Bioprospecção de actinobactérias associadas à esponja marinha ...
Isolamento e atividade antibiótica de Actinobactérias de solo do semi-árido do Nordeste/Brasil
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Isolamento e atividade Isolamento e atividade antibiótica de Actinobactérias antibiótica de Actinobactérias de solo do semi-árido do de solo do semi-árido do Nordeste/Brasil Nordeste/Brasil Thaís Mota de Mendonça Thaís Mota de Mendonça 1 , Diego Vieira da Costa , Diego Vieira da Costa 1 , Ludhimilla Suelen Gomes Lins , Ludhimilla Suelen Gomes Lins 2 , Glícia Maria Torres Calazans , Glícia Maria Torres Calazans 1 , , 1Universidade Federal de Pernambuco – Departamento de Antibióticos 1Universidade Federal de Pernambuco – Departamento de Antibióticos 50.670-901 - Recife – PE – E-mail: [email protected] 50.670-901 - Recife – PE – E-mail: [email protected] 2Faculdade dos Guararapes- CEP 54400-160 Jaboatão dos Guararapes - PE 2Faculdade dos Guararapes- CEP 54400-160 Jaboatão dos Guararapes - PE Introdução As actinobactérias vem sendo cada vez mais exploradas, com o desenvolvimento da biotecnologia, por serem descritas como os principais microrganismos produtores de antibióticos. Estas bactérias são distribuídas em vários nichos ecológicos, sendo encontradas principalmente no solo. A ampla distribuição das actinobactérias na natureza, ocorre devido à sua resistência na ausência de nutrientes no ambiente e da dispersão efetiva de seus esporos ( Zvyagintesev et al., 1996). Nesse trabalho foram isoladas 14 linhagens de actinobactérias oriundas de amostras do solo da região do semi-árido do Nordeste as quais foram submetidas a testes de atividade antibiótica. Na avaliação utilizou-se um método qualitativo no qual blocos de gelose das actinobactérias foram usadas contra microrganismos-teste com o objetivo de se verificar a capacidade de inibição de fungos e outras bactérias. Materiais e Métodos Para o isolamento da população microbiana, o solo sofreu diluição decimal em série, na proporção 1:10, até 10 -5 . Foram utilizadas duas técnicas: “pour plate” (incorporação de alíquotas ao meio) e spread plate (espalhamento na superfície em placa) com as diluições da ordem de 10 -3 e 10 -5 . Os meios de cultura foram o ISP-2 (International Streptomyces Project), Czapeck e CAA (Ágar-Caseína-Amido). A cada um dos meios foi incorporado nistatina (50mg/litro) com o objetivo de inibir fungos indesejáveis. As cepas de actinobactérias após 7 dias de incubação a 30°C foram identificadas macroscopicamente e isoladas em seus respectivos meios de origem. Para as observações micromorfológicas foi utilizada a metodologia descrita por Shrling e Gottilieb (1966), na qual se pode visualizar ao microscópio ótico o crescimento do micélio aéreo. Foram selecionadas quatorze actinobactérias para teste de atividade baseando-se na diversidade de pigmentação apresentada assim como forma e presença de micélio aéreo e vegetativo. A atividade antimicrobiana foi realizada utilizando-se um método qualitativo que fez uso de blocos de gelose das actinobactérias contra o microrganismo-teste, com o objetivo de se verificar a capacidade de inibição das mesmas sobre o crescimento de fungos e de bactérias. Os microrganismos- teste utilizados foram: Staphylococcus aureus (UFPEDA 02), Bacillus subtilis (UFPEDA 86), Escherichia coli (UFPEDA 224), Mycobacterium smegmatis (UFPEDA 71), Enterococcus faecalis (UFPEDA 138), Candida albicans (UFPEDA 1007). Resultados As actinobactérias isoladas mostraram variadas exigências