformans encontra-se mais relacionado a fezes de pombos (Columba livia) e de outras

aves no ambiente, enquanto que C. gattii normalmente é isolado de material vegetal, como em

árvores de eucaliptos (GULLO et al., 2013; SORRELL, 2001)

Além disso, os genótipos de C. neoformans e C. gattii não são igualmente distribuídos

no mundo: VGIV é mais frequente no sul do continente africano; VGII é o C. gattii mais

encontrado nas Américas e VGI na Europa. De modo geral, VGII e VGI são os mais

encontrados globalmente (CHEN; MEYER; SORRELL, 2014). Quanto à resposta à terapia

21

antifúngica, sabe-se que ela é menos expressiva nas infecções causadas por C. gattii, requerendo

uma terapia mais prolongada (SORRELL, 2001; SPEED; DUNT, 1995), e que ainda dentro

desta espécie, o genótipo VGII é o menos susceptível às drogas antifúngicas (especialmente a

azólicos), seguidos pelos isolados VGI, VNI e VNIV (CHONG et al., 2010; HAGEN et al.,

2010; IQBAL et al., 2010; TRILLES et al., 2012).

Visto que os tipos moleculares de C. neoformans e C. gattii apresentam expressivas

diferenças em sua epidemiologia, ecologia, patogenicidade, características moleculares,

distribuição geográfica e susceptibilidade antifúngica, temos que apenas a distinção entre as

espécies (C. neoformans ou C. gattii) não é mais suficiente para o correto direcionamento do

tratamento da criptococose. Portanto, a busca por novos alvos moleculares de fácil acesso e

identificação, especialmente aqueles altamente polimórficos são de grande importância para a

distinção entre os tipos moleculares de C. neoformans e C. gattii. Além disso, a utilização

desses novos alvos com as técnicas de biologia molecular já conhecidas, como PCR e

eletroforese, os tornariam ainda mais atrativos uma vez que estas ferramentas já são

amplamente empregadas.

Neste sentido, o uso de elementos genéticos invasivos, como inteins e introns

autocatalíticos parecem ser também atrativos para a distinção entre espécies e genótipos de

Cryptococcus, além daqueles tipos moleculares mais resistentes a antifúngicos. Os inteins são

sequências transcritas e traduzidas juntamente com a sequência flanqueadora (extein) capazes

de sofrer um splicing (excisão) protéico autocatalítico. As sequências protéicas flanqueadoras

são unidas por uma ligação peptídica, formando uma proteína funcional. Os inteins geralmente

ocorrem em genes importantes para a reprodução e sobrevivência do fungo como genes

codificadores de enzimas metabólicas, DNA e RNA polimerases e proteases (GOGARTEN et

al., 2002). Butler & Poulter (2005) avaliaram polimorfismos dos inteins PRP8 de C.

neoformans e C. gattii (CnePRP8 e CgaPRP8) e observaram que cepas das duas variedades de

C. neoformans (neoformans e grubii) e C. gattii podem ser facilmente distinguidas pelo

sequenciamento deste elemento. Foi ressaltado que os sorotipos A (C. neoformas var. grubii) e

D (C. neoformans var. neoformans) poderiam ser diferenciados por digestão do intein PRP8

com HindIII, e que VGII poderia ser distinguido dos demais C. gattii por digestão com BamHI.

Os autores ainda ressaltam que, pelo fato do intein estar presente em regiões conservadas do

gene hospedeiro, é relativamente fácil o desenho de primers que os amplifiquem em todas as

espécies ou genótipos dentro de C. neoformans e C. gattii.

Os introns autocatalíticos, por sua vez, são elementos encontrados em uma grande

variedade de organismos (como fungos, algas e em muitos outros eucariotos unicelulares),

22

genes (rRNA, tRNA e codificadores de proteínas) e genomas em toda a árvore da vida

(HAUGEN; SIMON; BHATTACHARYA, 2005).

Existem quatro principais classes de introns, definidos pelo mecanismo de splicing:

introns autocatalíticos do grupo I e grupo II, introns spliceossômicos e os introns tRNA ou

introns de archea (archaeal introns). Os introns do grupo I estão distribuídos nos genes

codificadores do RNA ribossômico nuclear, DNA mitocondrial de fungos, bactérias e

bacteriófagos. A distribuição dos introns do grupo I é altamente desigual entre os seres vivos.

Sabe-se que estes elementos genéticos são amplamente encontrados nos genes nucleares

codificadores de rRNA, além de diversos genes mitocondriais em fungos, como COX1

(Cyclooxygenase 1), COB (Cytochrome b) e LSU rRNA (do inglês “Large subunit” em tradução

livre “Grande Subunidade Ribossomal”), ao passo que são ausentes na maioria dos animais e

protistas (LANG; LAFOREST;BURGER, 2007). Entretanto, eles já foram encontrados no

genoma mitocondrial da anêmona marinha Metridium senilea e no gene mitocondrial da

subunidade I do Citocromo c oxidase do coral Acropora tenuis. Os introns do grupo II são

encontrados em bactérias e no genoma de organelas. Os introns spliceossômicos são os mais

amplamente encontrados nos pré-RNAm nucleares de eucariotos. Já os introns tRNA são

encontrados no núcleo eucariótico e em Archaea e são enzimaticamente removidos por um

mecanismo de clivagem e colagem que requer ATP e endonuclease (HAUGEN; SIMON;

BHATTACHARYA, 2005).

Os introns do grupo I são pequenos RNAs, com tamanho entre 250-500 nucleotídeos,

que catalisam o seu próprio splicing a partir do RNA precursor (HAUGEN; SIMON;

BHATTACHARYA, 2005). Sua parte catalítica constitui uma das principais classes de RNAs

catalíticos, as ribozimas do grupo I. Alguns introns do grupo I tem uma organização muito

complexa incorporando genes funcionais e outras sequências, estabelecendo profundas relações

com o genoma de seus hospedeiros (NIELSEN; JOHANSEN, 2009).

