Larissa Borba Santos

EFEITOS DA MITOMICINA C E QUINONAS NATURAIS �-LAPACHONA E LAPACHOL NA INATIVAÇÃO DE CELULAS HUMANAS

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Biofísica)

Orientadora: Claudia de Alencar Santos Lage

Rio de Janeiro

2010

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Santos, Larissa Borba Efeitos da mitomicina C e quinonas naturais �-lapachona e

lapachol na inativação de células humanas./Larissa Borba Santos. - Rio de Janeiro: UFRJ/Centro de Ciências da Saúde/Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho/Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), 2010.

xii, 90 f. : il. ; 31 cm. Orientador: Cláudia de Alencar Santos Lage

Dissertação (mestrado) -- UFRJ, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), 2010.

Referências bibliográficas: f. 85-96 1. Quinonas – uso terapêutico. 2. Mitomicina C – toxicidade. 3. Naftoquinonas – uso terapêutico. 4. Reparo do DNA – efeitos de drogas. 5. Anemia de Fanconi. 6. Xeroderma Pigmentoso. 7. Espécies Reativas de Oxigênio. 8. Biofísica-Tese. I. Lage, Claudia de Alencar Santos. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Centro de Ciências da Saúde, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho. III. Título.

Dedico esta dissertação de mestrado à minha família, amigos

e a todos que aproveitam da melhor forma o presente VIDA.

AGRADECIMENTOS

A Deus, a quem devo todas as minhas conquistas.

À minha familia e amigos e a todos que cultivam por mim um sentimento de amor sincero e leal, pois contribuíram direta ou indiretamente para a conclusão deste trabalho, através do seu carinho, tempo e dedicação. OBRIGADA DE TODO MEU CORAÇÃO!

Ao Dr. Alvaro da Costa Leitão, pelas ótimas sugestões e por todo o apoio material.

À Dra. Claudia de Alencar Santos Lage, pela confiança depositada em mim e pela orientação na execução do projeto.

Ao Dr. Januário Bispo Cabral Neto por sempre ter se disposto a tirar minhas dúvidas, a ajudar no planejamento dos experimentos e ter se empenhado em conseguir um local de trabalho ideal para a realização dos mesmos.

Ao Dr. Carlos Frederico Martins Menck, por ceder a maioria das linhagens celulares humanas utilizadas neste trabalho, assim como por suas sugestões sobre meus experimentos.

Ao Prof. Dr. Antonio Ventura Pinto, por ter se interessado sobre o nosso trabalho e por ceder as quinonas lapachol e �-lapachona utilizadas neste trabalho.

Ao Dr. Héctor Seuánez Abreu e a todos que compõem a Divisão de Genética do Centro de Pesquisa do Instituto Nacional do Câncer (INCa), em especial aos técnicos Claudio e Leila, por todo o apoio material e pela amizade.

À Dra. Rosa Estela Caseira Cabral que me ensinou muito, e com todo o seu carinho e paciência quase maternais, acolheu minhas dúvidas em muitos momentos durante boa parte do mestrado. Serei eternamente grata!

À Dra. Izabel de Lorena Paula Claudio, com quem compartilhei momentos de angústia e de alegria, e até mesmo material para experimento. Muito obrigada pelo carinho e amizade!

À Msc. Érika Carvalho e ao Msc. Maurício Caetano do INCa, que sempre estiveram dispostos a me auxiliar pacientemente com os experimentos de citometria de fluxo, cedendo protocolos e compartilhando suas idéias e impressões.

Ao Dr. Pedro Cabello do Laboratório de Genética Humana da Fiocruz, que foi muito gentil e prestativo ao me auxiliar nas análises estatísticas.

À FAPERJ e à CAPES, pelo apoio financeiro.

A todos os amigos do laboratório de Radiobiologia Molecular do IBCCF, que torceram e me apoiaram sempre, com palavras de conforto e alegria. Muito obrigada mesmo!

Se um dia tiver que escolher entre o mundo e o amor... Lembre-se: se escolher

o mundo ficará sem o amor, mas se escolher o amor com ele você conquistará

o mundo.

Albert Einstein

RESUMO

SANTOS, Larissa Borba. Efeitos da mitomicina C e quinonas naturais �-lapachona e lapachol na inativação de células humanas. Rio de Janeiro, 2010. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas - Biofísica) – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2010.

