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JOHNATT ALLAN ROCHA DE OLIVEIRA
INVESTIGAÇÃO DAS ETAPAS PARA O PROCESSO DE PRODUÇÃO DE
ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO A PARTIR DA BIOMASSA DO C AROÇO DE
AÇAÍ ( EUTERPE OLERACEA)
Campinas, 2014
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA
JOHNATT ALLAN ROCHA DE OLIVEIRA
INVESTIGAÇÃO DAS ETAPAS PARA O PROCESSO DE
PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO A PARTIR DA
BIOMASSA DO CAROÇO DE AÇAÍ ( EUTERPE OLERACEA)
Tese de Doutorado apresentada à Faculdade
de Engenharia Química da Universidade
Estadual de Campinas, como requisito para
obtenção do título de Doutor em Engenharia
Química
Orientador: Prof. Dr. Rubens Maciel Filho
Este exemplar corresponde à versão final da Tese de Doutorado defendida por Johnatt
Allan Rocha de Oliveira sob a orientação do Prof. Dr. Rubens Maciel Filho
Campinas, 2014
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA
DEPARTAMENTO DE DESENVOLVIMENTO DE PROCESSOS E PRODUTOS
TESE DE DOUTORADO
Investigação das etapas para o processo de produção de etanol de segunda geração a partir da biomassa do caroço de açaí (euterpe oleracea)
Autor: Johnatt Allan Rocha de Oliveira
Orientador: Prof.Dr. Rubens Maciel Filho
A Banca Examinadora composta pelos membros abaixo aprovou esta Tese:
Campinas, 09 de dezembro de 2014.
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ABSTRACT
The use of lignocellulosic wastes to ethanol production has become a focus of research in several parts of the world. Each region of the world focused in a specific waste from your local industry. However the Brazil is a country of immense agro-industrial production and with different residues that can be explored within each region one of its regions. Such as açaí seeds in northern of Brazil. A central composite experimental design rotational 23 for evaluation of pretreatment with H2SO4 diluted of açaí seeds was carried outj and study conditions were : concentration of H2SO4 (0.5 - 1.5% w/v), solids loading (5-15% w/v) and time (30-90 min). Then delignification of pretreated seeds açaí was evaluated through an experimental design 22 under the following conditions: 1% NaOH (w/v), solids loading (10-40% w/v), temperature (50-100 °C) and time 60 minutes. Both materials were hydrolysed enzymatically (enzyme load of 15FPU/g seed and 25CBU/g of seed) chemically and characterized via HPLC (high performance liquid chromatography). The best conditions achieved for the pretreatment and delignification were used to evaluate the effect of loading solids (5-15% w/v) and agitation (100-200 rpm) on the enzymatic hydrolysis (in reactor) through an experimental design 32. The optimum conditions for pre-treatment dilute sulfuric acid was 1% acid, 10% solids at 60°C. While the optimum conditions for delignification sequential was 25% solids at 75°C. For the enzymatic hydrolysis, the solids loading of 3% allowed for conversion the highest values (78.97%). However the highest values of g glucose (g/L) were obtained for 10 and 15% solids in the reactor 200rpm (best condition of agitation). The fermentation of the hydrolyzate from the material pretreated with dilute sulfuric acid and sequentially deslignificated was one which produced the highest yield of ethanol (21,65g/L). It was concluded that the steps of pretreatment and delignification of seeds of acai allowed the release of good levels of sugars and subsequent ethanol production.
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RESUMO
O aproveitamento de resíduos lignocelulósicos para a produção de etanol combustível tem se tornado um foco de pesquisas em diversas partes do mundo. Cada região do mundo focou em um resíduo de sua indústria local o que é típico da industria de biocombustíveis. Entretanto o Brasil é um país de imensa produção agroindustrial e com diferentes resíduos que podem ser explorados para cada região, como é o caso do caroço de açaí na região norte do Brasil. Dentro deste contexto o objetivo desse trabalho é propor e investigar as etapas de processos para a obtenção de etanol a partir do caroço de açaí (Euterpe oleracea). Para tanto foi realizado um planejamento experimental central composto rotacional 23 para a avaliação do pré-tratamento do caroço de açaí com H2SO4 diluído, e as condições do estudo foram: concentração de H2SO4 (0,5 - 1,5% m/v), carga de sólidos (5-15% m/v) e o tempo (30-90 min). Em seguida a deslignificação do caroço de açaí pré-tratado foi avaliada através de um planejamento experimental do tipo 22 nas seguintes condições: 1% de NaOH (m/v), carga de sólidos (10-40% (m/v), temperatura (50-100 °C) e tempo de 60 minutos. Ambos os materiais foram hidrolisados enzimaticamente (carga enzimática de 15FPU/g de caroço e 25CBU/g de caroço) e caracterizados quimicamente via HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência). As melhores condições obtidas para o pré-tratamento e deslignificação foram utilizadas para avaliar o efeito da carga de sólidos (5-15%) e agitação (100-200 rpm) na hidrólise enzimática (em reator) através de um planejamento experimental 32. A fermentação dos hidrolisados obtidos foi realizada e os hidrolisados e fermentados foram caracterizados via HPLC. As condições consideradas ótimas para o pré-tratamento com H2SO4 diluído foi de 1% de ácido, 10% de sólidos durante 60°C, enquanto que a melhor condição para a deslignificação sequencial foi de 25% de sólidos a 75°C. Para a hidrólise enzimática, a carga de sólidos de 3% foi a que permitiu maiores valores de conversão (78,97%). Entretanto, os maiores valores de glicose (g/L) foram obtidos para 10 e 15% de sólidos em reator a 200rpm (melhor condição de agitação). A fermentação do hidrolisado obtido a partir do material pré-tratado com H2SO4 diluído e sequencialmente deslignificado foi aquela que produziu o maior índice de etanol (21,65 g/L). Foi possível concluir que as etapas de pré-tratamento e deslignificação do caroço de açaí permitiram a liberação de índices aceitáveis de açúcares e posterior produção de etanol.
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SUMÁRIO CAPÍTULO 1
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ............................................................................................................ 1 1.1 OBJETIVOS ................................................................................................................................................. 3 1.2 OBJETIVO GERAL ..................................................................................................................................... 3 1.3 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ....................................................................................................................... 3
CAPÍTULO 2
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ....................................................................................................................... 6 2.1 AÇAÍ ............................................................................................................................................................ 6 2.2 BIOMASSAS ............................................................................................................................................... 8 2.3 PAREDE CELULAR E COMPOSIÇÃO DOS MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS ........................... 12 2.3.1 Celulose ................................................................................................................................................... 14 2.3.2 Hemicelulose ........................................................................................................................................... 18 2.3.3 Lignina .................................................................................................................................................... 21 2.3.4 Substâncias pécticas ................................................................................................................................ 24 2.3.5 Extrativos................................................................................................................................................. 26 2.3.6 Outros constituintes ................................................................................................................................. 27 2.4 PRÉ-TRATAMENTOS .............................................................................................................................. 27 2.4.2 Pré-tratamento com ácidos diluídos ........................................................................................................ 32 2.5 DESLIGNIFICAÇÃO ALCALINA COM NaOH ..................................................................................... 38 2.6 HIDRÓLISES ............................................................................................................................................. 40 2.6.1 Hidrólise ácida ......................................................................................................................................... 40 2.6.2 Hidrólise enzimática ou sacarificação ..................................................................................................... 42 2.7 FERMENTAÇÃO ...................................................................................................................................... 46
CAPÍTULO 3
3. METODOLOGIA EXPERIMENTAL ......................................................................................................... 51 3.1 REAGENTES ............................................................................................................................................. 51 3.3 MATÉRIA-PRIMA .................................................................................................................................... 52 3.3.1 Preparação da matéria-prima ................................................................................................................... 53 3.4 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DO CAROÇO DE AÇAÍ ...................................................... 55 3.4.1 Determinação do teor de umidade ........................................................................................................... 55 3.4.1.1 Em estufa .............................................................................................................................................. 56 3.4.1.2 Em infravermelho (usado para controle e verificação) ......................................................................... 56 3.4.2 Teor de extrativos totais .......................................................................................................................... 57 3.4.3 Determinação dos componentes lignocelulósicos do caroço de açaí ....................................................... 57 3.4.3.1 Hidrólise ácida para caracterização química do caroço de açaí ............................................................ 57 3.4.3.2 Determinação do teor de lignina ........................................................................................................... 58 3.4.3.3 Determinação do teor de Cinzas ........................................................................................................... 60 3.4.3.5 Determinação o teor de proteínas ......................................................................................................... 65 3.4.4 Técnicas espectroscópicas e de imagem aplicadas para a caracterização do caroço de açaí. .................. 66 3.4.4.1 Análise dos materiais lignocelulósicos por microscopia eletrônica de varredura (MEV) .................... 66 3.4.4.2 Espectroscopia de difração de Raios-X (DRX) .................................................................................... 67 3.4.4.3 Infravermelho com Transformada de Fourier (FTRI). ......................................................................... 67 3.5 PRÉ-TRATAMENTO COM ÁCIDO SULFÚRICO DILUÍDO ................................................................ 68 3.5.1 Planejamento experimental e fator de severidade aplicado para o estudo do pré-tratamento com ácido sulfúrico diluído ............................................................................................................................................... 70
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3.6 DESLIGNIFICAÇÃO COM HIDRÓXIDO DE SÓDIO (NAOH) ............................................................ 71 3.7 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA E SUAS ETAPAS ....................................................................................... 73 3.7.1 Enzimas utilizadas ................................................................................................................................... 73 3.7.2 Preparo do Tampão citrato utilizado........................................................................................................ 73 3.7.3 Preparação do DNS e Tartarato ............................................................................................................... 73 3.7.4 Determinação da atividade enzimática da celulase .................................................................................. 73 3.7.6 Hidrólise enzimática do caroço de açaí pré-tratado e deslignificado para obtenção de dados cinéticos . 78 3.7.7 Estudo da variação da carga de sólidos e agitação na etapa de hidrólise enzimática .............................. 79 3.8 FERMENTAÇÃO ...................................................................................................................................... 80 3.8.1 Preparação do padrão glicose .................................................................................................................. 80 3.8.2 Preparo do hidrolisado ............................................................................................................................. 80 3.8.3 Esterelização dos hidrolisados ................................................................................................................. 80 3.8.4 Microrganismo ........................................................................................................................................ 81 3.8.5 Ativação do microrganismo ..................................................................................................................... 81 3.8.6 Crescimento do microrganismo ............................................................................................................... 81 3.8.7 Fermentação dos hidrolisados ................................................................................................................. 82 3.8.8 Métodos analíticos utilizados para avaliar a fermentação ....................................................................... 82
CAPÍTULO 4
4. RESULTADOS DA CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO CAROÇO DE AÇAÍ “ IN NATURA” ............ 85
CAPÍTULO 5
5. RESULTADOS DO PRÉ-TRATAMENTO COM ÁCIDO SULFÚRICO (H2SO4) DILUÍDO DO CAROÇO DE AÇAÍ ........................................................................................................................................ 89 5.1 RESULTADOS OBTIDOS PARA A COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA FRAÇÃO SÓLIDA RECUPERADA APÓS O PRÉ-TRATAMENTO ........................................................................................... 89 5.2 RESULTADOS OBTIDOS PARA A COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA FRAÇÃO LÍQUIDA APÓS O PRÉ-TRATAMENTO COM ÁCIDO SULFÚRICO DILUÍDO .................................................................... 100 5.3 RESULTADOS OBTIDOS PARA A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DO CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO COM ÁCIDO SULFÚRICO DILUÍDO ..................................................................................... 108 5.4 RESULTADOS OBTIDOS PARA AS CINÉTICAS DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICAS DO CAROÇO DE AÇAÍ PRÉTRATADO COM ÁCIDO SULFÚRICO DILUÍDO ............................................................ 113
CAPÍTULO 6
6. RESULTADOS DA DESLIGNIFICAÇÃO DO CAROÇO DE AÇAI PRÉ-TRATADO COM ÁCIDO SULFÚRICO DILUÍDO ................................................................................................................................ 118 6.1 RESULTADOS DA CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DA FRAÇÃO SÓLIDA APÓS A DESLIGNIFICAÇÃO. ................................................................................................................................... 118 6.2 RESULTADOS OBTIDOS PARA A LIGNINA PRECIPITADA RECUPERADA NA FRAÇÃO LÍQUIDA APÓS A DESLIGNIFICAÇÃO DO CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO COM ÁCIDO SULFÚRICO DILUÍDO ................................................................................................................................ 127 6.3 RESULTADOS OBTIDOS PARA A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DO CAROÇO DE AÇAI PRÉ-TRATADO COM ÁCIDO SULFÚRICO DILUÍDO E DESLIGNIFICADO ............................................... 128 6.4 RESULTADOS OBTIDOS PARA AS CINÉTICAS DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICAS DO CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO COM ÁCIDO SULFÚRICO DILUÍDO E SEQUENCIALMENTE DESLIGNIFICADO ....................................................................................................................................... 130 6.5 BALANÇO DE MASSA PARA A ETAPA DE DESLIGNIFICAÇÃO DO MATERIAL PRÉ-TRATADO COM ÁCIDO E POSTERIORMENTE DESLIGNIFICADO ....................................................................... 132
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CAPÍTULO 7
7. MUDANÇAS ESTRUTURAIS E VISUAIS NO CAROÇO DE AÇAI E PODER CALORÍFICO .......... 136 7.1 ANÁLISE VISUAL DO CAROÇO DE AÇAI ........................................................................................ 136 7.2 ANÁLISE DE MICROSCOPIA ELETRÕNICA DE VARREDURA (MEV) DO CAROÇO DE AÇAI “ IN NATURA”, APÓS PRÉ-TRATAMENTO, DESLIGNIFICAÇÃO E HIDRÓLISE ENZIMÁTICA....... 138 7.3 RESULTADOS DA ANÁLISE DE CRISTALINIDADE POR ESPECTROSCOPIA DE DIFRAÇÃO DE RAIO X (DRX) .............................................................................................................................................. 140 7.4 RESULTADOS DA ESCTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO COM TRASFORMADA DE FOURIER (FTIR) ........................................................................................................................................... 143
CAPÍTULO 8
8. RESULTADOS DA VARIAÇÃO DA CARGA DE SÓLIDOS E AGITAÇÃO NA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO CAROÇO DE AÇAI ...................................................................................................... 148 8.1 ANÁLISE E TRATAMENTO ESTATÍSTICO DOS RESULTADOS OBTIDOS PARA A HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO CAROÇO DE AÇAI PRÉ-TRATADO APENAS COM ÁCIDO SULFÚRICO DILUÍDO ........................................................................................................................................................................ 148 8.2 ANÁLISE E TRATAMENTO ESTATÍSTICO DOS RESULTADOS OBTIDOS PARA A HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO CAROÇO DE AÇAI PRÉ-TRATADO COM ÁCIDO SULFÚRICO DILUÍDO E SEQUENCIALMENTE DESLIGNIFICADO ............................................................................................... 154 8.3 RESULTADOS OBTIDOS PARA A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DA CELULOSE APÓS O PRÉ-TRATAMENTO COM ÁCIDO SULFÚRICO E DESLIGNIFICAÇÃO ...................................................... 158
CAPÍTULO 9
9. FERMENTAÇÃO ...................................................................................................................................... 165 9.1 RESULTADOS OBTIDOS PARA A FERMENTAÇÃO DOS HIDROLISADOS ................................ 165 CAPÍTULO 10. CONCLUSÕES ................................................................................................................... 171 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................................... 174 SUGESTÃO PARA TRABALHOS FUTUROS ............................................................................................ 173
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Dedico a minha mãe, pai e avós
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AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente à Deus, sem o qual acredito que nenhuma realização em
minha vida teria sido possível. Agradeço a minha mãe, que foi, e é meu maior exemplo em
todos os sentidos de minha vida e que sempre me apoiou em minhas escolhas e sonhos. Ao
meu pai e avós que foram fundamentais para que os mesmos sonhos se tornassem reais.
Agradeço ao meu orientador o Dr. Rubens Maciel, por me fornecer sempre um bom
conselho, uma boa contribuição para o trabalho, e que será sempre um exemplo para mim
de pesquisador e professor. Agradeço ao CNPQ pela bolsa fornecida durante parte da
realização deste trabalho e à FAPESP que através do BIOEN me proporcionou a estrutura
técnica necessária ao bom andamento deste trabalho.
Agradeço à Universidade Federal do Pará (UFPA) pelo apoio concendido através do
meu afastamento durante a finalização desta Tese e que também forneceu estrutura para a
realização de alguns experimentos. Sou muito grato a Universidade Estadual de Campinas
(UNICAMP) onde realizei este doutorado, do qual pude obter muito conhecimento técnico-
profissional, e à todos os professores e funcionários que a tornam a grande universidade
que é.
Aos Membros da Banca por aceitarem avaliar esta Tese e contribuirem com
sugestões de grande importância.
Não poderia esquecer dos meus grandes amigos Luiza Helena, Andrea Komesu,
Debora Kono e Rodrigo Gouvêa pela ajuda em importantes momentos deste trabalho. Fica
aqui o meu muito obrigado à todos!
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Lembre-se da minha ordem: “seja forte e corajoso! Não fique desanimado nem tenha medo, porque eu, o eterno, o seu Deus, estarei com você em qualquer lugar, para onde você for!”
(JOSUÉ 1:9)
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LISTA DE FIGURAS FIGURA 1.1. DIAGRAMA DE BLOCOS DAS PRINCIPAIS ETAPAS REALIZADAS NESTE TRABALHO. ........................... 4 FIGURA 2.1 A) AÇAIZEIROS; B) FRUTOS “ IN NATURA”; C) CAROÇOS DESPOLPADOS; D) CAROÇO SECIONADO E
E) ESQUEMA DA SECÇÃO. ........................................................................................................................... 7 FIGURA 2.2 VÁRIOS RESÍDUOS AGRÍCOLAS LIGNOCELULÓSICOS E CULTURA PARA A PRODUÇÃO DE ETANOL ... 10 FIGURA 2.3 FRACIONAMENTO DA BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA PARA A PRODUÇÃO DE BIOCONBUSTÍVEIS ..... 12 FIGURA 2.4 ESTRUTURA E COMPONENTES DA PAREDE CELULAR VEGETAL ....................................................... 14 FIGURA 2.5 ESTRUTURA MOLECULAR DA CELULOSE ......................................................................................... 15 FIGURA 2.6 CELULOSE E SUA ESTRUTURA ......................................................................................................... 16 FIGURA 2.7 ESTRUTURA DA CELULOSE E QUEBRA ENZIMÁTICA ........................................................................ 18 FIGURA 2.8 HEMICELULOSES: (A) GLUCURONOARABINOXILANAS (GAX), PRINCIPAIS POLISSACARÍDEOS
HEMICELULÓSICOS, CONSISTEM EM UMA CADEIA DE XILANAS, COM SUSTITUÇÕES DE ARABINOSE, ÁCIDO
D-GLUCURÔNICO E ÁCIDO FERÚLICO E (B) Β-GLUCANAS COM LIGAÇÕES MISTAS, CONSISTEM EM
UNIDADES DE CELOTRIOSE E CELOTETRAOSE UNIDAS POR LIGAÇÕES Β(1-4) QUE SE ENTRELAÇAM POR
LIGAÇÕES Β(1-3)....................................................................................................................................... 20 FIGURA 2.9 PRECURSORES TÍPICOS, FENILPROPANÓIDES, UTILIZADOS NA BIOSSÍNTESE DE LIGNINA DA BIOMASSA
VEGETAL .................................................................................................................................................. 22 FIGURA 2.10 TIPOS DE LIGAÇÕES PROPOSTAS ENTRE LIGNINA E OS POLISSACARÍDEOS; A) L IGAÇÕES ÉTER
BENZÍLICAS; B) LIGAÇÕES ESTER BENZÍLICA ............................................................................................. 23 FIGURA 2.11 ESTRUTURA HIPOTÉTICA DA LIGNINA E OS TIPOS DE LIGAÇÕES POSSÍVEIS ENTRE SUAS UNIDADES
ESTRUTURAIS............................................................................................................................................ 24 FIGURA 2.12 UM SEGMENTO DE REPETIÇÃO DA MOLÉCULA DE PECTINA E GRUPOS FUNCIONAIS: (B) CARBOXILO;
(C) ÉSTER; (D) AMIDA NA CADEIA DE PECTINA .......................................................................................... 25 FIGURA 2.13 DIFERENTES PRÉ-TRATAMENTOS .................................................................................................. 29 FIGURA 2.14 LIBERAÇÃO DE PRODUTOS DE DEGRADAÇÃO A PARTIR DOS CARBOIDRATOS DA BIOMASSA
DURANTE O PRÉ-TRATAMENTO COM ÁCIDOS ............................................................................................ 34 FIGURA 2.15 DEGRADAÇÃO DA CELULOSE ........................................................................................................ 35 FIGURA 2.16 DEGRADAÇÃO DA XILANA ............................................................................................................ 36 FIGURA 2.17 MECANISMO DE DEGRADAÇÃO EM MEIO ÁCIDO – QUEBRA DA LIGAÇÃO Β-O-4 ............................ 36 FIGURA 2.18 MODELO QUE REPRESENTA AS REAÇÕES DE HIDRÓLISE E AS PROVÁVEIS ALTERAÇÕES
OBSERVADAS NA ESTRUTURA SUPRAMOLECULAR DO MATERIAL LIGNOCELULÓSICO DURANTE A HIDRÓLISE
COM ÁCIDOS DILUÍDOS ............................................................................................................................. 37 FIGURA 2.19 MECANISMO DE HIDRÓLISE DA CELULOSE CATALISADA POR ÁCIDO ............................................. 42 FIGURA 2.20 DEGRADAÇÃO ESQUEMÁTICA DA CELULOSE POR CELULASES ...................................................... 45 FIGURA 2.21 MODO DE AÇÃO DAS GLICOSIDASES ............................................................................................. 45 FIGURA 2.22 ESQUEMA SIMPLIFICADO DA FERMENTAÇÃO ALCOOLICA ............................................................ 47 FIGURA 3.1 V ISTA DE SATÉLITE DA REGIÃO METROPOLITANA DE BELÉM-PA ................................................... 53 FIGURA 3.2 FLUXOGRAMA DE PROCESSAMENTO DO CAROÇO DE AÇAÍ UTILIZADO NOS EXPERIMENTOS. ........... 54 FIGURA 3.3 AÇAÍ ANTES E DEPOIS DA LAVAGEM (DA ESQUERDA PARA A DIREITA) ........................................... 54 FIGURA 3.4 CAROÇO DE AÇAÍ APÓS SECO E TRITURADO .................................................................................... 55 FIGURA 3.5 BIOMASSA NOS TUBOS SCHOTT ANTES DE SEGUIREM PARA O AUTOCLAVE..................................... 69 FIGURA 5.1 CONCENTRAÇÃO DE AÇUCARES NA FRAÇÃO LÍQUIDA DO PRÉ-TRATAMENTO (LICOR) .................. 103 FIGURA 5.2 GRÁFICO DE PARETO PARA OS TEORES DE XILOSE NOS LICORES OBTIDOS A PARTIR DO PRÉ-
TRATAMENTO COM H2SO4 DILUÍDO. ....................................................................................................... 107 FIGURA 5.3 RESULTADOS OBTIDOS PARA CONVERSÃO E RENDIMENTO GLOBAL OBTIDOS PARA O MATERIAL
PRÉ-TRATADO. ........................................................................................................................................ 110 FIGURA 5.4 GRÁFICO DE PARETO PARA O TEOR DE G DE GLICOSE/ G DE CAROÇO CRU. ................................... 112 FIGURA 5.5 GRÁFICO DAS CINÉTICAS ENZIMÁTICAS DOS ENSAIOS 1E 2. ......................................................... 113 FIGURA 5.6 GRÁFICO DAS CINÉTICAS ENZIMÁTICAS DOS ENSAIOS 3 E 4. ........................................................ 114
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FIGURA 5.7 - GRÁFICO DAS CINÉTICAS ENZIMÁTICAS DOS ENSAIOS 5 E 6. ...................................................... 114 FIGURA 5.8 - GRÁFICO DAS CINÉTICAS ENZIMÁTICAS DOS ENSAIOS 7 E 8. ...................................................... 114 FIGURA 5.9 - GRÁFICO DAS CINÉTICAS ENZIMÁTICAS DOS ENSAIOS 9 E 10. .................................................... 115 FIGURA 5.10 - GRÁFICO DAS CINÉTICAS ENZIMÁTICAS DOS ENSAIOS 11 E 12. ................................................ 115 FIGURA 5.11 - GRÁFICO DAS CINÉTICAS ENZIMÁTICAS DOS ENSAIOS 13 E 14. ................................................ 115 FIGURA 5.12 GRÁFICO DAS CINÉTICAS ENZIMÁTICAS DOS ENSAIOS 15, 16 E 17. ............................................. 116 FIGURA 6.1 SOLUBILIZAÇÃO DOS COMPONENTES LIGNOCELULÓSICOS CALCULADOS EM RELAÇÃO AO MATERIAL
PRÉ-TRATADO COM ÁCIDO DILUÍDO. ....................................................................................................... 125 FIGURA 6.2 SOLUBILIZAÇÃO DOS COMPONENTES LIGNOCELULÓSICOS CALCULADOS EM RELAÇÃO AO MATERIAL
“ IN NATURA”. ......................................................................................................................................... 126 FIGURA 6.3 LIGNINA RECUPERADA NO LICOR OBTIDO APÓS A DESLIGNIFICAÇÃO DO CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-
TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO............................................................................................................... 127 FIGURA 6.4 CINÉTICAS DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA REALIZADA PARA OS ENSAIOS 1 E 2. ................................ 130 FIGURA 6.5 CINÉTICAS DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA REALIZADA PARA OS ENSAIOS 3 E 4. ................................ 131 FIGURA 6.6 CINÉTICAS DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA REALIZADA PARA OS ENSAIOS 5 E 6. ................................ 131 FIGURA 6.7 CINÉTICAS DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA REALIZADA PARA OS ENSAIOS 7 E 8. ................................ 131 FIGURA 6.8 CINÉTICA ENZIMÁTICA REALIZADA PARA OS PONTOS CENTRAIS 9. ............................................... 132 FIGURA 6.9 BALANÇO DE MASSA PARA O PRÉ-TRATAMENTO COM H2SO4 DILUÍDO DO CAROÇO DE AÇAÍ. ....... 133 FIGURA 6.10 BALANÇO DE MASSA PARA O PRÉ-TRATAMENTO COM H2SO4 DILUÍDO E DESLIGNIFICAÇÃO
SEQUENCIAL DO CAROÇO DE AÇAÍ. ......................................................................................................... 134 FIGURA 7.1 BIOMASSA DO CAROÇO DE AÇAÍ “ IN NATURA” (A) E PRÉ-TRATADA (B). ...................................... 136 FIGURA 7.2 CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO COM 0,2% (A); 1,0% (B) E 1,84%(C) DE H2SO4. ...................... 137 FIGURA 7.3 CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO COM 1,84% E DESLIGNIFICADO. ................................................ 137 FIGURA 7.4 A E B FOTOMICROGRAFIAS DO CAROÇO DE AÇAÍ “ IN NATURA” (A E B DA ESQUERDA PRA DIREITA).
OS AUMENTOS E BARRAS DE COMPARAÇÃO ESTÃO APRESENTADAS EM CADA FIGURA. .......................... 138 FIGURA 7.5 A E B FOTOMICROGRAFIAS APÓS O PRÉ-TRATAMENTO COM H2SO4 DILUÍDO (A E B DA ESQUERDA
PRA DIREITA). OS AUMENTOS E BARRAS DE COMPARAÇÃO DE ESTÃO APRESENTADAS EM CADA FIGURA. ............................................................................................................................................................... 139
FIGURA 7.6 A E B FOTOMICROGRAFIAS APÓS O PRÉ-TRATAMENTO COM H2SO4 DILUÍDO E DESLIGNIFICADO COM
NAOH (A E B DA ESQUERDA PRA DIREITA). OS AUMENTOS E BARRAS DE COMPARAÇÃO DE ESTÃO
APRESENTADAS EM CADA FIGURA. ......................................................................................................... 139 FIGURA 7.7 FOTOMICROGRAFIAS APÓS O PRÉ-TRATAMENTO COM H2SO4 DILUÍDO E DESLIGNIFICADO E
POSTERIOR HIDRÓLISE ENZIMÁTICA. ....................................................................................................... 140 FIGURA 7.8 CURVAS DE DIFRAÇÃO OBTIDAS PARA O CAROÇO DE AÇAÍ. .......................................................... 141 FIGURA 8.1 VALORES OBSERVADOS VS. VALORES PREDITOS OBTIDOS PARA OS VALORES DE G DE GLICOSE/ G DE
CAROÇO “ IN NATURA” A 95% DE CONFIANÇA ......................................................................................... 152 FIGURA 8.2 GRÁFICO DE PARETO OBTIDO PARA OS EFEITOS ESTIMADOS DOS VALORES DE G DE GLICOSE/ G DE
CAROÇO “ IN NATURA” EM UM INTERVALO DE 95% DE CONFIANÇA ........................................................ 152 FIGURA 8.3 SUPERFÍCIE DE RESPOSTA GERADA PARA OS VALORES DE G DE GLICOSE / G DE CAROÇO “ IN
NATURA”. ............................................................................................................................................... 153 FIGURA 8.4 VALORES OBSERVADOS VS. VALORES PREDITOS OBTIDOS PARA OS VALORES DE G DE GLICOSE/ G DE
CAROÇO PRÉ-TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO PARA UM INTERVALO DE 99% DE CONFIANÇA (CAROÇO PRÉ-TRATADO E SEQUENCIALMENTE DESLIGNIFICADO) ................................................................................. 156
FIGURA 8.5 GRÁFICO DE PARETO OBTIDOS DOS EFEITOS ESTIMADOS PARA OS VALORES DE G DE GLICOSE/ G DE
CAROÇO PRÉ-TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO EM INTERVALO DE 99% DE CONFIANÇA. .......................... 156 FIGURA 8.6 SUPERFÍCIE DE RESPOSTA OBTIDA PARA OS VALORES DE G DE GLICOSE/ G DE BAGAÇO PRÉ-TRATADO
COM H2SO4 DILUÍDO .............................................................................................................................. 157 FIGURA 8.7 RESULTADOS DA CONVERSÃO DA CELULOSE OBTIDOS PARA O CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO COM
H2SO4 DILUÍDO E PRÉ-TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO E SEQUENCIALMENTE DESLIGNIFICADO. ............. 159
xxiii
FIGURA 8.8 RESULTADOS DA CONVERSÃO ENZIMÁTICA OBTIDA PARA A CELULOSE DO CAROÇO DE AÇAÍ APENAS
PRÉ-TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO, PRÉ-TRATADO E DESLIGNIFICADO SEQUENCIALMENTE E “ IN NATURA”
A 200 RPM............................................................................................................................................... 160 FIGURA 8.9 CINÉTICAS DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA REALIZADAS PARA O CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO COM
H2SO4 DILUÍDO (1° DA ESQUERDA PARA DIREITA) E CAROÇO DE AÇAÍ “ IN NATURA”/BRUTO (2° DA
ESQUERDA PARA DIREITA) DURANTE 96 HORAS A 200RPM. .................................................................... 161 FIGURA 8.10 CINÉTICAS DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA REALIZADAS PARA O CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO COM
H2SO4 DILUÍDO E DESLIGNIFICADO SEQUENCIALMENTE DURANTE 96 HORAS A 200RPM. ....................... 162 FIGURA 8.11 CINÉTICAS DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA REALIZADAS PARA O CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO
APENAS COM H2SO4; PRÉ-TRATADO E SEQUENCIALMENTE DESLIGNIFICADO E CAROÇO “ IN
NATURA”/BRUTO DURANTE 96 HORAS A 200RPM. .................................................................................. 162 FIGURA 8.12 CINÉTICAS DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA REALIZADAS PARA O CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO
APENAS COM H2SO4; PRÉ-TRATADO E SEQUENCIALMENTE DESLIGNIFICADO E CAROÇO “ IN
NATURA”/BRUTO DURANTE 96 HORAS A 200RPM A 3% DE SÓLIDOS. ...................................................... 163 FIGURA 9.1 GRÁFICOS DAS CINÉTICAS DE FERMENTAÇÃO DOS HIDROLISADOS PADRÃO (GLICOSE PADRÃO),
HIDROLISADO OBTIDOS COM O CAROÇO DE AÇAÍ APENAS PRÉ-TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO E
HIDROLISADO OBTIDO COM O CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO E SEQUENCIALMENTE DESLIGNIFICADO (DA
ESQUERDA PARA DIREITA). ..................................................................................................................... 169
xxiv
xxv
LISTA DE TABELAS TABELA 3-1 REAGENTES UTILIZADOS NOS EXPERIMENTOS. .............................................................................. 51 TABELA 3-2 FAIXA DE CONCENTRAÇÃO DOS PADRÕES USADOS NA CURVA DE CALIBRAÇÃO. ........................... 62 TABELA 3-3 PH E VOLUME DE H2SO4 A 72% ADICIONADO PARA A HIDRÓLISE ÁCIDA DO LICOR, PARA POSTERIOR
QUANTIFICAÇÃO DE CARBOIDRATOS E INIBIDORES PRESENTES. ................................................................ 65 TABELA 3-4 FAIXA DAS VARIÁVEIS ESTUDADAS NO PLANEJAMENTO 23
DO PRÉ-TRATAMENTO COM H2SO4. .... 71 TABELA 3-5 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL DO PRÉ TRATAMENTO COM H2SO4 ............................................. 71 TABELA 3-6 PLANEJAMENTO 22
REALIZADO PARA O ESTUDO DA DESLIGNIFICAÇÃO DO CAROÇO DE AÇAÍ. ....... 72 TABELA 3-7 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL APLICADO PARA A VARIAÇÃO DA CARGA DE SÓLIDOS E AGITAÇÃO.
................................................................................................................................................................. 79 TABELA 4-1 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA BIOMASSA DO CAROÇO DE AÇAÍ “ IN NATURA” EM BASE SECA. ............ 85 TABELA 4-2 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DE ALGUNS MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS. ............................................ 88 TABELA 5-1 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA FRAÇÃO SÓLIDA OBTIDA DO PRÉ TRATAMENTO COM H2SO4 (SEM A
CORREÇÃO) .............................................................................................................................................. 91 TABELA 5-2 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA FRAÇÃO SÓLIDA OBTIDA DO PRÉ-TRATAMENTO COM H2SO4 DA
BIOMASSA DO CAROÇO DE AÇAÍ (COM A CORREÇÃO DO RENDIMENTO DO PRÉ-TRATAMENTO) ................. 93 TABELA 5-3 RESULTADOS ESTATÍSTICOS OBTIDOS PARA OS PRINCIPAIS COMPONENTES DA FRAÇÃO SÓLIDA
OBTIDA APÓS O PRÉ TRATAMENTO COM H2SO4 DILUÍDO. ......................................................................... 99 TABELA 5-4 RESULTADOS DA ANOVA REALIZADA PARA OS TEORES DE CELULOSE RECUPERADA NA FRAÇÃO
SÓLIDA APÓS O PRÉ TRATAMENTO ÁCIDO NO NÍVEL DE 90% DE CONFIANÇA. ......................................... 100 TABELA 5-5 BALANÇO DE MASSA DA FRAÇÃO LÍQUIDA PROVENIENTE DO PRÉ TRATAMENTO COM H2SO4...... 102 TABELA 5-6 RESULTADOS DOS TEORES DE XILOSE E INIBIDORES RECUPERADOS NO LICOR. ............................ 104 TABELA 5-7 RESULTADOS DOS EFEITOS ESTIMADOS E SIGNIFICÂNCIA DAS RESPOSTAS: XILOSE, HMF E
FURFURAL OBTIDOS PARA O PRÉ-TRATAMENTO COM H2SO4 DILUÍDO . ................................................... 106 TABELA 5-8 RESULTADOS DA ANOVA PARA O TEOR DE XILOSE PRESENTE NO LICOR (HIDROLISADO) .......... 108 TABELA 5-9 RESULTADOS OBTIDOS PARA OS TEORES DE GLICOSE (G/G DE BIOMASSA CRUA), CONVERSÃO
ENZIMÁTICA E RENDIMENTO GLOBAL. .................................................................................................... 109 TABELA 5-10 ANÁLISE DOS EFEITOS PRINCIPAIS E DE INTERAÇÃO DAS VARIÁVEIS DO PRÉ-TRATAMENTO COM
H2SO4. .................................................................................................................................................. 111 TABELA 5-11 ANÁLISE DA VARIÂNCIA (ANOVA) PARA A CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE LIBERADA APÓS A
HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO BAGAÇO PRÉ-TRATADO COM H2SO4. ......................................................... 113 TABELA 6-1 TABELA DA COMPOSIÇÃO DA FRAÇÃO SÓLIDA DO MATERIAL DESLIGNIFICADO (SEM CORREÇÃO
PARA A BASE DO RENDIMENTO). ............................................................................................................. 121 TABELA 6-2 TABELA DA COMPOSIÇÃO DA FRAÇÃO SÓLIDA DO MATERIAL DESLIGNIFICADO (NA BASE DO
RENDIMENTO) EM RELAÇÃO AO MATERIAL PRÉ-TRATADO COM ÁCIDO DILUÍDO. .................................... 122 TABELA 6-3 BALANÇO DE MASSA PARA A COMPOSIÇÃO DO CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO E DESLIGNIFICADO
EM RELAÇÃO AO MATERIAL “ IN NATURA” .............................................................................................. 124 TABELA 6-4 RESULTADOS OBTIDOS COM A HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DA BIOMASSA DO CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-
TRATADO (NA CONDIÇÃO CONSIDERADA ÓTIMA) E DESLIGNIFICADO. ..................................................... 128 TABELA 6-5 ANÁLISE DOS EFEITOS PRINCIPAIS E DE INTERAÇÃO DAS VARIÁVEIS DE DESLIGNIFICAÇÃO DO
CAROÇO PRÉ-TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO. ....................................................................................... 129 TABELA 6-6 RESULTADOS DA ANOVA REALIZADA OS TEORES DE GLICOSE LIBERADA APÓS A HIDRÓLISE
ENZIMÁTICA DO BAGAÇO PRÉ-TRATADO COM H2SO4 E DESLIGNIFICADO. ............................................. 129 TABELA 8-1 RESULTADOS OBTIDOS PARA O PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL UTILIZADO PARA AVALIAR O
EFEITO DA AGITAÇÃO E DA CONCENTRAÇÃO DE SÓLIDOS NA LIBERAÇÃO DE GLICOSE APÓS A HIDRÓLISE
ENZIMÁTICA DO CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO E/OU PRÉ-TRATADO E
DESLIGNIFICADO. .................................................................................................................................... 149
xxvi
TABELA 8-2 ANÁLISE DOS EFEITOS PRINCIPAIS DAS VARIÁVEIS DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO CAROÇO PRÉ-TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO (G DE GLICOSE/ G DE CAROÇO “ IN NATURA”) PARA UM INTERVALO DE
95% DE CONFIANÇA. .............................................................................................................................. 150 TABELA 8-3 ANÁLISE DE VARIÂNCIA (ANOVA) REALIZADA PARA OS VALORES DE G DE GLICOSE/ G DE CAROÇO
“ IN NATURA” OBTIDOS PARA A HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO CAROÇO PRÉ-TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO
PARA UM INTERVALO DE 95% DE CONFIANÇA. ....................................................................................... 151 TABELA 8-4 ANÁLISE DOS EFEITOS PRINCIPAIS DAS VARIÁVEIS DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO CAROÇO PRÉ-
TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO E SEQUENCIALMENTE DESLIGNIFICADO (G DE GLICOSE/ G DE CAROÇO PRÉ-TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO) PARA UM INTERVALO DE 99% DE CONFIANÇA. ..................................... 154
TABELA 8-5 ANÁLISE DOS EFEITOS PRINCIPAIS DAS VARIÁVEIS DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO CAROÇO PRÉ-TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO E SEQUENCIALMENTE DESLIGNIFICADO (G DE GLICOSE/ G DE CAROÇO PRÉ-TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO) PARA UM INTERVALO DE 99% DE CONFIANÇA. ..................................... 155
TABELA 9-1 CINÉTICA DOS VALORES DE CELOBIOSE, GLICOSE, ETANOL, MASSA SECA, HMF, ÁCIDO ACÉTICO E
FURFURAL OBTIDOS PARA O HIDROLISADO PROVENIENTE DA CARGA DE SÓLIDOS DE 15% DE CAROÇO
APENAS PRÉ-TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO (FERMENTAÇÃO DE 24H). ................................................. 166 TABELA 9-2 CINÉTICA DOS VALORES DE CELOBIOSE, GLICOSE, ETANOL, MASSA SECA, HMF, ÁCIDO ACÉTICO E
FURFURAL OBTIDOS PARA O HIDROLISADO PROVENIENTE DA CARGA DE SÓLIDOS DE 10% DE CAROÇO PRÉ-TRATADO COM H2SO4 DILUÍDO E SEQUENCIALMENTE DESLIGNIFICADO (FERMENTAÇÃO DE 24H) .......... 166
TABELA 9-3 CINÉTICA DE FERMENTAÇÃO OBTIDA PARA SOLUÇÃO PADRÃO DE GLICOSE ................................ 167
xxvii
LISTA DE SIGLAS
ATP-Adenosina trifosfato
DRX - Espectroscopia de difração de Raios-X
FTRI - Infravermelho com Transformada de Fourier
GAX - Glucuronoarabinoxilanas
HMF- Hidroximetil furfural
HPLC- High Performance Liquide Chromatography
IBGE-Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
LRAC - Laboratório de Recursos Analíticos e de Calibração
MEV- Microscopia eletrônica de varredura
MLC- Materiais lignocelulósicos
NREL- National Renewable Energy Laboratory
UFPA-Universidade Federal do Pará
UNICAMP- Universidade Estadual de Campinas
xxviii
1
CAPÍTULO 1 - INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
A crise do petróleo associada às tendências globais de redução das emissões de
gases do efeito estufa têm sido um dos principais fatores de incentivo ao desenvolvimento
de novas tecnologias no setor de combustível, principalmente as relacionadas com
biocombustíveis, bioenergia e química de produtos de fontes renováveis. Esta necessidade
de processos ecoeficientes têm motivado extensivas pesquisas com o objetivo de converter
resíduos industriais e agrícolas em produtos comercialmente valorizados (CHRISTOS et
al., 2013).
