JULIANA DE MAGALHÃES BANDEIRA

JULIANA DE MAGALHÃES BANDEIRA

Compatibilidade reprodutiva e micropropagação de ameixeiras japonesas

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências: Fruticultura de Clima Temperado.

Orientador: Valmor João Bianchi Co-Orientador: José Antonio Peters

Co-Orientador: Maria do Carmo Bassols Raseira

Pelotas/RS, 2010

Dados de catalogação na fonte:

(Marlene Cravo Castillo – CRB-10/744)

B214c Bandeira, Juliana de Magalhães

Compatibilidade reprodutiva e micropropagação de ameixeiras

japonesas/Juliana de Magalhães Bandeira; orientador Valmor João

Bianchi; co-orientadores José Antonio Peters e Maria do Carmo

Bassols Raseira. - Pelotas, 2010. -120f.; il..- Tese (Doutorado) –

Programa de Pós-Graduação em Agronomia. Faculdade de Agro-

nomia Eliseu Maciel. Universidade Federal de Pelotas. Pelotas,

2010.

1. Prunus salicina 2. Cultivo in vitro 3.Polinização controla-

da I Bianchi, Valmor João (orientador) II. Título.

CDD 634.22

Banca examinadora:

__________________________ __________________________

Dr. Elizete Beatriz Radmann Dr. Leonardo Ferreira Dutra

Universidade Federal de Pelotas Embrapa Clima Temperado

__________________________ __________________________

Dr. Márcia Wulff Schuch Dr. Paulo Vitor Dutra de Souza

Universidade Federal de Pelotas Universidade Federal do Rio Grande do Sul

__________________________

Valmor João Bianchi

Orientador

Aos meus pais, Celso e Ieda,

Aos meus irmãos, Rafael, Carolina, Letícia e Felipe

Dedico.

Ao meu namorado, Sérgio Renato

Ofereço.

Agradecimentos

Em primeiro lugar, agradeço a minha família pelo apoio, incentivo e

compreensão em todos os momentos da minha vida;

A minha avó Ieda de Magalhães por ser o alicerce de uma família tão

grande quanto a nossa, mantendo-nos unidos, sempre com o espírito alegre e

batalhador, servindo de exemplo a todos nós;

A todos os meus familiares pelo apoio, educação, base familiar e

valores morais, através dos quais pude formar meu caráter. Agradeço, em

especial, aos meus pais Celso e Ieda, e irmãos (Rafael, Carolina, Letícia e

Felipe) por sempre terem acreditado em mim, me incentivando e vibrando a

cada conquista. Aos meus tios Ariano Martins de Magalhães Jr. e Airton José

Rombaldi pelo apoio, incentivo e acima de tudo por serem pessoas

maravilhosas, grandes pesquisadores e ótimos exemplos a serem seguidos;

Ao meu namorado Sérgio Renato pelo companheirismo, apoio, garra,

incentivo, compreensão, se fazendo presente durante todas as etapas desta

caminhada;

À Universidade Federal de Pelotas (UFPel) pela oportunidade de

realizar o curso de Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração em

Fruticultura de Clima Temperado, em especial ao Departamento de Botânica e à

Embrapa Clima Temperado pela oportunidade e disponibilização de suas

dependências físicas para o desenvolvimento deste trabalho;

Ao Prof Dr. Valmor João Bianchi pela imprescindível orientação,

profissionalismo, colaboração, incentivo, auxílio e amizade, assim como aos

professores co-orientadores Dr. José Antônio Peters e Drª. Maria do Carmo

Bassols Raseira, por sua especial atenção, confiança, dedicação e

ensinamentos durante a realização do curso;

À Profª. Drª. Eugênia Jacira Bolacel Braga e ao Prof. Dr. Marcos Antonio

Bacarin pela colaboração, apoio, incentivo, disposição e amizade;

Aos demais professores e pesquisadores do curso de Pós-Graduação

em Agronomia, concentração em Fruticultura de Clima Temperado que fizeram

parte do meu crescimento profissional, Andrea de Rossi Rufato, Caroline

Marques Castro, Flávio Herter, Márcia Wulff Schuch e José Carlos Fachinello

devido ao profissionalismo e ensinamentos transmitidos, imprescindíveis à

realização do curso de doutorado;

Aos colegas e amigos do Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas

pelo apoio e incentivo. Em especial à Carina da Silva, Daiane Benneman,

Elizete Radmann, Ilda da Silva, Isabel Rodrigues, Letícia Benitez, Letícia

Barbosa, Luciane Arantes, Luciana Nogueira, Luis Willian Arge, Márcia Ribeiro,

Monalize Mota, Rodrigo Danielowski e Simone Wendt, os quais tornaram este

período muito mais prazeroso e agradeço em especial, à bolsista Liane Bahr

Thurow pela dedicação, apoio, amizade e incansável ajuda;

Aos funcionários, pesquisadores, colegas e estagiários, mas, sobretudo

amigos, do Laboratório de Melhoramento Genético Vegetal, da Embrapa Clima

Temperado, Gisely Correia, Daiana Finkenauer, Diego Borges Duarte, Everton

Pederzol, José Martins Pereira, Luciane Leitzk, Maicon Bonemann, Maria de

Fátima Tavares da Silveira, Marcelo Couto, Patrícia Einhardt, Rodrigo Franzon e

Tiago da Silveira, por terem me recebido gentilmente na Embrapa, pelo apoio,

dedicação e amizade;

Aos demais colegas e amigos do curso de Pós-Graduação em

Agronomia pelo apoio, dedicação e cooperativismo André de Souza, Andressa

Comiotto, Cari Timm; Cláudia Lima, Doralice Fischer, Evandro Schneider,

Fernanda Azevedo, Fernando Hawerroth, Ivan Pereira, Juliano Shimitz, Mateus

Pasa, Poliana Francescatto, Luciano Picolotto, Simone Galarca, Thaís

Cappellaro, Tânia Pelizza e Zeni Tomaz, por mais breve que tenha sido o nosso

convívio, valeu a pena cada momento;

Aos meus amigos que muitas vezes sem entender as preocupações que

me acercavam, sempre estiveram presentes me auxiliando, apoiando e vibrando

a cada conquista, amenizando os percalços desta caminhada;

E é claro, a todos que de alguma forma contribuíram para realização

deste trabalho e do meu crescimento profissional.

Saibam que eu carrego comigo um

pouquinho de cada um de vocês.

Muito obrigada a todos!

“... Porque se a estrada me cobra, pago seu preço

E desabrigo o caminho pra o meu sustento

Mesmo que o mundo desabe num tempo feio

Sei o que as asas do poncho trazem por dentro...”

Gujo Teixeira E Luiz Marenco

“... Carrego nas costas meu mundo

E junto umas coisas que me fazem bem

Fazendo da minha janela

Imenso horizonte, como me convém ...”

Luiz Marenco

“A vida é curta,

A arte é longa,

A oportunidade fugaz,

A experiência falaciosa,

O julgamento difícil.”

Hipócrates

Resumo Geral

BANDEIRA, Juliana de Magalhães. Compatibilidade reprodutiva e micropropagação de ameixeiras japonesas. 2010. 120f. Tese (Doutorado) – Programa de Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração em Fruticultura de Clima Temperado. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas/RS.

A ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.) tem papel de destaque na fruticultura mundial. Possui grande importância no mercado brasileiro e vem ganhando adeptos à sua produção, principalmente no Rio Grande do Sul e Santa Catarina onde as condições de inverno favorecem o seu cultivo. Porém, existem alguns problemas enfrentados pelos produtores e melhoristas que limitam o aumento da produção nacional de ameixeiras, entre esses, destacam-se a autoincompatibilidade gametofítica, devido à presença de um loco multialélico (contendo os denominados alelos-S) e a suscetibilidade à Xillela fastidiosa Wells, que afeta a qualidade do material propagativo. Frente a esses problemas, o objetivo da realização deste trabalho foi identificar fisiologicamente os alelos-S de seis cultivares de ameixeira japonesa e desenvolver um protocolo de micropropagação para a cv. América. Desta forma, foram realizados experimentos de polinização controlada nos campos experimentais da Embrapa Clima Temperado (Pelotas/RS) e polinização in vivo, em laboratório, de seis cultivares copa de ameixeira japonesa (América, Rosa Mineira, Pluma 7, Amarelinha, Reubennel e Santa Rosa), onde foram avaliados a frutificação efetiva e o crescimento do tubo polínico (CTP), respectivamente. Também foram realizados experimentos no Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas (UFPel/RS), visando identificar um protocolo adequado para a micropropagação da cv. América. Nos estudos de compatibilidade reprodutiva, a frutificação efetiva foi muito baixa para todos os cruzamentos, sendo observado maior valor na autopolinização da ‘Reubennel’ (8,41%). ‘América’ somente apresentou frutificação quando polinizada com as cvs. Rosa Mineira, Amarelinha, Santa Rosa e Reubennel, sendo que essa última apresentou compatibilidade mútua com a cv. América. ‘Amarelinha’ e ‘Rosa Mineira’ mostraram-se compatíveis com o pólen da ‘Rosa Mineira’ e ‘Reubennel’. Houve interação significativa para o grau de CTP e o pólen utilizado para polinizar cada um dos genitores femininos, sendo que os cruzamentos entre ‘América’ x ‘Pluma 7’ e ‘Rosa Mineira’ x ‘Santa Rosa’ foram incompatíveis enquanto que a cv. América apresentou-se autoincompatível. Alguns cruzamentos que não apresentaram polinização e frutificação no campo, atingiram o óvulo (grau 6) ou o ovário (grau 5) durante a polinização in vivo, tais como ‘Reubennel’ x ‘Rosa Mineira’;

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‘Rosa Mineira’ e ‘Amarelinha’ x ‘América’ e ‘Amarelinha’ e ‘Pluma 7’, e ‘Santa Rosa’ x ‘América’. Estes resultados, juntamente com os dados moleculares dos alelos-S, permitem um melhor entendimento a respeito da biologia reprodutiva de P. salicina.

Nos experimentos de micropropagação verificou-se que o estabelecimento in vitro de explantes basais da cv. América em meio MS, é superior ao de explantes apicais. Concentrações de BAP entre 0,25 e 0,50mg dm-3 são mais adequadas para sua multiplicação enquanto que o meio MS suplementado com 1,0mg dm-3 de AG3 e 2,0g dm-3 de carvão vegetal é o mais adequado para o alongamento in vitro de suas brotações. A metade da concentração dos sais e vitaminas do meio MS com a adição de 1,0mg dm-3 de AIB é o mais eficiente para o enraizamento in vitro de brotações de ameixeira japonesa, cv. América, por períodos inferiores a 20 dias, atingindo 88% de sobrevivência após 30 dias de aclimatização.

Palavras-Chave: Prunus salicina. Cultivo in vitro. Polinização controlada.

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General Abstract

BANDEIRA, Juliana de Magalhães. Reproductive compatibility and micropropagation of Japanese plum. 2010. 120p. Tese (Doutorado) – Programa de Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração em Fruticultura de Clima Temperado. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas/RS.

The Japanese plum (Prunus salicina Lindl.) has an important role in the horticulture worldwide. It has great importance in Brazilian market and is gaining fans for its production, especially in Rio Grande do Sul and Santa Catarina where winter conditions are propicious to its cultivation. However, there are some problems faced by farmers and breeders, which limit the increase in domestic production of plum trees, among these, there are the gametophytic self-incompatibility, due to the presence of a codominant multi-site (containing the so-called S-alleles) and susceptibility to Xillela fastidiosa Wells, which affects quality of propagation material. In face of these problems, the objective of this work was to identify physiologically S-alleles of six cultivars of Japanese plum and develop a micropropagation protocol for the cv. America. Thus, experiments of controlled pollination were carried out in experimental fields at Embrapa Clima Tempreado (Pelotas/RS) and the in vivo pollination were carried out in the laboratory of six cup cultivars of Japanese plum (America, Rosa Mineira, Pluma 7, Amarelinha, Reubennel and Santa Rosa), to evaluate the fruit set and pollen tube growth (CTP), respectively. Additionaly, were also performed experiments of micropropagation in the Laboratory of Plant Tissue Culture (UFPel/RS) to identify an appropriate protocol for micropropagation of cv. America. In studies of reproductive compatibility, the fruit set was very low for all crosses, with the larger value had occur in the autopollination of 'Reubennel' (8.41%). 'America' only formed fruit when pollinated with the cvs. Rosa Mineira, Amarelinha, Santa Rosa and Reubennel, these last one had mutual compatibility with cv. America. 'Amarelinha' and 'Rosa Mineira' proved to be compatible with the pollen of 'Rosa Mineira' and 'Reubennel'. There was significant interaction for CTP level and pollen used to pollinate each female parents, and the crosses between 'America' x 'Pluma 7' and 'Rosa Mineira' x 'Santa Rosa' were incompatible while cv. America is self-incompatible. Some crosses that showed no pollination and fruiting in the field, hit the egg (level 6) or ovary (level 5) during in vivo pollination, such as 'Reubennel' x 'Rosa Mineira', 'Rosa Mineira' and 'Amarelinha' x 'America' and 'Amarelinha' and 'Pluma 7', and 'Santa Rosa' x 'America'. These results, together with the molecular data of S-alleles, allow a better understanding of the reproductive biology of P. salicina. In the micropropagation experiments we found that the in vitro establishment of basal

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explants of cv. America in MS medium is higher than the apical explants. BAP concentrations between 0.25 and 0.50mg dm-3 are more appropriate for the multiplication while MS medium supplemented with 1.0mg dm-3 GA3 and 2.0g dm-3 of vegetal charcoal is the most appropriate to in vitro elongation of their shoots. Half of concentration of salts and vitamins of MS medium with the addition of 1.0mg dm-3 of IBA is the most efficient for the in vitro rooting of Japanese plum, cv. America, during periods of less than 20 days, reaching 88% survival after 30 days of acclimatization.

Keywords: Prunus salicina. In vitro cultivation. Controlled pollination.

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Lista de Figuras

Capítulo 1 Caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva de seis cvs. copa de ameixeira japonesa

Figura 1 Percentagem de grãos de pólen germinados no estigma de

cultivares de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), nas genitoras femininas ‘América’ (a), ‘Amarelinha’ (b), ‘Reubennel’ (c), ‘Rosa Mineira’ (d), ‘Pluma 7’ (e) e ‘Santa Rosa’ (f) após 120h das polinizações controladas, realizadas in vivo e mantidas em temperatura ambiente. As barras representam o erro padrão da média. Embrapa/Pelotas/RS, 2010..............................................................................................

35 Figura 2 Desenvolvimento do tubo polínico no pistilo de flores das

cultivares de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), após 120h das polinizações controladas realizada in vivo e mantidas em temperatura ambiente (a). Germinação dos grãos de pólen na superfície estigmática (b), no estilete demonstrando o depósitos de calose (c) e interrupção do crescimento do tubo polínico no estilete (d, e), tubo polínico atingindo o ovário (grau 5) (f) e tubo polínico atingindo o óvulo (grau 6) (g). Embrapa/Pelotas/RS, 2010..........................................................

36 Figura 3 Percentagem de incidência do tubo polínico em cada etapa do

percurso estigma-óvulo de ameixeiras japonesas (Prunus salicina Lindl.), em função das polinizações controladas, realizadas in vivo, após 120h, e mantidas em temperatura ambiente nas genitoras femininas ‘América’ (a), ‘Santa Rosa’ (b), ‘Pluma 7’ (c), ‘Amarelinha’ (d), ‘Rosa Mineira’ (e) e ‘Reubennel’ (f). As barras representam o erro padrão da média. Emrapa/Pelotas/RS, 2010............................................................

38

13

Capítulo 2 Estabelecimento, multiplicação e alongamento in vitro da ameixeira japonesa, cv. América

Figura 1 Comprimento médio das brotações (cm), número médio de

folhas e de gemas formadas nos explantes de gemas apicais e basais (a) e aspecto das brotações iniciais de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, a partir de explantes apicais (b) e basais (c), após 30 dias do estabelecimento in vitro em meio MS. As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010.........................

53 Figura 2 Comprimento médio das brotações de ameixeira japonesa

(Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro, em função do tipo de regulador de crescimento (BAP e 2iP) e suas concentrações (0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0mg dm-3). As barras representam o erro padrão da média. ns* equação de regressão polinomial não significativa. UFPel, Pelotas/RS, 2010..............................................................................................

54 Figura 3 Número médio de brotos (a) e de gemas (b) por explante das

brotações de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro em função do tipo de regulador de crescimento (BAP e 2iP) e suas concentrações (0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0mg dm-3). As barras representam o erro padrão da média. ns* equação de regressão polinomial não significativa. UFPel, Pelotas/RS, 2010.........................................

55 Figura 4 Brotações de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv.

América, aos 40 dias de cultivo in vitro em meio MS acrescido de citocininas (BAP e 2iP) em diferentes concentrações (0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0mg dm-3). UFPel, Pelotas/RS, 2010..............................................................................................

56 Figura 5 Média da massa seca (mg) das brotações de ameixeira

japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro em função da adição de citocininas (BAP e 2iP) (a) e suas concentrações (0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0mg dm-3) (b). As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010.........................................................................

58 Figura 6 Comprimento médio das brotações (cm) (a); número médio de

gemas e de brotações por explante (b); média da massa seca das brotações (mg) (c); aspecto geral das brotações de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro em função dos diferentes meios de cultura. As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010.........................................................................

59

14

Figura 7 Comprimento médio das brotações (a) e aspecto das brotações (b) de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro em função da adição AG3 nas concentrações de 0; 0,25; 0,50; 0,75; 1,0mg dm-3, acrescido de 2,0mg dm-3 de carvão vegetal ativado. As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010.........................

61 Figura 8 Comprimento médio (a) e aspecto das brotação (b) de

ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro em meio MS suplementado com AG3 nas concentrações de 0; 1; 5 e 10mg dm-3 na presença ou ausência de carvão vegetal ativado. As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010................................

62 Capítulo 3 Enraizamento in vitro e aclimatização de brotações de ameixeira

japonesa cv. América Figura 1 Percentagem de enraizamento, de formação de raízes

secundárias, de primórdios radiculares e de calos (a), e número de raízes por brotação (b) de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 20 dias de cultivo in vitro no meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIA (0; 0,5 e 1,0mg dm-3). As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010.............................................................

71 Figura 2 Percentagem de sobrevivência após 20 dias de aclimatização

(a); volume (cm3) e massa seca das raízes (g) (b), e aspecto geral das plantas (c) de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, micropropagadas e enraizadas in vitro em meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIA (0; 0,5 e 1,0mg dm-3) , após 120 de aclimatização. As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010.............................................................................................

72 Figura 3 Número de raízes por brotação (a) e percentagem de

enraizamento de brotações de ameixeira japonesa (Prunus

salicina Lindl.), cv. América, aos 20 dias de cultivo in vitro no meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIB e AIA (0; 0,25; 0,50; 0,75 e 1,0mg dm-3). As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010.........................

74 Figura 4 Comprimento médio das raízes de plantas de ameixeira

japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 20 dias de cultivo in vitro no meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIB e AIA (0; 0,25; 0,50; 0,75 e 1,0mg dm-3). As barras representam o erro padrão da média. ns* equação de regressão polinomial não significativa. UFPel, Pelotas/RS, 2010.............................................................................................

75

15

Figura 5 Plantas de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, após 20 dias de cultivo in vitro no meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIB (a-e) e AIA (f-j) (0; 0,25; 0,50; 0,75 e 1,0mg dm-3). UFPel, Pelotas/RS, 2010.....

76 Figura 6 Percentagem de sobrevivência após 20 (a) e 30 (b) dias de

aclimatização de plantas de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, micropropagadas e enraizadas in vitro em meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIA (0; 0,5 e 1,0mg dm-3). UFPel, Pelotas/RS, 2010...............................

78

16

Lista de Tabelas

Capítulo 1 Caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva de seis cvs. copa de ameixeira japonesa

Tabela 1 Genótipos de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.) utilizados

para a polinização controlada e posterior caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva. Embrapa/Pelotas/RS, 2010................................................................................................

29 Tabela 2 Notas atribuídas ao grau de desenvolvimento do tubo polínico

através do pistilo das cultivares de ameixeira japonesa (Prunus

salicina Lindl.) polinizadas in vivo. Embrapa/Pelotas/RS, 2010................................................................................................

30 Tabela 3 Percentagem de frutificação efetiva dos cruzamentos

controlados, realizados a campo, nos pomares de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.) da Embrapa Clima Temperado, no ano de 2008. Embrapa/Pelotas/RS, 2010.................................

32 Capítulo 2 Estabelecimento, multiplicação e alongamento in vitro de

ameixeira japonesa, cv. América Tabela 1 Percentagem de contaminação e de oxidação dos explantes

com gemas apicais e basais de ameixeira japonesa (Prunus

salicina Lindl.), cv. América, após 30 dias do estabelecimento in vitro em meio MS. UFPel, Pelotas/RS, 2010..................................

