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Isolamento de linhagens bacterianas do solo capazes de crescer em altas concentrações de glifosato

Priscila Monteiro(1), Anelise Beneduzi(2), Jamilla Sampaio(2), Luciano Kayser Vargas(2) e Bruno Lisboa(2)

(1) Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola e do Ambiente, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Rua

Sarmento Leite, 500, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil. primonteiro21@yahoo.com.br (2)

Departamento de Diagnóstico e Pesquisa Agropecuária, Secretaria da Agricultura, Pecuária e Irrigação, Rua Gonçalves Dias, 570. Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil. abeneduzi@seapi.rs.gov.br, jamila-sampaio@seapi.rs.gov.br, luciano-vargas@seapi.rs.gov.br, bruno-lisboa@seapi.rs.gov.br

Resumo - O glifosato é um herbicida sistêmico, não seletivo e muito utilizado devido a sua alta eficiência. A biodegradação surge como alternativa para a descontaminação de solos que contenham grande quantidade deste herbicida. Este estudo teve como objetivo isolar bactérias de solo contaminado com glifosato, capazes de crescer em altas concentrações do herbicida utilizando-o como fonte de energia. Para tal, foram coletadas amostras de solo da Fepagro Viamão/RS em área em que o herbicida é utilizado com regularidade. O isolamento bacteriano foi realizado utilizando-se meios seletivos contendo o glifosato como única fonte de carbono na concentração de 7,2 mg/mL. A avaliação do potencial biodegradador dos isolados bacterianos obtidos foi realizada em diferentes concentrações do herbicida (50, 75 e 100 mg/mL) e posterior contagem das unidades formadoras de colônias (UFC/mL). Observou-se que o crescimento das linhagens bacterianas isoladas foi até a concentração de 50 mg/mL de glifosato, onde observou-se três potenciais de crescimentos distintos. Os isolados tiveram o DNA extraído e foram submetidos ao sequenciamento de um fragmento do gene 16S rRNA para identificação do gênero e/ou espécie a que pertencem. As bactérias identificadas como Burkholderia foram as únicas capazes de crescer em meio contendo glifosato. Os isolados bacterianos obtidos neste estudo foram capazes de utilizar o glifosato como única fonte de fósforo e carbono, destacando-se o isolado L14, identificado como Burkholderia gladioli. Portanto, acredita-se que a atuação dessas bactérias na degradação do glifosato possibilite a aplicação desses microrganismos na biorremediação de áreas contaminadas com esse tipo de herbicida. Palavras-chave: Herbicida, biodegradação, bactérias, Burkholderia.

Isolation of soil bacterial strains capable of growing in high glyphosate concentrations

Abstract - Glyphosate is a systemic herbicide, non-selective, used worldwide due to its high efficiency. The biodegradation emerges as an alternative to decontaminate soils that contain large amounts of this compound. The objective of this work was to isolate bacteria from soil contaminated with glyphosate able to grow in high concentrations of the herbicide, degrading the compound as an energy source. For this purpose, soil samples where herbicide is applied with regularity was collected from the Fepagro Viamão/RS and the isolation of the bacteria was carried using selective medium with glyphosate at the concentration 7,2 mg/mL. The strains growth in high concentrations of the compound was measured in different concentrations of the herbicide (50, 75 e 100 mg/mL) and later, colony forming units (CFU/mL) was count. The source of energy used by bacteria from the active compound was determined by inoculating the microorganisms in medium containing glyphosate as the only carbon source or as the only phosphorus source. The results showed that the bacterial growth was up to 50 mg/mL of glyphosate, which we found three distinct potential growth. The DNA of bacteria was extracted and subjected to PCR and sequencing a fragment the 16S rRNA gene to identify the genus and/or species. The bacteria of the genus Burkholderia is the only microorganisms able to grow in medium containing glyphosate from this soil in this study. The microorganisms were able to metabolize glyphosate as a phosphorus and carbon source, it is noteworthy of isolated L14, that used glyphosate as a source of carbon and phosphorus identified as Burkholderia gladioli. Therefore, it is believed that activity of these bacteria in degradation of glyphosate will enable the application of these microorganisms in bioremediation of contaminated areas with this type of herbicide. Keywords: Herbicide, biodegradation, bacteria, Burkholderia.