Entre os principais produtos que podem ser obtidos a partir do material
lignocelulósico está o etanol de segunda geração (SÁNCHEZ & CARDONA, 2008). O
etanol de segunda geração ou etanol lignocelulósico é obtido por hidrólise dos
polissacarídeos presentes na parede celular da biomassa (SIMS et al., 2010).
Para a produção de etanol de segunda geração, é essencial aplicar à biomassa
utilizada pré-tratamentos para aumentar a acessibilidade da enzima e consequente aumento
do rendimento em etanol (MOSIER et al., 2005). Um dos primeiros pré-tratamentos que
apresentaram bons resultados para o aumento efetivo da hidrólise enzimática foi o
tratamento com ácidos diluídos, principalmente aquele realizado com o ácido sulfúrico
(H2SO4), produto com valor relativamente reduzido com relação a outros ácidos. Este
tratamento pode estar associado a temperaturas relativamente elevadas e a uma ampla
variedade de tipos e concentrações de ácido (CHRISTOS et al., 2013). Durante o
tratamento com ácidos diluídos, remove-se basicamente a fração hemicelulósica que, de
maneira geral, impede a adsorção eficiente da celulase na celulose, reduzindo assim os
índices de bioconversão. Dessa forma, a remoção dessa fração teria um efeito positivo no
aumento dos valores de hidrólise enzimática. Entretanto, parte da lignina permanece no
material pré-tratado com H2SO4 diluído (HENDRIKS & ZEEMAN, 2009). A lignina é um
dos fatores que mais impedem o acesso das enzimas hidrolíticas ao substrato. Logo a
remoção dessa fração pode ser um fator crucial para o aumento na eficiência produtiva de
açúcares para a posterior fermentação e produção de etanol (CHRISTOS et al., 2013). Um
2
dos métodos de deslignificação do qual se tem maior conhecimento é aquele realizado com
NaOH. Neste método soluções do reagente promovem a solubilização de até 90% da
lignina presente na biomassa tratada, possibilitando aumento no rendimento das taxas de
hidrólise.
Nos últimos anos, tem aumentado o uso de diferentes biomassas para a produção de
etanol de segunda geração, que requer adaptação ou desenvolvimento de processos para
alcançar o desempenho desejado (CHRISTOS et al., 2013). Um dos importantes aspectos
da produção de etanol de primeira ou segunda geração, o que é típico de biocombustíveis, é
que cada região do mundo escolheu, de certa forma, um resíduo ou uma matéria-prima de
grande produtividade local e volume de resíduo, como a beterraba na Europa, o milho nos
Estados Unidos ou a cana-de-açúcar no Brasil.
Entretanto, o Brasil apresenta uma imensa produção agroindustrial, com os mais
diferentes resíduos lignocelúlósicos provenientes de suas diferentes regiões, que
apresentam hábitos de consumo e de produtividade local diferenciada. Assim, os diferentes
resíduos lignocelulósicos de cada região do país poderiam ser aproveitados para a produção
local de etanol e, dessa maneira, diminuir a pressão comercial sofrida pelo etanol
primariamente produzido a partir da cana-de-açúcar, proveniente em sua maior parte, na
região sudeste do país.
No caso da região norte do país, um dos produtos de maior consumo é o açaí do
qual tem-se como resíduo, o seu caroço. Os caroços de açaí são considerados resíduos
urbanos e, atualmente, se configuram como um enorme inconveniente ao bem-estar e
higiene sanitária das cidades no norte do Brasil, como Belém. A possibilidade de converter
o resíduo obtido após o processo de obtenção da polpa do açaí em etanol, seria interessante
do ponto de vista comercial e ambiental. De acordo com a literatura, este material contém
grandes quantidades de celulose e hemicelulose (45%), o que justifica a sua utilização para
a produção do etanol de segunda geração (KIM et al., 2005). Poucos estudos para o
aproveitamento do caroço com fins energéticos são relatados na literatura, dentre os quais
se destaca a queima do resíduo (PADILHA et al, 2005) para produção de energia. No
entanto, este processo de queima é caracterizado como um processo de baixo valor
agregado e, a princípio, ecologicamente incorreto. Além disso, não há relatos até o
3
momento do aproveitamento do caroço para a produção de etanol combustível, o que
motivou a realização deste trabalho.
1.1. OBJETIVOS
1.2. OBJETIVO GERAL
O objetivo geral deste trabalho foi estudar as etapas para a produção de etanol a partir do caroço de açaí.
1.3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Realizar a caracterização química do caroço de açaí “in natura” (Capítulo 4);
• Realizar o pré-tratamento com H2SO4 diluído do caroço de açaí e observar a melhor
condição (Capítulo 5);
• Estudar a deslignificação alcalina com NaOH do caroço de açaí pré-tratado com
H2SO4 diluído (Capítulo 6);
• Estudar as mudanças morfológico-estruturais no caroço de açaí após o pré-
tratamento com H2SO4 diluído e com sequencial deslignificação alcalina com NaOH
(Capítulo 7);
• Estudar o efeito da variação da carga de sólidos de material pré-tratado e/ou
sequencialmente deslignificado e agitação na hidrólise enzimática realizada em reator
(Capítulo 8);
• Realizar a fermentação dos hidrolisados de caroço de açaí e verificar os índices de
produtividade de etanol (Capítulo 9).
Na Figura 1.1, é apresentado o diagrama de blocos que descreve as principais etapas
realizadas neste trabalho.
4
Figura 1.1. Diagrama de blocos das principais etapas realizadas neste trabalho.
5
1.4. PRINCIPAIS CONTRIBUIÇÕES DESTE TRABALHO
Dentre as principais contribuições deste trabalhos, podem-se citar:
• A obtenção de maiores informações técnicas sobre as características químicas e
morfológico-estruturais para o caroço de açaí (Capítulos 4 e 7);
• Obtenção de dados sobre os efeitos de pré-tratamentos já conhecidos sobre uma
matéria-prima ainda pouco explorada do ponto de vista científico (Capítulos 5 e 6);
• Fornecimento de dados sobre a hidrólise enzimática do caroço de açaí, avaliação a
influência de importantes parâmetros e a possibilidade de se produzir um componente de
alto valor agregado após a fermentação, o etanol (Capítulos 8 e 9).
6
CAPÍTULO 2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
O Capítulo apresenta a Revisão Bibliográfica sobre os temas abordados no decorrer
desta Tese de Doutorado com a finalidade de fundamentar o estudo realizado pela mesma.
Foram abordados os aspectos que tornam o caroço de açaí uma potencial biomassa para a
produção de etanol. Neste mesmo capítulo, são mostradas outras biomassas, das quais já se
têm relatos na literatura de sua utilização para a produção de etanol. Em seguida, são
descritas os componentes da parede celular que constituem o material lignocelulósico:
celulose, hemicelulose, lignina, substâncias pécticas e extrativos. São ainda abordadas as
demais etapas para a produção do etanol de 2ª geração: pré-tratamentos (pré-tratamento
com H2SO4 diluído e deslignificação com NaOH), hidrólise (ácida e enzimática) e a
fermentação alcoólica.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. AÇAÍ
O açaí (Euterpe oleracea) é uma palmeira amazônica que tem a polpa obtida dos
seus frutos amplamente consumidos pela população do norte do Brasil e que tem tido seu
consumo expandido para o mercado internacional com o aumento das exportações da polpa
do fruto para diferentes fins tecnológicos, principalmente alimentícios (GALOTTA &
BOAVENTURA, 2005).
Arecaceae pertence à família e gênero Euterpe, a Euterpe oleracea, Euterpe edulis e
Euterpe precatoria denominadas de "açaí" (POULOSE et al., 2012). O açaí da espécie E.
oleracea Mart. é uma fruta exótica que, quando madura muda de verde para roxo escuro
com uma única semente coberta por uma pequena polpa comestível que representa cerca de
13-15% do fruto (SCHAUSS et al., 2006) .
O gênero Euterpe congrega cerca de 28 espécies e ocorre principalmente nas
Américas Central e do Sul, o qual encontra-se distribuído por toda a bacia Amazônica
(MINISTÉRIO DO MEIO AMBIENTE, 1998). De acordo com Rogez (2000), o fruto do
açaí é arredondado, tendo de 1 a 2 cm de diâmetro e um peso médio de 0,8 a 2,3g, sendo
seu epicarpo de cor violáceo; púrpura quase negro e muito fino. O mesocarpo também é
7
bastante fino, tem de 1 a 2 mm de espessura. O epicarpo e o mesocarpo constituem a parte
comestível do fruto.
O caroço de açaí nos últimos anos tem se mostrado como um resíduo de
processamento, para o qual foram desenvolvidas poucas alternativas tecnológicas de
aproveitamento. Esse resíduo tem se apresentado como um transtorno ambiental para as
cidades do norte do Brasil, principalmente Belém e Manaus (SILVA & ROCHA, 2003) e
ainda continua assim nos dias de hoje. Na Figura 2.1, são mostradas algumas características
botânicas do caroço de açaí.
Figura 2.1 A) Açaizeiros; B) Frutos “in natura”; C) Caroços despolpados; D) Caroço secionado e E) Esquema da secção (adaptado de ROGEZ, 2000; EMBRAPA, 2013).
Principal subproduto da indústria de processamento do açaí, o caroço é uma
semente oleaginosa, formada por um pequeno endosperma sólido ligado a um tegumento,
que na maturidade é rico em celulose (53,20%), hemicelulose (12,26%) e lignina (22,30%)
(RODRÍGUEZ-ZÚÑIGA et al., 2008) e que mesmo após a remoção da polpa ainda
apresenta elevados teores de celulose e hemicelulose (ALTMAN, 1956).
8
O estado do Pará atualmente é o maior produtor nacional de açaí com 120.890
ton/ano do fruto. Deste total 93.521 ton/ano é de resíduo (caroço), ou seja, cerca de 83%
(IBGE, 2008). Somente na cidade de Belém existem cerca de 3 mil estabelecimentos que
comercializam o açaí processado, que representa um consumo diário de 440 mil quilos do
fruto (IBGE, 2008) e que gera um excedente de 365 toneladas por dia de lixo orgânico,
constituído principalmente de caroços, descartados em aterros sanitários e cursos de água.
Na Tabela 2.1 são mostrados os principais Estados produtores de açaí no Brasil.
Tabela 2-1 Principais produtores de Açaí no Brasil (IBGE, 2008)
Brasil e Unidades
da Federação
Variável
Quantidade (ton/ano) Valor (mil reais) Participação (%) sobre a quantidade
Brasil 120.890 133.746 100 Pará 107.028 122.638 89
Maranhão 9.191 7.432 8 Acre 1.537 745 1
Amapá 1.294 939 1 Amazonas 1.274 1.392 1 Rondônia 314 385 0
Bahia 250 213 0 Tocantins 2 4 0
2.2. BIOMASSAS
A produção e crescimento da biomassa têm início na conversão da energia solar
capturada e fixada como carbono na biomassa via fotossíntese, durante a qual o dióxido de
carbono (CO2) é convertido em compostos orgânicos no qual, para cada grama mol de
carbono fixado cerca de 470 kJ (112 Kcal) são absorvidos (KLASS, 2004). Este processo é
descrito pela equação (2.1).
CO2 + H2O + luz + clorofila (CH2O) + O2 (2.1)
São caracterizados como biomassa, os materiais de natureza orgânica (de origem
animal ou vegetal) e ainda aqueles que se apresentam sob a forma de resíduos da
agricultura, pesca ou pecuária que são acumulados anualmente, no mundo em grandes
9
quantidades (MCKENDRY, 2002). Dentre a matéria orgânica de origem vegetal, ou seja, a
biomassa vegetal, pode-se citar (PEREIRA Jr., 2007):
• Biomassa Natural;
• Biomassa Alimentícia;
• Biomassa Residual;
• Biomassa de Cultivos Energéticos.
De acordo com Ballesteros, (2001) os maiores usos da lignocelulose concentram-se
nas polpas e indústrias de papéis, proteína para ração, em meios tecnológicos de
alimentação, além de poderem gerar energia através da produção de etanol. Deve ser ainda
considerada a produção de energia por queima direta do material lignocelulósico como, por
exemplo, a produção de energia elétrica através da queima do caroço de açaí.
Dentre as biomassas residuais, podem-se destacar as de composição lignocelulósica
(resíduos lignocelulósicos) que em função da sua natureza renovável e seu baixo custo têm
sido utilizada amplamente como matéria-prima para geração de energia, ração animal e
ainda como fonte de carboidratos para processos de bioconversão (CHEN et al., 2010). Na
Figura 2.2 é possível observar vários resíduos agrícolas lignocelulósicos e culturas que tem
sido estudados para a produção de etanol.
10
Figura 2.2 Vários resíduos agrícolas lignocelulósicos e cultura para a produção de etanol (adaptado de SINGH et al., 2014.)
A conversão da biomassa em energia pode ser realizada através de processos
termoquímicos, nos quais estão inclusos combustão, pirólise ou gaseificação, ou ainda, a
conversão microbiológica da biomassa a gases e líquidos combustíveis através de métodos
fermentativos (MCKENDRY, 2002)
O aproveitamento de biomassa para a produção de energia ganhou grande interesse
com o possível esgotamento dos combustíveis fósseis convencionais, ou mesmo a elevação
de seus preços, o que exigiria um aumento da utilização de fontes de energia renováveis
(SUKUMARAN & PANDEY, 2009; SHABANGU et al., 2014). Associado a tal fato, tem-
se a pressão da população por políticas governamentais que atendam a idéia de maior
sustentabilidade ambiental nos processos de geração de energia (DERMIBAS, 2001).
A biomassa lignocelulósica para fins de bioconversão caracteriza um potencial
avanço econômico e tecnológico sobre as fontes tradicionais de combustíveis (SINDHU,
2010). As biomassas ricas em material lignocelúlósico (MLC) recebem uma atenção maior
do ponto de vista tecnológico, pois são promissoras fontes de hexoses e pentoses utilizadas
11
para a produção de etanol e outros componentes químicos de interesse industrial
(CHERUBINI, 2010).
Associado a este cenário, há ainda o adicional fator de abundância deste material em
função do grande número de fontes disponíveis (resíduos agrícolas, resíduos industriais da
fruticultura, além dos dejetos urbanos, entre outros) (SÁNCHEZ, 2009), além de ser uma
forma de incentivar a geração de empregos e a economia local.
Há uma tendência observada de acordo com as últimas pesquisas para o
aproveitamento de resíduos urbanos como aqueles provenientes das podas das árvores ou
ainda de resto de alimentos consumidos nas zonas urbanas, serragem ou folhas caídas, para
a sua conversão em combustíveis líquidos (HAHN-HÄGERDAL et al., 2006), com a
vantagem de que a utilização dessa biomassa lignocelulósica evitaria a concorrência com a
produção de alimentos e ração além de sua abundância e sustentabilidade como já
mencionado (CAROLINA et al., 2012).
Os principais benefícios de tecnologias de conversão de biomassas residuais ou
resíduos lignocelulósicos, através de rotas biotecnológicas e/ou químicas para o Brasil, de
acordo com Pereira Jr. (2007), são:
• Fontes abundantes e baratas de recursos renováveis;
• Oportunidade para o desenvolvimento industrial com base no conceito de
Biorrefinaria;
• Redução nas emissões gasosas que causam o “efeito estufa”;
• São tecnologias mais limpas;
• Promovem benefícios macroeconômicos para as comunidades rurais e para a
sociedade como um todo;
• Estão inseridas no contexto de Desenvolvimento Sustentável.
Na Figura 2.3, é possível observar o fluxograma de fracionamento da biomassa
lignocelulósica para a produção de biocombustíveis.
12
Figura 2.3 Fracionamento da Biomassa lignocelulósica para a produção de bioconbustíveis (adaptado de SINGH et al., 2014)
2.3. PAREDE CELULAR E COMPOSIÇÃO DOS MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS
A parede celular é um componente próprio da célula vegetal presente na maioria dos
vegetais e é constituída basicamente por compostos lignocelulósicos que representam mais
de 90% do peso seco de uma célula vegetal e outros compostos minoritários
(BUCKERIDGE & TINÉ, 2001). A parede celular é composta principalmente pelos
polímeros: celulose (30-60%), hemicelulose (20-40%) e lignina (12-25%), que se
encontram unidos fortemente entre si por forças não covalentes e ligações covalentes
(BALAT, 2011).
13
As propriedades estruturais e funcionais da parede celular são controladas pela
composição e organização de cada um de seus componentes individuais (BALAT, 2011).
Considera-se que a ligação entre os componentes da parede tem uma importante influência
em numerosas propriedades como a acessibilidade, extensibilidade, diferenciação,
plasticidade, digestibilidade e aderência, cujas aplicações são de considerável interesse nos
campos da nutrição e tecnologia de alimentos humana e animal, além da produção de
biocombustíveis (BARROS-RIOS et al., 2011) e de produtos químicos.
A função mais importante atribuída à parede celular é a de determinar a forma e
tamanho das células o que auxilia na manutenção do tecido em condições ótimas de
funcionamento fisiológico e o fornecimento de maior resistência à pressão e ao ataque de
agentes externos como agentes patogênicos, entre outros agentes biológicos capazes de
danificar a célula vegetal (LAGAERT et al., 2009).
Os polímeros celulose e hemicelulose representam os mais abundantes polímeros
naturais existentes na terra, seguidos pela lignina (BUCKERIDGE & TINÉ, 2001). De
maneira geral, esses componentes estão presentes na parede celular dos tecidos de plantas
superiores e a configuração mais freqüente é aquela em que as fibrilas de celulose
encontram-se localizadas em uma matriz amorfa de lignina e hemicelulose (PAULY &
KEEGSTRA, 2010).
A quantidade de cada um dos polímeros presentes em diferentes biomassas varia
com a espécie e a idade da planta, bem como entre as partes da mesma (SANTIAGO et al.,
2013). Essas diferenças na composição podem ocorrer também de maneira qualitativa
(FARINAS et al., 2010; PAULY & KEEGSTRA, 2010). Quando o material avaliado trata-
se de uma biomassa, ambos os aspectos anteriores são ainda influenciados por condições
ambientais e outros aspectos que incluem desde o método de colheita e armazenamento até
os processos químicos, físicos ou biológicos, aos quais estes materiais foram submetidos
(FARINAS et al., 2010; PAULY & KEEGSTRA, 2010).
Os vegetais de tecido vascular possuem quantidades significativas de lignina no
talo, tronco e folhas (SANTANA, 2005). Já nos vegetais de rápido crescimento, os tecidos
jovens são ricos em hemicelulose e pectina (GLAZER & NIKAIDO, 1995).
Na Figura 2.4, observa-se uma parede celular esquemática e alguns dos seus
constituintes.
14
Figura 2.4 Estrutura e componentes da parede celular vegetal (DE WILD et al., 2011)
2.3.1. Celulose
A celulose é o mais abundante material orgânico renovável produzido na biosfera
(1,5 x 1012 toneladas), encontrando-se amplamente distribuído em plantas (corresponde a
aproximadamente 35-50% do peso da mesma), em vários animais marinhos, e em menor
grau em algas, fungos, bactérias, invertebrados e até mesmo ameba (KLEMM et al., 2005;
HABIBI, LUCIA, & ROJAS, 2010).
A fórmula química da celulose é C6nH10n+2O5n+1 onde n representa o grau de
polimerização (SJOSTROM, 1993). A celulose é formada por longas cadeias lineares de
moléculas de glicose, que são ligadas na forma de unidades de D-anidroglucopiranose, com
15
pontes ésteres α -1→4 e β -1,4 -D-glicosídicas (LYND et al., 2002). A natureza desta
ligação faz com que as unidades de glicose fiquem alinhadas num ângulo de 180º,
formando uma cadeia plana, o que permite um elevado grau de empacotamento das fibras
(BURANOV & MAZZA, 2010). As moléculas de glicose encontram-se ligadas entre si por
forças intermoleculares formadas por pontes de hidrogênio e o número de unidades de
glicose numa única molécula de celulose pode variar de 500 a 5000, dependendo do tipo de
biomassa (GUPTA & DEMIRBAS, 2010).
Na Figura 2.5, é mostrada a estrutura química da celulose.
Figura 2.5 Estrutura molecular da celulose (KLEMM et al., 2005)
De acordo com Fengel & Wegener (1989), as pontes de hidrogênio originam as
microfibrilas de celulose que formam um conjunto de agregados insolúveis em água
(FENGEL & WEGENER, 1989). Cada uma das fibrilas que compõe a estrutura da celulose
é formada pela agregação de cerca de 250 microfibrilas, sendo que cada microfibrila é
formada por um pequeno número de feixes de molécula de celulose (fibrilas elementares),
onde cada molécula de celulose é formada por mais de mil unidades de glicose, que se
interligam por pontes de hidrogênio (KLEMM et al., 2005).
Os grupos hidroxilas (OH) presentes são responsáveis pelo comportamento físico e
químico da celulose, sendo capazes de assumir dois comportamentos, em função do seu
posicionamento na unidade glicosídica (KLEMM et al., 2005; GIL, 2008; OGEDA &
PETRI, 2010). Dessa forma, existem pontes de hidrogênio entre grupos OH de unidades
glicosídicas adjacentes da mesma molécula de celulose, que são ligações intramoleculares,
responsáveis pela rigidez das cadeias unitárias (KLEMM et al., 2005). Ocorre também
ligações entre grupos OH de moléculas adjacentes de celulose, constituindo as chamadas
ligações intermoleculares (FENGEL; WEGENER, 1989). A estrutura molecular observada
16
na celulose confere à mesma as características de hidrofilicidade, quiralidade,
degradabilidade e ampla variabilidade química que é gerada pela alta reatividade dos
grupos hidroxila (OH) (KLEMM et al., 2005).
Na Figura 2.6, é mostrado um esquema da estrutura da fibra celulósica.
Figura 2.6 Celulose e sua estrutura adaptada de Lavoine et al. (2012).
A resistência da celulose a processos de hidrólise é devida principalmente à sua
estrutura cristalina, região da cadeia que apresenta uma estrutura altamente ordenada e
rígida (LYND et al., 2002). A associação da zona cristalina com algumas regiões menos
ordenadas (amorfas), que são mais sensíveis à hidrólise, confere à celulose uma reatividade
heterogênea (GIL, 2008; OGEDA & PETRI, 2010). A cristalinidade da celulose é resultado
da ação combinada da biopolimerização e cristalinização e é normalmente expressa em
porcentagem (índice de cristalinidade ou CrI) e depende da origem e processo de obtenção
da celulose (SAMIR et al., 2005; EICHHONR et al., 2001; HABBIB et al., 2007;
PITARELO, 2007). Por outro lado, as regiões amorfas são resultado da má formação da
estrutura devido a alterações no processo de cristalinização (SAMIR et al., 2005;
EICHHONR et al., 2001; HABBIB et al., 2007).
17
A proporção entre regiões cristalinas e amorfas é o que se chama de grau de
cristalinidade e é variável na celulose de acordo com sua origem (SAMIR et al., 2005;
EICHHONR et al., 2001; HABBIB et al., 2007).
A estrutura celulósica pode ser quebrada pela ação de agentes químicos como os
ácidos ou bases ou biológicos, como as enzimas. A degradação da celulose é chamada de
homogênea, quando a celulose é solúvel no meio e heterogênea, quando ela é insolúvel,
como é o caso da quebra por ácidos, como o ácido sulfúrico (KLOCK et al., 2005;
LAPOINT, 2000). Neste tipo de hidrólise, as zonas amorfas são rapidamentes hidrolisadas.
Em seguida há uma redução na velocidade de hidrólise, correspondente a hidrólise da
região cristalina (KLOCK et al., 2005; LAPOINT, 2000). A fração mais facilmente
hidrolisável representa geralmente de 10 a 12% da celulose (KLOCK et al., 2005;
LAPOINT, 2000).
A hidrólise com agente alcalino pode ser realizada com a utilização de reagentes
como NaOH e NH3 no qual ocorre as chamadas reações de peeling dos grupos terminais
redutores dos polissacarídeos e a hidrólise alcalina das ligações ß-glucosídicas e dos grupos
acetílicos (FENGEL & WEGENER, 1984; KLOCK et al., 2005).
A biodegradação de celulose ocorre pela ação de três grupos de enzimas que atuam
sinergicamente e sequencialmente. Estes grupos compreendem as endo-1,4-ß-glucanases
(rompe a cadeia de celulose aleatoriamente nas regiões amorfas gerando fragmentos
menores), as exo-1,4-ß-glucanases ou celobiohidrolases (atacam as extremidades da cadeia
de celulose gerando dímeros de glicose) e as 1,4-ß-glucosidases (hidrolisam a celobiose à
glicose) (ERICKSON et al., 1990). Na Figura 2.7, é possível observar a quebra por via
enzimática da celulose.
18
Figura 2.7 Estrutura da celulose e quebra enzimática (GUO et al., 2012)
2.3.2. Hemicelulose
A hemicelulose ou polioses são polissacarídeos de baixo peso molecular, não
celulósicos e não amiláceos, associados com o material lignocelulósico nas células das
plantas e que é constituída por um polímero de pentoses com 100 a 200 moléculas de
monômeros (principalmente xilose e arabinose), valor este bem inferior ao da celulose
nativa (PITARELO, 2007; GUPTA & DEMIRBAS, 2010).
Estes polissacarídeos pertencem a uma classe de polímeros bastante heterogêneos
que diferem da celulose por serem compostas por diferentes açúcares (pelo menos dois
tipos de unidades de açúcares) com cadeias estruturais menores e mais ramificadas que
representam, em geral, de 15 a 35% da biomassa da planta (FENGEL & WEGENER, 1984;
19
SUN, 2010) e que podem ser constituídas de pentoses (β-d-xilose, α-L-arabinose) , hexoses
(β-d-manose, β- d-glicose, α-d-galactose) e/ou ácidos urônicos (d-glucorónico-α, α-d-4-O-
metilgalacturônico e ácidos d- galacturônico-α) (GÍRIO et al., 2010; BARROS-RÍOS et al.,
2011). É também possível observar a presença de outros açúcares, como a α-l-ramnose e α-
l-fucose que podem estar presentes em pequenas quantidades e os grupos hidroxila dos
açúcares pode ser parcialmente substituídos por grupos acetil (GÍRIO et al., 2010).
Homopolímeros de xilose, chamados homoxilanas só ocorrem em algas (algas vermelhas e
verdes) (GÍRIO et al., 2010).
Os açúcares constituintes da matriz hemicelulósica estão ligados entre si, por
ligações glicosídicas β-1,4, formando uma estrutura principal composta por um tipo
específico de resíduo, a partir da qual surgem ramificações laterais de cadeias curtas de
outros açúcares (BIELY, 1985). A função principal das hemiceluloses é a de agir como um
material aglomerante que se liga firmemente entre si e à superfície das microfibrilas de
celulose, mantendo-as unidas (DERMIBAS, 2008).
As hemiceluloses podem receber diferentes denominações, como por exemplo,
xilanas, mananas, arabinanas de acordo com o açúcar predominante na cadeia principal e na
ramificação lateral (BIELY, 1985; PEREIRA JR., 2007; MARTINS, 2005). Assim, xilanas,
galactomananas, arabino-xilanas, arabinoglucurono-xilanas, arabino-4-metil-glucurono-
xilana, 4-metil-glucurono-xilanas, galactosanas e galacto-arabino-glucurono-xilana são
diferentes denominações das hemiceluloses em função da estrutura química que as
compõem (BIELY, 1985; BUCKERIDGE, 2010).
As principais hemiceluloses encontradas em plantas são os xiloglucanos (XyG), os
glucuronoarabinoxilanos (GAX) e os mananos (MN), nos quais sempre estará presente uma
cadeia principal de monossacarídeos de glicose, xilose e manose, respectivamente, que
pode ser ramificada com diferentes monossacarídeos (BUCKERIDGE, 2010).
As cadeias de xilanas são as principais representantes das hemiceluloses e são
heteropolíssacarídeos compostos por unidades de xilose que se encontram ligadas entre si
através de ligações glicosídicas ß-1,4 e ramificadas por ligações glicosídicas a-1,2 com
ácido 4-O-metilglucurónico (LARSSON et al., 1999; BUCKERIDGE, 2010; GUPTA &
DEMIRBAS, 2010).
20
Na Figura 2.8 podemos observar a representação de hemiceluloses mais comumente
encontradas.
Figura 2.8 Hemiceluloses: (A) glucuronoarabinoxilanas (GAX), principais polissacarídeos hemicelulósicos, consistem em uma cadeia de xilanas, com sustituções de arabinose, ácido D-glucurônico e ácido ferúlico e (B) β-glucanas com ligações mistas, consistem em unidades de celotriose e celotetraose unidas por ligações β(1-4) que se entrelaçam por ligações β(1-3) (Adaptado de BARROS-RÍOS et al., 2011).
A xilana representa a hemicelulose mais abundante (SAHA, 2003). Desta forma,
sua desconstrução para os açúcares constituintes, principalmente xilose e arabinose, para
posterior fermentação por microrganismos, é fundamental para o uso eficiente da biomassa
vegetal para a produção de biocombustíveis (DODD & CANN, 2009).
De acordo com Kumar et at. (2009), as hemiceluloses são mais facilmente
hidrolisáveis quando comparadas com a celulose e não se agregam, mesmo quando co-
cristalizam com a celulose e são muito solúveis em soluções alcalinas. Sua biodegradação
pode ocorrer de forma semelhante à da celulose e as enzimas envolvidas na biodegradação
são hidrolases específicas que clivam determinados tipos de ligações existentes no polímero
21
(GOODELL, 2003). Tendo em vista que as hemiceluloses são constituídas de vários
polímeros, formados por diferentes resíduos de açúcares, a sua degradação completa
também necessita de enzimas específicas como, por exemplo, as β-1,4 xilanases (EC
3.2.1.8) que formam o principal grupo de enzimas envolvidas na degradação da xilana
(HALTRICH et al., 1996 ; KULKARNI et al., 1999).
2.3.3. Lignina
A lignina é um dos constituintes da parede celular das plantas vasculares, sendo um
composto heterogêneo, de alto peso molecular e estrutura irregular (HOFRICHTER, 2002;
ONNERUD, 2002) que apresenta natureza hidrofóbica, não polissacarídica e que interage
com a celulose e a hemicelulose conferindo rigidez à parede celular das plantas, oferecendo
à planta um mecanismo de resistência contra estresses bióticos e abióticos (SANTIAGO et
al., 2013; HENRIKSSON, 2009). Apresenta-se como uma macromolécula constituída de
unidades de fenilpropano, com uma conformação tridimensional e amorfa, representando
de 20 a 30% do total dos lignicelulósicos (AZEVEDO, 2004). Dessa forma, pode ser
caracterizada como um derivado dos grupos fenilpropanóides que têm sua origem na
polimerização desidrogenativa dos álcoois cumarílico, coniferílico e sinapílico
(BUDZIAK, 2004).
É o segundo polímero em maior abundância na biosfera e constitui a maior fração
não-polissacarídica dos materiais lignocelulósicos (JØRGENSEN et al., 2007) não podendo
ser isolada sem que a sua estrutura seja alterada, o que representa o principal motivo que
impede a completa elucidação de sua estrutura (HWANG et al., 1989; SANTIAGO et al.,
2013). As ligninas podem ser divididas de acordo com os constituintes da unidade
estrutural básica, ou seja, as ligninas G (possuem unidades de guaiacil – grupo metóxi no
carbono de posição 3 do esqueleto fenilpropanóide); as ligninas S (que possuem unidades
siringil – o grupo metóxi está localizado nos carbonos três e cinco) e as ligninas GSH, que
possuem unidades guaiacil, siringil e unidades de compostos fenilpropanóides não
metoxilados (PALMQVIST & HAHN-HÃGERDAL, 2000; SUN et al., 2001).
Em sua estrutura, as unidades de fenilpropano encontram-se interconectadas por
uma variedade de ligações carbono-carbono e ligações éter (RAMACHANDRA et al.,
22
1987). Dessa forma, a lignina é um produto final da via fenilpropanóide e/ou um
heteropolímero de três monômeros de álcool hidroxicinamil ou monolignóis: álcool p-
cumarílico, álcool coniferílico e o álcool sinapílico (BOERJAN et al., 2003).
Os produtos intermediários da via biossintética dos monolignóis servem como
precursores de hidroxicinâmicos e outros compostos fenólicos (SANTIAGO et al., 2013).
Tanto os monolignóis como os seus precursores são sintetizados no citoplasma (retículo
endoplasmático), e depois transportado para a parede celular onde a lignina é depositada
(SANTIAGO et al., 2013). Devido ao fato de os monolignóis serem relativamente tóxicos
para as células, foi sugerido que estes são exportados e armazenados na forma de
monolignóis-glucosídeos (SANTIAGO et al., 2013).
De acordo com Lewis et al. (1990), o mecanismo de polimerização da lignina não
ocorre totalmente ao acaso, porém, ainda não foi totalmente elucidado e acredita-se que
ocorra via radicais livres em presença de peróxido de hidrogênio/peroxidase.
Na Figura 2.9, é possível observar as estruturas dos fenilpropanóides precursores
típicos utilizados na biossíntese de lignina da biomassa vegetal.
Figura 2.9 Precursores típicos, fenilpropanóides, utilizados na biossíntese de lignina da biomassa vegetal (PU et al., 2013)
O acoplamento dos precursores da lignina em diferentes formas dá origem a vários
tipos de ligações entre as unidades de fenilpropanos. As mais comumente observadas são:
β-O-4 e α-O-4 (50 a 65%), β-5 (6 a 15%), β-1 (2 a 9%) e β-β (2 a 5%) (KANTELINEN,
1992; BOERJAN et al., 2003).
As ligações covalentes que unem os monômeros que as contituem são ligações do
tipo éter e resistem a vários agentes hidrolíticos e diversos sistemas enzimáticos
degradativos (FUKUSHIMA & HATFIELD, 2003; ZIEGLER et al., 2004). De acordo com
23
Azuma (1985), as ligações que unem a lignina aos polissacarídeos são do tipo éter ou
estéres benzílicos, tal como é mostrado na Figura 2.10.
Figura 2.10 Tipos de ligações propostas entre lignina e os polissacarídeos; a) Ligações éter benzílicas; b) ligações ester benzílica (AZUMA, 1985).
A lignina é o componente mais recalcitrante da parede celular e quanto maior for o
seu teor no material lignocelulósico, maior será a resistência do material à degradação
química e enzimática (TAHERZADEH & KARIMI, 2007). Dessa forma, sua presença tem
sido apresentada como uma das desvantagens da utilização de materiais lignocelulósicos
para a fermentação, uma vez que torna a lignocelulose resistente à degradação química e
biológica (TAHERZADEH & KARIMI, 2007).
A degradação da lignina pode ser realizada através da utilização de agentes
químicos ou ainda através de enzimas. De acordo com Ferraz (2004), um vasto grupo de
enzimas poderiam realizar a biodegradação da lignina e estas podem ser divididas em pelo
menos duas classes distintas: as fenoloxidases e as enzimas que produzem peróxido de
hidrogênio.
24
Na Figura 2.11, é possível observar uma estrutura hipotética da lignina e os tipos de
ligações possíveis entre suas unidades estruturais.
Figura 2.11 Estrutura hipotética da lignina e os tipos de ligações possíveis entre suas unidades estruturais (CARVALHO et al., 2009).
2.3.4. Substâncias pécticas
A pectina é um biopolímero de ocorrência natural que tem sido encontrado com
cada vez mais aplicações na indústria farmacêutica e de biotecnologia, sendo composto por
macromoléculas glicosídicas de alto peso molecular que constituem o maior componente da
lamela média (ALMEIDA et al., 2005; SUNDAR RAJ et al., 2012). A pectina é um
polissacárideo essencialmente linear e como a maioria dos outros polissacarídeos de
plantas, que é ao mesmo tempo polidispersa e polimolecular, a composição irá variar de
25
acordo com a fonte e as condições aplicadas durante o isolamento (SUNDAR RAJ et al.,
2012).
A composição e estrutura de pectina ainda não são completamente compreendidas,
embora a pectina tenha sido descoberta a mais de 200 anos (NOVOSEL'SKAYA et al.,
2000). A estrutura da pectina é muito difícil de determinar pois pode se alterar durante o
isolamento a partir de plantas, armazenamento e processamento de material vegetal
(NOVOSEL'SKAYA et al., 2000).
A pectina é caracterizada como uma mistura complexa de polissacarídeos ácidos
(KERTESZ, 1951), composto de unidades de ácido D-galacturônico (GalA)
(MUKHIDDINOV et al., 2000) unidos por meio de ligações glicosídicas α-1,4,
parcialmente esterificados por grupos metil éster (GUMMADI; PANDA, 2003) e parcial ou
completamente neutralizadas por uma ou mais bases (íons sódio, potássio ou amônio)
(GUMMADI; PANDA, 2003).
Na Figura 2.12, é possível observar um segmento de repetição da molécula de
pectina e seus grupos funcionais: (b) carboxilo; (c) éster; (d) amida na cadeia de pectina.
Figura 2.12 Um segmento de repetição da molécula de pectina e grupos funcionais: (b) carboxilo; (c) éster; (d) amida na cadeia de pectina (SUNDAR RAJ et al., 2012).
Ao contrário das proteínas, lipídeos e ácidos nucléicos, e por serem polissacarídeos,
as substâncias pécticas não possuem massa molecular definida (SAKAI et al., 1993)
podendo conter algumas centenas até cerca de 1000 unidades de sacarídeos, numa
26
configuração de cadeia semelhantes isto corresponde a pesos moleculares médios de cerca
de 50.000 a 150.000 daltons (SUNDAR RAJ et al., 2012). De acordo com Alkorta (1998), a
Sociedade Americana de Química (American Chemical Society) classifica as substâncias
pécticas em: protopectina, ácido pectínico, ácido péctico e pectina, sendo os três últimos
total ou parcialmente solúveis em água.
A protopectina é insolúvel em água e constitui a forma nativa unida com outros
constituintes das células vegetais e, em condições de hidrólise restrita, produzem ácidos
pectínicos ou pectina (ALKORTA et al., 1998; GUMMADI; PANDA, 2003). Ácido
péctico é uma designação aplicada à substâncias pécticas compostas de ácido
poligalacturônico coloidal, onde os grupos carboxilas estão essencialmente livres de grupos
metil éster e seus sais são pectatos neutros ou ácidos, dependendo do função do pH da
matriz (SAKAI et al., 1993). Ácido pectínico é um grupo de compostos contendo ácido
poligalacturônico coloidal com baixo grau de metoxilação (SAKAI et al., 1993;
WHITAKER, 1994).
Pectinas com alto teor de metoxilas (acima de 50%) são freqüentemente
denominadas apenas de “pectinas” e têm poder de geleificação na presença de açúcares e
ácidos, enquanto que a geleificação de pectinas com baixo teor de metoxilação é possível
na ausência de açúcares e na presença de alguns íons metálicos (GUMMADI & PANDA,
2003; ALKORTA et al., 1998).
2.3.5. Extrativos
Os extrativos dos materiais lignocelulósicos são compostos inorgânicos ou
orgânicos (terpenóides, ácidos graxos, flavonóides, esteróides e outros compostos
aromáticos) que ocorrem no material vegetal sem fazer parte dos elementos estruturais da
parede celular e que são, em geral, responsáveis pela cor, cheiro e resistência do material
sendo agrupados de acordo com a sua polaridade e estrutura química (LEWIN &
GOLDENSTEIN, 1991; HARTLEY & CLIVE, 1989; FENGEL & WEGENER, 1989;
GIL, 2008). Assim, de acordo com a sua polaridade, estes podem ser divididos em duas
frações. Uma fração lipofílica, na qual se encontram os terpenos e terpenóides, mas também
os lípidos, e uma fração hidrofílica da qual fazem parte os compostos fenólicos (FENGEL
27
& WEGENER, 1984; GIL, 2008). A presença dos extrativos ocorrerá em diferentes tipos e
concentrações de acordo com a parte da planta que está sendo analisada e que podem
incluir: cascas, folhas, frutos e sementes (FENGEL & WEGENER, 1989; ROWEL et al.,
2000).