51

17

Sumário

Resumo Geral ............................................................................................................8

General Abstract .....................................................................................................10

Lista de Figuras.......................................................................................................12

Lista de Tabelas ......................................................................................................16

Sumário....................................................................................................................17

Introdução Geral......................................................................................................19

Capítulo 1 - Caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva de seis

cvs. copa de ameixeira japonesa...........................................................................24

1.1 Introdução ......................................................................................................25

1.2 Material e Métodos.........................................................................................28

1.3 Resultados e Discussão................................................................................31

1.4 Conclusão ......................................................................................................43

Capítulo 2 - Estabelecimento, multiplicação e alongamento in vitro de

ameixeira japonesa, cv. América ...........................................................................44

2.1 Introdução ......................................................................................................45

2.2 Material e métodos ........................................................................................48

2.2.1 Experimento 1 – Estabelecimento in vitro de ameixeira japonesa cv.

América.................................................................................................................48

2.2.2 Experimento 2 – Multiplicação in vitro de ameixeira japonesa cv.

América.................................................................................................................49

2.2.3 Experimento 3 – Alongamento in vitro de brotações de ameixeira

japonesa cv. América ..........................................................................................50

2.3 Resultados e discussão................................................................................51

18


América.................................................................................................................51


América.................................................................................................................53


japonesa cv. América ..........................................................................................60

2.4 Conclusão ......................................................................................................64

Capítulo 3 - Enraizamento in vitro e aclimatização de brotações de ameixeira

japonesa cv. América..............................................................................................65

3.1 Introdução ......................................................................................................66

3.2 Material e Métodos.........................................................................................69

3.3 Resultados e Discussão................................................................................70

3.4 Conclusão ......................................................................................................79

Considerações Finais .............................................................................................80

Referências..............................................................................................................81

Apêndices ..............................................................................................................100

Apêndice A – Capítulo 1....................................................................................101

Apêndice B – Capítulo 2....................................................................................107

Apêndice C – Capítulo 3....................................................................................112

Anexos ...................................................................................................................115

Anexo A ..............................................................................................................116

Anexo B ..............................................................................................................117

Anexo C ..............................................................................................................119

Anexo D ..............................................................................................................120

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Introdução Geral

Dentre as plantas lenhosas cultivadas, as espécies frutíferas apresentam um

importante papel econômico no Brasil, pois contribuem significativamente para

manter o país como terceiro maior produtor de frutas do mundo, depois da China e

da Índia (PORTOCARRERO, 2005). Em 2007 os pomares brasileiros produziram

43.112.804 toneladas de frutas, em uma área plantada de 2.260.154ha (IBGE,

2009). Devido ao potencial de geração de emprego e renda, a fruticultura ocupa hoje

posição estratégica na expansão do agronegócio brasileiro. A base agrícola da

cadeia produtiva gera 5,6 milhões de empregos, ou seja, 27% do total da mão-de-

obra agrícola ocupada no País (PORTOCARRERO, 2005).

Dentre as frutíferas exploradas no mundo, várias espécies do gênero Prunus

(P. persica L. Bastch, P. salicina Lindl. e P. domestica L.) são largamente cultivadas por

apresentarem grande aceitação pelos consumidores e por sua rentabilidade, fatos

que têm contribuído para uma notável expansão da produção e também consumo de

frutas no Brasil. Como essas espécies são originárias de locais de clima temperado,

a adaptação ocorre de forma mais fácil nas regiões mais frias do país,

principalmente nos estados do Sul e Sudeste, como Rio Grande do Sul, Santa

Catarina, Paraná, São Paulo e Sul de Minas Gerais, que apresentam condições

edafoclimáticas favoráveis ao cultivo e graças ao uso de cultivares próprias para

microclimas dessas regiões (SEGANFREDO, 1995; BIASI, 2004).

A ameixeira pertence à família Rosaceae, subfamília Prunoidae, gênero Prunus,

que compreende mais de 20 espécies (WEINBERGER, 1975). As espécies mais

importantes são P. salicina Lindl. (ameixeira japonesa), P. domestica L. (ameixeira

européia), P. insititia Linn. (ameixeira européia) e P. cerasifera Ehrn. (ameixeira

mirabolão) (JOLY, 1993).

20

Muitos botânicos indicam a ameixeira como núcleo central de divergência do

gênero Prunus que, por sucessivas variações, originou as diferentes frutíferas da

família Rosaceae. A maioria das cultivares de interesse comercial pertence ao grupo

das ameixeiras japonesas, diplóides (2n=16), originárias do Extremo Oriente, e das

ameixeiras européias, hexaplóides (2n=48), originárias da região do Cáucaso, da

Turquia e da Pérsia (CASTRO et al., 2008a).

As cultivares de ameixeira japonesa são as mais exploradas no Brasil por

possuírem variedades com menor exigência em frio, as quais foram introduzidas

e/ou selecionadas de acordo com as condições climáticas das regiões com potencial

para sua produção. Por outro lado, as ameixeiras européias são pouco cultivadas,

devido à alta exigência em frio para a superação da dormência, no entanto,

apresentam grande importância econômica em outros países (REVERS;

MACHADO, 2005).

Em virtude das várias espécies existentes e do resultado de hibridações

ocorridas ao longo do desenvolvimento da cultura, principalmente pelo plantio de

variedades selecionadas, a ameixeira é considerada uma das frutíferas arbóreas que

mais se difundiu pelo mundo (CASTRO et al., 2008a). Entretanto, a produção

brasileira de ameixa japonesa é pequena e insuficiente para suprir a demanda do

mercado interno e destina-se, na quase totalidade, ao consumo in natura. Os frutos

prestam-se também ao aproveitamento industrial, em forma de passas, geléias,

licores e destilados. Em 2008, o país importou cerca de 18.367.942Kg de ameixas in

natura, ocupando terceiro lugar de fruta fresca mais importada, logo após a pêra e a

maçã (IBRAF, 2009). O volume médio de ameixeira comercializado no país entre

2002 e 2007, de acordo com a CEAGESP/SP, foi de 1.904,33t ano-1 (INSTITUTO

FNP, 2007).

Dentre os fatores associados à baixa produção e produtividade da maioria

das cultivares de ameixeira japonesa no Brasil encontra-se a autoincompatibilidade

reprodutiva do tipo gametofítica (GSI - gametofitic self incompatibility) (SCHIFINO-

WITTMANN; DALL’AGNOL, 2002; RASEIRA, 2003; SAPIR et al., 2004; TAKAYAMA;

ISOGAI, 2005) e a suscetibilidade à escaldadura das folhas, causada pela bactéria

Xillela fastidiosa Wells, que afeta a qualidade do material propagativo (SILVEIRA et al.,

2003), sendo que uma das principais formas de disseminação desse patógeno é por

meio da propagação de material contaminado.

21

A autoincompatibilidade reprodutiva (SI - self-incompatibility) é um dos

maiores problemas no manejo das culturas que apresentam esta característica e em

programas de melhoramento genético de várias espécies frutíferas, podendo

comprometer significativamente a frutificação efetiva e a produtividade dos cultivos.

No sistema de incompatibilidade gametofítica o determinante feminino é uma RNAse

- a S-RNAse - que se expressa exclusivamente no pistilo e suas proteínas são

localizadas principalmente na parte superior do estilete onde atuam inibindo ou

degradando o RNA do tubo polínico que compartilha o mesmo alelo-S do pistilo

(SCHIFINO-WITTMANN; DALL’AGNOL, 2002; TAKAYAMA; ISOGAI, 2005;

BRUCKNER et al., 2006).

Dentre as espécies pertencentes à família Rosaceae, a qual inclui mais de

110 gêneros e 2.000 espécies, a maioria das cultivares de P. salicina apresentam o

sistema de GSI (SAPIR et al., 2004). Desta forma, a identificação dos alelos-S é

importante para o estabelecimento de pomares com cultivares compatíveis

reprodutivamente e, assim, reduzir perdas no campo, devido a baixa frutificação

efetiva.

Considerando a importância econômica desta cultura para o país, deve-se

procurar compreender melhor o mecanismo reprodutivo que envolve a combinação

entre cultivares polinizadoras, para obtenção de uma produção satisfatória de frutas

(RASEIRA, 2003), utilizando plantas livres de patógenos. Deste modo, metodologias

que permitam avaliar antecipadamente a compatibilidade genética entre cultivares

são de grande interesse, na medida que permitem selecionar previamente cultivares

totalmente compatíveis (MOTA; OLIVEIRA, 2005).

Por meio de ensaios de polinização controlada a campo e in vivo, e

avaliação molecular dos alelos-S das cultivares, é possível tornar o processo de

seleção de uma polinizadora muito mais eficiente (BROOTHAERTS et al., 1995;

ISHIMIZU et al., 1999; YAEGAKI et al., 2001).

Instituições governamentais vêm investindo em pesquisas com a finalidade

de melhorar os sistemas de produção atualmente empregados. A introdução de

novas espécies, o melhoramento genético e a produção de mudas sadias

contribuem para o aumento da eficiência do sistema produtivo. A muda de qualidade

potencializa a resposta à tecnologia aplicada no pomar, auxiliando na redução de

custos e na produção de frutas com alta qualidade e produtividade (OLIVEIRA et al.,

2004).

22

A micropropagação tem sido desenvolvida para inúmeras espécies frutíferas,

como um método alternativo e rápido de propagação vegetativa a partir de uma

célula ou de segmentos de tecidos de plantas (ERIG et al., 2004; ERIG; SCHUCH,

2005a), com a finalidade de multiplicar plantas com as mesmas características

genéticas da planta-matriz, livres de patógenos, independente da época do ano

(SCHUCH; ERIG, 2005), permitindo a produção de matrizes com qualidade genética

e sanitária comprovadas, quando comparado aos métodos convencionais de

enxertia e estaquia (ERIG; SCHUCH, 2005b; GRIMALDI et al.,2008).

A propagação in vitro permite o controle de variáveis responsáveis pelo

desenvolvimento da planta, produzindo material vegetal clonal homogêneo e com

elevada qualidade sanitária (ASSIS; TEIXEIRA, 1998; OLIVEIRA et al., 2006;

SOUZA et al., 2006; SOUZA et al., 2008).

Além disso, esse método de propagação pode ser utilizado para vários

estudos biotecnológicos, a exemplo da transformação genética para características

de interesse. Porém, o uso prático da propagação in vitro de plantas lenhosas,

principalmente prunoídeas, requer domínio da tecnologia de propagação in vitro, o

qual é o resultado de estudos realizados com os fatores que afetam o crescimento e

o desenvolvimento para cada espécie e/ou cultivar, entre eles, a constituição do

meio de cultura, tipo e concentração de reguladores de crescimento (ERIG et al.,

2002; DONINI et al., 2008b).

Dentre as cultivares adaptadas a região sul do país, a ameixeira japonesa (P.

salicina) cv. América é considerada uma das preferidas do mercado sul-brasileiro,

devido às suas características organolépticas, porém, é uma cultivar

autoincompatível, que apresenta grande flutuação na produtividade e exige

polinização cruzada para que ocorra a frutificação (RASEIRA, 2003). É uma das

cultivares recomendadas para o plantio no Rio Grande do Sul, considerada região

de clima ameno, já que exige cerca de 500 a 600 horas de acúmulo de frio

(temperaturas inferiores a 7,2ºC) e suas principais polinizadoras são as cultivares

Reubennel e Rosa Mineira (CASTRO et al., 2008a).

Diante do exposto, a caracterização fisiológica da compatibilidade

reprodutiva entre cultivares de ameixeira japonesa é de grande valia para a

confirmação da caracterização molecular dos alelos-S, a qual foi realizada

previamente no Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas da UFPel (MOTA,

2008), além de possibilitar seu uso como subsídios para programas de

23

melhoramento genético, já que estudos relacionados a caracterização fisiológicas da

compatibilidade reprodutiva das cultivares de ameixeira japonesa adaptadas a

região sul do país são bastante escassos e desatualizados em virtude das

mudanças climáticas.

Por outro lado, a técnica de micropropagação permite a multiplicação clonal

de plantas em larga escala, com alta qualidade genético-sanitária para a formação

de pomares, além de fornecer material para experimentos de regeneração, que é

uma etapa crucial para o melhoramento via transformação genética, almejando

selecionar novos genótipos com características de interesse.

Dentre as características desejadas para a ameixeira está a obtenção de

plantas autoférteis, que pode ser obtida por meio do silenciamento gênico via RNAi

(RNA de interferência), responsável pela degradação dos RNAs homólogos no

citosol, impedindo, desta forma, que ocorra a tradução do RNA alvo (VAUCHERET

etal., 2001), podendo promover, neste caso, o bloqueio da tradução dos alelos-S

envolvidos na incompatibilidade reprodutiva. Para este estudo foi eleita a cv.

América por ser bem adaptada a região sul do país, com boa produção e aceitação

do mercado consumidor, além de ser categoricamente autoincompativel

reprodutivamente.

24

Capítulo 1

Caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva de seis cvs.

copa de ameixeira japonesa

25

Caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva de seis cvs. copa de

ameixeira japonesa

1.1 Introdução

Dentre as espécies de ameixeira, Prunus salicina Lindl. (2n=18), também

conhecida como ameixeira japonesa, é a mais cultivada no Brasil por possuir

genótipos com menor exigência em frio, os quais foram introduzidos e/ou

selecionados de acordo com as condições climáticas das regiões aptas para o

cultivo (REVERS; MACHADO, 2005). Entretanto, as cultivares de ameixeira

japonesa apresentam diferentes graus de compatibilidade reprodutiva, determinada

por um loco multialélico, contendo os denominados alelos-S (TAKAYAMA; ISOGAI,

2005), necessitando de plantio de cultivares polinizadoras durante a instalação do

pomar, a fim de garantir a fecundação e níveis de produção aceitáveis

economicamente.

É indicada a implantação de pelo menos uma planta polinizadora para cada

quatro produtoras (CASTRO et al., 2008a), com compatibilidade e período de

floração total ou parcialmente sincronizadas (CARVALHO; RASEIRA, 1989; SAPIR

et al., 2004). O uso de mais de uma cultivar polinizadora também é recomendável

para se ter maior garantia de cobertura de todo o período de floração da cultivar

principal (DALBÓ; FELDBERG, 2009).

O sucesso da polinização cruzada é influenciado por fatores genéticos de

incompatibilidade, pela ação de insetos polinizadores (SPIERS, 1983; HARDER;

THOMSON, 1989; GOLDWAY et al., 1999), fatores ambientais (chuva,vento, baixas

temperaturas após a floração, carência de acúmulo de frio durante o período de

dormência, alternância de temperatura após a polinização), além de possíveis

deficiências de caráter fisiológico, conforme verificado em outras culturas, como por

26

exemplo em macieira (WHILLIAM; MAIER, 1977; PETRI; PASCOAL, 1981;

SCHRAMM, 1985; SOLTÉSZ et al., 1997). De acordo com os mesmos autores,

esses fatores afetam o crescimento e a penetração do tubo polínico até o óvulo.

Para que ocorra a polinização e a fecundação, o grão de pólen deve ser

transportado adequadamente até o estigma, onde emitirá o tubo polínico através do

pistilo, fertilizando o óvulo. Alterações em qualquer um destes processos poderão

impedir a formação do fruto (SANZOL; HERRERO, 2001), reduzindo

significativamente a frutificação efetiva ou fruit set.

A velocidade de crescimento do tubo polínico (CTP) até o ovário é variável

em angiospermas, podendo ser de poucas horas a dias. Em Acacia retinodes Schltr. o

crescimento do tubo até o ovário leva em torno de 11 horas, enquanto que em

Banksia coccinea R.Br. pode levar até seis dias. Pound et al. (2003) verificaram que em

Eucalyptus nitens (Deane & Maiden) o pólen alcançou o óvulo duas semanas após a

polinização.

Em ameixeiras o CTP é relativamente lento, cerca de 120h (CARVALHO,

1989). A velocidade de crescimento é de extrema importância para o sucesso

reprodutivo da planta, pois quanto mais rápido minimiza-se os danos por fatores

desfavoráveis (TANGMITCHAROEN; OWENS, 1997), os quais podem provocar a

abscisão do estilete, antes da fecundação (CARVALHO, 1989).

A identificação da região do pistilo onde o CTP é interrompido pode

evidenciar o sistema de autoincompatibilidade atuante. Este mecanismo é

considerado um dos sistemas mais importantes, estando presente na maioria das

angiospermas para evitar a autofecundação, produzindo e mantendo a diversidade

dentro das espécies (DE NETTANCOURT, 1977; RICHARDS, 1986; BARRETT,

1988).

De acordo com Bittencourt Júnior. et al. (2003), no sistema de

incompatibilidade reprodutiva do tipo gametofítico os tubos polínicos incompatíveis

têm o seu desenvolvimento cessado no estilete. Por possuir como determinante

feminino uma RNAse - a S-RNAse - a qual segrega junto com os alelos-S e se

expressa exclusivamente no pistilo. Estas proteínas estão presentes desde a

superfície das papilas estigmáticas até o ovário, mas localizam-se principalmente na

parte superior do estilete (HARING et al., 1990; DE NETTANCOURT, 2000;

SHIFINOWITTMANN; DALL’AGNOL, 2002), onde atuam inibindo ou degradando o

RNA do tubo polínico que compartilha o mesmo alelo-S do pistilo (ZISOVICH et al.,

27

2004; ZUCCHERELLI et al., 2002; TAKAYAMA; ISOGAI, 2005; BRUCKNER et al.,

2006).

Este sistema de incompatibilidade é considerado o mais distribuído nas

angiospermas, a exemplo das famílias Rosaceae, Solanaceae, Papaveraceae,

Liliaceae, dentre outras (GIBBS, 1986), constituindo uma das principais barreiras

para programas de melhoramento genético que buscam a obtenção de novas

cultivares, bem como para o manejo reprodutivo dos pomares.

O reconhecimento do pólen incompatível opera no nível de interação

proteína-proteína dos dois determinantes (masculino e feminino), sendo que a

resposta de autoincompatibilidade ocorre quando ambos determinantes estão

carregados com o mesmo alelo-S (BATLLE et al., 1995; BROOTHAERTS et al.,

1995; TAKAYAMA; ISOGAI, 2005). Os grãos de pólen mostram expressão

independente, segregando 1:1, e assim os cruzamentos podem ser compatíveis -

quando os alelos do grão de pólen e do pistilo são diferentes; semicompatíveis -

quando pelo menos um alelo-S do grão de pólen é idêntico ao do pistilo e, desta

forma, metade dos grãos de pólen germinam e desenvolvem o tubo polínico normal;

ou totalmente incompatíveis - quando os dois alelos-S do grão de pólen são

idênticos aos do pistilo (RICHARDS, 1986).

A análise da fertilidade do grão de pólen é indispensável para o

melhoramento genético clássico. Portanto, dados sobre a viabilidade e o

desenvolvimento de grãos de pólen são fundamentais para os estudos da biologia

reprodutiva e para o desenvolvimento de programas de melhoramento genético

(FLANKLIN et al., 1995).

A viabilidade do pólen pode ser determinada por diferentes métodos: através

da utilização de corantes, germinação in vitro, germinação in vivo e percentagem de

frutificação efetiva (DAFNI, 1992; KEARNS; INOUYE; 1993; LEITE; SOUZA, 2003).

A avaliação das plantas polinizadoras envolve polinizações controladas a

campo, combinadas com análises laboratoriais, para determinar a viabilidade dos

grãos de pólen (SOUZA; RASEIRA, 1998). Além disso, técnicas de microscopia

permitem analisar características associadas à germinação dos tubos polínicos e

suas taxas de crescimento, servindo também para analisar hibridações efetivas em

programas de melhoramento genético e, assim, elucidar características referentes a

incompatibilidade reprodutiva (KEARS; INOUYE, 1993), sendo considerado um teste

de grande valia, já que elimina resultados falsos de incompatibilidade por não ser

28

influenciados pelos fatores ambientais, os quais, a polinização realizada a campo

está sujeita.

Com base no que foi exposto, a realização deste trabalho teve por objetivo a

caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva de seis cvs. copa de

ameixeira japonesa, por meio da avaliação da frutificação efetiva e do crescimento

do tubo polínico (CTP), após a polinização in vivo, a fim de confirmar alguns dados

da caracterização molecular dos alelos-S destas cultivares, realizada previamente

em nosso laboratório, além de possibilitar seu uso como subsídio para programas de

melhoramento genético.

1.2 Material e Métodos

Para as análises de caracterização fisiológica dos alelos-S foram utilizadas

cultivares de P. salicina (Tab. 1, Anexo A e B) do Campo Experimental da Embrapa

Clima Temperado (CPACT) (Pelotas/RS), tanto para os experimentos realizados a

campo quanto para aqueles realizados em laboratório. As polinizações foram

executadas no momento em que os genótipos a serem polinizados possuíam

número suficiente de flores em estádio de balão para compor os tratamentos.

Durante a hibridação controlada, realizada a campo, para garantir que o

pólen fosse inoculado no período de receptividade máxima do pistilo, as polinizações

foram realizadas repetidamente durante o período de floração. Desta forma, botões

florais foram emasculados e a polinização foi realizada manualmente, passando-se

levemente o dedo indicador contendo o pólen de interesse sobre o estigma. Os

ramos foram ensacados com tecido não tecido (TNT) branco e devidamente

identificadas com fitas plásticas. Após cada cruzamento, as mãos foram lavadas

com álcool 70% para evitar a contaminação de um pólen com o outro. Como

controle, foi realizada a autopolinização das cultivares produtoras, onde os botões

florais foram emasculados e polinizados com o pólen da própria cultivar.

Para verificar a percentagem de fecundação foram polinizadas 150 flores,

em estádio de balão para cada cruzamento, conforme metodologia descrita para

gramíneas, por Wilson e Brown (1957), adaptada para frutíferas como ameixeira,

pereira, pessegueiro e damasqueiro (CARVALHO, 1989; GONÇALVES, 2008). Após

uma semana da polinização retirou-se o TNT para permitir o crescimento normal dos

ramos e desenvolvimento dos frutos, os quais foram contados após 40 dias da

29

polinização, determinando-se a percentagem de frutificação efetiva em relação ao

número de flores polinizadas e ensacadas (fruit set).

Tabela 1 – Genótipos de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.) utilizados para a polinização controlada e posterior caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva. Embrapa/Pelotas/RS, 2010

Genitores femininos Genitores masculinos América Rosa Mineira Pluma 7 Amarelinha Reubennel Santa Rosa

América

The First Reubennel América Reubennel Rosa Mineira Reubennel América Amarelinha

Amarelinha

Rosa Mineira América Reubennel Rosa Mineira Amarelinha

Rosa Mineira

Santa Rosa* América Pluma 7 Pluma 7 América

Santa Rosa Santa Rosa**

* Cruzamento realizado apenas in vivo, no laboratório. ** Cruzamento realizado apenas a campo.