As quinonas fazem parte de uma ampla e variada família de metabólitos, cuja enorme distribuição na natureza possivelmente implica em funções biológicas múltiplas, com participação em diversos ciclos bioquímicos. Ultimamente, o interesse nestas substâncias cresceu devido a sua importância nos ciclos bioquímicos vitais e também ao seu destaque em variados estudos farmacológicos. O ciclo redox das quinonas tem sido um bom modelo para estudos teóricos de quimioterapia baseada em sistemas racionais de fármacos. As quinonas estudadas neste trabalho foram a mitomicina C (MMC), o lapachol e a �-lapachona. O modo de ação das quinonas depende da estrutura química da molécula de quinona e das condições internas da célula como, por exemplo, a presença de enzimas oxidorredutases, dentre outras. Após a ativação intracelular da molécula de quinona por redução enzimática, a célula pode sofrer desde danos provocados por estresse oxidativo até adutos em biomoléculas como DNA e proteínas, e danos decorrentes destes adutos. A MMC é amplamente utilizada no tratamento contra vários tipos de câncer, sozinha ou em combinação com outros quimioterápicos, sendo uma das poucas drogas efetivas contra o câncer cólon-retal. Em nível molecular, há evidência que a sua citotoxicidade se deve, primariamente, à formação de adutos do que aos radicais de oxigênio, em particular, os crosslinks. Entretanto, quanto ao potencial anti-tumoral e ao modo de atuação do lapachol e da �-lapachona, ainda há muito a ser esclarecido. Além disso, a ocorrência de resistência a quimioterápicos por parte das células tumorais devido à indução de mecanismos de reparo de DNA tem sido um estímulo na busca de novos compostos químicos. Neste contexto, foram realizados ensaios in vitro para comparar a viabilidade e o ciclo celular de linhagens celulares humanas estabelecidas, proficientes e deficientes em reparo de DNA, após tratamento com diferentes concentrações de MMC, lapachol e �-lapachona. Foram obtidas para cada linhagem, curvas de inativação celular pelos métodos de redução de sal tetrazolium (MTT) e incorporação do corante vital vermelho neutro, e o ciclo celular foi analisado através da marcação do conteúdo total de DNA com iodeto de propídeo (PI). Os resultados finais foram obtidos pela média de três ensaios e submetidos a testes estatísticos. Como conclusão, observa-se que a MMC provoca lesões que requerem proficiência em reparo de DNA, as quais parecem interferir no ciclo celular, enquanto que, para as concentrações utilizadas de lapachol, não se observa citotoxicidade significativa nem necessidade de proficiência em reparo de DNA, e para as concentrações utilizadas de �-lapachona, observa-se citotoxicidade significativa, porém parece não haver necessidade de proficiência em reparo de DNA, sendo a MMC a única que apresentou genotoxicidade.

QUINONAS, MITOMICINA C, LAPACHOL, �-LAPACHONA, REPARO DE DNA, ADUTOS, CROSSLINKS, QUIMIOTERÁPICOS, ANTINEOPLÁSICOS FITOGÊNICOS

ABSTRACT

SANTOS, Larissa Borba. Effects of MMC and natural quinones lapachol and �-lapachone in inactivation of human cells. Rio de Janeiro, 2010. Dissertation (Master in Biological Sciences - Biophysics) - Institute of Biophysics Carlos Chagas Filho, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2010.

Quinones are part of a broad and diverse family of metabolites, whose enormous distribution in nature possibly involves multiple biological functions, participating in various biochemical cycles. Lately, interest in these substances has grown due to their importance in vital biochemical cycles and also to its significance in various pharmacological studies. The redox cycling of quinones has been a good model for theoretical studies of chemotherapy based on rational systems of medicines. Quinones studied in this work were mitomycin C (MMC), lapachol and �-lapachone. The mode of action of quinones depends on the chemical structure of the quinone molecule and the internal conditions of the cell, eg, the presence of oxidoreductase enzymes, among others. Upon intracellular activation of the molecule of quinone by enzymatic reduction, the cell may suffer from damages caused by oxidative stress until adducts in biomolecules such as DNA and proteins, and also damages resulting from these adducts. The MMC is widely used in the treatment against several types of cancer, alone or in combination with other chemotherapeutic agents, being one of the few drugs effective against colorectal cancer. At the molecular level, there is evidence that its cytotoxicity is due primarily to the formation of adducts than to oxygen radicals, particularly the crosslink. However, regarding potential anti-tumor and mode of action of lapachol and �-lapachone, much remains to be clarified. Furthermore, the occurrence of resistance to chemotherapeutic agents by tumor cells due to induction of DNA repair mechanisms has been a stimulus in the search for new chemical compounds. In this context, in vitro tests were performed to compare the viability and cell cycle of human cell lines, proficient and deficient in DNA repair after treatment with different concentrations of MMC, lapachol and �-lapachone. For each strain were obtained curves for cell inactivation by the methods of reduction of tetrazolium salt (MTT) and incorporation of the neutral red vital dye, and cell cycle was analyzed by marking the content of total DNA with propidium iodide (PI). Final results were obtained by averaging three trials and subjected to statistical tests. In conclusion, we observe that MMC causes lesions that require proficiency in DNA repair, which seem to interfere with cell cycle, whereas at the concentrations of lapachol, it is not observed significant cytotoxicity neither the requirement for proficiency in DNA repair, and for the concentrations of �-lapachone, there was significant cytotoxicity, but it seems not to require proficiency in DNA repair, being MMC the only among them that appears to be genotoxic.

