INVESTIGAÇÃO DA OCORRÊNCIA DE DIROFILARIOSE … · as infecções caninas e em humanos são...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS INVESTIGAÇÃO DA OCORRÊNCIA DE DIROFILARIOSE HUMANA EM MORADORES DO MUNICÍPIO DE SÃO SEBASTIÃO DA BOA VISTA, ARQUIPÉLAGO DO MARAJÓ, PARÁ, BRASIL HÉLIOMAR BORRALHO MIRANDA Belém-PA 2013
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS
INVESTIGAÇÃO DA OCORRÊNCIA DE DIROFILARIOSE HUMANA EM MORADORES DO MUNICÍPIO DE SÃO SEBASTIÃO DA BOA VIS TA,
ARQUIPÉLAGO DO MARAJÓ, PARÁ, BRASIL
HÉLIOMAR BORRALHO MIRANDA
Belém-PA 2013
HÉLIOMAR BORRALHO MIRANDA
INVESTIGAÇÃO DA OCORRÊNCIA DE DIROFILARIOSE HUMANA EM
MORADORES DO MUNICÍPIO DE SÃO SEBASTIÃO DA BOA VIS TA,
ARQUIPÉLAGO DO MARAJÓ, PARÁ, BRASIL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos
e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas
da Universidade Federal do Pará como requisito
para a obtenção do grau de Mestre em Biologia
de Agentes Infecciosos e Parasitários.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Jeannie Nascimento dos
Santos.
Belém-PA 2013
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação ( CIP) Sistema de Bibliotecas da UFPA
___________________________________________________ _____________
Miranda, Héliomar Borralho, 1966- Investigação da ocorrência de dirofilariose humana em moradores do município de São Sebastião da Boa Vista, arquipélago do Marajó, Pará, Brasil / Héliomar Borralho Miranda. - 2013. Orientadora: Jeannie Nascimento dos Santos. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários, Belém, 2013. 1. Zoonoses São Sebastião da Boa Vista (PA). 2. Dirofilaria immitis. 3. Dirofilariose canina. 4. Animais como transmissores de doenças. 5. Epidemiologia. I. Título. CDD 22. ed. 616.9590098115 Dados Internacionais de Catalogação-na- Publicação (CIP) Sistema de Bibliotecas da UFPA
___________________________________________________ ___________________
HELIOMAR BORRALHO MIRANDA
INVESTIGAÇÃO DA OCORRÊNCIA DE DIROFILARIOSE HUMANA EM
MORADORES DO MUNICÍPIO DE SÃO SEBASTIÃO DA BOA VIS TA,
ARQUIPÉLAGO DO MARAJÓ DO MARAJÓ, PARÁ, BRASIL.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes
Infecciosos e Parasitários, do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal
do Pará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Biologia de
Agentes Infecciosos e Parasitários.
Orientadora: Profª. Drª Jeannie Nascimento dos Santos Instituto de Ciências Biológicas
Universidade Federal do Pará
Banca Examinadora: Prof. Dr. Adriano Penha Furtado Laboratório de Biologia Celular e Helmintologia “Reinalda Lanfredi”
Instituto de Ciências Biológicas(UFPA)
Profª. Drª. Elane Guerreiro Giese
Universidade Federal Rural da Amazônia(UFRA)
Prof. Dr. Marcelo Beltrão Molento
Universidade Federal do ParanáUFPR)
Membro Suplente: Profª. Drª. Marinete Marins Póvoa (IEC)
Belém, 05 de setembro de 2013
"A pessoa mais rica é aquela cujos prazeres são menos dispendiosos. Nossa civilização consiste em milhões de seres vivendo juntos, num espaço restrito, em total solidão. A natureza é o único local onde o ser humano pode se encontrar consigo mesmo. As coisas não mudam – nós mudamos. Seguir a trilha dos próprios sonhos e viver a vida que desejamos é garantia de sucesso. Investir em bondade é o melhor negócio que você pode fazer."
(Henry David Thoreau)
A Profª Drª, Jeannie Nascimento dos Santos
Dedico.
AGRADECIMENTOS
A Deus pelos Dom da vida e sabedoria.
A minha Mãe Doraci Borralho pela minha vida, e o que sou.
Ao meu Pai e meus avós “in memoria” pelo incentivo aos estudos e a viver.
A toda minha família pelo incentivo, torcida, amor e companheirismo,
principalmente Minha esposa Ruth Belo e meu filho Anderson Hélio.
Ao Profª. Drª. Jeannie pela amizade, respeito, confiança e seu apoio.
A Equipe do Laboratório de Biologia Celular e Helmintologia (LBCH) do ICB,
UFPA , pela disposição em auxiliar e pela gentileza com que me receberam.
Ao Amigo Eder do Carmo pelo incentivo e colaboração nas coletas de
amostras e construção da dissertação.
A Amiga Vera Lucia Coimbra pelo apoio no trabalho e por ter me apresentado a
equipe do LBCH.
A Secretaria Municipal de Saúde de São Sebastião da Boa Vista pelo apoio na
coleta de amostras.
A população de São Sebastião da Boa Vista na Ilha do Marajó pelo
acolhimento e participação no trabalho.
A todos aqueles que torceram pelo meu sucesso e hoje estão felizes com
minhas conquistas. Minha eterna gratidão.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.........................................................................................................10
1.1. MORFOLOGIA E BIOLOGIA................................................................................10
1.1.1. Morfologia .........................................................................................................10
1.1.2. Biologia... ..........................................................................................................11
1.1.2.1. Hospedeiros....................................................................................................11
1.1.2.2.Ciclo Biológico..................................................................................................11
1.2. DIROFILARIOSE CANINA....................................................................................13
1.2.1. Epidemiologia da Dirofilariose Canina ..........................................................13
1.2.1.1. Mundo..............................................................................................................13
1.2.1.2. Europa............................................................................................................14
1.2.1.3. América do Norte.............................................................................................14
1.2.1.4. Brasil................................................................................................................15
1.2.1.5. Estado do Pará................................................................................................16
1.2.2. Diagnóstico da Dirofilariose Canina ...............................................................18
1.2.2.1. Métodos Parasitológicos.................................................................................18
1.2.2.2. Métodos Sorológicos ......................................................................................20
1.3. INFECÇÃO HUMANA POR Dirofilaria immitis......................................................22
1.3.1. Epidemiologia da Dirofilariose Humana .......................................................23
1.3.2 Manifestações Clínicas da Dirofilariose Pulmonar Hu mana (DPH) ...........24
1.3.3. Patogenia da Dirofilariose .............................................................................26
1.3.4. Aspectos Imunológicos da Dirofilariose Huma na ......................................27
1.3.5. Diagnóstico das Dirofilarioses em Humanos ..............................................28
1.4. OBJETIVOS ………………………………………..................................................29
1.4.1.Objetivo Geral ...................................................................................................29
1.4.2. Objetivos Específicos .....................................................................................30
2. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................31
2.1. ÁREA DO ESTUDO .............................................................................................31
2.2. ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO RETROSPECTIVO...............................................33
2.3. OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS BIOLÓGICAS.....................................................33 2.3.1. Coleta de Amostras de Sangue de Cães .............................................................33
2.3.2. Inquérito Hematológico no Cão. .....................................................................34
2.3.3. Coleta de Amostras de Sangue de Humanos ...............................................34
2.3.4. Recepção de Amostras de Fezes............... ....................................................34
2.3.5. Dosagem Laboratorial da IgG Específica Para D. Immitis por ELISA.........35
2.3.6. Dosagem Laboratorial da IgE Total por ELISA. .............................................37
2.3.7. Realização de Hemograma Completo ........... ................................................38
2.3.8. Realização de Exame Parasitológico Das Fezes ..........................................38
2.4. ASPECTOS ÉTICOS.............................................................................................39
2.5. ANÁLISE DOS DADOS .......................................................................................39
3. RESULTADOS ........................................................................................................40
3.1. INQUÉRITO HEMATOLÓGICO EM CÃES...........................................................40
Analise Microscópica a Fresco do Sangue de Cães . ............................................40
3.1.2. Análise Microscópica da Gota Espessa. ........................................................40
3.1.3. Método de Knnot Modificado . .......................................................................40
3.2. QUANTIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS DO ASDIA.................................................41
3.3. ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO E LABORATORIAL EM HUMANOS.....................42
3.3.1. Estudo Epidemiológico ...................................................................................42
3.3.2. Estudo Laboratorial ..........................................................................................43
3.3.2.1. Exame Parasitológico das Fezes ...................................................................43
3.3.2.2. Contagem de Eosinófilos.................................................................................43
3.3.2.3. Dosagem de IgE Total.....................................................................................45
Curva de Calibração do IgE.........................................................................................45
3.3.2.4. Pesquisa de Anticorpos IgG Específico para Dirofilaria immitis......................48
3.3.2.5. Análise dos Marcadores de infecção por D. Immitis, após Tratamento
das Helmintíases Intestinais. .......................................................................................50
3.3.2.6. Relação entre os resultados das análises laboratoriais dos cães e posse
dos animais por humanos............................................................................................52
4. DISCUSSÃO............................................................................................................53
5. CONCLUSÕES........................................................................................................56
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS............................ .........................................................57
7. REFERÊNCIAS................................................ .......................................................58
8. ANEXOS..................................................................................................................62
LISTA DE FIGURAS
FIGURA1: Ciclo de vida de Dirofilaria immitis Modificado de......................................12
FIGURA 2: Distribuição mundial de D. immitis ..........................................................13
FIGURA 3: Distribuição da dirofilariose canina na Europa..........................................14
FIGURA 4: Distribuição da dirofilariose canina nos Estados Unidos da América...15
FIGURA 5: Distribuição da dirofilariose canina no Brasil.............................................16
FIGURA 6: Mapa geográfico do Estado do Pará destacando
O Arquipélago do Marajo.............................................................................................17
FIGURA 7: Mapa geográfico do Arquipélago do Marajó, destaque para a prevalência
de dirofilariose canina de 53,4% em Salvaterra e 32,45% em SSBV........................17
FIGURA 8. Microfilária de Dirofilaria immitis método da gota espessa.................18
FIGURA 9: Imagem de microfilárias de Dirofilaria immitis no Knott Modificado.........19
FIGURA10: Placa de imunocromatografia para D. immitis.........................................21
FIGURA 11. Edema da córnea e hiperemia episcleral no e um filaridio livre
na câmara anterior do olho esquerdo.........................................................................24
FIGURA 12. Lesão tipo moeda em radiografia de pulmão..........................................25
FIGURA 13: Representação da produção de Anticorpos IgG e IgE........................28
FIGURA 14 : Mapa geogáfico da ilha do Marajó.........................................................31
FIGURA 15: Mapa da cidade de São Sebastião da Boa Vista, destacando a área
de realização do estudo.............................................................................................32
FIGURA 16: Vista aérea da cidade de São Sebastião da Boa Vista...........................32
FIGURA 17: Coleta de sangue de cães......................................................................33
FIGURA 18: Coleta de sangue de humanos...............................................................35
FIGURA 19: Gráfico da curva de calibração da IgE....................................................46
FIGURA 20: Gráfico da distribuição da IgE total.........................................................48
FIGURA 21: Gráfico da distribuição dos valores de absorbância da IgG anti –
D. immitis, dos participantes do estudo......................................................................50
FIGURA 22: Gráfico da relação entre a absorbância da IgG e da IgE total................51
RESUMO
A dirofilariose ou “doença do verme do coração” é uma antropozoonose de
caráter crônico em cães causada pelo nematódeo do gênero Dirofilaria. No humano
a infecção ocorre de forma acidental, através da picada de mosquitos dos gêneros
Culex, Aedes, Anopheles, Mansonia e Psophora. Em humanos, esta zoonose
caracteriza-se pela fixação de larvas do helminto no pulmão (dirofilariose pulmonar
humana), na região subcutânea e até mesmo na conjuntiva ocular. Na Europa esta
zoonose é causada pela espécie Dirofilaria repens, na América do Norte e no Brasil
as infecções caninas e em humanos são causadas pela espécie Dirofilaria immitis.