De acordo com Baudel (1999), os extrativos interagem com reagentes utilizados nos
processos de hidrólise e delignificação da biomassa, bem como na quantificação da lignina
presente na mesma, acarretando resultados errôneos na caracterização do material. Segundo
Sluiter et al., (2010), estes componentes são facilmente extraídos com água ou solventes e
na biomassa podem contribuir de forma significativa, em até 30% ou mais, para o
fechamento do balanço de massa, o que poderá interferir com a subsequente caracterização
dos carboidratos e da lignina.
2.3.6. Outros constituintes
Muitas outras substâncias orgânicas e inorgânicas ocorrem nas paredes celulares,
em quantidades variáveis, dependendo do tipo de célula. Entre as orgânicas, destacam-se as
de natureza protéica e as de natureza lipídica, como cutina, suberina e ceras sendo que estas
últimas se encontram nos tecidos protetores superficiais da planta (FRANCO, 1997;
BUCKERIDGE & TINÉ, 2001).
2.4. PRÉ-TRATAMENTOS
A fermentação de açúcares fermentescíveis a etanol, ainda é seriamente restrita em
função do fato de a digestibilidade da celulose presente nos materiais lignocelulósicos ser
dificultada por sua físico-química, estrutura e composição, mas pode ser facilitada com
etapas prévias de pré-tratamentos (ALVIRA et al., 2010; WANG et al., 2014).
Apesar dos materiais lignocelulósicos constituírem uma excelente fonte de açúcares
hexoses (C6) e pentoses (C5), eles são considerados substratos complexos constituídos
basicamente de celulose e hemiceluloses recobertas por uma macromolécula aromática
complexa (lignina), formando a microfibrila celulósica, além de uma fração menor
remanescente representada por minerais e extrativos (ADEN et al., 2002; RABELO, 2008;
GÍRIO et al., 2010). Essa estrutura complexa caracteriza a recalcitrância do material
28
lignocelulósico, e torna difícil a sua despolimerização em açúcares fermentescíveis por
restringir a acessibilidade do material ao ataque enzimático (ADEN et al., 2002; PU et al.,
2013).
Menos de 20% da biomassa pode ser hidrolisada enzimaticamente sem um efetivo
pré-tratamento (HIMMEL et al., 2007; WALDRON et al., 2010). Dessa forma, a obtenção
do etanol de segunda geração inclui e necessita de três principais etapas: pré-tratamento,
hidrólise enzimática e fermentação (RUIZ et al., 2012). Assim, o pré-tratamento tem como
objetivo favorecer os processos seguintes de obtenção do etanol combustível,
principalmente a hidrólise enzimática (CARDONA et al., 2014).
Cada pré-tratamento deverá ser adequado ao tipo de material, e apresentará
vantagens e desvantagem sem a existência de um considerado “ideal” (GÍRIO et al., 2010).
Do ponto de vista econômico, os pré-tratamentos devem: melhorar a produtividade de
açúcares fermentescíveis, manter o conteúdo de carboidratos presentes, minimizar a
formação de produtos de degradação que são inibidores dos processos de fermentação e
serem rentáveis (SUN & CHENG, 2002).
Vários são os desafios envolvidos na eficiente despolimerização do material
lignocelulósico à açúcares fermentescíveis e dentre os principais está a cristalinidade da
celulose, que se apresenta em duas diferentes formas: amorfa e cristalina (COHEN et al.,
2005; KUMAR et al., 2008). Esta última é aquela que apresenta maior resistência aos
processos de degradação enzimática e microbianos (KUMAR et al., 2008).
O pré-tratamento é essencial para a obtenção de resultados viáveis do ponto de vista
econômico e tecnológico na produção de etanol (ROCHA et al., 2014). Os métodos de pré-
tratamentos utilizados devem ser adequados a cada tipo de biomassa, em função das suas
diferentes características físico-químicas (KARAGÖZ et al., 2012).
Os métodos de pré-tratamentos incluem, métodos físicos (mecânicos ou térmicos),
métodos químicos, métodos biológicos e, quando possível, a combinação de um ou mais
métodos (TALEBNIA et al., 2010). Sendo cada vez mais comuns estudos que se
concentram em investigar os chamados métodos híbridos que incorporam as vantagens de
diferentes pré-tratamentos (TAKARA & KHANAL, 2012).
O tratamento físico é representado principalmente pelas diversas formas de moagem
do material físico e age de maneira a aumentar a área de superfície acessível e diminuir a
29
cristalinidade da lignocelulose por lascar, moer ou irradiar o material (MARGEOT et al.,
2009; SAHA et al., 2013) o que facilitaria inclusive o efeito dos pré-tratamentos posteriores
(SUN & CHENG, 2002). Entretanto, a quebra física pode representar em muitos casos um
gasto mais intensivo de energia tornando o processo caro e dispendioso (Alvira et al.,
2010).
Os métodos térmicos incluem: a explosão à vapor, extração com água quente
(LHW), explosão de fibra com amônia (AFEX). Enquanto que os métodos químicos são
representados principalmente pela hidrólise alcalina, extração por solventes e hidrólise
ácida (SUN & CHENG, 2002). Os pré-tratamentos causam efeitos como: alteração das
características estruturais da celulose (cristalinidade e grau de polimerização); dissociação
do revestimento formado pela hemicelulose e lignina em torno da celulose, o que
proporciona maior adesão das enzimas à mesma; aumento da área superficial do material e
ainda a solubilização ou redistribuição da lignina (DOMINGUEZ, 2003; PEJÓ, 2010,
SAHA et al., 2013).
Na Tabela 2.2, é possível verificar as principais características dos pré-tratamentos
aplicados à biomassa. Na Figura 2.13, são mostrados os diferentes tipos de pré-tratamentos
utilizados para a produção de etanol de segunda geração.
Figura 2.13 Diferentes pré-tratamentos (adaptado de SINGH et al., 2014).
30
De acordo com Dominguez (2003), um pré-tratamento deve possuir baixo custo
energético e baixo investimento, utilizar reagentes baratos e facilmente recuperáveis e ser
aplicável a diversos substratos. Dentre aqueles que têm mostrado vantagens do ponto de
vista técnico-econômico, estão aqueles realizados com água quente que são considerados
ambientalmente limpos desde que não utilizem químicos, o que evitaria processos de
corrosão e a liberação de componentes tóxicos (ROCHA et al., 2014). Entretanto, a
associação desses métodos a ácidos diluídos tem sido observada com atenção em função
dos bons resultados de hidrólises enzimáticas posteriores, apesar liberação de substâncias
inibidoras da fermentação (CAO et al., 2012).
Quando a biomassa é submetida a condições extremas de temperatura, pressão ou
ainda na presença de ácidos são liberados componentes tóxicos que dividem-se em três
grupos (LARSSON, 2000): derivados do furano, ácidos alifáticos de baixo peso molecular
e derivados fenólicos (DOMINGUEZ, 2003).
31
Tabela 2-2 Características dos principais pré-tratamentos aplicados a biomassa (Adaptado de ZHU, 2005).
Pré-tratamento Mudanças na composição da biomassa
Vantagens Desvantagens Referência Celulose Hemicelulose Lignina
Moinhos de bolas Diminuição do grau
de cristalinidade Não houve Não houve
Redução da cristalinidade
Alto consumo de energia
CHANG & HOLTZAPPLE, 2000; KOULLAS et al., 1990
Explosão à vapor Pouca
despolimerização 80-100% de
remoção
Pouca remoção Maior
redistribuição
Eficiente energeticamente
Degradação das xilanas com produto
inibitório
GRETHLEIN & CONVERSE, 1991
Ácido diluído Pouca
despolimerização 80-100% de
remoção
Pouca remoção Maior
redistribuição
Obtenção de alto rendimento em xilose
Difícil recuperação do ácido, corrosivo e de custo relativamente
elevado
TORGET, 1991; GRETHLEIN &
CONVERSE, 1991
AFEX Diminuição do grau
de cristalinidade >60% de
solubilização 10-20% de
solubilização
Menor perda de xilanas, sem formação de inibidores
Recuperação de amônia
DALE & MOREIRA, 1982; HOLTZAPPLE et
al., 1991
Hidróxido de sódio
Inchaço significativo Considerável solubilização
>50% de solubilização
Remoção efetiva de ésteres
Reagente caro, recuperação alcalina
MILLETT et al., 1976
Ozonólise Quase nenhuma
despolimerização Pequena
solubilização Solubilização acima de 70%
Deslignificação em condições suaveis
Custo alto, requer grande quantidade de
ozônio
VIDAL & MOLINIER, 1988
Organosolv Considerável inchaço Solubilização
quase completa Solubilização
quase completa
Elevada redução de xilose e efetiva deslignificação
Elevado custo para recuperação do
solvente CHUM et al., 1988
Biológico 20-30% de
despolimerização >80% de
solubilização ~ 40% de
solubilização Baixo uso de energia
Perda de celulose e baixa traxa de
hidrólise
KIRK & FARREL, 1987; DATTA, 1981
32
2.4.1. Pré-tratamento com ácidos diluídos
Existem vários métodos para pré-tratamentos, mas o realizado com ácido diluído
ganhou uma importância considerável ao longo dos últimos 20 anos e é considerado um
dos mais eficientes e com custos relativamente reduzidos (SANNIGRAHI et al., 2011). Pu
et al. (2008) e Yang & Wyman, ( 2008) afirmam que este tipo de pré-tratamento é capaz de
solubilizar as hemiceluloses e, mesmo não dissolvendo a lignina presente, a torna inativa o
que permite uma ação mais efetiva das enzimas sobre a celulose.
O pré-tratamento com ácido diluído é um método aplicado a uma ampla variedade
de biomassas (folhosas e resinosas de gramíneas, resíduos agrícolas e resíduos sólidos
urbanos) (ZENG et al., 2009). Neste tipo de tratamento são empregadas temperaturas
elevadas acima de 100ºC e concentrações de ácidos menores que 2% (m/v) (ZENG et al.,
2009). Por ter efetivo resultado para diferentes materiais apresenta alto potencial para
aplicação industrial (ROCHA et al., 2011).
Este método permite uma alta taxa de recuperação da hemicelulose (80-90%) na
forma de xilose principalmente e uma alta taxa de conversão da celulose pela hidrólise
enzimática (em torno de 90%). O ácido mais comumente utilizado é o ácido sulfúrico
(H2SO4), devido ao seu menor preço e poucos problemas com corrosão quando comparado,
por exemplo, ao ácido clorídrico (HENDRIKS & ZEEMAN, 2009). Dessa forma, o ácido
sulfúrico pode ser aplicado em baixas concentrações (HARUN & DANQUAH, 2011). O
pré-tratamento com ácido têm se mostrado preferido por proporcionar uma maior eficiência
na conversão de materiais lignocelulósicos (RABELO et al., 2009). Durante o pré-
tratamento com ácidos, vários fatores influenciarão significativamente a quantidade total de
açúcares fermentescíveis liberados como: tempo de processamento, temperatura, carga de
sólidos e concentração de ácido (SAHA et al., 2013).
Na maioria dos estudos envolvendo o pré-tratamento com ácido diluído, a eficiência
do pré-tratamento é medido pela digestibilidade da biomassa pré-tratada, e pouca atenção é
dada para os outros atributos de um bom processo de pré-tratamento, tal como a limitação
da formação de compostos inibidores da hidrólise enzimática ou da fermentação
subsequente (DJIOLEU et al., 2012). Além disso, durante muito tempo o açúcar de
interesse foi apenas a glicose (CHUNG et al, 2005;. SAHA et al, 2005). Entretanto para
33
melhorar os custos globais de operação em se tratando de biorrefinaria, é necessário
considerar também os açúcares de hemicelulose, especialmente a xilose, que também pode
ser convertida à etanol por microrganismos apropriados (CHUNG et al, 2005;. SAHA et al,
2005).
A formação de compostos inibidores durante o pré-tratamento com ácidos diluídos à
altas temperaturas é tida como uma das principais desvantagens deste método, pois tais
produtos como o furfural e hidroximetil furfural (HMF) são tóxicos para a hidrólise
enzimática e para os microrganismos fermentativos (AVCI et al., 2013; SAHA et al., 2013).
Esses compostos são, em sua maioria provenientes da desidratação dos açúcares
pentoses (xilose e arabinose) e hexoses (glucose e galactose), respectivamente (RIANSA-
NGAWONG & PRASERTSAN, 2011). A taxa de desidratação dos açúcares e consequente
liberação de inibidores está diretamente relacionada com a temperatura, concentração de
ácido e duração do pré-tratamento (RIANSA-NGAWONG & PRASERTSAN, 2011;
SAHA et al., 2013). Após o pré-tratamento com ácido, o pH deve ser ajustado para a
atividade ótima das enzimas hidrolíticas, o que leva à presença de sais que poderão ser
prejudiciais para a fermentação (SAHA et al., 2013).
Segundo OLSSON & HAHN-HÃGERDAL (1996), os inibidores da fermentação
presentes em um hidrolisado lignocelulósico provenientes da hidrólise ou pré-hidrólise
podem estar divididos em:
- Grupo 1) Substâncias liberadas durante a pré-hidrólise e hidrólise: ácido acético,
que é liberado pela degradação da hemicelulose e os extrativos, como os terpenos, álcoois e
compostos aromáticos, como os taninos;
- Grupo 2) Subprodutos da degradação dos açúcares durante a pré-hidrólise e
hidrólise: furfural, 5-Hidroximetilfurfural, ácido levulínico, ácido fórmico e substâncias
húmicas;
- Grupo 3) Produtos de degradação da lignina: incluem compostos aromáticos e
poliaromáticos com uma variedade de constituintes;
- Gurpo 4) Produtos da fermentação: etanol, ácido acético, glicerol e ácido lático;
- Grupo 5) Metais liberados dos equipamentos usados na hidrólise e os aditivos,
como o SO2.
34
A Figura 2.14 apresenta os produtos de degradação passíveis de serem gerados em pré-tratamentos ácidos.
Figura 2.14 Liberação de produtos de degradação a partir dos carboidratos da biomassa durante o pré-tratamento com ácidos (Adaptado de SHUAI et al., 2010).
Os diferentes inibidores que são gerados podem afetar severamente a fermentação,
assim, um processo de detoxificação adicional é necessário para a obtenção de um elevado
rendimento, o qual é acompanhado com alguma perda de açúcar (QURESHI et al. , 2010).
A detoxificação pode ser realizada por meios físicos, químicos ou biológicos
(PALMQVIST e HAHNHÄGERDAL, 2000). De acordo com Chandel et al. (2011), a
remoção poderia ser realizada através de métodos físicos como a evaporação que remove
compostos voláteis, tais como ácido acético, furfural e vanilina ou ainda pelo uso de
membranas que ajudam na redução do tempo de separação. Para os métodos químicos, são
citadas estratégias, como neutralização, supercalagem com hidróxido de cálcio, utilização
de resinas de troca iônica, carvão ativado e extração com acetato de etila.
Um ponto importante a ser considerado durante o pré-tratamento com ácidos
diluídos são as reações que ocorrem com cada um dos principais componentes da biomassa
em meio ácido. De acordo com Holtzapple (1985), a Figura 2.15 mostra como a celulose
(a) é hidrolisada de maneira aleatória dentro do polímero para formar glicose solúvel (b).
Na mesma figura, é possível verificar a perda de três moléculas de água para a
transformação da glicose em 5-hidroximetilfurfural (c). Assim para Holtzapple (1985), são
35
observadas três vias de degradação do 5-hidroximetilfurfural; na primeira, o componente se
polimeriza e forma uma resina de cor marrom de estrutura desconhecida; na segunda, o
componente se divide para formar ácido levulínico (d) e ácido fórmico (e). Existe uma
terceira via para a degradação do hidroximetilfurfural, mas ocorre só a concentrações
ácidas fortes (~15M H2SO4) no qual o formaldeído (f) é clivado ao 5-hidroximetilfurfural e
em seguida resulta em furfural (g).
Figura 2.15 Degradação da celulose (HOLTZAPPLE, 1985).
A degradação ácida das hemiceluloses é discutida, em geral, com base na
degradação da xilana, que é o principal representante da classe. De acordo com Holtzapple
(1985), durante este processo, a xilana (a) é hidrolisada a xilose (b). Em seguida ocorre a
perda de três moléculas de água o que gera a degradação da xilose em furfural (c). Em
condições extremas de hidrólise, o furfural forma uma resina. Na Figura 2.16, é possível
observar as etapas de degradação da xilana.
36
Figura 2.16 Degradação da xilana (HOLTZAPPLE, 1985)
De acordo com Holtzapple (1985), a degradação da lignina em meio ácido tem
como tem como principal reação a quebra das ligações α e β. Na Figura 2.17, é possível
observar o efeito do ácido na quebra de ligações da lignina durante o tratamento com
ácidos.
Figura 2.17 Mecanismo de degradação em meio ácido – quebra da ligação β-O-4 (FENGEL E WEGNER, 1989).
37
Na Figura 2.18, é mostrado um modelo que representa as reações de hidrólise e as
prováveis alterações observadas no estrutura supramolecular do material lignocelulósico
durante a hidrólise com ácidos diluídos.
Figura 2.18 Modelo que representa as reações de hidrólise e as prováveis alterações observadas na estrutura supramolecular do material lignocelulósico durante a hidrólise com ácidos diluídos (Adaptado de HU, 1980).
Um importante aspecto do tratamento com ácido diluído é o chamado fator de
severidade (R0) que foi introduzido a partir do processo de polpação e que era usado como
um indicador do nível de severidade do pré-tratamento aplicado na indústria de papel e
celulose e que foi trazido para avaliar os pré-tratamentos realizados para a biomassa. Este
termo foi definido como uma função do tempo de reação (t, min) e temperatura (T, °C)
(OVEREND et al., 1987), como mostra a Equação 2.2.
−=
75,14exp.log)log( refTT
tRo (2.2)
38
Se o efeito do pH for incorporado no caso de condições ácidas de pré-tratamento,
passa a ser denominado como grau de severidade combinado (CHUM et al., 1990) e é
calculado pela Equação 2.3:
pHRoCS −= )log( (2.3)
Sendo para as equações 2.2 e 2.3:
Log (Ro) = Fator de severidade
t = tempo de reação (minutos)
T= Temperatura (°C)
Tref = 100°C
2.5. DESLIGNIFICAÇÃO ALCALINA COM NaOH
O pré-tratamento alcalino pode ser realizado como uma etapa complementar à pré-
tratamentos ácidos, em um processo similar à polpação sódica realizada na indústria de
papel, porém em condições menos severas (no máximo 4% de soda a 70°C) (SILVA, 2009;
REZENDE et al., 2011).
O pré-tratamento alcalino tem sua ação na remoção da lignina e foi usado
inicialmente para melhorar a digestibilidade de biomassas usadas como ração animal
(REZENDE et al., 2011). Este pré-tratamento utiliza diversas bases incluindo hidróxido de
sódio, hidróxido de cálcio, hidróxido de potássio e amônia e permite um maior acesso das
enzimas à celulose e hemiceluloses presentes na biomassa (ZHENG et al., 2009).
O NaOH quando comparado com outros agentes alcalinos como carbonato de sódio,
hidróxido de amônia, hidróxido de cálcio e peróxido de hidrogênio é aquele que permite
maiores índices de degradação e subseqüente fermentação (RODRÍGUEZ-VÁZQUEZ et
al., 1992; RODRÍGUEZ-VÁZQUEZ et al., 1994).
Durante o pré-tratamento com hidróxido de sódio (NaOH), as ligações éster entre
hemiceluloses e lignina são rompidas o que leva a um aumento na porosidade do material,
além de outros efeitos como a intumescência da biomassa, aumento da área superficial
39
interna, diminuição do grau de polimerização da celulose, redução da cristalinidade da
celulose e ruptura da estrutura da lignina ocasionada pela quebra das ligações α-aril-éter
dos monômeros polifenólicos (JACKSON, 1977; SUN & CHENG, 2002; SUN et al.,
2004). A dissolução da hemicelulose e inchamento da celulose são também conseqüências
do enfraquecimento e quebra das ligações de hidrogênio (JACKSON, 1977; SUN &
CHENG, 2002; SUN et al., 2004). Quando comparados com os pré-tratamentos ácidos, os
métodos alcalinos apresentam a vantagem de utilizarem condições moderadas de operação,
em termos de temperatura e pressão, com a possibilidade de ser realizado em temperatura
ambiente (ZHENG et al., 2009; KUMAR et al., 2009).
A deslignificação realizada com a utilização de NaOH, mostra excelentes resultados
quando associada ao peróxido de hidrogênio, o que proporciona uma eficiente remoção da
lignina e ainda permite a solubilização da hemicelulose. Essa associação ocorre em função
da ação do ânion hidroperóxido (HOO.) que é formado em pH alcalino, que corresponde à
principal espécie ativa no peróxido. Em meio alcalino, também ocorre a decomposição do
peróxido em radicais hidroxila (OH.) e superóxido (OO.) que são os responsáveis pela
oxidação da estrutura da lignina (RABELO, 2007).
Durante a deslignificação da biomassa com NaOH ocorre o processo denominado
de hidrogenólise que, de acordo com Pandey et al. (2011), é o processo no qual ocorre a
clivagem de ligações carbono-carbono pela reação com o hidrogênio. De acordo com os
mesmos autores, a associação do tratamento térmico na presença do hidrogênio parece ser
muito promissor para o favorecimento da produção de combustíveis líquidos e produtos
químicos como fenóis (PANDEY et al. 2011). Neste processo ocorrem reações que
envolvem a remoção da ampla funcionalidade das subunidades de lignina para formar
compostos monoméricos simples, tais como fenóis, benzeno, tolueno, ou xileno
(ZAKZESKY et al. 2011).
Gurgel (2007) observou que o tratamento de bagaço de cana-de-açúcar com
soluções de NaOH provocaram a hidrólise e a degradação de ligninas e hemiceluloses.
Observou que concentrações de 20% de NaOH não atuam somente como um reagente de
degradação destes materiais, mas também podem atuar como um solvente de decomposição
destes tipos de materiais, o que facilita a eliminação da lignina e da hemicelulose presente.
40
Miller et al. (2002) observaram que o excesso molar de uma base forte como NaOH
mostra bons resultados quando utilizada sozinha, mas que também pode ser eficiente
quando utilizada em pequena quantidade em associação com uma quantidade maior de um
agente menos dispendioso como o CaO (óxido de cálcio).
2.6. HIDRÓLISES
O efetivo aproveitamento dos carboidratos presentes em biomassas só ocorre nas
suas formas monoméricas, que são os materiais mais importantes que podem ser utilizados
diretamente como matéria-prima para a produção de produtos químicos de base biológica
(SROKOL et al., 2004). Vários métodos foram propostos para hidrólise do material
celulósico, com o ponto em comum de que este material deve ser preliminarmente
quebrado mecanicamente para aumentar sua área superficial (LJUNGDAHL &
ERIKSSON, 1985; OGEDA & PETRI, 2010). Duas vias catalíticas para a conversão da
biomassa, principalmente celulose, estão sendo estudadas de forma mais ampla, a primeira
é o uso de hidrólise química e a segunda é a hidrólise enzimática do material pré-tratado
(TAHERZADEH & KARIMI, 2007; GUO et al., 2012). Ambas permitirão a obtenção dos
açúcares simples para a produção do etanol de segunda geração (SUN & CHENG, 2002;
KUMAR & WYMAN, 2009). Em ambos os casos, vários modos de operação poderão ser
utilizados. A escolha será baseada em várias considerações como: o produto bruto que será
usado, o microrganismo usado para a fermentação dos açúcares liberados e a conveniência
econômica do mesmo (OGEDA & PETRI, 2010). No presente trabalho, a ênfase será dada
à hidrólise enzimática, visto ter sido o processo utilizado no decorrer do mesmo.
2.6.1. Hidrólise ácida
Hidrólise direta de biomassa lignocelulósica com ácido inorgânico remonta ao
início do século 19 e sua comercialização no início do século 20 (NANJING FORESTRY
INSTITUTE, 1961). Assim, a hidrólise ácida é considerada um método antigo e que foi
operado primeiramente em países como Alemanha, Japão e Estados Unidos (GALBE &
ZACCHI, 2002).
41
A hidrólise ácida de materiais lignocelulósicos, e a subseqüente fermentação do
hidrolisado para obter etanol, tem sido considerada uma alternativa importante para
produzir etanol em larga escala (RODRIGUES, 2007). Este método pode ser realizado de
duas maneiras: (a) hidrólise com ácido concentrado e (b) hidrólise com ácido diluído
(BALAT, 2011), sendo que, o ácido sulfúrico têm sido o mais investigado e utilizado
industrialmente, embora outros ácidos, tais como o HCl, também tenham sido utilizados
(TAHERZADEH & KARIMI, 2007).
De acordo com Parisi (1989), os ácidos minerais atuam de maneira simples e
rápida, nas frações de polissacarídeo da matriz vegetal. Durante a hidrólise ácida, o agente
químico entra em contato com a estrutura da celulose, a qual é levada a um inchamento e
quebra das suas ligações glicosídicas (GUO et al., 2012). Em temperaturas relativamente
baixas, em torno de 50°C, e pressão atmosférica, a celulose incha quando a concentração de
ácido sulfúrico é superior a 50% (GUO et al., 2012).
Camacho et al. (1996) estudaram o efeito da concentração de H2SO4 [31 a 70%
(m/v)] na taxa de solubilização da celulose microcristalina e observaram solubilização total
da celulose quando a sua concentração era superior a 62% (m/v). Durante a hidrólise ácida,
as ligações glicosídicas presentes na celulose são rompidas e podem sofrer hidratação, o
que leva a formação no hidrolisado de muitos intermediários, tais como celuloses
hidrolisadas, que se assemelham a amidos, dextrina, oligossacarídeos e D-glicose (GUO et
al., 2012). Em seguida, os intermediários são convertidos em ésteres de açúcar ou produtos
de degradação, tais como aldeídos e furfurais (GUO et al., 2012).
O uso de ácido concentrado permite baixo consumo de energia em função do uso de
condições amenas de temperatura e pressão (30 a 50°C). No entanto, necesssita de atenção
rigorosa ao teor de umidade da matéria-prima que será utilizada (SAEMAN et al., 1945).
As principais desvantagens da hidrólise ácida são: formação de produtos de
degradação dos açúcares, que apresentam efeitos inibitórios à fermentação; necessidade de
recuperação do ácido utilizado, neutralização do hidrolisado e utilização de equipamentos
caros que resistam ao processo de corrosão durante o processo (KLINKE et al., 2003;
MARTÌN et al., 2007).
A hidrólise ácida tem início com a protonação do oxigênio glicosídico (Figura 2.19)
com posterior quebra da ligação C1–O (MENDGEN & DEISING, 1993; DANIEL, 1994).
42
O carbocátion gerado na etapa b é estabilizado pela deslocalização do par de elétrons
existente sobre o oxigênio do anel glicosídico, adjacente a C1 (MENDGEN & DEISING,
1993; DANIEL, 1994). O ataque nucleofílico da água sobre C1 (Figura 2.19) com
regeneração do ácido encerra a etapa de despolimerização (se esta ocorrer no interior da
cadeia da celulose, gerando novos terminais) ou de produção de glicose (quando ocorre
hidrólise diretamente nos terminais) (MENDGEN & DEISING, 1993; DANIEL, 1994).
Figura 2.19 Mecanismo de hidrólise da celulose catalisada por ácido. (Adaptada de Daniel, 1994).
2.6.2. Hidrólise enzimática ou sacarificação
Em função da produção de etanol de segunda geração, têm-se dado maior atenção à
eficiência e ao custo do processo de hidrólise enzimática, o qual é utilizado para conversão
de materiais lignocelulósicos em açúcares monoméricos ou fermentescíveis (LARABI et
al., 2013; AMIRI et al., 2014). No processo de sacarificação, são obtidos açúcares simples a
43
partir de carboidratos complexos como amido, celulose, hemicelulose, pectina, entre outros
(KARIMI et al., 2006).
A hidrólise enzimática de materiais lignocelulósicos têm sido amplamente estudada
em função das vantagens que ela apresenta como processo: alta especificidade de reação,
não apresenta reações secundárias, que poderiam levar a perdas de rendimento, não há
formação de inibidores da fermentação alcoólica e pode ser realizada em condições de
processo mais amenas (pH de 4,8 e temperatura entre 46 e 51°C) e sem condições
corrosivas para os equipamentos (BASTOS, 2007; ALVIRA et al., 2010) o que pode levar
a custos de operação menores quando comparada com a hidrólise química (ALVIRA et al.,
2010). No entanto, o custo das enzimas é ainda relativamente alto para obtenção de
produtos com valor agregado como os biocombustíveis o que requer pesquisas no sentido
de seu barateamento, assim como, no desenvolvimento dos processos de hidrólise para
diminuir a quantidade de enzima utilizada (ALVIRA et al., 2010).
Em geral, no processo de obtenção do etanol de segunda geração a hidrólise
enzimática encontra-se associada a métodos de pré-tratamentos, que alteram a estrutura da
parede celular do material e reduzem a recalcitrância da estrutura dos materiais
lignocelulósicos com o objetivo de tornar a hidrólise eficiente (KARIMI et al. , 2013).
Quando realizada para materiais lignocelulósicos pode ser um processo lento, por
ser prejudicada pelas características estruturais do substrato, tais como o conteúdo de
lignina e hemicelulose, a área de superfície e a cristalinidade da celulose (ALVIRA et al.,
2010). Em geral encontra-se associada a métodos de pré-tratamentos, que “abrem” o
material e reduzem a recalcitrância da estrutura dos materiais lignocelulósicos com o
objetivo de tornar a hidrólise eficiente (KARIMI et al. , 2013).
De acordo com Abels et al. (2013), durante o processo de hidrólise, a remoção dos
açúcares simples produzidos pela degradação da celulose e hemicelulose seria uma etapa
fundamental para minimizar os efeitos de inibição enzimática pela presença do excesso de
produto o que melhoraria a atividade das enzimas utilizadas.
O processo de hidrólise enzimática ainda não é totalmente esclarecido e ainda
experimenta, como comentado acima, o entrave do relativo alto custo das enzimas
utilizadas. Porém, já em 2008 (TAYLOR, 2008) se mostrava promissor para a produção de
etanol de segunda geração.
44
Segundo Maki et al. (2009) para que um complexo celulolítico seja considerado
ideal deve apresentar as seguintes condições: operação em temperatura e pH brandos; ajuste
correto na quantidade das diferentes enzimas componentes, o que garantiria uma ação
sinérgica entre elas; elevada especificidade; tolerância ao produto de hidrólise; alta
estabilidade a pH e temperaturas ótimos e alta atividade em substratos insolúveis. De
acordo com Van Dyk & Pletschke (2012) as principais enzimas envolvidas na degradação de
materiais lignocelulósicos a monômeros podem ser observados na Tabela 2.3.
Tabela 2-3 Algumas das principais enzimas envolvidas na degradação de materiais lignocelulósicos a monômeros (VAN DYK & PLETSCHKE, 2012). Lignina Lacase, Manganase peroxidase, Lignina
peroxidase
Pectina Pectina metill esterase, pectato liase, poligalacturonase, ramnogalacturona liase
Hemicelulose
Endo-xilanase, acetil xylana esterase, β-xilosidase, endo-mannanase, β-mannosidase, αL-arabinofuranosidase, αglucuronidase, acido ferulico esterase, α-galactosidase, acido p-coumarico esterase
Cellulose Celobiohidrolase (exoglucanase), endoglucanase, β-glucosidase
Nesta revisão serão, consideradas apenas para as enzimas degradadoras da
celulose, pois foram aquelas que foram utilizadas neste trabalho. As glicosidases são o
principal grupo de enzimas que realiza a degradação da celulose através da clivagem das
ligações glicosídicas, processo do qual provém sua energia livre. Esse grupo de enzimas
apresenta uma complexa estrutura molecular constituída por uma seqüência de aminoácidos
hidrofóbicos não-catalíticos – carhohydrate- binding modules (CBM) – que se ligam aos
terminais redutores dos polissacarídeos. Os CBM são capazes de aumentar a taxa de
hidrólise do módulo catalítico das glicosidases (VIEGAS, 2008; MCCARTNEY et al.,
2006); esses grupos envolvem as microfibrilas amorfas e cristalinas de celulose, o que
leva a uma facilitação da hidrólise enzimática (PINTO et al., 2008 e MCCARTNEY et al.,
45
2006). A degradação da celulose já foi mencionada no item 2.3.1 e de acordo com Peterson
et al. (1978) pode ser descrita em três etapas (Figura 2.20):
Figura 2.20 Degradação esquemática da celulose por celulases
Os fatores que afetam a atividade da celulase são a concentração do substrato,
inibição pela presença dos produtos finais, temperatura de reação e pH (KIM & DALE,
2004). Outro ponto importante é que a presença de celobiose pode inibir a atividade da
celulase, o que torna sua remoção um importante fator para maior efetividade da hidrólise
(ZHANG et al., 2010; GUO et al., 2012). Na Figura 2.21, é observado o modo de ação das
celulases.
Figura 2.21 Modo de ação das glicosidases (JIMENÉZ, 2013).
46
A hidrólise enzimática pode ser realizada em processo simultâneo com a
fermentação. Todavia, a diferença de temperatura entre os processos é um dos principais
fatores que limitam a obtenção eficiente de produtos quando realizados em um mesmo
processo (MARQUES et al., 2008). Segundo Krishna (2000) a hidrólise enzimática é
superior à hidrólise ácida, em vários aspectos, como mostra a Tabela 2.4.
Tabela 2-4 Comparação entre hidrólise enzimática e hidrólise ácida (KRISHNA et al., 2000).
Parâmetro Hidrólise ácida Hidrólise enzimática
Pré-tratamento Pode ser necessário Necessário
Taxa de hidrólise Rápida (min.) Lenta (h)
Temperatura Alta (200°C) Baixa (45°C)
Pressão Alta Atmosférica
Rendimento Depende do material e dos
detalhes do processo
Depende do material e dos
detalhes do processo
Formação de subprodutos Provável formação Não há formação
2.7. FERMENTAÇÃO
O processo de fermentação apresenta um grande potencial do ponto de vista
industrial para a produção de importantes compostos ligados a indústria química e de
energia, tais como ácido lático (REDDY et al., 2008), etanol combustível (HAHN-
HA¨GERDAL et al., 2006) e hidrogênio (GUO et al., 2010).
A fermentação alcoólica é um processo biológico que ocorre no citoplasma no qual
açúcares são convertidos em álcool. Neste processo as leveduras principalmente,
descarboxilam o ácido pirúvido à CO2 + acetaldeído pela ação da enzima piruvato
descarboxilase. Em seguida, o acetaldeído formado é reduzido pela álcool-desidrogenase à
etanol, enquanto o NADH (nicotinamida adenina dinucleótido - forma reduzida) é oxidado
a NAD+ (CAMPOS, 2002). Na Figura 2.22, é mostrado um esquema simplificado da
fermentação alcoólica.
47
Figura 2.22 Esquema simplificado da fermentação alcoolica (adaptado de CAMPOS, 2002).
As leveduras de maior interesse industrial são as espécies Saccharomyces
cerevisiae, Saccharomyces uvarum (carlsbergensis), Schizosaccharomyces pombe, e
Kluyveromyces. Uma ótima conversão de açúcares a etanol requer das cepas de leveduras
capacidade para tolerar altas concentrações de etanol, dado que o etanol inibe o crescimento
e a fermentação (MELO, 2008).
A Saccharomyces cerevisiae é a mais utilizada em função de sua robustez, sendo
considerada para a fermentação dos hidrolisados lignocelulósicos. Esta levedura é capaz de
fermentar a glicose, manose e frutose bem como os dissacarídeos sacarose e maltose,
porém é incapaz de fermentar a xilose em função de sua inabilidade de produzir enzimas
que convertam a xilose em xilulose, a qual é passível de ser fermentada pelo S. cerevisiae
(BALAT, 2011). Este microrganismo é caracterizado como aeróbio facultativo, o que faz
com que o mesmo apresente a habilidade de se adaptar às condições ambientais. Durante o
processo de fermentação alcoólica, parte do açúcar é transformada em biomassa (CO2 e
H2O) em ambiente de aerobiose e a maior parte é convertida em etanol em anaerobiose, o
que dependerá das condições empregadas (AQUARONE, 2001).
48
A produção do etanol de segunda geração a partir de materiais lignocelulósicos tem
como etapa essencial a fermentação, na qual os açúcares, principalmente glicose e xilose,
serão convertidos em álcool por microrganismo por bactérias, leveduras ou fungos
filamentosos (MUSSATO & ROBERTO, 2004; HAHN-HA¨GERDAL et al., 2006).
Todavia a realização eficiente e economicamente viável deste processo enfrenta alguns
obstáculos como a presença dos chamados inibidores da fermentação provenientes dos
processos de pré-tratamentos aplicados à biomassa, e das limitações da fermentação das
pentoses, principalmente da xilose (LIN & TANAKA, 2006).
De acordo com Mussato & Roberto, 2004 os compostos tóxicos da fermentação
podem estressar os microrganismos, o que reduziria o eficiente aproveitamento dos
açúcares causando a conseqüente redução nos níveis de produtos formados. Os tipos de
compostos tóxicos formados e sua concentração nos hidrolisados lignocelulósicos irão
depender da matéria-prima utilizada e das condições operacionais empregadas na hidrólise
(MUSSATO & ROBERTO, 2004). Além disso algumas variáveis da fermentação - tais
como as condições fisiológicas da célula, concentração de oxigênio dissolvido e pH do
meio – também estão em muitos casos associados com a toxicidade desses compostos,
muitas vezes acentuando seu efeito tóxico (TAHERZADEH et al., 2000).
Na tentativa de reduzir os problemas observados pela presença dos inibidores
gerados, são cada vez maiores as aplicações dos métodos de detoxificação, incluindo
biológicos, físicos e mecânicos para converter os inibidores em compostos menos tóxicos e
reduzir suas concentrações nos hidrolisados (MUSSATO & ROBERTO, 2004).
Outro importante ponto a ser considerado no processo de fermentação dos açúcares
obtidos a partir da hidrólise dos materiais lignocelulósicos é aquele relacionado com a das
pentoses. O desenvolvimento de microrganismos robustos e capazes de realizar uma
eficiente fermentação das pentoses (C5) e hexoses (C6), como a Pichia stipitis, Candida
shehatae e Pachysolan tannophilus, associada a melhoria genética do Saccharomyces
cerevisiae, ao qual foi introduzida a xilose redutase e a xilitol desidrogenase, permitiu
ultrapassar algumas das limitações apresentadas ao processo de fermentação dos
hidrolisados para a obtenção do etanol de segunda geração (VAN ZYL et al., 1998;
CHANDEL et al., 2007; TOMÁS-PEJÓ et al., 2008; LIMAYEM et al., 2012).
49
As características necessárias para um microrganismo industrialmente adequado
resumem-se na Tabela 2.5.
Tabela 2-5 Características importantes para o processo de fermentação de bioetanol (DIEN et al., 2003).
Característica Requisitos
Produção de bioetanol > 90% do valor teórico
Tolerância ao bioetanol > 40 g L-1
Produtividade de bioetanol > 1 g L-1h-1
Crescimento robusto e requisitos de crescimento simples Formulação de meios de cultura pouco dispendiosa
Capacidade de crescimento em hidrolisado não diluído Resistência a inibidores
Condições que minimizem a produção de Contaminantes
pH ácido ou temperaturas mais elevadas
De acordo com Hamelinck et al. (2005), a produção máxima teórica de etanol é de
0,51 kg de etanol e de 0,49 kg de dióxido de carbono por kg de açúcar fermentado de
acordo como segue:
Fermentação de pentoses em etanol:
3 C5H10O5 → 5 C2H5OH + 5 CO (2.4)
1 kg 0,51 kg 0,49 kg
Fermentação de hexoses em etanol:
C6H12O6 → 2 C2H5OH + 2 CO (2.5)
1 kg 0,51 kg 0,49 kg
Os microorganismos fermentadores de xilose são encontrados entre bactérias,
leveduras e fungos filamentosos (SKOOG & HAHN-HA¨GERDAL, 1988). Porém, as
bactérias fermentadoras da xilose têm demonstrado o problema de sofrerem inibição na
presença de baixas concentrações de etanol (TAHERZADEH et al., 2000). Além disso, a
fermentação alcoólica ocorre com a formação de alguns compostos secundários, tais como:
50
ácidos carboxílicos, metanol, ésteres, aldeídos e álcoois superiores, que também reduzem a
produção de etanol (NOVAES, 1994; DESAI et al., 2004).
2.8. CONCLUSÕES PARCIAIS
Neste capítulo foi mostrado o grande potencial das biomassas lignocelulósicas para
a produção de etanol combustível, em função da grande quantidade de carboidratos
passíveis de conversão em açúcares fermentescíveis. Além de ser uma fonte renovável, de
baixo custo e que em sua maioria são resíduos de processos industriais. Dentre as
biomassas pode-se destacar o caroço de açaí, resíduo comumente encontrado na região
Norte do Brasil, como um incoveniente poluidor urbano, mas que tem demonstrado
potencial de aproveitamento para construção civil e queima. Todavia, nenhum relato de sua
aplicação na produção de etanol foi encontrado na literatura consultada. Nesse sentido, o
grande conhecimento do processo de obtenção do etanol de segunda geração, o qual inclui
as etapas de pré-tratamentos, hidrólises e fermentação, permite que o caroço de açaí possa
ser utilizado como matéria-prima alternativa às biomassas convencionais e ainda com o seu
aproveitamento econômico-ambiental.