A determinação do ponto onde ocorreu a interrupção do CTP foi avaliada por

meio da polinização in vivo e testes de CTP, utilizando o método empregado por

Wilson e Brown (1957), com algumas adaptações. Quatro ramos de cada planta-

mãe foram coletados a campo, de acordo com a disponibilidade de ramos contendo

dez flores em estádio de balão. Os mesmos foram levados para o laboratório, à

temperatura ambiente (18-20ºC), e mantidos com a base submersa em água para

evitar a desidratação. As flores foram emasculadas e polinizadas manualmente com

o pólen de interesse, conforme as combinações descritas na tab. 1.

30

Os pistilos foram coletados 120 horas após a polinização, colocados em

frascos contendo solução fixativa composta por formol, ácido acético e álcool etílico

(1:1:8) e armazenados em geladeira (4ºC) para, posteriormente, avaliar o CTP por

meio de coloração histoquímica.

Para o preparo das lâminas e visualização do CTP, os pistilos, previamente

fixados, foram lavados três vezes em água destilada e submersos em uma solução

de NaOH (8N) por 24h, à temperatura ambiente, para o amolecimento dos tecidos,

sendo novamente lavados três vezes com água destilada e transferidos para uma

solução de hipoclorito de sódio a 0,5%, durante 10 minutos, para descoloração dos

tecidos. A seguir, foram novamente lavados em água destilada e imersos em

solução aquosa do corante diferencial Lacmóide (Resorcina azul) 1%, por 10

minutos, lavados uma vez com água destilada para retirar o excesso de corante dos

tecidos, para finalmente proceder a montagem da lâmina. O pistilo foi posicionado

em lâmina de vidro, em seguida, acrescentou-se uma ou duas gotas de solução

Lacmóide diluída em água (1:2). Posteriormente, foi coberto com uma lamínula, a

qual foi levemente pressionada, para que rompesse os tecidos do pistilo, permitindo

a visualização do CTP no interior do mesmo.

Após o preparo das lâminas, as mesmas foram visualizadas em microscópio

óptico (Carl Zeiss Ind Brasileira) com ocular de 10x e objetiva de 40x. Foram

observadas 20 lâminas para cada combinação de cruzamento, avaliando-se a

percentagem de grãos de pólen germinados e o grau de desenvolvimento do tubo

polínico. Para esta última variável foram atribuídas notas de 1 a 6, baseado na

classificação de Fraken et al. (1988), com algumas alterações, conforme ilustrado na

tab. 2.

Tabela 2 – Notas atribuídas ao grau de desenvolvimento do tubo polínico através do pistilo das cultivares de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.) polinizadas in vivo. Embrapa/Pelotas/RS, 2010

* Adaptado de Fraken et al., 1988.

Notas* Grau de desenvolvimento do tubo polínico 1 Tubo polínico no estigma, sem penetrar no estilete 2 Tubo polínico no 1º terço do estilete 3 Tubo polínico no 2º terço do estilete 4 Tubo polínico no 3º terço do estilete 5 Tubo polínico no interior do ovário 6 Tubo polínico próximo ao óvulo 7 Tubo polínico no óvulo

31

O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com quatro

repetições de cinco flores. As médias foram submetidas à análise de variância e

comparação de médias pelo teste de Duncan com 5% de probabilidade de erro, por

meio do software WinStat 2.0 (MACHADO; CONCEIÇÃO, 2003). Os dados da

variável percentagem de grãos de pólen germinados foram transformados para

(x/100)1/2 enquanto que os graus de desenvolvimento do tubo polínico foram

transformados para log (x), onde x, em ambos os casos, representa o valor

observado.

1.3 Resultados e Discussão

Os resultados das polinizações controladas encontram-se na tab. 3, onde

é possível verificar que a maior percentagem de frutificação efetiva foi obitdo na

autopolinização da cv. Reubennel (8,41%), enquanto que todos os demais

cruzametos apresentaram valores inferiores a 3,5%. De acordo com Van e Bester

(1979), na polinização livre, apenas 5% de frutificação efetiva em cultivares de

ameixeira seria suficiente para assegurar uma boa produção comercial. Embora

estes autores tenham realizado o trabalho em regiões tipicamente de clima

temperado, onde a floração é mais abundante e uniforme do que no Brasil, verifica-

se que ’Reubennel’ é mais adaptada às condições de inverno ameno, do que as

demais cultivares e não é totalmente autoincompatível. Mesmo assim, quando a

floração não é abundante, a pesquisa recomenda o uso de uma cultivar polinizadora.

Em todas as combinações, a autopolinização foi realizada manualmente,

utilizando o pólen da própria cultivar, ao invés de apenas o ensacamento dos botões

florais, o que permitiu depositar grande quantidade de grãos de pólen no estigma,

pois segundo Stephenson e Bertin (1983), Bawa e Webb (1984) e Waser e Price

(1991) em polinizações naturais, o número de grãos de pólen alocados no estigma

nem sempre é suficiente para que haja penetração do tubo polínico no óvulo.

No presente trabalho, durante a autofecundação, obteve-se frutificação

somente nas cvs. Reubennel e Rosa Mineira (Tab. 3), sendo um indicativo de que

são autocompatíveis reprodutivamente. Tal resultado está de acordo com Raseira

(2003), a qual afirma que ambas cultivares são moderadamente compatíveis,

podendo produzir uma boa colheita comercial, mesmo sem a utilização de

32

polinizadora, desde que haja um florescimento abundante e condições climáticas

favoráveis.

Tabela 3 – Percentagem de frutificação efetiva dos cruzamentos controlados, realizados a campo, nos pomares de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.) da Embrapa Clima Temperado, na safra de 2007/2008. Embrapa/Pelotas/RS, 2010

Genitores femininos Genitores masculinos Frutificação efetiva (%) América 0 Rosa Mineira 0,66 Pluma 7 0 Amarelinha 0,63 Reubennel 2,44 Santa Rosa 1,33

América

The First 0 Reubennel 8,41 América 0,68 Reubennel Rosa Mineira 0 Reubennel 3,47 América 0 Amarelinha 0

Amarelinha

Rosa Mineira 1,28 América 0 Reubennel 3,47 Rosa Mineira 1,28

Rosa Mineira

Amarelinha 0 América 0 Pluma 7 Pluma 7 0 América 0

Santa Rosa Santa Rosa 0

Nos cruzamentos realizados a campo, ‘América’ apresentou frutificação

quando polinizada com as cvs. Rosa Mineira (0,66%), Amarelinha (0,63%), Santa

Rosa (1,33%) e Reubennel (2,44%), sendo que esta última apresentou

compatibilidade mútua com ‘América’ (0,68%). As cvs. Amarelinha e Rosa Mineira se

mostraram compatíveis com ‘Rosa Mineira’ e ’Reubennel’, apresentando 1,28% e

3,47% de frutificação efetiva em ambos cruzamentos, para cada genitora feminina,

respectivamente (Tab. 3). Nos demais cruzamentos não houve frutificação. Mesmo

assim não é possível afirmar que a falta de frutificação tenha ocorrido devido à

autoincompatibilidade reprodutiva, já que existem inúmeros fatores ambientais que

podem influenciar no sucesso da frutificação.

33

Além da incompatibilidade reprodutiva existente entre as cultivares, as

condições climáticas no momento da polinização (WEINBERGER, 1975) e após o

florescimento, tais como chuva, vento, geadas, seca, entre outros, também podem

ocasionar variação na polinização efetiva (THOMPSON; LIV, 1973; BARBOSA,

2006). A pseudocompatibilidade também pode ocorrer, influenciada por fatores

ambientais e fisiológicos que permitem ou não a ocorrência de fertilização entre

cultivares, neste caso, não existe influência de fatores genéticos para a fecundação

(LARSEN, 1983; WHILLIAM; MAIER, 1977; EGEA; BURGOS, 1996).

Ademais, a emasculação, realizada durante os cruzamentos dirigidos, pode

causar injúria no pistilo devido à delicada constituição das flores de ameixeira

(THIELE; STRYDROM, 1964), sendo um importante fator associado à baixa

frutificação observada nos cruzamentos dirigidos.

Diferenças de frutificação efetiva e pegamento do fruto são bastante comuns

de um ano para o outro, sendo influenciado pelas condições ambientais no momento

da polinização e após o florescimento (WEINBERGER, 1975).

Segundo Nava et al. (2009), recentemente tem sido verificada baixa taxa de

frutificação efetiva e/ou irregularidades de produção nos pomares brasileiros de

ameixeiras, pessegueiros, e nectarineiras, principalmente em algumas áreas da

região sul do Brasil. Ressaltam que dentre os possíveis motivos para este

acontecimento está a antecipação do florescimento devido a elevada temperatura

durante o período que antecede a floração, acarretando no retardamento do

desenvolvimento do gametófito feminino e na formação de anomalias dos

gametófitos masculinos. Estes fatores promovem redução da viabilidade do grão de

pólen e baixa produção de sacos embrionários viáveis, resultando na falta de

sincronia no processo de fecundação, reduzindo, desta forma, a frutificação efetiva.

Portanto, esta pode ter sido outra razão para a baixa frutificação efetiva nos

cruzamentos realizados no presente estudo, uma vez que na safra 2007/2008 nos

pomares de ameixeira da Embrapa Clima Temperado (Pelotas/RS) foram muito

prejudicados devido ao rápido aquecimento, no final do inverno, após o acúmulo de

frio hibernal, além da incidência de chuvas no período de florescimento, entre os

meses de agosto a início de novembro.

De acordo com o Laboratório de Agrometeorologia da Embrapa Clima

Temperdo (CPACT) (Pelotas/RS) houve acúmulo de 700h de frio, entre os meses de

maio a setembro de 2007, apresentando em média 4h de frio por dia no mês de

34

maio, 8h nos meses de junho e julho, e 3h no mês de agosto, a partir deste mês as

temperaturas começaram a subir, iniciando, desta forma, a floração de diversas

cultivares, enquanto que no mês de setembro o acúmulo de horas de frio foi de 13h

em apenas três dias do final do mês, causando a queima de diversos botões florais

que já haviam florecido. Quanto ao índice pluviométrico foi verificado que durante a

época de floração houve um acúmulo de precipitação de 206mm no mês de agosto,

no início do florescimento, 148,1mm em setembro, 149,3mm em outubro e 76,9mm

em novembro, as chuvas foram bem distribuídas ao longo de cada mês,

prejudicando a polinização controlada, realizada a campo (Anexo C).

Em relação aos cruzamentos in vivo, realizados no laboratório, foi

observada uma elevada percentagem de grãos de pólen germinados na região

estigmática do pistilo, entre 60-100%, exceto para o pólen da cv. Santa Rosa

(21,67%) e para a cv. Rosa Mineira (40,23%) quando utilizada para polinizar as cvs.

Rosa Mineira e Reubennel, respectivamente. Entretanto, ‘Santa Rosa’ apresentou

70,56% de grãos de pólen germinados na região estigmática da cv. América (Fig. 1),

demonstrando que os grãos de pólen utilizados, quando polinizados nos pistilos das

respectivas genitoras femininas, estavam viáveis e foram capazes de germinar.

De acordo com a análise de variância houve diferença significativa pelo teste

de Duncan para a percentagem de grãos de pólen germinados na região estigmática

da planta-mãe apenas entre os cruzamentos realizados com as genitoras femininas

‘América’, ‘Reubennel’ e ‘Rosa Mineira’ (Fig. 1, ilustração na Fig. 2b).

Na genitora feminina ‘América’ o pólen da cv. Amarelinha teve 100% de

germinação, diferindo das cultivares Rosa Mineira (71,61%), Santa Rosa (70,56%),

América (67,86%) e Reubennel (60%) (Fig. 1a, Apêndice A1). Dentre os

cruzamentos realizados com a cv. Amarelinha, a ‘Rosa Mineira’ apresentou 100% de

germinação dos grãos de pólen na região estigmática, diferindo apenas do

cruzamento com ‘América’ (88,89%) (Fig. 1b, Apêndice A2). Já, em relação à cv.

Reubennel houve diferença na percentagem de germinação do grão de pólen no

estigma entre os três cruzamentos realizados, com maior percentagem de

germinação do pólen da cv. América (94,66%) e menor da cv. Rosa Mineira

(40,23%) (Fig. 1c, Apêndice A3). Nos cruzamentos realizados na ‘Rosa Mineira’ os

grãos de pólen da própria cultivar e das cvs. Amarelinha e Reubennel apresentaram

100% de germinação no estigma diferindo apenas do pólen da ‘Santa Rosa’

(21,67%) (Fig. 1d, Apêndice A4).

35

Figura 1 – Percentagem de grãos de pólen germinados no estigma de cultivares de

ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), nas genitoras femininas

‘América’ (a), ‘Amarelinha’ (b), ‘Reubennel’ (c), ‘Rosa Mineira’ (d), ‘Pluma

7’ (e) e ‘Santa Rosa’ (f) após 120h das polinizações controladas,

realizadas in vivo e mantidas em temperatura ambiente. As barras

representam o erro padrão da média. Embrapa/Pelotas/RS, 2010.

Nos cruzamentos realizados nas cultivares ‘Pluma 7’ e ‘Santa Rosa’ não

houve diferença significativa, apresentando média de 78,20% e 75,35% dos grãos

de pólen germinados na região estigmática, respectivamente (Fig. 1e, 1f e

Apêndices A5 e A6, respectivamente).

Genitor feminino cv. América

90,65

6070,5667,8671,61

84,23

100

0

20

40

60

80

100

120

Amarelinha

The First

Rosa Mineira

Pluma 7

América

Santa Rosa

Reubennel

cultivares doadoras de pólen

Grã

os d

e pó

len

germ

inad

os n

o es

tigm

a (%

)Genitor feminino cv. Amarelinha

97,27 97,69 10088,9

0

20

40

60

80

100

120

Reubennel Amarelinha Rosa Mineira América


Grã

os d

e pó

len

germ

inad

os n

o es

tigm

a (%

)

Genitor feminino cv. Reubennel

80,46

94,66

40,23

0

20

40

60

80

100

120

Rosa Mineira América Reubennel


Grã

os d

e pó

len

germ

inad

os n

o es

tigm

a (%

)

Genitor feminino cv. Rosa Mineira

10089,29

21,67

100100

0

20

40

60

80

100

120

Reubennel Amarelinha Rosa Mineira América Santa Rosa


Grã

os d

e pó

len

germ

inad

os n

o es

tigm

a (%

)

71,42

85

0

20

40

60

80

100

120

Pluma 7 x América Pluma 7 x Pluma 7

Grã

os d

e pó

len

germ

inad

osno

est

igm

a (%

)

80,1470,56

0

20

40

60

80

100

120

Santa Rosa x América América x Santa Rosa

Grã

os d

e pó

len

germ

inad

os n

o es

tigm

a (%

)

d c

a b

f e

36

De acordo com estes resultados pode-se verificar que os grãos de pólen de

qualquer uma das cultivares utilizadas no presente estudo, foram capazes de

germinar no estigma (Fig. 2b), demonstrando sua viabilidade, porém o crescimento

do tubo polínico durante o percurso entre o estigma até os óvulos (Fig. 2a), etapa

essencial para que ocorra a fecundação e consequente frutificação, pode ser

bloqueado por barreiras pré-zigóticas, a exemplo da autoincompatibilidade

reprodutiva do tipo gametofítica que é considerada de maior incidência nas

angiospermas (GIBBS, 1986).

Figura 2 – Desenvolvimento do tubo polínico no pistilo de flores das cultivares de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), após 120h das polinizações controladas realizada in vivo e mantidas em temperatura ambiente (a). Germinação dos grãos de pólen na superfície estigmática (b), no estilete demonstrando o depósitos de calose (c) e interrupção do crescimento do tubo polínico no estilete (d, e), tubo polínico atingindo o ovário (grau 5) (f) e tubo polínico atingindo o óvulo (grau 6) (g). Embrapa/Pelotas/RS, 2010.

A autoincompatibilidade gametofítica é um mecanismo controlado

geneticamente que impede a autopolinização, tornando-se necessária a polinização

a b c d

e f g

37

cruzada, garantindo, desta forma, a variabilidade genética. Quando os alelos-S do

gametófito feminino (pistilo) e masculino (grão de pólen) forem diferentes, ocorre a

síntese de um polissacarídeo (calose) na parte basal do tubo polínico protegendo-o,

permitindo, desta forma, o desenvolvimento do mesmo para que ocorra a

fecundação. Já, quando os alelos são iguais, promoverá a inibição ou paralisação do

desenvolvimento dos tubos polínicos no estilete, devido a um engrossamento na

extremidade dos tubos polínicos, os quais podem romper-se devido a excessiva

deposição da própria calose (RAMALHO et al., 1996; WESTWOOD, 1982) (Fig. 2c,

2d e 2e).

O mecanismo de ação que confere a autoincompatibilidade ainda não está

bem elucidado. Pode ser que o mecanismo de rejeição envolva a destruição da

parede interna do estilete, devido ao acúmulo de calose, ou ainda, o aumento da

calose pode ocorrer devido à degeneração prematura do citoplasma em resposta a

inibição do CTP (VITI et al., 1997).

Foi verificado o desenvolvimento do tubo polínico alcançando cada um dos

pontos, para os quais foram atribuídas notas para o grau de desenvolvimento ao

longo do pistilo, após 120h da polinização em temperatura ambiente de 25ºC (Tab. 2

e Fig. 2). De acordo com a análise de variância houve interação significativa para o

grau de desenvolvimento do tubo polínico e o pólen utilizado, em cada genitor

feminino (Fig. 3).

Nos cruzamentos realizados não foi observada penetração no óvulo e sim, o

tubo polínico bem próximo ao óvulo, conforme pode ser observado na fig. 2g. Este

fato pode ser justificado pelo tempo decorrido após a polinização, uma vez que em

estudos realizados por Carvalho (1989), em relação ao desenvolvimento dos tubos

polínicos, em cruzamentos entre cultivares de ameixeira, constatou que nem sempre

o tempo de 120 horas é suficiente, sendo necessárias 144 horas, para que os

mesmos fecundem os óvulos.

Dentre outros fatores que também podem influenciar a não penetração no

óvulo está a imaturidade do órgão reprodutor feminino. Entretanto, este fato não

influenciou negativamente os resultados do presente estudo, o qual foi realizado

com intuito de verificar se as cultivares apresentavam ou não a incompatibilidade

reprodutiva do tipo gametofítica através do CTP. Para tanto, observou-se apenas se

o tubo polínico ultrapassou a barreira da incompatibilidade, que conforme

mencionado anteriormente, se localiza no terço médio do estilete.

38

Figura 3 – Percentagem de incidência do tubo polínico em cada etapa do percurso estigma-óvulo de ameixeiras japonesas

(Prunus salicina Lindl.), em função das polinizações controladas, realizadas in vivo, após 120h, e mantidas em temperatura ambiente nas genitoras femininas ‘América’ (a), ‘Santa Rosa’ (b), ‘Pluma 7’ (c), ‘Amarelinha’ (d), ‘Rosa Mineira’ (e) e ‘Reubennel’ (f). As barras representam o erro padrão da média. Embrapa/Pelotas/RS, 2010.

a b c Genitor feminino ameixeira japonesa cv. América

0 0 00 0 0 00 0 0 00 0

10

35

55

30

1520 15

20

35 40

25

40

25

1015

1010 15

3535

5

25 30

40

5

3530

15 20

0102030405060708090

100

1 2 3 4 5 6Grau de desenvolvimento do tubo polínico

Inci

dênc

ia d

o tu

bo p

olín

ico

em. c

ada

eta

pa (

%)

América Amarelinha Pluma 7 Reubennel Rosa Mineira Santa Rosa The First

0 0 05

60

1510105

4030

25

0

20

40

60

80

100

1 2 3 4 5 6

Grau de desenvolvimento do tubo polínico

% d

e in

cidê

ncia

do

tubo

po

línic

o em

cad

a et

apa

Santa Rosa x América América x Santa Rosa Genitor feminino ameixeira japonesa cv. Pluma 7

0 0 0 0 0

2010

25

45

20

30

50

0

20

40

60

80

100


Inci

dênc

ia d

o tu

bo

polín

ico.

em

cad

a et

apa

(%)

América Pluma 7

Genitor feminino ameixeira japonesa cv. Amarelinha

0 00 00 0 0 0 00 0 0

10

60

20

30

55

35

55

100

510

85

0

20

40

60

80

100


Inci

dênc

ia d

o tu

bo

polín

ico

em c

ada

etap

a (%

)

América Amarelinha Reubennel Rosa Mineira

Genitor feminino ameixeira japonesa cv. Rosa Mineira

00 0 00 0 0 0 00 0 0 0

60

10 10 155

35

60

5

100

25

60

10 5

70

20

5 5

0

20

40

60

80

100


Inci

dênc

ia d

o tu

bo

polín

ico

em c

ada

etap

a (%

)

América Amarelinha Reubennel Rosa Mineira Santa Rosa Genitor feminino ameixeira japonesa cv. Reubennel

0 00 0 0

3530

2015

51010 10

55

105

70

30

0

20

40

60

80

100


Inci

dênc

ia d

o tu

bo

polín

ico.

em

cad

a et

apa

(%)

América Reubennel Rosa Mineira

d e f

38

39

Nos cruzamentos realizados com a cv. América como genitor feminino (Fig.

3a, Apêndice A7), o pólen da própria cultivar apresentou CTP apenas até o estádio

3, que representa o terço médio do estilete, com 55% de incidência, não diferindo

estatisticamente do estádio 2, e não apresentando crescimento nos estádios 4, 5 e

6, o que caracteriza a autoincompatibilidade reprodutiva do tipo gametofítica desta

cultivar (RASEIRA, 2003; MOTA, 2008). O tubo polínico da cv. Pluma 7 atingiu 40%

de incidência no grau 3, não diferindo dos graus 2 e 4, portanto não apresentou

crescimento nos graus 5 e 6. Já com a cv. Santa Rosa houve 40% de incidência

também no estádio 3, o qual não diferiu significativamente dos estádios 1 e 2,

apresentando CTP até o estágio 5, não havendo nenhuma incidência no estádio 6,

evidenciando que o CTP destas duas últimas cultivares, quando polinizadas na cv.