nutricionais e de crescimento, assim como, em sua maioria, micélio aéreo e vegetativo com diversidade de pigmentações. As características morfológicas tais como: ramificação do micélio sobre o substrato, formação de micélio aéreo e sua fragmentação ou produção de esporos foram fatores que auxiliaram na identificação. As observações ao microscópio óptico demonstraram em sua maioria pertencerem ao gênero Streptomyces. Na avaliação da atividade antimicrobiana pode-se verificar a capacidade inibitória das actinobactérias sobre fungos e outras bactérias. Conclusões O presente estudo obteve resultado satisfatório, uma vez que o solo em questão, por ser muito árido, era considerado pouco favorável ao desenvolvimento de determinados microrganismos. Os testes demonstraram que as actinobactérias isoladas são capazes de produzir metabólitos de interesse biotecnológico, podendo ser utilizadas no desenvolvimento de substâncias antibióticas contra fungos e bactérias. Com base nos resultados das observações macro e micromorfológicas deduziu-se que os isolados pertenciam ao gênero Streptomyces. No entanto, necessita-se confirmação dos espécimes isolados, podendo isso ser feito, através de estudo quimiotaxonômico das paredes das linhagens, para confirmação dos gêneros. Referências Bibliográficas 1.Araújo, J.M.; Calazans G.M.T.; Melo, I. S. “Importância de actinobactérias para a agricultura”, Microrganismos e agrobiodiversidade. p. 273–292 (2008). 2.Bergey’s Manual of Sistematic Bacteriology, Williams, S.T.; Holt J. G. v.4, 1989. 3.Theilleux, J. Los actinomicetos In: Leveau, J.Y.; Bouix, M. Microbiologia Industrial. Zaragoza : Acribia. 2000. p. 418-471. 4.Castillo, U.F. et al, Kakadumycins, novel antibiotics from Streptomyces sp. NRRL 30566, an endophyte of Grevillea pteridifolia. FEMS Microbiology Letters, v. 224, p. 183-190, 2003. . Microrganismo- Teste Act.1 Act.2 Act.3 Act.4 Act.5 Act.6 Act.7 Act.8 Act.9 Act.10 Act.11 Act.12 Act.13 Act.15 Staphylococcus aureus (Gram +) ___ ___ ___ ___ 14 ___ 12 10 9 ___ ___ ___ ___ ___ Bacillus subtilis (Gram +) ___ 12 13 ___ 13 ___ ___ 12 13 3 ___ ___ 6 ___ Enterococcus faecalis (Gram +) ___ 8 ___ ___ ___ ___ 5 1 ___ ___ ___ ___ ___ ___ Escherichia coli (Gram -) ___ ___ 12 ___ ___ ___ 6 6 8 ___ ___ ___ 8 ___ Mycobacterium smegmatis (AAR) ___ 20 20 9 35 14 15 30 24 13 ___ ___ ___ ___ Candida albicans (Levedura) ___ ___ 19 ___ ___ ___ ___ 6 ___ ___ ___ ___ 5 ___ Somente as linhagens 1, 11, 12 e 15 não apresentaram atividade sobre nenhum dos microrganismos-teste, sendo as outras actinobactérias consideradas ativas, por apresentarem halos de inibição. Destaca-se a linhagem 8 que apresentou um amplo espectro de atividade inibindo todos representantes de diferentes grupos microbianos testados, a citar: Gram+ (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis) Gram- (Escherichia coli), Álcool- Ácido-Resistente (Mycobacterium smegmatis) e levedura (Candida albicans). Além da linhagem 5 que produziu um halo contra o Mycobacterium smegmatis de diâmetro considerável (35mm). Tabela 1: Teste de atividade das actinobactérias utilizando a técnica dos blocos de gelose. Diâmetro do disco: 5mm; Valores numéricos correspondem aos halos de inibição expressos em mm. --- Não apresentou halo de inibição, AAR – Álcool Ácido Resistente, Act. = Actinobactéria
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Isolamento e atividade antibiótica de Isolamento e atividade antibiótica de Actinobactérias de solo do semi-árido do Actinobactérias de solo do semi-árido do