51
CAPÍTULO 3 – MATERIAIS E MÉTODOS
Neste capítulo 3, são apresentados os materiais e metodologias experimentais
utilizados nesta Tese. Inicialmente são descritas as etapas de caracterização química da
matéria-prima “in natura“ e pré-tratada. São descritos os procedimentos dos pré-
tratamentos realizados com H2SO4 diluído e hidróxido de sódio. Em seguida, a metodologia
de atividade enzimática realizadas para as enzimas utilizadas na hidrólise enzimática do
caroço de açaí são descritas. Os planejamentos experimentais para a investigação das etapas
de pré-tratamentos, hidrólises enzimáticas e avaliação da variação de carga de sólidos e
agitação durante a hidrólise enzimática, também são mostrados neste mesmo capítulo. Por
fim, são descritas as etapas do processo de fermentação.
3. METODOLOGIA EXPERIMENTAL
3.1. REAGENTES
Na Tabela 3.1 são apresentados os reagentes utilizados nos experimentos realizados
para esta Tese.
Tabela 3-1 Reagentes utilizados nos experimentos. Reagentes Fabricante Pureza (%) Lote
Ácido acético CHEMCO 99,37 19519
Ácido cítrico monoidratado ECIBRA 99,8 17.159
Ácido dinitro-3,5-salicílico VETEC ≥99 0707406
Ácido fosfórico SYNTH 85 123920
Ácido sulfúrico SYNTH 98,0 124289
Azida de sódio VETEC 100 0800840
Álcool etílico NUCLEAR 99,5 10030276
Ciclohexano SYNTH 99 100409
Carbonato de cálcio ECIBRA 98,00 18.167
Carbonato de sódio NUCLEAR 99,00 10040361
Corante Comassie Brilliant Blue SIGMA ALDRICH ---- 03396BJ
D-(+)-celobiose CHEM SERVICE ≥99,0 37-47C
52
D-arabinose CHEM SERVICE >98,0 299-14C
D-glicose SYNTH ≥99,0 125844
D-manose CHEM SERVICE ≥99,0 55-219H
D-xilose FLUKA ≥99,0 012508/1
5-(hidroximetil) furfural CHEM SERVICE 98,50 431-121B
Furfural CHEM SERVICE 99,3 ----
Fenol NUCLEAR 99 10040404
Filtro de papel nº1 WHATMAN ---- FC000102
Hidróxido de Sódio SYNTH 97 133817
Kit Glicose GOD-PAP LABORLAB --- 161029
Meta-bissulfito de sódio ECIBRA 97 16.638
Reagente de Folin-Ciocalteu 2N SIGMA ALDRICH --- 33496KK
Sulfato de cobre NUCLEAR 98 10020199
Tartarato de sódio e potássio
tetrahidratado
VETEC 99 0702652
Celulase de Trichoderma reesei SIGMA 080M1599V
Β-glicosidase de Aspergillus niger SIGMA 011M2020
3.2. MATÉRIA-PRIMA
Os caroços do açaí foram coletados nas barracas de venda de açaí existentes na
cidade de Belém do Pará (01º27'21"S e 48º30'16"W). A coleta foi realizada no período da
manhã, logo após o beneficiamento dos frutos (despolpamento para obtenção de suco),
garantindo matéria prima de qualidade. Na Figura 3.1 é possível observar a área de coleta.
53
Figura 3.1 Vista de satélite da região metropolitana de Belém-PA (Fonte: GOOGLE MAPS, 2013).
3.2.1. Preparação da matéria-prima
O material foi lavado com água corrente para a remoção de resíduos como terra e
outros componentes indesejados. Em seguida, foi imerso em água quente a 80°C durante 15
minutos e mais 15 minutos em banho refrigerado a 0°C. O material foi seco durante 48h a
temperatura de 50°C em estufa com circulação de ar e mais 24h em temperatura ambiente
até que se conseguisse umidade menor que 10%, condição recomendada pelo NREL
(National Renewable Energy Laboratory) para a secagem biomassas com fins de produção
de etanol.
O material foi triturado em moinho de facas da marca Willye modelo TE-650 –
Tecnal – Brasil e peneirado. O material utilizado foi aquele que passou na peneira de 9
mesh (2,0 mm) e que ficou retido na peneira de 35 mesh (0,43 mm). Este material foi
acondicionado em sacos plásticos e mantido sobre refrigeração (- 20°C) até o momento da
utilização.
A Figura 3.2 mostra o fluxograma de processamento do caroço de açaí utilizado nos
experimentos.
54
Figura 3.2 Fluxograma de processamento do caroço de açaí utilizado nos experimentos.
A Figura 3.3. e 3.4 mostram o material recém coletado, após a lavagem com água
corrente e o material seco e triturado.
Figura 3.3 Açaí antes e depois da lavagem (da esquerda para a direita)
55
Figura 3.4 Caroço de açaí após seco e triturado
3.3. CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DO CAROÇO DE AÇAÍ
A caracterização química do caroço de açaí foi realizada em triplicatas nos
Laboratórios: Bioen (Programa Fapesp de Pesquisa em Bioenergia) e LEPFE (Laboratório
de processos fermentativos e enzimáticos) localizados nas instalações da Faculdade de
Engenharia Química da Unicamp.
Para a caracterização química do caroço de açaí, foram realizadas as seguintes
análises químicas: teor de umidade, teor de extrativos, teor de carboidratos (celulose e
hemicelulose), lignina (solúvel e insolúvel e total), extrativos totais, descritos nos itens de
3.3.1 a 3.3.3.
3.3.1. Determinação do teor de umidade
A secagem do material e a determinação de umidade visaram garantir baixas
concentrações de água no material a ser utilizado visto que, de acordo com NREL (2009)
elevados teores de água no material podem alterar a concentração efetiva de ácido na etapa
de hidrólise ácida. Tal fato poderia provocar uma diminuição no conteúdo de carbono
ocasionada pela hidrólise incompleta dos polímeros. A determinação de umidade foi
determinada de acordo com os itens 3.3.1.1 e 3.3.1.2.
56
3.3.1.1. Em estufa
Após a trituração e secagem do material a ser utilizado como substrato para os
experimentos, foi realizada a determinação de umidade de acordo Sluiter et al. (2005).
Dessa forma o material foi submetido à secagem em estufa (105 °C ± 5°C), para a remoção
da água por aquecimento. Para isso, foram pesados 3g de amostra em béqueres de vidro os
quais foram levados à estufa para a secagem a 105°C até peso constante (aproximadamente
6h). Após a secagem, as amostras foram retiradas da estufa e acomodadas em dessecador
até atingir temperatura ambiente e, em seguida, foram pesadas. O teor de umidade foi
calculado de acordo com a equação 3.1:
(3.1)
onde:
M1= massa da placa vazio (g)
M2= massa da amostra úmida com béquer (g)
M3= amostra absolutamente seca com béquer (g)
3.3.1.2. Em infravermelho por radiação (usado para controle e verificação)
A determinação do teor de umidade foi realizada por meio de um analisador de
umidade por Infravermelho IV 2000. Este método foi utilizado por ser rápido, o que
possibilitou uma verificação quase que imediata do teor de umidade no material
armazenado (controle e verificação).
Para essa determinação, aproximadamente 5g de amostra eram depositadas sobre
um prato de alumínio removível que era acoplado ao equipamento de infravermelho
durante a análise. Após aproximadamente 5 minutos, o equipamento fornecia o teor de
umidade da amostra, o qual foi anotado para as análises seguintes.
57
3.3.2. Teor de extrativos totais
A determinação de extrativos foi realizada de acordo com SLUITER et al. (2005) e
visou eliminar os extrativos para as análises posteriores do material lignocelulósico. Nessa
metodologia, o experimento se subdivide em duas etapas, sendo que ambas foram
realizadas em extrator Soxhlet (modelo MA – 188 da marca Marconi). Para tanto, foram
utilizados cartuchos confeccionados com papéis de filtro qualitativos previamente tarados
cada um com 8g de material seco e triturado.
A primeira extração foi realizada com 190 mL de solução de álcool etílico a 99%
de pureza, até completa descoloração do solvente (aproximadamente 48h). Ao final da
extração com etanol, foi realizada uma segunda extração na qual se utilizou 190 mL de
água destilada em cada balão do extrator, juntamente com uma quantidade de pérolas de
vidro. A água, em cada balão do extrator, foi trocada à medida que esta ainda apresentava
coloração escura. Em seguida, as amostras foram secas em estufa com circulação de ar
(Estufa de secagem especial modelo MA-035/2 da marca Marconi) a 105 °C até massa
constante. As análises foram realizadas em triplicata e a quantificação do conteúdo de
extrativos foi calculada pela equação 3.2.
100%1
21 xM
MMExtrativos
−= (3.2)
M1= massa do caroço seco (g)
M2= massa do caroço livre de extrativos (g)
3.3.3. Determinação dos componentes lignocelulósicos do caroço de açaí
3.3.3.1. Hidrólise ácida para caracterização química do caroço de açaí
Após a remoção dos extrativos da biomassa, o material foi submetido a uma
hidrólise ácida com H2SO4 a 72%. De acordo com a metodologia utilizada (SLUITER et al.,
2008a), é necessário que o material apresente umidade menor que 10% e esteja livre de
extrativos.
58
Para a hidrólise, foram pesados 0,3 g caroço de açaí moído e peneirado em tubos de
ensaio, aos quais foram adicionados 3 mL de H2SO4 72% (m/m) e imediatamente
depositados em banho maria a 30 °C. Os tubos permaneceram no banho por um período de
1h. Durante o banho-maria, o conteúdo dos tubos foi agitado a cada 10 minutos com o
auxílio de um bastão de vidro por um período de 1h a fim de garantir uma mistura mais
homogênea da amostra. Ao final do período, a amostra foi resfriada para a interrupção da
reação em banho de gelo.
A cada tubo de ensaio foram adicionados 84 mL de água destilada e seu conteúdo
foi transferido quantitativamente para frascos Schott de 250mL os quais foram fechados e
autoclavados (Autoclave vertical modelo AV 50 da marca Phoenix) a 121 °C e 1,1 bar
durante 1 h, para a total hidrólise dos oligômeros presentes na amostra. Um “branco” (3mL
de ácido + 84mL de água destilada) foi preparado com H2SO4 a 72%, constituindo uma
solução com concentração de 4% que foi posteriormente utilizada na determinação de
lignina solúvel. Após a descompressão, os frascos Schott foram retirados, resfriados e o seu
conteúdo foi filtrado em um funil com papel filtro previamente tarado. A fase líquida foi
transferida para um balão volumétrico de 100 mL (sem aferir). Desse material, foi retirada
uma alíquota de 1mL para quantificar a lignina solúvel (item 3.3.3.2) e a outra parte do
volume foi analisada para carboidratos, inibidores (Hidroximetilfurfural e Furfural) e ácido
acético em HPLC.
3.3.3.2. Determinação do teor de lignina
• Determinação de lignina insolúvel (Lignina de Klason)
O material proveniente da hidrólise ácida, o qual ficou retido no papel de filtro
conforme descrito no item 3.3.3.1, foi lavado com aproximadamente 2L de água destilada
(até a água de lavagem ficar com pH neutro - isto é feito para evitar a queima do papel de
filtro durante a secagem a 105°C pela presença de ácido residual). Em seguida foi colocado
para secar em estufa a 105°C até massa constante (Mkla). Uma parte do material insolúvel
presente é constituída de cinzas, visto que estas não são solúveis em ácido. Para não haver
59
uma superestimação dos valores de lignina insolúvel as cinzas foram determinadas como
descrito no item 3.3.3.3. O teor de lignina Klason foi calculado pela equação 3.3.
cinzas%xM
MMKlasonlignina%
b
pkla −
−= 100
(3.3)
onde:
Mb= massa do bagaço absolutamente seco, (g)
Mp= massa do papel filtro tarado, (g)
Mkla= massa do papel filtro + lignina insolúvel seca, (g)
• Lignina solúvel
A determinação do teor de lignina solúvel foi realizada de acordo com foram
transferidos 1,0 mL do hidrolisado ácido para balões volumétricos de 25 mL. Os balões
foram completados com água destilada e seu conteúdo foi analisado em espectrofotômetro
UV-Visível a 280 nm. O cálculo da concentração da lignina solúvel é realizado pela
equação 3.4
−−−=
B
AC.AC FurfHMFHMFnm
lig
εε280
(3.4)
onde:
Clig= Concentração de lignina no hidrolisado (g/L)
A = absorbância da amostra a 280 nm
εHMF = absortividade do hidroximetilfurfural (114 L.g-1)
εFurfural= absortividade do hidroximetilfurfural (146,85 L.g-1)
CHMF= Concentração de hidroximetilfurfural no hidrolisado (g/L)
CFurfural= Concentração de furfural no hidrolisado (g/L)
B= Absortividade da lignina
60
• Determinação de Lignina precipitada no material deslignificado
A metodologia utilizada para a determinação do teor de lignina presente no licor
proveniente da deslignificação foi realizada de acordo com o método descrito por Kim et al.
(1987). De acordo com a literatura, este apresenta alta eficiência em precipitar a lignina
presente no licor (75 a 85%).
Para a realização da análise o licor foi filtrado em papel de filtro para um béquer de
200mL do qual retirou-se uma alíquota de 50mL a qual foi transferida para outro béquer de
100mL. Em seguida, foi realizada a precipitação da lignina através da acidificação do licor
filtrado com solução de H2SO4 1N até se atingir um pH próximo de 2. Nesse ponto,
observa-se a precipitação da lignina. O material precipitado foi lavado com água deionizada
e o volume adicionado foi coletado com uma pipeta pasteur. A lavagem prosseguiu até pH
neutro, em seguida o material resultante foi transferido para uma placa de Petri e seguiu
para secagem em temperatura ambiente. Determinou-se a concentração da lignina no licor
negro dividindo-se a massa da lignina precipitada pela massa da amostra de licor negro
seco utilizada na etapa de precipitação.
Concentração da Lignina precipitada = (MLP / MALNS) x 100 (3.5)
onde:
MLP = massa de lignina precipitada;
MALNS = Massa da amostra de licor negro seco
3.3.3.3. Determinação do teor de Cinzas
As cinzas, em geral, mostram a presença de resíduos inorgânicos remanescentes
após a queima da matéria orgânica de uma amostra. A cinza é constituída principalmente de
grandes quantidades de K, Na, Ca e Mg; pequenas quantidades de Al, Fe, Cu, Mn e Zn e
traços de Ar, I, F e outros elementos.
A determinação do teor de cinzas na biomassa seguiu a metodologia descrita por
NREL “Determination of Ash in Biomass” (SLUITER et al., 2005). Dessa forma, cadinhos
de porcelana foram identificados e incinerados em mufla (modelo Q-318D24 da marca
Quimis) a 800°C por 2 horas. Em seguida, amostras de 1g de caroço de açaí moído e
61
peneirado (descontando-se a umidade do material) foram incineradas em mufla à
temperatura de 300°C durante 10 minutos e, em seguida, a temperatura foi elevada para
800°C para mais 2h de calcinação. A diferença entre as amostras iniciais e finais forneceu o
teor de cinzas.
Ao final da calcinação os cadinhos foram depositados em dessecador até
temperatura ambiente para em seguida serem pesados. As análises foram realizadas em
triplicata. O cálculo do teor de cinzas da biomassa é dado pela Equação 3.6.
100×
=
+ cadinhoBC
cadinhocinza
M-M
M-McinzasdeTeor% (3.6)
MC+B = massa do cadinho + massa do bagaço seco (g)
Mcadinho = massa do cadinho calcinado vazio (g)
Mcinza= massa do cadinho com cinzas, (g)
3.3.3.4. Determinação de açúcares e produtos de decomposição por HPLC (Cromatografia líquida de alta eficiência)
• Preparação da Curva de calibração dos carboidratos e produtos de decomposição
A determinação dos açúcares e produtos de degradação seguiu a metodologia
descrita na norma NREL/TP-510-42618 – “Determination of structural carbohydrates and
lignin in biomass” (SLUITER et al., 2008a), a qual foi realizada em um aparelho de
cromatografia líquida de alta eficiência (High-Performance Liquid Cromatography –
HPLC). A quantificação dos teores de carboidratos e produtos de degradação foi realizada
com base em uma curva de calibração previamente preparada com os padrões de arabinose,
celobiose, xilose, glicose, ácido acético, furfural e hidroximetilfurfural os quais
encontravam-se nas faixas de concentração descritas na Tabela 3.2.
62
Tabela 3-2 Faixa de concentração dos padrões usados na curva de calibração. Padrões Faixas de concentração g/L
Arabinose 0,01 – 4
Celobiose 0,01 – 4
Xilose 0,01 – 4
Glicose 0,01 – 4
Ácido acético 0,1 – 2,0
Furfural 0,005 – 0,01
Hidroximetilfurfural 0,0005 – 0,1
• Determinação dos carboidratos
O hidrolisado proveniente da hidrólise ácida foi filtrado (filtros de membrana GS
em éster de celulose com poros de 0,22 µm - Milipore) diretamente em “vials” de 1,5 mL.
As amostras contidas nos vials foram injetadas no HPLC nas condições: coluna BIORAD
Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) com temperatura da coluna de 30°C, fluxo do eluente de
0,6 mL.min -1. O eluente utilizado foi uma solução de H2SO4 0,01 mol/L com pH de 2,6, a
qual foi preparada com água ultra-pura (Milli-Q). Esta solução foi filtrada com o auxílio de
bomba a vácuo em membrana HAWP 0,45µm (Millipore) e degaseificada em banho ultra-
som (Microsonic SX-50) por 40 minutos. O volume da amostra injetada foi de 30µL
através de um detector IR (índice de refração) a 35°C, por um tempo de execução de 25
min.
As concentrações dos componentes analisados foram obtidas pelas áreas dos
cromatogramas que foram correlacionadas com as curvas padrão (previamente
determinadas para os padrões de celobiose, glicose, xilose e arabinose).
As massas de celobiose e glicose foram convertidas em celulose com os fatores de
0,95 e 0,90, respectivamente. As massas de xilose e arabinose foram convertidas para
hemiceluloses com o fator de 0,88. O cálculo do teor de carboidratos é mostrado na
equação 3.7.
1001
×
⋅⋅=
M
VFCCAçúcares% filtradoHPLC (3.7)
63
onde:
CHPLC: concentração do açúcar quantificado por HPLC, em g/L
FC: fator de correção para o cálculo da concentração polimérica dos açúcares dada a
concentração monomérica dos açúcares (celobiose= 0,95; glicose= 0,9; xilose= 0,88 e
arabinose = 0,88).
Vfiltrado: volume do hidrolisado filtrado, 0,087 L
M1: massa do caroço utilizado na hidrólise (g)
• Determinação dos grupos acetil
O teor de grupos acetil foi analisado durante a análise de açúcares. Dessa forma,
foram utilizadas as mesmas condições descritas no item anterior (Determinação dos
carboidratos). As massas obtidas para ácido acético a partir dos cromatogramas foram
utilizadas para calcular a concentração dos grupos acetil no qual se utilizou o fator de
conversão do ácido acético para acetato de 0,717. O cálculo do teor de acetato é mostrado
na equação 3.8.
1001
×
⋅⋅=
M
VFCCAcetato% filtradoHPLCA
(3.8)
CA HPLC: concentração de ácido acético quantificado por HPLC, em g/L
FC: fator de conversão do ácido acético em acetato = 0,717
Vfiltrado: volume do hidrolisado filtrado, 0,087 L
M1: massa do caroço utilizada na hidrólise (g)
• Determinação de furfural e hidroximetilfurfural
A quantificação dos compostos chamados inibidores (furfural e
hidroximetilfurfural) foi realizada em HPLC na qual se utilizou uma coluna Nova-Pak C18
(Waters Co., Milford, MA) a 30°C. O eluente utilizado foi uma solução de acetonitrila/água
64
(1:8 com 1% de ácido acético). O eluente antes de ser utlizado foi filtrado com o auxílio de
bomba a vácuo em membrana HAWP 0,45µm (Millipore) e degaseificada em banho
ultrassom (Microsonic SX-50) por 60 minutos e o fluxo de injeção foi de 0,8 mL.min-1. Os
componentes foram analisados com a utilização de um detector UV-VIS a 27°C com o
comprimento de onda de 280 nm e tempo de execução de 20 min. Para o cálculo das
massas de furfural e hidroximetilfurfural foram utilizados os fatores de conversão de 1,375
e 1,286, respectivamente. O cálculo do teor de furfural foi calculado pela equação 3.9.
1001
×
⋅⋅=
M
VFCCFurfural% filtradoHPLCF
(3.9)
CF HPLC: concentração de furfural quantificado por HPLC, em g/L
FC: fator de conversão do furfural, 1,375
Vfiltrado: volume do hidrolisado filtrado, 0,087 L
M1: massa do caroço utilizada na hidrólise em g (gramas)
O cálculo do teor de hidrometilfurfural foi calculado pela equação 3.10.
1001
×
⋅⋅=
M
VFCCilfurfuralHidroximet% filtradoHPLCH
(3.10)
CH HPLC: concentração de ácido acético quantificado por HPLC, em g/L
FC: fator de conversão do hidroximetilfurfural, 1,286
Vfiltrado: volume do hidrolisado filtrado, 0,087 L
M1: massa do caroço utilizada na hidrólise em g (gramas)
• Análise da composição química da fase líquida do material após o pré-tratamento
com ácido diluído e/ou deslignificação
Para a composição química da fração líquida (licor), foi retirada uma alíquota de
5mL do licor (fase líquida) resultante do pré-tratamento e/ou deslignificação, a qual foi
transferida para tubos Schott de 250mL. Em seguida, foram adicionados os volumes de
H2SO4 a 72% de acordo com a Tabela 3.3 que foi baseada na metodologia descrita pelo
65
NREL “Determination of Sugars, Byproducts, and Degradation Products in Liquid Fraction
Process Samples” (SLUITER et al., 2008b). Em seguida, os tubos foram levados para o
autoclave a 121°C durante 1h. Após a descompressão, foram removidos e resfriados em
banho de água fria. O conteúdo dos tubos foi diluído quando necessário e filtrado com o
auxílio de um filtro (filtros de membrana GS em éster de celulose com poros de 0,22 µm -
Milipore) diretamente em “vials” de 1,5 mL os quais seguiram para a leitura em HPLC.
Tabela 3-3 pH e volume de H2SO4 a 72% adicionado para a hidrólise ácida do licor, para posterior quantificação de carboidratos e inibidores presentes.
Ponto pH do licor Volume de ácido adicionado (µL)
1 1,90 172 2 1,90 172 3 1,90 172 4 1,90 172 5 1,30 164 6 1,30 164 7 1,30 164 8 1,30 164 9 2,30 173 10 1,20 161 11 1,65 170 12 1,65 170 13 1,65 170 14 1,65 170
PC* 1,65 170 *PC – Ponto central
3.3.3.5. Determinação do teor de proteínas
O teor de proteína foi determinado de acordo com o método nº 920.152 da AOAC
(1997) pela técnica micro-Kjeldahl, no qual as amostras foram submetidas a digestão com
adição de H2SO4 concentrado até o ponto de ebulição do ácido utilizando bloco digestor da
marca TECNAL modelo TE 040/25, controlador de temperatura da TECNAL modelo TE
007. Em uma segunda etapa, o material digerido foi destilado em destilador de nitrogênio
da TECNAL modelo TE-036/1 e, em seguida, foi realizada uma titulação com ácido
clorídrico 0,1N. Para conversão da porcentagem de nitrogênio em proteínas, utilizou-se o
fator 6,25. Os cálculos para obtenção das porcentagens de proteína são mostrados nas
equações 3.11 e 3.12:
66
%N (% de nitrogênio) = mLHCl x NR HCl x 0,014 x 100 (3.11)
g
%P (porcentagem de proteína) = %N x fator de correção (6,25) (3.12)
onde : NR = normalidade real do HCl; g = peso da amostra
3.3.4. Técnicas espectroscópicas e de imagem aplicadas para a caracterização do caroço de açaí.
De acordo com Farinãs (2010), a avaliação das características estruturais e
morfológicas de biomassas é uma etapa essencial, pois favorece a definição de processos
operacionais mais adequados ao material em questão. Várias técnicas têm sido utilizadas
no sentido de esclarecer de maneira mais profunda a estrutura e a composição química da
biomassa analisada. O caroço de açaí “in natura”, pré-tratado com H2SO4 diluído e
deslignificado foram analisados pelas metodologias de microscopia eletrônica de varredura
(MEV), Espectroscopia de difração de Raios-X (DRX) e infravermelho com Transformada
de Fourier (FTRI).
As análises contidas neste item foram todas realizadas no Laboratório de Recursos
Analíticos e de Calibração (LRAC), na Faculdade de Engenharia Química da UNICAMP.
3.3.4.1. Análise dos materiais lignocelulósicos por microscopia eletrônica de varredura (MEV)
Para a análise em questão, foi necessária a fixação das amostras de caroço de açaí
com fita de carbono em suporte de alumínio “stubs”. Em seguida, as amostras foram
submetidas a um recobrimento metálico de 10 nm de ouro em um metalizador Sputter
Coater POLARON Modelo SC7620 da Marca VG Microtech (Uckfield, Inglaterra).
Para o cálculo da estimativa da espessura da camada de Au (ouro) as seguintes
condições foram utilizadas: Espessura = K.i.V.t. Onde: K=0,17 Aº/mA.Volt.s; i=3 mA;
V=1 Volt e t=180 s. Portanto: Espessura=92 Aº.
As micrografias foram obtidas em um Microscópio Eletrônico de Varredura com
Detector de Energia Dispersiva de raios X, modelo- Leo 440i; Modelo EDS: 6070; Marca
67
MEV/EDS: LEO Electron Microscopy/Oxford (Cambridge, Inglaterra). Utilizou-se tensão
de aceleração igual a 20 kV e corrente do feixe igual a 100 pA.
As amostras foram dispostas de forma que fosse possível observar as modificações
superficiais resultantes dos tratamentos aplicados.
3.3.4.2. Espectroscopia de difração de Raios-X (DRX)
O índice de cristalindade da celulose foi determinado através da Espectroscopia de
difração de Raios-X (DRX) para as amostras de caroço de açaí pré-tratadas com H2SO4
diluído, deslignificado e hidrolisado enzimaticamente, no sentido de observar as possíveis
diferenças na cristalinidade das celuloses remanescentes.
Após serem devidamente moídas e secas, as amostras foram analisadas pela
difratometria de raios X, com um difratômetro de raios X da marca Philips Analytical X
Ray - Modelo: X'Pert-MPD (Almelo, Holanda), Radiação: Cu (Ka) lambda = 1.54060
Angstron, que continha um tubo de cobre gerador de raios X com filamento de tungstênio
(λ = 1,5418Å) e monocromador de grafite no intervalo angular de 5° a 70° (ângulo de
Bragg-2θ), passo angular de 0,02° e velocidade de 0,016 °.seg-1.
O índice de cristalinidade da biomassa (CrI) é definido como a porcentagem de
material cristalino na biomassa e é calculado de acordo com a Equação 3.13 (SEGAL et al.,
1959).
100002
002 ×−
=I
IICrI am
(3.13)
onde:
CrI é o índice de cristalinidade
I002 é o máximo de intensidade do pico 2θ = 16º
Iam é a intensidade na fase amorfa a 2θ que foi de 18º
3.3.4.3. Infravermelho com Transformada de Fourier (FTRI)
68
A análise em questão foi utilizada para a identificação das estruturas químicas e
grupos funcionais presentes nas amostras avaliadas e foi baseada na metodologia descrita
por Silva (2009). Para a análise foram preparadas manualmente pastilhas compactadas a
partir de 250mg de KBr e 1,5 mg de amostra seca a 60°C em estufa e resfriada em
dessecador durante 30 min. Foi preparada uma amostra utilizada, como referência,
contendo apenas KBr. A transmitância foi medida na região de 4000 a 400 cm-1 em um
espectrofotômetro NICOLET IR 100 FT-IR da marca THERMO. As amostras avaliadas
foram: o caroço de açaí “in natura”, hidrolisado enzimaticamente, “in natura”
deslignificado, pré-tratado com ácido diluído e pré-tratado e deslignificado.
3.4. PRÉ-TRATAMENTO COM H 2SO4 DILUÍDO
Foi realizada a pesagem da quantidade de biomassa estabelecida em cada um dos
pontos do planejamento em frascos de borosilicato de 250 mL, nos quais foi adicionada a
solução de H2SO4 de acordo com as concentrações (m/v) propostas nos ensaios. Os
volumes de H2SO4 adicionados foram calculados descontando-se a umidade do material
analisado (~8%). Em seguida, os frascos foram depositados no autoclave a 121°C
(aquecido à taxa de 2,6 e 3,0°C.min-1). Quando a temperatura do autoclave atingiu a
temperatura de estudo, a contagem do tempo de tratamento foi iniciada. Ao término da
reação, retiraram-se os frascos da autoclave e os mesmos foram submetidos a um banho
com água destilada a 20°C, para resfriar os frascos e garantir a interrupção da reação. O
material foi retirado dos frascos e filtrado com auxílio de bomba a vácuo e papel de filtro.
A fase sólida foi lavada com aproximadamente 3L de água destilada até a água de lavagem
atingir pH neutro. O material sólido foi seco em temperatura ambiente até atingir umidade
de aproximadamente 10%. Em seguida, foi realizada a pesagem para o cálculo da perda de
massa e analisada por HPLC para os teores de carboidratos, grupos acetil e lignina.
A fase líquida foi coletada antes do início da lavagem da fase sólida e analisada
para carboidratos, ácido acético, furfural e HMF determinados também via HPLC. As
metodologias de caracterização realizadas para as fases líquida e sólida encontram-se
descritas no item 3.2. Na Figura 3.5 é mostrada a biomassa nos tudos Schott, antes de
seguirem para o autoclave.
69
Figura 3.5 Biomassa nos tubos Schott antes de seguirem para o autoclave.
Os rendimentos mássicos foram calculados pela equação 3.14:
R = (m final/m inicial) x 100 onde: (3.14)
m inicial: massa inicial seca de material lignocelulósico
m final: massa final seca de material lignocelulósico
R: Rendimento mássico da etapa
A solubilização ou perda dos componentes celulose, hemicelulose e lignina,
proteínas, cinzas e grupos acetil foi calculada pela equação 3.15:
−=
−=
i
f
i
fi
Y
YR
Ymi
YRmiYmiP 1100
.
...100
(3.15)
onde:
P: perda do componente (%)
mi: massa inicial de material lignocelulósico
Y i: teor do componente no material lignocelulósico “in natura”;
Yf: teor do componente no material lignocelulósico pré-tratado;
R: Rendimento mássico da etapa de pré-tratamento
70
3.4.1. Planejamento experimental e fator de severidade aplicado para o estudo do
pré-tratamento com H2SO4 diluído
A determinação das variáveis e condições utilizadas no estudo do pré-tratamento
com H2SO4 diluído foi baseada na literatura relatada para outros materiais lignocelulósicos
(LU et al., 2009; FERREIRA et al., 2011; GIL et al., 2012). Dessa maneira, foi realizado
um planejamento central composto rotacional 23 com as variáveis independentes:
Concentração de ácido (0,5-1,5% m/v), tempo de tratamento (30-90 min) e concentração de
sólidos (5-15 %m/m). O software estatístico Statistica 7.0 foi utilizado para auxiliar na
análise dos dados experimentais obtidos definidos de acordo com as faixas das variáveis
experimentais mostradas na Tabela 3.4.
Na Tabela 3.5 é apresentado o planejamento utilizado que foi constituído de 17
ensaios incluindo 3 repetições no ponto central. O efeito do fator de severidade combinado
(FSC) do pré-tratamento com ácido diluído foi calculado de acordo com a equação 3.16
descrita por Overend & Chornet, (1987). O FSC é um índice que integra as variáveis de
mudanças na temperatura, tempo e acidez em um único valor, o que facilitaria a
comparação de diferentes combinações de processos (LEE & JEFFRIES, 2011, GUO et al.,
2008; LLOYD & WYMAN, 2005).
pHTT
tFSC RH −
−=
75,14exp.log
(3.16)
onde:
t - é o tempo de reação em minutos;
TH - temperatura de reação em °C;
TR - a temperatura de referência (foi utilzada a TR=100°C);
pH ácido da solução aquosa
A faixa de valores estudados no planejamento 23 realizado para o estudo do pré-
tratamento com H2SO4 diluído é mostrado na Tabela 3.4.
71
Tabela 3-4 Faixa das variáveis estudadas no planejamento 23 do pré-tratamento com H2SO4.
Na Tabela 3.5 é mostrado planejamento realizado para o estudo do pré-tratamento
com H2SO4 diluído.
Tabela 3-5 Planejamento experimental do pré tratamento com H2SO4
Ponto
Concentração de
ácido (% m/v)
Tempo de tratamento
(min)
Concentração de Sólidos (% m/v)
Fator de Severidade
1 0,5 30 5 0,195 2 0,5 30 15 0,195 3 0,5 90 5 0,673 4 0,5 90 15 0,673 5 1,5 30 5 0,795 6 1,5 30 15 0,795 7 1,5 90 5 1,273 8 1,5 90 15 1,273 9 0,2 60 10 0,096 10 1,84 60 10 1,196 11 1 9.5 10 - 12 1 111 10 1,014 13 1 60 1,6 0,746 14 1 60 18 0,746 15 1 60 10 0,746 16 1 60 10 0,746 17 1 60 10 0,746
3.5. DESLIGNIFICAÇÃO COM HIDRÓXIDO DE SÓDIO (NAOH)
A deslignificação foi realizada baseada em dados da literatura (PAN et al., 2005,
GUPTA, 2008; LEHTO & ALÉN, 2013). Para a deslignificação, foram pesadas massas do
caroço de açaí pré-tratado de acordo com o planejamento aplicado no qual foi descontado o
teor de umidade do material.
No experimento, a massa de caroço foi pesada em frascos Schott de 250 mL e em
seguida foi adicionado o volume de aproxidamente 100mL (descontando a umidade do
material) da solução de NaOH a 1% (m/v). Os frascos foram fechados para que não
Variáveis Níveis
-1,68 -1 0 1 +1,68
Concentração de ácido (%m/v) 0,2 0,5 1,0 1,5 1,84 Tempo de tratamento (min) 9,5 30 60 90 111 Concentração de Sólidos (%) 1,6 5 10 15 18
72
houvesse alteração considerável do volume reacional e foram colocados nas temperaturas
de estudo de acordo com o planejamento durante o tempo fixo de 60 minutos. Após o
tempo de deslignificação com o auxílio de uma peneira de 400 mesh o licor foi recolhido
para posteriores análises e o material sólido resultante foi lavado com água corrente sob a
peneira até que a água de lavagem apresentasse pH neutro (sem coloração amarelada).
O pré-tratamento teve que ser realizado duas vezes pois a secagem do material a ser
caracterizado necessitou ser realizada de maneira diferente daquela realizada para o
material a ser hidrolisado enzimaticamente. Dessa maneira, o material que foi caracterizado
quimicamente passou por secagem em estufa a 105°C até massa constante com o objetivo
de minimizar possíveis erros experimentais. Enquanto que o material que seguiria para a
hidrólise enzimática foi submetido à secagem a temperatura ambiente. Este procedimento
foi necessário uma vez que, a secagem promove colapso nos poros do material o que
promove redução no rendimento da hidrólise enzimática, além do gasto energético
(HENDRIKS & ZEEMAN, 2009; ZHANG et al., 2004).
Após a deslignificação o licor recolhido foi analisado para os teores de carboidratos
e inibidores (Grupos acetil, HMF e furfural), lignina (lignina precipitada) e proteínas
conforme os itens 3.3.3.4; 3.3.3.2 e 3.3.3.5. Enquanto que a fração sólida foi analisada para
o teores de carboidratos, grupos acetil, lignina (solúvel e insolúvel), cinzas e proteínas de
acordo com os itens 3.3.3.4; 3.3.3.2, 3.4.3.3 e 3.5.3.5, respectivamente.
O planejamento aplicado é mostrado na Tabela 3.6. E os rendimentos mássicos e
solubilização foram calculados de maneira semelhante conforme descrito no item 3.4.
Tabela 3-6 Planejamento 22 realizado para o estudo da deslignificação do caroço de açaí.
Ponto Temperatura Carga de sólidos % (m/v)
1 50,00 10,00 2 50,00 40,00 3 100,00 10,00 4 100,00 40,00 5 40,00 25,00 6 110,00 25,00 7 75,00 3,79 8 75,00 46,21 9 75,00 25,00 10 75,00 25,00 11 75,00 25,00
73
3.6. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA E SUAS ETAPAS 3.6.1. Enzimas utilizadas
As enzimas utilizadas para as hidrólises dos materiais foram as enzimas celulase de
Trichoderma reesei (Sigma-Aldrich) e β-glicosidase de Aspergillus niger (Sigma-Aldrich).
3.6.2. Preparo do Tampão citrato utilizado
Para o preparo do tampão citrato, 0,05 mol/L de pH 4,5 foram pesados em um
Béquer, 9,60 g de ácido cítrico anidro com 99,5% de pureza, o qual foi dissolvido em
50mL de água destilada com o auxílio de um bastão de vidro. Em seguida, foram
adicionados 450mL de água destilada e 0,07% de Azida sódica. O pH foi medido e ajustado
com aproximadamente 2g de hidróxido de sódio, para atingir o pH de 4,5. O volume foi
transferido para um balão volumétrico de 1L e aferido.
3.6.3. Preparação do DNS e Tartarato
O reagente DNS foi preparado de acordo com BAZÁN (1993). Para a preparação do
DNS (ácido dinitro-3,5-salicílico) dissolveu-se 10,6 g do reagente em 1416 mL de água.
Em seguida adicionou-se 7,6 mL de fenol fundido a 50°C e 8,3 g de meta-bissulfito de
sódio e 19,8g de NaOH. O reagente preparado foi guardado em um frasco âmbar para
protegê-lo da luz e evitar possíveis degradações. Paralelamente, foi preparada uma solução
estabilizante da cor formada do DNS, adicionando 15,1 g de tartarato de sódio e potássio
tetrahidratado em 1L de água destilada, que foi filtrada e guardada em frasco âmbar.
3.6.4. Determinação da atividade enzimática da celulase
A determinação da atividade enzimática da celulase foi adaptada e realizada de
acordo com Ghose (1987), onde a atividade da enzima foi calculada em termos de unidades
de filtro de papel por mL de solução enzimática (UFP/mL). A análise baseia-se na
capacidade da solução analisada reduzir o reagente DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico). Essa
medida ocorreu através da medida da absorbância a 540 nm da glicose liberada. Para a
74
determinação foi preparada uma solução de celulase (Solução mãe) 1:20, sendo realizadas
cinco diluições a partir da mesma. A determinação foi realizada nas seguintes etapas:
1ª etapa: Em sete diferentes tubos de ensaio foram pesados 0,05g de papel de filtro
whatman n°1 previamente picado.
2ª etapa - Preparo de cinco soluções com diferentes diluições: em sete diferentes
tubos, foram preparadas, a partir da solução mãe, cinco diferente soluções, retirando-se um
volume X da solução mãe e adicionando-se um volume Y de tampão.
3° etapa: Aos tubos que continham apenas o papel de filtro pesado foi adicionado
1mL de tampão sem enzima. Estes tubos foram levados para o banho termostático a 50°C,
durante 10 minutos. Após o tempo decorrido, foi adicionado a cada tubo 0,5 mL retirado
dos tubos que continham as diferentes diluições enzimáticas.
4ª Etapa: Os tubos da 3° etapa ficaram 60 minutos sob incubação. Em seguida, a
reação foi interrompida com a adição de 1,5 mL de reagente DNS. Esses tubos foram
fechados e depositados em banho termostático a 95°C durante 5 minutos e em seguida
imersos em banho de gelo por 5 minutos.
5ª Etapa: Após os 5 minutos em banho de gelo, foi adicionado 10,5 mL da solução
estabilizante de tartarado de sódio e potássio diretamente nos tubos de ensaio, em seguida
tampou-se os mesmos homogeneizando a solução, após esta etapa os tubos permaneceram
em repouso até a decantação total do papel. Em seguida foram transferidos
aproximadamente 1,5mL das soluções para as cubetas e em seguida, mediu-se a
absorbância em espectrofotômetro a 540nm.
6ª Etapa: Durante o andamento foram preparados tubos controles, uma vez que parte
da glicose analisada pode vir ou do substrato ou da própria enzima utilizada (RABELO,
2007). Dessa forma, foram preparados tubos que continham: 1 - a enzima sem substrato e
(2 - o substrato sem enzima. A leitura obtida a partir destes tubos foi subtratídas da leitura
dos demais tubos reacionais analisados.
7ª Etapa: Preparação do branco reacional – Um tubo denominado branco reacional
para zerar o equipamento foi preparado com um tubo contendo 1,5mL do tampão citrato.
8ª Etapa: Preparação de um tubo para o controle da enzima – foi preparado
paralelamente sete tubos, nos quais adicionaram-se 1,0mL do tampão citrato e 0,5mL de
cada uma das diluições da enzima.
75
9ª etapa: Os tubos das etapa 7 e 8 (branco e controle da enzima) foram incubados a
95ºC por 60 min, e submetidos à análise de DNS, conforme já descrito.