América, é mais lento e, provavelmente, seria necessário mais tempo para que

chegasse ao óvulo (Fig. 2f e ilustração na Fig. 3a).

Thiele e Stridom (1964) observaram que em casos de incompatibilidade

entre ameixeiras, mesmo ocorrendo germinação dos grãos de pólen em 24 horas

após a polinização, depois de 48 horas o tubo polínico ainda não atingiu a metade

do pistilo, e após 72, 96 e 120 horas os tubos polínicos ainda continuam se

desenvolvendo lentamente, podendo, desta forma, indicar certo grau de

compatibilidade, concordando com resultados obtidos por Modlibowska (1945),

Teskey e Shoemaker (1978), Stott (1972) e Silveira (2008), os quais sugerem que o

desenvolvimento dos tubos polínicos nos cruzamentos incompatíveis apresenta

crescimento mais lento do que os compatíveis.

De acordo com Frankel e Galum (1977), quando os alelos-S são idênticos, a

velocidade de CTP torna-se mais lenta, ou mesmo nula, retardando a sua

penetração até o ovário, e quando atinge o mesmo, dificilmente ocorrerá a

fecundação, porque geralmente a fase de receptividade do óvulo já passou.

As demais polinizadoras da cv. América apresentaram desenvolvimento do

tubo polínico até o estádio 6, ou seja, até o óvulo, porém a cv. Reubennel

apresentou 40% de incidência do CTP no estádio 1, não diferindo do 3. A cv. The

First também apresentou 35% no estádio 3, diferindo apenas dos estádios 1 e 2, nos

quais não apresentaram nenhuma incidência, demonstrando que não houve

interrupção do CTP nestes estádios. Quando utilizado a cv. Rosa Mineira como

polinizadora, houve 35% de incidência de CTP nos estádios 6 (próximo ao óvulo) e 4

(no último terço do estilete), não diferindo do 3 (no terço médio do estilete),

40

enquantoque a polinizadora ‘Amarelinha’ apresentou 30% de incidência do tubo

polínico no estádio 3, diferindo apenas do 1.

Dentre as cultivares utilizadas na polinização da cv. América, todas atingiram

o ovário após 120h, exceto no caso de autopolinização dessa cultivar que teve o

CTP interrompido no terço médio do estilete, e a cv. Pluma 7, no último terço do

estilete. O tubo polínico da cv. Santa Rosa apresentou o crescimento até o ovário,

demonstrando que haveria a capacidade de fecundação, porém seu crescimento foi

mais lento.

De acordo com Souza (1999), estudos realizados com a autopolinização das

cultivares de Pyrus spp. ‘Ya-li’, ‘Carrick’ e ‘Kieffer’, a reação de incompatibilidade

reprodutiva está concentrada na região do estilete dos pistilos, o que concorda com

os resultados encontrados no presente trabalho. O mesmo autor observou que o

CTP em pereira, após 120 horas da polinização, alcançou no máximo 1/3 do

comprimento do estilete.

Segundo Raseira (2003) e Castro et al. (2008b), a campo, as cultivares

polinizadoras recomendadas para a cv. América são as cvs. Reubennel e Rosa

Mineira. Porém, no presente trabalho, foi possível observar que as cvs. Amarelinha e

The First também podem ser utilizadas como possíveis polinizadoras em trabalhos

de melhoramento, sendo que de acordo com Carvalho (1989), a primeira é

considerada de floração precoce, ou seja, floresce no início de agosto até meados

de setembro, enquanto que a segunda, é considerada de floração mediana, porém

apresenta floração precoce em anos frios e floração tardia quando o frio é

insuficiente para superação da dormência.

As cultivares Santa Rosa e América são consideradas autoincompatíveis

(RASEIRA, 2003; MOTA, 2008). Entretanto, nos cruzamentos ‘Santa Rosa’ x

‘América’ houve 60% de incidência do tubo polínico no grau 6, apresentando

diferença estatística em relação aos demais graus, demonstrando compatibilidade

entre elas. Porém, a total reciprocidade não é verdadeira, sendo que no cruzamento

‘América’ x ‘Santa Rosa’ 40% dos tubos polínicos estavam no grau 3, não diferindo

dos graus 1 e 2, apresentando baixa incidência de CTP no grau 5, caracterizando

um cruzamento semi-compatível (Fig. 3b, Apêndice A8). Conforme Modliboswka

(1945), cruzamentos semi-compatíveis ocorrem quando pelo menos um dos alelos-S

do genitor masculino, neste caso a cv. Santa Rosa, apresenta um alelo-S diferente

ao dos tecidos diplóides dos pistilos da genitora feminina. Desta forma 50% dos

41

grãos de pólen são capazes de germinar e fecundar o óvulo, enquanto que os outros

50% terão o seu crescimento interrompido no estilete, conforme observado no

presente estudo, confirmando os resultados encontrados por Mota (2008) que

identificou os alelos-S de algumas cultivares de ameixeira japonesa, dentre elas a

‘Santa Rosa’ e ‘América’ que apresentam um alelo idêntico Sc ou S4 (Anexo D).

Conforme os dados apresentados no presente estudo, a cultivar América

pode ser considerada polinizadora da ‘Santa Rosa’, o que seria de grande valia já

que esta última possui o alelo Se (MOTA, 2008), o qual está associado a

autocompatibilidade reprodutiva, determinando uma relativa autofertilidade nas

condições de cultivo da região sul do Brasil, em pomares plantados sem

polinizadoras ou mesmo na ausência de coincidência de floração com possíveis

polinizadoras (BEPPU et al., 2002). Desta forma, através da segregação deste alelo,

existe a possibilidade da produção de um híbrido que possa quebrar parcialmente

esta barreira de incompatibilidade gametofítica de cultivares autoincompatíveis como

a cultivar América.

Quando utilizada a cv. Pluma 7 como genitor feminino, os grãos de pólen da

cv. América apresentaram CTP até o grau 6, apresentando maior incidência no grau

5 (45%), diferindo significativamente apenas dos graus 1 e 2, enquanto que na

autopolinização, 50% dos tubos polínicos se desenvolveram apenas até o grau 3,

sendo que a sua incidência não diferiu dos graus 1 e 2, caracterizando a

autoincompatibilidade reprodutiva (Fig. 3c, Apêndice A9), nas condições em foi

desenvolvido o experimento, diferindo dos dados disponíveis na literatura, já que

Raseira (2003) e Mota (2008) afirmam que a cv. Pluma 7 é moderadamente

autocompatível.

As cultivares utilizadas como polinizadoras da cv. Amarelinha apresentaram

elevada incidência do tubo polínico próximo ao óvulo (grau 6). Com exceção da

autopolinização que apresentou 55% de incidência do tubo polínico no grau 3, não

diferindo do grau 4, havendo CTP somente até o grau 5, podendo indicar a

autocompatibilidade desta cultivar, porém com um crescimento mais lento do tubo

polínico. As cvs. Reubennel e Rosa Mineira apresentaram 100% e 85% de

incidência do tubo polínico no grau 6, respectivamente, diferindo dos demais

estádios de desenvolvimento (Fig. 3d, Apêndice A10).

Da mesma forma, os tubos polínicos do pólen da cv. América tiveram um

crescimento até o grau 6 em 60% das amostras, não diferindo dos graus 3 e 5 (Fig.

42

3d, Apêndice A10), caracterizando um crescimento mais acelerado em relação a

autofecundação e demonstrando que estas cultivares são compatíveis

reprodutivamente com a cv. Amarelinha, para uso no melhoramento, uma vez que

de acordo com Raseira (2003) e Castro et al. (2008b), as polinizadoras

recomendadas para esta cultivar são ‘Pluma 7’, ‘Friar’ e ‘Blood Plum’.

Os cruzamentos realizados com a cv. Rosa Mineira apresentaram elevada

incidência do CTP até o grau 6, chegando a 100% com a polinizadora Reubennel, e

60% com as cvs. América, Amarelinha e a própria Rosa Mineira. Em todos estes

cruzamentos houve diferença estatística em relação aos demais graus de

desenvolvimento. Entretanto, no cruzamento desta cultivar com o pólen da Santa

Rosa, não houve CTP nos estádios 5 e 6, havendo 70% de incidência de tubos

polínicos no estádio 1, diferindo dos demais estádios (Fig. 3e, Apêndice A11). Porém

acredita-se que este cruzamento seja compatível já que de acordo com Mota (2008),

ambas cultivares (Rosa Mineira e Santa Rosa) possuem alelos-S completamente

distintos.

Todas as polinizações realizadas com a cv. Reubennel apresentaram CTP

até o grau 6, sendo que a autopolinização apresentou 55% de incidência do tubo

polínico no grau 5, diferindo dos demais graus e 10% no grau 6. A polinização

realizada com a cv. Rosa Mineira apresentou 70% no grau 6, diferindo dos demais

graus, enquanto que a cv. América apresentou 35%, não diferindo dos graus 3, 4 e

5, demonstrando a capacidade de polinização da cv. Reubennel com estas

polinizadoras (Fig. 3f, Apêndice A12).

As polinizadoras recomendadas para a cv. Reubennel de acordo com

Raseira (2003) são ‘Rosa Mineira’, ‘Amarelinha’ e ‘Pluma 7’ e de acordo com Castro

et al. (2008b), ‘Blood Plum’ e ‘Amarelinha’. Dentre estas apenas a ‘Rosa Mineira’ foi

utilizada no presente trabalho, confirmando a sua compatibilidade.

Nas condições em que foi realizado o experimento, diante dos resultados da

polinização in vivo, foi observado que os cruzamentos entre ‘América’ x ‘Pluma 7’ e

‘Rosa Mineira’ x ‘Santa Rosa’ são incompatíveis e que as cultivares América e

Pluma 7 são autoincompatíveis, apesar desta última ser considerada

moderadamente compatível (RASEIRA, 2003; MOTA, 2008). Além disso, foi

verificado que em alguns cruzamentos apesar de não terem apresentado frutificação

quando realizados no campo, foi visualizado o crescimento do tubo polínico até o

óvulo (grau 6) ou ovário (grau 5) na polinização in vivo, tais como ‘Reubennel’ x

43

‘Rosa Mineira’; ‘Rosa Mineira’ e ‘Amarelinha’ x ‘América’ e ‘Amarelinha’; e ‘Pluma 7’

e ‘Santa Rosa’ x ‘América’, confirmando a sua compatibilidade reprodutiva.

No presente estudo, de acordo com os resultados encontrados, foram

apresentadas diversas possibilidades de plantas polinizadoras para cada uma das

cultivares genitoras femininas de P. salicina testadas, permitindo aprimorar o

conhecimento a respeito das interações de incompatibilidade existente entre as

cultivares de ameixeira japonesa.

Estes dados obtidos são válidos para uso em programas de melhoramento

genético, através de hibridações controladas, utilizando pólen colhido em anos

anteriores e devidamente armazenados, para polinizar as cultivares de floração

precoce, ou então para as que não apresentam coincidência na época de floração

em uma determinada região de produção. Já que para poder recomendar uma

cultivar como polinizadora ela deve apresentar, principalmente, período de floração

coincidente e pólen compatível com a cultivar produtora. Além disso, deve produzir

grande quantidade de pólen, florescimento anual regular e frutos preferencialmente

de interesse e valor comercial (CARVALHO; RASEIRA, 1989; WREGE, 2005).

Diante destes resultados de caracterização fisiológica e associados aos da

caracterização molecular dos alelos-S, desenvovida previamente no Laboratório de

Cultura de Tecidos de Plantas (LCTP) da UFPel, foram realizados experimentos de

micropropagação da cv. América com o intuito de obter material para experimentos

de regeneração de plantas a partir de explantes foliares, visando a realização de

futuros trabalhos para obter o silenciamento desses alelos, através da tranformação

genética, uma vez que esta cultivar é comprovadamente autoincompatível.

1.4 Conclusão

Por meio do presente estudo conclui-se que:

- A caracterização fisiológica realizada por meio dos cruzamentos das

cultivares de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.) confirmam a caracterização

molecular de seus alelos-S;

- Apenas os cruzamentos entre ‘América’ x ‘Pluma 7’ e ‘Rosa Mineira’ x

‘Santa Rosa’ são incompatíveis;

- A cultivar América é autoincompatível.

44

Capítulo 2

Estabelecimento, multiplicação e alongamento in vitro de ameixeira

japonesa, cv. América

45

Estabelecimento, multiplicação e alongamento in vitro de ameixeira japonesa,

cv. América

2.1 Introdução

A cultura de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.) destacou-se no

mercado nacional, principalmente no Rio Grande do Sul e Santa Catarina onde as

condições de invernos favorecem seu cultivo (SEGANFREDO, 1995; CASTRO,

2003). A cultivar América é considerada uma das preferidas no mercado sul-

brasileiro devido às suas características organolépticas e adaptação às condições

edafoclimáticas do RS (REVERS; MACHADO, 2005), porém apresenta problemas

de produção quando o pomar não é manejado adequadamente. Dentre os fatores

limitantes destacam-se a susceptibilidade à escaldadura das folhas, causada pela

bactéria Xylella fastidiosa Wells, que afeta a qualidade do material propagativo

(SILVEIRA et al., 2003) e a autoincompatibilidade gametofítica, prejudicando o

sucesso do empreendimento (LEWIS, 1994; RASEIRA, 2003; SAPIR et al., 2004;

TAKAYAMA; ISOGAI, 2005).


de melhorar os sistemas de produção atualmente empregados. Desta forma, a

introdução de novas espécies, o melhoramento genético e a produção de mudas

sadias poderão contribuir para o aumento da eficiência do sistema produtivo. Mudas

de qualidade potencializam a resposta à tecnologia aplicada no pomar, auxiliando na

redução de custos e na produção de frutas com alta qualidade e produtividade

(OLIVEIRA et al., 2004).

Uma das principais formas de disseminação de X. fastidiosa é por meio de

material propagativo contaminado. Sendo assim, o cultivo in vitro possibilita

46

propagar rapidamente espécies de interesse, além de promover a limpeza clonal,

permitindo a produção de matrizes com qualidade genética e sanitária comprovadas,

quando comparado aos métodos de enxertia e estaquia, devido ao maior controle

sobre as várias etapas do processo de micropropagação, além de proporcionar a

formação de pomares clonais (ASSIS; TEIXEIRA, 1998; OLIVEIRA et al., 2006;

SOUZA et al., 2006; SOUZA et al., 2007; SOUZA et al., 2008). Além disso, esse

método de propagação pode ser utilizado para vários estudos biotecnológicos, a

exemplo da transformação genética para características de interesse.

Porém, o uso prático da propagação in vitro de plantas lenhosas,

principalmente prunoídeas, requer o estudo e adaptação das condições de cultivo,

específico para cada espécie e/ou cultivar. Essa tecnologia é afetada por diversos

fatores, entre eles, a constituição do meio de cultura, tipo e concentração de

reguladores de crescimento.

Um aspecto fundamental para realizar a micropropagação de uma espécie

frutífera, visando maximizar sua multiplicação, é o domínio da tecnologia de

propagação em laboratório, que é resultado de estudos realizados com os fatores

que afetam o crescimento e o desenvolvimento das plantas in vitro (ERIG et al.,

2002; DONINI et al., 2008b). Esta técnica tem sido desenvolvida, para inúmeras

frutíferas, como um método alternativo e rápido de propagação vegetativa a partir de

uma célula ou de segmentos de tecidos de plantas (ERIG et al. 2004; ERIG;

SCHUCH, 2005b), com a finalidade de multiplicar plantas com características

genéticas idênticas a planta-matriz e livres de patógenos, independente da época do

ano (SCHUCH; ERIG, 2005).

Para micropropagar uma espécie, um dos primeiros passos é o

estabelecimento de plantas in vitro, o que se inicia com a seleção dos explantes

mais adequados (ERIG; SCHUCH, 2003b) e, também, com o protocolo de

descontaminação.

Após o estabelecimento, durante o cultivo in vitro, os meios nutritivos

fornecem aos explantes substâncias essenciais para o seu crescimento e controlam,

em grande parte, o padrão de desenvolvimento da cultura. O meio MS

(MURASHIGE; SKOOG, 1962) é o mais utilizado para diversas espécies

(GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). Entretanto, na micropropagação do gênero

Prunus são utilizadas composições mais diluídas desse meio, ou mesmo, meios com

formulações contendo menores concentrações de sais e vitaminas, a exemplo do

47

WPM – Wood Plant Medium (LLOYD; McCOWN, 1980). Mesmo assim cada cultivar

apresenta uma resposta de crescimento diferenciada necessitando de ajustes

específicos no protocolo de propagação (SILVEIRA et al., 2001; COUTO, 2003;

SILVA, 2004; ROCHA, 2006a).

Além da concentração de sais e vitaminas, os reguladores de crescimento

também são fatores determinantes no crescimento e no padrão de desenvolvimento

para a maioria dos sistemas de cultura de tecidos (MARTINELLE, 1985; CALDAS et

al., 1990; GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).

As citocininas atuam na divisão celular e são necessárias na regulação da

síntese de proteínas que está diretamente relacionada com a formação de fibras do

fuso mitótico (GEORGE; SHERRINTON, 2008). Na cultura de ápices caulinares,

potencializam a proliferação de gemas axilares, por meio da capacidade de

superação da dominância apical (BHOJWANI; RAZDAN, 1996). Compõem uma das

classes de reguladores de crescimento mais utilizadas na cultura de tecidos, sendo o

BAP (6-benizilaminopurina) responsável pela indução da formação de brotos e alta

taxa de multiplicação em muitos sistemas de micropropagação (MARTINELLE, 1985;

GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998; GEORGE; SHERRINTON, 2008), enquanto

que o 2iP (Isopenteniladenina) é uma citocinina considerada de ação mais fraca

(HU; WANG, 1998).

Entretanto, uma das formas de aumentar a taxa de multiplicação dos

explantes é por meio de ajustes no protocolo, modificando o tipo e a concentração

de citocininas a serem acrescidas ao meio de cultura (SILVEIRA et al., 2001). A

citocinina é, na maioria das vezes, indispensável nesta fase, para a superação da

dominância apical e a indução da proliferação de gemas axilares (HU; WANG,

1983).

O BAP contribui eficientemente na multiplicação de explantes, geralmente

apresentando melhores resultados, além de ser mais barata que outras citocininas

(SCHUCH; ERIG, 2005). Neste sentido, estudos realizados por Rogalski et al.

(2003), permitiram obter maior número de brotos de P. salicina cv. Santa Rosa,

utilizando 2,0mg dm-3 de BAP, enquanto que a maior altura das brotações foi

registrada na menor concentração utilizada (0,5mg dm-3). Em ameixeira européia

(Prunus domestica L.) as maiores taxas de multiplicação in vitro foram observadas

utilizando BAP nas concentrações entre 0,5 e 1,5mg dm-3, evidenciando que

48

concentrações crescentes de citocininas inibem o alongamento de brotações de

prunoídeas cultivadas in vitro (LEONTIEV-ORLOV et al., 2000a e 2000b).

Durante a multiplicação in vitro, as brotações formadas podem ser pequenas

em comprimento, ocasionando baixo percentual de enraizamento se forem

transferidas diretamente para meio de enraizamento, ou mesmo, dar origem a

mudas de baixa qualidade para a fase de aclimatização (SILVA, 2004). Entretanto,

uma das formas de estimular o crescimento das brotações é através da adição do

ácido giberélico (AG3) ao meio de cultura, o qual promove o aumento do

comprimento das mesmas, devido ao estímulo da expansão e alongamento das

células (MÉTRAUX, 1987).

Diante do exposto, objetivou-se, com o presente trabalho, desenvolver um

protocolo de estabelecimento, de multiplicação, onde foram testadas duas fontes de

citocinina e diferentes meios de cultivo, e de alongamento in vitro de brotações de

ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, com a finalidade de obter de

material micropropagado para realizar experimentos de regeneração, a patir de

explantes foliares, e produzir mudas em larga escala através do enraizamento das

brotações.

2.2 Material e métodos

Mudas da ameixeira japonesa (P. salicina Lindl.), cv. América, enxertadas

sobre porta-enxerto de caroços de pessegueiros oriundos da indústria de conserva

com 10 meses de idade, foram cultivadas em casa-de-vegetação, tratadas com

fungicida e bactericida (benlate 0,6mg dm-3 e agrimicina 2,4mg dm-3), a cada dois

dias, por duas semanas antecedentes à coleta do material para o estabelecimento in

vitro.


América

Ramos vegetativos semi-estiolados, em desenvolvimento, com cerca de

50cm de comprimento, foram colhidos e transferidos para o laboratório, sendo então

retiradas as folhas e descartada a parte apical com os dois primeiros nós. O restante

dos ramos foi dividido em dois segmentos: do terceiro ao sexto nó, a contar-se do

ápice para a base, constituindo os explantes apicais e do sétimo ao décimo nó,

49

constituindo os explantes basais. Estes explantes constituíram-se de segmentos

nodais, com aproximadamente 0,5cm de comprimento, contendo uma gema axilar.

Em câmara de fluxo laminar, os explantes foram desinfestados sendo

inicialmente imersos em álcool 70% por um minuto, em hipoclorito de sódio 1,5%

durante 20 minutos, sob agitação e, posteriormente, lavados com água destilada

autoclavada três vezes.

Os explantes apicais e basais foram inoculados em tubos de ensaio

contendo 5cm3 de meio MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) solidificado com ágar (7g

dm-3) e pH ajustado para 5,8. O material foi mantido em sala de crescimento, por

sete dias no escuro, para evitar a oxidação, posteriormente transferidos para luz com

condições de luz e temperatura controladas (42µmol m-2 s-1 de densidade de fluxo

de fótons, fotoperíodo de 16 horas de luz e temperatura de 25 ± 1ºC, durante o

período de luz e 23 ± 1ºC, durante o período de escuro).