Nordeste/BrasilNordeste/BrasilThaís Mota de Mendonça Thaís Mota de Mendonça 11, Diego Vieira da Costa , Diego Vieira da Costa 11, Ludhimilla Suelen Gomes Lins, Ludhimilla Suelen Gomes Lins22, Glícia Maria Torres Calazans, Glícia Maria Torres Calazans11,,
1Universidade Federal de Pernambuco – Departamento de Antibióticos1Universidade Federal de Pernambuco – Departamento de Antibióticos50.670-901 - Recife – PE – E-mail: [email protected] - Recife – PE – E-mail: [email protected]
2Faculdade dos Guararapes- CEP 54400-160 Jaboatão dos Guararapes - PE2Faculdade dos Guararapes- CEP 54400-160 Jaboatão dos Guararapes - PE
IntroduçãoAs actinobactérias vem sendo cada vez mais exploradas, com o desenvolvimento da biotecnologia, por serem descritas como os principais
microrganismos produtores de antibióticos. Estas bactérias são distribuídas em vários nichos ecológicos, sendo encontradas principalmente no solo. A ampla distribuição das actinobactérias na natureza, ocorre devido à sua resistência na ausência de nutrientes no ambiente e da dispersão efetiva de seus esporos ( Zvyagintesev et al., 1996). Nesse trabalho foram isoladas 14 linhagens de actinobactérias oriundas de amostras do solo da região do semi-árido do Nordeste as quais foram submetidas a testes de atividade antibiótica. Na avaliação utilizou-se um método qualitativo no qual blocos de gelose das actinobactérias foram usadas contra microrganismos-teste com o objetivo de se verificar a capacidade de inibição de fungos e outras bactérias.
Materiais e MétodosPara o isolamento da população microbiana, o solo sofreu diluição decimal em série, na proporção 1:10, até 10 -5. Foram utilizadas duas técnicas:
“pour plate” (incorporação de alíquotas ao meio) e spread plate (espalhamento na superfície em placa) com as diluições da ordem de 10 -3 e 10-5. Os meios de cultura foram o ISP-2 (International Streptomyces Project), Czapeck e CAA (Ágar-Caseína-Amido). A cada um dos meios foi incorporado nistatina (50mg/litro) com o objetivo de inibir fungos indesejáveis. As cepas de actinobactérias após 7 dias de incubação a 30°C foram identificadas macroscopicamente e isoladas em seus respectivos meios de origem. Para as observações micromorfológicas foi utilizada a metodologia descrita por Shrling e Gottilieb (1966), na qual se pode visualizar ao microscópio ótico o crescimento do micélio aéreo. Foram selecionadas quatorze actinobactérias para teste de atividade baseando-se na diversidade de pigmentação apresentada assim como forma e presença de micélio aéreo e vegetativo. A atividade antimicrobiana foi realizada utilizando-se um método qualitativo que fez uso de blocos de gelose das actinobactérias contra o microrganismo-teste, com o objetivo de se verificar a capacidade de inibição das mesmas sobre o crescimento de fungos e de bactérias. Os microrganismos-teste utilizados foram: Staphylococcus aureus (UFPEDA 02), Bacillus subtilis (UFPEDA 86), Escherichia coli (UFPEDA 224), Mycobacterium smegmatis (UFPEDA 71), Enterococcus faecalis (UFPEDA 138), Candida albicans (UFPEDA 1007).
ResultadosAs actinobactérias isoladas mostraram variadas exigências nutricionais e de crescimento, assim como, em sua maioria, micélio aéreo e vegetativo
com diversidade de pigmentações. As características morfológicas tais como: ramificação do micélio sobre o substrato, formação de micélio aéreo e sua fragmentação ou produção de esporos foram fatores que auxiliaram na identificação. As observações ao microscópio óptico demonstraram em sua maioria pertencerem ao gênero Streptomyces.