No Estado do Pará estudos demonstraram o caráter endêmico da dirofilariose
canina, principalmente em alguns Municípios do Arquipélago do Marajó. Este
trabalho realizou uma investigação epidemiológica no Município de São Sebastião
da Boa Vista, Arquipelago do Marajó, na comunidade as margens da estrada que
leva a Vila Cocal. Foram analisados cães através de inquérito hematológico, por
exame a fresco, método da gota espessa e pelo método de Knnot modificado. Cerca
de 38,5% dos cães estudados apresentavam microfilárias de D. immitis. A
investigação em humanos da ocorrência de dirofilariose humana teve a participação
voluntária de 61 pessoas da referida comunidade e observou-se que 100% dos
participantes mantinham contato com cães. Deste total, 8% já foram acometidos por
doença pulmonar inespecífica, e dentre os participantes que já passaram por
internação hospitalar, 12% tiveram como causa pneumonia e 19,3% a malária. A
análise laboratorial de amostras sanguíneas e de fezes dos 61 participantes mostrou
os seguintes dados: 33% forneceram fezes para pesquisa de parasitas intestinais e
70% deste grupo estavam infectados por um ou mais parasitos intestinais; 83,6%
apresentaram eosinofilia, 72,1% apresentaram taxas sérica de IgE total elevadas; na
pesquisa por ELISA da IgG específica anti-Dirofilaria immitis, 16,39% apresentaram
valores de absorbância elevados. Em nova análise sorológica, pós tratamento das
parasitoses intestinais, o padrão soro-hematológico permaneceu inalterado. Deste
modo, este estudo demonstra que além das condições ambientais propícias, os
dados de anamnese e laboratoriais sugerem fortes indícios da exposição e/ou
ocorrência de dirofilariose humana em moradores do município de São Sebastião da
Boa Vista, Arquipélago do Marajó, Estado do Pará.
Palavras Chaves: Zoonose, Dirofilaria immitis, dirofilariose humana, Arquipélago do
Marajó, epidemiologia.
ABSTRACT
The dirofilariasis or "heartworm disease" is a chronic anthropozoonosis in dogs
caused by nematodes of the genus Dirofilaria. In human infection occurs accidentally,
through the bite of mosquitoes of the genus Culex, Aedes, Anopheles, Mansonia and
Psophora. In humans, this zoonotic disease characterized by the development of
helminth larvae in the lung (human pulmonary dirofilariasis), the subcutaneous region
and even in the ocular conjunctiva. In Europe this is a zoonosis caused by the species
Dirofilaria repens in North America and Brazil and canine infections in humans are
caused by the species Dirofilaria immitis. In Pará State studies demonstrated the
endemicity of canine heartworm disease, especially in some municipalities of Marajó
Archipelago. This study was an epidemiological investigation in São Sebastião da Boa
Vista city, Marajó Archipelago, in the community of Vila Cocal. In this region, dogs
were analyzed through a survey hematological examination by the fresh, thick drop
method and the modified method Knnot. Approximately 38.5% of the dogs studied had
microfilariae of D. immitis. Research on the occurrence of human heartworm disease
had voluntary participation of 61 persons of that community, and it was observed that
100% of the participants had contact with dogs. Of this total, 8% have been affected
by nonspecific lung disease, and among participants who have experienced
hospitalization, 12% was caused by pneumonia and malaria 19.3%. Laboratory
analysis of blood and stool samples of 61 participants showed the following data: 33%
provided stool to survey of intestinal parasites and 70% of this group were infected
with one or more intestinal parasites, 83.6% had eosinophilia, 72, 1% showed high
total serum IgE rate; research by specific ELISA IgG anti-Dirofilaria immitis, showed
that 16.39% had high absorbance value. In new serological analysis, post-treatment of
intestinal parasites, the standard serum hematology remained unchanged. Thus, this
study demonstrates that in addition to the favorable environmental conditions, the
clinical history and laboratory data suggest strong evidence of exposure and / or
occurrence of heartworm disease in human residents of São Sebastião da Boa Vista,
Marajó Archipelago, Pará State.
1. INTRODUÇÃO
A dirofilariose, é uma zoonose de caráter crônico nos cães onde é chamada de
“doença do verme do coração”, causada por nematódeos do gênero Dirofilaria. No ser
humano, caracteriza-se por comprometimento do parênquima pulmonar ou nódulos
subcutâneos (Da Silva & Langoni, 2010).
Dentro do gênero Dirofilaria, as espécies Dirofilaria repens (Raillet & Henry,
1911) e Dirofilaria immitis (Leidy, 1856; Raillet & Henry, 1911) possuem grande
importância clínica na medicina veterinária bem como na medicina humana, por
serem causadoras da dirofilariose (Kartashev et al., 2011). Em países da Europa e
Ásia espécie D. repens ocorreu com frequência nas formas oculares e subcutâneas.
Nos países das Américas a espécie D. immitis está relacionada com infecção em
cães e gatos (verme do coração) e humanos nos quais a maioria dos casos relatados
são de infecção pulmonar (Klotchko et al., 2010).
1.1. MORFLOGIA E BIOLOGIA DA Dirofilaria immitis
1.1.1. Morfologia
Dirofilaria immitis apresenta-se como um helminto filiforme, longo,
esbranquiçado na região anterior do corpo está presente o orifício oral que é pequeno
e circular, apresenta acentuado dimorfismo sexual, onde os machos medem de 12 a
20 cm de comprimento, com cauda em espiral, e as fêmeas medindo de 25 a 31 cm
de comprimento, com extremidade caudal arredondada (Cicarino, 2010)
Este nematódeo teve sua morfologia redescrita por Furtado et al. (2010) a partir
de exemplares encontrados infectando cães no Arquipélago do Marajó, Estado do
Pará, Brasil onde adicionaram dados sobre a morfometria e descrições detalhadas de
estruturas como: Extremidade cefálica que apresenta-se levemente fina e
arredondada, onde está localizada a abertura oral, circular, sem lábios, cercada por
quatro pares de papilas cefálicas pequenas e dois anfídios laterais, com aberturas
voltadas para região posterior do corpo do helminto, o esôfago é dividido em regiões
muscular e glandular, apresenta deirídios que possuem uma estrutura filamentosa,
com a base mais larga que o ápice e a concavidade longitudinal, pequenas papilas
sensoriais laterais e anel nervoso. Na superfície do corpo encontram-se estrias
transversais cuticulares delicadas, e estrias cuticulares aleatórias na extremidade
cefálica. Na extremidade posterior do corpo da fêmea e do macho ocorrem fasmídios
que são papilas sensoriais.
1.1.2. Biologia
1.1.2.1 Hospedeiros
Os hospedeiros naturais e principais reservatórios de D. immitis são os cães
domésticos e silvestres, no entanto sua ocorrência já foi registrada em ampla
variedade de espécies animais, tais como gatos, castores, mustelídeos e mesmo
seres humanos, entre outros mamíferos (Brito et al., 1999; Cicarino, 2009).
Em felinos, a ocorrência da dirofilariose pode ser frequente, dependendo da
proximidade de cães com microfilárias circulantes na corrente sanguínea, e da
presença de vetores competentes para a transmissão (Branco et al., 2009; Khurana et
al., 2010).
Os hospedeiros intermediários de D. immitis são mosquitos vetores dos
gêneros Culex, Aedes, Anopheles, Mansonia e Psorophora, os quais transmitem a um
hospedeiro vertebrado larvas de D. immitis em estágio L3 no ato do repasto
sanguineo (Khurana et al., 2010).
1.1.2.2. Ciclo Biológico
O ciclo biológico da D. immitis (Fig. 1), é considerado longo, leva em média 6,5
meses pós-infecção até a geração de microfilárias no hospedeiro vertebrado, similar
ao ciclo de outros filarídeos. As larvas de primeiro estádio (L1), também chamadas
microfilárias, liberadas na circulação periférica do hospedeiro pelos helmintos adultos
em fase reprodutiva, são capturadas juntamente com as células sanguíneas durante o
repasto do vetor. A partir do tubo digestivo (intestino médio) as larvas migram para os
túbulos de Malpighi, onde sofrem duas mudas, alcançando o terceiro estádio larvar
(L3), fase infectante para o hospedeiro vertebrado, em um período médio de 14 dias.
Estas larvas L3 migram através da hemocele até a probóscide do mosquito e são
depositadas na pele de um novo hospedeiro vertebrado, juntamente com a saliva,
quando o mosquito realizar seu próximo repasto (Borges, 2001; Silva et al., 2010;
Khurana et al., 2010). As microfilárias penetram então no hospedeiro vertebrado
através da solução de continuidade provocada pela picada do mosquito fêmea,
realizando uma migração subcutânea em direção ao tórax, chegando ao ventrículo
direito do coração, onde passam do estádio larvar L3 para o estádio larvar L4 e ao fim
de 50 a 60 dias sofrem a quarta e última muda para estádio L5 ou adultos imaturos.
Passados aproximadamente dois meses da infecção do cão, os helmintos atingem
sua maturidade sexual, originando novas microfilárias que migram para a circulação
periférica, gerando a infecção pré-patente, geralmente entre 7 e 9 meses pós -
infecção (Cicarino, 2009).
FIGURA 1. Ciclo de vida de Dirofilaria immitis. Modificado de (http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/ImageLibrary/Filariasis_il.htm)
1.2. DIROFILARIOSE CANINA
A maioria dos cães afetados têm infecções patentes com microfilárias
circulantes no sangue periférico, embora os cães infectados, por vezes possam
desenvolver infecções ocultas caracterizadas pela ausência de microfilárias. A
ocorrência de microfilárias (MF +) na infecção está associada com uma resposta
imunológica de tipo Th2 predominante, enquanto que uma resposta do tipo Th1
predomina nas infecções amicrofilarêmicas (MF-), o que sugere um papel para esta
resposta na supressão da microfilária circulante (Oleaga. et al., 2009).
1.2.1. Epidemiologia da Dirofilariose Canina
1.2.1.1. Mundo
A dirofilariose canina é encontrada em todo o mundo , apresentando-se
endêmica em regiões de clima tropical, subtropical e temperado (Cicarino, 2009).
FIGURA 2 – Distribuição mundial de D. immitis . Fonte: http://www.revista.inf.br/veterinaria/ (2004).
1.2.1.2. Europa
A dirofilariose causada por D. repens é considerada endêmica nos países
situados na bacia Mediterrânea (Klotchko et al., 2010). A Itália é o país com maior
prevalência, onde uma parte significativa da população canina está infectada.