Após 30 dias, foram avaliados os seguintes parâmetros: porcentagem de

explantes brotados, oxidados e contaminados, comprimento médio das brotações

iniciais (cm), número médio de gemas e de folhas formadas. O delineamento

experimental foi inteiramente casualizado, sendo analisadas 100 repetições para

cada tipo de explante. Cada repetição foi constituída pelo tubo de ensaio contendo

um segmento nodal. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e as

médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey com 5% de

probabilidade de erro.


América

Segmentos nodais das brotações estabelecidas e multiplicadas in vitro, com

aproximadamente 0,5cm de comprimento contendo uma gema, foram inoculados em

frascos contendo meio MS suplementado com duas citocininas, BAP e 2iP, nas

concentrações de 0; 0,25; 0,5; 0,75 e 1,0mg dm-3, constituindo o primeiro

experimento de multiplicação. O mesmo tipo de explante foi empregado no segundo

experimento, os quais foram inoculados nos meios MS, MS com ⅓ da concentração

dos sais de NH4NO3 e KNO3 (MS ⅓ do N), e WPM, acrescidos de 100mg dm-3 de

inositol, 3% de sacarose e 0,3mg dm-3 de BAP.

O pH de todos os meios foi ajustado para 5,8 antes da adição do ágar (7g

dm-3) e autoclavado a 121ºC por 20 minutos. Em capela de fluxo laminar, procedeu-

50

se a inoculação dos explantes nos meios de cultura, os quais foram posteriormente

mantidos em sala de crescimento com temperatura de 25 ± 2ºC, fotoperíodo de 16

horas de luz e densidade de fluxo de fótons de 48µmol m-2 s-1.

Avaliou-se, após 40 dias o comprimento médio das brotações (cm), número

médio de brotos (sendo considerados brotos, as gemas com internó alongado, com

cerca de 0,5cm de comprimento) e de gemas por explante, assim como média da

massa seca das brotações (mg), obtida com auxílio de estufa de ventilação forçada,

mantida a 70ºC, e balança analítica com quatro casas de precisão, até que a massa

das brotações se tornasse constante.

O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, para ambos os

experimentos. O primeiro, composto por um fatorial 2x5, representado por duas

citocininas e cinco concentrações, contendo oito repetições, cada uma representada

por um frasco com cinco explantes. O segundo experimento foi unifatorial (tipo de

meio), constituído por 12 repetições por tratamento, cada uma representada por um

frasco com cinco explantes.

Os experimentos foram repetidos duas vezes e os dados obtidos foram

submetidos à análise de variância. No primeiro experimento foi realizada análise de

regressão polinomial e, para o segundo ensaio, teste de médias, onde as médias

dos tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey com 5% de probabilidade de

erro, através do programa estatístico WinStat 2.0 (MACHADO; CONCEIÇÃO, 2003).


japonesa cv. América

Depois de multiplicadas, devido às brotações apresentarem aspecto de

roseta, com internós muito curtos e folhas pequenas, as mesmas foram utilizadas

para realizar dois experimentos independentes de alongamento, onde brotações

(aproximadamente 0,5cm) cultivadas em meio MS com 0,3mg dm-3 de BAP foram

inoculados em frascos contendo meio MS suplementado com ácido giberélico (AG3)

nas concentrações de 0; 0,25; 0,50; 0,75 e 1,0mg dm-3, com adição de 2,0g dm-3 de

carvão vegetal ativado, para realizar o primeiro experimento de alongamento.

Como não foi observado um alongamento desejado com os meios citados

acima, foi realizado um segundo experimento, com concentrações mais elevadas de

AG3 (0; 1; 5 e 10mg dm-3), na presença ou ausência de carvão ativado. Para ambos

51

os experimentos de alongamento, os frascos foram mantidos por 40 dias em sala de

crescimento, nas condições descritas anteriormente.

Após o período de incubação, foram avaliados: comprimento médio das

brotações (cm), número médio de brotos (sendo considerados brotos, as gemas com

internó alongado, com cerca de 0,5cm de comprimento) e de gemas por explante e

massa seca das brotações (mg), onde o material vegetal foi seco em estufa de

ventilação forçada à 70ºC.

O delineamento experimental, para os experimentos de alongamento foram

inteiramente casualizados, contendo, no primeiro ensaio, cinco repetições,

representadas por um frasco com cinco explantes e, no segundo, um fatorial 4x2,

com quatro concentrações de AG3 e meios acrescidos ou não de carvão vegetal,

contendo quatro repetições, cada uma compostas por um frasco com seis explantes.

Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e de regressão

polinomial, através do programa estatístico WinStat 2.0 (MACHADO; CONCEIÇÃO,

2003).

2.3 Resultados e discussão


América

No estabelecimento in vitro obteve-se 76,19% e 83,33% de sobrevivência

dos explantes apicais e basais, respectivamente. Em valores absolutos, a

percentagem de contaminação foi maior para os explantes apicais (20%) do que

para os basais (9,38%), ocorrendo, entretanto, maior percentagem de oxidação nos

explantes basais (Tab. 1), sendo que este fenômeno pode estar relacionado à maior

lignificação do material e maior presença de compostos fenólicos.

Tabela 1 - Percentagem de contaminação e de oxidação dos explantes com gemas apicais e basais de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, após 30 dias do estabelecimento in vitro em meio MS. UFPel, Pelotas/RS, 2010

Contaminação (%) Tipo de explantes

Explantes sobreviventes (%) Fungo Bactéria

Oxidação (%)

Apicais 76,19 6,67 13,33 3,81 Basais 83,33 3,13 6,25 7,29

52

O percentual de contaminação observado no presente trabalho foi maior do

que os registrados por Rocha et al. (2007b), no estabelecimento in vitro de porta-

enxerto de Prunus, cv. Tsukuba, os quais obtiveram 3,32% explantes contaminados

por fungo e bactéria. Enquanto que Silva et al. (2003) obtiveram percentuais de

contaminação que variaram de 14,8% a 29,8% no estabelecimento in vitro dos porta-

enxertos Capdeboscq, GF677 e VP411, respectivamente.

Conforme Erig e Schuch (2003a), e Donini et al. (2008a), as espécies

frutíferas lenhosas apresentam dificuldades para o estabelecimento in vitro,

principalmente devido à contaminação e oxidação (ERIG; SCHUCH, 2003a; DONINI

et al., 2008a).

De acordo com Montarroyos (2000), Couto et al. (2004) e Fachinello e

Bianchi (2005) o alto percentual de contaminação (bacteriana e fúngica) e oxidação

dos explantes são os principais problemas observados durante o estabelecimento in

vitro de Prunus. Entretanto, esses autores, citam que a redução de explantes

contaminados durante esta etapa pode ser obtida pela manutenção das plantas-

matrizes sob condições controladas, em casa-de-vegetação, com realização

periódica de tratamento fitossanitário, conforme realizado no presente estudo.

As variáveis comprimento médio das brotações, número de folhas e de gemas

apresentaram diferença estatística significativa em relação ao tipo de explante

utilizado, sendo que os explantes basais apresentaram médias superiores aos

apicais (Fig. 1, Apêndice B1).

No presente trabalho os explantes utilizados para o estabelecimento in vitro

continham meristemas secundários, indicados para propagação clonal in vitro, por

possuírem determinação para o crescimento vegetativo e, quando supridas as

necessidades nutricionais e hormonais, irão se desenvolver em novas brotações e

plantas (GRATAPAGLIA; MACHADO, 1998; TAIZ; ZEIGER, 2009).

Seu desenvolvimento se dá através de divisões celulares que requerem

substâncias de reserva, por isso o tamanho do explante é um fator que pode

determinar sua possibilidade de sobrevivência e capacidade de crescimento inicial in

vitro. Assim, é possível considerar que o resultado obtido no presente trabalho esteja

relacionado, provavelmente, à maior quantidade de reservas presentes nos

explantes mais lignificados (basais), do que nos explantes apicais.

53

Figura 1 - Comprimento médio das brotações (cm), número médio de folhas e de

gemas formadas nos explantes de gemas apicais e basais (a) e aspecto das brotações iniciais de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, a partir de explantes apicais (b) e basais (c), após 30 dias do estabelecimento in vitro em meio MS. As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010.


América

A multiplicação in vitro é uma etapa muito importante que promove um

aumento clonal das brotações, mantendo a integridade genética e sanitária do

material vegetal.

Sendo assim, no primeiro experimento, com base no resultado da análise de

variância, verificou-se interação significativa entre os fatores para todas as variáveis

analisadas, comprovando que, nas condições em que foi realizado esse

experimento, as diferentes concentrações e tipos de citocininas utilizadas

proporcionam respostas distintas nas brotações de ameixeira japonesa, cv. América,

exceto para a variável média da massa seca das brotações (Apêndice B2).

Para o comprimento médio das brotações as maiores médias foram

observadas quando o cultivo foi realizado em meio de cultura com adição de BAP,

independente da concentração utilizada. Explantes cultivados em meio acrescido de

BAP apresentaram uma resposta quadrática para esta variável, onde o valor máximo

estimado foi de 1,34cm com 0,68mg dm-3 de BAP (Fig. 2, Apêndice B3). Esse

resultado foi melhor que o obtido por Leontiev-Orlov et al. (2000b), na multiplicação

in vitro de prunáceas, que obtiveram comprimento médio dos brotos de 0,44cm,

b

c

a

0,821,831,25

2,48

8,65

13,21

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Comprimento médio dasbrotações iniciais (cm)

Número médio de folhas Número médio de gemas

Explantes apicais Explantes basais

54

utilizando 0,25mg dm-3 de BAP. Já, nos tratamentos com adição de 2iP, não houve

efeito significativo nas diferentes concentrações, obtendo-se 0,92cm de comprimento

médio das brotações (Fig. 2, Apêndice B3).

yBAP = 0,7493 + 1,743x - 1,28x2

R2 = 76,54

y2iP = 0,916 ns*

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

0 0,25 0,5 0,75 1Concentrações dos reguladores de crescimento (mg dm-3)

Com

prim

ento

méd

io d

as

brot

açõe

s (c

m)

BAP 2iP

Figura 2 - Comprimento médio das brotações de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro, em função do tipo de regulador de crescimento (BAP e 2iP) e suas concentrações (0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0mg dm-3). As barras representam o erro padrão da média. ns* equação de regressão polinomial não significativa. UFPel, Pelotas/RS, 2010.

Assim como no presente trabalho, para multiplicação in vitro de Prunus spp.,

Rogalski e Leontiev-Orlov (1999), Leontiev-Orlov et al. (2000a) e Rogalski et al.

(2003), obtiveram um maior comprimento de brotos por explante em meios

suplementados BAP nas concentrações entre 0,5 - 1,0mg dm-3. Enquanto que,

Arena e Caso (1992), obtiveram maior comprimento de brotos do mesmo gênero

com adição de 1,0mg dm-3 de BAP.

Com relação ao número médio de brotos e de gemas, os meios

suplementados com BAP apresentaram uma tendência linear crescente para o

número de brotos variando de 1,28 a 4,01 e uma resposta quadrática para o número

de gemas por explante com valor máximo estimado de 14,16 na concentração de

0,61mg dm-3 de BAP (Fig. 3a, 3b e Apêndice B4). Em contrapartida, as brotações

mantidas em meio com 2iP, mais uma vez, não apresentaram respostas

significativas, indepedente das concentrações testadas, com médias menores que

55

as obtidas nas brotações cultivadas em meio suplementado com BAP, com 1,17

brotos e 9,02 gemas por explante (Fig. 3a, 3b e Apêndice B4).

Figura 3 - Número médio de brotos (a) e de gemas (b) por explante das brotações de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro em função do tipo de regulador de crescimento (BAP e 2iP) e suas concentrações (0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0mg dm-3). As barras representam o erro padrão da média. ns* equação de regressão polinomial não significativa. UFPel, Pelotas/RS, 2010.

Os resultados do presente trabalho foram semelhantes aos encontrados por

Souza et al. (2008), em estudos de multiplicação in vitro de Eugenia uniflora L.

submetida a diferentes citocininas (BAP, zeatina e 2iP) e suas concentrações (0, 5 e

10µM), onde o acréscimo de BAP apresentou as melhores respostas para o número

de gemas (3,96). Enquanto que, para o número de brotos o BAP gerou melhores

resultados (2,35 na concentração de 0,5mg dm-3), seguido da zeatina e 2iP.

Entretanto, Erig et al. (2002), obtiveram o maior número de brotações em estudos

com Rubus idaeus L., em meios suplementados com BAP nas concentrações de 0,5 e

1,0mg dm-3 (0,67 e 0,87, respectivamente) e maior número de gemas (6,26) na

concentração de 0,5mg dm-3 de BAP.

Novák e Juvová (1983) comprovaram que, em videira, o BAP foi a citocinina

mais eficiente, sendo superior à cinetina e 2iP para estimular a proliferação de novas

brotações. Diversos autores tais como Barlass e Skene (1980), Goussard (1981) e

Gray e Benton (1990), também observaram a superioridade de BAP em relação a

outras citocininas no cultivo in vitro de videiras (Vitis vinifera L.).

O tipo e concentração de citocinina utilizado nos meios de cultura são

específicos para espécies e/ou cultivar. Na multiplicação de porta-enxertos de

ameixeiras, Morini e Loretti (1991) obtiveram bons resultados utilizando 0,4mg dm-3

yBAP = 2,8895x + 1,3077

R2 = 97,78

y2iP = 1,168 *ns

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

5

0 0,25 0,5 0,75 1Concentrações dos reguladores de crescimento (mg dm-3)

Núm

ero

méd

io d

e br

otos

por

ex

plan

te

BAP 2iP

yBAP = -14,4314x2 + 17,5764x + 8,8126

R2 = 74,46

y2iP = 9,02 *ns

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 0,25 0,5 0,75 1Concentrações dos reguladoresde crescimento (mg dm-3)

Núm

ero

méd

io d

e ge

mas

por

expl

ante

BAP 2iPa b

56

de BAP, enquanto Alderson et al. (1987) e Arena e Caso (1992) obtiveram melhores

resultados utilizando 1,0mg dm-3 de BAP.

O cultivo dos explantes na presença de BAP, em concentrações entre 0,61 -

0,68mg dm-3, proporcionou a obtenção de um maior número de brotações e de

gemas, com um razoável alongamento, quando comparadas àquelas cultivadas em

meios com adição de 2iP. Entretanto, explantes cultivados nas concentrações de

0,5mg dm-3 de BAP, e acima desta, desenvolveram brotações com elevado número

de gemas (12,88) e com 2,19 brotos por explante, o que indicaria uma elevada taxa

de multiplicação. Porém, as brotações formadas nestas condições, apresentaram

internós curtos, dando à planta um aspecto de roseta (Fig. 4), dificultando o

manuseio das mesmas e reduzindo a taxa de sobrevivência das brotações muito

pequenas, durante as repicagens.

Figura 4 - Brotações de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro em meio MS acrescido de citocininas (BAP e 2iP) em diferentes concentrações (0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0mg dm-3). UFPel, Pelotas/RS, 2010.

Resultados similares foram encontrados por Leontiev-Orlov et al. (2000b) e

Pérez-Tornero et al. (2000) na multiplicação in vitro de prunáceas, onde observaram

que a presença de BAP no meio ocasionou alta taxa de multiplicação, formando um

grande número de brotos por explante, porém, concentrações crescentes desta

citocinina inibiram o alongamento das brotações. A redução no alongamento das

brotações com o aumento da concentração de BAP também foi observada por

Dustan et al. (1992) em espécies de frutíferas lenhosas.

Geralmente, o alongamento das brotações é inibido com o aumento da

concentração de BAP no meio de cultura. De acordo com Rocha et al. (2007a) isso

ocorre porque, em alguns casos, o aumento do número de brotações formadas por

57

explante faz com que ocorra uma competição pela absorção de sais minerais e

vitaminas do meio de cultura, tornando-se fator limitante para o seu alongamento.

Mesmo assim, o BAP é um componente essencial do meio de multiplicação para

Prunus spp., sendo sua presença necessária para a sobrevivência e subsequente

multiplicação das gemas (CHIARIOTTI; ANTONELLI, 1988; WAGNER JÚNIOR, et

al., 2003).

Além disso, essa resposta é justificada pelo fato de que as citocininas, de

modo geral, induzem a produção da parte aérea dos cultivos in vitro, mas seu

excesso pode ser tóxico e levar a formação de um grande número de brotações com

tamanho muito pequeno, caracterizado por internós curtos, folhas de tamanho

reduzido e engrossamento exagerado dos caules, causando sérios problemas para

as demais etapas da micropropagação (LESHEN et al., 1988; PASQUAL, 2001;

LIMA et al., 2008), inclusive na fase de enraizamento (SANTO-SEREJO et al., 2006;

LESHEM et al., 2008).

Na multiplicação in vitro de ameixeiras, Rogalski e Leontiev-Orlov (1999) e

Leontiev-Orlov et al. (2000a) observaram que a presença de BAP no meio provoca

alta taxa de multiplicação, formando um grande número de brotos por explante,

porém com um pequeno comprimento médio das brotações. Esse efeito também foi

observado por Dustan et al. (1992), comprovando que a adição de BAP ao meio,

nem sempre proporciona alongamento adequado.

O BAP é uma das citocininas de menor custo, além de ser encontrada

naturalmente nas plantas, por isso tem sido muito eficaz na multiplicação de diversas

espécies, provavelmente, devido à capacidade dos tecidos vegetais metabolizarem

os hormônios de ocorrência natural mais rapidamente (GRATTAPAGLIA;

MACHADO, 1998).

Não houve diferença significativa entre os fatores tipo de citocinina e suas

concentrações para a média da massa seca das brotações (Apêndice B2). Porém,

foi possível observar diferença significativa entre os fatores quando analisados

isoladamente. As brotações cultivadas no meio acrescido de BAP apresentaram

maiores médias de massa seca (19,08mg) em relação às brotações submetidas ao

2iP (14,26mg) (Fig. 5a).

Em relação às diferentes concentrações de citocininas utilizadas, foi possível

observar uma relação diretamente proporcional entre o aumento da matéria seca

das brotações e as crescentes concentrações das citocininas (Fig. 5b). Esse

58

comportamento justifica-se pelo fato das citocininas estimularem a multiplicação

celular e proliferação de gemas axilares, promovendo maior produção de parte aérea

e, consequentemente, de massa seca (TORRES et al., 1998). A resposta observada

para essa variável, no presente trabalho, diverge da encontrada por Dutra et al.

(2004), em trabalhos de multiplicação in vitro de oliveira (Olea europaea L.), no qual, a

medida em que se aumentou a concentração de BAP, houve redução dessa

variável.

Figura 5 - Média da massa seca (mg) das brotações de ameixeira japonesa (Prunus

salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro em função da adição de citocininas (BAP e 2iP) (a) e suas concentrações (0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0mg dm-3) (b). As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010.

No segundo experimento de multiplicação, no qual foram testados diferentes

meios de cultura, a análise de variância foi significativa apenas para o número de

brotos por explante e para a massa seca das brotações, apresentando melhores

resultados no meio MS com 11,65 brotos por brotação e 24,42mg, respectivamente

(Fig. 6b, 6c e Apêndice B5). Enquanto que o comprimento médio das brotações e o

número de gemas apresentaram em média 1,53cm e 10,65 brotos por explante,

respectivamente (Fig. 6a e 6c, respectivamente, Apêndice B5).

Esses resultados foram superiores ao encontrados por Radmann et al.

(2009) em porta-enxertos de Prunus ‘GxN-9’, onde o maior índice de brotos por

brotação foi de 3,37 nos meios MS e QL, superiores as brotações cultivadas nos

meios WPM e MS com ½ dos sais nitrogenados. Em contrapartida, Machado et al.

(2007) identificaram que meios com concentrações inferiores de sais, como o QL,

proporcionaram maior número de brotos e comprimento das brotações em relação

yBAP = 13,894 + 5,555x

R2 = 82,17

0

5

10

15

20

25

0 0,25 0,5 0,75 1

Concentrações dos reguladores de crescimento (mg dm-3)

Méd

ia d

a m

assa

sec

a da

s br

otaç

ões

(mg)

a b

19,08

14,26

0

5

10

15

20

25

BAP 2iPTipo de citocinina

Méd

ia d

a m

assa

sec

a da

s br

otaç

ões

(mg)

59

aos meios MS e WPM no cultivo in vitro de videira. Assim como Couto et al. (2004),

constataram maior multiplicação de porta-enxertos de Prunus ‘Barrier’ e ‘Cadaman’

com 50% de redução dos sais do meio MS, da mesma forma, o porta-enxerto ‘GxN-

22’ apresentou respostas superiores, quando explantes foram cultivados em meio

MS ¾, comparado ao meio MS na sua concentração plena (SILVEIRA et al., 2001).

Já, Rocha (2006b) não constatou efeito com diferença significativa entre os meios

QL e MS para os porta-enxertos de Prunus ‘Mr. S. 2/5’ e ‘Sírio’.

Figura 6 - Comprimento médio das brotações (cm) (a); número médio de gemas e de brotações por explante (b); média da massa seca das brotações (mg) (c); aspecto geral das brotações de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro em função dos diferentes meios de cultura. As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010.

Quando cultivados em meio MS, os explantes produziram maior número de

brotos e massa seca das brotações, diferindo significativamente dos demais

tratamentos (Fig. 6c e 6b, respectivamente), além de apresentarem melhores

características morfológicas das brotações (Fig. 6d), em relação aos demais meios

testados no presente trabalho. Essa resposta, provavelmente, ocorreu devido a

4,051,99 2,69

11,65 10,11 10,2

02468

101214

MS MS ⅓ do N WPM

Número de brotos por explante Número de gemas por explante

c d

1,651,441,5

0

0,5

1

1,5

2

MS MS ⅓ do N WPM

Com

prim

ento

méd

io d

as

brot

açõe

s (c

m)

a b

21,16

14,38

24,42

0

5

10

15

20

25

30

MS MS ⅓ do N WPM

Méd

ia d

a m

assa

sec

a da

s br

otaç

ões

(mg)

60

maior concentração de sais do meio MS, característica destacada por Krikorian

(2002), que proporciona ganhos significativos no crescimento de tecidos e células

em diversas espécies de plantas, tornando-o o meio nutritivo mais utilizado em

trabalhos de cultura de tecidos vegetais (PASQUAL, 2001). Os dados obtidos estão

de acordo com os encontrados por Santa-Catarina et al. (2001), os quais

observaram que o meio MS promoveu maior indução de brotos (2,5) quando

comparado às brotações cultivadas no meio QL (1,4), para o porta-enxerto de

macieira ‘Seleção 69’.