Introdução

O Brasil transformou-se nas últimas décadas em um dos maiores consumidores mundiais de agrotóxicos devido à expansão da fronteira agrícola e da modernização da tecnologia de produção vegetal e animal (Góes, 2009), sendo um dos primeiros no ranking

de vendas de pesticidas, onde os herbicidas correspondem quase à metade do volume total (Araújo, 2002). No entanto, o uso intensivo de agrotóxicos tornou-se uma questão de preocupação ambiental por causa dos efeitos perigosos destes produtos químicos sobre processos biológicos do solo e organismos não-alvo (Zabaloy et al., 2008).

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Uma das tecnologias de descontaminação mais eficaz de ambientes contaminados por agrotóxicos (também chamados de xenobióticos) é o processo biológico, que utiliza microrganismos nativos e modificados que degradam estas moléculas, transformando-as em moléculas mais simples (Bellinaso, 2002). A biorremediação é a utilização de microrganismos para controlar e degradar compostos orgânicos contaminantes, tratando-se de uma alternativa tecnológica interessante pela possibilidade de obter-se completa degradação do poluente, isto é, sua mineralização, ou sua transformação em produtos finais menos tóxicos ou inócuos. Além disso, o custo dessa tecnologia é geralmente menor que outros processos de remediação ambiental (Bononi et al., 2008).

Diante da preocupação ambiental, em especial à contaminação do solo por glifosato, pesquisadores são motivados a estudar o efeito deste composto na microbiota do solo e isolar microrganismos com capacidade de crescimento em altas doses deste herbicida. Portanto, este trabalho teve como objetivo a seleção de isolados bacterianos capazes de crescer em concentrações elevadas e degradar o herbicida glifosato.

Material e Métodos

Isolamento e identificação das bactérias

As amostras de solo foram coletadas em abril de 2014,

a 5 cm da superfície, em solo em que a aplicação do herbicida glifosato é feita de forma regular. Este solo é classificado como Argissolo Vermelho (Embrapa, 2006) da unidade da Fepagro Viamão/RS.

O isolamento das linhagens bacterianas foram conduzidos no Laboratório de Microbiologia Agrícola/ Fepagro Sede (Porto Alegre/RS). Após a coleta, cinco gramas de solo foram peneirados em uma malha de 2 mm e misturados em 50 mL de meio de sais minerais - MSM (Dworkin e Foster, 1958), consistindo em (NH4)2SO4 – 0,375 g/L, MgSO4 – 0,075 g/L, CaCO3 – 0,03 g/L, FeSO4.7H2O – 0,001 g/L, glicose -1 g/L, pH 7,0, previamente esterilizado e acrescido de 1 mL de glifosato (7,2 mg/mL) esterilizado em unidade filtrante estéril, poro 0,45 µm (Millex). As amostras foram incubadas em agitação (120 rpm), a 30 °C durante sete dias. Após, 100 µL do cultivo foi inoculado em triplicatas em placas contendo o meio MSM acrescido de ágar – 11 g/L, pH 7,0, e de 1mL de glifosato para cada 50mL de meio MSM (7,2 mg/mL). As placas foram incubadas a 30 °C por três dias. As colônias bacterianas que apresentaram morfologias diferentes foram selecionadas e submetidas ao mesmo procedimento anterior e depois de cultivadas em Meio King B (Glickmann, 1995). As bactérias foram incubadas em estufa a 30 °C, por três dias. Para verificação da morfologia e pureza foi feita a coloração de Gram e as amostras foram estocadas em glicerol a -20 °C.

Avaliação do crescimento dos isolados em diferentes concentrações de glifosato

A quantidade de células bacterianas de cada pré-

inóculo foi determinada pela leitura da OD em 660 nm (entre 0,3 e 0,4) em espectrofotômetro. Os inóculos foram feitos em MSM seguido das diferentes concentrações de glifosato (Tabela 1) (Moneke et al., 2010). As amostras foram incubadas em câmara de crescimento com agitação (120rpm), a 30°C durante cinco dias. Postoriormente, foi realizada uma diluição seriada dos cultivos até a diluição 10-6 e estas plaqueadas em meio ágar nutritivo (AN) (Peptona Bacteriológica – 10 g/L, Extrato de carne – 5 g/L, NaCl – 5 g/L, Ágar – 14 g/L, pH 7,0), em triplicatas, para a contagem de UFC/mL. Tabela 1. Concentrações utilizadas do composto ativo (glifosato) em meio de sais minerais (MSM)