Também há registros desta zoonose na França, Espanha, Grécia e Ucrânia (Klotchko
et al., 2010; Silva et al., 2010; Miliaras et al., 2010). Na Rússia estudos também
mostram alta incidência de dirofilariose canina (Kartashev et al., 2011).
FIGURA 3: Distribuição da dirofilariose canina na Europa. Fonte: www.scalibor.pt/leishmaniose/dirofilariose.asp.
1.2.1.3. América do Norte
A dirofilariose canina tem sido diagnosticada na maioria dos 50 Estados dos
Estados Unidos da América (EUA), com prevalência variável entre os Estados e por
região geográfica (0,3%, 0,5% e 1,2% no Colorado, Washington e Montana,
respectivamente) para até 40% na Flórida e Carolina do Sul (Figura 4) . A dirofilariose
é considerada regionalmente endêmica, em 48 Estados contíguos, no Havaí, Porto
Rico, Ilhas Virgens dos EUA e Guam. Não foram registrados casos de dirofilariose
nos Estados de Nevada e no Alasca, apesar de o Alasca possuir vetores e algumas
Europa
regiões de seu território com condições climáticas favoráveis por um período do ano.
(Klotchko et al., 2010; Silva et al., 2010; American Heartworm Society, 2011).
FIGURA 4. Distribuição da dirofilariose canina nos Estados Unidos da América. Modificado de: http://www.heartwormsociety.org/download/Incidence-Map-
2010.pdf .
1.2.1.4. Brasil
De acordo com Almosny (2002) no Brasil foi registrada a ocorrência de
dirofilariose canina em todas as cinco regiões; com maior ocorrência nas regiões
Sudeste onde no Estado de São Paulo foram registrados de 0,9 a 45% de Cães
infectados, e o Estado de Rio de Janeiro com 21,3% de cães infectados, e a Região
Norte onde o estado do Pará apresentou 43% de cães infectados, nas demais regiões
existem registros de dirofilariose canina isolados em Estados como: Rio Grande do
Sul com 1,1% e Santa Catarina com 12%, Mato Grosso com 9,62%, Alagoas com
12,5%, Paraíba com 12,4% e Pernambuco com 2,3%. A Região Norte passou a ter
destaque pelos altos níveis de infecção detectados em cães da Ilha do Marajó no
Estado do Pará por Furtado et al (2009) conforme demonstrado na Figura 5 .
FIGURA 5: Distribuição da dirofilariose canina no Brasil. Modificado pelo autor de: www. brasil-turismo.com.
1.2.1.5. Estado do Pará
Os municípios de Salvaterra e São Sebastião da Boa Vista no Arquipélago
de Marajó, (Figuras 6 e 7) apresentam-se como áreas endêmicas para a dirofilariose
canina, condição esta confirmada através de inquérito hemoscópico realizado
utilizando-se os métodos diagnóstico de Knott Modificado e distensões sanguíneas,
além de diagnósticos moleculares, onde revelou-se alta prevalência de cães
infectados tanto em São Sebastião da Boa Vista (32,45 %), quanto em Salvaterra
(53,4%) (Furtado et al., 2009, Carmo, 2011).
FIGURA 6: Mapa geográfico do Estado do Pará destacando o Arquipélago do Marajó. Modificado de: www.guiageo.com.
FIGURA 7: Mapa geográfico do Arquipélago do Marajó, destaque para a prevalência de dirofilariose canina de 53,4% em Salvaterra e 32,45% em SSBV. Modificado de: www.guiageo.com.
Arquipélago do marajó
1.2.2. Diagnóstico da Dirofilariose Canina
1.2.2.1. Métodos Parasitológicos
a) Pesquisa em Lâmina Com Gota Espessa
Método de diagnóstico parasitológico mais utilizado em cães, por ser
economicamente mais favorável, de rápida e fácil obtenção, permitindo a identificação
de larvas circulantes do parasito (Figura 8). Esta técnica consiste na visualização de
larvas do parasito, utilizando-se uma gota de sangue venoso do animal, sobre lamina
corada pelo panótico modificado.
Estas larvas são analisadas de acordo com o padrão de coloração, presença
ou não de bainha, localização e quantidade de núcleos caudais, etc. conforme
metodologia descrita no Guia de vigilância epidemiológica e eliminação da filariose
linfática do Ministério da Saúde do Brasil (2009).
A técnica apresenta boa sensibilidade quando o cão parasitado tem filaremia
superior a 10 mf/mL de sangue (Lima, 2007; Furtado et al., 2009).
FIGURA 8. Microfilária de Dirofilaria immitis método da gota espessa. Fonte: Laboratório de Biologia Celular e Helmintologia
do ICB- UFPA (2006).
b) Médodo de Knott Modificado
Técnica descrita por Knott em 1939 utiliza a centrifugação de sangue para o
diagnóstico filarial. Ainda é muito utilizada uma vez que possibilita a concentração de
microfilárias em maior quantidade de amostras sanguíneas, possibilitando a
identificação da presença de microfilárias quando o cão apresenta baixa filaremia,
Esta técnica consiste no aumento da sensibilidade diagnóstica laboratorial de
microfilárias, pela concentração sanguínea através da centrifugação, utilizando
formalina a 2% que fixa e conserva as estruturas da microfilária além de possibilitar
que o exame microscópico laboratorial seja realizado vários dias após a coleta de
material realizada em campo. Esta metodologia permite diferenciar D. immitis e de
outras espécies de filarias (Kittleson, 1999).
FIGURA 9: Imagem de microfilárias de Dirofilaria immitis no Knott Modificado. Fonte: instruction.cvhs.okstate.edu
1.2.2.2. Métodos Sorológicos
a) Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Neste método diagnóstico as proteínas são imobilizadas em uma superfície
sólida de poliestireno e a reação imune é revelada pela formação de produtos
coloridos resultantes de reação enzima-substrato, na presença de um componente
doador de elétrons, denominado cromógeno (Teva et al.; 2010).
Metodologia usada tanto quantitativamente quanto qualitativa, para medir a
ligação antígeno anticorpo, onde utiliza antígenos somáticos de Dirofilaria immitis
adulto (DISA), para identificar a presença de anticorpos no hospedeiro infectado,
deste modo é feita dosagem da IgG para identificar indivíduos infectados por D.
immitis. Nesta metodologia são detectados anticorpos circulantes no soro, plasma e
sangue fresco de cães e de gatos (Teva et al., 2010).
b) Método Imunocromatográfico
O método imunocromatográfico baseia-se na reação específica antígeno-
anticorpo e se constitui por uma fase sólida (membrana porosa), onde estão
imobilizados elementos de captura, e por uma fase móvel, onde estão suspensos o
conjugado (que pode ser a proteína A, ligada ao ouro coloidal ou outros conjugados
disponíveis) e a molécula alvo da amostra. A fase móvel migra sobre a fase sólida por
efeito de capilaridade, conduzindo o complexo formado entre a molécula alvo e o
conjugado, que, por sua vez, será retido na linha de captura da fase sólida, formando
um complexo macromolecular colorido visível ao olho humano. Caso a amostra não
contenha a molécula alvo, esta linha de reação não se formará. Uma segunda linha
de reação, denominada linha de controle, se forma pela captura do conjugado livre,
que permite a confirmação da migração da fase móvel (Teva et al.; 2010).
Estes testes são realizados em cães e gatos, mostram sensibilidade e
especificidade superior aos métodos parasitológicos, são práticos para rotinas
laboratoriais ou em clínicas ( Klotchko et. al., 2010).
FIGURA 10: Placa de imunocromatografia para D. immitis, (a) positivo (b) negativo. Fonte: Batista et al. (2008).
c) Método de Western Blotting
Western blotting é um importante método para a imunodetecção de proteínas
pós-electroforese, principalmente proteínas que estão em pequenas quantidades.
Desde o início do uso deste protocolo para a transferência de proteínas a partir de um
gel de electroforese a uma membrana, a detecção de proteína evoluiu muito. Esta
metodologia consiste na transferência da proteína a partir de um gel para uma
membrana, com base nos princípios de difusão simples (Kurien & Scofield, 2006).
Esta técnica apresenta grande especificidade, pois permite detectção de anticorpos
frente as proteínas (antígenos) de D. Immitis no soro do animal infectado (Barreto et
al.,2008).
d) Método da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
A utilização da técnica molecular Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é
utilizada para detecção do DNA genômico do parasito isolado em cães com clínica
para dirofilariose é bem-sucedida para o diagnóstico da infecção por D immitis e
D.repens por ser um método específico de diagnóstico (Klotchko et al., 2010). Neste
método, um segmento específico do DNA do helminto é amplificado, com a utilização
de iniciadores específicos obtidos a partir de uma porção do gene de ARN
ribossômico (ADNr 12S). O ensaio de PCR multiplex é uma ferramenta adicional para
estudos epidemiológicos e de avaliação de doença de rotina em áreas co-endêmicas
para as espécies Dirofilaria immitis e Dirofilaria repens (Gioia et al.; 2010).
1.3. INFECÇÃO HUMANA POR Dirofilaria immitis
Seres humanos aparecem no ciclo de D. immitis como hospedeiros acidentais e
não compatíveis, pois nestes, as larvas do parasito morrem antes de alcançar a fase
adulta (Silva et al., 2010). Logo após penetrar o tecido subcutâneo, as larvas
alcançam a corrente sanguínea, chegando ao ventrículo direito, onde morrem, são
levadas através da corrente sanguínea aos vasos pulmonares, onde embolizam,
causando um pequeno infarto pulmonar, com posterior evolução para nódulo solitário
claramente visualizado em exames radiológicos. Esta forma de infecção é conhecida
como dirofilariose pulmonar humana (DPH), sendo a confirmação diagnóstica
realizada pela excisão cirúrgica do nódulo (Cavallazzi et al., 2002; Klotchko et al.,
2010).
Embora a DPH seja uma zoonose benigna, que desencadeia pouco prejuízo ao
estado clínico geral do seu portador, com sua infecção cursando sem microfilaremia,
frequentemente leva a um diagnóstico incorreto de tumor neoplásico, pela imagem
radiológica dos nódulos pulmonares. (Jelinek et al., 1996; Echeverri et al., 1999;
Klotchko et al., 2010).
A ocorrência da zoonose por D. immitis está diretamente relacionada ao
tamanho da população canina, da prevalência da infecção em cães, da densidade dos
vetores e da freqüência de exposição do homem às picadas dos vetores (Da Silva &
Langoni, 2010).
1.3.1. Epidemiologia da Dirofilariose Humana
A ocorrência de casos humanos de dirofilariose e o número de países onde há
registros desta zoonose aumentou na última década. Dentre os fatores responsáveis
por este aumento, tem-se a maior conscientização de profissionais da área médica e
a ampliação do conhecimento sobre a doença. A maioria dos casos de dirofilariose
humana foram diagnosticados em áreas onde a dirofilariose canina é endêmica e
estão concentrados em regiões específicas em volta do mundo, principalmente onde
há especialistas nesta zoonose (Klotchko et al., 2010).
Um estudo retrospectivo realizado por Kartashev et al.(2011), na Russia
levantou a ocorrência da zoonose no período de 2002 a 2009, mostrou a ocorrência
de 131 casos clínicos, a maior parte destes diagnosticados (129), estavam
parasitados por D. repens e somente dois apresentaram nódulos pulmonares
sugestivos de infecção por D. immitis.