Dentre os vários elementos minerais que compõem os meios de cultura, o

nitrogênio é o componente mais importante (CHAWALA, 2002). Entretanto, a

insuficiência de qualquer um dos minerais pode causar mudanças bioquímicas,

fisiológicas e morfológicas nas plantas, de acordo com o nutriente e a deficiência

causada (PREECE, 1995; MONTEIRO et al., 2000). Apesar de não ter sido

verificado desordens no desenvolvimento da cv. América, diluições nas

concentrações dos sais são frequentemente utilizadas para espécies lenhosas,

sendo que a redução da concentração da fonte de nitrogênio, principalmente na

forma amoniacal, tem sido utilizada para combater a vitrificação (GRATTAPAGLIA;

MACHADO, 1998).

De acordo com Radmann et al. (2009), o meio MS, que apresenta elevada

concentração de sais em sua composição, propiciou a vitrificação de brotações de

porta-enxerto de Prunus ‘GxN-9’ quando comparado com o meio MS com apenas ¾

da concentração dos sais e vitaminas. Os mesmos autores também verificaram

diminuição da vitrificação das brotações cultivadas no meio MS com ½ dos sais

nitrogenados em relação ao meio MS em sua constituição completa, não

apresentando sintomas de vitrificação nas brotações cultivadas no meio MS. Sendo

que estas características não foram observadas no presente trablho.



Diante dos resultados obtidos no experimento de multiplicação, uma etapa

adicional - de alongamento – tornou-se necessária, uma vez que o BAP, nas

maiores concentrações testadas, proporcionou aumento na taxa de multiplicação,

porém ocorreu a produção de brotações com internós curtos o que ocasiona a

redução no comprimento das brotações.

61

No primeiro experimento de alongamento, houve diferença significativa

apenas para a variável comprimento médio das brotações, apresentando uma

resposta linear crescente com o aumento da concentração de AG3 (Fig. 7a, 7b,

Apêndices B6 e B7), variando de 1,12 a 1,82cm.

Figura 7 - Comprimento médio das brotações (a) e aspecto das brotações (b) de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro em função da adição AG3 nas concentrações de 0; 0,25; 0,50; 0,75; 1,0mg dm-3, acrescido de 2,0mg dm-3 de carvão vegetal ativado. As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010.

Para as demais variáveis analisadas não houve diferença significativa, em

relação às diferentes concentrações de giberelina adicionadas ao meio de cultivo,

apresentando em média 9,98 gemas por explante, 1,12 brotos por explante e massa

seca de 20,09mg por brotação formada por explante (Apêndices B6 e B7).

No segundo experimento de alongamento, houve interação significativa

entre os fatores apenas para a variável comprimento médio das brotações (Apêndice

B8). Verificou-se incremento linear dessa variável para as brotações cultivadas em

meio com adição de carvão vegetal, de acordo com o aumento da concentração

AG3, apresentando valores entre 1,14 a 3,50cm. Entretanto, as brotações mantidas

em meio sem adição de carvão vegetal, de acordo com a análise de regressão

polinomial, apresentaram uma resposta quadrática, com um valor máximo estimado

em 2,41cm com a adição de 6,74mg dm-3 de AG3 (Fig. 8a, Apêndice B9).

b y = 0,637x + 1,07

R2 = 85,75

0,5

0,7

0,9

1,1

1,3

1,5

1,7

1,9

2,1

2,3

0 0,25 0,5 0,75 1

Concentrações de AG3 (mg dm-3)

Com

prim

ento

méd

io d

as b

rota

ções

(cm

)

a

62

Figura 8 - Comprimento médio (a) e aspecto das brotação (b) de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro em meio MS suplementado com AG3 nas concentrações de 0; 1; 5 e 10mg dm-3 na presença ou ausência de carvão vegetal ativado. As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010.

Provavelmente esta resposta diferencial tenha ocorrido pelo fato do carvão

vegetal funcionar como um adsorvedor dos produtos provenientes do metabolismo

vegetal, bem como substâncias hormonais e vitaminas (GEORGE; SHERRINGTON,

1984; TORRES et al., 2001). O carvão vegetal tem a capacidade de reter os

nutrientes no meio de cultura, disponibilizando estes compostos de forma gradual

para a absorção da brotação.

Desta forma, explica-se a resposta observada no presente estudo, onde os

explantes submetidos ao meio de cultura acrescido de carvão vegetal possivelmente

tiveram a disponibilização do regulador de crescimento de forma controlada, de

maneira que durante o período de exposição ao AG3, não foi suficiente para

determinar o ponto máximo e posterior queda no alongamento, enquanto que os

explantes cultivados na ausência do mesmo, atingiram um ponto de máximo para o

comprimento das brotações (2,41cm), com posterior decréscimo, demonstrando que

concentrações acima de 6,74mg dm-3 de AG3 na ausência de carvão vegetal são

prejudiciais para esta característica.

Assim como no presente trabalho, diversos estudos relataram o efeito

benéfico do carvão ativado no alongamento de brotações para inúmeras espécies

frutíferas. De acordo com Roy (1995), o carvão vegetal já foi empregado na

multiplicação in vitro videira, ameixeira, framboeseira, morangueiro, macieira,

y = 0,202x + 1,26

R2 = 83,19

y = -0,027x2 + 0,3641x + 1,1847

R2 = 96,29

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Concentração de AG3 (mg dm-3)

Com

prim

ento

méd

io d

as

brot

açõe

s (c

m)

Com carvão ativado Sem carvão ativadoa b

63

abacaxizeiro e bananeira. Outros autores relatam que o carvão vegetal ativado, no

meio de cultivo, proporcionou aumento no comprimento das brotações de Podocarpus

henkelii Stapf ex Dallim. Jacks (KOWALSKI; STADEN, 2001), Zea mays L.

(MOHAMED-YASSEEN, 2001) e Acacia mearnsii (De Wild.) (QUOIRIN et al., 2001).

O número médio de gemas e de brotos, assim como a massa seca das

brotações, não apresentou diferença significativa em relação aos níveis dos fatores

analisados (concentração de AG3 e presença ou ausência de carvão vegetal no meio

de cultivo), no quarto experimento. Sendo registrado, em média, 1,34 brotos, 10,01

gemas e 16,53mg de matéria seca por brotação (Apêndice B8).

Mesmo tendo promovido aumento significativo no comprimento das

brotações, concentrações de ácido giberélico iguais ou superiores a 5mg dm-3 foram

prejudiciais para o seu desenvolvimento, por promoverem abscisão foliar e, com

10mg dm-3, além desta característica, foi possível observar necrose apical,

demonstrando o efeito tóxico dessas concentrações no cultivo in vitro da cultivar

América (Fig. 8b).

A necrose apical e abscisão foliar são efeitos que podem ter sido

provocados pelo excesso de etileno, o qual é estimulado pelas auxinas, sendo que a

síntese desse regulador pode, por sua vez, ser estimulada pelas giberelinas, as

quais foram adiciondas em excesso no meio de cultivo, causando um efeito em

cascata (TAIZ; ZEIGER, 2009). Outra possível causa para a necrose apical pode ser

decorrente da má distribuição do cálcio na planta (COLLIER; TIBBITTS, 1982). Já

que esse nutriente é translocado juntamente com a água pelos vasos do xilema

(COLLIER; HUNTINGTON, 1983) e, uma vez depositado, não apresenta

redistribuição para outras partes da planta, sendo acumulado principalmente nos

tecidos que tranpiram mais facilmente (MILLAWAY; WIERSHOLM, 1979).

Desta forma, o seu teor nos tecidos ocorre de acordo com a taxa de

transpiração, os órgãos que apresentam dificuldade para transpirar, como no caso

de plantas micropropagadas, por estarem sujeitas a microclima com elevada

umidade relativa, apresentam baixa translocação de cálcio acarretando fornecimento

inadequado para os tecidos, ocasionando a necrose apical, principalmente nas

extremidades das folhas em desenvolvimento (COLLIER; TIBBITTS, 1982). Além

disso, segundo Thibodeau e Minotti (1969) e Nagata e Stratton (1994), condições

que favoreçam o rápido crescimento da planta também aumentam a incidência deste

fenômeno.

64

Este efeito prejudicial ao desenvolvimento das brotações, também foi

observado por Mishra et al. (1999), em estudos realizados com Emblica officinalis

Gaertn., onde 1,0mg dm-3 de AG3 promoveu o alongamento dos internós, enquanto

que 3,0mg dm-3 causou desfolhamento de algumas brotações. Da mesma forma,

Deccetti (2000) relatou o efeito danoso do AG3 no desenvolvimento de brotações de

Annona glabra L., causando queda das folhas e necrose apical. No entanto, vários

autores tais como Reeves et al. (1985), Figueredo et al. (2001) e Rocha et al. (2009)

ressaltam a necessidade da adição de AG3 no meio para o alongamento das

brotações de Prunus cv. ‘St. Julien A’; Rollinia mucosa Jacq. e Prunus, cv. Mr. S. 2/5,

respectivamente.

2.4 Conclusão

Nas condições em que foram realizados os experimentos, é possível concluir

que:

- O estabelecimento in vitro de explantes basais de P. salicina, cv. América, é

superior ao de explantes apicais, formando brotações iniciais maiores, com maior

número de gemas e de folhas;

- O BAP é a citocinina que induz a formação de brotações com melhor

aspecto, maior número de brotos e de gemas, em relação ao 2iP;

- Concentrações elevadas de BAP induzem altas taxas de multiplicação,

porém com brotos pequenos que inviabilizam sua utilização nas etapas posteriores

do processo de multiplicação;

- O meio MS acrescido de 0,3mg dm-3 de BAP é mais adequado para a

multiplicação in vitro de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América.

- O meio de cultivo MS suplementado com carvão vegetal ativado, acrescido

de 1,0mg dm-3 de AG3, é o mais adequado para o alongamento in vitro de brotações

de ameixeira japonesa, cv. América.

65

Capítulo 3

Enraizamento in vitro e aclimatização de brotações de ameixeira


66

Enraizamento in vitro e aclimatização de brotações de ameixeira japonesa cv.

América

3.1 Introdução

O Brasil, apesar de ser o maior produtor mundial de frutas, possui uma

pequena participação no mercado internacional, sendo que nos últimos anos, a

quantidade de frutas tropicais para exportação, vem aumentando (REETZ et al.,

2007). Dentre as frutíferas, a cultura da ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.)

ocorre principalmente nos Estados do Rio Grande do Sul e Santa Catarina

(CASTRO, 2003). A cultivar América é umas das preferidas no sul do RS, devido às

suas características organolépticas e adaptação às condições edafoclimáticas dessa

região (REVERS; MACHADO, 2005), porém, apresenta problemas de produção

quando o pomar não é manejado adequadamente ou as mudas são de baixa

qualidade genético-sanitária.

A produção de mudas de espécies frutíferas está baseada na multiplicação

vegetativa, por assegurar a uniformidade genética dos indivíduos e as

características da planta-matriz (DUTRA et al., 1999; MAYER et al., 2001). Na

ameixeira, a produção de mudas é realizada principalmente por enxertia de gema

ativa, nos meses de novembro a janeiro (NACHTIGAL; PEREIRA, 2000).

No Brasil, devido a ausência de um sistema de certificação da produção de

mudas de prunoídeas, não existe um adequado controle genético-sanitário do

material utilizado na propagação, potencializando a disseminação de pragas e

patógenos via material propagativo, além de resultar em mudas de baixa qualidade

(BIANCHI; FACHINELLO, 2005).


de melhorar esse sistema de produção. Desta forma, a cultura de tecidos tem se

67

apresentado como uma alternativa potencialmente viável para clonagem de

espécies lenhosas e produção comercial de mudas clonais, permitindo controlar

diversas variáveis responsáveis pelo desenvolvimento da planta (ASSIS; TEIXEIRA,

1999), possibilitando a multiplicação de plantas livres de doenças, em um curto

espaço de tempo, independente da época do ano (COUTO et al., 2004).

Dentre as etapas da micropropagação, o enraizamento in vitro é controlado

e determinado geneticamente, variando entre espécies e cultivares (ASSIS;

TEIXEIRA, 1999), sendo considerado um dos principais fatores limitantes para o

estabelecimento de protocolos gerais desse processo para espécies do gênero

Prunus (ROGALSKI et al., 2003b). Portanto, o sucesso dessa tecnologia em escala

comercial, depende da capacidade de aclimatização das plantas cultivadas in vitro

com baixo custo e com elevadas taxas de sobrevivência, tendo em vista que,

geralmente, ocorre um alto índice de mortalidade dessas plantas durante o

transplantio (HAZARIKA, 2006).

Após a rizogênese das brotações é que são constituídas as plantas

completas, aptas a serem aclimatizadas às condições ex vitro (HU; WANG, 1983;

RADMANN et al., 2002). Logo, a obtenção de uma planta com um sistema radicular

bem desenvolvido é de grande importância para a sua sobrevivência e crescimento

nas novas condições ambientais.

Foi observado, em espécies florestais, que a sobrevivência das plantas na

fase de aclimatização, também depende do desenvolvimento de um bom sistema

vascular entre a parte aérea e as raízes (SOMMER; CALDAS, 1991), pois raízes

originadas a partir de calos apresentam a função de absorção de água e nutrientes

comprometida, resultando na morte das mudas quando transferidas para o solo

(RADMANN et al., 2002).

Para a indução do enraizamento in vitro, geralmente, os meios de cultura

são acrescidos de diferentes tipos e concentrações de auxinas, sendo esses fatores

que mais influenciam no sucesso do enraizamento (HARTMANN et al., 2002;

ROCHA, 2006b). Essas substâncias atuam na expansão, divisão e alongamento

celular na cultura de tecidos, principalmente durante a etapa de enraizamento

(KRIKORIAN, 1991; ROSS, 1992), além de estimularem a síntese do etileno que

favorece a emissão das raízes (HINOJOSA, 2000; NORBERTO et al., 2001).

Na maioria das vezes, os explantes não iniciam o processo de enraizamento

em meios com concentrações altas de sais no meio de cultivo, mesmo na presença

68

de auxinas. Portanto, durante a rizogênese, o meio utilizado tem as concentrações

de sais reduzidas para 1/2, 1/3 ou 1/4, melhorando esse processo (ZIMMERMAN;

BROOME, 1982; DRUART et al., 1982; HU; WANG, 1983; ANDERSON, 1984;

VALLES; BOXUS, 1987; McCOWN, 1988; GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998;

PINTO; LAMEIRA, 2001; PASQUAL, 2001; SOUZA et al., 2004; LIMA, 2004;

SOUZA; PEREIRA, 2007).

Durante a aclimatização a maioria das plantas oriundas do cultivo in vitro

sofre desidratação, por não serem capazes de manter o equilíbrio hídrico,

prejudicando, desta forma, a sobrevivência das plantas em condição ex vitro

(MALDA et al., 1999; POSPÍSILOVÁ et al., 1999; HAZARIKA, 2006). Isso ocorre

devido ao cultivo in vitro proporcionar um microclima controlado, em ambiente

fechado, sem trocas gasosas, com alta umidade do ar, baixa intensidade luminosa e

disponibilidade de açúcares, como fonte de carbono e energia, no meio de cultivo

(PREECE; SUTTER, 1991; SCIUTTI; MORINI, 1993; POSPÍSILOVÁ et al., 1999;

HAZARIKA, 2006). Estas condições especiais podem provocar alterações na

morfologia, anatomia e fisiologia das plantas (MARÍN et al., 1988; PREECE;

SUTTER, 1991; DESJARDINS, 1995; POSPÍSILOVÁ et al., 1999; 2000; HAZARIKA,

2006), dificultando o processo de aclimatização ao ambiente externo.

Alguns autores afirmam que o processo de aclimatização no gênero Prunus

tem apresentado bons resultados com índice de sobrevivência variável de 84-93%

(BORKOWSKA, 1985; CAMPANA et al., 1994; RADICE et al., 1999). Além disso,

Marín et al. (1988) demonstraram que plantas micropropagadas de Prunus cerasus L.

apresentavam xilema radicular contínuo e funcional. O emprego de auxinas na fase

de indução do enraizamento in vitro tem revelado eficiência, promovendo acréscimo

na taxa de sobrevivência das plantas na aclimatização (AL-MAARRI et al., 1994;

CAMPANA et al., 1994; YEPES; ALDWINCKLE, 1994; MURAI et al., 1997).

Deste modo, o desenvolvimento do presente trabalho teve como objetivo

testar o enraizamento in vitro e aclimatização de brotações micropropagadas de

ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, para a produção de mudas

em larga escala.

69

3.2 Material e Métodos

Foram realizados dois experimentos, onde brotações de ameixeira japonesa

(Prunus salicina Lindl.), cv. América, com 3 a 4cm de comprimento, oriundas do cultivo

in vitro, multiplicadas em meio MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) suplementado

com 0,3mg dm-3 de BAP (6-benzilaminopurina) e alongadas no mesmo meio com

adição 1,0mg dm-3 de AG3 (ácido giberélico), tiveram a base cortada em bisel e

então, utilizadas como fonte de explante para os experimentos. Estas brotações

foram inoculadas em frascos contendo 40cm3 de meio MS com a metade da

concentração dos sais e vitaminas (MS/2), acrescido de 20g dm-3 de sacarose,

100mg dm-3 de inositol, 7g dm-3 de ágar e pH 5,8.

No primeiro experimento, as brotações foram cultivadas em meio MS/2

suplementado com diferentes concentrações de AIA (0; 0,5 e 1,0mg dm-3), enquanto

que no segundo foram testadas concentrações de AIA e AIB intermediárias ao

experimento anterior de 0; 0,25; 0,50; 0,75 e 1,0mg dm-3. Os explantes foram

mantidos, por 20 dias, em sala de crescimento com condições de luz e temperatura

controladas (42µmol m-2 s-1 de densidade de fluxo de fótons, fotoperíodo de 16 horas

de luz e temperatura de 25 ± 1ºC, durante o período de luz e 23 ± 1ºC, durante o

período de escuro) para indução do enraizamento. Posteriormente, as plantas foram

transplantadas para bandejas alveoladas de poliestireno contendo como substrato

uma mistura de Plantmax® com casca de arroz carbonizada (1:1, v:v), autoclavados,

as quais foram mantidas em câmara de nebulização intermitente dentro da casa-de-

vegetação durante 30 dias para aclimatização das plantas. Após esse período, as

bandejas foram retiradas da câmara nebulizadora e mantidas em casa-de-vegetação

a 22-28ºC, 80-95% de umidade relativa do ar e com a frequência de irrigação

reduzida.

No primeiro experimento, 20 dias após o enraizamento in vitro, foi avaliado o

comprimento das raízes (cm), número de raízes por brotação, percentagem de

enraizamento, número de plantas com raízes secundárias, com formação de

primórdios radiculares (< 0,5cm) e com calos na base. Ao completar 20 dias de

aclimatização, foi avaliada a percentagem de sobrevivência das plantas, e aos 120

dias de aclimatização, foi avaliado o volume das raízes (cm3) e massa seca das

raízes (mg), em cinco plantas de cada tratamento.

No segundo experimento, as plantas foram avaliadas, após 20 dias de

cultivo in vitro, quanto ao comprimento das raízes (cm), número de raízes por

70

brotação e percentagem de enraizamento. Durante a fase de aclimatização foi

avaliada a percentagem de sobrevivência aos 20 e 30 dias em casa-de-vegetação.

No primeiro experimento, o delineamento experimental tanto para o

enraizamento como para aclimatização foi inteiramente casualizado, contendo oito

repetições, cada uma representada por um frasco/parcela com cinco explantes. Os

dados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias dos tratamentos

comparadas pelo teste de Tukey, com 5% de probabilidade de erro.

Enquanto que o delineamento experimental do segundo experimento tanto

para indução do enraizamento quanto para aclimatização foi inteiramente

casualizado, composto por um fatorial 2x5, duas fontes de auxina e cinco

concentrações, contendo cinco repetições, representadas por um frasco/parcela com

cinco explantes. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e de

regressão polinomial. As análises estatísticas para ambos experimentos foram

realizadas através do programa estatístico WinStat 2.0 (MACHADO; CONCEIÇÃO,

2003).

3.3 Resultados e Discussão

3.3.1 Experimento 1 – Enraizamento in vitro com diferentes concentrações de

AIA

De acordo com a análise de variância, não houve diferença estatística para

as variáveis analisadas após os 20 dias de enraizamento in vitro, exceto para a

percentagem de enraizamento (Apêndices C1 e C2).

Foi observada resposta crescente com o aumento das concentrações de AIA

para percentagem de enraizamento, variando de 52,48% a 82,29%, porém, não

houve diferença significativa pelo teste de Tukey com 5% de probabilidade de erro

(Fig. 1a). Apesar de não ocorrer diferença significativa entre tratamentos, verificou-

se resposta similar para a variável número de raízes por brotação, a qual apresentou

maior média de 2,8, na concentração de 1,0mg dm-3 (Fig. 1b), demonstrando o efeito

promotor de enraizamento do AIA nos explantes desta cultivar. Estes resultados

concordam com a afirmação de Hu e Wang (1983) que dizem que o AIA é a auxina

mais eficaz para estimular o enraizamento in vitro, embora não seja a mais utilizada.