Volume de Meio de Sais Minerais (MSM)

Concentração do composto ativo

(glifosato)

50 mL 50 mg/mL 50 mL 75 mg/mL

50 mL 100 mg/mL

Avaliação da utilização do glifosato como fonte de carbono e fósforo

Foram utilizados os meios de cultura descritos na

Tabela 2 (Moneke et al., 2010) acrescidos de glifosato. A quantidade de células de cada pré-inóculo foi determinada pela leitura da OD em 660 nm (entre 0,3 e 0,4 de absorbância) em espectrofotômetro.

A incubação em câmara de crescimento com agitação (120 rpm), a 30°C durante cinco dias. Após o crescimento, foi realizada diluição seriada até 10-7 e 100µL, inoculado em triplicatas nas placas contendo meio AN e incubadas a 30 °C, durante três dias para contagem das UFC/mL.

Tabela 2. Meios de cultura para verificação do padrão metabólico na degradação do herbicida glifosato

Fonte de energia Composição Concentração de glifosato

Glifosato como fonte de Carbono

MSM sem glicose + KH2PO4 + glifosato

7,2 mg/mL

Glifosato como fonte de Fósforo

MSM + glifosato 7,2 mg/mL

Controle Positivo (com glicose e KH2PO4)

MSM + KH2PO4 -

Controle Negativo (sem glicose e KH2PO4)

MSM sem glicose -

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Extração de DNA e PCR Os isolados bacterianos foram lavados com tampão

TES (Tris pH 8.0 10 mM, EDTA 25 mM, NaCl) e ressuspendidos em tampão TE (Tris pH 8.0 10 mM, EDTA 25 mM). A lise celular foi realizada com lisozima 20 mg ml−1 a 37 °C e sódio dodecil-sulfato 4%. As extrações foram feitas com fenol/clorofórmio, seguida de precipitação com etanol como descrito por Sambrook e Russel (2001). A qualidade e integridade do DNA foram verificadas por eletroforese em gel de agarose 0,8%.

Sequenciamento parcial do gene 16S rRNA

Um fragmento do gene 16S rRNA foi amplificado das

amostras em um termociclador Veriti 96 Thermal Cycler (Aplied Biosystem) em 25 ul de reação contendo 0.1 mM de cada primer, 1 mM MgCl2 (Invitrogen), 10 mM de cada dNTP (Amersham Biosciences) e 1U Taq DNA polimerase (Invitrogen). A sequencia do gene 16S rRNA quase completa (1500 pb) foi amplificada utilizando os primers 5'AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3’ (Stackebrandt e Liesack, 1993) e 5’AGA AAG GAG GTG ATC CAG CC 3’ (Edwards et al., 1989).

As reações foram realizadas com um ciclo inicial de desnaturação a 94 °C por 5 min, seguido por 30 ciclos de amplificação, sendo cada ciclo composto por: 1 fase de desnaturação com duração de 1 min a 94 °C, 1 fase de anelamento de 1 min a 49 °C e uma fase de extensão de 1 min a 72 °C. A extensão final foi de um ciclo a 72 °C por 5 min. Os produtos da PCR foram analisados em gel de agarose 1% corado com Blue Green Loading Dye I (LGC biotecnologia). Os fragmentos obtidos dos isolados bacterianos foram sequenciados em uma orientação no laboratório ACTGene do Centro de Biotecnologia, UFRGS, RS, no sequenciador automático ABI-PRISM 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). As sequências obtidas foram comparadas com as disponíveis no banco de dados GenBank através do programa BLASTN (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST/). As sequências de 14 isolados bacterianos obtidos neste estudo foram depositadas no banco de dados com os números de acesso KU738870, KU738871, KU738873, KU738874, KU738876 a KU738879, KU738881, KU758907, KU758908, KU870668, KY398727 e KY398728.

Análise estatística

Foi utilizado o teste de Scott-Knott para avaliar a

média de UFC/mL na concentração de 50 mg/mL de glifosato. Nas análises foi utilizado o software Assistat versão 7.7 beta (Silva e Azevedo, 2002).