Há ainda relatos de casos humanos no Japão, Índia, Sri Lanka, Austrália e em
países do continente Africano (Klotchko et al., 2010; Kartashev et al., 2011).
Os Estados Unidos é o país com o maior registro de infecção humana por D.
immitis causando DPH ( Klotchko et al., 2010).
No Brasil casos humanos foram descritos nos Estados de São Paulo, Santa
Catarina, Rio de Janeiro, Mato Grosso e Minas Gerais. (Neto et al., 1993; Cavallazzi
et al., 2002, Silva et al., 2010).
No Pará, Otranto et al. (2011) relataram a ocorrência de dirofilariose intra-
ocular em um adolescente oriundo do Município de Cametá, no qual um exame
oftalmológico mostrou a ocorrência de um nematódeo na câmara anterior do olho
esquerdo, identificado como Dirofilaria immitis após extração cirúrgica e análise
taxonômica e molecular.
FIGURA 11. Edema da córnea e hiperemia episcleral no e um filaridio livre na câmara anterior do olho esquerdo de um menino de 16 anos de idade do Estado do Pará. Fonte: Otranto et al.; (2011).
A infecção humana por Dirofilaria SP em área endêmica para dirofilariose
canina é independente da posse do cão, visto que a residência ou viagem para estas
áreas são fatores determinantes para a ocorrência da infecção (Klotchko et al., 2010).
Outros fatores relevantes para a infecção por D. immitis em humanos diz
respeito às características ecológicas de seus vetores, a densidade dos mosquitos e
sua época de reprodução, combinados com o clima quente, as atividades humanas
ao ar livre e a ocorrência de grande quantidade de cães microfilarêmicos (Borges,
2001; CavallazzI et al., 2002).
1.3.2. Manifestações Clínicas da Dirofilariose Humana
A DPH é uma doença benigna, autolimitante, transmitida por mosquitos.
Manifesta-se na maioria dos casos como nódulos pulmonares periféricos, geralmente
assintomáticos, e quando manifestam algum sintoma estes se caracterizam pela
presença de inchaço transitório ou nódulos inflamatórios que podem ou não ser
dolorosos (Echeverri et al., 1996).
Em até 90% dos casos os nódulos pulmonares possuem forma de moeda,
circunscritos, periféricos, únicos ou em pequeno número, resultantes da presença de
larvas mortas do parasito nos vasos pulmonares (Klotchko et al., 2010). As lesões
decorrentes são pequenas, 30 mm em média, geralmente sub-pleurais, localizadas
em sua maioria do lado direito, devido ao tropismo pelo lobo inferior do pulmão direito.
As lesões múltiplas, podem estar distribuídas em um mesmo lobo ou em lobos
diferentes (Figura 12 ) (Klotchko et al., 2010).
FIGURA 12. Lesão tipo moeda em radiografia de pulmão Fonte: Klotchko et al., (2010).
Em humanos a doença pode permanecer assintomática ou na forma de tosse,
hemoptise, dor na garganta, sibilo, calafrio, febre, dor torácica, dispnéia dependente
de esforço, sudorese, fadiga, síncope, emagrecimento e eosinofilia, com derrame
pleural em alguns casos (Da Silva & Langoni, 2010). Khurana et al. (2011), relatam
que em média são necessários 5 meses após a infecção para que ocorra o achado
radiológico do nódulo formado por larvas mortas de D. immitis e também que a
ocorrência de derrame pleural aparece em até 13% dos pacientes com DPH.
O significado clínico mais importante desta zoonose consiste no diagnóstico
radiológico errôneo de tumor primário ou metástico com a grave consequência de
submeter o paciente a toracotomia com biópsia pulmonar ou ressecção do pulmão
para obter o diagnóstico correto da doença (Echeverri et al., 1996; Khurana et al,.
2010; Klotchko et al., 2010).
A presença de eosinofilia em exame hematológico pode indicar diagnóstico de
DPH em pacientes com nódulo observado na radiografia, embora esta ocorrência não
seja fator específico para o diagnóstico preciso, devido ao fato que a eosinofilia
também ocorre em outras helmintíases (Miyoshi et al., 2006).
Pacientes com DPH ou outras infecções profundas podem ter complicações
após ressecção cirúrgica das lesões, se as lesões forem confundidas com um tumor
maligno e tratadas de forma agressiva (quimioterapia e radioterapia). Nos casos
relatados na literatura, há predominância de ocorrência de complicações em
pacientes do sexo masculino em relação ao feminino, da ordem de 2:1, concentrando-
se no grupo de idade que varia de 40 a 59 anos (Cavallazzi et al., 2002; Klotchko et
al., 2010).
A dirofilariose humana também pode ocorrer como nódulos subcutâneos, ou
forma aberrante cutânea, ou ainda na conjuntiva. Assim, apesar da forma mais
comumente descrita da dirofilariose humana ser a pulmonar, o acometimento de
outras áreas tem sido relatado ao longo do tempo, encontrando-se descrições de
casos com a manifestação aguda da dirofilariose até mesmo de infecção na região do
crânio, produzindo convulsões epileptiformes e/ou meningite eosinofílica (Theis, 2005;
Klotchko et al., 2010).
A dirofilarose intra-ocular humana tem como principais sintomas: redução de
acuidade visual, aumento da pressão intra-ocular, edema da córnea , e hiperemia
episclerais (Otranto et al., 2011),.
1.3.3. Patogenia da Dirofilariose
Faz-se importante destacar a relação existente entre a Wolbachia, gênero de
bactérias que infectam artrópodes, e os nematódeos filarídeos, de acordo com Barreto
et al (2008). Esta relação de mutualismo obrigatório, representa um novo paradigma
para a compreensão da patogenia, tratamento e diagnóstico das infecções por
filarídeos (Foster et al., 2008).
A eliminação dos endossimbiontes Wolbachia, pelo tratamento do hospedeiro
vertebrado com antibióticos, induz perturbação da embriogênese dos ovos dos
helmintos filarídeos, com conseqüente interrupção da formação de microfilárias,
interrompendo o crescimento e o desenvolvimento dos filarídeos (Simón et al., 2007).
Apesar de a Wolbachia não posuir lipopolissacarídios, é possivel que outras
moléculas, tais como as proteínas de superfície WSP, hsp 60 ou DNA, sejam capazes
de estimular resposta inflamatória. Por esta razão, estas bactérias se tornaram alvo
de tratamento com antibióticos (Simón et al., 2007).
1.3.4. Aspectos Imunológicos da Dirofilariose Human a
Infecções por helmintos parasitas são caracterizados pela ocorrencia de
eosinofilia e níveis elevados de antígeno-inespecíficos, a imunoglobulina E (IgE),
como respostas de proteção contra a infecção (Imai et. al., 2001).
A IgE está presente em baixa concentração no soro humano, sendo
encontrada na superfície da membrana de basófilos e mastócitos devido a elevada
afinidade desta Imunoglobulina pelos receptores Fc&R destas células, possuindo um
papel importante na resposta imune ativa contra helmintos, atraindo eosinófilos para
seu local de desenvolvimento (Imai et. al., 2001).
A Dirofilaria immitis, como todos os helmintos induz forte resposta imune em
seu hospedeiro, por possuir como característica a cronicidade da infecção, sendo esta
resposta imune predominantemente polarizada para linfócitos T, fenótipo Th2 e
também por células T reguladoras (T. regs) Figura13 (Wilson & Maizels, 2004).
Nas infecções assintomáticas por D. immitis em humanos, verifica-se indução
da produção da IgE, produção esta estimulada principalmente pela presença da
galectina (lectinas de animais) e uma aldolase que são liberadas por este helminto
quando da infecção. Este mecanismo ocorre quando a larva é imobilizada e destruída,
formando os nódulos pulmonares, momento em que liberam grande quantidade de
proteínas de superfície, que estimula uma resposta do tipo Th1, regulando a resposta
Th2, Figura13 (Barreto et al., 2008; Sant' Ana et al., 2011).
Galectinas e aldolases de D. immitis possivelmente estão envolvidas no
surgimento de reações alérgicas em indivíduos residentes em áreas endêmicas para
o parasito. A confirmação desta suposição é feita através de diagnóstico da IgE
produzida contra a galectina e aldolase em dirofilariose humana. Considerando-se
também a possibilidade da produção de IgE ser estimulada por outros helmintos,
atenta-se ao fato de que estes anticorpos aparecem sempre em indivíduos infectados
por D. immitis sem nódulos pulmonares (Barreto et al., 2008).
FIGURA 13: Representação esquemática da produção de Anticorpos IgG e IgE pelo estimulo de proteínas de superfície da Dirofilaria immitis liberadas no momento em que a larva morta é imobilizada e fixada no pulmão humano. Fonte: Miranda, H.B. (2013).
1.3.5. Diagnóstico das Dirofilarioses em Humanos
O diagnóstico clínico não é eficaz, devido seu caráter assintomático levando à
ausência de sinais ou sintomas específicos, fazendo-se necessário sua confirmação
através de exames laboratoriais. Estes podem ser feitos por técnicas parasitológicas,
imunológicas, moleculares e por imagem. Para as dirofilarioses humanas, a técnica
da gota espessa apresenta baixa sensibilidade, em função da ausência de larvas
viáveis no sangue periférico.
Klotchko et al. (2010) dizem que estudos sorológicos com utilização do método
de ELISA podem produzir resultados positivos em 75% dos pacientes humanos com
DPH, demonstrando portanto que esta ferramenta é útil em levantamentos
epidemiológicos de ocorrência de dirofilariose humana em áreas endêmicas para
dirofilariose canina, no entanto o método não deve ser utilizado na população em
geral por não possuir especificidade comprovada.
O método sorológico descrito por Barreto et al. (2008) que utiliza antígenos
somáticos de Dirofilaria immitis adulto (DISA) para diagnóstico de dirofilariose
humana, onde são pesquisados anticorpos IgG circulantes no soro humano para
identificar indivíduos infectados por D. immitis demonstrou ser sensível para o
diagnóstico das dirofilarioses humanas.
Estudos recentes desenvolvidos por Furtado et al., (2009) Carmo (2011)
descrevem a ocorrência endêmica de dirofilariose canina por Dirofilaria immitis em
alguns municípios do Arquipélago do Marajó. Nesta região, existem condições
geográficas associadas às condições de saneamento básico, índice pluviométrico, do
desmatamento, da alta concentração das populações de mosquitos e o aumento
desordenado da população de cães, gatos e outros animais errantes, que permitem a
manutenção e disseminação de microfilárias entre os animais e o ser humano,
favorecendo a ocorrência de surtos, endemias e epidemias (Da Silva & Langoni,
2010; Klotchko et al., 2010).
Portanto, como todas essas condições que podem levar a infecção humana por
D. immitis estão presentes no Município de São Sebastião da Boa Vista no
arquipélago do Marajó, Pará, Brasil, foi idealizada e desenvolvida a presente
pesquisa, na qual investigou-se a hipótese da ocorrência de dirofilariose humana em
pessoas que co-habitam com cães diagnosticados positivos.
1.5. OBJETIVOS
1.5.1. Objetivo Geral
Investigar a ocorrência de dirofilariose humana em pessoas que coabitam com
cães infectados por Dirofilaria immitis no Município de São Sebastião da Boa Vista na
Ilha do Marajó, Estado do Pará, Brasil.