71

Figura 1 - Percentagem de enraizamento, de formação de raízes secundárias, de

primórdios radiculares e de calos (a), e número de raízes por brotação (b) de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 20 dias de cultivo in vitro no meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIA (0; 0,5 e 1,0mg dm-3). As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010.

Em contrapartida, a percentagem de formação de primórdios radiculares

apresentou valores decrescentes (Fig. 1a), evidenciando que as concentrações mais

elevadas de AIA, utilizadas no presente estudo, não foram tóxicas a ponto de inibir o

alongamento das raízes (SALISBURY; ROOS, 1991; FETT NETO et al., 1992).

A percentagem de formação de raízes secundárias e formação de calos

apresentaram maiores valores (44,79 e 10%, respectivamente) no meio sem adição

do regulador de crescimento, e menores (28,54 e 2,5%, respectivamente) quando as

brotações foram expostas a 0,5mg dm-3 de AIA (Fig. 1a), permitindo demonstrar que,

neste caso, não são respostas influenciadas pela exposição ao regulador de

crescimento AIA.

A indução do enraizamento no tratamento sem adição de regulador de

crescimento pode ter ocorrido em virtude do acúmulo de auxinas endógenas

provenientes das folhas ou gemas. Tal acúmulo pode promover o aumento da

atividade metabólica dos tecidos e, consequentemente, a formação de raízes

(WAREING; PHILLIPS, 1981). Este fato também foi observado por Centellas et al.

(1999) no enraizamento in vitro de macieira onde, na ausência de reguladores de

crescimento, cerca de 5% de brotações enraizaram. Outro fator que pode ter

favorecido o enraizamento dessas brotações é o rejuvenecimento dos tecidos

causado por sucessivos subcultivos durante a micropropagação (GONÇALVES,

1982; BONGA; VON ADERKAS, 1992; ASSIS; TEIXEIRA, 1998; GRATTAPAGLIA;

82,2976,67

52,0844,79

28,5434,52

7,2914,58

21,88

52,510

0

20

40

60

80

100

0 0,5 1

Concentrações de AIA (mg dm-3)

Per

cent

agem

Enraizamento Raízes secundárias Primórdios radiculares Calos

a b

2,8

2,49

1,83

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 0,5 1


Núm

ero

de ra

ízes

por

bro

taçã

o

72

MACHADO, 1998), visto que, o material utilizado neste experimento passou por seis

subcultivos consecutivos. A restauração das características juvenis, promovendo

maior potencial de enraizamento, tem sido constatado em Eucalyptus, com o aumento

do número de subcultivos (CHAPERON, 1987; ZOBEL, 1993; HACKETT; MURRAY,

1993; XAVIER; COMÉRIO, 1996; ASSIS, 1996).

Com relação à percentagem de sobrevivência após 20 dias durante a fase

de aclimatização, houve diferença significativa entre as concentrações de AIA, onde

a maior percentagem de sobrevivência (67,5%) foi observada na concentração de

1,0mg dm-3 de AIA, diferindo significativamente apenas do tratamento sem a adição

do regulador de crescimento (Fig. 2a, Apêndice C3).

Figura 2 - Percentagem de sobrevivência após 20 dias de aclimatização (a); volume (cm3) e massa seca das raízes (g) (b), e aspecto geral das plantas (c) de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, micropropagadas e enraizadas in vitro em meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIA (0; 0,5 e 1,0mg dm-3) , após 120 de aclimatização. As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010.

a

67,5 a60 ab

40 b

0

20

40

60

80

100

0 0,5 1


Sobrevivência (%)

b

2,5

1,91,66

0,2270,1940,141

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 0,5 1


Volume das raízes (cm ) Massa seca da raízes (g)3

0mg dm-3 de AIA 0,5mg dm-3 de AIA 1,0mg dm-3 de AIA

c

73

Depois de aclimatizadas, ou seja, ao final do período de 120 dias em casa-

de-vegetação, as plantas de ameixeira foram avaliadas quanto ao volume e massa

seca das raízes. Ambas as variáveis apresentaram aumento de acordo com o

aumento da concentração de AIA, embora não apresentando diferenças

significativas (Fig. 2a, 2b, 2c e Apêndice C3). Demonstrando que na maior

concentração de AIA, houve uma melhor formação do sistema radicular.

O papel das auxinas na indução e no desenvolvimento de raízes tem sido

bastante estudado. Conforme já mencionado anteriormente, o AIA é a auxina

natural, encontrada nas plantas, tanto na forma livre quanto conjugada, a qual foi

identificada em 1928. Posteriormente, auxinas sintéticas análogas ao AIA, como o

AIB e ANA foram preconizados como fitorreguladores de enraizamento (LEOPOLD;

KRIEDEMANN, 1975; SOUZA; PEREIRA, 2007).

Entretanto, o sucesso do enraizamento dos explantes é pré-requisito para

qualquer protocolo de micropropagação, por facilitar o estabelecimento da muda no

solo (PATI et al., 2006). Nesse sentido, verificou-se que no primeiro experimento, a

percentagem de sobrevivência não foi tão alta quanto esperava-se, motivando a

realização do segundo experimento.

3.3.2 Experimento 2 – Enraizamento in vitro com diferentes concentrações de

AIA e AIB

Não houve interação significativa entre os fatores para as variáveis número

de raízes por brotação e percentagem de enraizamento, apresentando resultado

significativo apenas para o tipo de auxina utilizado (Apêndice C4). Os melhores

resultados foram obtidos a partir de brotações cultivadas em meio suplementado

com AIB em relação às cultivadas em meio com AIA, para ambas variáveis (0,87 e

41,95%, respectivamente) (Fig. 3a e 3b). Esses resultados foram inferiores aos do

primeir experimento.

Esta resposta diferenciada frente à exposição ao mesmo regulador de

crescimento (AIA), pode ser justificada em virtude dos diferentes estádios de

maturação do material utilizado em cada um dos experimentos. Sendo que no

primeiro, foi utilizado material oriundo de seis subcultivos, o que justifica a melhor

capacidade para enraizar em virtude do maior rejuvenescimento das brotações,

enquanto que para o segundo, utilizou-se material proviniente de dois subcultivos.

74

Figura 3 - Número de raízes por brotação (a) e percentagem de enraizamento de brotações de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 20 dias de cultivo in vitro no meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIB e AIA (0; 0,25; 0,50; 0,75 e 1,0mg dm-3). As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010.

Entretanto, foi verificado, no segundo experimento, a superioridade do AIB

em relação ao AIA, por induzir maior número de raízes por brotação e percentagem

de enraizamento. Em estudos realizados por Miranda et al. (2004), foi demonstrado

aumento no percentual de enraizamento de estacas de porta-enxertos de

pessegueiro utilizando AIB, o que confirma o efeito benéfico desse regulador no

enraizmento de prunoídeos. Em contrapartida, Tofanelli et al. (2002) observaram um

baixo potencial de enraizamento para cultivares de pessegueiro utilizando AIB,

evidenciando que não é apenas o tipo de auxina que tem influência sobre o

enraizamento mas que, as características intrínsecas de cada espécie e/ou cultivar

também são determinates.

De acordo com Radmann et al. (2002) o AIA proporcionou a formação de um

bom sistema radicular de porta-enxertos de macieira 'M-9', sem a formação de

raízes grossas, com maior formação de raízes secundárias, menor formação de

calos e um bom desenvolvimento da parte aérea. Os mesmos autores salientam que

brotações enraizadas com AIB e ANA apresentam melhor enraizamento em

concentrações mais baixas em relação ao AIA. Provavelmente devido a maior

degradação e menor taxa de absorção do AIA em relação as demais auxinas

(NISSEN; SUTTER, 1990).

Entretanto, verificou-se interação significativa entre os fatores para a variável

comprimento médio das raízes, comprovando que nas condições em que foi

0,28 b

0,874 a

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

AIB AIAAuxinas

Núm

ero

méd

io d

e ra

ízes

por

br

otaç

ãoa b

41,95 a

15,33 b

0

20

40

60

80

100

AIB AIAAuxinas

Enr

aiza

men

to (%

)

75

realizado este experimento, as diferentes concentrações e tipos de auxinas

utilizadas provocaram respostas distintas para essa variável (Apêndice C4).

O maior comprimento das raízes foi observado nas brotações cultivadas no

meio de cultura com adição de AIB em relação ao AIA, em todas as concentrações

utilizadas. As brotações cultivadas em meio acrescido de AIB apresentaram uma

tendência linear crescente para o comprimento médio das raízes, variando de 1,45 a

5,73cm. Já nos tratamentos com adição de AIA não houve efeito significativo nas

diferentes concentrações testadas, obtendo-se uma média de comprimento das

raízes bastante inferior, de 0,86cm (Fig. 4, Apêndice C5).

Figura 4 - Comprimento médio das raízes de plantas de ameixeira japonesa (Prunus

salicina Lindl.), cv. América, aos 20 dias de cultivo in vitro no meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIB e AIA (0; 0,25; 0,50; 0,75 e 1,0mg dm-3). As barras representam o erro padrão da média. ns*

equação de regressão polinomial não significativa. UFPel, Pelotas/RS, 2010.

As brotações que foram submetidas ao tratamento com AIB, formaram

plantas mais alongadas com maior número de folhas. Estas características se

tornam mais marcantes à medida que a concentração deste regulador aumentou

(dados não demonstrados). Enquanto isso, as brotações cultivadas em meio com

AIA em concentrações maiores que 0,75mg dm-3, formaram plantas com baixo

desenvolvimento da parte aérea, com entrenós curtos, dando o aspecto de roseta

(Fig. 5). Esta diferença entre as auxinas pode ser devida à maior degradação e

yAIB = 4,9205x + 1,6614

R2 = 86,15

yAIA = 0,8556 ns*

0

1

2

3

4

5

6

7

0 0,25 0,5 0,75 1

Concentrações das auxinas (mg dm-3)

Com

prim

ento

méd

io d

as ra

ízes

(cm

)

AIB AIA

76

menor taxa de absorção de AIA em relação às outras auxinas, que determinaria

acúmulo de ANA e AIB nas células dos explantes (NISSEN; SUTTER, 1990).

Figura 5 - Plantas de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, após 20

dias de cultivo in vitro no meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIB (a-e) e AIA (f-j) (0; 0,25; 0,50; 0,75 e 1,0mg dm-3). UFPel, Pelotas/RS, 2010.

De acordo com Mohammed e Vidaver (1990), não é apenas o tipo de

sistema radicular que influencia na sobrevivência das plantas após a transferência

para o cultivo ex vitro, mas o bom desenvolvimento da parte aérea também é

extremante importante.

Considerando que o AIA é a principal aixina encontrada nas plantas, sendo

ativa em concentrações extremamente baixas. Além do processo de síntese, esse

fitohormônio também é inativado durante os processos de crescimento e

diferenciação das células, estando sujeito a oxidação através do processo de foto-

oxidação e reações de oxidação catalisadas por enzimas (AIA-oxidase). Além dos

processos de oxidação, o AIA pode ligar-se a outras moléculas na planta,

produzindo conjugados que podem reter ou mesmo perder a atividade auxínica

(SALISBURY, 1991; TAIZ; ZEIGER, 2009).

O AIB também proporcionou melhores resultados no enraizamento in vitro

de macieira, quando comparado ao ANA e AIA (CENTELLAS et al., 1999). Nesse

estudo, o AIA proporcionou melhores respostas em altas concentrações,

corroborando com os resultados observados no presente trabalho.

a b c d e

f g

h i j

77

Segundo Leopold e Kriedemann (1975), a reduzida capacidade de indução

de enraizamento pelo AIA, comparado ao ANA e AIB, é atribuída aos diversos

mecanismos metabólicos para reduzir ou anular os efeitos do AIA através da

conjugação e/ou degradação, pela ação da AIA-oxidase nos tecidos do explantes

(GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1990; SALISBURY, 1991), sendo considerada fraca

comparada ao AIB e ANA (CALDAS et al., 1990). Além disso, o AIA exógeno,

quando aplicado no meio de cultura, apresenta baixa estabilidade degradando-se

mais facilmente pela ação da luz do que o AIB (NISSEN; SUTTER, 1990; CALDAS

et al., 1998), o que pode justificar, em parte, as melhores respostas quando se

utilizou concentrações mais altas desta auxina.

Como a cultura in vitro fornece condições especiais para o crescimento e

desenvolvimento das brotações com ótimas condições e estabilidade para

multiplicação das brotações com o mínimo de estresse (PREECE; SUTTER, 1991;

SCIUTTI; MORINI, 1993; POSPÍSILOVÁ et al., 1999; HAZARIKA, 2006), a

aclimatização destas plantas, ou seja, a capacidade de sobreviverem fora dos

frascos de cultivo, faz com que esta seja uma etapa bastante delicada e de grande

importância para o estabelecimento de protocolos de micropropagação (HAZARIKA,

2006). A maioria das plantas sofre desidratação nesta fase, tornando-se uma etapa

crucial para a produção de mudas (MALDA et al., 1999).

Conforme mencionado anteriormente, a obtenção de uma planta com

sistema radicular bem desenvolvido é de grande importância para a sua adaptação e

sobrevivência nas novas condições ambientais. No presente trabalho, 20 dias após

a transferência para o solo, a percentagem de sobrevivência foi maior para as

plantas cultivadas em meio com adição de AIB, a não ser na concentração de 0,5mg

dm-3, chegando a 100% na concentração de 1,0mg dm-3 (Fig. 6a). Entretanto, este

quadro apresentou pequena variação após 30 dias da transferência, apresentando

92% de sobrevivência no meio com AIA e 88% com AIB, na maior concentração

(Fig. 6b). Essa queda, pouco acentuada, da sobrevivência das brotações enraizadas

com AIB pode ter ocorrido devido a uma má formação do sistema vascular entre as

brotações e as raízes, já que o enraizamento ocorreu de forma mais rápida. De

acordo com Sommer e Caldas (1991), em estudos com espécies florestais, a

sobrevivência das plantas não depende apenas da formação de um sistema

radicular bem definido, mas de uma boa conexão vascular entre raiz/broto.

78

Figura 6 - Percentagem de sobrevivência após 20 (a) e 30 (b) dias de aclimatização de plantas de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, micropropagadas e enraizadas in vitro em meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIA (0; 0,5 e 1,0mg dm-3). UFPel, Pelotas/RS, 2010.

Mesmo o AIB tendo proporcionado a formação de maior número de raízes e

com maior comprimento durante a indução in vitro, a maior porcentagem de

sobrevivência das plantas após 30 dias do transplantio foi das brotações

provenientes do meio com adição de AIA, o que pode ter ocorrido por ter formado

raízes mais curtas, as quais são mais facilmente manipuladas, proporcionando

menores danos quando manipuladas na fase de aclimatização.

A rápida formação das raízes nas brotações cultivadas em meio com adição

de AIB pode ter prejudicado, de certa forma, a aclimatização, pois normalmente

raízes longas são facilmente danificadas durante o transplantio. Além disso, o

rompimento dos tecidos propicia infecções por patógenos podendo, desta forma,

prejudicar a sobrevivência das plantas durante a aclimatização, uma vez que não se

fez uso de fungicidas ou bactericidas nessa etapa.

Outro fator a considerar seria pelo fato do AIA ser uma auxina naturalmente

encontrada nas plantas podendo ser mais facilmente absorvida e menos prejudicial

durante o processo de crescimento e diferenciação das raízes (SALISBURY, 1991)

devido ao metabolismo diferencial das auxinas nas células vegetais onde o AIA é

conjugado e oxidado enquanto que o AIB é conjugado e metabolizado (SMULDERS

et al., 1990).

O AIB promoveu o enraizamento de forma mais eficiente que o AIA durante

o cultivo in vitro, portanto, para melhorar a eficiência de aclimatização, o ideal seria

que o período de cultivo in vitro para a formação da raiz fosse menor, provavelmente

Após 20 dias de aclimatização

20

10085

9610094,12

8484

16

54,17

0

20

40

60

80

100

120

0 0,25 0,5 0,75 1Concentrações das auxinas (mg dm-3)

Acl

imat

izaç

ão (%

)

AIB AIA

Após 30 dias de aclimatização

12

52

68

88

20

50

88,8980

92

47,06

0

20

40

60

80

100

0 0,25 0,5 0,75 1Concentrações das auxinas (mg dm-3)

Acl

imat

izaç

ão (%

)

AIB AIA

a b

79

inferior a 10 dias na concentração de 1,0mg dm-3, pois, segundo De Klerk et al.

(1997), a indução das raízes adventícias ocorre nos primeiros cinco dias após a

transferência para o meio de enraizamento.

Desta forma, seria possível promover a indução e a formação apenas de

primórdios radiculares, os quais são mais adequados para o transplantio e

pegamento da planta, por se encontrarem em fase de crescimento ativo e evitarem a

quebra no momento da retirada do meio de cultura (GRATTAPAGLIA; MACHADO,

1998), facilitando a lavagem e retirada do meio aderido na base, bem como a

introdução da planta no substrato (ASSIS; TEIXEIRA, 1999). Conforme Rocha et al.

(2006c), o tamanho adequado das raízes para serem transplantadas para o

substrato é de aproximadamente 0,2 a 0,3cm.

Existem relatos de brotações de porta-enxerto de Prunus spp. submetidas ao

enraizamento in vitro com adição de AIB em concentrações entre 0,1 e 0,5mg dm -3,

que, mesmo não apresentando formação de raízes aparentes, quando transferidas

para o substrato durante a fase de aclimatização, foram capazes de formar raízes e

sobreviverem (ROGALSKI et al., 2003a). Pietropaolo e Reisch (1984) também

observaram a mesma resposta na aclimatização de Prunus domestica L., onde

brotações de ameixeira ‘Stanley’ não enraizadas in vitro desenvolveram sistema

radicular no substrato, apresentando alta taxa de sobrevivência das plantas nas

condições ex vitro.

Em contrapartida, Radmann et al. (2003), em trabalhos de enraizamento in

vitro de amoreira, relataram que mesmo havendo 100% de brotações com formação

de raízes bem desenvolvidas com a adição de AIB, estas plantas não sobreviveram

após terem sido transplantadas para as condições ex vitro, tendo atribuído esta

resposta ao longo comprimento das raízes na ocasião do transplante.

3.4 Conclusão

Com o desenvolvimento deste trabalho conclui-se que para ameixeira

japonesa, cv. América, o enraizamento in vitro ocorreu de forma mais rápida com a

adição de 1,0mg dm-3 de AIB.

Enquanto que a maior percentagem de sobrevivência, após 30 dias, foi

obtida com a adição de 1,0mg dm-3 de AIA.

80

Considerações Finais

Os resultados apresentados no primeiro capítulo deste trabalho são de

grande valia, tendo em vista a ausência de publicações atualizadas sobre a

compatibilidade reprodutiva entre cultivares adaptadas a nossa região; servindo de

subsídio para programas de melhoramento genético, uma vez que podem ser

contrastados com informações de sequenciamento dos alelos-S de cada uma das

cultivares, aprimorando, desta forma, o conhecimento a respeito da compatibilidade

reprodutiva entre cultivares de ameixeira japonesa (P. salicina).

Os estudos fisiológicos confirmaram dados da caracterização molecular dos

alelos-S de algumas cultivares dessa espécie, entretanto seria necessário

caracterizar molecularmente esses alelos de outras cultivares de interesse para a

região, comparando com os resultados obtidos neste trabalho.

A identificação desses alelos é muito importante para reduzir perdas no

campo, bem como para serem utilizados com o intuito de realizar transformação

genética, para o silenciamento dos alelos-S de interesse, objetivando obter plantas

autoférteis, o que facilitaria o manejo dos pomares, aumentando a produtividade e

uniformizando a produção dos frutos.

Para tanto, o desenvolvimento do protocolo de micropropagação é de

extrema importância, visando estudos de regeneração a partir de explantes foliares.

Com o presente estudo foi desenvolvido protocolo de micropropagação da cv.

América, que é uma cultivar de grande interesse para o estudo de silenciamento

gênico, por ser autoincompatível reprodutivamente. Tentativas para definir

protocolos de regeneração da cv. América, a partir de explantes foliares estão sendo

desenvolvidos, porém ainda não produziram resultados satisfatórios, necessitando,

para isso, maiores estudos.

81

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100

Apêndices

101

Apêndice A – Capítulo 1

Caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva de seis cvs. copa de

ameixeira japonesa

Apêndice A1 – Resumo da análise de variância e testes de significância para a variável percentagem de grãos de pólen germinados na região estigmática do pistilo de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, após 120h das polinizações controladas, realizadas in vivo e mantidas em temperatura ambiente. Pelotas/ RS, 2010

Percentagem de grãos de pólen germinados na região estigmática da cv. América

Causas da variação GL

QM QM** Estatística F Estatística F** Cruzamentos 6 4018,91 0,38 3,06* 3,38*

Resíduos 133 1.314,71 0,11 - - Média geral - 77,84 0,81 - -

Cv (%) - 46,58 41,23 - - * Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ns Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ** Análise dos dados transformados para (x/100)1/2. Apêndice B2 – Resumo da análise de variância e testes de significância para a

variável percentagem de grãos de pólen germinados na região estigmática do pistilo de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. Amarelinha, após 120h das polinizações controladas, realizadas in vivo e mantidas em temperatura ambiente. Pelotas/ RS, 2010

Percentagem de grãos de pólen germinados na região estigmática da cv. Amarelinha


QM QM** Estatística F Estatística F** Cruzamentos 3 472,62 0,02 2,22ns 2,36ns

Resíduos 76 212,58 0,01 - - Média geral - 95,96 0,97 - -

cv (%) - 15,19 10,25 - - * Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ns Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ** Análise dos dados transformados para (x/100)1/2.