Análises das sequências dos introns do grupo I revelaram que estes elementos

apresentam uma estrutura secundária em comum, o que inclui a presença de regiões de

pareamento de bases designadas P1 a P10 e regiões de loop sem pareamento. Alguns introns

podem apresentar estruturas variáveis, especialmente os introns mitocondriais, já que podem

não apresentar certos elementos estruturais, como as alças P2, e mais raramente as alças P8, P9

e P10. Os introns do grupo I apresentam algumas sequências conservadas, denominadas regiões

P, Q, R e S. As regiões P e Q se pareiam auxiliando na formação da alça P4, ao passo que R e

S auxiliam na aça P3. A internal guide sequence (IGS, em tradução livre “Sequência guia

interna”) é outra região intrônica localizada próxima à região 5’ que se complementa com o

23

exon anterior para determinar a região de 5’ splice site (Figura 2). Assim, observa-se que os

introns do grupo I apresentam a sua arquitetura estrutural organizada em três grandes domínios,

são eles: os domínios de ligação ao substrato representados por P1 (5’ splice site) e P10 (3’

splice site); o domínio catalítico formado por P3, P7, P8 e P9 e o domínio estrutural ou

scaffolding domain, representado por P4, P5 e P6 (HAUSNER; HAFEZ; EDGELL, 2014; LI;

ZHANG, 2005; MICHEL; WESTHOF, 1990).

Figura 2- Modelo de estrutura secundária dos introns do grupo I. Representação genérica da estrutura dos

introns do grupo I com ênfase nas principais alças e domínios com sequências conservadas. [a] as

regiões com linhas em azul indicam ORFs que codificam homing endonucleases, localizadas

predominantemente nos loops. As linhas em laranja mostram a localização das sequências conservadas

P, Q, R, S e IGS. Retângulos em preto representam exons localizados nas porções anterior e posterior

as regiões 5’ e 3’ splice site (triângulos em verde), respectivamente. O local de ligação da guanina

exógena (ExoG) no G-binding site, localizado na alça P7, está representado por um asterisco. [b] as

ORFs codificando homing endonucleases também podem se estender para as junções que unem as

principais alças, como as junções J1/2 e J6/7. Fonte: Hausner; Hafez; Edgell (2014).

O sucesso dos introns do grupo I, bem como também dos introns do grupo II, está

relacionado à sua inata capacidade de sofrer auto-splicing, que permite que eles se propaguem

pela inserção dentro do gene do hospedeiro (LAMBOWITZ et al., 1999). O processo

autocatalítico de remoção do intron do grupo I é essencial para a maturação do RNA hospedeiro

e, por consequência, para o desenvolvimento da levedura (CECH, 1990), visto que estes

elementos interrompem regiões codificadoras dos genes de mRNA, tRNA, e em sua maioria de

rRNA (LI; ZHANG, 2005). Esta habilidade dos introns do grupo I em sofrer auto-splicing foi

24

primeiramente demostrada por Kruger et al. (1982) para um intron presente no gene nuclear da

grande subunidade ribossomal do protozoário Tetrahymena thermophila.

Os introns do grupo I são removidos do RNA precursor através de duas reações de

splicing distintas (reações de transesterificação), nas quais a estrutura enovelada participa

diretamente da reação. Muitos introns podem sofrer auto-splicing in vitro espontaneamente, ou

seja, nenhuma proteína é requerida no processo, enquanto outros necessitam de fatores

proteicos para facilitar a correta dobragem do sítio catalítico (CECH, 1990). O pré-requisito

para o splicing é a ligação com uma guanosina exógena (ExoG) ou uma de suas formas

fosforiladas (GMP, GDP ou GTP) que atuam como cofator no sítio catalítico do intron,

chamado G-binding site (localizado na alça P7) (Figura 2). Durante o primeiro passo do

splicing, o cofator ataca a região 5’ (SS) e se liga ao intron, resultando na liberação do éxon.

Esse processo se dá quando o cofator ataca o átomo de fósforo da região 5’ formando uma ponte

3,5’- fosfodiéster do primeiro nucleotídeo ao intron. O segundo passo é iniciado por um ataque

na região 3’ do éxon gerado pelo grupo 3’-hidroxil livre do éxon 5’. Isso promove a liberação

da região 3’SS posterior ao último nucleotídeo do intron – que é sempre uma guanina (ωG) -,

resultando na ligação dos éxons e a liberação do intron (CECH, 1990; HAUGEN; SIMON;

BHATTACHARYA, 2005) (Figura 3).

Os introns do grupo I podem ser classificados em cinco subgrupos, sendo eles IA, IB,

IC, ID e IE (MICHEL; WESTHOF, 1990; SUH; JONES; BLACKWELL, 1999), e suas

sequências e estruturas estão disponíveis no GISSD (do inglês “Group I intron sequence and

structure Database” em tradução livre “banco de dados de estrutura e sequência de introns do

grupo I”) (http://www.rna.whu.edu.cn/gissd/index.html). Esta classificação leva em

consideração a presença de domínios conservados, configurações alternativas de elementos na

estrutura secundária e terciária do intron, especialmente as regiões envolvidas com as alças P1,

P3, P4, P6 e P7 (por exemplo, a presença das estruturas P7.1, P7.2) (HAUSNER; HAFEZ;

EDGELL, 2014; MICHEL; WESTHOF, 1990; ZHOU et al., 2008). Dependendo da presença

ou ausência de configurações estruturais específicas, quatro dos cinco subgrupos ainda podem

ser subdivididos em IA1, 1A2, IA3, IB1, IB2, IB3, IB4, IC1, IC2, IC3, IE1, IE2, IE3 (ZHOU

et al., 2008).

25

Figura 3- Representação esquemática do processo de auto-splincing dos introns do grupo I. Fonte: Haugen;

Simon; Bhattacharya (2005).

Os introns do grupo I, além da capacidade de auto-splicing, podem codificar genes de

homing endonucleases (HEG, do inglês: ‘Homing Endonuclease gene’) de DNA específicas

que fazem com que estes elementos genéticos possam se mover dentro do genoma. As Homing

endonucleases são enzimas de clivagem de DNA altamente específicas, encontradas dentro de

todas as formas bacterianas, bem como em mitocôndrias e cloroplastos de células eucarióticas.

Apesar do tamanho reduzido destas proteínas, de modo geral, elas são capazes de reconhecer

longas sequências de DNA, geralmente entre 20-30 pares de bases (STODDARD, 2011).