10ª Etapa: Após as leituras das absorbâncias, uma reta foi traçada relacionando-se o
logaritmo da concentração da enzima em cada uma das diluições em função da massa de
glicose liberada por 0,5mL da enzima diluída, obtendo-se então a atividade enzimática da
celulase.
Uma unidade enzimática (FPU) é a quantidade de enzima que libera 2,0mg de
açúcar redutor como a glicose a partir de 50 mg de papel de filtro nas condições do ensaio.
A atividade específica (AE) da celulase, expressa em termos de FPU por mililitro de
proteína, foi calculada a partir da equação 3.17 e 3.18:
)(
)37,0()/(
CmLFPU =
(3.17)
onde:
- C - é a concentração de enzima (mg/mL) necessária para transformar 50mg de substrato
em 2 mg de glicose, ou seja, a concentração enzimática necessária para realizar 4% de
conversão do substrato;
- O numerador 0,37 é derivado do fator de conversão de 2,0mg de glicose gerados no
ensaio por mmol de glicose, a partir do volume de enzima utilizado e do tempo requerido
para geração dos açúcares redutores.
11*min*)*60*5,0*18016,0(
0,2/ −−= mLmol
CmLFPU µ (3.18)
Apesar da constante 0,37 ter seu cálculo baseado nas unidades internacionais de
atividade do Sistema Internacional de medidas (S.I.), a celulase não tem sua atividade
determinada nestas unidades, devido ao fato de que as mesmas são baseadas nas taxas
iniciais de reação, portanto, esta enzima deve ter sua atividade expressa simplesmente como
FPU.
76
3.6.5. Determinação da atividade enzimática da β-glicosidase
A determinação da atividade enzimática da β-glicosidase foi realizada de acordo
com o método recomendado pela IUPAC (WOOD e BHAT, 1988). Dessa forma, foi
preparada uma solução de celobiose 15 mmol/L e expressa em unidades de celobiose
(CBU) por volume de enzima original. Foi preparada também uma solução enzimática da
enzima β-glicosidase de diluição 1:1000. A partir da qual foram feitas 4 novas diluições em
tampão citrato 0,05 mol/L pH 4,8.
Em tubos de ensaios, foram adicionados 1,0 mL de cada uma das diluições da
enzima e estes seguiram para o banho termostático a 50°C durante 10 minutos. Após
decorridos os 10 minutos, 1mL da solução de celobiose preparada inicialmente foi
adicionada aos tubos que seguiram para a incubação a 50°C pelo período de 30 minutos.
Em seguida, os tubos foram imersos em um banho de água fervente durante 5 minutos e
logo de imediado seguiram para um banho de gelo. A determinação quantidade de glicose
liberada por cada uma das soluções nos diferentes tubos foi realizada com o auxílio do kit
de quantificação Glicose GOD-PAP. Após o final da reação de quantificação, foram
adicionados 0,2 mL de uma solução de H2SO4 72% em cada tubo de ensaio para garantir
que a reação tivesse sido terminada.
Foram preparados 4 tubos denominados controle da enzima. Em cada um dos tubos,
foram adicionados 1,0 mL de cada uma das diluições da enzima e 1,0 mL do tampão
citrato. Decorrido o tempo de reação, foi utilizado o método enzimático Glicose GOD-
PAP. Para o tubo controle do substrato,yhh adicionou-se 1,0 mL do substrato celobiose e
1,0 mL do tampão citrato que ao final de 30 minutos de reação também foi analisado pelo
método enzimático Glicose GOD-PAP. A partir das absorbâncias medidas foi traçada uma
reta, que relacionou a concentração da enzima em cada uma das diluições em função da
massa de glicose liberada por 1,0 mL dessa enzima diluída. Dessa forma foi determinada a
atividade enzimática da β-glicosidase. Cada unidade da atividade da β-glicosidase (CBU)
baseia-se na liberação de exatamente 1,0 mg de glicose, isto é, 0,5/0,18016 µmol de
celobiose convertida por 1,0 mL de enzima diluída em 30 minutos de reação. A Equação
3.19 e 3.20 mostram o cálculo da atividade da β-glicosidase.
77
11*min*)*30*0,1*18016,0(
5,0/ −−= mLmol
CmLCBU µ (3.19)
11*min*0926,0
/ −−= mLmolC
mLCBU µ (3.20)
Onde C: Concentração de enzima diluída
O método enzimático Glicose GOD-PAP é um kit enzimático pronto para o uso. A
metodologia de uso é descrita por HENRY et al. (1974) e baseia-se na capacidade da
oxidação enzimática da glicose através da enzima glicose oxidase (GOD) o que resulta em
peróxido de hidrogênio, o qual é, em seguida, usado na formação da coloração rosada pela
peroxidase (PAP). A aplicação do método para a quantificação da glicose foi realizada
adicionando-se 10 µL de cada uma das amostra em tubos de ensaio previamente
identificados e 1,0 mL do mono-reagente contido no Kit. Em seguida, os tubos foram
mantidos em banho termostático a 37°C por 10 minutos para o desenvolvimento da
coloração rosada. Ao final do tempo de reação, foram adicionados aos tubos 3,0 mL de
água destilada. Os tubos foram homogeneizados e a absorbância foi medida.
Em paralelo aos tubos das amostras, foram realizados os tubos do branco e do
padrão de glicose. Dessa forma, para o tubo do branco foi adicionado 1mL do reagente
enzimático e para o tubo padrão adicionou-se 10 µL da solução padrão de glicose (100
mg/dL) e 1,0mL do mono-reagente enzimático. Foram realizadas diluições, quando
necessário, as quais foram realizadas para possibilitar a leitura, visto que a reação é linear
até 500 mg/dL (recomendações do fabricante). Outra observação feita pelo fabricante diz
respeito ao fato de que, quando a leitura do branco apresentar absorbância acima de 0,250,
o mono-reagente deve ser descartado, pois indicaria deterioração do reativo de trabalho. A
cor final da reação é estável por 60 minutos. Para determinar a concentração de glicose,
utilizou-se a equação da reta obtida pela curva padrão de glicose 10mg/mL, com valor de
R² próximo de 1.
78
3.6.6. Hidrólise enzimática do caroço de açaí pré-tratado e deslignificado para
obtenção de dados cinéticos
A hidrólise enzimática do material pré-tratado com ácido diluído e deslignificado
para a obtenção dos dados referentes à observância do efeito do pré-tratamento e
deslignificação nos resultados de conversão foi realizada com a utilização do tampão de
citrato de sódio a pH 4,8 a 50 mM contendo 0,07% de azida sódica. O experimento teve
início com a prévia suspensão de 3g de caroço de açaí pré-tratado ou deslignificado em 100
mL de tampão dentro de tubos erlemeyers de 250 mL e que foram acondicionados em
“shaker” a 50°C, pelo período de 60 minutos para estabilização da temperatura sob agitação
de 150 rpm.
Após o decorrido o período, foram adicionados aos tubos os volumes de enzimas
nas cargas enzimáticas de 15FPU/g de caroço e 25CBU/g de caroço. A liberação dos
açúcares redutores e da glicose foi medida nos períodos de (0,5, 2, 4, 6, 12, 24, 30, 48, 60 e
72h) com a coleta de alíquotas de 2 mL, as quais foram analisadas por Cromatografia
líquida de alta eficiência (HPLC). A carga enzimática utilizada foi baseada no estudo de
Gomez-Rueda, (2010), e a conversão enzimática da celulose foi calculada pela Equação
3.21:
100.Y.m
f.mCC
iinicial
hecosgli= (3.21)
onde:
CC: conversão enzimática da celulose;
mglicose: massa de glicose presente no hidrolisado (g);
minicial: massa seca de material lignocelulósico, antes da etapa de hidrólise enzimática (g);
Yi: teor de celulose no material lignocelulósico;
fh: fator de hidrólise da celulose (correspondente a 0,9)
79
3.6.7. Estudo da variação da carga de sólidos e agitação na etapa de hidrólise
enzimática
Baseado no estudo de RABELO (2010), foi realizado um estudo da influência da
variação da carga de sólidos e da agitação na hidrólise enzimática do caroço apenas pré-
tratado com H2SO4 diluído e, também, com aquele que foi sequencialmente deslignificado
(ambos nas condições que foram consideradas ótimas).
As massas de sólidos descritas (descontando-se a umidade do material) no
planejamento foram pesadas em reator encamisado de vidro borosilicato com capacidade de
500mL para o qual foram adicionados 100 mL de tampão citrato 4,8 (pH ótimo da enzima)
quando necessário foi ajustado). A temperatura utilizada foi de 50ºC e as cargas
enzimáticas utilizadas para celulase e β-glicosidase foram de 15 FPU/g de caroço e 25
CBU/g caroço, respectivamente. O planejamento aplicado possuiu 3 níveis com 9 ensaios e
3 repetições no ponto central, os quais são mostrados na Tabela 3.8.
Tabela 3-7 Planejamento experimental aplicado para a variação da carga de sólidos e agitação.
Ensaio Concentração de sólidos (%)
Agitação (rpm)
1 5 100 2 5 150 3 5 200 4 10 100 5 10 150 6 10 200 7 15 100 8 15 150 9 15 200 10 10 150 11 10 150 12 10 150
80
3.7. FERMENTAÇÃO
As etapas da fermentação foram baseadas no estudo de Andrade (2012) e foram
realizadas como descritas nos itens de 3.7.1 a 3.7.8.
3.7.1. Preparação do padrão glicose
Foram preparados 100mL de uma solução de glicose pura na concentração de (X
g/L) que foi a mesma observada nos hidrolisados a serem fermentados. Esta etapa foi
realizada com o objetivo de se observar possíveis diferenças de fermentabilidade entre a
solução padrão e o hidrolisado. O preparo da solução padrão foi basicamente realizado pela
diluição de glicose em tampão citrato de sódio a pH 4,8.
3.7.2. Preparo do hidrolisado
O caroço de açaí pré-tratado apenas com H2SO4 diluído (item 3.3) e que também foi
sequencialmente deslignificado (item 3.4) foi hidrolisado de acordo com o item 3.5 com a
utilização das cargas de sólidos de 15% para o apenas pré-tratado e de 10% para o que foi
sequencialmente deslignificado na melhor condição de agitação observada no item 3.5.7,
que foi 200rpm. Não foram adicionados azida sódica na preparação do tampão utilizado na
produção dos hidrolisados a serem fermentados.
3.7.3. Esterelização dos hidrolisados
A metodologia de esterelização dos hidrolisados foi baseada no estudo de Andrade,
(2012). Os hidrolisados enzimáticos foram esterelizados a frio na Faculdade de Engenharia
de Alimentos – FEA/UNICAMP. O hidrolisado foi previamente centrifugado a 5000 rpm
por 20 minutos para obtenção de uma fração líquida que, posteriormente, seguiu para a
esterelização, no qual o hidrolisado passou por um sistema de filtração estéril por
menbranas modelo Minikap HF Filter MK2M-512-V6S (Spectrum Laboratories, Inc., FL,
USA). A membrana de filtração utilizada é constituída de éster de celulose, com diâmetro
de poro de 0,2 µm, e área de filtração de 500 cm2. O material filtrado estéril foi coletado em
frascos “Erlenmeyers” fechados e previamente esterilizados em autoclave.
81
3.7.4. Microrganismo
O microrganismo utilizado foi o Sacchamomyces cerevisiae, o qual foi mantido sob
refrigeração em meio de ativação contendo ágar. A manipulação do microrganismo foi
realizada em câmara de fluxo laminar, nas devidas condições de esterelização. Todo o
material utilizado foi autoclavado previamente, e quando necessário, foi utilizado álcool
etílico 70°GL para a esterelização de superfícies e posterior à radiação ultravioleta por 30
minutos. Antes da fermentação no “shaker”, foram realizadas propagações do
microrganismo a cada 24 horas. Neste procedimento, com o auxílio de uma alça platina,
foram realizados repiques para novos tubos que continham o meio semi-sólido YM
composto por Extrato de levedura (3kg/m3), Extrato de malte (3 kg/m3), Peptona (5 kg/m3),
Glicose (10 kg/m3) e de ágar-ágar (20 kg/m3).
3.7.5. Ativação do microrganismo
Após o período de 24h, o microrganismo crescido e contido dentro dos tubos com o
meio semi sólido, foi transferido com o auxílio de uma alça de inoculação para novos tubos
contendo o meio de ativação YM (preparado da maneira anteriormente mencionada, porém
sem a adição do ágar). Em seguida, o inóculo foi novamente levado para o shaker na
temperatura de 30°C durante 24h.
3.7.6. Crescimento do microrganismo
Após decorrido o período de 24h, os inóculos contidos nos tubos de ativação foram
transferidos para um erlemmeyers de 250mL que já continha 100mL do meio de
crescimento sintético que foi preparado contendo: sacarose (20 kg/m3), Extrato de levedura
(5 kg/m3), K2HPO4 (5 kg/m3), NH4Cl (1,5 kg/m3), KCl (1,15 kg/m3) e MgSO4.7H2O (0,65
kg/m3). Em seguida, o erlemeryer contendo o meio de crescimento e os inóculos foram
levados para incubadora do tipo “shaker”, onde ficou sob incubação durante 24h a 30°C e
agitação de 150rpm. Após este período, o conteúdo do erlemeyer foi distribuído em tubos
de centrifugação, os quais foram centrifugados a 3000rpm durante 20 minutos.
82
3.7.7. Fermentação dos hidrolisados
A fração líquida, contida nos tubos de centrifugação foi desprezada e a fração sólida
dos tubos foi transferida para novos erlemeyers de 250mL, os quais continham 100mL de
hidrolisados esterelizados. Em seguida, os erlemeyers foram deixados sob incubação
durante 24h na temperatura de 34°C e, a cada 2h, foram coletadas alíquotas de 2mL. A
alíquota coletada foi centrifugada durante 15 minutos a 4000 rpm. A fração líquida foi,
então, coletada e analisada em HPLC para os teores de carboidratos e inibidores
determinados de acordo com o item 3.3.3.4 e o teor de etanol e glicerol de acordo com o
item 3.7.8.2. A fração sólida foi utilizada para a determinação da concentração de células
totais realizada conforme o item 3.7.8.1.
3.7.8. Métodos analíticos utilizados para avaliar a fermentação
3.7.8.1. Concentração de Células Totais
Após a mistura do meio de crescimento contendo o inóculo com o hidrolisado, foi
coletada uma alíquota de 2mL a cada 2h durante 24h, incluindo o ponto de uma coleta no
ponto zero. O volume de 2mL foi coletado em eppendorff e centrifugado durante 15
minutos a 4000 rpm. Em seguida, a fração líquida foi coletada para as análises já descritas e
o precipitado formado foi lavado por 3 vezes com água destilada. Essa lavagem foi
realizada colocando-se água destilada dentro do eppendorff, o qual foi centrifugado e a
fração líquida descartada (procedimento repetido por 3 vezes). Ao final das lavagens, o
material sólido foi transferido para placas de petri e seco em estufa com circulação de ar a
60°C até massa constante e a massa final foi usada para determinar por método
gravimétrico a concentração de células totais (ANDRADE, 2012).
3.7.8.2. Análise do teor de glicerol e etanol
A fração sobrenadante resultante da centrifugação do material fermentado foi e
diluída e filtrada, com seringas acopladas a filtros contendo membrana microporo de éster
83
de celulose (diâmetro de poro de 0,22 µm) e analisadas para os teores de glicerol de etanol.
Parra isso foi utilizado o cromatógrafo líquido modelo 1260 Infinity HPLC Agilent
Technologies com detector de índice de refração IR e DAD UV-vis, sendo a fase móvel
utilizada uma solução de H2SO4 0,05M; preparada com água ultra-pura (Milli-Q) e fluxo de
eluente de 0,6 mL min-1. Utilizou-se uma coluna Aminex HPX-87H de 300 mm x 7,8 mm a
30°C e o volume de amostra injetado foi de 15 µL e o tempo total de análise foi fixado em
30 min. Os tempos médios de retenção de cada composto foram: etanol (21,1 min) e
glicerol (13 min). Os padrões foram soluções de glicerol e etanol preparadas na faixa de
concentração de 0,01 a 4 %.
3.7.8.3. Parâmetros de avaliação da fermentabilidade (rendimento de produtividade
de etanol)
A fermentação foi avaliada para os hidrolisado obtidos com 15% de caroço de açaí
apenas pré-tratado com H2SO4 diluído e para o hidrolisado obtido com 10% de caroço de
açaí pré-tratado e deslignificado. Os parâmetros para a avaliação da fermentação foram:
rendimento de fermentação e a produtividade volumétrica de etanol. Os valores de
produtividade volumétrica de etanol foram calculados pela Equação 3.22:
PV = (PF – Pi)/ t (3.22)
onde:
PF é a concentração de etanol (g.L-1) no final da fermentação, Pi é a concentração
de etanol (g.L-1) no início da Fermentação e t é o tempo em horas.
Enquanto que o rendimento de fermentação (RF) foi calculado pela Equação 3.23 :
( ) 100511,0
××−
−=
fi
if
GG
EERF
(3.23)
onde:
Ef = concentração de etanol no final da fermentação;
84
Ei = concentração de etanol no inicial da fementação;
Gi = concentração de glicose no início da fermentação;
Gf = concentração de glicose no final da fermentação;
0,511 é o fator estequiométrico
3.8. CONCLUSÕES PARCIAIS
No capítulo 3, foram mostrados, detalhadamente, os materiais e metodologias
utilizadas para o desenvolvimento desta Tese. Foi possível perceber que as metodologias
aplicadas a este trabalho foram capazes de propocionar a obtenção de dados comparáveis
aos consultados na literatura. Além disso, foi observada boa repetibilidade para os dados
obtidos com as metodologias utilizadas.
85
CAPÍTULO 4 - CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO CAROÇO DE AÇ AÍ ”IN
NATURA”
No Capítulo 4, foi caracterizado o caroço de açaí “in natura”. Por se tratar de uma
matéria-prima ainda pouco explorada e com reduzidos dados científicos relacionados à sua
composição, esta foi uma etapa essencial para se conhecer melhor os componentes deste
material e obter dados para a escolha dos melhores tratamentos a serem aplicados ao
mesmo no decorrer deste trabalho.
4. RESULTADOS DA CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO CAROÇO DE A ÇAÍ “IN NATURA”
Na Tabela 4.1, é possível observar a caracterização química da biomassa do caroço
de açaí utilizada nos experimentos desta Tese.
Tabela 4-1 Composição química da biomassa do caroço de açaí “in natura” em base seca.
(*) Desvio padrão para média de três repetições
A caracterização química da biomassa do caroço de açaí e os desvios médios de
cada componente estão apresentados na Tabela 4.1. Os dados obtidos foram comparados
com outros trabalhos que relatam a composição deste mesmo material e com outras
biomassas atualmente estudadas para a potencial produção de etanol de segunda geração.
Componentes (%)*
Celulose 45,3 ± 1,30
Hemicelulose 18,2 ± 0,80
Lignina Total 20,37 ± 0,50
Cinzas 3,5 ±0,10
Extrativos 9,5 ± 0,20
Grupos acetila 3,01 ± 0,80
Proteína 4,3± 1,10
Total 98,52
86
Para a caracterização da biomassa do caroço de açaí, foi realizada previamente a
determinação do teor de umidade e de cinzas do material, os quais foram de 8,1% e 3,5%
respectivamente. Este último foi ligeiramente maior que aquele obtido por Teixeira et al.
(2004) que obteve 2,60%. Não foi realizada a análise de metais nas cinzas mas a literatura
revela que estes tipos de materiais freqüentemente apresentam um elevado teor de sílica
(CALDAS et al., 2000; SEYE et al., 2000). Em relação ao percentual de carboidratos totais,
foi observado o teor de 63,5%, semelhante ao relatado por Rodriguez-Zúñinga et al. (2008)
(65,46%) e superiores aos encontrados por Altman et al. (1956) (54,02%), porém bem
inferior ao obtido por Kabacznik e Rogez (1998) (81,29%). Quando comparado com outros
resíduos este material apresentou valor maior que aqueles relatados para palha de trigo
(59%) (BALLESTEROS et al., 2008), biomassa de cardo (52%) (KOOTSTRA et al., 2009)
ou materiais semelhantes como sementes de Jatropha curcas (42,9%) (MARASABESSY
et al., 2012). Porém, ficou dentro do intervalo relatado para o bagaço-de-cana (59,3%)
(RABELO, 2007) e (63,1%) (LI-QUN JIANG et al., 2013). De acordo com Kim et al.,
(2005), o elevado teor de carboidratos como o que foi obtido para o caroço de açaí
justificaria a sua utilização na produção de etanol.
O principal componente da biomassa do caroço de açaí foi a celulose com o teor de
45,3%, seguido pela hemicelulose com 18,2% e lignina 20,37%. Foram encontradas poucas
informações na literatura quanto à composição química desta biomassa. Rodriguez-Zúñinga
et al. (2008) caracterizaram o caroço de açaí e obtiveram valores maiores que os obtidos
neste trabalho para os teores de celulose (53,20%) e lignina (22,30%) porém com teores
menores de hemicelulose (12,26%). Já Altman (1956) obteve teores um pouco diferentes
que foram de 34,41% de celulose, 12,26% de hemicelulose e 7,72% de lignina e que são
apresentados na Tabela 4.2 juntamente com dados de outros materiais lignocelulósicos.
O teor de hemicelulose foi praticamente todo obtido na forma de xilana (~95%).
Este comportamento é observado também para madeiras de folhosas como a oliveira, no
qual a xilose e a arabinose são normalmente os açúcares mais representativos na
constituição da hemicelulose presente, verificando-se um predomínio da xilose nessa
constituição (LYND et al., 1999).
Para o teor de lignina, foi observado um valor relativamente elevado quando
comparado àquele obtido para o caroço de açaí por Altman (1956) e do intervalo relatado
87
por Kim et al. (2005) para a palha de milho que variou de 17 a 19%. De acordo com
Boussarsar et al. (2009), a lignina tem importante papel no fortalecimento da estrutura do
material lignocelulósico, influencia na suspensão do material na água e por possuir caráter
hidrofóbico reduz a facilidade de hidratação do material. Segundo Saha et al. (1999)
elevados teores de cinzas e lignina podem dificultar a bioconversão de materiais
lignocelulosicos a etanol. Além disso, a partir da lignina também são gerados compostos
fenólicos tóxicos inibidores da fermentação (PALMQVIST & HAHN-HÃGERDAL, 2000;
ALMEIDA et al., 2007).
O teor de proteína encontrado (4,3%) para o material foi menor que aqueles
relatados na literatura para materiais lignocelulósicos como pedúnculo de trigo (17,01%) e
de algodão (14,97%) ambos relatados por Dundar et al. (2009) e ainda frutos de jatropha
curcas (semente da indonésia utilizada para produção de biodiesel) com 4,9%
(MARASABESSY et al.,2012) e bagaço de beterraba 11.42% (ZHENG et al.,2013).
O teor de extrativos obtido (9,5%) esteve dentro de um intervalo relatado para uma
ampla variedade de materiais lignocelulósicos como: frutos de jatropha curcas (30%)
(MARASABESSY et al.,2012), bagaço-de-cana não peneirado (2,3%) (RABELO, 2007);
resíduos de podas de oliveiras (15,87%) (PEDRO, 2013) os quais podem incluir
componentes não-estruturais como componentes estruturais de casca de frutos, tais como
ceras, gorduras, taninos, algumas resinas e pectinas solúveis (CARA et al., 2006;
WINKLER et al., 1997).
Apesar do balanço de massa não ter fechado em 100%, Ruzene (2005) explica que
este tipo de comportamento pode ocorrer em função da provável presença de outros
compostos de baixo peso molar e extrativos (a presença de extrativos poderia levar a
formação de grumos que não podem ser hidrolisados ou quantificados).
De maneira geral, os teores de celulose, hemicelulose e lignina encontraram-se em
concordância com análises efetuadas para a mesma matéria-prima por outros autores, como
pode ser verificado na Tabela 4.2, na qual também são mostradas as composições químicas
de vários outros resíduos lignocelulósicos.
88
Tabela 4-2 Composição química de alguns materiais lignocelulósicos.
Resíduo lignocelulósico Celulose (%)
Hemicelulose (%)
Lignina (%)
Referência Bibliográfica
Caroço de açaí 53,2 12,26 22,3 (RODRIGUEZ-ZUÑINGA et al., 2008)
39,83 14,19 8,93 (ALTMAN, 1956)
Bagaço de cana-de-açúcar 40,9 20,8 24,9 (QIU et al., 2012)
38,1 29,2 24,2 (SILVA, 2009)
Podas de olival 33,8 16,6 24,7 (REQUEJO et al., 2011)
Palha de colza 36,59 24,11 17,03 (DIAS et al., 2010)
Palha de trigo 54,1 4,4 27,4 (PIHLAJANIEMI., 2014)
Eucalipto 44,4 17,5 27,7 (ROMANÍ et al., 2010)
Palha de milho 37.0 31.3 17.8 (SAHA et al., 2013)
Bagaço de caju 20,9 16,3 33,6 (ROCHA et al., 2014)
Capim-elefante 22.6 20.9 19.4 (ELIANA et al., 20014)
Bagaço de beterraba 22,7 36,64 - (ZHENG et al., 2013)
Cachos de dênde 39,2 24,4 31,8 (JUNG et al., 2013)
Acácia 43,4 18,7 20,7 (FERREIRA et al., 2011)
Pinheiro 41,4 5,2 28,5 (YU et al., 2011)
Casca de soja 38 10 3 (MIELENZ et al., 2009)
Casca de arroz 31 26 9,1 (CASSALES et al., 2011)
Micro-alga 15,22 17,3 - (HARUN & DANQUAH, 2011)
4.1. CONCLUSÕES PARCIAIS
Neste capítulo, foi observado o elevado valor de 63,5% para o teor de carboidratos
totais presente no caroço de açaí. O maior carboidrato presente no material foi a celulose
seguida pela hemicelulose. Os teores de lignina foram considerados ligeiramente elevados,
porém muito semelhantes aos obsevados para a maioria das matérias-primas comumente
utilizadas para a produção do etanol de segunda geração. A caracterização do caroço de
açaí revelou que o caroço de açaí apresenta grande potencial para a produção do etanol de
segunda geração porém com a necessidade de pré-tratamentos.
89
CAPÍTULO 5 - PRÉ-TRATAMENTO COM H 2SO4 DILUÍDO DO CAROÇO
DE AÇAÍ
No Capítulo 5, foi estudado o pré-tratamento com H2SO4 diluído para a remoção da
fração hemicelulósica presente no caroço de açaí. Foram avaliadas as duas frações obtidas
após o pré-tratamento. A fração sólida foi caracterizada quimicamente dando-se destaque
para os teores de carboidratos, principalmente a celulose. E a fração líquida também foi
caracterizada quimicamente, com atenção aos níveis de xilose e inibidores. Os níveis de
solubilização do caroço de açaí após o pré-tratamento foram analisados e em seguida foram
verificados os efeitos do pré-tratamento na conversão enzimática da fração sólida
recuperada. Os dados obtidos para a conversão enzimática (valores de g de glicose liberada)
foram analisados estatisticamente. Por fim foram realizadas as cinéticas de hidrólise
enzimática para cada um dos ensaios delimitados pelo planejamento experimental utilizado.
5. RESULTADOS DO PRÉ-TRATAMENTO COM H 2SO4 DILUÍDO DO
CAROÇO DE AÇAÍ
5.1. RESULTADOS OBTIDOS PARA A COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA
FRAÇÃO SÓLIDA RECUPERADA APÓS O PRÉ-TRATAMENTO
Na Tabela 5.1 são apresentados os resultados obtidos para a composição química da
biomassa pré-tratada. Após o pré-tratamento, o material resultante denominado “slurry” foi
separado em fase líquida (hidrolisado) e fase sólida e tiveram sua composição química
realizada. As alterações na composição da fase sólida e a composição em açúcares e outros
compostos da fase líquida foram comparados com a composição da matéria-prima “in
natura”, para se observar melhor os resultados do pré-tratamento, os quais foram exibidos
em tabelas.
Com base na Tabela 5.2, é possível verificar que a recuperação de material após o
pré-tratamento variou de 58,32% (na condição de 121°C; 1,5% de ácido; 30 minutos e 5%
de sólidos) a 79,85% (na condição de 121°C; 0,5% de ácido; 30 minutos e 5% de sólidos) e
foi menor que os valores obtidos por por Jung et al. (2013), o qual obteve em condições
90
ótimas (190°C; 1% de H2SO4; 3 segundos e 10% de sólidos) o valor de 51,1% de sólidos
recuperados, para o pré-tratamento de cachos de dendê.
Lu et al. (2009) pré-tratou com H2SO4 palha de canola e obteve taxas de
recuperação de material sólido que variaram de 52,6 a 88,7% com concentrações de ácido
entre de 0,5 e 2%; tempo de 5 a 20 minutos e concentração de sólidos de 5 a 20% na
temperatura de 180°C. Diaz et al. (2010) verificaram uma taxa de recuperação que variou
de 51 a 71% para o tratamento de palha de canola com água aquecida entre 210 a 220°C.
91
Tabela 5-1 Composição química da fração sólida obtida do pré tratamento com H2SO4 (sem a correção)
Ponto de
ensaio
Sólidos recuperados
g/100g de
material não-tratado
Ácido (% m/v)
Tempo de
tratamento (min)
Concentração de
Sólidos (%)
Celulose (%)
Hemicelulose (%)
Grupos Acetil (%)
Cinzas (%)
Lignina total (%)
Proteínas (%)
Total
1 79,85 0,5 30 5 49,67±0,04 14,40±0,13 0,78±0,12 4,30±0,01 23,13±1,03 4,12±0,23 96,50 2 75,4 0,5 30 15 52,30±0,15 14,78±0,03 0,88±0,13 4,40±0,02 23,30±0,63 4,52±0,43 100,27 3 77,5 0,5 90 5 50,12±0,03 14,40±0,03 0,56±0,12 4,49±0,01 23,40±0,43 4,52±0,07 97,49 4 75,55 0,5 90 15 52,10±0,10 14,75±0,04 0,63±0,13 4,56±0,02 22,10±1,13 4,53±0,10 98,67 5 57,45 1,5 30 5 60,83±0,13 4,33±0,04 0,65±0,11 5,88±0,03 18,30±1,04 5,98±1,03 95,97 6 59,53 1,5 30 15 58,56±0,04 4,32±0,06 0,65±0,09 5,65±0,03 23,40±1,21 4,02±1,06 96,60 7 56,5 1,5 90 5 57,40±0,03 4,20±0,07 0,45±0,05 4,89±0,03 25,43±0,73 3,45±0,75 95,82 8 58,32 1,5 90 15 63,34±0,03 5,54±0,11 0,64±0,03 5,80±0,01 19,40±0,53 3,12±0,45 97,84 9 78,4 0,2 60 10 50,30±0,06 16,10±0,14 0,70±0,08 4,30±0,01 21,50±0,55 5,17±0,40 98,07 10 58,3 1,84 60 10 53,40±0,05 2,55±0,03 0,48±0,08 5,80±0,01 31,40±0,45 3,83±0,27 97,46 11 78,2 1 9.5 10 51,40±0,05 14,56±0,01 0,98±0,06 4,28±0,02 22,90±0,50 4,14±1,03 98,26 12 66,9 1 111 10 57,32±0,02 2,50±0,01 0,40±0,05 5,12±0,04 28,30±1,22 2,41±1,09 96,05 13 63,75 1 60 1.6 57,20±0,02 1,20±0,11 0,20±0,11 5,28±0,05 30,10±0,34 2,31±0,97 96,29 14 77,33 1 60 18 54,12±0,01 10,80±0,13 0,69±0,11 4,48±0,03 24,23±0,53 4,10±0,65 98,42 15 65 1 60 10 57,67±0,03 4,34±0,04 0,50±0,06 5,20±0,01 26,80±0,54 3,11±0,45 97,62 16 65,5 1 60 10 57,33±0,11 4,47±0,03 0,45±0,05 5,15±0,01 26,70±0,58 3,46±0,24 97,56 17 64,9 1 60 10 57,20±0,03 4,43±0,03 0,46±0,03 5,25±0,01 26,05±1,16 3,71±0,36 97,55
*médias de três replicatas;
92
Rocha et al. (2014) estudou o pré-tratamento com ácido diluído de bagaço de caju e
verificaram taxas de recuperação de sólidos que variaram de 61,2 a 86,7%.
Os percentuais de sólidos recuperados após o pré-tratamento foram utilizados para
os cálculos dos teores de celulose, hemicelulose e demais componentes observados na
Tabela 5.2 e também foram utilizados nos cálculos dos balanços de massas na etapa de
hidrólise enzimática.
De acordo com a Tabela 5.1, é possível verificar um aumento nos teores de
celulose, o que é uma falsa impressão pois os valores não estão convertidos para a base do
rendimento. De acordo com esta tabela, é possível verificar, para o material caracterizado,
teores de celulose que variaram de 49,67-63,34% de celulose; 1,2-16,1% de hemicelulose e
18,3-26,8% de lignina. Quando corrigidos para a base do rendimento (Tabela 5.2) é
possível perceber o real efeito do pré-tratamento na composição química do material “in
natura”.
93
Tabela 5-2 Composição química da fração sólida obtida do pré-tratamento com H2SO4 da biomassa do caroço de açaí (com a correção do rendimento do pré-tratamento)
Ponto de
ensaio
Sólidos recuperados
g/100g de
material não-tratado
Concentração de
ácido (% m/v)
Tempo de
tratamento (min)
Concentração de
Sólidos (%)
Celulose (g/100g)
Hemicelulose (g/100g)
Lignina (g/100g)
Proteínas (g/100g)
Cinzas (g/100g)
Grupos acetil
(g/100g)
Total
1 79,85 0,5 30 5 39,66±0,01 11,50±0,03 18,47±1,03 3,29±0,13 3,51±0,03 0,62±0,03 77,06 2 75,4 0,5 30 15 39,43±0,11 11,14±0,03 17,57±1,13 3,41±0,45 3,39±0,01 0,66±0,05 75,60 3 77,5 0,5 90 5 38,84±0,03 11,16±0,01 18,14±0,15 3,50±1,06 3,48±0,01 0,43±0,05 75,55 4 75,55 0,5 90 15 39,36±0,09 11,14±0,01 16,70±0,12 3,42±0,77 3,45±0,02 0,48±0,07 74,55 5 57,45 1,5 30 5 34,95±0,02 2,49±0,09 10,51±0,19 3,44±0,75 3,38±0,01 0,37±0,09 55,13 6 59,53 1,5 30 15 34,86±0,5 2,57±0,09 13,93±1,12 2,39±0,03 3,36±0,02 0,39±0,03 57,51 7 68 1,5 90 5 32,43±0,5 2,37±0,01 14,37±1,09 1,95±0,93 2,76±0,03 0,25±0,11 54,14 8 58,32 1,5 90 15 36,94±0,02 3,23±0,11 11,31±0,17 1,82±0,24 3,38±0,02 0,37±0,12 57,06 9 78,4 0,2 60 10 39,44±0,03 12,62±0,09 16,86±0,43 4,05±0,22 3,37±0,05 0,55±0,12 76,89 10 58,3 1,84 60 10 31,13±0,07 1,49±0,02 18,31±0,23 2,23±1,02 3,38±0,03 0,28±0,11 56,82 11 78,2 1 9,5 10 40,19±0,07 11,39±0,01 17,91±0,19 3,24±0,83 3,35±0,03 0,77±0,05 76,84 12 66,9 1 111 10 38,35±0,03 1,67±0,01 18,93±0,11 1,61±0,63 3,43±0,01 0,27±0,07 64,26 13 63,75 1 60 1,6 36,47±0,01 0,77±0,10 19,19±0,09 1,47±0,05 3,37±0,01 0,13±0,07 61,38 14 77,33 1 60 18 41,85±0,02 8,35±0,01 18,74±0,65 3,17±0,03 3,46±0,03 0,53±0,09 76,11 15 65 1 60 10 37,49±0,03 2,82±0,01 17,42±0,63 2,02±0,03 3,38±0,5 0,33±0,11 63,45 16 65,5 1 60 10 37,55±0,05 2,93±0,11 17,49±0,73 2,27±1,04 3,37±0,01 0,29±0,12 63,90 17 64,9 1 60 10 37,12±0,05 2,88±0,03 17,20±0,77 2,41±1,02 3,41±0,01 0,30±0,11 63,31
*médias de três replicatas;
94
Após o pré-tratamento, é possível verificar que na base do rendimento, os níveis de
celulose no material pré-tratado variaram de 31,13 a 41,85g/100g. De maneira geral, esse
teor mostrou uma redução quando comparado com o material “in natura” (45,3%). Este
comportamento já era esperado uma vez que uma parte da celulose é solubilizada a
monômeros como, por exemplo, a glicose. Ainda para o teor de celulose, verifica-se que o
material tratado nas condições do ponto 10 (1,84% de ácido; 60 minutos e 10% de sólidos)
promoveu a permanência do menor teor de celulose (31,13g/100g) e conseqüentemente
também, foi aquele responsável pelo maior índice de solubilização observado (31,28%)
(Figura 5.1) o que ocorreu claramente em função da elevada concentração de ácido
utilizada e da elevada quebra das cadeia de celulose. Zhang et al. (2009) obteve taxa
máxima de solubilização da celulose de 42,3% em reator Par de 1L com H2SO4 diluído. É
importante ressaltar que a degradação excessiva da celulose não é um aspecto desejável
para o pré-tratamento nesta etapa.
Quando se compara os teores de celulose obtidos para os pontos médios (15, 16 e
17) (1% de H2SO4 /60 min/10% de sólidos) no qual se obteve uma média de 37,38g/100g
de celulose com os resultados obtidos para o ponto 10 (aumento da concentração de ácido
para 1,84%) verificou-se uma redução no teor de celulose em 17% o que gerou um aumento
nas concentrações de glicose e celobiose nos licores (Figura 5.1) obtidos para este último
ponto em relação aos pontos 15, 16 e 17. Porém, quando o teor de ácido utilizado caiu para
0,2% (Ponto 9) nas mesmas condições dos pontos médios, foi verificado um aumento no
teor de celulose de 5,5% e uma menor taxa de solubilização para os índices de celulose
(12,95%) deste ponto em comparação com os obtidos para os pontos médios (17,47%) o
que evidencia a efetiva influência da concentração de ácido no pré-tratamento.
É possível verificar a influência do tempo no teor de celulose no material
caracterizado quando se observa que um acréscimo no tempo de pré-tratamento de 30 para
90 minutos (ponto 5 para o ponto 7) promoveu uma redução no teor de celulose de
34,95g/g100g para 32,43 g/g100g, o que representou um aumento na taxa de solubilização
de 24%. A menor taxa de solubilização da celulose obtida para o pré-tratamento aplicado
foi de 7,61% observada para o ponto 14 (1% de ácido; 60 min; 18% de sólidos)
provavelmente pelo alto teor de sólidos utilizados neste ensaio. Nesses casos é comum
95
ocorrer uma redução na penetração do solvente no material tratado em função do aumento
da concentração de sólidos (CONTRERAS & SMYRL, 1981).
De acordo com a literatura, o pré-tratamento ácido da maioria dos materiais
lignocelulósicos resulta na quase completa solubilização de hemicelulose e de uma digestão
parcial da celulose (em torno de 10%) o que leva ao fornecimento de açúcares
monoméricos ou oligoméricos (KIM et al., 2005; LU et al. , 2007; ELANDER et al., 2009).
O pré-tratamento do caroço de açaí com ácido diluído apresentou maior influência na
remoção da fração de hemicelulose. Os teores de hemicelulose no material pré-tratado
variaram de 0,77 a 12,62 g/100g e as taxas de solubilização para este componente variaram
de 30,65% a 95,80%. Rocha et al. (2014) encontraram teores de hemicelulose no bagaço de
caju pré-tratado com H2SO4 que variaram de 1,62 a 3,24 g/100g. De acordo com o mesmo
autor, esses teores reduzidos de hemicelulose são esperados uma vez que o pré-tratamento
com ácidos diluídos é direcionado à solubilização da hemicelulose visando reduzir o custo
associado com a compra de enzimas hemicelulases.
O ponto 13 (1% de ácido/60 minutos/1,6% de sólidos) foi aquele que demonstrou
menor teor de hemicelulose (0,77g/100g) e maior taxa de solubilização (95,80%) após ser
pré-tratado, esse comportamento pode ser explicado pela baixa carga de sólidos utilizada
neste ponto. De acordo com Contreras & Smyrl (1981), o coeficiente de difusividade da
água depende do conteúdo de sólidos dissolvidos, ou seja, a difusividade cresce com a
diminuição de sólidos o que consequentemente permitiria uma penetração maior da solução
ácida e consequente solubilização da biomassa.
Quando houve um aumento na concentração de ácido de 1% (pontos 15, 16 e 17)
para 1,84% foi verificado um aumento de apenas 9% na solubilização da hemicelulose. Por
outro lado, o aumento na concentração de ácido de 0,2% para 1% promoveu um aumento
na taxa de solubilização de 174%.
De acordo com a Figura 5.1, a taxa de solubilização da lignina variou de 5,08% a
48,39%. De maneira geral, houve uma redução nos teores de lignina observados para o
material pré-tratado (10,51 a 19,19%) em comparação com o material “in natura”
(20,37g/100g) quando considerado o rendimento. Rocha et al. (2014), observaram
conteúdos constantes para a lignina durante o pré-tratamento de bagaço de caju com H2SO4
96
dilúído. Apesar da solubilização de uma parte da lignina, grande parte deste componente
permanece no material sólido remanescente (TAHERZADEH & KARIMI, 2008).