QUINONES, MITOMYCIN C, LAPACHOL, �-LAPACHONE, REPAIR OF DNA, ADDUCTS, CROSSLINKS, CHEMOTHERAPEUTIC AGENTS, ANTINEOPLASTIC AGENTS

LISTA DE FIGURAS, QUADROS E TABELAS

1INTRODUÇÃO.........................................................................................................13 FIGURA 1. Tipos de câncer mais incidentes estimados para 2010, exceto pele não melanoma, na população...........................................................................................15 FIGURA 2. Formação de Espécies Reativas de Oxigênio (ERO) após redução de um substrato quinoídico.............................................................................................22 FIGURA 3. Estrutura química da molécula da mitomicina C (MMC).........................24 FIGURA 4. Adutos formados entre a MMC e os sítios N2 em guaninas no DNA: (A) monoaduto (B) biaduto inter-hélice (crosslink) e (C) biaduto intra-hélice..................25 FIGURA 5. A cascata redutora de ativação da MMC e sua ligação às guaninas do DNA............................................................................................................................27 FIGURA 6. Formação exclusiva de crosslink na seqüência 5’CG•CG3’ pelo monoaduto de MMC...................................................................................................28FIGURA 7. Estrutura química da molécula de lapachol.............................................29FIGURA 8. Estrutura química da molécula de �-lapachona......................................31

1.4 REPARO DE DNA................................................................................................35 FIGURA 9. Esquema ilustrativo do reparo por excisão de nucleotídeos (NER) e suas subdivisões, GGR (Reparo Global do Genoma) e TCR (Reparo Acoplado à Transcrição)................................................................................................................38 FIGURA 10. Esquema ilustrativo relacionando muitas proteínas que parecem participar no reparo de crosslinks...............................................................................43 FIGURA 11. Esquema representativo das possíveis vias de reparo de crosslinks...46

3 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................50 QUADRO 1. Linhagens celulares humanas utilizadas...............................................51

4RESULTADOS.........................................................................................................60 FIGURA 12. Gráficos de viabilidade celular da linhagem normal (MRC5) e das linhagens deficientes em NER para MMC. A) MTT, B) vermelho neutro (Viabilidade Celular (%) versus concentração (µM))..................................................62 FIGURA 13. Gráficos de viabilidade celular da linhagem normal (MRC5) e das linhagens deficientes em NER para lapachol. A) MTT, B) vermelho neutro (Viabilidade Celular (%) versus concentração (µM))..................................................64 FIGURA 14. Gráficos de viabilidade celular da linhagem normal (MRC5) e das linhagens deficientes em NER para �-lapachona. A) MTT, B) vermelho neutro (Viabilidade Celular (%) versus concentração (µM))..................................................65 FIGURA 15. Gráficos de viabilidade celular da linhagem normal (MRC5) com e sem incubação com cafeína (1mM) após o tratamento com MMC. A) MTT, B) vermelho neutro (Viabilidade Celular (%) versus concentração (µM)).......................................68 FIGURA 16. Gráficos de viabilidade celular da linhagem normal (MRC5) com e sem incubação com cafeína (1mM) após o tratamento com lapachol. A) MTT, B) vermelho neutro (Viabilidade Celular (%) versus concentração (µM))..................69 FIGURA 17. Gráficos de viabilidade celular da linhagem normal (MRC5) com e sem incubação com cafeína (1mM) após o tratamento com �-lapachona. A) MTT, B) vermelho neutro (Viabilidade Celular (%) versus concentração (µM))..................70 FIGURA 18. Gráficos de viabilidade celular da linhagem normal (LIU) e da linhagem deficiente (NEO) no gene FANCC a A) MMC, B) lapachol e C) �-lapachona (Viabilidade Celular (%) versus concentração (µM)).................................................72