Na avaliação da atividade antimicrobiana pode-se verificar a capacidade inibitória das actinobactérias sobre fungos e outras bactérias.
ConclusõesO presente estudo obteve resultado satisfatório, uma vez que o solo em questão, por ser muito árido, era considerado pouco favorável ao
desenvolvimento de determinados microrganismos. Os testes demonstraram que as actinobactérias isoladas são capazes de produzir metabólitos de interesse biotecnológico, podendo ser utilizadas no desenvolvimento de substâncias antibióticas contra fungos e bactérias. Com base nos resultados das observações macro e micromorfológicas deduziu-se que os isolados pertenciam ao gênero Streptomyces. No entanto, necessita-se confirmação dos espécimes isolados, podendo isso ser feito, através de estudo quimiotaxonômico das paredes das linhagens, para confirmação dos gêneros.
Referências Bibliográficas
1.Araújo, J.M.; Calazans G.M.T.; Melo, I. S. “Importância de actinobactérias para a agricultura”, Microrganismos e agrobiodiversidade. p. 273–292 (2008).
2.Bergey’s Manual of Sistematic Bacteriology, Williams, S.T.; Holt J. G. v.4, 1989.3.Theilleux, J. Los actinomicetos In: Leveau, J.Y.; Bouix, M. Microbiologia Industrial. Zaragoza : Acribia. 2000. p. 418-471.4.Castillo, U.F. et al, Kakadumycins, novel antibiotics from Streptomyces sp. NRRL 30566, an endophyte of Grevillea pteridifolia. FEMS
Microbiology Letters, v. 224, p. 183-190, 2003.
AGRADECIMENTOSA Universidade Federal de Pernambuco e ao Departamento de Antibióticos/UFPE.
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Microrganismo-Teste Act.1 Act.2 Act.3 Act.4 Act.5 Act.6 Act.7 Act.8 Act.9 Act.10 Act.11 Act.12 Act.13 Act.15
Staphylococcus aureus(Gram +)
___ ___ ___ ___ 14 ___ 12 10 9 ___ ___ ___ ___ ___
Bacillus subtilis(Gram +)
___ 12 13 ___ 13 ___ ___ 12 13 3 ___ ___ 6 ___
Enterococcus faecalis(Gram +)
___ 8 ___ ___ ___ ___ 5 1 ___ ___ ___ ___ ___ ___
Escherichia coli(Gram -)
___ ___ 12 ___ ___ ___ 6 6 8 ___ ___ ___ 8 ___
Mycobacterium smegmatis
(AAR)___ 20 20 9 35 14 15 30 24 13 ___ ___ ___ ___
Candida albicans(Levedura)
___ ___ 19 ___ ___ ___ ___ 6 ___ ___ ___ ___ 5 ___
Somente as linhagens 1, 11, 12 e 15 não apresentaram atividade sobre nenhum dos microrganismos-teste, sendo as outras actinobactérias consideradas ativas, por apresentarem halos de inibição. Destaca-se a linhagem 8 que apresentou um amplo espectro de atividade inibindo todos representantes de diferentes grupos microbianos testados, a citar: Gram+ (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis) Gram- (Escherichia coli), Álcool-Ácido-Resistente (Mycobacterium smegmatis) e levedura (Candida albicans). Além da linhagem 5 que produziu um halo contra o Mycobacterium smegmatis de diâmetro considerável (35mm).
Tabela 1: Teste de atividade das actinobactérias utilizando a técnica dos blocos de gelose. Diâmetro do disco: 5mm; Valores numéricos correspondem aos halos de inibição expressos em mm. --- Não apresentou halo de inibição, AAR – Álcool Ácido Resistente, Act. = Actinobactéria