O teor de proteínas, cinzas e grupos acetil variaram de 1,47 a 3,50%; 2,76 a 3,51 e
0,27 a 0,78% respectivamente.
Na Figura 5.1, pode-se observar as taxas de solubilização encontradas após o pré-
tratamento com H2SO4 diluído. Estes valores foram encontrados a partir da relação entre a
quantidade do componente no caroço pré-tratado e no caroço “in natura”.
De acordo com a Figura 5.1, o principal componente lignocelulósico solubilizado no
pré-tratamento com ácido diluído foi a hemicelulose (30,65 a 91,83%) seguida pela
celulose (11,27 a 31,28%) e lignina (5,80 a 48,39%). O teor de proteína demonstrou um
intervalo de solubilização que variou de 5,74 a 65,75%. De acordo com Diaz et al. (2010),
aumentos na severidade do pré-tratamento diminuem as taxas de sólidos recuperados, como
uma consequência da solubilização dos extrativos e da fração de hemicelulose.
97
Figura 5.1. Solubilização dos componentes da biomassa após o pré-tratamento com H2SO4 diluído.
98
Oliveira (2010) encontrou para o pré-tratamento de palha de cana-de-açúcar taxas
máximas de solubilização de 95,3% e 46,1% para a hemicelulose e lignina,
respectivamente, em temperaturas que variavam de 180 a 195°C. Silva (2009) obteve
rendimentos menores que aqueles citados pelo último autor e foram de 66,9% e 31,9%
para a hemicelulose e lignina, respectivamente.
Zhang et al. (2011) obtiveram altas taxas de solubilização da hemicelulose (74,5%)
menores que as obtidas neste trabalho (máxima de 91,83%) a uma temperatura de 180°C
em uma concentração de H2SO4 de 1% durante 15 minutos. O mesmo autor utilizou
concentrações que variaram de 0,5% a 1% de H2SO4 e obtiveram taxas máximas de
solubilização da celulose (2% a 55%) maiores que as observadas neste trabalho.
Nas Tabelas 5.3 e 5.4 são apresentados os resultados obtidos para a análise
estatística realizada para os principais componentes recuperados na fase sólida: Celulose,
hemicelulose e grupos acetil. Na Tabela 5.3 é possível verificar as variáveis que foram
significativas a um nível de confiança de 90% e o efeito de cada uma delas nos teores dos
componentes analisados (Variáveis-respostas).
De acordo com a Tabela 5.3, a variável de maior influência na concentração de
celulose recuperada em fase sólida foi a concentração de ácido (L) a qual mostrou-se
significativa (p = 0,000729) a um nível de 90% de confiança. A mesma variável demonstra
valor negativo o que significa que aumentos na concentração de ácido reduziriam os teores
de celulose recuperada em fase sólida.
Tanto para a concentração de hemicelulose como também para a concentração de
grupos acetil, a variável significativa de maior influência também foi a concentração de
ácido (L) ambas com valores negativos o que demonstraria o mesmo comportamento que
foi observado para os teores de celulose. As variáveis: tempo (L) e a Carga de sólidos (Q)
foram consideradas estatisticamente significativas para todas as repostas analisadas.
99
Tabela 5-3 Resultados estatísticos obtidos para os principais componentes da fração sólida obtida após o pré tratamento com H2SO4 diluído.
Fatores
Celulose Hemicelulose Grupos Acetil
Efeitos Significância
estatística
(p)
Efeitos Significância
estatística
(p)
Efeitos Significância
estatística
(p)
Média 37,51346 0,000012 2,88732 0,000113 0,308270 0,001501
(X1)Concentração de ácido (L) -4,67506 0,000729 -7,97149 0,000013 -0,190258 0,003567
(X1) Concentração de ácido (Q) -1,96803 0,005187 3,48999 0,000089 0,089193 0,020100
(X2) Tempo (L) -0,65412 0,034399 -2,38454 0,000146 -0,198680 0,003185
(X2) Tempo (Q) 0,89711 0,021984 2,75142 0,000130 0,153715 0,006245
(X3) Carga de sólidos (L) 2,04549 0,003789 1,99424 0,000215 0,133180 0,007239
(X3) Carga de sólidos (Q) 0,84016 0,027508 1,43765 0,000525 0,021286 0,239205
(X1)(X2) 0,11250 0,565016 0,22089 0,028027 0,057500 0,059722
(X1)(X3) 1,03289 0,024048 0,32817 0,012994 0,012500 0,485201
(X2)(X3) 1,33520 0,014601 0,27793 0,017979 0,027500 0,202675
(*)Resultados analisados a um nível de confiança de 90%, logo p<0,1 = significativo;
**Variáveis significativas em negrito
De acordo com BARROS NETO et al. (2003), para que um modelo estatístico seja
considerado bom deve atender o requisito de passar em dois testes, os chamados testes F. O
Teste F1 representa a significância da regressão e permite dizer se o modelo é significativo
desde que o Fcalculado da regressão seja maior que o Ftabelado da regressão (5 a 10 vezes
maior). No caso do segundo teste, a condição de validade é inversa, ou seja, o Fcalculado
da falta de ajuste tem que ser no mínimo 5 (cinco) vezes menor que o Ftabelado para se
verificar se há falta de ajuste do modelo.
É importante ressaltar que na fração sólida o principal componente de interesse seria
o teor de celulose, que posteriormente seria hidrolisado enzimaticamente a
monossacarídeos. Dessa forma após a eliminação dos fatores considerados não-
significativos foi realizada a ANOVA apenas para o teor de celulose com o objetivo de
gerar um modelo que pudesse prever tais concentrações deste componente na fração sólida
no pós pré-tratamento.
100
Na Tabela 5.4 é possível observar os resultados da ANOVA realizada para os teores
de celulose presentes na fração sólida.
Tabela 5-4 Resultados da ANOVA realizada para os teores de celulose recuperada na fração sólida após o pré tratamento ácido no nível de 90% de confiança.
Fonte de variação Soma Quadrática
Graus de
Liberdade
Média Quadrática
F calculado
F tabelado
Regressão (R) 116,521 8 14,56517 13,01 2,58 Resíduos (r) 8,953 8 1,119126 Falta de ajuste (faj) 8,8466 6 1,47443 27,70 9,32 Erro puro (ep) 0,1064 2 0,05322 Total (T) 125,4744 16
% de variação explicada (R²) 92,86% % máxima de variação explicável 99,92%
Teste F1 calculado para verificar a significância estatística da regressão Teste F2 calculado para verificar a falta de ajuste do modelo
De acordo com a análise estatística, o modelo que poderia ser gerado a partir dos
resultados de celulose obtidos apresentou regressão significativa, mas o modelo não pode
ser considerado preditivo, pois a falta de ajuste também foi significativa (F calculado
superior ao F tabelado). Dessa maneira, nem o modelo nem as superfícies de respostas
puderam ser geradas.
O coeficiente de determinação (R2) obtido foi de 0,92, indicando que o modelo
explicou 92,86% da variação dos dados experimentais.
5.2. RESULTADOS OBTIDOS PARA A COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA
FRAÇÃO LÍQUIDA APÓS O PRÉ-TRATAMENTO COM H 2SO4 DILUÍDO
As condições ácidas permitem uma maior decomposição do material
lignocelulósico, porém são gerados os chamados produtos de degradação dos
monossacarídeos (CHEUNG & ANDERSON, 1996). Estes compostos incluem o Furfural
que é resultante da desidratação das pentoses e o Hidroximetilfurfural (HMF) resultante da
decomposição das hexoses. Juntamente com o ácido acético formado a partir da ruptura das
ligações dos grupos acetil aos açúcares contribuirão para a inibição da posterior
101
fermentação, o que ocasionará a redução nas taxas de produção de etanol (ROMERO et al.,
2007).
A análise dos licores obtidos após o pré-tratamento foi realizada com o objetivo de
se verificar a viabilidade do processo com um visão mais completa uma vez que vários
trabalhos da literatura relatam a fermentação dos licores obtidos (principalmente a xilose)
para a produção de biohidrogênio num processo chamado fermentação negra (HAWKES et
al., 2008; CHEN et al., 2008) ou para a produção de etanol com a utilização de
microorganicos fermentadores de pentoses (QIAN et al., 2006; CHANDEL et al., 2007). ´
Dessa forma, a avaliação dos teores de inibidores produzidos durante o pré-
tratamento é de extrema importância e são obtidos a partir da análise dos licores após o pré-
tratamento os quais são mostrados na Tabela 5.5.
De acordo com a Tabela 5.5, a concentração de celulose presente no licor variou de
3,45 a 14,17g/100g . Mais de 90% da celulose foi recuperada na forma de glicose. O
aumento do tempo de 30 para 90 minutos nas condições de 1,5% de ácido e 5% de sólidos
promoveu uma redução no teor de celulose recuperada de 10,37% para 6,27%. Enquanto
que o aumento na concentração de ácido de 0,2% (condições do ponto 9) para 1%
(condições dos pontos 15, 16 e 17) aumentaram os teores de celulose recuperada de 5,86
para 7,91g/100g o que mostra o efeito do ácido na solubilização da celulose na fração
sólida e consequente passagem do mesmo para a fração líquida (licor) na forma de
monômeros e oligômeros.
102
Tabela 5-5 Balanço de massa da fração líquida proveniente do pré tratamento com H2SO4
Ponto de ensaio
Concentração de
ácido (% m/v)
Tempo de
tratamento (min)
Concentração de
Sólidos (%)
Celulose (g/100g)
Hemicelulose (g/100g)
Grupos acetil
(g/100g)
Proteínas (g/100g) Total
1 0,5 30 5 5,69±0,05 6,61±0,05 2,03±0,05 1,01±0,11 15,34 2 0,5 30 15 6,22±0,09 6,63±0,05 2,0±0,03 0,89±0,13 15,77 3 0,5 90 5 6,20±0,12 6,89±0,05 2,04±0,03 0,80±0,13 15,92 4 0,5 90 15 6,33±0,09 6,98±0,05 2,23±0,05 0,88±0,15 16,42 5 1,5 30 5 10,87±0,09 15,58±0,05 2,36±0,05 0,86±0,17 29,67 6 1,5 30 15 9,18±0,11 14,67±0,05 2,36±0,05 1,91±0,09 28,11 7 1,5 90 5 13,49±0,11 16,02±0,05 2,35±0,09 1,95±0,09 34,20 8 1,5 90 15 9,05±0,12 14,88±0,05 2,37±0,11 2,48±0,09 28,78 9 0,2 60 10 6,00±0,20 5,56±0,05 2,38±0,03 0,25±0,03 14,18 10 1,84 60 10 15,26±0,02 16,54±0,05 1,99±0,01 2,07±0,03 35,86 11 1 9.5 10 5,26±0,21 6,77±0,05 2,67±0,03 1,06±0,05 15,77 12 1 111 10 7,19±0,23 16,32±0,05 2,16±0,02 2,69±0,05 28,36 13 1 60 1,6 8,29±0,15 17,35±0,05 2,13±0,01 2,83±0,05 30,60 14 1 60 18 3,65±0,15 9,81±0,05 2,13±0,03 1,13±0,15 16,73 15 1 60 10 8,30±0,17 15,34±0,05 2,13±0,03 2,28±0,09 28,05 16 1 60 10 8,15±0,11 15,24±0,05 2,12±0,05 2,03±0,08 27,54 17 1 60 10 8,73±0,11 15,29±0,05 2,12±0,05 1,89±0,08 28,03
*médias de três replicatas;
103
De acordo com os resultados mostrados na Tabela 5.5, é possível perceber que o
maior constituinte presente nos licores foi a hemicelulose com taxas que variaram de
5,56 a 17,35 g/100g. É possivel verificar que o aumento na concentração de ácido de
1% para 1,84% (comparação da média dos pontos 15, 16 e 17 com o ponto 10) elevou
os níveis desse componente no licor, que passaram de 15,29g/100g (média) para
16,54g/100g. Esse comportamento foi verificado também por Rocha et al. (2014)
quando foi variada a concentração de H2SO4 com uma concentração de sólido de 15%
de bagaço de caju. Em geral, o licor proveniente do tratamento com H2SO4 diluído
apresenta um elevado teor de hemiceluloses. Dependendo do substrato e das condições
utilizadas, entre 80% a 95% dos açúcares hemicelulósicos podem ser recuperados com o
prétratamento com ácido diluído (BALAT, 2011).
Em relação ao teor de celulose, foi verificado um intervalo que variou de 3,65 a
15,26g/100g. Enquanto que o teor de proteína variou de 0,25 a 2,83% e também
aumentou quando houve aumento no tempo e na concentração de H2SO4. O que
também foi observado para os grupos acetil recuperados nos licores.
Na Figura 5.2, é possível verificar que a maior parte da celulose foi recuperada
na forma de glicose (mais de 90%) e a hemicelulose na forma de xilose (mais de 90%)
que, foi por sua vez, o principal componente presente no licor, com valores que
variaram entre 2,90 a 25,38 g/L (Tabela 5.6).
Figura 5.1 Concentração de açucares na fração líquida do pré-tratamento (licor)
104
O principal açúcar presente no licor é a xilose, de tal forma que qualquer pré-
tratamento realizado deve ser realizado tendo-se em mente a possibilidade de fermentar
a fração líquida (principalmente xilose). Dessa forma, a condição ótima seria aquela que
possibilitasse a presença de uma grande quantidade de xilose no liquor e baixa
quantidade de inibidores. O ponto 8 (1,5% de ácido; 90 minutos e 15% de sólidos) foi
aquele que melhor atendeu a primeira condição.
O teor de glicose recuperado no hidrolisado variou de 1,2 a 14,9 g/L sendo o
ponto 10 ( Figura 5.2) a condição (1,84% de ácido; 60 minutos e 10% de sólidos) que
permitiu uma maior recuperação de glicose. Já para a recuperação de xilose a melhor
condição foi aquela observada para o ponto 8 (1,5% de ácido, 90 minutos e 15% de
sólidos). Não foram detectados índices de arabinose nos licores analisados.
A possibilidade de fermentar os licores provenientes do pré-tratamento ácido
enfrenta o obstáculo da presença dos chamados inibidores da fermentação que também
foram quantificados e tem seus teores apresentados jutamente com os teores de xilose e
glicose recuperada na Tabela 5.6.
Tabela 5-6 Resultados dos teores de xilose e inibidores recuperados no licor. Ponto
De ensaio
Fator de
Severidade
Xilose (g/L)
Glicose (g/L) Furfural
(g/L) HMF (g/L)
Ácido Acético (g/L)
1 0,19 3,3800 2,3000 0,0070 0,0370 1,2551 2 0,19 10,9400 9,2200 0,0060 0,0530 4,1561 3 0,673 3,2800 2,9800 0,0060 0,0710 1,4085 4 0,673 11,3800 9,2000 0,0008 0,1110 4,6791 5 0,795 8,4500 5,2000 0,0010 0,0600 1,3457 6 0,795 25,3800 13,5000 0,0020 0,1340 4,6372 7 1,273 8,4500 6,4000 0,0050 0,0740 1,4852 8 1,273 24,8800 13,2000 0,0010 0,1320 4,6582 9 0,096 6,0900 5,9900 0,0010 0,0100 2,9218 10 1,196 17,3800 14,9000 0,0010 0,1830 3,2286 11 - 7,1100 5,2100 0,0020 0,0310 2,5312 12 1,014 17,7800 7,1300 0,0009 0,2210 3,3402 13 0,746 2,9000 1,1200 0,0091 0,0010 0,3271 14 0,746 19,3000 6,3200 0,0020 0,0570 5,5243 15 0,746 17,1900 8,1200 0,0009 0,0270 3,2007 16 0,746 17,0900 8,1000 0,0010 0,0240 3,2704 17 0,746 17,0500 8,5400 0,0010 0,0260 3,2565
De acordo com os resultados obtidos, verifica-se que o aumento no fator de
severidade do pré-tratamento gerou maiores taxas de xilose recuperada e inibidores. O
105
maior teor de xilose recuperada foi obtido para o ponto 6 que apresentou o valor de
0,795 de fator de severidade.
Os níveis de inibidores Furfural e HMF observados encontraram-se entre
0,0008 a 0,0091 g/L e 0,0010 a 0,221 g/L, respectivamente. De acordo com Felipe et al.
(1993), apenas concentrações acima de 1g/L de HMF, são reportadas como inibitórias
ao metabolismo microbiano. Já Taherzadeh et al. (2000) reportaram que o crescimento
de Saccharomyces cerevisiae em meio sintético foi inibido em 70% com a presença de
4g/L de HMF, e em 89% com 4g/L de furfural. Foi observado pelos mesmos autores
que na presença de furfural (2g/L) e HMF (2g/L), que o crescimento deste
microrganismo foi inibido completamente o que poderia sugerir um efeito sinergístico
de inibição destes dois compostos. De maneira geral, os teores de furfural e HMF
encontrados seriam menores que aqueles relatados como inibitórios.
Os teores de acido acético mostraram valores que variaram entre 0,3271 a
5,5243g/L em sua maioria acima do limite de 0,3 g/L, considerado inibitório para a
maioria dos microrganismo até o momento estudados (HELLE et al., 2003) o que
exigiria uma etapa de detoxificação para uma maior viabilidade de fermentação dos
licores obtidos. Todavia, Delgenes et al. (1996) observou que concentrações de 10 g/L
de ácido acético levaram a uma redução de apenas 27% na produção de etanol pela
S.cerevisiae. Djioleu et al. (2012) realizou o pré-tratamento com H2SO4 diluído e
observou a produção de compostos inibitórios tais como furfural, HMF, ácido fórmico e
ácido acético em um intervalo que variou 0,1 to 32,3 g/L. De maneira geral, o pré-
tratamento com ácido diluído produz menos produtos de degradação do que o pré-
tratamento com ácido concentrado (ALVIRA et al., 2010).
É possível observar que aumentos no fator de severidade de maneira geral
levaram a aumentos nos teores de inibidores. Este fato fica evidenciado quando se
comparam os pontos 9, 10 e 15.
A análise estatística do planejamento experimental mostrado na Tabela 5.5 foi
realizada para os teores de xilose, furfural e HMF e os resultados são apresentados na
Tabela 5.7. A análise estatística revelou que a variável carga de sólidos (L) foi aquela
que mais influenciou no teor de xilose presente no licor analisado, seguida pela
concentração de ácido (L). A variável concentração de ácido (L) apresentou o valor do
efeito positivo (Efeito = 8,59252), e foi significativa em um limite de confiança de 90%
(p < 0,1 = 0,000012). O valor positivo indica que aumentos na concentração de ácido
106
levariam a aumentos dos teores de xilose no licor. Entretanto, a variável concentração
de ácido (Q) também foi significativa (p<0,1 = 0,000086) e apresentou valor negativo o
que indica que a concavidade da superfície de resposta estaria voltada para baixo o que
mostra a presença de um ponto de máximo (condição ótima), a partir do qual se observa
uma redução dos teores de xilose a partir de novos aumentos na concentração de ácido.
Este comportamento também foi verificado no trabalho de Lu et al. (2009), que variou a
concentração de ácido de 0,5 a 2% a 180°C e por Sun & Cheng (2005) que utilizaram as
concentrações de ácido de 0,6 a 1,5% a 120°C.
Tabela 5-7 Resultados dos efeitos estimados e significância das respostas: xilose, HMF e Furfural obtidos para o pré-tratamento com H2SO4 diluído.
Fatores Xilose HMF Furfural Efeitos Significância
estatística (p)
Efeitos Significância estatística
(p)
Efeitos Significância estatística
(p) Média 17,01614 0,000003 0,000829 0,001598 0,024564 28,0006 (X1)Concentração de ácido (L)
8,59252 0,000012 -0,001636 0,000373 0,059899 71,6455
(X1) Concentração de ácido (Q)
-3,78294 0,000086 0,000501 0,005008 0,051656 54,8260
(X2) Tempo (L) 2,62639 0,000119 -0,000748 0,001731 0,061524 74,5997
(X2) Tempo (Q) -2,90523 0,000120 0,000697 0,002349 0,069102 77,1618
(X3) Carga de sólidos (L) 11,22954 0,000007 -0,002988 0,000112 0,041865 50,0751
(X3) Carga de sólidos (Q) -3,87273 0,000077 0,003797 0,000088 0,001998 2,1206
(X1)(X2) -0,21000 0,054208
0,002300 0,000315 -0,020000 -18,5164
(X1)(X3) 4,42500 0,000087 0,000800 0,002594 0,019000 17,5906
(X2)(X3) 0,01000 0,072791 -0,002300 0,000315 0,002000 1,8516
De acordo com a Tabela 5.7, todas as variáveis analisadas foram consideradas
significativas a 90% de significância para os teores de HMF. E as variáveis de maior
efeito nos teores de HMF foram as variáveis carga de sólidos (L) e carga de sólido (Q).
A primeira apresentou valor negativo o que demonstra que aumentos na concentração
dos sólidos diminuiríam os teores de HMF. Com relação à segunda variável, observou-
se um valor positivo, o que significa que a superfície de resposta apresenta concavidade
voltada para cima e que aumentos na carga de sólidos reduziriam os teores de HMF até
um ponto mínimo, a partir do qual, novos aumentos gerariam elevações nos teores de
HMF.
Em relação aos teores de furfural, as variáveis que tiveram maiores efeitos
foram: tempo (L) e (Q), ambas com valores positivos, o que indica que aumentos no
107
tempo levariam a aumentos nos teores dessa resposta e que existiria a presença de um
ponto máximo, a partir do qual, novos aumentos de tempo levariam a reduções nos
teores de furfural.
Na Figura 5.3, é possível observar o gráfico de Pareto no qual se verifica como
cada variável do processo contribuiu para os teores de xilose recuperada nos licores
obtidos a partir do pré-tratamento com H2SO4 diluído em um nível de significância de
90% (p=0,1).
Gráfico de pareto para o teor de Xilose (licor)
,0055303
-,116136
1,902279
-1,93782
-2,39837
2,44715
-2,4553
6,139141
8,023223
p=,1
2Lby3L
1Lby2L
(2)Tempo (minutos)(L)
Tempo (minutos)(Q)
concentração de ácido (%)(Q)
1Lby3L
Carga de sólidos (%)(Q)
(1)concentração de ácido (%)(L)
(3)Carga de sólidos (%)(L)
1,902279
-1,93782
-2,39837
2,44715
-2,4553
6,139141
8,023223
Figura 5.2 Gráfico de Pareto para os teores de xilose nos licores obtidos a partir do pré-tratamento com H2SO4 diluído.
Como o principal interesse no licor proveniente do pré-tratamento com H2SO4
diluído é a xilose foi realizada a análise de variância para verificar a possibilidade de
gerar um modelo que pudesse prever esses teores. Os resultados da análise de variância
realizada para os teores de xilose (Tabela 5.6) estão apresentados na Tabela 5.8.
108
Tabela 5-8 Resultados da ANOVA para o teor de xilose presente no licor (hidrolisado)
Fonte de variação Soma
Quadrática
Graus de
Liberdade
Média Quadrática
F calculado
F tabelado
Regressão (R) 800,260 8,000 100,0325 17,48 2,59 Resíduos (r) 45,776 8,000 5,721965 Falta de ajuste (faj) 45,7653 6 7,6276 1466,83 9,32 Erro puro (ep) 0,0104 2 0,0052 Total (T) 846,0354 16 % de variação explicada (R²) 94,59% % máxima de variação explicável 100,00%
De acordo com a Tabela 5.8, o modelo foi considerado significativo pois o
Fcalculado da regressão foi maior que o Ftabelado. No entanto, o modelo não pode ser
considerado preditivo, pois a falta de ajuste também foi significativa (F calculado
superior ao F tabelado). Dessa forma, não foi possível gerar superfícies de repostas e
nem modelo a partir dos resultados obtidos. O alto valor de F calculado para a falta de
ajuste é devido ao fato de que à média quadrática (MQ) do erro puro apresenta um valor
muito inferior a média quadrática da falta de ajuste (devido à boa repetição dos ensaios
nos pontos centrais); isso faz com que a razão entre eles resulte num valor muito alto. O
coeficiente de determinação (R2) obtido foi de 0,94 o que indica que o modelo explicou
94% da variação dos dados experimentais.
5.3. RESULTADOS OBTIDOS PARA A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DO
CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO COM H 2SO4 DILUÍDO
Na Tabela 5.9, são mostrados resultados obtidos com a hidrólise enzimática da
biomassa do caroço de açaí pré-tratado.
109
Tabela 5-9 Resultados obtidos para os teores de glicose (g/g de biomassa crua), conversão enzimática e rendimento global.
Ensaio
Concentração de
ácido (% m/v)
Tempo de
tratamento (min)
Concentração de
Sólidos (%)
Fator de
Severidade
g glicose/
g caroço
cru
Conversão (%)
Rendimento
Global (%)
1 0,5 30 5 0,195 0,20 44,91 39,51 2 0,5 30 15 0,195 0,15 34,88 30,51 3 0,5 90 5 0,673 0,22 51,92 44,74 4 0,5 90 15 0,673 0,20 44,84 39,16 5 1,5 30 5 0,795 0,28 72,63 56,30 6 1,5 30 15 0,795 0,28 71,99 55,67 7 1,5 90 5 1,273 0,17 46,94 33,77 8 1,5 90 15 1,273 0,28 68,43 56,08 9 0,2 60 10 0,096 0,16 35,52 31,07 10 1,84 60 10 1,196 0,25 73,17 50,53 11 1 9.5 10 - 0,15 34,69 30,93 12 1 111 10 1,014 0,31 72,93 62,04 13 1 60 1,6 0,746 0,31 76,11 61,57 14 1 60 18 0,746 0,26 56,77 52,70 15 1 60 10 0,746 0,27 65,80 54,72 16 1 60 10 0,746 0,28 67,42 56,16 17 1 60 10 0,746 0,27 66,23 54,54
Nesta etapa do trabalho, uma determinada massa do material pré-tratado foi
hidrolisada enzimaticamente com o objetivo de se avaliar o efeito do pré-tratamento
com H2SO4 diluído na conversão de celulose em glicose e os resultados são mostrados
na Tabela 5.9.
De acordo com a Tabela 5.9, é possível observar que a conversão variou de
34,69 a 76,11%. O ponto 13 (1% de ácido; 60 minutos e 1,6% de sólidos) foi aquele que
permitiu a maior taxa de conversão. Na comparação entre os pontos 9 (0,2% de ácido,
60 minutos e 10% de solidos) e 15, 16 e 17 (1% de ácido, 60 minutos e 10% de solidos)
é possível observar que houve um aumento na conversão de 35,52% para 66,48%
(média). Esse comportamento é novamente observado quando é realizado um novo
aumento na concentração de ácido no ponto 10 (1,84% de ácido, 60 minutos e 10% de
sólidos) o que resultou em uma taxa de conversão de 73,17%. Pode-se afirmar que a
concentração de ácido promoveu maior remoção da hemicelulose e consequentemente,
houve maior efetividade no ataque enzimático, observado na forma de maiores
resultados de conversão enzimática. De acordo com Marasabessy et al. (2012), o
110
aumento na concentração de H2SO4 aumenta a solubilização das pentoses o que
proporciona um aumento na acessibilidade enzimática a biomassa.
É possível verificar que o ponto 13 (fator de severidade = 0,746) que mostrou
maior valor de conversão enzimática (76,11%). Este comportamento está diretamente
relacionado ao fato de que houve, para este ponto uma alta taxa de solubilização da
hemicelulose e da lignina o que contribuiu para o aumento da efetividade do ataque
enzimático. Na Figura 5.4, pode-se verificar o gráfico que mostra os valores de
conversão enzimática e rendimento global obtidos para os ensaios realizados.
Figura 5.3 Resultados obtidos para conversão e rendimento global obtidos para o material pré-tratado.
De maneira geral, o pré-tratamento com ácidos diluídos tem um efeito pouco
efetivo na remoção da lignina e na modificação da estrutura cristalina da celulose, o que
leva a atribuir o aumento na conversão enzimática pelo aumento da acessibilidade das
enzimas a celulose devido à remoção da hemicelulose (DJIOLEU et at., 2012).
A partir da Tabela 5.9, também é possível observar que o rendimento global
variou de 30,51 a 62,04%. Na mesma tabela, são mostrados os resultados obtidos para
os teores de glicose (g de glicose/ g de bagaço cru) que variaram de 0,15 a 0,31. A título
de facilitar a comparação com dados encontrados na literatura para a hidrólise
enzimática, escolheu-se realizar o tratamento estatístico para os resultados de glicose (g
111
de glicose/ g de bagaço cru). A análise estatística dos resultados obtidos para glicose (g
de glicose/ g de bagaço cru) foi realizada utilizando o erro puro e o software Statistica
(Statsoft, v. 7.0) e é mostrada na Tabela 5.10.
Tabela 5-10 Análise dos efeitos principais e de interação das variáveis do pré-tratamento com H2SO4.
Fatores Efeito estimado
Erro puro
t(2) Significância estatística (p)
Efeitos principais Média 0,276321 0,002555 108,1651 0,000085 (X1) Concentração de ácido (%)(L) 0,061755 0,002435 25,3658 0,001551 (X1) Concentração de ácido (%)(Q) -0,061006 0,002744 -22,2355 0,002016 (X2) Tempo (min)(L) 0,032619 0,002402 13,5822 0,005377 (X2) Tempo (min)(Q) -0,036081 0,002608 -13,8355 0,005183 (X3) Carga de sólidos (L) -0,005626 0,002435 -2,3110 0,147038 (X3)Carga de sólidos (Q) 0,001117 0,002744 0,4071 0,723362
Efeitos de interação
X1 X2 -0,045038 0,003145 -14,3190 0,004842 X1 X3 0,045346 0,003145 14,4170 0,004777 X2 X3 0,032962 0,003145 10,4796 0,008983
*Valores estatisticamente significativos a 90% de confiança (p < 0,10); **Valores em negrito: valores significativos a 90% de confiança.
De acordo com a Tabela 5.10, é possível verificar que, com exceção das
variáveis carga de sólidos (L) e (Q), todas as outras variaveis e suas interações foram
consideradas significativas a 90% de confiança. A variável concentração de ácido (L)
foi aquela que mostrou maior efeito (efeito = 0,061755) nos resultados de glicose (g de
glicose/ g de bagaço cru). A mesma variável demonstrou valor positivo o que significa
que aumentos nos teores de ácido promoveriam aumentos nos valores de glicose (g de
glicose/ g de bagaço cru) obtidos pela hidrólise enzimática da biomassa pré-tratada. A
concentração de ácido (Q) foi a segunda variável com maior efeito considerada
significativa a qual demonstrou valor (-0,061006) negativo o que indica que a superfície
de resposta apresentaria concavidade voltada para baixo com a presença de um ponto
máximo da resposta analisada.
Na Figura 5.5, é mostrado o gráfico de Pareto no qual se verifica o quanto cada
uma das variáveis influenciou nos teores de g de glicose/g de bagaço cru obtidos após a
hidrólise enzimática. É possível verificar que as variáveis concentração de ácido (L)
seguidas pela variável tempo (Q), foram as que mais mostraram influência nos teores de
glicose liberada/ g de caroço cru.
112
Gráfico de Pareto para o teor de g de glicose/ g de caroço cru
10,47962
13,58296
-14,319
14,41702
-14,5563
-23,2535
25,3696
p=,1
2Lby3L
(2)Tempo (minutos)(L)
1Lby2L
1Lby3L
Tempo (minutos)(Q)
concentração de ácido (%)(Q)
(1)concentração de ácido (%)(L)
Figura 5.4 Gráfico de Pareto para o Teor de g de glicose/ g de caroço cru.
Na Tabela 5.11, são observados os resultados obtidos para a ANOVA realizada
para os resultados dos teores de glicose liberada após a hidrólise enzimática do bagaço
pré-tratado com H2SO4.
É possível verficar que o modelo foi signifcativo uma vez que passou no teste F
da regressão (Fcalculado > Ftabelado). Porém, o modelo e as superfícies de respostas
não puderam ser gerados em virtude da falta de ajuste significativa observada para o
planejamento, pois não passou no teste F da falta de ajuste (Fcalculado > Ftabelado). De
acordo com Tabela 5.11, o R2 apresentou valor de 0,7626 o que demonstra que o
modelo explicou 76,26% da variação dos dados experimentais.
113
Tabela 5-11 Análise da variância (ANOVA) para a concentração de glicose liberada após a hidrólise enzimática do bagaço pré-tratado com H2SO4.
Fonte de variação Soma
Quadrática
Graus de
Liberdade
Média Quadrática
F calculado
F tabelado
Regressão (R) 0,038 7,000 0,005459 17,48 2,50 Resíduos (r) 0,012 9,000 0,001322 Falta de ajuste (faj) 0,011859 7 0,001694 85,62 9,35 Erro puro (ep) 0,000040 2 0,000020 Total (T) 0,050115 16
% de variação explicada (R²) 76,26% % máxima de variação explicável 99,92%
*Valores calculados pelo software STATISTICA 7.0. 5.4. RESULTADOS OBTIDOS PARA AS CINÉTICAS DE HIDRÓLISE
ENZIMÁTICAS DO CAROÇO DE AÇAÍ PRÉTRATADO COM H 2SO4
DILUÍDO
Os resultados obtidos pelas cinéticas da hidrólise enzimática realizada para os
pontos do planejamento experimental do estudo do pré-tratamento com H2SO4 são
mostrados nas Figuras 5.6 a 5.13. É possível verificar pelos gráficos que a glicose é o
açúcar que aparece em maior quantidade e que demonstra maior crescimento nos
primeiros 30 minutos de hidrólise a partir do qual tem seu conteúdo em níveis
constantes ou com ligeiros decréscimos ou acréscimos. De maneira geral, a celobiose
apresentou níveis constantes e reduzidos durante todos os ensaios.
Figura 5.5 Gráfico das Cinéticas enzimáticas dos ensaios 1e 2.
114
Figura 5.6 Gráfico das Cinéticas enzimáticas dos ensaios 3 e 4.
Figura 5.7 - Gráfico das Cinéticas enzimáticas dos ensaios 5 e 6.
Figura 5.8 - Gráfico das Cinéticas enzimáticas dos ensaios 7 e 8.
115
Figura 5.9 - Gráfico das Cinéticas enzimáticas dos ensaios 9 e 10.
Figura 5.10 - Gráfico das Cinéticas enzimáticas dos ensaios 11 e 12.
Figura 5.11 - Gráfico das Cinéticas enzimáticas dos ensaios 13 e 14.
116
Figura 5.12 Gráfico das Cinéticas enzimáticas dos ensaios 15, 16 e 17.
5.5. CONCLUSÕES PARCIAIS
De acordo com o Capítulo 5, foram observados que o pré-tratamento com H2SO4
permitiu um percentual de recuperação de sólidos que variou de 58,32% a 79,85%.
O pré-tratamento reduziu em até 45,3% os níveis de celulose para a condição
considerada mais severa, que foi a de 1,84% de ácido; 60 minutos e 10% de sólidos.
Para esta mesma condição foram observados os menores teores de celulose residual
(31,13g/100g), e maior índice de solubilização (31,28%), sendo considerado indesejável
para posterior hidrólise enzimática.
Foi verificado que o aumento na severidade do pré-tratamento, principalmente
como resultado do aumento na concentração de ácido promoveu maior remoção da
fração celulósica e hemicelulósica. Grande parte da fração celulósica que foi recuperada
no licor apresentou-se na forma de glicose, já o principal carboidrato removido pelo pré-
tratamento com H2SO4 diluído foi a hemicelulose, recuperada em mais de 90% na forma
de xilose no licor.
Após o tratamento estatístico, foi observado que a variável mais significativa
para os teores de celulose, hemicelulose e grupos acetil foi a variável concentração de
ácido (%) (L).
Para a fração líquida, foi observada que a concentração de ácido (%)(L) também
foi aquela que mais influenciou nos níveis finais de xilose recuperada no licor obtido
após o pré-tratamento.
Em relação a conversão enzimática, foi possível verificar que a condição do
ensaio 8 (1,5% de ácido; 90 minutos e 15% de sólidos) foi a que permitiu maior valor
de conversão (68,43%). Todavia para este trabalho o ensaio 16 (1%, 60 minutos e 10%
de sólidos) foi considerado como o de melhor condição, em função do menor tempo de
117
processo e menor concentração de ácido, apresentando o valor de conversão de
67,42%).
As cinéticas enzimáticas revelaram um comportamento padrão para os teores de
glicose e celobiose. A glicose foi o açúcar que apareceu em maior quantidade e
demonstrou maior crescimento nos primeiros 30 minutos de hidrólise. De maneira geral
a celobiose apresentou níveis constantes e reduzidos durante todos os ensaios
realizados.
118
CAPÍTULO 6 - DESLIGNIFICAÇÃO ALCALINA COM NaOH DO C AROÇO
DE AÇAÍ PRÉ-TRATAMENTO COM H 2SO4 DILUÍDO
No Capítulo 6, através da aplicação da técnica estatística de planejamento
experimental é avaliada a remoção da lignina (deslignificação com NaOH 1%) ainda
presente no caroço de açaí pré-tratado no Capítulo 5 com H2SO4 diluído. As frações
sólidas e líquidas obtidas após a deslignificação foram caracterizadas quimicamente.
Para a fração líquida, avaliou-se o teor de lignina residual e para a demonstração do
correto balanço de bassa também foi realizada a caracterização química para os teores
de celulose e hemicelulose. A fração sólida, após ser quimicamente caracterizada, foi
utilizada para os estudos de conversão enzimática. São ainda mostradas as cinéticas de
hidrólise enzimática obtidas para cada um dos ensaios do planejamento experimnetal
aplicando a deslignificação.
6. RESULTADOS DA DESLIGNIFICAÇÃO DO CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ -TRATADO COM H 2SO4 DILUÍDO
6.1. RESULTADOS DA CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DA FRAÇÃO SÓLIDA APÓS A DESLIGNIFICAÇÃO.
As Tabelas 6.1 e 6.2 mostram os resultados da composição química do caroço de
açaí pré-tratado e deslignificado considerando o rendimento em relação ao caroço pré-
tratado com H2SO4 diluído. De acordo com a Tabela 6.1, após a deslignificação, os
sólidos recuperados variaram de 32,48% a 78,33% nas condições de 3,79% de sólidos,
1% de NaOH a 75°C durante 60 minutos (Ensaio 7) e 46,21% de sólidos, 1% NaOH a
75°C durante 60 minutos (Ensaio 8), respectivamente. Oliveira (2010) deslignificou
palha de cana-de-açúcar pré-tratada com H2SO4 diluído a 10% de sólidos com uma
solução de NaOH a 1,5% e obteve, a 190°C após 60 minutos, o rendimento máximo de
76%. Esse rendimento é próximo do rendimento máximo que foi obtido neste trabalho
no ensaio 8 (46,21% de sólidos a 75°C) que foi de 78%. O maior rendimento observado
pode ser resultado das menores concentração de NaOH e temperatura de tratamento e
maiores concentrações de sólidos.
É possível observar, que os balanços de massas de maneira geral fecharam em
no mínimo 97,55% indicando que os procedimentos de análise foram bem executados.
119
De acordo com a Tabela 6.1, são verificados elevados teores de celulose
remanescente para o ensaio 6 (condição: 110,36°C e 25% de sólidos) que foi de
80,10%. O menor teor de hemicelulose foi encontrado para o ensaio 7 (condição
mencionada acima) e foi de 0,75%. Já o menor valor de lignina encontrado foi
verificado para a condição do ensaio 7 e foi de 9,7%.
Ainda de acordo com a Tabela 6.1, pode-se comparar os valores de celulose após
a deslignificação com os valores de celulose do material “in natura” e que foi pré-
tratado apenas com ácido e verificar que o teor de celulose remanescente aumenta para a
maioria dos pontos. Já para os teores de hemicelulose e lignina, verifica-se um
decréscimo para a maioria dos ensaios quando estes são comparados.
Entretanto, só é possível fazer um análise mais profunda com base na Tabela 6.2
na qual são mostrados os resultados do planejamento de deslignificação na base do
rendimento. A Tabela 6.2 considerou para o seu cálculo o rendimento apenas da
deslignificação em relação ao material pré-tratado.
De acordo com a Tabela 6.2, pode ser verificar que o conteúdo de celulose
variou em um intervalo de 24,91 a 49,66% e que a condição do ensaio 8 (46,21% de
sólidos a 75°C) foi aquela que permitiu maior manutenção do conteúdo de celulose após
a deslignificação do material pré-tratado com H2SO4 diluído. O ensaio 7 (3,79% de
sólidos a 75°C) foi aquele que mostrou maior redução (62%) do conteúdo de celulose
em relação ao material pré-tratado com H2SO4 diluído.
Ainda de acordo com a Tabela 6.2, quando o teor de sólidos aumentou de 3,79%
(Ensaio 7) para 46,21% (Ensaios 8) na condição de temperatura de 75°C, foi observada
uma elevação no teor de celulose remanescente de 99,31%. Quando os sólidos foram
aumentados para 25% (Ensaios 9, 10 e 11) a elevação foi de 91%. O aumento da
temperatura de deslignificação de 75°C para 110°C com 25% de sólidos levou a uma
diminuição nos teores de celulose de aproximadamente 10%. Esse comportamento náo é
desejável uma vez que a manutenção da fração celúlósica é de grande interesse para as
etapas posteriores de hidrólise enzimática e fermentação envolvidas na produção de
etanol.