1.5.2. Objetivos Específicos
- verificar a prevalência de dirofilariose canina através de inquérito
hematológico em cães domiciliados em São Sebastião da Boa Vista no Arquipélago
do Marajó.
- Realizar estudo epidemiológico para verificar a possível ocorrência de
dirofilariose humana em pessoas que coabitam com cães infectados por D. immitis no
Município de São Sebastião da Boa Vista no Arquipélago do Marajó;
- Realizar exame parasitológico das fezes das pessoas;
- Realizar exame hematológico (hemograma) dos participantes do estudo;
- Realizar dosagem sorológica de IgE total na população alvo deste estudo;
- Realizar teste sorológico para detecção de IgG especifico para D. immitis;
- Correlacionar os dados resultantes dos estudos epidemiológicos e
laboratoriais.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. ÁREA DO ESTUDO
O estudo foi realizado no Município de São Sebastião da Boa Vista que fica
localizado ao Sul do Arquipélago do Marajó, a uma latitude 01º43'03" sul e a uma
longitude 49º32'27" oeste, estando a uma altitude de 2 metros limitando-se ao Norte
com Breves e Anajás; ao Sul com o Rio Pará; a Leste com Muaná; e a Oeste com
Curralinho ( Figura 13). Dista 136 Km, em linha reta, de Belém (figura 13), na
comunidade localizada as margens da Avenida Boa Vista – Cocal (Figura 14),
localidade onde está localizado o depósito de lixo domestico da cidade e havia
registros da ocorrência de dirofilariose canina em estudos prévios realizados por
Furtado et al., (2009), e também considerando fatores Geográficos (figura 15),
ambientais e climáticos que favorecem a ocorrência de vetores em potencial e o
hábito da população da criação de cães bem como a ocorrência de cães errantes na
comunidade.
FIGURA 14 : Mapa geogáfico da ilha do Marajó. Fonte: http://www.infoescola.com.
FIGURA 15: Mapa da cidade de São Sebastião da Boa Vista, destacando a área de
realização do estudo. Fonte: Grupo de Estudos do Arquipélago do Marajó.
FIGURA 16: Vista aérea da cidade de São Sebastião da Boa Vista. Fonte :http://jetrofagundes.blogspot.com.br. 2.2. ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO RETROSPECTIVO
Este estudo foi realizado com a aplicação de questionário aos participantes do
estudo, onde foram levantados aspectos epidemiológicos da população, como
exposição a animal reservatório de D. immitis, idade, sexo, ocorrência de doença
pulmonar inespecífica (DPI), sintomatologia, e numero de internações hospitalares e
seus motivos, os questionários foram aplicados após leitura e explicação do TCLE
(ANEXO 1).
2.3. OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS BIOLÓGICAS
2.3.1. Coleta de Amostras de Sangue de Cães:
O procedimento foi realizado por punção venosa radial (Figura 17 ) e o sangue
coletado foi armazenado em tubos contendo EDTA, para pesquisa direta a fresco de
microfilarias, a confecção de gota espessa em lâmina para microscopia e refigerado e
conduzido ao Laboratório de Biologia Celular e Helmintologia do ICB – UFPA para
realização do método de Knott Modificado.
FIGURA 17: Coleta de sangue de cães. Fonte pessoal, Miranda, H.B., (2013).
2.3.2. Inquérito Hematológico no Cão:
• Exame a fresco: logo após a coleta das amostras sanguineas de cães uma
gota da amostra foi depositada entre lâmina e laminula e observado em
microscópio de luz, com objetiva de 10X;
• Exame da gota espessa: duas gotas de sangue foi colocado sobre lamina que
após secar foi acondicionada em cassete adequado ao transporte e enviadas
ao LBCH-ICB-UFPA, onde as laminas foram coradas pelo Panótico Rápido e a
leitura se procedeu em microcópio de luz com objetiva de 100X;
• Método de Knott Modificado: a 01 mL da amostra foi acrescido formalina a 2%,
submetido a centrifugação e preparado o esfregaço a partir do concentrado,
que foi corado pelo panótico rápido observado em microscópio de luz com
objetiva de 10X.
2.3.3. Coleta de Amostras de Sangue de Humanos
O Procedimento foi realizado através de punção venosa utilizando o sistema de
coleta Vacutainer (Figura 18 ), ou com seringa de 10 mL, dos indivíduos residentes
em casas com cães diagnosticados com Dirofilaria immitis e residentes na vizinhança,
dos sexos Masculino e Feminino, sem critérios quanto a idade do participante. As
amostras foram depositadas em tubos contendo EDTA, 3 mL de sangue para
realização de hemograma e em tubos secos contendo gel separador com capacidade
para 5 mL, para realização das sorologias. As amostras foram mantidas sob
refrigeração até serem processadas e analisadas no Laboratório de Análises Clínicas
do Hospital Universitário João de Barros Barreto (HUJBB), da UFPA.
FIGURA 18: Coleta de sangue de humanos. Fonte pessoal Miranda, H.B.,(2013).
2.3.4. Recepção de Amostras de fezes:
As amostras de fezes coletadas em frascos coletores próprios, previamente
identificados e entregues aos participantes foram recebidas e mantidas sob
refrigeração em caixa térmica com gelo reciclável e encaminhadas ao Laboratório de
Análises Clínicas do Hospital Universitário João de Barros Barreto (HUJBB), da UFPA
para serem processadas e analisadas.
2.3.5. Dosagem Laboratorial De IgG Específico Anti- D. Immitis :
Utilizando a metodologia adaptada de protocolo elaborado por Simon et al., (2001) e
modificado por Barreto et al. (2008), utilizando como base um Kit de reagente para
detecção de IgG de chagas por método de ELISA da (EBRAM). Esta metodologia
compreende três etapas:
Etapa 1. Obtenção do Antígeno Somático de Dirofilaria immitis Adulta (ASDIA):
Os antígenos somáticos foram obtidos a partir de helmintos adultos obtidos o
da Necropsia de cães coinfectados por Leishimania e Dirofilaria immitis,
eutanasiados no Município de São Sebastião da Boa Vista no Arquipélago do Marajó,
em 2009. O helminto adulto foi macerado em solução salina 0,9% na proporção de
1:3 m/v; até formar suspensão homogênea a qual foi submetida a banho ultrassônico
em três ciclos de 1 minuto cada, a 70 KHz, seguido por adição de 10 mL de tampão
PBS pH 7.2 (para neutralizar anticorpos irregulares). Posteriormente a suspensão foi
centrifugada a 5.000 RPM durante 30 minutos, o sobrenadante foi filtrado em Papel
de filtro, e a ocorrência de proteínas foi confirmada pela medida da concentração de
proteínas totais em autoanalisador bioquímico ARCHITECT (ABOTT). Todos
procedimentos foram realizados a uma temperatura de 4º C, por fim o ASDIA foi
alicotado em tubos criogênicos de 2mL e armazenado a temperatura de - 10ºC até o
uso.
Etapa 2. Sensibilização da Microplaca de ELISA:
O ASDIA foi diluído a 4,0 mg/dl com solução de cloreto de sódio a 0,9%. Os
poços da placa de poliestireno a serem utilizados foram revestidos com 100 µL da
solução diluída do ASDIA. Que permaneceu em repouso over night em temperatura
ambiente. No dia seguinte os poços foram lavados em lavadora automática de
microplacas, 5 vezes com 200µL de solução de lavagem diluída (Solução do Kit
Chagas ELISA EBRAM). Após a lavagem, a placa foi invertida sobre papel absorvente
para retirar excesso de solução de lavagem.
Etapa 3 : Dosagem do IgG específico para D. immitis.
As amostras de soro foram homogeneizadas por inversão em agitador de tubos
antes do uso, procedimento seguido pela adição de 190 µL de solução diluidora de
amostra a cada poço da placa a ser utilizado no teste, exceto no B (branco) onde
adicionado 200 µL de água destilada. Um total de 10 µL da amostra foi adicionado a
cada cavidade previamente marcada, inclusive no (C +) e (C-) (controle positivo e
controle negativo) perfazendo uma diluição 1/200. A placa foi vedada com fita adesiva
e agitada delicadamente e incubada por 30 minutos a 37 ° C. Em seguida os poços
foram lavados em lavadora de microplacas 5 vezes com 200µL da solução de
lavagem diluída e a placa foi secada em papel absorvente, acrescentado 100µL do
conjugado em cada poço, com exceção do B, fechada com fita adesiva. A placa foi
agitada delicadamente e incubada por 30 minutos a 37 ° C, após este período foi
retirada a vedação e lavados os poços 5 vezes com 200µL da solução de lavagem
diluída. A placa foi secada em papel absorvente, adicionada de 100µL do substrato
em todos os poços, fechados novamente com fita adesiva, agitada suavemente e
incubada a por 30 minutos a temperatura ambiente ao abrigo da luz.
Passado esta etapa foi retirado a vedação dos poços, adicionado 100µL de
solução de parada em todos os poços e por fim realizada leitura das densidades
ópticas (DO) a 450 nm usando leitora de microplacas marca THERMO PLATE, a
leitura foi realizada dentro de no máximo 10 minutos ao fim da dosagem.
2.3.6. Dosagem Laboratorial de IgE Total por ELISA:
Passo inicial para a dosagem de IgE total dos participantes foi a construção da
curva de calibração do IgE (Tabela 6), que foi construída matematicamente a partir
dos resultados das medidas das absorbância dos padrões de concentrações 0, 10,
50, 100, 400 e 800 aos quais foi aplicada uma expressão matemática:
EX: Abs. de cada ponto = abs do padrão de Conc.. 10 – abs. do padrão conc. 0
Nº de intervalos
Ex: abs. de cada ponto do intervalo = 0,123 – 0,000 = 0,024 5 Nesta metodologia foi utilizado um kit para dosagem de IgE total, de onde
foram separadas a quantidade de cavidades necessárias no suporte de tiras. Foi
adicionado 20 µL de calibradores, amostras e controles nas cavidades previamente
marcadas, seguido da adição de 100 µL de solução tampão em cada cavidade,
homogeneizado por 10 segundos e incubado por 30 minutos a temperatura ambiente
(18-25 ºC).
Em seguida toda a mistura foi aspirada e as cavidades foram lavadas 5 vezes
com água destilada em lavadora de microplacas; no passo seguinte as cavidades
foram invertidas em papel absorvente para remover todas as gotas de água.
Realizado este processo, foi acrescentado 150 µL do reagente conjugado enzimático
em cada cavidade e homogeneizado por 10 segundos, levado a incubação por 30
minutos a temperatura ambiente.
Novamente, toda a solução foi aspirada e as cavidades em uso lavadas
cavidades 5 vezes com água destilada, devidamente removido o excesso de água em
papel absorvente, 100 µL do reagente TMB foi adicionado em cada cavidade. A placa
foi homogeneizada por 5 segundos e levada à incubação por 20 minutos em
temperatura ambiente, no abrigo da luz; passado o tempo de incubação foi adicionado
100 µL de solução de parada em cada cavidade, homogeneizado por 30 segundos.
observou-se uma mudança da cor de azul para amarelo completamente; a placa foi
lida em leitora de microplacas a uma densidade óptica de 450 nm, sendo obedecido o
tempo máximo 15 minutos entre a ultima etapa da preparação da placa e a leitura.