FIGURA 19. Gráficos representativos dos histogramas de ciclo celular e morte celular das linhagens A) normal (MRC5) e B) XP30RO (XP-V) para MMC (% de células versus concentração (µM)).................................................................75 FIGURA 20. Gráficos representativos dos histogramas de ciclo celular e morte celular das linhagens A) normal (MRC5) e B) XP30RO (XP-V) para lapachol (% de células versus concentração (µM)).................................................................76 FIGURA 21: Gráficos representativos dos histogramas de ciclo celular e morte celular das linhagens A) normal (MRC5) e B) XP30RO (XP-V) para �-lapachona (% de células versus concentração (µM)).................................................................77

LISTAS DE ABREVIATURAS, UNIDADES E SÍMBOLOS

ATM – ataxia telangiectesia mutated protein ATR – ATM e Rad3 related proteinBRCA – breast cancer proteinCoQ - coenzima Q CS – Cockayne syndrome DDB – DNA damage-binding protein DMEM – Dulbecco's Modified Eagle MediumDMSO – dimetilsulfóxido DNA – ácido desoxirribonucleico EBV – Epstein-Barr virusEDTA – ácido etilenodiamino tetra-acético FA – Fanconi anemiaFDA – Food and Drug Administration GGR – Reparo Global do Genoma MMC – mitomicina C MTT – 3-(4,5-Dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil brometo de tetrazolium NBS – Nijmegen breakage syndrome NER – Reparo por Excisão de Nucleotídeos NQO1 – NAD(P)H:quinona oxidoredutase 1 PARP – poli (ADP ribose) polimerase PCNA – proliferating cell nuclear antigenPI – iodeto de propídeo PIKK – phosphoinositide 3 kinase-like kinase familyRFC – replication factor cRPA – replication protein A SV40 – Simian vacuolating virus 40 TCR – Reparo Acoplado à Transcrição XP – xeroderma pigmentosumoC – graus centígrados g – grama µg – micrograma L – litro mL – mililitro µL – microlitro M – molar mM – milimolar µM - micromolar � – delta � – épsilon � – eta

SUMÁRIO

1

INTRODUÇÃO.........................................................................................................................13

1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS.............................................................................................13

1.2 CÂNCER: DEFINIÇÕES E ESTIMATIVAS........................................................................13

1.3 TRATAMENTO DO CANCER COM QUIMIOTERAPIA: EMPREGO DE QUINONAS......15

1.3.1 QUINONAS: ORIGEM NATURAL E EXEMPLOS..........................................................18

1.3.2 MODO GERAL DE ATUAÇÃO DAS QUINONAS...........................................................19

1.3.2.1 MITOMICINA C............................................................................................................23

1.3.2.2 LAPACHOL..................................................................................................................28

1.3.2.3 �-LAPACHONA............................................................................................................31

1.4 REPARO DE DNA.............................................................................................................35

1.4.1CICLO CELULAR E INDUÇÃO DO REPARO DE DNA..................................................36

1.4.2 REPARO DE DNA POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS EM CÉLULAS DE

MAMÍFEROS...........................................................................................................................37

1.4.3 REPARO DE CROSSLINKS EM CÉLULAS DE MAMÍFEROS......................................41

1.4.4 MECANISMOS DE REPARO DE DNA: ALVOS IMPORTANTES NAS

QUIMIOTERAPIAS ANTI-TUMORAIS.....................................................................................47

1.5 CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA..............................................................................48

2 OBJETIVOS.........................................................................................................................49

2.1 OBJETIVO GERAL...........................................................................................................49

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS..............................................................................................49

3 MATERIAL E MÉTODOS.....................................................................................................50

3.1 LINHAGENS CELULARES................................................................................................50

3.2 ESTOCAGEM E MANUTENÇÃO DAS LINHAGENS CELULARES.................................52

3.3 QUINONAS E TRATAMENTO DAS CÉLULAS.................................................................53

3.4 EXPERIMENTOS DE VIABILIDADE CELULAR AS QUINONAS......................................54

3.4.1 MÉTODOS COLORIMÉTRICOS....................................................................................54

3.4.2 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS................................................................................56