Quando o gene da homing endonuclease está localizado dentro de elementos que sofrem auto-

splicing (introns do grupo I, II e inteins, por exemplo), eles conferem ao elemento uma maior

habilidade de invasão dentro do genoma do organismo hospedeiro (STODDARD, 2014).

Os introns do grupo I podem ser classificados em duas classes gerais: as que codificam

ORFs (do inglês: ‘Open reading frames’ em tradução livre ‘quadros abertos de leitura’) e as

que não a contém. Essas ORFs codificando homing endonucleases são encontradas em cerca de

30% dos introns do grupo I. Como as HEG estão associadas a um intron autorremovível, sua

presença não interfere na funcionalidade do RNA maduro. A localização dessas ORFs varia

dentro da conservada estrutura secundária de RNA, mas eles são geralmente encontrados em

loops onde não interferem no centro catalítico do splicing (Figura 2) (EDGELL;

CHALAMCHARLA; BELFORT, 2011).

26

Basicamente, a mobilidade do intron/HEG ocorre quando a homing endonuclease gera

uma quebra na dupla fita de DNA (DSB, do inglês “double strand break”) contendo o alelo

cognato sem o intron (portanto sem a homing endonuclease) próximo ou dentro do sítio de

inserção do intron. Pelo sistema de reparo por recombinação homóloga, o alelo íntegro, que

possui o intron com a homing endonuclease, serve de molde para o reparo, sendo copiado para

o alelo cognato, antes vazio (HAUGEN et al., 2007). As lesões no DNA causadas pelas enzimas

homing são subsequentemente reparadas por recombinação homóloga usando a maquinaria de

reparo da célula (BELL-PEDERSEN et al., 1989; MUELLER; SMITH; BELFORT, 1996). Os

genes codificadores de homing endonuclease geralmente ocorrem em regiões não críticas do

intron, como os loops terminais, de modo a não interferir em seu auto-splicing (HAUGEN et

al., 2007; HAUGEN; SIMON; BHATTACHARYA, 2005). Apesar da proximidade e da intensa

relação simbiótica observada entre algumas espécies microbianas e organismos eucarióticos

multicelulares, ainda não foi observado caso de relato da existência destes genes codificadores

de homing endonuclease dentro do genoma de organismos mais complexos (STODDARD,

2011).

As homing endonucleases são classificadas em seis famílias de acordo com os

aminoácidos conservados que fazem parte da estrutura e sítio ativo da proteína, sendo elas

LAGLIDADG, His-Cys box, H-N-H, GIY-YIG, PD-(D/E) xK e EDxHD. Destas famílias,

quatro são mais restritas a introns do grupo I presentes em fagos, bactérias, archea/eucarióticos

e protistas, são elas GIY-YIG, PD-(D/E)xK, LAGLIDADG e His-Cys box, respectivamente

(HAUSNER; HAFEZ; EDGELL, 2014; STODDARD, 2011). Entretanto, de todas as famílias,

a LAGLIDADG apresenta a maior diversidade de distribuição, pois está presente no genoma

de organelas de plantas, fungos, protistas, bactérias, metazoários basais e archaea (BELFORT;

PERLMAN, 1995). Já as famílias His-Cys box e H-N-H apresentam a arquitetura de seu sítio

ativo muito similares, o mesmo ocorrendo para as famílias PD- (D/E)xK e EDxHD

(HAUSNER; HAFEZ; EDGELL, 2014).

Embora altamente dispersos, a distribuição dos introns do grupo I é tendenciosa, visto

que se encontram comumente presentes em alguns taxa de fungos, mas ausente em outros,

sugerindo uma transferência horizontal destes elementos (HAUGEN; SIMON;

BHATTACHARYA, 2005). Além disso, observa-se que um mesmo intron do grupo I pode ter

invadido diferentes genes. Tal observação provavelmente não se deve à ação de homing

endonucleases, pois como supracitado estas enzimas são sítio específicas. Contudo, outro

mecanismo associado à invasão dos introns do grupo I em diferentes sequências do genoma,

conhecido como splicing reverso, parece ser o responsável pela sua mobilidade intra e

27

intergênica. No splicing reverso, o intron do grupo I livre se insere dentro de um sítio natural

de inserção de um outro intron já removido (seja um RNA homólogo ou heterólogo) através da

complementariedade de bases entre o intron e o exon do RNA (HEDBERG; JOHANSEN,

2013). O intron do grupo I é capaz de reconhecer sua sequência alvo, que contém entre 4-6

nucleotídeos (bem menor e, portanto, menos específico que o sítio reconhecido pela HE),

permitindo que o intron se insira na ligação entre os dois exons. Após a integração no transcrito,

o RNA recombinado sofre uma transcrição reversa e o cDNA (DNA complementar) é integrado

ao genoma (BIRGISDOTTIR; JOHANSEN, 2005).

A maior prevalência dos introns do grupo I em genes de rRNA e tRNA talvez seja um

reflexo da enorme abundância destes RNAs – visto que se tratam de genes multicópia. Assim,

eles poderiam gerar muitos alvos de cópia via homing ou splicing reverso in vivo deste elemento

(BELFORT; PERLMAN, 1995). Além disso, o splicing reverso facilita a mobilidade do intron

entre genes distintos, o que seria mais difícil de ocorrer pelo processo de homing. Apesar disso,

este último ainda é mais eficiente em promover a mobilidade do intron, visto que ele não

depende de passos adicionais requeridos pelo splicing reverso, como a transcrição reversa

(BHATTACHARYA et al., 2005).

Quanto a presença dos introns do grupo I em Cryptococcus spp., o estudo realizado por

Litter et al. (2005), utilizando duas cepas de Cryptococcus, IFO 410 (Cryptococcus neoformans

var. grubii - sorotipo A) e IFM 5844 (C. neoformans var. neoformans - sorotipo D), mostrou a

existência de alguns destes elementos no genoma mitocondrial deste fungo. Na cepa IFM 5844

foram identificados 5 introns no gene COX1 (introns com tamanho de 953, 1071, 1043, 1104 e

246 pb), dois introns no gene COB (979 e 1143 pb) e dois introns no gene LSU (417 e 1168

pb), ao passo que nenhum intron foi identificado nos genes COX1 e LSU da cepa IFO 410 e

apenas um intron no gene COB (com tamanho de 1142 pb).