Para os teores de hemicelulose do material deslignificado, é possível verificar a
partir da Tabela 6.2 teores que variaram de 0,24 a 3,29%. A condição que proporcionou
menor teor de hemicelulose foi mais uma vez a do ensaio 7, que foi aquela que utilizou
a menor carga de sólidos (3,79%). Quando comparado com o material “in natura” e
120
com aquele pré-tratado apenas com ácido, a deslignificação causou uma redução nos
teores de hemicelulose de 98% e 75,5% respectivamente.
A condição do ensaio 7 (3,79% de sólidos) mostrou menor teor de lignina
(3,15%) após a deslignificação. A redução na concentração de sólidos de 40% para 10%
na temperatura de 50°C reduziu os teores de lignina em aproximadamente 46%,
enquanto que o aumento na temperatura de 39,64°C (ensaio 5) para 110,36°C (ensaio 6)
na carga de sólidos de 25% promoveu uma redução de aproximadamente 64% nos
teores de lignina. Os teores dos demais componentes variaram de 0,03 a 0,13%, 3,74 a
4,72% e 0,76 a 3,74% para os grupos acetil, cinzas e proteínas, respectivamente.
121
Tabela 0-1 Tabela da composição da fração sólida do material deslignificado (Sem correção para a base do rendimento). Ensaios Sólido
recuperado (%)
Celulose (%)
Hemicelulose (%)
Grupos acetil (%) Lignina (%) Cinzas (%)
Proteínas (%)
Extrativos (%)
Total (%)
In natura - 45,3 18,2 3,01 20,37 3,5 4,3 9,5 98,52 Pré-tratado ácido 65,5 57,33 4,47 0,45 26,7 5,15 3,45 - 97,55
1 65,70 73,1±0,65 1,5±0,43 0,11±0,13 14,33±0,22 7,2±0,15 4,67±0,21 - 101,02 2 76,25 64,8±0,34 3,8±0,33 0,10±0,22 22,8±0,35 5,4±-,25 3,88±0,13 - 100,78 3 60,80 78,7±0,33 1,12±0,56 0,12±0,21 10,8±0,12 7,5±0,33 2,9±0,41 - 101,14 4 70,50 69±0,22 2,23±0,43 0,11±0,32 18,2±0,22 6,7±0,34 3,83±0,22 - 100,07 5 69,60 67,2±0,55 2,2±0,23 0,18±0,34 20,3±0,16 6,4±0,35 3,67±0,31 - 99,95 6 52,48 80,1±0,43 0,98±0,23 0,09±0,23 9,8±0,16 8,1±0,36 2,02±0,24 - 101,09 7 32,48 76,7±0,21 0,75±0,22 0,10±0,22 9,7±0,12 11,5±0,22 2,35±0,21 - 101,1 8 78,33 63,4±0,31 4,2±0,45 0,22±0,43 22,7±0,22 5,9±0,25 3,86±0,17 - 100,28 9 62,00 75,2±0,18 2,1±0,40 0,13±0,34 13,2±0,33 6,8±0,38 2,81±0,15 - 100,24 10 63,20 75,1±0,21 1,9±0,39 0,13±0,55 13,1±0,24 6,7±0,41 3,23±0,23 - 100,16 11 62,40 75,5±0,19 2±0,25 0,13±0,44 13,2±0,22 6,9±0,38 3,4±0,30 - 101,13
122
Tabela 0-2 Tabela da composição da fração sólida do material deslignificado (na base do rendimento) em relação ao material pré-tratado com ácido diluído.
Ensaios Celulose* Hemicelulose* Lignina* Grupos acetil* Cinzas* Proteínas* Total *
1 48,03±0,35 0,99±0,21 9,41±0,33 0,07±0,21 4,73±0,15 3,07±0,12 66,23 2 49,41±0,34 2,90±0,15 17,39±0,22 0,08±0,32 4,12±0,13 2,96±0,21 76,78 3 47,85±0,23 0,68±0,20 6,57±0,21 0,07±0,19 4,56±0,11 1,76±0,12 61,42 4 48,65±0,12 1,57±0,22 12,83±0,12 0,08±0,12 4,72±0,19 2,70±0,13 70,47 5 46,77±0,21 1,53±0,15 14,13±0,23 0,13±0,11 4,45±0,20 2,55±0,20 69,43 6 42,04±0,23 0,51±0,13 5,14±0,24 0,05±0,10 4,25±0,17 1,06±0,12 53,01 7 24,91±0,18 0,24±0,51 3,15±0,33 0,03±0,14 3,74±0,16 0,76±0,14 32,8 8 49,66±0,15 3,29±0,22 17,78±0,22 0,17±0,12 4,62±0,12 3,02±0,13 78,37 9 46,62±0,20 1,30±0,34 8,18±0,12 0,08±0,20 4,22±0,10 1,74±0,15 62,06 10 47,46±0,21 1,20±0,33 8,28±0,21 0,08±0,21 4,23±0,11 2,04±0,22 63,21 11 47,11±0,16 1,25±0,22 8,24±0,20 0,08±0,22 4,31±0,14 2,12±0,12 63,03
Memória do cálculo para base do rendimento: celulose (ensaio 1) 73,1 (Teor de celulose obtido sem correção x 0,6570 (Rendimento da deslignificação) = 48,03
* g/100g de biomassa in natura.
123
É possível verificar na literatura que, ao realizar processos sequenciais alguns
autores mostram os resultados da composição química do material tratado, levando em
consideração o efeito somatório das etapas realizadas sobre o material utilizado. Essa
forma de análise permite ter uma visão mais ampla do processo completo.
Dessa forma, na Tabela 6.3, pode-se observar os resultados da caracterização
química do caroço de açaí após o pré-tratamento ácido e posterior deslignificação, no
qual é considerado para seu cálculo os rendimentos de ambas as etapas em relação ao
material “in natura”.
Assim, pode-se observar que o rendimento variou de 21,28 a 51,31%. A
condição do ensaio 7 foi a que demonstrou menores valores de hemicelulose (0,16 de
g/100g de biomassa in natura) e lignina (2,06 g/100g de biomassa “in natura”)
respectivamente, o que indica uma maior remoção destes componentes para tal
condição, no entanto para esta mesma condição foi verificado também a menor
concentração de celulose (16,32%).
Para os demais componentes, foi possível verificar intervalos de 0,07 a 0,17%;
2,45 a 3,5% e 0,29 a 4,3% para os teores de grupos acetil, cinzas e proteínas.
Na Figura 6.1, são mostrados os resultados da solubilização dos principais
componentes de interesse após a deslignificação com base no material pré-tratado,
enquanto que, na Figura 6.2 são mostrados os resultados de solubilização considerando
como material de entrada o material “in natura”, a partir do qual podemos novamente
visualisar o efeitos do pré-tratamento e deslignificação sobre o material “ in natura".
124
Tabela 0-3 Balanço de massa para a composição do caroço de açaí pré-tratado e deslignificado em relação ao material “in natura”
Ensaios Rendimento %
Celulose * Hemicelulose* Lignina* Grupos acetil* Cinzas* Proteínas* Total*
In natura - 45,3 18,2 3,01 20,37 3,5 4,3 98,52 1 43,03 31,46±0,29 0,65±0,19 6,17±0,33 0,15±0,3 3,10±0,15 1,67±0,10 43,2 2 49,94 32,36±0,25 1,90±0,19 11,39±0,35 0,17±0,29 2,70±0,11 1,60±0,13 50,12 3 39,82 31,34±0,35 0,45±0,21 4,30±0,29 0,13±0,21 2,99±0,19 0,75±0,22 39,96 4 46,18 31,86±0,32 1,03±0,21 8,40±0,3 0,16±0,2 3,09±0,12 1,79±0,19 46,33 5 45,59 30,64±0,33 1,00±0,2 9,25±0,33 0,12±0,22 2,92±0,15 1,78±0,11 45,71 6 34,37 27,53±0,24 0,34±0,17 3,37±0,33 0,12±0,23 2,78±0,2 0,35±0,15 34,49 7 21,28 16,32±0,35 0,16±0,17 2,06±0,25 0,07±0,23 2,45±0,12 0,29±0,15 21,35 8 51,31 32,53±0,24 2,15±0,23 11,65±0,23 0,12±0,31 3,03±0,1 1,95±0,19 51,43 9 40,61 30,54±0,31 0,85±0,23 5,36±0,31 0,13±0,32 2,76±0,15 1,10±0,12 40,74 10 41,40 31,09±0,24 0,79±0,21 5,42±0,32 0,13±0,29 2,77±0,11 1,32±0,11 41,52 11 40,87 30,86±0,25 0,82±0,22 5,40±0,27 0,13±0,28 2,82±0,13 0,98±0,19 41,01
Memória do cálculo para base do rendimento: celulose (ensaio 1) 73,1 (Teor de celulose obtido sem correção x 0,655 (Rendimento do pré-tratamento
com H2SO4 diluído) x 0,6570 (rendimento da deslignificação) = 31,46%;
* g/100g de biomassa “in natura”.
125
De acordo com a Figura 6.1, a solubilização da celulose levando em
consideração como material de entrada o material pré-tratado variou de 13,37 a 56,54%
(ensaios 8 e 7). No entanto como já foi mencionado é possível avaliar o efeito das duas
etapas (pré-tratamento e deslignificação) sobre o material “in natura” e dessa forma ter
uma visão mais completa do processo. Dessa forma verifica-se a partir da Figura 6.2 um
intervalo de solubilização de 28,19 a 63,98% para os ensaios 8 e 7, respectivamente.
A maior solubilização observada para o ensaio 7 foi resultante da baixa carga de
sólidos utilizada. Oliveira (2010) verificou que após a deslignificação e pré-tratamento
com ácido diluído da palha de cana-de-açúcar a 10% de sólidos e realizada em reator,
ocorreram perdas médias de 35% de celulose e máximas de 45%. Enquanto Silva (2009)
realizou o pré-tratamento com ácido diluído e posterior deslignificação em condições
semelhantes às realizadas neste trabalho e observou perdas de celulose em torno de 30%
para a palha da cana. É possível verificar que o caroço de açaí apresentou valores de
solubilização semelhantes as que foram encontradas na literatura, conforme observado
na Figura 5.2.
16,23 13,81 16,54 15,15 18,42 26,6856,54
13,37 18,67 17,21 17,82
77,95
35,18
84,7764,83 65,74
88,49
94,55
26,40
70,87 73,14 72,08
64,74
34,89
75,41
51,94 47,08
80,74
88,20
33,40
69,35 68,99 69,15
0
50
100
150
200
250
300
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
So
lub
iliz
açã
o
do
s c
om
po
ne
ne
ts (
%)
Ensaios
Celulose Hemicelulose Lignina
Figura 0.1 Solubilização dos componentes lignocelulósicos calculados em relação ao material pré-tratado com ácido diluído.
126
30,56 28,56 30,81 29,66 32,37 39,2263,98
28,19 32,59 31,37 31,88
96,45 89,5797,55 94,34 94,49
98,15
99,12
88,1695,31 95,68 95,51
11,47 22,9414,66
11,60 16,6420,45
30,10
13,51
21,10 20,76 19,42
0
50
100
150
200
250
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
So
lub
iliz
açã
o
do
s c
om
po
ne
nte
s (
%)
Ensaios
Celulose Hemicelulose Lignina
Figura 0.2 Solubilização dos componentes lignocelulósicos calculados em relação ao material “in natura”.
De acordo com a Figura 6.1, é possível verificar que o componente que sofreu
maior solubilização foi a hemicelulose com intervalo de 26,40 a 94,55% quando
considerado como material de entrada, o caroço de açaí pré-tratado com ácido diluído.
Em seguida, foi a lignina que mostrou intervalo de 33,40 a 88,20%. É possível verificar,
o quão efetivo os pré-tratamentos foram quando observados seus efeitos em conjunto
sobre o material “in natura” (Figura 6.2).
De acordo com a Figura 6.2, no caso da hemicelulose, o intervalo de
solubilização mais uma vez, foi o que apresentou maiores resultados e variaram de
88,16 a 99,12%. Enquanto que a lignina apresentou um intervalo que variou de 44,10 a
89,87%. Silva (2009) observou 88,8% e 77,9% de solubilização para a hemicelulose e
lignina, respectivamente, para a palha de cana. Oliveira (2010) observou mais de 90%
da remoção da hemicelulose e valores próximos a 80% para a remoção da lignina após a
utilização das duas etapas de pré-tratamento e deslignificação. Esse valores, são
semelhantes aos que foram obtidos pelas condições de pré-tratamento e deslignificação
aplicadas ao caroço de açaí. A alta solubilidade de lignina e hemicelulose, foi sem
dúvida, devido à clivagem das ligações α-éter entre a lignina e as hemiceluloses, durante
o tratamento alcalino (XIAO et al., 2001).
Quando as fibras são sujeitas ao tratamento alcalino com NaOH, a hemicelulose
é parcialmente hidrolisada e a lignina é despolimerizada, o que leva à formação de
127
açúcares e compostos fenólicos que são solúveis em água (FERNFINDEZ et al., 1999)
e que serão transferidos, em sua maioria, para a fração líquida obtida após os pré-
tratamento aplicados a biomassa. A composição química da fração líquida obtida após a
deslignificação, em geral, costuma ser rica em lignina, a qual seria o principal
componente de interesse na mesma. Dessa forma, optou-se por quantificar apenas a
lignina precipitada na fração líquida. A Tabela 6.4 mostra os valores de lignina
precipitada obtidos na fração líquida após a deslignificação do caroço pré-tratado com
hidróxido de sódio (NaOH) do material pré-tratado com H2SO4 diluído.
6.2. RESULTADOS OBTIDOS PARA A LIGNINA PRECIPITADA
RECUPERADA NA FRAÇÃO LÍQUIDA APÓS A DESLIGNIFICAÇÃO DO
CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO COM H 2SO4 DILUÍDO
A fração líquida obtida após a deslignificação realizada conforme o
planejamento mostrado na Tabela 3.6 (planejamento de deslignificação) foi
caracterizada apenas para o ponto considerado ótimo (ensaio 9) para fins de
demonstração do correto fechamento de balanço de massa. O único componente
caracterizado no licor para todos os ensaios foi a lignina recuperada, visto que seria o
componente de interesse existente nessa fração. Na Figura 6.3 são mostrados os valores
de lignina recuperada na fração líquida após a deslignificação do caroço de açaí pré-
tratado com NaOH.
Figura 0.3 Lignina recuperada no licor obtido após a deslignificação do caroço de açaí pré-tratado com H2SO4 diluído.
128
De acordo com a Figura 6.3 foram encontrados elevados valores de lignina
recuperada na fração líquida, o que indica uma elevada eficiência da etapa de
deslignificação. Os valores observados variaram de 19,15 a 83,46%. A condição do
ensaio 7 (3,79% de sólidos, 1% de NaOH a 75°C durante 60 minutos) foi aquela que
demonstrou maior teor de lignina recuperada, provavelmente como resultado direto da
efetiva deslignificação da fração sólida observada nesta condição.
6.3. RESULTADOS OBTIDOS PARA A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DO
CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO COM H 2SO4 DILUÍDO E
DESLIGNIFICADO
Na Tabela 6.4, são mostrados resultados obtidos com a hidrólise enzimática da
biomassa do caroço de açaí pré-tratado (na condição considerada ótima) e
deslignificado.
Tabela 0-4 Resultados obtidos com a hidrólise enzimática da biomassa do caroço de açaí pré-tratado (na condição considerada ótima) e deslignificado.
Ensaio Temperatura °C
Concentração de
Sólidos (%)
g glicose/g caroço pré-
tratado
Conversão (%)
Rendimento Global (%)
1 50 10 0,42 79,62 66,62 2 50 40 0,36 64,86 55,84 3 100 10 0,47 87,75 73,15 4 100 40 0,38 70,69 59,91 5 39,64 25 0,40 76,21 62,10 6 110,36 25 0,36 77,41 56,69 7 75 3,79 0,26 94,76 41,13 8 75 46,21 0,34 62,40 53,99 9 75 25 0,42 80,41 65,32 10 75 25 0,40 75,78 62,67 11 75 25 0,41 78,38 64,34
Os valores obtidos para a concentração de glicose variaram de 0,26 a 0,47 g de
glicose/g de caroço pré-tratado com ácido diluído. Enquanto que os valores da
conversão variaram de 62,40 a 94,76%. A condição do ensaio 7 (3,79% de sólidos a
75°C) foi a que permitiu maior conversão. O valor médio de conversão ótima obtido
para o material que foi apenas pré-tratado com ácido diluído foi de 66,48%. Após a
deslignificação foi possível obter um aumento máximo para essa conversão de até
129
42,53%, no ensaio 7, o qual demonstrou o valor de conversão já mencionado de
94,76%.
Os resultados da análise estatistica obtida para os valores g de glicose/ g de
caroço pré-tratado com H2SO4 diluído são mostrados na Tabela 6.5.
Tabela 0-5 Análise dos efeitos principais e de interação das variáveis de deslignificação do caroço pré-tratado com H2SO4 diluído.
Fatores Efeito estimado
Erro puro
t(2) Significância estatística (p)
Efeitos principais Média 0,408338 0,004931 82,8102 0,000146 (X1) Temperatura °C (L) 0,004707 0,006039 0,7794 0,517338 (X1) Temperatura °C (Q) 0,003100 0,007187 0,4314 0,708252 (X2) Concentração de sólidos (%)(L) -0,009301 0,006040 -1,5400 0,263450 (X2) Concentração de sólidos (%)(Q) -0,072274 0,007190 -10,0522 0,009752
Efeitos de interação
(X1) (X2) -0,007824 0,008541 -0,9161 0,456320
De acordo com a Tabela 6.6, pode-se verificar que a única variável considerada
significativa e também de maior influência no processo de deslignificação do caroço
pré-tratado foi a concentração de sólidos (Q) com valor negativo de 0,072274 o que
indica que a superfície de resposta apresentaria concavidade voltada para baixo com a
presença de um ponto de máximo da resposta analisada.
Na Tabela 6.7 são observados os resultados obtidos para a ANOVA realizada
para os resultados dos teores de glicose liberada após a hidrólise enzimática do bagaço
pré-tratado com H2SO4 e deslignificado.
Tabela 0-6 Resultados da ANOVA realizada os teores de glicose liberada após a hidrólise enzimática do bagaço pré-tratado com H2SO4 e deslignificado.
Fonte de variação Soma Quadrática
Graus de
Liberdade
Média Quadrática
F calculado
F tabelado
Regressão (R) 0,008 1 0,008274 3,73 3,36 Resíduos (r) 0,020 9 0,002216 Falta de ajuste (faj) 0,019798 7 0,002828 38,77 9,35 Erro puro (ep) 0,000146 2 0,000073 Total (T) 0,028218 10
% de variação explicada (R²) 29,32% % máxima de variação explicável 99,48%
É possível verficar que o modelo não foi signifcativo, uma vez que o valor do
Fcalculado não foi no mínimo 5 vezes maior que o valor do Ftabelado (Teste F da
130
Regressão). Além disso nem o modelo ou as de respostas puderam ser gerados em
virtude da falta de ajuste significativa observada para o planejamento, pois não passou
no teste F da falta de ajuste (Fcalculado > Ftabelado). De acordo com tabela da
ANOVA (Tabela 6.6) o R2 apresentou valor de 0,2932 o que demonstra que o modelo
explicou 29,32%% da variação dos dados experimentais.
6.4. RESULTADOS OBTIDOS PARA OS PERFIS DE HIDRÓLISES
ENZIMÁTICAS DO CAROÇO DE AÇAÍ PRÉ-TRATADO COM H 2SO4
DILUÍDO E SEQUENCIALMENTE DESLIGNIFICADO
Nas Figuras 6.4 a 6.8 são mostrados os perfis de hidrólise enzimática realizadas
para o caroço de açaí pré-tratado com H2SO4 diluído e sequencialmente deslignifcado.
O comportamento observado foi semelhante aqueles verificados no Capítulo 5 para as
cinéticas de hidrólise do caroço de açaí pré-tratado apenas com H2SO4 diluído.
De maneira geral, é possível verificar que os níveis de glicose (g/L) aumentam
com o tempo até niveis de estabilidade em função do consumo do substrato. Esse
comportamento se repete para todos os demais ensaios inclusive para os ensaios 9, 10 e
11 que foram realizados para o ponto central e apresentam as barras de erros verificados
para a repetição dos mesmos. Em relação ao teor de celobiose, foram verificados níveis
estáveis para todos os ensaios.
Figura 0.4 Cinéticas de hidrólise enzimática realizada para os ensaios 1 e 2.
131
Figura 0.5 Cinéticas de hidrólise enzimática realizada para os ensaios 3 e 4.
Figura 0.6 Cinéticas de hidrólise enzimática realizada para os ensaios 5 e 6.
Figura 0.7 Cinéticas de hidrólise enzimática realizada para os ensaios 7 e 8.
132
Figura 0.8 Cinética enzimática realizada para os pontos centrais 9.
6.5. BALANÇO DE MASSA PARA A ETAPA DE DESLIGNIFICAÇÃO DO
MATERIAL PRÉ-TRATADO COM ÁCIDO E POSTERIORMENTE
DESLIGNIFICADO
Nas Figuras 6.9 e 6.10 são mostrados os balanços de massa obtidos para a
melhor condição do pré-tratamento com H2SO4 diluído (ensaios 15, 16 e 7 - 1% de
ácido, 60 min e 10% de sólidos) e do caroço após deslignificação seqüencial (ensaio 9,
10 e 11 – 75°C e 25% de sólidos). A caracterização destes pontos foi realizada para a
demonstração do correto fechamento do balanço de massa.
133
Figura 0.9 Balanço de massa para o pré-tratamento com H2SO4 diluído do caroço de açaí.
134
Figura 0.10 Balanço de massa para o pré-tratamento com H2SO4 diluído e deslignificação sequencial do caroço de açaí.
135
6.6. CONCLUSÕES PARCIAIS
De acordo com o Capítulo 6, os sólidos recuperados variaram de 32,48% a
78,33% nas condições de 3,79% de sólidos, 1% de NaOH a 75°C durante 60 minutos
(Ensaio 7) e 46,21% de sólidos, 1% NaOH a 75°C durante 60 minutos (Ensaio 8),
respectivamente. Quando comparado com o material “in natura” e com aquele pré-
tratado apenas com ácido, a deslignificação causou uma redução nos teores de
hemicelulose de 98% e 75,5% respectivamente.
A condição do ensaio 7 (3,79% de sólidos) foi a que mostrou menor teor de
lignina (3,15%) após a deslignificação. O aumento da temperatura de deslignificação
levou a uma diminuição nos teores de celulose e a condição que proporcionou menor
teor de hemicelulose foi mais uma vez a do ensaio 7. A baixa carga de sólidos do ensaio
7, foi aquela que permitiu a maior solubilização observada durante a deslignificação.
O componente que sofreu maior solubilização foi a hemicelulose com intervalo
de 26,40 a 94,55%%, seguida pela lignina que mostrou intervalo de 33,40 a 88,20%.
Foram encontrados elevados valores de lignina recuperada na fração líquida o que
indica uma elevada eficiência da etapa de deslignificação.
A única variável considerada significativa e também de maior influência no
processo de deslignificação do caroço pré-tratado foi a concentração de sólidos (Q).
A condição do ensaio 7 (3,79% de sólidos a 75°C) foi a que permitiu maior
conversão enzimática do caroço deslignificado. Entretanto, para este trabalho foi
considerada como condição ótima aquela observada para o ensaio 9 (75°C e 25% de
sólidos) em função do ótimo valor de 80,41%, obtido para conversão enzimática e
possibilidade de se trabalhar com maiores cargas de sólidos.
As cinéticas de hidrólise enzimática do material deslignificado mostraram um
comportamento semelhante àqueles verificados para o Capítulo 5.
136
CAPÍTULO 7 - MUDANÇAS ESTRUTURAIS E VISUAIS NO CARO ÇO DE
AÇAÍ APÓS OS TRATAMENTOS APLICADOS
Neste capítulo 7, serão apresentados os efeitos resultantes dos tratamentos
aplicados ao caroço de açaí (pré-tratamento com H2SO4 diluído, deslignificação com
NaOH e hidrólise enzimática) observados visualmente e através das análises de
microscopia eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia de difração de raio-X
(DRX) e espectroscopia no infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR).
7. MUDANÇAS ESTRUTURAIS E VISUAIS NO CAROÇO DE AÇAÍ E PODER CALORÍFICO APÓS TRATAMENTOS
7.1. ANÁLISE VISUAL DO CAROÇO DE AÇAÍ
Nas Figuras 7.1, 7.2 e 7.3, é possível verificar a biomassa do caroço de açaí
acondicionada antes do pré-tratamento e o efeito desta etapa na mudança de coloração
do material.
Figura 7.1 Biomassa do caroço de açaí “in natura” (A) e pré-tratada (B).
137
Figura 7.2 Caroço de açaí pré-tratado com 0,2% (A); 1,0% (B) e 1,84%(C) de H2SO4.
Figura 7.3 Caroço de açaí pré-tratado com 1,84% e deslignificado.
De acordo com as figuras 7.1 e 7.2, é possível observar um escurecimento do
material pré-tratado em função da concentração de ácido utilizada no pré-tratamento, o
que fica mais evidente quando comparado com o material “in natura”. Curreli et al.
(2002) afirma que este comportamento está relacionado com a catálise ácida das
ligações do complexo lignina-carboidrato e com a formação de compostos de
degradação dos carboidratos uma vez que tanto a lignina como tais produtos apresentam
a coloração marrom escura que se intensifica a medida que a concentração de ácido
aumenta. É possível verificar ainda uma maior cominuição do material pré-tratado em
relação ao material “ in natura” como se o material tivesse sido triturado novamente e
reduzido a sua granulometria. Este comportamento é novamente resultado da ação do
ácido nas estruturas do material. Quando comparado com o material pré-tratado com
ácido, observou-se que após a sua deslignificação (Figura 7.3) houve uma descoloração
138
em relação ao material “in natura” e ao material pré-tratado (verificação de pontos
brancos na Figura 7.3). De acordo com Mussato et al. (2006), este comportamento é
observado em função da remoção da lignina.
7.2. ANÁLISE DE MICROSCOPIA ELETRÕNICA DE VARREDURA (MEV )
DO CAROÇO DE AÇAÍ “IN NATURA”, APÓS PRÉ-TRATAMENTO,
DESLIGNIFICAÇÃO E HIDRÓLISE ENZIMÁTICA
Nas Figuras 7.4 (a e b) são apresentadas as fotomicrografias obtidas do caroço
de açaí “in natura” após o pré-tratamento com H2SO4 diluído.
Figura 7.4 a e b Fotomicrografias do caroço de açaí “in natura” (a e b da esquerda pra direita). Os aumentos e barras de comparação estão apresentadas em cada figura.
É possível verificar que o material encontra-se parcialmente íntegro com
pequenos pontos de cortes e rompimentos resultantes da moagem a qual o material foi
submetido. Quando comparado com a Figura 7.5 (a e b), verifica-se que o tratamento
ácido provoca uma parcial desorganização na estrutura do material com rompimentos e
fissuras provocadas ao material como resultado da quebra de ligações entre carboidratos
e lignina (HENDRIKS & ZEEMAN, 2009).
Nas Figuras 7.5 (a e b) são apresentadas as fotomicrografias obtidas após o pré-
tratamento com H2SO4 diluído.
139
Figura 7.5 a e b Fotomicrografias após o pré-tratamento com H2SO4 diluído (a e b da esquerda pra direita). Os aumentos e barras de comparação de estão apresentadas em cada figura.
Na Figura 7.6 (a e b) são mostrados as fotomicrografias obtidas após o pré-
tratamento com H2SO4 diluído e deslignificação alcalina com NaOH.
Quando se observa as Figuras 7.6 (a e b) é claramente verficada uma grande
desorganização da estrutura da biomassa. Após a deslignificação o material torna-se
muito mais poroso e amorfo se comparado com o material “in natura” ou com aquele
tratado apenas com o H2SO4. Semelhante ao que foi verificado por Zúñiga (2010) a alta
heterogeneidade do material foi um fator que dificultou a avaliação mais eficiente da
estrutura da biomassa pela técnica do MEV.
Figura 7.6 a e b Fotomicrografias após o pré-tratamento com H2SO4 diluído e deslignificado com NaOH (a e b da esquerda pra direita). Os aumentos e barras de comparação de estão apresentadas em cada figura.
140
O material pré-tratado com H2SO4 diluído e deslignificado o qual foi submetido
à hidrólise enzimática também foi analisado e mostrou uma estrutura mais densa e
compacta provavelmente pelo fato de as enzimas atacarem as áreas mais superficiais do
material, que foram expostas durante os pré-tratamentos aplicados. Dessa forma, o
material resultante seria aquele que não foi possível hidrolisar e, consequentemente,
mais compacto e cristalino, conforme é possível verificar na Figura 7.7.
Figura 7.7 Fotomicrografias após o pré-tratamento com H2SO4 diluído e deslignificado e posterior hidrólise enzimática.
7.3. RESULTADOS DA ANÁLISE DE CRISTALINIDADE POR DIFRAÇÃ O
DE RAIO X (DRX)
O grau de cristalinidade (IC%) é determinado de forma rápida e sem necessidade
de padrões pela espectroscopia de difração de raio-X (DRX) que pode ser usado como
um indicativo da natureza e da reatividade de materiais lignocelulósicos. Segundo
Krassig (1993) o (IC%) pode ser definido como a razão entre as intensidades dos picos
correspondentes à região cristalina e à região amorfa.
Os resultados das análises de DRX mostrados na Figura 7.8 e os resultados dos
índices de cristalinidade (Tabela 7.1) foram obtidos a partir do caroço de açaí “in
natura”; do caroço pré-tratado com H2SO4 (10% de sólido, 1% de ácido por 60 minutos
a 121°C) e também do material pré-tratado nas condições anteriores e deslignificado
sequencialmente na condição de 25% de sólidos, 1% de peróxido a 75°C. As condições
mencionadas foram aquelas consideradas como ótimas para a avaliação de ambos os
pré-tratamentos.
141
Na Figura 7.8, são mostradas as curvas de difração raio-X a partir das quais
foram calculados os índices de cristalinidade observados na Tabela 7.1.
O índice de cristalinidade apresenta grande influência na hidrólise enzimática de
materiais lignocelulósicos, principalmente quando este material é pouco conhecido e há
o interesse na sua utilização como matéria-prima para a produção de etanol. Tem sido
usado extensivamente como uma medida da proporção de celulose cristalina em relação
ao total de celulose do material analisado. Além disso, tem sido utilizado como uma
ferramenta de avaliação do efeito dos pré-tratamentos existentes em reduzir a
cristalinidade do material em questão.
A partir da análise dos materiais estudados, foi verificado que o índice de
cristalinidade do caroço de açaí foi de 47,05% e foi menor que os valores citados por
Rodriguez-zuñiga (2010) para o bagaço de cana (58,18%) e por Ayala (2012) para a
palha da cana-de-açúcar (49,01%). O índice de cristalinidade após o pré-tratamento
ácido (na condição analisada) reduziu em apenas 11% seu valor em comparação com o
material “in natura”. Este resultado foi bem semelhante ao citado por Samuel et al.
(2012) que observou que pré-tratamento com H2SO4 diluído promoveu uma redução de
12% na cristalinidade da biomassa de “switchgrass”. Para o material pré-tratado e
sequencialmente deslignificado a redução foi de 64% em comparação ao material “in
Figura 7.8 Curvas de difração obtidas para o caroço de açaí.
142
natura”. Conforme mostrado na Tabela 7.1, os índices de cristalinidade corrigidos para a
base do rendimento foram de 41,64% para o material pré-tratado apenas com ácido e de
17,01% quando realizada a deslignificação.
Dessa forma, é possível afirmar que a deslignificação foi altamente eficaz em
reduzir a cristalinidade do caroço de açaí, o que pode ter ocorrido muito mais pela
remoção da lignina e hemicelulose do que pela conversão da celulose I em celulose II.
Isto pode ser evidenciado pelo fato de que os picos observados para os difratogramas do
material “in natura” assim como também aqueles obtidos para os pré-tratados e
deslignificados mostraram picos à 2θ graus que permaneceram na faixa de 16° (plano
002) e 18° (101) e que correspondem a picos típicos da celulose I (ASS et al., 2006;
TERINTE et al., 2011). Não é possível afirmar que a redução da cristalinidade foi
gerada por uma significativa conversão da celulose I em celulose II.
Ben Sghaier et al. (2012) tratou fibras de Agave americana e observou que
concentrações a partir de 5% de NaOH causaram decréscimo na cristalinidade das fibras
de celulose em torno de 15% por levar a um fenômeno de inchamento das fibras após a
penetração do agente alcalino. Os mesmos autores afirmam que, durante esse pré-
tratamento, as fibras de celulose são rearranjadas de celulose I (cadeias alinhadas em
paralelo) para celulose II (anti-paralelas). Este último comportamento não foi verificado
para a mercerização do caroço de açaí provavelmente em função da baixa concentração
de agente alcalino utilizado. Pesquisas anteriores relataram que a transformação de
celulose I em celulose II ocorre em concentrações de NaOH acima de 6% (BORYSIAK
& GARBARCZYK, 2003; MOIGNE & NAVARD, 2010).
Tabela 7-1 Índices de cristalinidade (CrI) obtidos para o caroço de açaí “in natura”, pré-tratado com H2SO4 diluído e para o caroço pré-tratado com ácido e sequencialmente deslignificado.
Caroço de açaí Índice
de cristalinidade
Rendimento no
pré-tratamento (%)
Corrigido pelo pré-tratamento
(%)
In natura 47,05 - - Pré-tratado com ácido diluído 64,07 65 41,64 Pré-tratado e deslignificado 71,35 23,85 17,01
143
7.4. RESULTADOS DA ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO COM
TRASFORMADA DE FOURIER (FTIR)
A espectrofotometria na região do infravermelho refere-se a radiação de
excitação a números de onda entre 4000 e 400 cm-1. De acordo com Regiane (2000) a
diferença de intensidade entre o feixe de referência e o feixe transmitido mede a
quantidade de radiação absorvida; os números de onda de absorção referem-se ao modo
de vibração e a diferença do momento dipolar na mesma ligação. Assim, é possível
determinar a função química do componente presente.
O FTIR foi usado para demonstrar a estrutura física e os grupos funcionais do
caroço de açaí analisado. Dessa forma, na Figura 7.10, é possível verificar os espectros
de FTIR na região de 4000 a 400 cm-1 para os materiais:”in natura”, pré-tratado com
H2SO4 (10% de sólido, 1% de ácido por 60 minutos a 121°C) e também do material pré-
tratado nas condições anteriores e deslignificado sequencialmente na condição de 25%
de sólidos, 1% de peróxido a 75°C.
144
Figura 7-10 Espectro de FTIR para o caroço de açaí “in natura”, apenas pré-tratado e pré-tratado e sequencialmente deslignificado. Cada um dos números a seguir apresenta os picos identificados e discutidos: (1) 3411; (2) 2921; (3) 2875; (4) 2852; (5) 1743 (6) 1629 (7)1517 (8)1445 (9)1378 (10) 1321; (11)1245; (12) 1160; (13) 128; (14)1099; (15) 1010; (16)1060; (17) 937; (18)871; (19) 804.
145
É possível verificar que as principais características desses espectros são
atribuídas à presença de lignina, hemicelulose e celulose componentes típicos de fibras
naturais. Nesse tipo de material, modificado ou não, é comum o aparecimento na faixa
de 3100-3500cm-1, uma banda larga, associada à deformação axial do grupo O-H. Dessa
forma o espectro das fibras do caroço de açaí “in natura” foi caracterizado por uma
banda em 3411 cm-1, referente ao estiramento vibracional dos grupos OH presentes na
celulose (MERLINI, 2011). Quando esta banda é observada para os materiais que foram
tratados ou deslignificados percebemos que elas apresentaram uma drástica diminuição
em termos de absortividade exatamente pela remoção da celulose pelos tratamentos
aplicados.
A faixa entre 2894-2950 cm-1 pode ser atribuída ao alongamento de C-H
semelhante ao que foi observado por Khalil et al. (2001). Nessa faixa foram, observados
as bandas com picos em 2921 e 2875 e 2852 cm-1 que estão relacionadas ao estiramento
C-H alifático dos grupos metila (CH3) e metileno (CH2) (SINHA & ROUT, 2008).
Importante ressaltar que os dois últimos picos se tornam mais evidentes para os dois
materiais que sofreram tratamentos.
Assim como observado por Kim et al. (2003), foi possível verificar que a
intensidade das bandas de uma grande número de picos característicos da lignina
(intervalo de 1502–1600 cm-1) foi maior para o material pré-tratado apenas com ácido e
muito maior para o pré-tratado e sequencialmente deslignificado. Isso comprova o efeito
dos tratamentos aplicados para a remoção da lignina presente no material.
O pico da banda 1743 cm-1 no material “in natura” é característico do
estiramento da banda carbonila (C=O), atribuído a hemicelulose (OWEN & THOMAS,
1989) presente no caroço de açaí e que apresentou menor intensidade para os materiais
submetidos ao pré-tratamento e deslignificação, o que evidenciou a remoção desse
componente. O pico da banda em 1629 cm-1 representa para todos os espectros de água
residual (NACOS et al., 2006; TROEDEC et al., 2008).
A diferença de intensidade entre as bandas 1510 e 1600 cm-1 pode ser utilizada
para diferenciar as ligninas de coníferas (alto teor de grupos guaiacila) das ligninas de
folhosas (teor de siringila maior que na conífera) (OWEN & THOMAS, 1989; COLOM
et al., 2003; FENGEL; WEGENER, 2003; MARABEZI, 2009). Comparando as bandas
existentes no caroço de açaí, é possível observar que a intensidade na banda de 1600
146
cm-1 é maior, o que indica que as ligninas do material analisado possuem maiores
quantidades de unidades siringila.
De acordo com a literatura, pode-se atribuir os picos de 1517, 1445, 1378 e 1321
cm-1, ao estiramento da ligação C-C no anel aromático, deformação assimétrica do
grupo metila, alongamento C-H nos polissacarídeos e a deformação angular da hidroxila
(-OH) presente no anel aromático da lignina (NACOS et al., 2006; TROEDEC et al.,
2008). Já a banda ilustrada no pico de 1245cm-1 está relacionada com estiramento dos
grupos acetil da hemicelulose, porém a lignina também contribui para a formação dessa
banda. A banda dos picos 1160, 1128 e 1099 cm-1 indicaria um C-O-C alongamento
assimétrico em celulose e hemicelulose.
Os picos de 1010, 1060 e 1164 cm-1 (não identificados na Figura 7.10) são
característicos do alongamento dos grupos C-O; C=C e C-C-O alongamento
característico da celulose, hemicelulose e lignina (SILLS et al.,2012). Os valores de
absortividade para esses picos no material pré-tratado apenas com o ácido mostrou
valores mais elevados que aqueles observados para o material “in natura” e
sequencialmente deslignificado. Isso ocorreu pelo fato de que após a remoção da
hemicelulose durante o pré-tratamento com ácido, a lignina tem sua estrutura
evidenciada pela ausência do componente hemicelulose. É possível, verificar que após a
deslignificação as absortividades nesses picos são drasticamente reduzidas, as quais
mostraram valores menores que aquelas observadas tanto para o material “in natura”
como também para aquele que foi apenas pré-tratado com H2SO4.
Finalmente os picos de 937 e 871 e 804cm-1, observados para todos os
materiais, poderiam ser atribuídos ao estiramento C-O-C presente nas ligações β-
glucosídicas (SINDHU et al., 2010; CIOLACU et al., 2011; YOON et al. (2012).
7.5. CONCLUSÕES PARCIAIS
Foi possível concluir que visualmente ocorreram modificações na coloração do
material após os pré-tratamentos aplicados. Para o caroço de açaí tratado apenas com
H2SO4 diluído, foi observado um escurecimento do material em relação ao material “in
natura” e para o caroço deslignificado houve a descoloração do material com a presença
de pontos brancos.
147
Os resultados do MEV mostraram que após o pré-tratamento ácido houve uma
desorganização morfológico-estrutural em relação ao caroço “in natura”. Para a etapa de
deslignificação, foi observado o acentuamento desta desorganização. Entretanto, o
material pré-tratado e posteriormente hidrolisado enzimaticamente mostrou uma
estrutura novamente organizada e compacta. Em relação ao índice de cristalinidade, foi
verificado que os tratamentos aplicados ao caroço de açaí foram eficazes em reduzir a
cristalinidade do mesmo. A técnica por FTIR permitiu confirmar a presença dos
principais constituintes do caroço de açaí e as mudanças causadas pelos tratamentos
aplicados ao caroço de açaí.
148
CAPÍTULO 8 - VARIAÇÃO DA CARGA DE SÓLIDOS E AGITAÇÃ O NA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO CAROÇO DE AÇAÍ
Neste capítulo, é realizada a análise e tratamento estatístico dos resultados
obtidos para o planejamento experimental realizado para verificar o efeito da variação
da carga de sólidos e agitação na hidrólise enzimática do caroço de açaí que foi apenas
pré-tratado com H2SO4 diluído e também para aquele que foi sequencialmente
deslignificado.