3.5 EXPERIMENTOS DE CICLO E MORTE CELULAR AS QUINONAS...............................57

3.5.1 CITOMETRIA DE FLUXO...............................................................................................57

3.5.2 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS................................................................................58

3.6 ANÁLISES ESTATÍSTICAS...............................................................................................59

4 RESULTADOS.....................................................................................................................60

4.1 VIABILIDADE CELULAR DAS LINHAGENS FIBROBLÁSTICAS DEFICIENTES NO

REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS (NER) AO TRATAMENTO COM

DIFERENTES QUINONAS......................................................................................................60

4.2 VIABILIDADE CELULAR DA LINHAGEM NORMAL (MRC5) AO TRATAMENTO COM

DIFERENTES QUINONAS E RECUPERAÇÃO EM MEIO DE CULTURA CONTENDO

1 mM DE CAFEÍNA...............................................................................................................66

4.3 VIABILIDADE CELULAR DA LINHAGEM LINFOBLÁSTICA DEFICIENTE EM REPARO

DE CROSSLINKS HSC536NEO (NEO) AO TRATAMENTO COM DIFERENTES

QUINONAS...........................................................................................................................71

4.4 ANÁLISE DO CICLO E MORTE CELULAR DAS LINHAGENS NORMAL (MRC5) E

XP30RO (XP-V) AO TRATAMENTO COM DIFERENTES QUINONAS...............................73

5 DISCUSSÃO......................................................................................................................78

5.1 RELEVÂNCIA DO REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS (NER) NA

VIABILIDADE DE CÉLULAS HUMANAS TRATADAS COM QUINONAS............................78

5.2 AVALIAÇÃO DA AÇÃO GENOTÓXICA DAS QUINONAS ATRAVÉS DA INCUBAÇÃO

COM CAFEÍNA......................................................................................................................80

5.3 INVESTIGAÇÃO SOBRE A FORMAÇÃO DE CROSSLINKS PELAS QUINONAS........80

5.4 INFLUÊNCIA DAS QUINONAS SOBRE O CICLO CELULAR........................................81

CONCLUSÕES.....................................................................................................................83

PERSPECTIVAS...................................................................................................................84

REFERÊNCIAS.....................................................................................................................85

APENDICE............................................................................................................................97

13

1 INTRODUÇÃO

1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS

O DNA é um alvo permanente de agentes físicos, como as radiações, e

químicos, como os aditivos alimentícios, drogas e produtos gerados no metabolismo

celular, que causam lesões na sua estrutura. Uma parte dessas lesões pode ser

evitada pela ação de barreiras químicas como filtros solares ou substâncias

antioxidantes, ou restauradas por mecanismos enzimáticos de reparo. Se não

devidamente reparadas, elas podem levar a consequências degenerativas para o

organismo. Na ausência ou falha de tais mecanismos, a mutagênese é intensificada

com o aumento da probabilidade de desenvolvimento de diversos tipos de câncer,

malformações congênitas, envelhecimento e morte celular (SANTOS, 2006).

O papel fundamental desses sistemas de reparo de DNA verifica-se quando,

por exemplo, pacientes com xeroderma pigmentosum, síndrome de Cockayne,

anemia de Fanconi, etc., são diagnosticados como portadores de suas disfunções,

caracterizando deficiência em reparação de lesões (SANTOS, 2006).

1.2 CÂNCER: DEFINIÇÕES E ESTIMATIVAS

Câncer é o nome genérico dado a um conjunto de mais de cem doenças que

têm em comum a multiplicação desordenada de células, invadindo tecidos

saudáveis. Suas causas são variadas e inter-relacionadas, podendo ser externas ou

internas ao organismo. As externas provem da exposição a agentes genotóxicos do

meio ambiente e hábitos insalubres. As causas internas são, na maioria das vezes,

geneticamente pré-determinadas, e estão ligadas à incapacidade do organismo de

se defender das agressões externas. Os fatores genéticos, tais como mutações

14

espontâneas, herança de genes codificando proteínas com diferentes eficiências no

controle da proliferação celular, apoptose e/ou sistemas de reparo do DNA, ou ainda

alterações da sua expressão agem em conjunto com os fatores ambientais criando a

susceptibilidade para o desenvolvimento do câncer. Os tumores malignos são,

assim, denominados neoplasias, distintos dos tumores benignos, normalmente

existindo como uma massa localizada de células que se multiplica vagarosamente e

guarda semelhança com o tecido original (INCa, 2010).