Assim, os polimorfismos de presença e ausência, bem como de tamanho destes

elementos observados no genoma mitocondrial de Cryptococcus podem servir para a

diferenciação entre genótipos de C. neoformans e C. gattii. Isso porque, assim como os inteins,

os introns do grupo I possuem regiões mais e menos variadas, podendo ou não codificar homing

endonucleases. Eles também possivelmente podem estar ausentes ou presentes em

determinados tipos moleculares, e apresentarem diferentes tamanhos. Dessa forma, avaliar os

possíveis polimorfismos existentes entre os introns do grupo I poderá permitir sua utilização

em estudos populacionais e epidemiológicos.

De fato, os introns do grupo I apresentam uma ampla diversidade na sua estrutura e

distribuição. O mesmo também já foi visto para o seu tamanho, uma vez que vários autores já

28

relataram diferença de muitos nucleotídeos entre diversos introns. O estudo de Haugen, Simon

& Bhattacharya (2005) define os introns do grupo I com um tamanho bastante moderado,

variando entre 250-500 nucleotídeos, como já citado. Entretanto, este padrão de tamanho

normalmente é observado para os introns do grupo I presentes em genes nucleares. Porém, para

introns presentes em genes mitocondriais, a diversidade de tamanho observada é muitas vezes

maior, uma vez que eles podem chegar até a 3000 nucleotídeos. Este fato pode ser explicado

pela presença de longas inserções, o que inclui as ORFs codificando homing endonucleases

(LANG; LAFOREST; BURGER, 2007).

Os introns do grupo I já foram estudados em outras espécies de fungos, como Candida

albicans. Nessa espécie, o auto-splicing do intron do grupo I (localizado na subunidade 25S do

rRNA) é de fundamental importância para a maturação do RNA hospedeiro (ZHANG;

LEIBOWITZ; ZHANG, 2009). De forma geral, os introns do grupo I já foram relatados em

outros patógenos microbianos como Pneumocystis carinii, Acanthomoeba, Neissseria,

Neurospora crassa, Candida dubliniensis, Naegleria andersoni, etc. (BOUCHER et al., 1996;

EMBLEY; DYAL; KILVINGTON, 1992; GAST; FUERST; BYERS, 1994; LIU;

LEIBOWITZ, 1993; SOGIN; EDMAN, 1989).

O auto-splicing do intron do grupo I em fungos é também um importante alvo para

fármacos, pois uma vez o splicing inibido, o RNA precursor não se torna funcional. Como os

RNAs hospedeiros destes introns são essenciais para o metabolismo básico da célula, a não

excisão do intron teria um importante impacto na viabilidade da célula fúngica, com a vantagem

de ser um alvo seguro, uma vez que estes elementos invasivos estão ausentes no genoma

humano (DISNEY et al., 2001). Isto vem de encontro como acréscimo no número de casos de

doenças fúngicas relatadas (especialmente entre os fungos patogênicos oportunistas que

acometem pacientes imunodeprimidos), bem como o aumento na incidência da resistência a

antifúngicos, o que leva a necessidade da busca de novas drogas e novos alvos terapêuticos

(STERNBERG, 1994).

Em Candida albicans, o intron do grupo I do gene codificador do rRNA 25S, presente

em aproximadamente 40% das cepas (MERCURE; MONTPLAISIR; LEMAY, 1993) é

considerado um alvo terapêutico, uma vez que sua presença está relacionada a susceptibilidade

a pentamidina, que comprovadamente é capaz de inibir seu splicing, em concentrações de 200

µM, em experimentos conduzidos in vitro e em células. (MILETTI; LEIBOWITZ, 2000).

Pequenos oligonucleotídeos modificados por nucleases também apresentaram ação

inibitória do auto-splicing através de mecanismos de inibição suicida, no qual o

oligonucleotídeo se liga ao RNA precursor e subsequentemente inibe o auto-splicing do intron

29

in vivo (DISNEY et al., 2001). Outras moléculas pequenas, além dos oligonucleotídeos e

pentamidina, como é o caso do 5-Flurouracil e 5-Flucitosina, também são mostrados como

drogas atuantes no intron do grupo I de C. albicans (MERCURE et al., 1997; MERCURE;

MONTPLAISIR; LEMAY, 1993). Similarmente, muitos aminoglicosídeos e antibióticos

peptídicos foram reportados como inibidores do auto-splicing do intron do grupo I (VON

AHSEN; DAVIES; SCHROEDER, 1992; VON AHSEN; SCHROEDER, 1991; WANK et al.,

1994).

Testes de susceptibilidade conduzidos por Jayaguru & Raghunathan (2007) mostraram

a bleomicina como uma importante droga inibitória do auto-splicing do intron do grupo I em

C. albicans. A bleomicina é um antibiótico glicopeptídico antitumoral que se mostrou interagir

com o intron do grupo I de modo a afetar sua conformação, inibindo o seu auto-splicing. Uma

forte correlação entre a presença do intron e a alta susceptibilidade a bleomicina é evidente, de

modo que a concentração mínima inibitória da bleomicina para as cepas que continham o intron

foi de 1,56 µg/ml enquanto que para aquelas onde o intron estava ausente foi de 6,25 µg/ml.

Dessa forma, a bleomicina pode ser utilizada contra esse patógeno, mas sem afetar as células

normais do portador.

Assim, o desenvolvimento de drogas que inibem esse processo de splicing do intron do

grupo I pode ser promissor para a busca de terapias alternativas e com menores efeitos colaterais

aos pacientes. Os antifúngicos normalmente utilizados no tratamento da criptococose, como os

compostos azólicos (itraconazol, fluconazol), 5-flucitosina e anfotericina B podem causar

sérios problemas ao indivíduo. A exemplo tem-se o tratamento com anfotericina B, que por

provocar episódios de vômitos, náuseas, hipertensão ou hipotensão, hipóxia, além de sérios

efeitos nefrotóxicos ao paciente, torna a sua administração dependente de internação

(LANIADO-LABORÍN; CABRALES-VARGAS, 2009). Dessa forma, pode-se considerar os

introns do grupo I alvos terapêuticos potencialmente seguros, uma vez que estes elementos

estão ausentes no genoma humano (HAUGEN; SIMON; BHATTACHARYA, 2005).

