Identificação e Diversidade Genética de Populações

de Helicoverpa armigera do Brasil

Universidade Estadual de CampinasCentro de Biologia Molecular e Engenharia Genética

Rogério Martins Gonçalves

Mestrando em Genética e Biologia Molecular

rogerio.goncalves@cbmeg.unicamp.br

Sumário

1. Introdução– Crise Fitossanitária

– Identificação Morfológica de Helicoverpa armigera

– Novas incursões da praga no Brasil

– DNA barcoding

2. Material e Métodos– Extração de DNA Total

– Amplificação por PCR

– Purificação e Sequenciamento

3. Resultados– DNA barcodes

– Análises Filogenéticas

– Rede de Haplótipos baseada no gene COI

– Diversidade Genética e Distribuição dos Haplótipos no Brasil

– Rede de Haplótipos baseada no gene Cyt b

4. Conclusões

1. Introdução

1. H. armigera x Crise Fitossanitária

• Praga de importância econômica no mundo:

- Mundo: custos anuais (controle + perda na produção) ~US$ 5 bilhões (Lammers & MacLeod, 2007).

- China (1992): perdas de US$ 1.3 bilhões na cultura do algodão, Norte da China (Sheng, 1993).

- India + China: 50% dos pesticidas usados para controlar H. armigera (Lammers & MacLeod, 2007).

- USA: 4.431 interceptações de H. armigera + Helicoverpa spp. desde 1985 em frutas, legumes e

plantas ornamentais (Venette et al., 2003).

- USA: 1.400 interceptações nos portos entre 2.000 e 2.004 (Passoa, 2004).

(Pogue, 2004)

1.2. Identificação Morfológica

1.3. Novas incursões da praga

Centro de Biologia Molecular eEngenharia GenéticaLaboratório de Genética e Evolução Animal

(Caterino et al. 2000; Hebert et al. 2003)

Sistema de identificação de espéciesempregando um segmento curto padronizadodo genoma (Hebert et al., 2003).

DNA barcoding

1. CATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATCGAATAAACTGGGTGGGTTGTTGCTGTCCCTCTCGGGGGAACTGTGCACGCCTTACCTTTTTTGTTTTTCCA………….. Helicoverpa assulta

2. CATTATTGAATAAACTTGGTTAGGTTGCTGCTGGCTCCTTGGAGCATGTGCACACCTAGCACCNTTTTTACCACCTGTGCACCCTTTGTAGACCTGGATACCTCTCGAGGAAACTCGGTTTGAGGACTTTTTTCCA………….. Helicoverpa armigera

OU

1. …………………………………..…………………………………………………… Helicoverpa assulta2. ….…………………………………………………………………………………... Helicoverpa armigera

Detection and Genetic Diversity of a Heliothine Invader from Northand Northeast of Brazil (Mastrangelo et al., 2014, no prelo)

Journal of Economic Entomology

2. Material e Métodos

2.1 Extração de DNA Total

Método Fenol:Clorofórmio (Lyra et al. , 2009)133 amostras de 7 Estados (RO = 15; PI = 39 ;BA = 13; SP = 38; RR = 14 ; MT = 7; TO = 7)

2.1 Extração de DNA Total

Ressuspendidos em 100 µL de TE buffer Armazenados a -80 ºC

2.2 Amplificação por PCR

2.2 Amplificação por PCR

• Primers:

- COIF e COIR (Li et al., 2011)

- Cytb-F02 e Cytb-R02 (Behere et al., 2008)

• Mix para PCR:- 25 ng de DNA total

- 2,5 mM de MgCl2

- 0,25 mg/mL de BSA

- 100 µM de dNTPs

- 0,5 mM de cada primer (direto

e reverso)

- 1,5 U de TaqDNA polymerase

- 10 x TaqBuffer

- Volume final: 25 µL

GeneAmp®PCR System9700 thermal cycler

Condições94oC 3’

94oC 30”

35 Ciclos45 oC – COI

50 oC – Cyt b 30”

70 oC – COI72 oC – Cyt b

90”60”

70 oC – COI72 oC – Cyt b

7’10’

10oC forever

2 µL

Gel agarose 1% em 1 x TAE

2.3 Purificação e Sequenciamento

IllustraTMGFXTM kitABI3730xl DNA Analyzer sequencer

http://www.boldsystems.org/

http://blast.ncbi.nlm.nih.govBasic Local Alignment Search Tool

3. Resultados

3.1 DNA barcodes DNASP.V5 software

(Mastrangelo et al., 2014, no prelo)

3.2 Análises Filogenéticas – COI (658 pb)

3.3 Rede de Haplótipos – 150 sequências COIsoftware TCS versão 1.21

(Li et al., 2011)

17 sequências de Li et al., (2011) + 133sequências brasileiras = 23 haplótipos

3.4 Diversidade Genética das Populações e Distribuição dos Haplótipos – COI

‒ 11 haplótipos

‒ Alta diversidade de haplótipo (Ĥ) e baixadiversidade nucleotídica (π)

‒ Sem estrutura genética.

‒ Fluxo Gênico

Grande Capacidade de Dispersão

- Barreiras como o deserto do Sahara não impediram a migração

à longa distância de H. armigera (Nibouche et al., 1998).

• Esse padrão de variação genética é comum em

pragas capazes de se dispersar por longas

distâncias, como H. armigera (Daly & Gregg, 1985;

Zhou et al., 2000; Endersby et al., 2007) .

- Experimentos de marcação e recaptura

Mariposas de H. armigera podem voar 200-

300 km em uma única noite (Armes & Cooter,

1991).

(Pedgley, 1985)

3. Compatibilidade Reprodutiva entre H. armigera e H. zea

• Genes mitocondriais são informativos apenas quanto à herança maternal.

- Os 133 espécimes podem pertencer à linhagem original introduzida ou um híbrido

proveniente do cruzamento entre uma fêmea de H. armigera e um macho de H. zea.

-Nucleares: EF-1α, IDH, RpS5 (Wahlberg & Wheat, 2008).

Próximas etapas

(Pogue, 2004)

1.2. Identificação Morfológica

Cooperação Internacional

Austrália, China, Índia, Paquistão, Burkina Faso, UgandaUSA + Brasil

6 indivíduos de Mato Grosso

H. armigera

H. zea

26 haplótipos de Tay et al., (2013) + 38amostras do Brasil (RO, RR, MT, PI, BA e SP)

3.3 Rede de Haplótipos – sequências Cyt b

software TCS versão 1.21

4. Conclusões

1) Há fortes evidências genéticas de que as lagartas e adultos analisados dos sete

Estados brasileiros são Helicoverpa armigera.

2) Estudos combinando mtDNA e novos marcadores nucleares com linhagens puras e

híbridos de H. armigera e H. zea são necessários para a elaboração de protocolos de

identificação para essas duas espécies.

3) Sistemas de identificação baseados em mtDNA tem sido eficientes no diagnóstico e

análises geográficas complementando os dados morfológicos.

4) Há evidência de fluxo gênico entre as populações do Brasil.

Muito Obrigado !

rogerio.goncalves@cbmeg.unicamp.br