2.3.7. Hemograma Completo
O exame hemograma completo foi realizado do grupo de indivíduos
participantes do estudo, afim de estabelecer um perfil hematológico de indivíduos
portadores de dirofilariose humana, principalmente a ocorrência de eosinofilia. As
amostras de sangue periférico coletadas em EDTA foram processadas em um
contador automático Cell Dyn 3700, o perfil celular foi confirmado por microscopia de
luz, com leitura da distensão sanguínea corada pelo Giemsa, e o resultado final foi
liberado com a utilização do software Soft Lab de acordo com o protocolo de Failace
& Pranke, (2004).
2.3.8. Exame Parasitológico das Fezes
O exame parasitológico das fezes foi realizado pela metodologia descrita por
Hoffman, Pons & Janer ( 1934), onde uma porção da amostra de fezes de cada
participante foi solubilizada em água destilada, filtrada em gaze e sedimentada por 12
horas em cálice de sedimentação, o estudo se completou através da leitura do
sedimento que foi corado pelo lugol entre lamina e lamínula e a leitura realizada em
microscópio óptico com objetivas de 10X e 40X, para análise da ocorrência de
parasitoses intestinais.
2.4. ASPECTOS ÉTICOS
Para realização do estudo, o projeto foi submetido ao comitê de ética em
pesquisa do Hospital Universitário João de Barros Barreto e do Ministério da Saúde
através da Plataforma Brasil, protocolo Nº 01077412.3.0000.0017 obtendo o aceite de
ambos (ANEXO 1).
Na área estudada foi efetuada entrega para leitura e assinatura do “Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido” (TCLE) aos moradores que, após leitura,
assinaram e devolveram (APÊNDICE 1). Também foi aplicado aos participantes
questionário sobre dados sócio-demográficos e epidemiológicos, no momento da
coleta das amostras biológicas(APÊNDICE 2).
Os resultados dos exames dos cães foram informados aos proprietários e a
Secretaria de Saúde do Município de SSBV.
Os resultados dos exames hematológicos e parasitológicos foram entregues
aos indivíduos que aceitaram participar da pesquisa. Estes indivíduos foram
encaminhados ao serviço de saúde.
2.5. ANÁLISE DOS DADOS
Após os estudos epidemiológicos e laboratoriais os dados obtidos foram
tabulados e realizado o teste t para verificar a significância dos resultados obtidos
para aferição da possível ocorrência de infecção humana por D. immitis, no grupo de
pessoas estudado, bem como, verificada a eficácia das metodologias diagnosticas
utilizadas no estudo .
3. RESULTADOS
3.1. INQUÉRITO HEMATOLÓGICO EM CÃES
Foram investigados cães da comunidade localizada as margens da Avenida
Boa vista - Cocal, onde o índice de cães positivos foi alto e as proximidades do
deposito de lixo domestico da cidade e também a ausência de infra – estrutura de
saneamento básico propiciam a proliferação de vetores.
• Analise Microscópica a Fresco: foi realizada coleta de amostras de sangue
periférico de 13 cães domiciliados. No ato da coleta as amostras foram
analisadas utilizando microscopia de luz, onde foi observado a ocorrência de
microfilárias e amostra sanguínea de cinco (05) cães, o correspondendo a
positividade de 38,5% dos indivíduos analisados (Tabela 1 ).
• Análise Microscópica da Gota Espessa: as lâminas preparadas logo após a
coleta foram levadas ao laboratório de Biologia celular e Helmintologia da
UFPA, coradas pelo Panótico Rápido e analisados em microscopia de luz, com
objetiva de 100X, confirmando-se o resultado da metodologia a fresco,
resultando portanto em cinco (05) cães apresentando microfilaremia o que
perfaz um percentual de 38,5% (Tabela 1 ).
• Método de Knnot Modificado: Análise da concentração do sangue total dos
13 cães domiciliados também confirmou o total de cinco (05) microfilarêmicos
repetindo-se o percentual de 38,5% dos animais pesquisados, positivos,
conforme demonstrado na Tabela 1 a seguir:
TABELA1 : Resultados do inquérito hematológico de cão domicil iados, na comunidade da estrada que interliga SSBV a Vila Coc al na Ilha do Marajó, Estado do Pará.
Numero do cão Participante
Exame a fresco
Gota espessa
Knnot Modificado
Microfilaremia (MF/ml)
1 + + + 13
2 - - - 0
3 - - - 0
4 + + + 10
5 - - - 0
6 - - - 0
7 - - - 0
8 - - - 0
9 - - - 0
10 + + + 12
11 - - - 0
12 + + + 13
13 + + + 10
3.2. QUANTIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS DO ASDIA.
A verificação da concentração de proteínas (antígenos) foi realizada através da
dosagem bioquímica de microproteínas em analisador automático Modelo
ARCHITECT C8000 da marca ABOTT, onde o ASDIA apresentou a concentração
proteica de 68 mg/dl.
3.3. ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO E LABORATORIAL EM HUMANOS.
3.3.1. Estudo Epidemiológico:
Dentre as 61 pessoas participantes do estudo, 14 indivíduos, o que perfaz um
percentual 23% estão na faixa etária entre 10 e 20 anos de idade, 51% são do sexo
masculino, 100% estavam expostos a presença de cães.
Dos indivíduos participantes, apenas três (03) 5%, possuía contato com gatos,
cinco (05) ou 8% relataram já ter sido acometidos por alguma doença pulmonar
inespecífica (DPI); enquanto que vinte e sete (31) o que corresponde a 51%,
relataram já ter passado por internação hospitalar, sendo que destes, apenas quatro
(04), 12,9% deste grupo, relatou como motivo de internação o diagnóstico de
pneumonia. Também foi relatado por (05) 19,3% das pessoas terem passado por
internação hospitalar, devido a infecção por Malaria.
Os dados compilados dos questionários estão dispostos nas Tabelas 2 e 3 , a
seguir:
TABELA 2: Características epidemiológicas dos 61 pa rticipantes do presente estudo, moradores do Município de SSBV-PA.
Idade em Anos 0- 10 10-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 > 70 total
N° de participantes 9 14 12 10 5 4 3 4 61
Masculino 4 8 8 4 3 1 0 3 31
Feminino 5 6 4 6 2 3 3 1 30
Exposição a cão 9 14 12 10 5 4 3 4 61
Exposição a gato 0 2 0 1 0 0 0 0 3
DPI Relatada 0 1 0 3 0 0 0 1 5
Internações 4 6 4 7 3 4 1 2 27
TABELA 3: Doenças relatadas pelos participantes do estudo, mo radores do Município de SSBV e que resultaram em internação ho spitalar .
Doença que motivou a internação
Numero de internação por doença
Percentual das internações (%)
Pneumonia 4 12,9
Diabetes 3 9,8
Hipertensão 2 6,5
Doenças gastrointestinais 10 32,3
Malaria 6 19,3
Bronquite 1 3,1
Outras Doenças 5 16,1
Total de internações 31 100
3.3.2. Estudo Laboratorial
3.3.2.1. Exame Parasitológico das Fezes
Do total dos 61 participantes, apenas 20 pessoas forneceram amostras de
fezes, o que correspondeu a 32,79% do total de participantes. No entanto, destes
participantes, 14 (70%) apresentaram alguma parasitose intestinal. Dentre os
participantes parasitados, 12 (85,7%), estavam parasitados por helmintos e 4
(28,6%), por protozoários, observou-se também que 3 (21,4%), participantes
apresentavam co-infecção por helmintos e protozoários e 7 participantes ( 50%)
apresentava 2 ou mais parasitas, caracterizando multiparasitismo (Tabela 4 ).
3.3.2.2. Contagem de Eosinófilos
A contagem de eosinófilos realizada no hemograma completo mostrou que
dos 20 participantes com exame parasitológico das fezes, 16 (80 %) apresentaram
eosinofilia. Destes, 11 ( 68,75 %) apresentaram contagem de eosinófilos superior 10%
do total de leucócitos; destacamos entre estes o participante numero 17 que
apresentou eosinofilia da ordem de 44% do total de leucócitos conforme Tabela 4 , a
seguir:
TABELA 4: Infecção por parasitas intestinais e con tagem de eosinófilos em 20 participantes do estudo, moradores do Município de SSBV-PA.
Número do Participante
Parasito Encontrado Contagem de
Eosinófilos
2 Ascaris lumbricoides e Ancilostomídeos 03
5 Ausencia 06
7 Trichiuris trichiura e Eenterobius vermicularis 15
12 Ausência 12
17 Ascaris lumbricoides . 44
26 Trichiuris trichiura 14
27 Ancilostomídeos 13
29 Ausência 02
33 Trichiuris trichiura, Ascaris lumbricoides e
Ancilostomídeos 07
34 Ascaris lumbricóides 30
35 Ascaris lumbricóides e Ancilostomídeos 07
36 Ausencia 11
41 Ausência 26
42 Trichiuris trichiura ,Iodameba butschili e Endilimax nana 05
44 Trichiuris trichiura 04
46
Trichiuris trichiura , Ascaris lumbricoides, Eenterobius
vermicularis ,Entamoeba histolytica/díspar e
Iodamoeba butschili
08
51 Ausência 07
53 Entamoeba histolytica/díspar 11
56 Trichiuris trichiura e Giardia lamblia 21
60 Endolimax nana, Ascaris lumbricoides e
Ancilostomídeos 11
3.3.2.3 Dosagem da IgE Total.
Construção da Curva de Calibração da IgE : a partir das absorbâncias dos padrões
e utilizando uma expressão matemática foi construída a curva padrão que possibilitou
determinar a concentração da IgE Total dos indivíduos participantes da pesquisa,
onde a abs. dos testes dos participantes foi comparada com abs. da curva e desta
forma obtida a conc. de IgE total do Participante, Tabela 5.
TABELA: 5 :Curva de calibração da IgE total
Absorbância dos
Padrões
Concentração da
IgE Total (UI/mL)
Absorbância dos
Padrões
Concentração da
Ige Total (UI/mL)
0,000 0 1,114 100
0,024 2 1,281 120
0,049 4 1,448 140
0,074 6 1,615 160
0,098 8 1,782 180
0,123 10 1,949 200
0,189 15 2,116 220
0,255 20 2,283 240
0,321 25 2,45 260
0,387 30 2,617 280
0,453 35 2,784 300
0,519 40 2,953 320
0,585 45 3,119 340
0,652 50 3,286 360
0,698 55 3,453 380
0,744 60 3,626 400
0,79 65 3,79 450
0,836 70 3,954 500
0,882 75 4,118 550
0,928 80 4,282 600
0,974 85 4,446 650
1,020 90 4,610 700
1,066 95 4,774 750
4,940 800
FIGURA 19: Gráfico da curva de calibração da IgE, em um diagrama de dispersão Linear , construído no software Bioestat 5.0.
Dos 61 participantes, 44 ( 72,1 %) apresentaram a taxa da IgE sérica elevada,
considerando que para a faixa etária dos participantes o valor normal é de até 150
UI/mL, dentre os participantes com taxa de IgE elevado destacamos 11 ( 25%)
onde a taxa da imunoglobulina está superior ao dobro do limite Maximo aceitável,
Tabela 6 e no gráfico da Figura 20.
TABELA 6 Resultados da IgE total dos 61 participantes do est udo, moradores do Município de SSBV-PA.