Segundo Litter et al. (2005) e a base de dados CRW (Comparative RNA Web site and

Project) (http://www.rna.icmb.utexas.edu//) existem dois introns do grupo I no gene

mitocondrial 23S de C. neoformans var. neoformans, nomeados Cne.mL2449 (com 1168 pb) e

Cne.mL2504 (com 417 pb) (acesso em http://www.rna.whu.edu.cn/gissd//). Esses introns estão

localizados em um intervalo de apenas 53 nucleotídeos de distância um do outro (Figura 4) e

podem ser identificados no GenBank com número de acesso AY560611.1 para C. neoformans

var. neoformans, mas estão ausentes em C. neoformans var. grubii (AY560612.1) (LITTER et

al., 2005). A sequência e estrutura desses dois introns supracitados já se encontram disponíveis

30

no banco de dados do GISSD (http://www.rna.whu.edu.cn/gissd/search.html), onde ambos

foram classificados como pertencentes ao subgrupo IA1 (Figura 5). Entretanto, até o momento

não há relato de estudos populacionais dentro do gênero Cryptococcus para averiguar a

ocorrência e distribuição desses introns; e ainda, se estes elementos podem servir como

marcadores moleculares para a distinção entre tipos moleculares ou como um novo alvo para o

indicativo de resistência a drogas antifúngicas em Cryptococcus.

Figura 4- Introns descritos no gene mitocondrial 23S. O esquema ilustrativo mostra os dois introns do grupo I

presentes no gene mitocondrial 23S de C. neoformans var. neoformans que já se encontram depositados

em banco de dados do GISSD e CRW.

31

Figura 5- Predição da estrutura secundária para os introns Cne.ml2449 e Cne.mL2504. Ambos elementos já

foram identificados no trabalho realizado por Litter et al. (2005) para um isolado de Cryptococcus

neoformans var. neoformans (VNIV, sorotipo D) (GenBank número de acesso AY560611.1) e sua

sequência e estrutura já se encontram depositadas no GISSD, onde encontram classificados como

pertencentes ao subgrupo IA1. Fonte: GISSD.

32

Assim, a presente pesquisa foi pioneira na realização de um estudo populacional da

presença/ausência de polimorfismos de introns do grupo I no gene LSU (23S) em Cryptococcus,

apontando seu possível uso na clínica e em estudos epidemiológicos. Portanto, avaliar a

possível utilização dos introns do grupo I como novos alvos moleculares para susceptibilidade

a antifúngicos e genotipagem foi um dos fins deste estudo.

33

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Avaliar a relação entre os diferentes genótipos de Cryptococcus neoformans e

Cryptococcus gattii e sua susceptibilidade a antifúngicos com a presença e variabilidade dos

introns do grupo I do gene codificador do RNA ribossômico 23S (LSU) mitocondrial destes

patógenos.

2.2 Objetivos específicos

• Genotipar isolados de C. neoformans e C. gattii através de RFLP do gene URA5;

• Avaliar a presença de polimorfismos que possam ser úteis na rápida distinção entre as

espécies e seus tipos moleculares, definidos pelo PCR e sequenciamento dos introns do

grupo I de C. neoformans e C. gattii, presentes no gene mitocondrial LSU rRNA (23S);

• Observar a presença de possíveis associações entre a presença do intron e a

susceptibilidade às drogas para cada genótipo de C. neoformans e C. gattii;

• Elucidar a possível origem dos introns descritos pela comparação das sequências obtidas

com as sequências similares depositadas no GenBank;

• Avaliar a presença de possíveis ORFs nos introns;

• Avaliar a presença de sítios conservados que caracterizam a funcionalidade do intron

como elemento autocatalítico e propor modelos de estrutura secundária de RNA para os

introns estudados.

34

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Isolados fúngicos utilizados

Os isolados clínicos e ambientais analisados nesse estudo tiveram origem de fontes

distintas. Vinte e nove isolados foram cedidos pelo laboratório de Biologia de Fungos do

Instituto de Biociências da UNESP de Botucatu/SP. Nove isolados foram solicitados a

Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz) do Rio de Janeiro/RJ, nove vieram do Instituto de Medicina

Tropical de São Paulo – IMT/SP, três da Universidade Federal do Piauí – UFPI, sete da

Universidade Federal do Rio Grande do Sul – UFRGS, duas cepas foram obtidas por isolamento

ambiental na cidade do Natal (RN), dois foram provenientes do Laboratório Central de Saúde

Pública do Rio Grande do Norte (LACEN/RN) e outra do Hospital São Lucas (Natal/RN) e,

por fim, pelo convênio existente entre o Instituto de Medicina Tropical – IMT/RN e Hospital

Giselda Trigueiro (HGT), 16 amostras clínicas de pacientes (entre eles pacientes

imunodeprimidos e imunocompetentes) foram adquiridas por meio de punções do líquido

cefalorraquidiano e isolamento em Sabouraud Dextrose Agar realizadas por profissionais de

saúde especializados, na rotina diária de diagnóstico micológico. Assim, nesse estudo foram

analisados um total de 78 isolados (Tabela 1), sendo um pertencente a espécie C. laurentii, que

por ser grupo-irmão de C. gattii e C. neoformans foi escolhido como um grupo externo para a

avaliação da presença do intron do grupo I no gene mitocondrial 23S. Os isolados foram

cultivados no meio Sabouraud Dextrose Agar, acrescido de cloranfenicol (50 mg/L), mantidos

a 37°C durante 72 h e, então, condicionados em geladeira (4°C).

O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do

Rio Grande do Norte: CAAE 39640614.8.0000.5537.

Tabela 1- Isolados utilizados no estudo.