Resultados e Discussão

Isolamento e identificação das bactérias

Pode-se observar que as colônias bacterianas que cresceram no meio mineral contendo 7,2 mg/mL do glifosato, após isoladas, não apresentaram diferenças morfológicas entre si. Esse resultado mostra a redução na diversidade da morfologia colonial, indicando a predominância de um tipo de gênero e/ou espécie que é capaz de crescer em meio contendo glifosato como única fonte de carbono. Busse et al. (2001) demonstraram que o número de bactérias e fungos cultiváveis geralmente são reduzidos ou eliminados quando extraídos do solo ou cultivados em meio sólido contendo glifosato.

Os isolados bacterianos não se distinguiram morfologicamente na placa, sendo, portanto, selecionadas aleatoriamente cinco colônias de cada placa, resultando em 14 isolados denominados de L1 a L15. Esses isolados foram submetidos à técnica de coloração de Gram e todos se apresentaram como bacilos Gram-negativos. Segundo Lancaster et al. (2010), a maioria das bactérias capazes de degradar glifosato são espécies Gram-negativas.

As bactérias isoladas foram identificadas por sequenciamento de um fragmento do gene 16S rRNA e todas pertencem ao gênero Burkholderia, como indicado na Tabela 3. Tabela 3. Identificação do gênero e/ou espécie dos isolados bacterianos obtidos

Isolado Gênero e/ou espécie

L1 Burkholderia cepacia L2 Burkholderia cepacia

L3 Burkholderia cepacia L5 Burkholderia sp.

L6 Burkholderia sp. L7 Burkholderia cepacia

L8 Burkholderia sp. L9 Burkholderia sp.

L10 Burkholderia sp. L11 Burkholderia cenocepacia L12 Burkholderia sp.

L13 Burkholderia ambifaria L14 Burkholderia gladioli

L15 Burkholderia cepacia

Já foi visto que a versatilidade metabólica das estirpes

pertencentes ao complexo de espécies de Burkholderia pode ser utilizada para fins de biorremediação. Outros produtos como constituintes de óleos brutos (incluindo hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PHA), herbicidas e derivados de éter utilizados como aditivos de gasolina também podem ser degradados por isolados deste

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gênero (Coenye e Vandamme, 2003). Essa diversidade metabólica faz com que o gênero Burkholderia seja desejável para aplicações biotecnológicas. Além disso, algumas espécies deste gênero foram estudadas para potencial utilização em tratamento de poluição do solo ou de águas subterrâneas (Leahy et al., 1996). Crescimento dos isolados em diferentes concentrações de glifosato

A avaliação do crescimento dos isolados nas diferentes concentrações do herbicida glifosato em meio de cultura líquido serviu como um screening, tendo em vista que se procurava os isolados com melhor potencial para degradação. Sendo a concentração de 7,2 mg/mL do glifosato a sugerida pelo fabricante para uso no solo, foram também testadas as concentrações de 50, 75 e 100 mg/mL do herbicida, considerando-se um possível acúmulo ou derramamento desse produto no mesmo. Pode-se observar que em 75 e 100 mg/mL do composto ativo não houve crescimento de nenhum dos isolados, porém, na concentração de 50 mg/mL verificou-se diferenciação do crescimento. Portanto, a partir do resultado da técnica de diluição seriada, plaqueamento e contagem de UFC/mL, foi possível realizar o teste estatístico de Scott-Knott que diferenciou as médias do crescimento dos isolados em três grupos distintos (Tabela 4). Os isolados bacterianos que apresentaram um número maior de colônias em 50 mg/mL de glifosato foram L14, L12, L10 e L8. Tabela 4. Média de UFC/mL dos isolados bacterianos submetidos à concentração de 50 mg/mL de glifosato

Isolado (UFC/mL) x107

L14 126,3 a L12 119,3 a

L10 108,7 a L8 94,3 a L9 70,0 b L7 63,3 b

L6 45,3 b L5 38,3 c L13 38,3 c L2 22,0 c

L1 20,9 c L3 17,8 c L11 17,7 c L15 17,5 C

Médias na mesma coluna seguidas da mesma letra não diferem

entre si a 1% de probabilidade de erro. Médias seguidas de

letras diferentes diferem entre si a 1% de probabilidade (teste

Scott-Knott)