NUMERO DO PARTICIPANTE IDADE IgE TOTAL EM
UI/mL NUMERO DO
PARTICIPANTE IDADE IgE TOTAL EM UI/mL
1 55 260 31 50 220
2 18 170 32 16 321
3 44 225 33 33 280
4 36 250 34 31 340
5 39 290 35 23 280
6 60 310 36 15 180
7 78 55 37 11 75
8 60 275 38 16 280
9 50 285 39 20 230
10 42 190 40 22 310
11 12 210 41 22 283
12 35 215 42 72 40
13 28 270 43 15 170
14 16 255 44 30 93
15 19 125 45 05 340
16 17 280 46 45 290
17 44 320 47 45 350
18 68 159 48 54 215
19 23 85 49 58 291
20 24 225 50 72 250
21 20 165 51 33 115
22 22 315 52 35 300
23 23 130 53 05 67
24 38 345 54 13 290
25 01 90 55 77 68
26 03 310 56 02 157
27 39 370 57 04 285
28 09 270 58 67 165
29 32 225 59 71 178
30 12 85 60 28 215
61 23 170
FIGURA 20: Gráfico da distribuição da IgE total dentre os participantes do estudo,
temos que 53 dos participantes apresentam valores da IgE acima de 160 UI/mL, valor considerado normal para adultos.
3.3.2.4. Pesquisa de Anticorpos IgG Anti - Dirofilaria immitis,
Nesta pesquisa foi utilizada a metodologia de ELISA com o ASDIA como
antígeno. Foi utilizado amostra (soro) dos 61 participantes de idades variadas e de
ambos os sexos. Como não tínhamos um controle positivo, consideramos que todos
os valores de absorbância maiores que a média das absorbâncias mais dois desvios
padrão da dosagem de IgG de pessoas de áreas não endêmicas para dirofilariose
canina, (controle negativo) o que nos levou a considerar que os participantes com
valores de absorbância superior a 0,900 apresentam a IgG anti-Dirofilaria immitis
circulando no sangue. Considerando estes valores, observou-se que 12 dos
participantes (19,67%) apresentaram valor de absorbância da IgG anti - D. immitis
elevado e que 58,3% deste grupo de participantes têm idade superior a 40 anos
conforme se observa na Tabela 8 a seguir e no gráfico da Figura 21 .
TABELA 7: Valores de absorbância na dosagem do IgG Anti - Dirofilaria immitis dos participantes do estudo, moradores do Município de SSBV-PA.
Nº do Participante
Idade Anos
Abs. da IgG Anti- D. Immitis
Nº do Participante
Idade Anos
Abs. Do IgG Anti - D. Immitis
1 55 1.311 32 16 0.713
2 18 0.644 33 33 0.481
3 44 0.461 34 31 0.691
4 36 0.724 35 23 0.935
5 39 0.952 36 15 0.716
6 60 1.091 37 11 0.248
7 78 0.952 38 16 0.942
8 60 0.468 39 20 0.342
9 50 0.543 40 22 0.545
10 42 0.774 41 22 0.385
11 12 0.512 42 72 0.210
12 35 0.993 43 15 0.315
13 28 0.836 44 30 0.339
14 16 0.635 45 05 0.888
15 19 0.844 46 45 0.862
16 17 0.774 47 45 1.862
17 44 1.056 48 54 1.032
18 68 0.303 49 58 0.421
19 23 0.661 50 72 0.924
20 24 0.488 51 33 0.409
21 20 0.713 52 35 0.761
22 22 0.679 53 05 0.267
23 23 0.415 54 13 0.182
24 38 0.678 55 77 0.317
25 01 0.350 56 02 0.227
26 03 0.679 57 04 0.463
27 39 0.680 58 67 0.518
28 09 0.909 59 71 0.448
29 32 0.514 60 28 0.650
30 12 0.357 61 23 0.552
31 50 0.780
FIGURA 21: Gráfico da distribuição dos valores de absorbância da IgG Anti – D. immitis, dos participantes do estudo.
A hipótese de que 12 participantes do estudo estejam sensibilizados por D.
immitis é significativa, visto que quando executado o teste t, dos resultados da
dosagem das absorbâncias da IgG temos que p< 0,0001, o que indica uma provável
produção de IgG anti- D. immitis quando da infecção humana por D. immitis.
3.3.2.5. Análise dos Marcadores de infecção por D. Immitis, após Tratamento das
Helmintíases Intestinais.
A fim de afastar a possibilidade de as helmintíases intestinais estarem
interferindo na dosagem dos marcadores IgE Total, no número de eosinófilos e
também produzir um falso positivo para o IgG especifico para D. immitis, os
participantes foram submetidos a tratamento das parasitoses intestinais. E 45 dias
após, foi realizada nova coleta de amostra sanguínea de seis (06) dos onze (12)
participantes que apresentaram a IgG e os demais marcadores elevados na primeira
coleta. Após segunda rodada de análises das amostras verificou-se que as taxas não
reduziram, os níveis de IgE Total, bem como abs. do IgG especifico e a eosinofilia
permaneceram elevados, conforme demonstrado na Tabela 9 , a seguir.
TABELA 8 : Valores de absorbância da IgG Anti- D. immitis , IgE e Eosinófilos após tratamento das parasitoses intestinais de 06 p articipantes do estudo. Numero do Participante
Abs do IgG Anti – D.immitis
Resultado da IgE em Ui/Ml
Contagem de Eosinófilos
1 1.230 390 25
6 1.095 180 27
28 0.937 320 18
35 1.090 232 07
47 1.660 305 09
48 0.975 236 15
Quando testada a hipótese da relação entre a provável infecção por D. immitis,
observado quando do aumento da absorbância da IgG-Anti D. immitis e o aumento da
IgE total, observou-se que há uma relação significativa entre o aumento da IgG
específica e da IgE Total, visto que quando executado o teste t, temos que p<
0,0001, o que indica que a produção de IgE e IgG anti- D. immitis possuem
correlação, como observado no gráfico da Figura 22 a seguir.
FIGURA 22: Gráfico da relação entre a absorbância da IgG e da IgE total dos 06 participantes que participaram do estudo após tratamento das helmintíases intestinais.
3.3.2.6. Relação Entre os Resultados das Análises Laboratoriais e o Contato com
Cães Infectados.
Dos 12 participantes com que apresentaram valores de absorbância da IgG
elevado, 11 (100%) convivem com cão microfilarêmico, todos apresentam
eosinofilia e em 10 participantes a taxa de IgE total está alterada, como demonstrado
na Tabela 10 a seguir:
TABELA 9 : Relação entre o contato com cães portadores de micr ofiláris de D. immitis e o resultado das dosagens dos marcadores biológic os de dirofilariose humana.
Numero do Participante
Número do cão participante
Abs. do IgG Específico
Resultado de IgE em UI/Ml
Contagem de Eosinófilos
1 1 1,230 390 25
5 1 0,952 290 06
28 1 0,937 320 18
12 1 0,993 215 12
6 4 1,095 180 27
7 4 0,952 55 15
17 4 1,056 320 44
35 4 1,090 232 07
38 12 0,942 280 11
47 13 1.660 305 09
48 13 0.975 236 15
4. DISCUSSÃO
O estudo corrobora com os estudos de Furtado et al. (2010) que diz que o
município de São Sebastião da Boa Vista no Arquipélago do Marajó, Estado do Pará,
Brasil, é área endêmica para dirofilariose canina, com prevalência de 32,45 % de cães
infectados, no inquérito hematológico de cães neste trabalho, temos positividade de
38,5% dos indivíduos estudados, nas três metodologias aplicadas, com identificação
de microfilárias de D. immitis .
As às condições ambientais possibilitam a existência e proliferação do vetor,
possibilitando a ocorrência de dirofilariose, e também o hábito de criação de animais
domésticos, principalmente cães que são os principais reservatórios de D. immitis
(Borges, 2001; Cavallazzi et al., 2002; Da Silva & Langoni, 2010). Condições que
ocorrem no município de São Sebastião da Boa Vista, na Ilha do Marajó, Estado do
Pará, onde o número de cães domiciliados é grande, com domicílios apresentando
até 25 cães; e também a ocorrência de várias espécies de mosquitos transmissores
de microfilarias o que comprovamos a população relata ser acometido por outras
doenças transmitidas por mosquitos.
Os relatos dos trabalhos de Miyoshi et al., (2006), Barreto et al. (2008) e de
Sant’ Ana et al. (2011) de que a dirofilariose humana induz o aumento nas taxas
fisiológicas de eosinófilos, e da IgE Total, nos levam a sugerir que no grupo amostral
de São Sebastião da Boa Vista, participantes deste estudo apresentam indícios de
estarem sensibilizados por D. immitis uma vez que em nossas análises laboratoriais
estes marcadores, estão superior as taxas fisiológicas normais na maioria dos
participantes.
A acentuada ocorrência de parasitoses intestinais entre os participantes deste
estudo (70%), nos, conduz a ter cautela quanto a afirmar que a eosinofilia maciça e o
aumento das taxas da IgE total estejam diretamente relacionadas a dirofilariose
humana, uma vez que os estudos de Imai et al. (2001), diz que o aumento das taxas
destes elementos pode estar relacionado à ocorrência de parasitoses intestinais.
Mas não desprezamos estes elementos como marcadores da ocorrência de
dirofilariose humana, pois quando consideramos que para que ocorra aumento da IgE
bem como eosinofilia é necessário que os helmintos parasitos estejam fazendo ciclo
pulmonar, e por outro lado deve-se considerar também que as infecções
assintomáticas por D. immitis induzem a produção de galectinas e estas induzem
produção da IgE, quando da imobilização da larva no pulmão, de acordo com o
descrito por Barreto et al. (2008).
Baseado nos estudos de Barreto et al,. (2008), quando relacionamos os
resultados da IgE total, da contagem de eosinófilos, com os resultados das
absorbâncias da IgG total anti-Dirofilaria immitis, consideramos que 11 (18%) dos
participantes da pesquisa apresentam indícios de sensibilização por antígenos de D.
immitis.
Somado ao fato dos indivíduos que apresentam indícios estar sensibilizados
por antígenos de D. immitis nas análises laboratoriais, está a condição de residirem
ou conviverem diretamente com cães infectados, esta que segundo Da Silva &
Langoni, 2010, é uma condição para que ocorra casos de dirofilariose humana, além
da dificuldade ao acesso ao sistema de saúde pública para a realização de
diagnóstico radiológico, para um resultado preciso da presença de D. immitis, nos
conduzem a hipótese de que 11participantes tem indícios de serem portadores de
dirofilariose humana ou estar sensibilizados pelo helminto.
Os participantes que realizaram nova coleta após tratamento das parasitoses
intestinais mantinham mesmo perfil com eosinofilia, dosagem da IgE total elevado e
as absorbâncias na dosagem da IgG específica para D. immitis, este achado
laboratorial mostra que provavelmente a infecção por parasitas intestinais não altera
alguns marcadores biológicos de dirofilariose humana, principalmente a pesquisa da
IgG específica com o uso do ASDIA. Estes resultados corroboram com os estudos de
Barreto et al., (2008), que investigou a ocorrência de dirofilariose humana utilizando
amostras de soro coletadas em locais considerados endêmicos para dirofilariose
canina na Espanha (Cidade de Tenerife e Ilhas Canárias) em seu estudo também
utilizou a metodologia de ELISA descrita por Simon et al (2001), onde Utilizou o
ASDIA como antígeno. Como o nosso estudo utilizou a mesma metodologia com
algumas adaptações, quando combinado diagnóstico laboratorial e a situação
epidemiológica do local estudado, além dos fatores ambientais e culturais, temos
indícios da ocorrência de dirofilariose humana nos 06 participantes deste estudo,
participaram da recoleta.