Designação coleção UFRN Origem/referência

BT1 Hospital das Clínicas-Botucatu








35










BT18 NI

BT19 NI

BT20 Hospital Veterinário – Botucatu

BT21 NI

BT22 Hospital Veterinário – Botucatu

BT23 NI

BT24 NI

BT25 NI


BT27 NI

BT28 NI

BT29 NI

FC1 FIOCRUZ RJ (70302 - WM178)




FC5 FIOCRUZ RJ (70296 -WM626)

FC6 FIOCRUZ RJ

FC7 FIOCRUZ RJ

FC8 FIOCRUZ RJ (40043)


HGT1 Hospital Giselda Trigueiro-Natal






36









HGT15

HGT16

Hospital Giselda Trigueiro-Natal

Hospital Giselda Trigueiro-Natal

HSL1 Hospital São Lucas

UFRN1 Isolamento ambiental/Alecrim- Natal

UFRN2 Isolamento ambiental/Alecrim- Natal

PI1543 Universidade Federal do Piauí



CG606 Instituto de Medicina Tropical – SP




CN772 Instituto de Medicina Tropical – SP





CFP55 Universidade Federal do Rio Grande do Sul







LCR2002237

LCR2002368

LACEN/RN

LACEN/RN

Lista geral de todos os setenta e oito isolados de Cryptococcus sp. agrupados segundo sua origem.

NI- Não informado.

37

3.2 Extração de DNA

A extração de DNA foi feita de acordo com Trilles et al. (2008). Após o subcultivo, em

tubos com Sabouraud-Dextrose Agar (Kasvi, EUA) a 37°C por 48 h, a cultura foi toda removida

com o auxílio de uma espátula (em fluxo de biossegurança CSB classe 2), congelada com

nitrogênio líquido e triturada em um graal com um pistilo (todos previamente esterilizados). Ao

triturado foram adicionados 500 µL de solução de lise (SDS 0,5%, NaCl 1,4%, EDTA 0,73% e

Tris-HCl 0,2 M), homogeneizados com o pistilo e, então, transferidos para um micro tubo. A

mistura foi agitada no agitador de tubos (vórtex) à temperatura ambiente por 5 minutos; em

seguida foram adicionados 500µL de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (v:v:v 25:24:1). Após

homogeneização (por inversão) durante 2 minutos os tubos foram centrifugados por 20 minutos

a rotação de 16.000 g. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo previamente

identificado e um volume igual (mesmo volume, em microlitros, do sobrenadante retirado) de

clorofórmio:álcool isoamílico (v:v 24:1) foi adicionado, seguido de nova homogeneização e

centrifugação como anteriormente. O sobrenadante foi novamente transferido para um novo

microtubo, onde igual volume de isopropanol foi adicionado (seguindo o mesmo esquema

anterior). A mistura foi gentilmente homogeneizada e incubada a -20°C por 1 h ou overnight.

O DNA foi precipitado por centrifugação a 16.000 g por 20 minutos para a formação do pellet

e o sobrenadante foi removido. Lavou-se o DNA com 1 mL de etanol 70%, seguindo uma nova

centrifugação como anteriormente e posterior descarte do sobrenadante. O DNA foi secado no

concentrator (eppendorf concentrator plus) (45°C; 15 min.), suspendido em 50 µL de nuclease

free water (NFW, Sigma) e mantido a 4°C overnight, para então ser estocado a -20°C.

A quantificação do DNA extraído foi estimada por duas técnicas: através de gel de

agarose (GE Healthcare) a 1% e corrida em eletroforese com o marcador Low Mass Ladder

(Invintrogen) ou por quantificação direta no NanoDrop 2000 Spectrophotometers (Thermo

Scientific).

3.3 PCR e RFLP do gene URA5

Para a reação de PCR do gene URA5, um mix de 50 µL foi preparado contendo 27 µL

de nuclease free water (Sigma), 10 µL de PCR buffer CG 5X (200 mM tris-HCL PH 8,4; 1,5

mM MgCl2 50 mM; 500mM KCl), 5 µL de DMSO 30% (Thermo scientific), 1 µL de dNTP a

10 mM cada, 30ng de DNA genômico, 1,25 µL de cada primer URA5 - 5’-

ATGTCCTCCCAAGCCCTCGACTCCG -3’) e SJO1 - (5’-

38

TTAAGACCTCTGAACACCGTACTC- 3’) (MEYER et al., 2003) a 20 µM cada e 0,5 µL (1

unidade) de Phusion DNA Polymerase (Finnzymes). A termociclagem consistiu de 1 minuto a

98°C, 35 ciclos de 98°C por 10 segundos, 61°C por 30 segundos e 72°C por 30 segundos,

seguindo uma extensão final a 72°C por 10 minutos. A amplificação do gene URA5 foi

conferida em gel de agarose (GE healthcare) 1% pela aplicação de 5 µL do produto de PCR no

gel. A visualização foi feita pela exposição do gel a luz ultravioleta. Esperava-se uma banda

única de aproximadamente 750 pb correspondente ao gene URA5 (744 pb).

Os produtos de PCR foram então concentrados para 12,5 µL e submetidos à digestão

dupla com as enzimas de restrição Sau96I (New England BioLabs, 5 U/µL) e HhaI (New

England BioLabs, 20 U/µL). Foi montado um mix contendo 1,5 µL do tampão Cut Smart (Cut

Smart 10X, BioLabs), 0,5 µL de HhaI e 0,5 µL da enzima Sau96I. Um total de 2,5 µL do mix

foi adicionado para cada 12,5 µL do produto de PCR concentrado de cada isolado. A digestão

ocorreu em banho-maria a 37°C durante 3 horas. Os fragmentos foram separados por

eletroforese em gel de agarose (GE healthcare) 3% com TBE 1X na fonte (EPS 301, Amersham

Biosciences) durante 120 minutos a 100 volts. Os isolados foram genotipicamente classificados

segundo padrão proposto por Meyer et al. (2003), e reproduzido por outros autores (Figura 6)

(TRILES et al., 2008).

Figura 6- Método de genotipagem por PCR/RFLP do gene URA5. Padrão de bandas esperados após a digestão

do gene URA5 com as enzimas de restrição Sau96I e Hhal, diferenciando os oito tipos moleculares de

C. neoformans e C. gattii. Fonte: Trilles et al. (2008).

39

3.4 PCR do intron do grupo I e eletroforese

Os dois introns do grupo I presentes na subunidade 23S descritos para um isolado de C.

neoformans var. neoformans distam um do outro em apenas 53 nucleotídeos, e por esse motivo

foi feita uma reação de PCR com os primers CryLSUF (5’ GATTTGACTATTCTTATGTGC

3’) e CryLSUR (5’ GGTATATGCATGCTTGACTGC 3’), desenhados neste trabalho, que se

anelam nas porções 5’ e 3’ do gene 23S que flanqueiam esses dois introns (Figura 7). Os primers

CryLSUF e CryLSUR foram desenhados manualmente a partir de duas sequências depositadas

para Cryptococcus: C. neoformans var. neoformans (número de acesso AY560611.1) e C.

neoformans var. grubii (número de acesso AY560612.1). O PCR foi realizado como descrito

para o gene URA5, sendo a termociclagem constituída de um ciclo inicial de 2 minutos a 98ºC

para desnaturação inicial, seguido por 40 ciclos de 45 segundos de desnaturação a 98ºC, 1

minuto e meio de anelamento a 60ºC, 1 minuto e meio de extensão a 72ºC e um ciclo de

extensão final de 10 minutos a 72ºC. Controles positivos e negativos de amplificação foram

adicionados à reação. O produto da PCR permaneceu refrigerado a 4ºC até o uso.

O DNA amplificado foi separado por eletroforese em gel de agarose (GE Healthcare) a

1% com TBE 1X. Um volume de 12,5 µL da reação de PCR foi aplicado no gel de agarose e a

corrida foi realizada na fonte (EPS 301, Amersham Biosciences) a 90 volts por 70 minutos. A

visualização do DNA amplificado foi possível pela adição de brometo de etídio previamente

no gel, seguido de sua exposição a luz ultravioleta e posterior captura de imagem no

transluminador (Gel DocTM XR system, Bio-Rad).

Figura 7- Desenho dos primers. O esquema ilustrativo mostra a região de anelamento dos primers CRYLSUF e

CRYLSUR, representada pelos triângulos vermelhos, localizado nos exons que flanqueiam os dois

introns descritos para a região do gene mitocondrial LSU rRNA.

40

3.5 Sequenciamento e alinhamento do intron

Os produtos de PCR foram purificados com o kit IlustraTM GFXTM PCR DNA and Gel

Band Purification (GE Healthcare), segundo as instruções do fabricante e submetidos à reação

de sequenciamento e eletroforese em capilar junto a MACROGEN/Coreia do Sul.

As sequências foram alinhadas utilizando a versão online do programa PRANK-

(EMBL-EBI) (http://www.ebi.ac.uk/goldman-srv/webPRANK/) (LÖYTYNOJA;

GOLDMAN, 2010).

3.6 Estrutura secundária

Para a predição da estrutura secundária foi utilizada a versão online do programa mFold

RNA (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form) (ZUKER, 2003). Alças e

domínios conservados para os introns do grupo I assim como outras convenções propostas e já

reproduzidas por outros autores (HAUSNER; HAFEZ; EDGELL, 2014; LI; ZHANG, 2005;

MICHEL; WESTHOF, 1990) foram considerados. Para melhor localização das alças P1 e P10

foram incluídos na análise 10 nucleotídeos do exon em ambas as posições 5’ e 3’ do intron. A

predição da estrutura foi realizada em partes, utilizando sequências menores de nucleotídeos

para a localização das principais alças e domínios conservados do intron. Introns foram

nomeados de acordo com o proposto pelo guia de nomenclatura para introns do grupo I em

rDNA (JOHANSEN; HAUGEN, 2001). Foi utilizado o programa inkscape (v 0.91) para o

desenho da predição da estrutura secundária do intron.

3.7 Análise filogenética

Foi realizada uma busca individual em todos os introns por sequências conservadas de

homing endonucleases através do NCBI - Conserved Domain

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi). Todas as regiões que apresentaram

alta similaridade com homing endonuclease tiveram suas sequências removidas para se realizar

a análise filogenética. A fim de se especular a possível origem dos diferentes introns, foi feito

um BLAST - Basic Local Alignment Search Tool

(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LI

NK_LOC=blasthome) para a busca de sequências similares no banco de dados para os introns

estudados. Sequências com valores baixos de query cover (abaixo de 25%) não foram

http://www.ebi.ac.uk/goldman-srv/webPRANK/

41

selecionadas. Estas sequências foram agrupadas com os mesmos tipos de introns utilizados para

a busca (introns aqui sequenciados).

Para cada alinhamento, feito no webPRANK os melhores modelos evolutivos foram

acessados pelo JModelTest v.2.1.7 (POSADA, 2008). Para esta seleção, calculou-se os valores

de: (i) AIC (do inglês “Akaike Information Criterion”, em tradução livre “Critério Akaike de

Informação”) (AKAIKE, 1998), (ii) BIC (do inglês “Bayesian Information Criterion”, em

tradução livre “Critério Bayesiano de Informação”) (SCHWARZ, 1978) e (iii) DT (do inglês

“Decision Theory Performance-Based Selection”, em tradução livre “Teoria da decisão baseada

seleção de desempenho”) (MININ et al., 2003). Nos casos de discrepância, a escolha do melhor

modelo baseou-se preferencialmente no valor BIC e, como fator limitante, a disponibilidade do

modelo do MrBayes v.3.2.6 (RONQUIST et al., 2012).

De posse dos melhores modelos disponíveis para uso no MrBayes, executou-se as

análises filogenéticas em ambiente UNIX. Todos os alinhamentos foram convertidos do

formato fasta para o formato nex. Cada corrida contou com duas análises independentes e

simultâneas que foram executadas para cada um dos cinco alinhamentos, totalizando 10

corridas e 10 análises. Para cada análise, gerou-se 1.000.000 ou 5.000.000 árvores aleatórias,

com árvores e demais valores salvos a cada 500 gerações. Todas as demais opções foram

mantidas no padrão do programa (default), exceto quando explicitado nas legendas das figuras.

Ao final de cada corrida, o desvio padrão entre as duas análises sempre se manteve abaixo de

0.01. Após a sumarização dos valores estatísticos da corrida, certificou-se que os valores de

PSRF (do inglês “Potential Scale Reduction Factor”, em tradução livre “Fator Potencial de

Redução Escalar”) sempre se mantiveram muito próximo a 1,0 para todos os parâmetros [TL,

pi(A), pi(C), pi(G) e pi(T)]. Após todas estas certificações de qualidade estatística das corridas,

as árvores foram sumarizadas e a árvore consenso de cada corrida foi gerada. A visualização

das árvores deu-se no FigTree v.1.4.2 e o Inkscape (v.0.91) foi utilizado para edições finais,

sempre se preservando a escala.