8. RESULTADOS DA VARIAÇÃO DA CARGA DE SÓLIDOS E
AGITAÇÃO NA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO CAROÇO DE AÇAÍ
8.1. ANÁLISE E TRATAMENTO ESTATÍSTICO DOS RESULTADOS
OBTIDOS PARA A HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO CAROÇO DE AÇ AÍ PRÉ-
TRATADO APENAS COM H 2SO4 DILUÍDO
Neste capítulo, as cargas de sólidos e agitação durante a hidrólise enzimática do
caroço de açaí obtido nas melhores condições do pré-tratamento com H2SO4 diluído
(1% de ácido; 10% de sólidos a 121°C durante 60 minutos e 150 rpm) e que também foi
sequencialmente deslignificado na melhor condição (1% de NaOH; 25% de sólidos a
75°C durante 60 minutos e 150rpm) foram submetidas a um estudo de variação das
cargas de sólidos e influência da agitação.
Na Tabela 8.1, são mostrados os resultados obtidos para os valores de gramas de
glicose liberados após a hidrólise enzimática do caroço de açaí que foi apenas pré-
tratado com ácido diluído (g de glicose/ g de caroço “in natura”) e do caroço que foi
pré-tratado e deslignificado (g de glicose/ g de caroço pré-tratado).
149
Tabela 8-1 Resultados obtidos para o planejamento experimental utilizado para avaliar o efeito da agitação e da concentração de sólidos na liberação de glicose após a hidrólise enzimática do caroço de açaí pré-tratado com H2SO4 diluído e/ou pré-tratado e deslignificado.
Ensaio Agitação (rpm)
Concentração de sólidos
(%)
g glicose/g de
caroço “in
natura”
g glicose/g caroço pré-
tratado
1 100 5 0,21 0,34 2 150 5 0,21 0,33 3 200 5 0,23 0,35 4 100 10 0,18 0,33 5 150 10 0,19 0,34 6 200 10 0,20 0,34 7 100 15 0,16 0,26 8 150 15 0,19 0,28 9 200 15 0,19 0,29 10 150 10 0,19 0,33 11 150 10 0,19 0,33 12 150 10 0,18 0,34
De acordo com a Tabela 8.1, foi possível observar que os maiores valores
obtidos para os teores de g de glicose / g de material foram observados para o ensaio 3
que corresponde as condições de 200 rpm de agitação e 5% de sólidos e os valores
foram de 0,23g de glicose/ g de caroço “in natura”, para o material que foi pré-tratado
com H2SO4 diluído e de 0,35 g de glicose/ g de caroço pré-tratado para o material que
foi pré-tratado com ácido e também deslignificado.
De maneira geral, os valores variaram entre 0,18 a 0,23 g de glicose/g de caroço
“in natura” e de 0,26 a 0,35 g de glicose/ g de caroço pré-tratado. É possível verificar
que a deslignificação proporcionou maiores valores de gramas de glicose quando
comparados com os valores que foram obtidos para o material que foi apenas pré-
tratado com H2SO4 diluído.
Com os valores obtidos e mostrados na Tabela 8.1, foi realizada uma análise
estatística para verificar as variáveis de influência significativa no processo. Estes
resultados são verificados na Tabela 8.2.
150
Tabela 8-2 Análise dos efeitos principais das variáveis de hidrólise enzimática do caroço pré-tratado com H2SO4 diluído (g de glicose/ g de caroço “in natura”) para um intervalo de 95% de confiança.
Fatores Efeito
estimado Erro puro
t(2) Significância estatística (p)
Média 0,194519 0,001416 137,3950 0,000001 (X1) Agitação (rpm) (L) 0,021700 0,003707 5,8534 0,009940 (X1) Agitação (rpm) (Q) 0,001674 0,002781 0,6021 0,589566 (X2) Concentração de sólidos (%)(L) -0,040070 0,003707 -10,8082 0,001694 (X2) Concentração de sólidos (%)(Q) -0,010455 0,002781 -3,7600 0,032891
É possível verificar que as variáveis consideradas significativas no valor de (g de
glicose/ g de caroço “in natura”) após a hidrólise enzimática foram: Agitação (L),
Concentração de sólidos (L) e Concentração de sólidos (Q). A variável que se mostrou
mais significativa foi a concentração de sólidos (L) (-0,040070) a qual demonstrou valor
negativo, o que teoricamente nos leva a afirmar que aumentos na concentração de
sólidos promoveriam reduções nos valores da resposta analisada.
Sindihu et al., (2011) verificaram que o aumento na carga de sólidos até
concentrações em torno de 11% promoveram aumentos nos valores de glicose
produzida. Entretanto, o mesmo autor afirma que acima daquele valor, novos aumentos
não foram significativos para a obtenção de maiores índices de glicose. Qi et al. (2009)
afirmam que a carga de sólidos pode ser considerada como um dos fatores de maior
impacto na conversão enzimática.
A segunda variável mais significativa foi a agitação (L) com valor positivo
(0,021700), o que significaria que aumentos nos valores de agitação promoveriam
elevações nos valores de g de glicose/ g de caroço “in natura”. Este fato é confirmado
por Palmqvist et al. (2011) que relata uma relação quase linear entre o aumento nos
valores de agitação e os valores de conversão enzimática. Segundo os mesmos autores,
este comportamento pode se reproduz para diferentes cargas enzimáticas e não se altera
com o tempo. Todavia, deve-se também considerar que a agitação excessiva pode
desativar as enzimas e reduzir a eficiência de conversão eficiência (INGESSON et al.,
2001) o que não foi observado para o presente trabalho.
Com auxílio de programa estatístico foi realizada a análise de variância
(ANOVA) para os valores de g de glicose/ g de caroço “in natura” obtidos para a
hidrólise enzimática do caroço pré-tratado com H2SO4 diluído os quais são mostrados na
Tabela 8.3.
151
Tabela 8-3 Análise de Variância (ANOVA) realizada para os valores de g de glicose/ g de caroço “in natura” obtidos para a hidrólise enzimática do caroço pré-tratado com H2SO4 diluído para um intervalo de 95% de confiança.
Fonte de variação Soma
Quadrática
Graus de
Liberdade
Média Quadrática
F calculado
F tabelado
Regressão (R) 0,003409 3,000 0,001136 45,60 4,07 Resíduos (r) 0,000199 8,000 0,000025 Falta de ajuste (faj) 0,000137 5 0,000027 1,33 9,01 Erro puro (ep) 0,000062 3 0,000021 Total (T) 0,003608 11
% de variação explicada (R²) 94,48% % máxima de variação explicável 98,29%
A análise da Tabela 8.3 permite verificar que o modelo obtido a partir dos dados
analisados foi considerado significativo ao nível de 95% de confiança, visto que passou
no teste F da regressão (F calculado > F tabelado). Além disso, o modelo e as
superfícies de respostas puderam ser geradas visto que a análise revelou que o modelo
também passou para o segundo teste F (F da falta de ajuste) o que revela que o modelo
pode ser utilizado para predizer os valores para a faixa utilizada nos experimentos desse
planejamento. O segundo teste F também atendeu a exigência de que o F calculado da
falta de ajuste fosse de 4 a 5 vezes menor que o F tabelado da falta de ajuste. O R2
obtido foi de 0,9448 o que indica que o modelo explica 94,48% da variância dados
analisados. Este valor é considerado muito bom para a obtenção de um modelo válido e
útil para fins preditivos, segundo Box et al. (1978).
A Figura 8.1 mostra os valores observados vs. os valores preditos obtidos a
partir do planejamento e revela um bom ajuste dos dados e a boa repetibilidade dos
mesmos.
152
0,15 0,16 0,17 0,18 0,19 0,20 0,21 0,22 0,23 0,24
Valores observados
0,16
0,17
0,18
0,19
0,20
0,21
0,22
0,23
0,24
Val
ores
pre
dito
s
Figura 8.1 Valores observados vs. valores preditos obtidos para os valores de g de glicose/ g de caroço “in natura” a 95% de confiança
Na Figura 8.2 é possível ter uma melhor visualização dos efeitos considerados
avaliados no planejamento experimental aplicado.
,6021093
-3,75996
5,853369
-10,8082
p=,05
Efeitos Estimados
Agitação (rpm)(Q)
Carga de sólidos (%)(Q)
(1)Agitação (rpm)(L)
(2)Carga de sólidos (%)(L)
,6021093
-3,75996
Figura 8.2 Gráfico de Pareto obtido para os efeitos estimados dos valores de g de glicose/ g de caroço “in natura” em um intervalo de 95% de confiança
De acordo com a Tabela 8.3, a análise de variância obtida para o planejamento
realizado revelou a possibilidade de se gerar o modelo estatístico que foi considerado
significativo e preditivo a 95% de nível de confiança para a variável resposta g de
glicose/ g de caroço “in natura” (caroço de açaí pré-tratado com H2SO4 diluído). Este
153
fato também permitiu que a superfície que descreve o comportamentos dos dados
pudesse ser gerada e mostrada na Figura 8.3.
Figura 8.3 Superfície de resposta gerada para os valores de g de glicose / g de caroço “in natura”.
De acordo com a Figura 8.3, é possível verificar dentro das condições
experimentais estudadas as condições ótimas obtidas para os valores de g de glicose / g
de caroço “in natura” foi a realizada a 200 rpm de agitação e 5% de com cargas de
sólidos. Após a analise dos coeficientes de regressão e os fatores não significativos
(p<0,05) serem ignorados, foi gerado o modelo com as variáveis codificadas o qual é
mostrado na equação 8.1 .
g de glicose/ g de caroço in natura (Y) 2221 0,004X-0,020X - 0,010X+0,194 = (8.1)
onde: X1 é agitação e X2 é a concentração de sólidos
154
8.2. ANÁLISE E TRATAMENTO ESTATÍSTICO DOS RESULTADOS
OBTIDOS PARA A HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO CAROÇO DE AÇ AÍ PRÉ-
TRATADO COM H 2SO4 DILUÍDO E SEQUENCIALMENTE
DESLIGNIFICADO
A análise estatística também foi realizada para os dados obtidos para os valores
de g glicose/g caroço pré-tratado referente a hidrólise do material pré-tratado com ácido
e sequencialmente deslignificado os quais estão apresentados na Tabela 8.1. Dessa os
dados foram analisados para verificar as variáveis de influência significativa no
processo. Estes resultados são apresentados na Tabela 8.4
Tabela 8-4 Análise dos efeitos principais das variáveis de hidrólise enzimática do caroço pré-tratado com H2SO4 diluído e sequencialmente deslignificado (g de glicose/ g de caroço pré-tratado com H2SO4 diluído) para um intervalo de 99% de confiança.
Fatores Efeito
estimado Erro puro
t(2) Significância estatística (p)
Média 0,317086 0,000729 435,1889 0,000000 (X1) Agitação (rpm) (L) 0,018590 0,001908 9,7435 0,002297 (X1) Agitação (rpm) (Q) -0,000690 0,001431 -0,4822 0,662644 (X2) Concentração de sólidos (%)(L) -0,067242 0,001908 -35,2425 0,000050 (X2) Concentração de sólidos (%)(Q) 0,025549 0,001431 17,8543 0,000383
É possivel observar que as variáveis consideradas significativas ao nível de 99%
de confiança para a variável resposta analisada (g de glicose/ g de caroço pré-tratado
com H2SO4 diluído) foram: concentração de sólidos (L); concentração de sólidos (Q) e
agitação (L). De acordo com a mesma tabela, a variável concentração de sólidos (L) foi
aquela que se mostrou mais influente no processo com o valor de efeito de - 0,067242.
O valor negativo desta variável indica que aumentos na concentração de sólidos
levariam a redução nos valores da variável resposta analisada (g de glicose/ g de caroço
pré-tratado com H2SO4 diluído). A variável concentração de sólidos (Q) foi a segunda
mais significatica com o valor de 0,025549 seguida pela agitação (L) com o valor de
0,018590, o seu valor positivo demonstraria que aumentos na agitação proporcionariam
aumentos nos valores da resposta analisada.
Na Tabela 8.5, é mostrada a análise de variância (ANOVA) obtida para os dados
obtidos pelo planejamento experimental realizado.
155
Tabela 8-5 Análise dos efeitos principais das variáveis de hidrólise enzimática do caroço pré-tratado com H2SO4 diluído e sequencialmente deslignificado (g de glicose/ g de caroço pré-tratado com H2SO4 diluído) para um intervalo de 99% de confiança.
Fonte de variação Soma
Quadrática
Graus de
Liberdade
Média Quadrática
F calculado
F tabelado
Regressão (R) 0,009224 3,000 0,003075 90,41 7,59 Resíduos (r) 0,000272 8,000 0,000034 Falta de ajuste (faj) 0,000256 5 0,000051 9,36 28,23 Erro puro (ep) 0,000016 3 0,000005 Total (T) 0,009496 11
% de variação explicada (R²) 97,14% % máxima de variação explicável 99,83%
De acordo com os resultados da Tabela 8.5, a análise de variância realizada para
os dados mostrou que o modelo pode ser considerado significativo a um intervalo de
significância de 99% , uma vez que o modelo cumpriu o requisito para o Teste F da
regressão (Fcalculado>Ftabelado). Para este trabalho, foi encontrado que o Fcalculado
foi 11,91 vezes maior que o F tabelado da regressão. Já para o segundo teste F,
calculado para a Falta de ajuste mostrou mais um vez cumprir a condição no qual o
Fcalculado deve ser menor que o Ftabelado. Diante das duas condições mencionadas, é
possível afirmar que o modelo é significativo e preditivo para as condições
experimentais estudadas.
O valor encontrado para o R2 foi de 0,9714, o que indica que o modelo consegue
explicar em até 97,14% da variabilidade dos dados obtidos.
A Figura 8.4 mostra os valores observados vs. os valores preditos obtidos a
partir do planejamento e revela um bom ajuste dos dados e a boa repetibilidade dos
mesmo a 99% de significnância.
156
0,24 0,25 0,26 0,27 0,28 0,29 0,30 0,31 0,32 0,33 0,34 0,35 0,36 0,37
Valores observ ados
0,25
0,26
0,27
0,28
0,29
0,30
0,31
0,32
0,33
0,34
0,35
0,36
0,37
Val
ores
pre
dito
s
Figura 8.4 Valores observados vs. valores preditos obtidos para os valores de g de glicose/ g de caroço pré-tratado com H2SO4 diluído para um intervalo de 99% de confiança (caroço pré-tratado e sequencialmente deslignificado)
Na figura 8.5 é possível ter uma melhor visualização dos efeitos considerados
avaliados no planejamento experimental aplicado através do gráfico de Pareto.
-,482222
9,743537
17,85427
-35,2425
p=,01
Agitação (rpm)(Q)
(1)Agitação (rpm)(L)
Carga de sólidos (%)(Q)
(2)Carga de sólidos (%)(L)
-,482222
Figura 8.5 Gráfico de Pareto obtidos dos efeitos estimados para os valores de g de glicose/ g de caroço pré-tratado com H2SO4 diluído em intervalo de 99% de confiança.
De acordo com a Tabela 8.5, a análise de variância obtida para o planejamento
realizado revelou a possibilidade de se gerar o modelo estatístico que foi considerado
significativo e preditivo a um intervalo de 99% de confiança para a resposta g de
glicose/ g de caroço pré-tratado (caroço pré-tratado com ácido e sequencialmente
157
deslignificado). Este fato também permitiu que a superfície que descreve o
comportamento dos dados pudesse ser gerada e mostrada na Figura 8.6.
Figura 8.6 Superfície de resposta obtida para os valores de g de glicose/ g de bagaço pré-tratado com H2SO4 diluído
A análise da superfície de resposta obtida para os valores de g de glicose/ g de
bagaço pré-tratado com H2SO4 diluído permite afirmar que valores de cargas de sólidos
reduzidos associados a uma ampla faixa de agitação permitiu a obtenção de elevados
valores da resposta analisada. De acordo com a análise dos dados, a melhor condição
para as condições estudadas foi de 10% de sólidos e 200 rpm de agitação. Após a
análise dos coeficientes de regressão e os fatores não significativos (p<0,01) serem
ignorados, foi gerado o modelo em variáveis codificadas, o qual é mostrado na Equação
8.2
g de glicose/ g de caroço pré-tratado (Y) 2221 0,012X+0,033X - 0,009X+0,317 =
(8.2),
onde X1 é a agitaçãoe X2 é a carga de sólidos em variáveis codificadas
158
8.3. RESULTADOS OBTIDOS PARA A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DA
CELULOSE APÓS O PRÉ-TRATAMENTO COM H 2SO4 E
DESLIGNIFICAÇÃO
De acordo com a Figura 8.7, os valores da conversão enzimática obtidos após a
variação da carga de sólidos e agitação variaram de 41,05 a 58,87% para o material
que foi apenas pré-tratado com H2SO4 diluído e de 49,33 a 67,77% para o material
tratrado com ácido e sequencialmente deslignificado. O ensaio 3 (200 rpm e 5% de
sólidos) foi aquele que permitiu os maiores valores de conversão para os dois materiais
hidrolisados. A condição do ensaio 7 (100 rpm e 15% de sólidos) foi aquela que
mostrou os menores resultados de conversão para os dois tipos de material hidrolisado
(apenas pré-tratado com H2SO4 diluído e o que também foi sequencialmente
deslignificado).
O aumento na carga de sólidos de 5% para 10% a 100 rpm durante a hidrólise
enzimática, promoveu uma redução no valor da conversão em 15,74% e 0,58%, para o
caroço de açaí apenas pré-tratado com ácido e aquele para aquele que foi
sequencialmente deslignificado, respectivamente. De acordo com Gregg and Saddler,
(1996) altas cargas de sólidos durante a hidrólise enzimática reduzem as taxas de
conversão devido a inibição enzimática por produto, inativação enzimática ou redução
na reatividade do substrato celulósico.
Após o material pré-tratado com H2SO4 ser deslignificado verificou-se um
aumento médio no valor da conversão enzimática de 23,86%. O ensaio 12 (150rpm e
10% de sólidos) foi aquele no qual se verificou maior aumento no valor da conversão
após o material pré-tratado com ácido ser deslignificado (37,39%). Para o ensaio 3 (200
rpm, 5% de sólidos), o qual mostrou os melhores resultados de conversão, a
deslignificação proporcionou um aumento de 15,11% na conversão enzimática do
material.
159
Figura 8.7 Resultados da conversão da celulose obtidos para o caroço de açaí pré-tratado com H2SO4 diluído e pré-tratado com H2SO4 diluído e sequencialmente deslignificado.
Na Figura 8.8 são mostrados os valores de conversão enzimática obtidos nas
condições de 200 rpm (melhor condição de agitação) e com os materiais provenientes
das melhores condições de pré-tratamento e deslignificação nas melhores condições
observadas nos planejamentos aplicados. É possível observar que a carga de sólidos de
3% quando hidrolisada na melhor conversão de agitação (200rpm) foi aquela que
mostrou maiores valores de conversão com o valor de 78,97% para o caroço pré-tratado
e sequencialmente deslignificado.
Foi possível verificar que o aumento na concentração de sólidos para todos os 3
diferentes tipos de material convertido (apenas pré-tratado com H2SO4 diluído, pré-
tratado e deslignificado e “in natura”) promoveu redução nos valores de conversão
enzimática, semelhante ao que foi observado por Sindhu et al. (2010). Carvalho et al.
(2013) afirmaram que o aumento na carga de sólidos promove a redução nos níveis de
conversão e que isso se repete para uma ampla variedade de materiais lignocelulósicos.
Apesar da concentração de 3% de sólidos ter mostrado os melhores resultados de
conversão, é necessário considerar que os valores de conversão obtidos para 10 e 15%
de sólidos também foram bons e foram de 64,60 e 54,69%, respectivamente. Segundo
Kootstra et al. (2009) a utilização de cargas de sólidos elevadas reduzem os custos de
energia.
160
Os resultados mostrados na Figura 8.8 mostraram ainda que o pré-tratamento
realizado apenas com o H2SO4 diluído promoveu conversões 2,07 a 3,27 vezes maiores
se comparadas com o material “in natura” ou não-tratado. Quando o material pré-tratado
com ácido foi sequencialmente deslignificado esses valores foram ainda maiores e
atingiram valores de 2,4 a 3,76 vezes maior que os observados para o material “in
natura”. Esses valores foram menores que os obtidos por Sindihu et al. (2011) que
obteve valores de conversão de até 4 vezes maiores para bagaço de cana tratado apenas
com H2SO4 diluído.
Entretanto os valores de conversão obtidos neste trabalho são considerados bons
e maiores (conforme a Figura 8.7) se comparados com aqueles encontrados por Silva
(2009) que obteve valores de conversão de 32 e 61 % para o pseudocaule de bananaeira
pré-tratado com H2SO4 diluído e apenas deslignificado com NaOH. Já Martin et al.
(2007) relata que para cascas de amendoim, talos de mandioca e cascas de arroz o pré-
tratamento com H2SO4 diluído não foi eficiente em melhorar a hidrólise enzimática.
Figura 8.8 Resultados da conversão enzimática obtida para a celulose do caroço de açaí apenas pré-tratado com H2SO4 diluído, pré-tratado e deslignificado sequencialmente e “in natura” a 200 rpm.
A Figura 8.9 mostra o gráfico das cinéticas de hidrólise enzimática obtidas nas
concentrações de sólidos de 3, 5, 10 e 15% para o material pré-tratado com H2SO4
diluído (na melhor condição obtida durante o estudo do pré-tratamento com ácido –
item 3.3) e para o material “in natura” ou bruto após 96 horas de cinética a 200 rpm. É
possível verificar que os valores de glicose/L para o material pré-tratado atingem
161
valores máximos próximos a 45 g/L. Já quando se observa a cinética obtida para o
material “in natura” verificam-se valores máximos próximos de 11,5g/L. A maior
concentração de glicose /L foi obtida para a carga de sólidos de 15% seguida pela carga
de 10% para ambos os materiais. Na concentração de 15% de sólidos o pré-tratamento
com H2SO4 diluído permitiu um aumento de 297% no índice de g de glicose/L em
relação ao material “in natura” /bruto hidrolisado na mesma condição. Para a
concentração de sólidos de 10% esse aumento doi de 282%.
Figura 8.9 Cinéticas de hidrólise enzimática realizadas para o caroço de açaí pré-tratado com H2SO4 diluído (1° da esquerda para direita) e caroço de açaí “in natura”/bruto (2° da esquerda para direita) durante 96 horas a 200rpm.
Na Figura 8.10, é mostrado o gráfico com a cinética de hidrólise enzimática,
também realizada nas 4 diferentes concentrações de sólidos citadas anteriormente para
o caroço de açaí pré-tratado e deslignificado sequencialmente nas mesmas condições
citadas para a Figura 8.9. O material que foi pré-tratado com ácido e sequencialmente
deslignificado mostrou valores de g de glicose/L superiores aqueles que foram
mostrados para os materiais da Figura 8.9. De acordo com a Figura 8.10 foi mais uma
vez observado que as concentrações de sólidos de 15 e 10% foram aquelas que
permitiram os maiores índices de g de glicose/L. Os valores obtidos foram de 68,73 e
54,12 g de glicose/L para as concentrações de 15 e 10%, respectivamente. Após o pré-
tratamento e deslignificação sequencial foi possível observar um aumento máximo no
valor de g de glicose/L de 527% em relação ao material “in natura”/bruto na mesmas
condições de hidrólise (15% de sólidos). Isso representa um valor quase 6 vezes maior
na quantidade de g de glicose/L no hidrolisado.
162
Figura 8.10 Cinéticas de hidrólise enzimática realizadas para o caroço de açaí pré-tratado com H2SO4 diluído e deslignificado sequencialmente durante 96 horas a 200rpm.
Na Figura 8.11, são mostradas as cinéticas de hidrólise enzimáticas obtidas para
as melhores condições do planejamento realizado neste capítulo: 5% de sólidos para o
caroço apenas pré-tratado com H2SO4 diluído; 10% para o caroço sequencialmente
deslignificado; ainda é mostrada a cinética nestas mesmas condições para o material “in
natura”/bruto. De maneira geral, o pré-tratamento seguido de deslignificação foi o
material que apresentou um maior valor de g de glicose/L (54,12).
Figura 8.11 Cinéticas de hidrólise enzimática realizadas para o caroço de açaí pré-tratado apenas com H2SO4; pré-tratado e sequencialmente deslignificado e caroço “in natura”/bruto durante 96 horas a 200rpm.
Como as hidrólises enzimáticas iniciais observadas durante os estudos de pré-
tratamento e deslignificação foram realizadas nas cargas de sólidos de 3%, e foram
163
realizadas cinéticas de hidrólise enzimática para esta concentração com a condição
ótima de agitação e tempo mais elevado.
Os resultados mostrados na Figura 8.12. apontam que mais uma vez o material
pré-tratado e sequencialmente deslignificado foi aquele que mostrou maiores valores de
g de glicose/L (19,85) seguidos pelo material apenas pré-tratado com H2SO4 com o
valor de 14,09 g de glicose/L e “in natura” com o valor de 4,95. Esses resultados
confirmam a eficiência dos pré-tratamentos em melhorar os valores de açúcares para
posterior fermentação.
Figura 8.12 Cinéticas de hidrólise enzimática realizadas para o caroço de açaí pré-tratado apenas com H2SO4; pré-tratado e sequencialmente deslignificado e caroço “in natura”/bruto durante 96 horas a 200rpm a 3% de sólidos.
8.4. CONCLUSÕES PARCIAIS
De acordo com o planejamento experimental, foi possível observar que os
maiores valores obtidos para os teores de g de glicose / g de material foram observados
para o ensaio 3 (de 200 rpm de agitação e 5%) com os valores de 0,23g de glicose/ g de
caroço “in natura,” para o material pré-tratado com H2SO4 diluído e de 0,35 g de
glicose/ g de caroço pré-tratado, para o material pré-tratado com ácido e também
deslignificado.
Os ensaios realizados na melhor condição de agitação mostrou que a
concentração de 3% de sólidos foi aquela que permitiu a obtenção dos maiores valores
de conversão enzimática, para todos os materiais avaliados. Entretanto, a concentração
de 15% de sólidos foi aquela que permitiu a liberação dos maiores valores de g de
glicose/L.
164
Após o pré-tratamento e deslignificação seqüencial, foi possível observar um
aumento máximo no valor de g de glicose/L de 527% em relação ao material “in
natura”/bruto nas mesmas condições de hidrólise (15% de sólidos), o que representou
um valor quase 6 vezes maior na quantidade de g de glicose/L no hidrolisado.
A variável que se mostrou mais significativa no valor de (g de glicose/ g de
caroço “in natura” – apenas pré-tratado com H2SO4 diluído) hidrólise do caroço pré-
tratado foi a concentração de sólidos (L). Dentro das condições experimentais estudadas
as condições ótimas obtidas para os valores de g de glicose / g de caroço “in natura”
(resultado obtido para o caroço pré-tratado apenas com H2SO4 diluído) foi a realizada a
200 rpm de agitação e 5% de cargas de sólidos.
A variável concentração de sólidos (L) foi considerada como a mais significativa
ao nível de 99% de confiança para a variável resposta analisada (g de glicose/ g de
caroço pré-tratado com H2SO4 diluído – material pré-tratado com ácido e
deslignificado). De acordo com a análise dos dados, a melhor condição para as
condições estudadas foi de 10% de sólidos e 200 rpm de agitação (resultado obtido para
o caroço pré-tratado com H2SO4 diluído e seqüencialmente deslignificado).
165
CAPÍTULO 9 - FERMENTAÇÃO DOS HIDROLISADOS
No Capítulo 9 foi realizada a fermentação dos hidrolisados obtidos nas
condições consideradas ótimas para este trabalho. Para o mesmo capítulo, foram
estudados os principais parâmetros de avaliação do processo de fermentação como os
índices de etanol, glicose consumida e glicerol. Além disso foram observados os
rendimentos da fermentação realizada e os inibidores presentes no hidrolisado.
9. FERMENTAÇÃO
9.1. RESULTADOS OBTIDOS PARA A FERMENTAÇÃO DOS
HIDROLISADOS
A fermentação foi realizada com o hidrolisado obtidos com 15% de caroço de
açaí pré-tratado apenas com H2SO4 diluído e com o que foi obtido com 10% do caroço
pré-tratado e deslignificado. A utilização dessas condições se baseou no fato de terem
sido aquelas que mostraram valores bons e semelhantes para o índice de glicose (g/L).
Os valores de xilose foram praticamente nulos em função do pré-tratamento observado,
não sendo considerada a necessidade de quantificá-la.
A Tabela 9.1 mostra a cinética obtida para os valores de celobiose, glicose,
etanol, massa seca, HMF, ácido acético e furfural obtidos para o hidrolisado proveniente
da carga de sólidos de 15% de caroço que foi apenas pré-tratado com H2SO4 diluído.
166
Tabela 9-1 Cinética dos valores de celobiose, glicose, etanol, massa seca, HMF, ácido acético e furfural obtidos para o hidrolisado proveniente da carga de sólidos de 15% de caroço apenas pré-tratado com H2SO4 diluído (Fermentação de 24h).
Tempo (h)
Concentração (g/L)
Celobiose Glicose Glicerol Etanol Massa Seca
HMF Ácido acético
Fufural
0 3,23 43,50 0,00 0,00 1,02 0,02 2,15 0,00 1 3,22 40,10 0,00 0,53 1,89 0,02 2,33 0,00 2 3,21 37,47 0,78 3,24 2,34 0,02 2,21 0,00 4 3,22 18,36 1,20 5,66 3,39 0,02 2,43 0,00 6 3,45 12,90 1,30 7,12 3,67 0,03 2,12 0,00 8 3,44 7,53 2,28 9,35 4,15 0,02 2,12 0,00 10 3,22 6,07 3,33 10,11 4,67 0,02 2,44 0,00 12 3,55 5,34 3,48 13,56 5,15 0,02 2,33 0,00 14 3,56 4,23 4,12 14,50 5,34 0,02 2,14 0,00 16 3,45 3,22 4,21 15,67 5,67 0,02 2,13 0,00 18 3,45 3,12 5,12 15,50 5,45 0,02 2,14 0,00 22 3,53 3,21 5,08 15,20 5,66 0,02 2,13 0,00 24 3,44 3,11 5,02 15,23 5,34 0,02 2,15 0,00
Já na Tabela 9.2, são mostrados a cinética dos valores de celobiose, glicose,
etanol, massa seca, HMF, ácido acético e furfural obtidos para o hidrolisado proveniente
da carga de sólidos de 10% de caroço que foi pré-tratado com H2SO4 diluído e
sequencialmente deslignificado.
Tabela 9-2 Cinética dos valores de celobiose, glicose, etanol, massa seca, HMF, ácido acético e furfural obtidos para o hidrolisado proveniente da carga de sólidos de 10% de caroço pré-tratado com H2SO4 diluído e sequencialmente deslignificado (fermentação de 24h)
Tempo (h)
Concentração (g/L) Celobiose Glicose Glicerol Etanol Massa
Seca HMF Ácido
acético fufural
0 2,14 53,04 0,00 0,05 0,78 0,01 1,15 0,01 1 2,45 46,81 0,00 1,12 1,13 0,01 1,09 0,01 2 2,45 38,28 0,98 3,40 2,14 0,01 1,20 0,01 4 2,55 19,17 1,40 10,10 3,22 0,01 1,24 0,01 6 2,34 13,71 1,50 12,20 3,47 0,01 1,20 0,01 8 2,45 8,34 2,48 16,70 3,88 0,01 1,16 0,01 10 2,33 6,88 3,20 19,40 4,12 0,01 1,10 0,01 12 2,45 4,06 4,00 20,10 4,25 0,01 1,15 0,01 14 2,44 3,45 3,83 21,30 4,67 0,02 1,20 0,01 16 2,33 2,34 4,52 21,12 5,12 0,02 1,21 0,01 18 2,33 2,12 4,57 21,34 5,88 0,02 1,18 0,01 22 2,12 1,20 5,01 21,14 6,08 0,02 1,24 0,01 24 2,12 0,00 4,99 21,65 6,12 0,02 1,23 0,01
167
Os valores de glicose iniciais foram de 45,50 e 53,04 g de glicose/L para o
hidrolisado proveniente do caroço pré-tratado apenas com H2SO4 diluído e para o
caroço pré-tratado e sequencialmente deslignificado. Após as primeiras 8 horas, foi
possível verificar redução no teor de glicose dos hidrolisados nos valores de 82,68 e
84,27%.
Após as 24 de fermentação, foi possível verificar o consumo quase que completo
da glicose presente no hidrolisado proveniente do material deslignificado. Esse
comportamento não foi verificado para o hidrolisado proveniente do caroço apenas pré-
tratado com ácido. Umas das possíveis explicações seria a presença de teores de lignina
mais elevados para o hidrolisado que não foi submetido a deslignificação.
Na Tabela 9.3, é mostrado o comportamento cinético da fermentação de uma
solução padrão de glicose que possuía 55g de glicose/L. Verificou-se o mesmo
comportamento da cinética obtida com o material deslignificado, ou seja o consumo
quase total da glicose presente.
Tabela 9-3 Cinética de fermentação obtida para solução padrão de glicose
Tempo (h) Concentração (g/L)
Glicose Glicerol Etanol Massa Seca
0 55,00 0,00 0,00 1,02 1 40,12 0,10 0,53 1,89 2 38,14 0,55 3,24 2,34 4 34,12 2,30 5,66 3,39 6 20,12 2,44 10,22 3,67 8 15,66 2,28 14,55 4,15 10 12,34 3,33 16,70 4,67 12 6,36 3,48 20,12 5,15 14 4,23 4,34 21,30 5,34 16 2,44 4,56 23,40 5,67 18 0,00 4,67 24,50 5,45 22 0,00 5,13 24,20 5,66 24 0,00 5,12 25,10 5,34
Os valores dos rendimentos de fermentação obtidos para os hidrolisados foram
de 89,31% (glicose padrão), 79,69% (pré-tratado e deslignificado) deslignificado e
73,79% (apenas pré-tratado com H2SO4 diluído). Os valores de glicerol atingem os
níveis máximos de 5,12 e 4,99% após as 24h de fermentação para os hidrolisados
obtidos com o caroço pré-tratado apenas com ácido e aquele que foi obtido com o
caroço sequencialmente deslignificado.
168
Após 24h de fermentação foram observados os teores máximos de etanol de
21,65 e 15,23 g de etanol/L para o hidrolisado obtido com o caroço deslignificado e
para aquele obtido com o caroço apenas pré-tratado com H2SO4. O teor de etanol obtido
após a deslignificação é 42% maior que aquele obtido para o hidrolisado com caroço
apenas pré-tratado com H2SO4 diluído. O teor de etanol obtido para a fermentação da
glicose padrão foi o que mostrou maior valor (25,10g/L), provavelmente por não ter a
presença de lignina residual e ou inibidores da fermentação. Além disso, o hidrolisado
obtido do material que foi apenas pré-tratado com H2SO4 mostra valores de ácido
acético maiores que observados para aquele verificados para o hidrolisado obtido com
caroço de açaí pré-tratado e deslignificado.
Os valores mostrados nas Tabelas 9.1, 9.2 e 9.3 podem ser melhor visualizados
em forma de gráficos na Figuras 9.1. De maneira geral, é observada a redução no nível
de glicose em função do consumo da mesma pelo microrganismo de fermentação. De
acordo com Lima et al. (2001), durante a fermentação uma parte dos açúcares presentes
no meio é consumido em reações paralelas que são necessárias a síntese do etanol. Em
função desse aspecto os rendimentos da fermentação alcoólica industrial têm seu
rendimento em torno de 90%.
Neste trabalho, foi verificado que após as primeiras 14h de fermentação 90% da
glicose já havia sido consumida para ambos os hidrolisados avaliados. A produtividade
volumétrica de etanol obtida foi de 0,9 e 0,63 g de etanol.L-1.h-1 para o hidrolisado
obtido com o caroço apenas pré-tratado com H2SO4 diluído e para o hidrolisado obtido
com o caroço pré-tratado e deslignificado, respectivamente.
Nascimento (2011) cita valores de rendimento de 80 a 90% para a produção de
etanol a partir de hidrolisados de bagaço de cana- de-açúcar pré-tratados com NaOH.
Esses valores são ligeiramente maiores, porém muito próximos aos que foram obtidos
neste trabalho. Toscan (2013) cita o valor máximo de conversão de 76,72% para o
hidrolisado obtido a partir de capim elefante pré-tratado hidrotermicamente, enquanto
que Sipos et al. (2009) realizaram a fermentação do bagaço de sorgo de milho pré-
tratado com explosão a vapor e obtiveram novamente os valores de rendimento em
torno de 80 a 90%.
169
Figura 9.1 Gráficos das cinéticas de fermentação dos hidrolisados padrão (glicose padrão), hidrolisado obtidos com o caroço de açaí apenas pré-tratado com H2SO4 diluído e hidrolisado obtido com o caroço de açaí pré-tratado e sequencialmente deslignificado (da esquerda para direita).
170
9.2. CONCLUSÕES PARCIAIS
Após as 24 de fermentação, foi possível verificar o consumo quase completo da
glicose presente no hidrolisado proveniente do material deslignificado.
Durante as primeiras 14h de fermentação, 90% da glicose foi consumida para
ambos os hidrolisados avaliados. A produtividade volumétrica de etanol obtida foi de
0,9 e 0,63 g de etanol.L-1.h-1 para o hidrolisado obtido com o caroço apenas pré-tratado
com H2SO4 diluído e para o hidrolisado obtido com o caroço pré-tratado e
deslignificado, respectivamente.
Os valores dos rendimentos de fermentação obtidos para os hidrolisados foram
de 89,31% (glicose padrão), 79,69% (pré-tratado e deslignificado) deslignificado e
73,79% (apenas pré-tratado com H2SO4 diluído). Os valores de glicerol atingiram os
níveis máximos de 5,12 e 4,99% após as 24h de fermentação para os hidrolisados
obtidos com o caroço pré-tratado apenas com ácido e para aquele que foi obtido com o
caroço seqüencialmente deslignificado.
Após 24h de fermentação, foram observados os teores máximos de etanol de
21,65 e 15,23 g de etanol/L para o hidrolisado obtido com o caroço deslignificado e
para aquele obtido com o caroço apenas pré-tratado com H2SO4.
O teor de etanol obtido após a deslignificação foi 42% maior que aquele obtido
para o hidrolisado com caroço apenas pré-tratado com H2SO4 diluído.
CAPÍTULO 10
10. CONCLUSÕES
Foi possível concluir que o caroço de açaí “in natura” mostrou valores de
carboidratos superiores a 60% o que justificaria a utilização desta biomassa para a
produção de etanol.
O pré-tratamento do caroço de açaí com H2SO4 diluído mostrou-se eficiente na
remoção de até 95,80% da fração hemicelulose e 48% da lignina presentes na biomassa
tratada. A hemicelulose solubilizada foi recuperada na forma de xilose na fração líquida,
a qual demonstrou baixos níveis de inibidores. A conversão enzimática do caroço de
açaí pré-tratado com H2SO4 diluído atingiu o valor máximo de 68,43%. A análise
estatistica realizada para os valores de g de glicose obtidos para o material pré-tratado
revelou que as variáveis concentração de ácido (L) e (Q) foram as variáveis mais
significativas para tal resposta.
A deslignificação sequencial foi capaz de remover em até 88,20% da lignina do
material que foi apenas pré-tratado com H2SO4 diluído. A conversão enzimática do
material pré-tratado e sequencialmente deslignificado mostrou o valor máximo de
94,76%. A variável concentração de sólidos (Q) foi aquela que se mostrou mais
significativa para os valores de g de glicose liberadas na hidrólise do material
deslignificado.
No estudo de variação da carga de sólidos, realizada em reator encamisado, foi
possível verificar que a carga de 3% de sólidos com agitação de 200rpm com o material
sequencialmente deslignificado foi a condição que mostrou maiores valores de
conversão enzimática (78,97%) e que as concentrações de 10 e 15% de sólidos do
mesmo material foram as que permitiram os maiores valores de glicose liberada para o
mesmo material. Foi também que a deslignificação foi essencial para a melhoria da
conversão enzimática e dos níveis de glicose liberado no hidrolisado a ser fermentado.
As análises da estrutura morfológica revelaram importantes mudanças na
estrutura do material que foi apenas pré-tratado com H2SO4 diluído e/ou também
deslignificado.
Os hidrolisados obtidos permitiram fermentações com rendimentos de 89,31%
(glicose padrão), 79,69% (pré-tratado e deslignificado) e 73,79% (apenas pré-tratado
com H2SO4 diluído), o que mostra o potencial de se produzir etanol a partir do caroço
de açaí.
172
173
SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
Como sugestões para trabalhos futuros são sugeridos estudos mais aprofundados sobre
aqueles desenvolvidos neste Tese, como:
• Realizar estudo aprofundado sobre a variação da carga enzimática durante a
hidrólise do caroço de açaí;
• Avaliar o efeito de outros pré-tratamentos sobre a biomassa do caroço de açaí;
• Estudar possíveis aumentos na carga de NaOH na deslignificação da biomassa;
• Avaliar o aumento da carga de H2SO4 e seus efeitos
• Realizar um estudo técnico-econômico da produção de etanol a partir do caroço
de açaí;
• Estudar a fermentação de hidrolisados obtidos em fermentador;
174
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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