O contato com cão parasitado é fator determinante para a ocorrência de
dirofilariose humana, visto 100% dos indivíduos com indícios de apresentar esta
zoonose estão habitualmente em contato com cão microfilarêmico, da mesma forma
que Da Silva & Langoni,( 2010) descreveram.
Bem como nos estudos de Barreto et al. (2008) que em sua metodologia
diagnóstica utilizou o ASDIA como antígeno, nossa metodologia sorológica para
investigação de ocorrência de dirofilariose humana possui sensibilidade, visto que os
resultados foram reproduzidos nas repetições realizadas.
5. CONCLUSÕES
- Há indícios de que indivíduos que coabitam com cães portadores de
microfilárias de Dirofilaria immitis no Município de São Sebastião da Boa Vista, Ilha do
Marajó, Estado do Pará, sejam portadores de dirofilariose humana.
- As parasitoses intestinais não interferem na pesquisa de IgG anti- Dirofilaria
immitis com o uso de ASDIA.
- O aumento da IgE tem relação direta com o aumento da IgG anti – D. immitis
quando esta é dosada utilizando o ASDIA como antígeno.
- A metodologia analítica ELISA utilizando o ASDIA apresenta sensibilidade ao
diagnóstico de IgG Anti- Dirofilaria immitis em humanos.
- A metodologia diagnóstica por ELISA usando o ASDIA pode ser aprimorada a
fim de ter utilização no diagnostico de triagem de dirofilarioses humanas.
- A ocorrência de cães positivos sugere endemicidade da dirofilariose canina
em São Sebastião da Boa Vista.
- Os donos dos cães portadores de microfilárias de Dirofilaria immitis
apresentam padrões hematológicos e imunológicos que sugerem a infecção por D.
immitis.
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
A presente dissertação de mestrado intitulada investigação da Ocorrência de
Dirofilariose Humana em Moradores do Município de são Sebastião da Boa Vista, No
Arquipélago do Marajó, Pará, Brasil. Constitui-se em um primeiro passo para a
verificação da ocorrência desta zoonose no Estado do Pará, onde através de uma
abordagem epidemiológica e laboratorial se buscou identificar os fatores que
possibilitam a ocorrência da zoonose, e ao mesmo tempo elaborar uma metodologia
diagnostica mais palpável para a realidade apresentada, e também pela escassez de
literatura sobre metodologias diagnósticas validadas não tanto invasivas ou danosas
aos participantes do estudo.
Muitas duvidas surgiram, mas foram sendo transformadas ao longo do estudo
graças a colaboração do grupo de pesquisadores que colaborou na realização da
pesquisa, e do meu anseio e profª. Jeannie em tornar real o estudo desta zoonose em
humanos que convivem com cães microfilarêmicos no Arquipélago do Marajó no
estado do Pará.
Os resultados obtidos foram importantes, mas tanto quanto estes resultados foi
importante o despertar da certeza que é possível aprofundar os estudos a fim de em
um futuro próximo podermos afirmar através do uso de metodologias diagnósticas
seguras acessíveis, menos invasivas ou agressivas que esta zoonose está presente
na população do Arquipélago do Marajó.
Percebi também que a prevenção das zoonoses no Arquipélago do Marajó é
questão que vai além de diagnosticar e convencer pessoas do risco a que estão
expostas, mas que passa pela necessidade urgente de elaboração e aplicação de
políticas Públicas de Saúde voltadas a prevenção.
7. REFERÊNCIAS
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8. ANEXOS
ANEXO 1: TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO -TCLE
(Resolução N˚196, do Conselho Nacional de Saúde de 10/10/96)
INFORMAÇÕES SOBRE A PESQUISA:
TÍTULO DO PROJETO: INVESTIGAÇÃO DA OCORRÊNCIA DE DI ROFILARIOSE
HUMANA EM MORADORES DO MUNICÍPIO DE SÃO SEBASTIÃO DA BOA
VISTA, ILHA DO MARAJÓ, PARÁ, BRASIL.
Este é um estudo Epidemiológico Retrospectivo e Experimental, que tem o
objetivo de verificar a INVESTIGAÇÃO DA OCORRÊNCIA DE DIROFILARIOSE
HUMANA EM MORADORES DO MUNICÍPIO DE SÃO SEBASTIÃO DA BOA
VISTA, ILHA DO MARAJÓ, PARÁ, BRASIL , ( São Sebastião da Boa Vista), visto
estudos prévios realizados neste municípios por pesquisadores do Laboratório de
Biologia Celular e Helmintologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade
Federal do Pará terem verificado a ocorrência de dirofilariose canina em níveis
endêmicos (45% em média) além da existência na área de várias espécies de
mosquitos vetores da Dirofilaria, fatores estes determinantes para a ocorrência de
dirofilariose humana, principalmente o estágio pulmonar, “essa informações estão
sendo fornecidas para sua participação voluntária neste estudo que visa investigar a
ocorrência de dirofilariose humana em três municípios da Ilha do Marajó- Estado do
Pará, Brasil.
Serão realizados análise epidemiológica através da aplicação de questionário,
exames laboratoriais de Hemograma, a fim de verificar ocorrência de alterações
celulares, como a eosinofilia, dosagem de IgE sérico, a fim de verificar aumento desta
Imunoglobulina, por fixação de microfilarias mortas no pulmão, dosagem de IgG
Sérico especifico para Dirofilaria immitis com a finalidade de verificar a possível
formação de anticorpos pelo “hospedeiro”, Exame parasitológico das fezes, a fim de
verificar possível ocorrência de eosinofilia e aumento de IgE por uma infecção por
helmintos intestinais.
Para a realização do estudo serão aplicados os seguintes procedimentos:
� Aplicação de questionário intitulado Instrumento de Coleta de Dados as
pessoas que co-habitam com cães infectados na área do estudo.
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO-TCLE
� Coleta de amostras de sangue por punção da veia do antebraço; recepção
de amostras de fezes.
Estes procedimentos supra citados podem causar desconfortos ao
participante, devido a possível constrangimento ao responder o instrumento de coleta
de dados, além de apresentar os riscos inerentes ao procedimento de coleta de
amostras sanguineas por punção venosa, como: Processo doloroso, momentâneo ,
formação de pequenos hematomas localizados além do constrangimento natural em
fornecer amostras de fezes para análise laboratorial.
Como beneficio imediato aos participantes estão a realização de exames de
rotina de Hemograma e parasitológico das fezes, que terão os resultados fornecidos
aos mesmos.
Em qualquer etapa do estudo você terá acesso aos profissionais
responsáveis pela pesquisa para esclarecimento de eventuais dúvidas. O principal
investigador é o Farmacêutico Bioquímico Héliomar Borralho Miranda que pode
ser encontrado no Hospital Universitário João de Barros Barreto (Laboratório) situado
a rua dos Mundurucus, Nº 4487, Bairro do Guamá Belém-PA, telefone: (91) 3201-
6689, Celular (91) 9963-3760 E-mail: [email protected] , se você tiver alguma
consideração ou dúvida sobre a ética da pesquisa, entre em contato com o Comitê de
Ética em Pesquisa (CEP) – Rua dos Mundurucus, 4487 FONE (91) 3201-6754- E-
mail: [email protected].
É garantida a liberdade da retirada de consentimento a qualquer momento e
deixar de participar do estudo, sem qualquer prejuízo à sua pessoa.
As informações obtidas serão analisadas em conjunto com outros
participantes, não sendo divulgada a identificação de nenhum participante.
É garantido ao participante o conhecimento dos resultados atualizados
parciais da pesquisa.
Não há despesas pessoais para o participante em qualquer fase do estudo,
incluindo os exames. Também não há compensação financeira relacionada à sua
participação. Se existir qualquer despesa adicional, ela será absorvida pelo
orçamento da pesquisa.
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO-TCLE
Em caso de dano pessoal, diretamente causado pelos procedimentos
propostos neste estudo (nexo causal comprovado), o participante o participante tem
direito a tratamento médico custeado pelos responsáveis por este estudo, bem como
às indenizações legalmente estabelecidas.
É compromisso do pesquisador de utilizar os dados e o material coletado
somente para esta pesquisa.
Acredito ter sido suficientemente informado a respeito das informações que li
ou que foram lidas para mim, descrevendo o estudo “INVESTIGAÇÃO DA
OCORRÊNCIA DE DIROFILARIOSE HUMANA EM MORADORES DO MUNICÍPIO
DE SÃO SEBASTIÃO DA BOA VISTA, ILHA DO MARAJÓ, PAR Á, BRASIL”.
Eu discuti com o Dr. Héliomar Borralho Miranda, sobre minha decisão em
participar nesse estudo. Ficaram claros para mim quais são os propósitos do estudo,
os procedimentos a serem realizados, seus desconfortos e riscos, as garantias de
confidencialidade e de esclarecimentos permanentes. Ficou claro também que minha
participação é isenta de despesas e que tenho garantia do acesso a tratamento
hospitalar se necessário. Concordo voluntariamente em participar deste estudo e
poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento, antes ou durante o mesmo,
sem penalidades ou prejuízo ou perda de qualquer beneficio que eu possa ter
adquirido, ou no meu atendimento neste serviço.
________________________________________ Belem, ______/_______/______ Assinatura do Sujeito/ representante responsável ________________________________________ Belem______/_______/_____ Assinatura da testemunha (quando sujeito menor de 18 anos, analfabeto, semi- analfabeto ou portador de necessidades auditiva ou visual) _________________________________________ Belem, _____/_______/______ Assinatura do sujeito que colheu o TCLE
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO-TCLE
Declaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e
Esclarecido deste paciente ou representante legal para participação neste estudo.
_______________________________________________________
ASSINATURA DO PESQUISADOR RESPONSÁVEL
Nome: Héliomar Borralho Mir anda
End: Rua Terceira Nº 320 conj. Da COHAB Gleba II, Marambaia Belém-PA
Fone: (91) 3277-2494 Celular (91) 996 3-3760
E-mail: [email protected]
Reg. Conselho: CRF/PA nº 1364
Belém, _________/________/ _________
ANEXO 2: INSTRUMENTO DE COLETA DE DADOS
1 - Identificação
1.1 Iniciais do Nome
1.2 Data de nascimento ___/____/______
2 – Dados sócio-demográficos
2.1 Idade (anos)
2.2 Gênero ( ) M ( ) F
2.3 Raça/cor ( ) Negra ( ) Parda ( ) Amarela ( ) Indígena ( ) Branca
2.4 Escolaridade ( ) Analfabeto ( ) 1˚ grau incompleto ( ) 1˚ grau completo ( ) 2˚ grau ( ) Superior
2.5 Ocupação
2.6 Município
3 – Dados epidemiológicos
3.1 Exposição ( ) Cão ( ) Gato ( ) Outros
3.2 Diagnóstico de DPI ______/_______/_______
3.3 DPI Relatada ( ) Pneumonia ( ) Bronquite ( ) TB pulmonar
( ) CA de pulmão
3.4 Sintomatologia relatada:
3.5 N˚ de internações hospitalares
Observações:
