LABORATÓRIO DE TOXICOLOGIA

TRABALHOS LABORATORIAIS

2010

Haste onde se coloca a amostra de sangue

Mistura cromossulfúrica (amarela)

TRABALHO 1-Etanol

Objectivos: Doseamento do alcool no sangue pelos métodos de:

-Widmark-Cromatografia gasosa

Organização:1º-Começar pelo método de Widmark (tempo de espera de 2h)2º-Fazer padrões para GC e elaborar a curva de calibraçãoAnalisar a amostra por GCNão usar o GC sem ter assistido a demonstração prévia

Montagem do Método de Widmark :

matraz de Widmark

Cuidados a ter no Método de Widmark:Usar luvasConfirmar temperatura do banho (60 ºC)Prender matrazes de Widmark com pinçasColocar as hastes, com restos de sangue, na lexívia

Cuidados a ter no Método por cromatografia gasosa:A mudança de soluções , quer do padrão, quer das amostras, implica lavagem da seringa.Fazer cálculos da razão: área do padrão/área do padrão interno e representar vs. concentração.

Atenção ao volume das tomas de ensaio e diluições nos dois métodos.

No Met. de Widmark-> titula-se indirectamente o dicromato remanescente (que não foi reduzido e apresenta cor verde). Após adição de KI (5%) ao k2CrO7, liberta-se I2 que será titulado pelo hipossulfito de sádio (Na2S2O3), ficando a solução final incolor, no ponto de equivalência.

Fundamentos:

1- Método de Widmark

O alcool é separado do sangue por difusão no frasco de Widmark, em banho-maria à temp. de 60ºC/2h, reduzindo o dicromato colocado no matraz. Titula-se indirectamente o dicromato remanescente (que não foi reduzido). Após adição de KI (5%) ao k2CrO7, liberta-se I2 que será titulado pelo hipossulfito de sódio (Na2S2O3) N/100, ficando a solução final incolor, no ponto de equivalência.

32252 OSNa 12 OHHC 3

TRABALHO 2 – Carboxihemoglobina e Metahemoglobina no sangue

Objectivos:

-Doseamento do monóxido de carbono por redução do cloreto de paládio em célula de Conway (coeficiente de envenenamento)

- Doseamento da metahemoglobina no sangue por um método colorimétrico

Montagem:Célula de Conway

Esmerilado com silicone ou vaselina

H2SO4+sangue

Cloreto de paládio

Organização:- Começar por preparar a célula de Conway com a amostra de sangue em que se pretende determinar o monóxido de carbono e colocar na placa oscilante (+ 2h).- Fazer os padrões de cloreto de paládio e ler as absorvências-Fazer determinações de metahemoglobina; solução I e II estão preparadas mas é necessário preparar R1 e a sol. de KCN

Cuidados a ter:- Colocar o sangue na célula de Conway com esta quase fechada e rapidamente para evitar que o CO existente se liberte para a atmosfera.- Não esquecer de mudar de lâmpada para proceder ao doseamento do cloreto de paládio (=278 nm; UV) e usar só células de quartzo.Especificidades do trabalho:CarboxihemoglobinaReacção de redução do cloreto de paládio

Pd2HCl2COO2HCO2PdCl

Calcular a % de carboxihemoglobina ou coeficiente de envenenamento

Metahemoglobina

Leitura 1 absorvância a 630 nm metahemoglobina valor A+Adição de cianeto de potássioLeitura 2 cianometahemoglobina valor B («A)

Leitura 3 (após adição de ferricianeto de potássio) hemoglobina+metahemoglobina valor C + Adição

de cianeto de potássio Leitura 4 valor D

A diferença (A-B) é proporcional à meta-Hb existente na amostra.

A diferença (C-D) é proporcional à Hb total.

100DC

BAobinametahemogl %

V.N ≤ 2 %

TRABALHO 3- Doseamento do ácido δ-aminolevulínico na urina (Pb) e Determinação das coproporfirinas em ratos expostos ao PB

PB

(Woods, 1995)

PB

PBPB

O Pb interfere na biossíntese do grupo heme:- Ao nível da actividade de três enzimas; a ALA-D, a ALA-S e a COPRO-D-A inibição da ALA-D resulta na acumulação de δ- ALA no plasma e, consequente excreção na urina- Aumento das coproporfirinas urinárias- Diminuição da hemoglobina- aumento de ferro nos eritrocitos

Organização do trabalho:- Não trocar a ordem dos reagentes- Não confundir a fase orgânica com a aquosa

Valores normais:

δ-ALA- V.N ≤ 2 mg/L

Coproporfirinas urinárias- V.N ≤150 µg/L aceitável-150-500 µg/L excesso-500-1500 µg/L perigoso≥ 1500 µg/L

(adaptado de Tomokuni e Ogata, 1972)Clinical Chem., 18, 1534-1536

Fundamento do Método (ácido δ-aminolevulínico ):

1- condensação do ALA + acetoacetato de etilo-- ALA-pirrol que se extrai da fase aquosa (+ ureia que reage com o reagente de Ehrlich ) com acetato de etilo

2- Adição de reagente de Ehrlich ao ALA-pirrol, na presença de acetato de etilo, formando-se um conjugado com coloração vermelho cereja, com absorvência a 553 nm

Organização:1º- Montar o soxlet e iniciar a extracção2º - Saturar a câmara de cromatografia3º-Det. Actividade colinesterásica4º- Concentração do extracto e preparar placa TLC com padrões

Montagem:

Cuidados a ter:Não respirar padrões de TLC

Det. act. Colinesterásica - O ”kit” é composto por 2 frascos de pó liofilizado que se reconstituem com H2O destilada.Reunir todo o material necessário para a det. da act. colininesterásica junto ao espectofotómetro, não esquecendo cronómetro. -Agitar a tina (de plástico) após adição da amostra; no final colocar na lexívia.

Especificidades do trabalho:Organofosforados pesquisados na amostra de terra: Paratião; Malatião e Gusatião

TRABALHO 4 – Pesquisa de pesticidas Organofosforados na terra e Determinação da actividade colinesterásica no soro ou plasma

Butiriltiocolina + H2O pseudocolinesterase tiocolina + butirato

Tiocolina + ditiobisnitrobenzoato 2-nitro-5-mercaptobenzoato

Butiriltiocolina + H2O pseudocolinesterase tiocolina + butirato

Tiocolina + hexanocianoferrato (III) ditiobiscolina + hexanocianoferrato de potássio (II)

Determinação da actividade colinesterásica no soro ou plasma

Classificação do graú de intoxicação

% da Actividade normal da AchE

Baixo 20-50%

Moderado 10-20%

Elevado < 10%