102

Apêndice A3 – Resumo da análise de variância e testes de significância para a variável percentagem de grãos de pólen germinados na região estigmática do pistilo de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. Reubennel, após 120h das polinizações controladas, realizadas in vivo e mantidas em temperatura ambiente. Pelotas/ RS, 2010

Percentagem de grãos de pólen germinados na região estigmática da cv. Reubennel


QM QM** Estatística F Estatística F** Cruzamentos 2 1.5941,99 0,61 34,38* 16,48*


cv (%) - 30,00 23,56 - - * Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ns Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ** Análise dos dados transformados para (x/100)1/2. Apêndice A4 – Resumo da análise de variância e testes de significância para a

variável percentagem de grãos de pólen germinados na região estigmática do pistilo de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. Rosa Mineira, após 120h das polinizações controladas, realizadas in vivo e mantidas em temperatura ambiente. Pelotas/ RS, 2010

Percentagem de grãos de pólen germinados na região estigmática da cv. Rosa Mineira


QM QM** Estatística F Estatística F** Cruzamentos 4 23.325,06 2,14 49,65* 41,68*



variável percentagem de grãos de pólen germinados na região estigmática do pistilo de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. Pluma 7, após 120h das polinizações controladas, realizadas in vivo e mantidas em temperatura ambiente. Pelotas/ RS, 2010

Percentagem de grãos de pólen germinados na região estigmática da cv. Pluma 7


QM QM** Estatística F Estatística F** Cruzamentos 1 1.845,07 0,01 1,65ns 0,09ns


cv (%) - 42,82 35,20 - - * Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ns Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ** Análise dos dados transformados para (x/100)1/2.

103

Apêndice A6 – Resumo da análise de variância e testes de significância para a variável percentagem de grãos de pólen germinados na região estigmática do pistilo de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. Santa Rosa, após 120h das polinizações controladas, realizadas in vivo e mantidas em temperatura ambiente. Pelotas/ RS, 2010

Percentagem de grãos de pólen germinados na região estigmática da cv. Santa Rosa


QM QM** Estatística F Estatística F** Cruzamentos 1 864,90 24,75 6,58* 11,31*



variável percentagem de incidência do tubo polínico em cada etapa do percurso estigma-óvulo de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), após 120h das polinizações controladas, realizadas in vivo na cv. América, mantidas em temperatura ambiente. Pelotas/ RS, 2010

Percentagem de incidência do tubo polínico em cada etapa do percurso estigma-óvulo da cv. América Causas da variação GL QM QM** Estatística F Estatística F**

Cruzamentos 6 0 0,01 0ns 0,10ns

Etapa 5 2.403,81 0,46 8,91* 8,71* Cruzamentos x Etapa 30 883,81 0,21 3,27* 3.,97*


cv (%) - 98,56 83,17 - - * Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ns Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ** Análise dos dados transformados para log (x).

104

Apêndice A8 – Resumo da análise de variância e testes de significância para a variável percentagem de incidência do tubo polínico em cada etapa do percurso estigma-óvulo de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), após 120h das polinizações controladas, realizadas in vivo na cv. Santa Rosa, mantidas em temperatura ambiente. Pelotas/ RS, 2010

Percentagem de incidência do tubo polínico em cada etapa do percurso estigma-óvulo da cv. Santa Rosa Causas da variação GL

QM QM** Estatística F Estatística F** Cruzamentos 1 0 0,01 0ns 0,19ns

Etapa 5 793,33 0,12 2,38* 2,00ns

Cruzamentos x Etapa 5 2.300,00 0,40 6,90* 6,76* Resíduos 36 333,33 0,06 - -

Média geral - 16,67 0,26 - - cv (%) - 109,55 93,22 - -

* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ns Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ** Análise dos dados transformados para log (x). Apêndice A9 – Resumo da análise de variância e testes de significância para a

variável percentagem de incidência do tubo polínico em cada etapa do percurso estigma-óvulo de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), após 120h das polinizações controladas, realizadas in vivo na cv. Pluma 7, mantidas em temperatura ambiente. Pelotas/ RS, 2010

Percentagem de incidência do tubo polínico em cada etapa do percurso estigma-óvulo da cv. Pluma 7 Causas da variação GL QM QM** Estatística F Estatística F**

Cruzamentos 1 0 0,07 0ns 1,20ns

Etapa 5 1.113,33 0,21 3,28* 3,59* Cruzamentos x Etapa 5 1.780,00 0,34 5,25* 5,95*



105

Apêndice A10 – Resumo da análise de variância e testes de significância para a variável percentagem de incidência do tubo polínico em cada etapa do percurso estigma-óvulo de ameixeira japonesa (Prunus

salicina Lindl.), após 120h das polinizações controladas, realizadas in vivo na cv. Amarelinha, mantidas em temperatura ambiente. Pelotas/ RS, 2010

Percentagem de incidência do tubo polínico em cada etapa do percurso estigma-óvulo da cv. Amarelinha Causas da variação GL


Etapa 5 7.026,67 0,04 30,48* 24,23* Cruzamentos x Etapa 15 2.453,33 0,30 10,64* 8,50


cv (%) - 91,10 86,33 - - * Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ns Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ** Análise dos dados transformados para log (x). Apêndice A11 – Resumo da análise de variância e testes de significância para a

variável percentagem de incidência do tubo polínico em cada etapa do percurso estigma-óvulo de ameixeira japonesa (Prunus

salicina Lindl.), após 120h das polinizações controladas, realizadas in vivo na cv. Rosa Mineira, mantidas em temperatura ambiente. Pelotas/ RS, 2010

Percentagem de incidência do tubo polínico em cada etapa do percurso estigma-óvulo da cv. Rosa Mineira Causas da variação GL





106

Apêndice A12 – Resumo da análise de variância e testes de significância para a variável percentagem de incidência do tubo polínico em cada etapa do percurso estigma-óvulo de ameixeira japonesa (Prunus

salicina Lindl.), após 120h das polinizações controladas, realizadas in vivo na cv. Reubennel, mantidas em temperatura ambiente. Pelotas/ RS, 2010

Percentagem de incidência do tubo polínico em cada etapa do percurso estigma-óvulo da cv. Reubennel Causas da variação GL

QM QM** Estatística F Estatística F** Cruzamentos 2 5,56 0,01 0,02ns 0,17ns




107

Apêndice B – Capítulo 2

Estabelecimento, multiplicação e alongamento in vitro de ameixeira japonesa,

cv. América

Experimento 1 – Estabelecimento in vitro de ameixeira japonesa cv. América

Apêndice B1 – Resumo da análise de variância e testes de significância para as variáveis comprimento médio das brotações (cm), número de folhas e de gemas formadas nos explantes de gemas apicais e basais de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, após 30 dias do estabelecimento in vitro em meio MS. UFPel, Pelotas/ RS, 2010

Comprimento das brotações iniciais

(cm) Número de folhas Número de gemas Causas da

variação GL

QM QM QM** QM QM** Explante 1 2,61* 300,41* 7,21* 6,22* 0,66* Resíduo 56 0,05 10,19 0,26 0,52 0,05

Média geral - 1,03 10,93 3,33 2,15 1,61 cv (%) - 22,61 29,21 15,29 33,61 14,48

* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ns Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ** Análise dos dados transformados para (x+0,5)1/2.

108

Experimento 2 – Multiplicação in vitro de ameixeira japonesa cv. América

Apêndice B2 – Resumo da análise de variância e testes de significância para as variáveis comprimento das brotações (cm) e número de brotos, e de gemas e média da massa seca (mg) por brotação de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro em função do tipo de regulador de crescimento (BAP e 2iP) e suas concentrações (0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0mg dm-3).UFPel, Pelotas/ RS, 2010

Comprimento das brotações

(cm)

Número de brotos

Número de gemas

Massa seca por brotação

(mg) Causas da variação GL

QM QM QM** QM QM** QM Citocinina 1 1,01* 50,32* 4,65* 201,04* 4,28* 463,20*

Concentrações 4 0,30* 5,94* 0,49* 21,15* 0,45* 93,87* Citocinina x

Conc. 4 0,30* 4,81* 0,38* 26,48* 0,58* 39,26ns

Resíduo 70 0,03 0,36 0,03 2,21 0,05 22,39 Média geral - 1,028 1,96 1,53 10,60 3,31 16,67

cv (%) - 16,72 30,58 10,66 14,01 6,48 28,73 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ns Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ** Análise dos dados transformados para (x+0,5)1/2. Apêndice B3 – Análise de regressão polinomial para a variável comprimento médio

das brotações (cm) e massa seca das brotações (mg) de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro em função do tipo de regulador de crescimento (BAP e 2iP) e suas concentrações (0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0mg dm-3). UFPel, Pelotas/ RS, 2010.

Quadrados médios Comprimento das brotações

(cm) Massa seca das brotações (mg)


BAP 2iP Concentrações Regressão Linear 1 1,07* 0,003ns 308,55*

Regressão Quadrática 1 0,71* 0,01ns 62,64ns Desvio de Regressão 1 0,19* 0,006ns 2,72ns

Resíduo 70 2,07 2,07 1567,65 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ns Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.

109

Apêndice B4 – Análise de regressão polinomial para as variáveis número de brotos e de gemas por brotação de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro em função do tipo de regulador de crescimento (BAP e 2iP) e suas concentrações (0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0mg dm-3). UFPel, Pelotas/ RS, 2010.

Número de brotos Número de gemas QM QM** QM QM** Causas da variação GL

BAP 2iP BAP 2iP BAP 2iP BAP 2iP Regressão Linear 1 41,75* 0,12ns 3,32* 0,02ns 49,45* 0,21ns 1,17* 0,01ns

Regressão Quadrática 1 0,38ns 0,02ns 0,07ns 0,003ns91,12* 0,72ns 1,92* 0,02ns

Desvio de Regressão 1 0,03ns 0,13ns 0,01ns 0,02ns 19,18* 0,09ns 0,39* 0,003ns

Resíduo 70 0,36 0,03 2,21 0,05 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ns Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. Apêndice B5 – Resumo da análise de variância e testes de significância para as

variáveis comprimento médio das brotações (cm), número médio de gemas e de brotos formados por explante e massa seca das brotações (mg) ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, após 40 dias de cultivo in vitro em função dos diferentes meios de cultura (MS, MS com ⅓ do N e WPM). UFPel, Pelotas/ RS, 2010

Quadrados Médios Causas da variação GL Comprimento

das brotações (cm)

Número de brotos

Número de gemas


(mg) Meios 2 0,14ns 13,17* 8,95ns 314,00*

Resíduo 33 0,05 0,57 14,34 48,99 Média geral - 1,53 2,91 10,65 19,98

cv (%) - 14,68 25,96 35,55 35,03 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ns Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.

110

Experimento 3 – Alongamento in vitro de brotações de ameixeira japonesa cv.

América

Apêndice B6 – Resumo da análise de variância e testes de significância para as variáveis comprimento das brotações (cm) e número de brotos, e de gemas e média da massa seca por brotação de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro com diferentes concentrações de AG3 (0; 0,25; 0,50; 0,75; 1,0mg dm-3), acrescido de 2,0mg dm-3 de carvão vegetal ativado. UFPel, Pelotas/ RS, 2010


(cm)

Número de brotos

Número de gemas

Massa seca por

brotação (mg)

Causas da variação

GL

QM QM QM** QM QM** QM AG3 4 0,36* 0,03ns 0,01ns 0,67ns 0,02ns 49,04ns


cv (%) - 19,08 16,37 5,64 11,65 5,52 22,05 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ns Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ** Análise dos dados transformados para (x+0,5)1/2. Apêndice B7 – Análise de regressão polinomial para as variáveis comprimento das

brotações e número de brotos, e de gemas e média da massa seca por brotação de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro com diferentes concentrações de AG3 (0; 0,25; 0,50; 0,75; 1,0mg dm-3), acrescido de 2,0mg dm-3 de carvão vegetal ativado. UFPel, Pelotas/ RS, 2010


(cm)

Número de brotos

Número de gemas



QM QM QM** QM QM** QM Regressão

Linear 1 1,27* 0,13ns 0,02ns 0,05ns 1.10-3ns 14,80ns

Regressão Quadrática 1 0,11ns 1.10-3ns 3.10-4ns 1,19ns 0,03ns 166,81*

Desvio de Regressão 1 0,01ns 2.10-4ns 3.10-5ns 0,31ns 0,01ns 11,51ns

Resíduo 20 0,07 0,03 0,001 1,35 0,03 19,63 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ns Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.

111

Apêndice B8 – Resumo da análise de variância e testes de significância para as variáveis comprimento das brotações (cm) e número de brotos, e de gemas e média da massa seca por brotação de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro com diferentes concentrações de AG3 (0, 1, 5 e 10mg dm-3), acrescido de 2,0mg dm-3 de carvão vegetal ativado. UFPel, Pelotas/ RS, 2010


(cm)

Número de brotos

Número de gemas



QM QM QM** QM QM** QM Carvão 1 0,33ns 0,13ns 0,09ns 19,51ns 0,44ns 54,80ns

AG3 3 1,96* 0,20ns 0,06ns 3,83ns 0,11ns 52,51ns

AG3 x Carvão

3 0,64* 0,10ns 0,01ns 2,39ns 0,07ns 11,49ns


Cv (%) - 12,87 27,66 14,65 26,85 12,51 60,12 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ns Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ** Análise dos dados transformados para (x+0,5)1/2. Apêndice B9 – Análise de regressão polinomial para a variável comprimento médio

das brotações (cm) de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro com diferentes concentrações de AG3 (0, 1, 5 e 10mg dm-3), acrescido de 2,0mg dm-3 de carvão vegetal ativado. UFPel, Pelotas/ RS, 2010

Quadrados médios Comprimento das brotações (cm) Causas da variação GL

Com carvão Sem carvão Regressão Linear 1 5,07* 1,03*

Regressão Quadrática 1 0,41* 1,62* Desvio de Regressão 1 0,62* 0,06ns

Resíduo 8 0,06 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ns Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.

112

Apêndice C – Capítulo 3

Enraizamento in vitro e aclimatização de brotações de ameixeira japonesa cv.

América

Apêndice C1 – Resumo da análise de variância e testes de significância para as variáveis número de brotações enraizadas e de raízes por brotação, e percentagem de enraizamento das brotações de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 20 dias de cultivo in vitro no meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIA (0; 0,5 e 1,0mg dm-3). UFPel, Pelotas/ RS, 2010

Número raízes por brotação % de enraizamento Causas da variação

GL QM QM** QM QM***

AIA 2 1,96ns 0,20ns 2.064,64* 0,12ns


cv (%) - 38,11 17,92 34,43 24,87 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ns Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ** Análise dos dados transformados para (x+0,5)1/2. *** Análise dos dados transformados para (x/100)1/2. Apêndice C2 – Resumo da análise de variância e testes de significância para as

variáveis percentagem de formação de raízes secundárias, de primórdios radiculares e de calos das brotações de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 20 dias de cultivo in vitro no meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIA (0; 0,5 e 1,0mg dm-3). UFPel, Pelotas/ RS, 2010

% de raízes secundárias

% de primórdios radiculares % de calos Causas da

variação GL QM QM*** QM QM*** QM QM***

AIA 2 539,30ns 0,06ns 425,37ns 0,10ns 116,67ns 0,06ns


cv (%) - 72,37 59,89 133,29 122,94 156,49 156,49 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ns Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. *** Análise dos dados transformados para (x/100)1/2.

113

Apêndice C3 – Resumo da análise de variância e testes de significância para as variáveis percentagem sobrevivência após 120 dias de aclimatização volume (cm3) e massa seca das raízes (g) das plantas de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, micropropagadas e enraizadas in vitro em meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIA (0; 0,5 e 1,0mg dm-3), após 120 dias de aclimatização. UFPel, Pelotas/ RS, 2010

Sobrevivência (%) Volume das raízes (cm3)

Massa seca das raízes (g)

Causas da variação

GL QM QM*** QM QM

AIA 2 1.616,67* 0,13* 0,81ns 0,01ns


Cv (%) - 38,19 26,11 31,89 0,08 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ns Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. *** Análise dos dados transformados para (x/100)1/2. Apêndice C4 – Resumo da análise de variância e testes de significância para as

variáveis número de raízes por brotação, percentagem de enraizamento e comprimento das raízes (cm) de brotações de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 20 dias de cultivo in vitro no meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIB e AIA (0; 0,25; 0,50; 0,75 e 1,0mg dm-3). UFPel, Pelotas/ RS, 2010

Número de raízes por brotação Enraizamento (%)

Comprimento das raízes

(cm) Causas da variação GL

QM QM** QM QM*** QM Auxina 1 4,41* 1,01* 8.855,68* 1,57* 133,34*

Concentração 4 0,21ns 0,03ns 505,38ns 0,06ns 9,955* Auxina x Conc. 4 0,57ns 0,12ns 1.110,79ns 0,17ns 13,59*

Resíduo 40 0,28 0,05 566,08 0,07 2,44 Média geral - 0,58 1,00 28,64 0,42 2,49

cv (%) - 92,02 23,21 83,07 64,21 62,80 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ns Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ** Análise dos dados transformados para (x+0,5)1/2. *** Análise dos dados transformados para (x/100)1/2.

114

Apêndice C5 – Análise de regressão polinomial para a variável comprimento das raízes (cm) de brotações de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 20 dias de cultivo in vitro no meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIB e AIA (0; 0,25; 0,50; 0,75 e 1,0mg dm-3). UFPel, Pelotas/ RS, 2010.

Quadrados médios Causas da variação GL AIB AIA

Regressão Linear 1 75,66* 2,32ns

Regressão Quadrática 1 5,97ns 3,13ns

Desvio de Regressão 1 1,00ns 0,78ns

Resíduo 40 2,443 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. ns Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.

115

Anexos

116

Anexo A

Anexo A – Percentagem de germinação in vitro dos grãos de pólen de cultivares de ameixeira japonesa (P. salicina Lindl.), utilizados nos experimentos de polinização controlada realizada in vivo e no campo experimental da Embrapa Clima Temperada (CPACT) no ano de 2008. Pelotas/RS, 2010

Cultivar ♂ Viabilidade do grão de pólen (%) América 17 Amarelinha 39 Pluma 7 19 Reubennel 39 Rosa Mineira 41 Santa Rosa 20 The First 18

117

Anexo B

Anexo B – Descrição de algumas características das cultivares utilizadas no

presente trabalho:

América: Originada do cruzamento entre P. munsoniana e P. salicina, foi obtida

no final do século passado por Luther Burbank, através de uma semente do

cruzamento entre as cvs. Robinson x Abundance. A fruta é de tamanho médio

(4,5cm de diâmetro), esférico-oblonga, achatada na base e no ápice, com cavidade

peduncular pouco profunda. A película é facilmente removível, amarga, fina e forte,

com cor vermelho intenso sobre fundo amarelo. Enquanto que a polpa é amarela,

muito densa, sucosa, doce-acidulada e aromática. Caroço com 2cm de comprimento

e 1,5cm de largura, com faces rugosas (NAKASU et al., 2003).

Árvore de crescimento muito vigoroso, brotos glabros e avermelhados.

Folhas ovaladas, com bordos crenados, com 8,5cm de comprimento e 4cm de

largura, com pecíolos de 1,5cm de comprimento. Com duas a três flores por gema,

com pecíolo muito fino e pétalas brancas. Apresenta grande flutuação na

produtividade, sendo exigente em polinização cruzada para que ocorra frutificação

(NAKASU et al., 2003).

Reubennel: Altamente produtiva com frutos de tamanho médio a grande,

com formato redondo cônico. A epiderme é amarelo-esverdeada com 10 a 20% de

vermelho. Apresentando polpa amarela, firme, doce levemente ácida e bom sabor.

Amadurece em fins de janeiro. A planta é vigorosa, semiaberta e suscetível à

bacteriose (NAKASU et al., 2003).

Amarelinha: Produz frutos de tamanho médio a grande, arredondados e

levemente simétricos. A película é de cor predominante amarela, com manchas

vermelhas, e polpa amarela. É de boa qualidade, doce, amadurece na segunda

semana de janeiro. A planta é semivigorosa, de hábito semiaberto e sucetível à

bacteriose (NAKASU et al., 2003).

Rosa Mineira: Fruto de tamanho pequeno a médio, formato globoso-

cordiforme; satura pouco nítida, dividindo o fruto em duas partes iguais; cavidade

peduncular rasa e pedúnculo curto. Epiderme de coloração vermelho-rósea, com

pontuações amareladas; pruína escassa; aspecto bem atraente. A polpa é tenra e

118

sucosa, de cor avermelhada, brilhante quando madura, com algumas fibras

esbranquiçadas. Sabor doce-acidulado equilibrado, aromático; acidez presente junto

à película e à semente, que é bem pequena e aderente à polpa. Foi desenvolvida

pelo IAC, originária de semente de polinização aberta do cv. Kelsey Paulista. Planta

bem vigorosa, com abundância de folhas e com alta produtividade (OJIMA et al.,

1983).

Pluma 7: Bastante produtiva, com frutos de tamnho médio a grande,

redondos com sutura e ponta levemente depressivas, com epiderme 100%

vermelha. A polpa é firme, 100% vermelho-escuro, agridoce a doce quando madura

e de bom sabor. A planta é vigorosa e altamente suscetível à bacteriose. Amadurece

em princípio de janeiro (NAKASU et al., 2003).

Santa Rosa: Obtida em 1907 por Luther Burbank, na localidade de Santa

Rosa, na Califórnia. Produz frutos de tamanho médio, redondos, ligeiramente

oblatos, com epiderme pruinosa, 100% vermelha. A polpa é firme, amarela,

aromática e de muito bom sabor. A planta é de vigor médio, hábito ereto, suscetível

à bacteriose. A maturação ocorre no final de dezembro (NAKASU et al., 2003).

119

Anexo C

Anexo C – Distribuição das temperaturas mínimas, médias e máximas mensais no período de abril de 2007 a março de 2008 (A). Representação mensal da pluviosidade (mm) e umidade relativa (UR) no período de abril de 2007 a março de 2008. (FONTE: Estação Agroclimatológica de Pelotas)

a

b

120

Anexo D

Anexo D – Caracterização molecular dos alelos-S de cultivares de ameixeira japonesa (P. salicina Lindl.). Extraído de Mota (2008)

JULIANA DE MAGALHÃES BANDEIRA

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