Avaliação da utilização do glifosato como fonte de carbono e fósforo

Para avaliação da utilização do glifosato como fonte de carbono e fósforo pelas bactérias foi selecionado um isolado de cada grupo reunido na análise de Scott-Knott (L14, L9 e L5). Cultivou-se cada uma em meio contendo glicose como fonte de carbono e KH2PO4 como fonte de fósforo, sem acréscimo de glifosato para o controle positivo (Figura 1); meio de cultura onde a única fonte de fósforo era o glifosato (Figura 2); meio de cultura no qual a única fonte de carbono era o glifosato (Figura 3) e meio sem glicose, KH2PO4 e glifosato como controle negativo.

Figura 1. Crescimento dos isolados L5, L9 e L14 no meio para controle positivo em 28, 52 e 76h de incubação e médias correspondentes de UFC/mL

Figura 2. Verificação do crescimento dos isolados L5, L9 e L14 incubados em 28, 52 e 76h e médias correspondentes de UFC/mL no meio com glifosato como única fonte de fósforo

Figura 3. Verificação do crescimento dos isolados L5, L9 e L14 incubados em 28, 52 e 76h e médias correspondentes de UFC/mL no meio com glifosato como única fonte de carbono

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Nas primeiras 28h de crescimento os três isolados tiveram um comportamento semelhante. O melhor tempo de crescimento verificado para as bactérias L5 e L14 foi de 52 horas e para o isolado L9 observou-se que em 76h o microrganismo ainda apresentava crescimento. Nos ensaios no qual se utilizou o glifosato como fonte de fósforo ou carbono, a concentração do composto utilizada foi de 7,2 mg/mL, sendo essa a concentração que permite que as bactérias metabolizem o glifosato sem inibição do crescimento (Moneke et al., 2010). Na verificação do crescimento e metabolismo dos três isolados com o glifosato como fonte de fósforo, pode-se observar que todos apresentaram um crescimento mais acentuado em comparação ao controle positivo, destacando-se o isolado L5 que apresentou o maior crescimento entre os isolados em 52h. Cabe mencionar ainda, que o isolado L14 manteve seu metabolismo ativo até a última verificação que ocorreu em 76h de incubação (Figura 2). Esse menor crescimento das bactérias no meio usado como controle positivo pode ser devido à quantidade de glicose utilizada (1 g/L) ser menor que a quantidade de glifosato em termos de átomos de carbono.

A alta capacidade desses organismos em utilizar glifosato in vitro pode ser atribuída ao contato prévio com o herbicida no solo de onde foram isolados. Martínez-Nieto et al. (2012) avaliaram a tolerância e degradação do glifosato por bactérias isoladas do solo com aplicações frequentes de Roundup SL® e constataram que bactérias do gênero Pseudomonas, Burkholderia e Flavimonas cresceram em meio contendo glifosato como única fonte de carbono. Nos estudos de Moneke et al. (2010) as bactérias isoladas utilizaram glifosato como fonte de fósforo e carbono, mas preferencialmente como fonte de fósforo.

Em nosso estudo, pode-se observar que os três isolados utilizaram glifosato como fonte de fósforo e carbono, mas o isolado L5 utilizou-o preferencialmente como fonte de fósforo e o isolado L14 como fonte de carbono. Destaca-se ainda, o comportamento do isolado L14, o qual nesse estudo utilizou melhor o glifosato como fonte de carbono e fósforo que a glicose e KH2PO4, fontes mais facilmente assimiláveis. Este fato pode ser observado pelo maior crescimento no decorrer das horas de incubação em comparação ao controle positivo, não havendo declínio do seu crescimento até 72h, significando que este isolado continua metabolizando o glifosato ainda presente no meio.

Conclusões

1. Foi possível observar que o isolado L14

(Burkholderia gladioli) foi o que melhor metabolizou o herbicida em ambas as situações, pois nos dois meios de cultura utilizados (glifosato como fonte de carbono e

fósforo) ele apresentou um crescimento contínuo até 76h de incubação.

2. As bactérias do gênero Burkholderia foram as predominantes neste estudo e capazes de crescer em meio de cultivo com a presença do glifosato, a partir do isolamento do solo analisado.

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