3.8 Testes de susceptibilidade a antifúngicos

Para o teste de susceptibilidade a antifúngicos foram utilizadas as drogas itraconazol

(SIGMA- ALDRICH), anfotericina B (SIGMA- ALDRICH) e 5-flucitosina (SIGMA-

ALDRICH). As concentrações inibitórias mínimas (minimum inhibitory concentrations –

MICs) foram determinadas pelo método de microdiluição para 38 isolados testados, seguindo

o protocolo do CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) documento (CLSI -

42

CLINICAL & LABORATORY STANDARDS INSTITUTE, 2008a, 2008b). Para o preparo

das soluções estoque, diluiu-se o itraconazol em DMSO, a 5-flucitosina em água milli-q estéril

e a anfotericina B (SIGMA- ALDRICH) utilizada já estava em solução a 250µg/mL. As

diluições seguintes das drogas foram feitas em RPMI 1640 com glutamina e sem bicarbonato

(Gibco, Life Technologies), pH 7.6 (tamponada com HCl 1M) e esterilizado por filtração. A

microdiluição de cada droga foi realizada em placa de 96 poços, onde as concentrações finais

variaram de 0.125-64 µg mL-¹ para a 5-flucitosina e 0.0313-16 µg mL-1 para a anfotericina B e

itraconazol, com volume final 100µL.

Para o preparo do inóculo da levedura todos os microrganismos foram previamente

subcultivados em sabouraud ágar a 35°C durante 48h. Colônias isoladas foram removidas,

suspensas em 5mL de salina (0,85% NaCl) estéril, homogeneizadas e a densidade celular foi

comparada a escala 0,5 McFarland. O inóculo foi então ajustado a uma concentração de 1x103

a 5x103 em RPMI 1640 após a contagem e mensuração das células em câmara de Neubauer

(adotou-se uma diluição 1:10 da escala 0,5 Mcfarland em RPMI 1640 após padronização). Uma

alíquota de 100µL foi adicionada em cada poço contendo as diluições das drogas (que já

continha 100µL de droga nas 10 diluições testadas), de modo que o inóculo fosse novamente

diluído duas vezes (1:1), resultando na concentração final desejada de 0,5x103 a 2,5x103 de

células por poço com volume final de 200µL. Controles positivos (RPMI + veículo da droga +

inóculo fúngico) e controles negativos (RPMI) foram utilizados em cada placa, ambos com o

mesmo volume final de 200µL. Em cada placa foi utilizada Candida parapsilosis (ATCC

22019) e Candida krusei (ATCC 6258) como controles de qualidade.

As leituras foram realizadas após 48h e 72h de incubação a 35°C, através da indicação

de scores variando entre 0-4 (0 – visualmente claro; 1 – ligeiramente turvo; 2 – queda de 50%

do crescimento; 3 – ligeira redução do crescimento; 4 – nenhuma redução do crescimento). O

MIC foi atribuído após 72h de crescimento e definido para 5-flucitosina e itraconazol como a

menor concentração capaz de causar uma queda de 50% do crescimento (score 2) e para a

anfotericina B como a menor concentração capaz de inibir o crescimento fúngico (score 0),

sempre comparando com os controles.

3.9 Análises Estatísticas

Para a análise estatística, os dados referentes aos introns do grupo I foram tratados como

variáveis dicotômicas (ou seja, presente/ausente) para as análises específicas de cada intron e

43

na avaliação dos introns em geral. O teste de Fisher exact foi utilizado para testar as diferenças

na distribuição dos introns entre os grupos de genótipos (virulento e não-virulento). Para se

avaliar o efeito dos introns sobre a resposta aos antifúngicos testados, foram aplicados modelos

logísticos ordenados utilizando os valores de MIC como variável resposta e introns (ausente

como referência) e espécie (C. gattii como referência) como preditores. As análises estatísticas

foram realizadas no programa Stata (v. 11.1).

44

4 RESULTADOS

4.1 PCR e RFLP do gene URA5

A maioria dos isolados deste estudo foram identificados como C. neoformans (n=51),

seguido por C. gattii (n=26). Um isolado era pertencente a espécie C. laurentii. O PCR-RFLP

do gene URA5 identificou os tipos moleculares em VNI (39 isolados), VGII (20 isolados),

VNIV (5 isolados), VNII (4 isolados), VNIII (3 isolados) e dois isolados para cada um dos

demais genótipos, VGI, VGIII e VGIV (Figura 8).

Os perfis de RFLP dos isolados foram comparados segundo o padrão já observado por

Trilles et al. (2008) para os oito genótipos conhecidos (Figura 6). As imagens com a

genotipagem de todos os isolados são visualizadas no APÊNDICE A.

Figura 8- Distribuição dos isolados de C. neoformans e C. gattii segundo seu genótipo. Pela análise do RFLP

do gene URA5, foram identificados os tipos moleculares VNI e VGII como os mais prevalentes dentre

os 78 isolados utilizados neste estudo.

4.2 PCR e sequenciamento do intron do grupo I

Como previamente mencionado, os primers CryLSUF e CryLSUR, desenhados neste

estudo, se anelam exatamente nas porções 5’ e 3’ dos exons que flanqueiam os introns

Cne.mL2449 (1168 pb) e Cne.mL2504 (417 pb). Assim são gerados amplicons de,

VNI39

VGII20

VNIV5

VNII4

VNIII3

VGI2

VGIII2

VGIV2

45

aproximadamente, 300 pb caso os dois elementos estejam ausentes, ou cerca de 1,9 Kb na

presença dos dois elementos. Após PCR, observou-se a presença de amplicons variando de

aproximadamente 300 pb a 2500 pb, indicando um polimorfismo de tamanho destes elementos

entre os oito tipos moleculares (Figura 9).

Figura 9- Os genótipos de C. neoformans e C. gattii apresentam polimorfismos entre os introns do grupo I.

Produtos de diferentes tamanhos foram observados após o PCR do intron do grupo I com

Introns do grupo I no LSU rRNA mitocondrial de ... · TRIS-HCl Trisaminometano – hydroxymethyl...

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