Importante causa de doença e morte no Brasil desde 2003, as neoplasias

malignas constituem-se a segunda causa de morte na população, representando

quase 17% dos óbitos de causa conhecida, notificados em 2007 no Sistema de

Informações sobre Mortalidade (INCa, 2010). A incidência do câncer mais que

dobrou em 30 anos e o contínuo crescimento e envelhecimento populacional farão

incrementar de forma significativa o impacto do câncer no mundo (INCa, 2010).

Em homens, a neoplasia mais comum é a de próstata, seguido por pulmão,

estômago, cólon e reto. Nas mulheres, a mais frequente é a de mama, seguido do

colo do útero, cólon e reto, estômago e pulmão (INCa, 2010). No Brasil, as

estimativas para o ano de 2010 serão válidas também para o ano de 2011, e

apontam para a ocorrência de quase 500 mil casos novos de câncer. Os tipos mais

incidentes, à exceção do câncer de pele do tipo não melanoma, serão os cânceres

de próstata e de pulmão no sexo masculino e os cânceres de mama e do colo do

útero no sexo feminino, acompanhando o mesmo perfil da magnitude observada

para a América Latina (Figura 1) (INCa, 2010).

15

Figura 1: Tipos de câncer mais incidentes estimados para 2010, exceto pele não melanoma, na população brasileira. (adaptado de http://www.inca.gov.br/estimativa/2010/index.asp?link=conteudo_view.asp&ID=2)

1.3 TRATAMENTO DO CÂNCER COM QUIMIOTERAPIA: EMPREGO DE QUINONAS

Embora grandes avanços tenham ocorrido na pesquisa de novos alvos celulares

para agentes anti-câncer, a interferência na replicação de células tumorais ainda

constitui-se como o principal mecanismo dos agentes clinicamente mais importantes.

A alquilação de DNA é um dos métodos mais simples. Isto ocorre pela ação de um

agente alquilante, possuidor de regiões eletrofílicas, que são atraídas para os sítios

nucleofílicos no DNA. Para muitos agentes alquilantes simples, a posição altamente

nucleofílica N7 da guanina é o sítio preferencial de alquilação dentre todas as bases

16

do DNA. Contudo, nos casos de agentes mais complexos, os sítios de alquilação

dependem de interações não-covalentes com o DNA (HARGREAVES et al., 2000).

A monoalquilação simples de DNA, ou seja, o agente alquilante ligado apenas

a uma hélice de DNA, pode resultar em várias consequências, incluindo o

desemparelhamento de bases, a formação de sítios apurínicos e a formação de

quebras simples em hélice. A bialquilação da hélice de DNA pode levar a biadutos

intra-hélice, inter-hélice e adutos de DNA-proteína (HARGREAVES et al., 2000). Os

crosslinks (biadutos inter-hélice) representam uma importante classe de danos

químicos ao DNA, uma vez que eles evitam a separação das hélices, bloqueando,

dessa forma, a sua replicação e a transcrição de RNA (LARMINAT et al., 1998).

Além disso, são muito tóxicos para as células em divisão por induzirem mutações e

rearranjos cromossômicos, podendo levar à morte celular (DRONKERT e KANAAR,

2001). Ocorrem em seqüências específicas que resultarão em mínima distorção do

DNA, sendo que a razão dessa preferência é a de ser requerida mínima energia

para conversão de monoadutos em crosslinks (HOPKINS et al., 1991). Foi estimado

que aproximadamente 40 crosslinks podem matar células de mamíferos deficientes

em reparo (DRONKERT e KANAAR, 2001). Uma vez que se atribui aos crosslinks a

citotoxicidade resultante desses agentes, um grande número de agentes alquilantes

bifuncionais, como a mitomicina C (MMC), tem sido usado para eliminação de

tumores malignos (MIYAGAWA, 2008).

Embora o impedimento da replicação e transcrição seja um mecanismo pelo

qual sejam eleitos agentes como as quinonas para serem utilizadas em tratamentos

de quimioterapia, o conceito da ativação biorredutiva de substâncias em células em

hipóxia tem sido estudado (DENNY e WILSON, 1986, OLIVEIRA e ALVES, 2002,

BUSTAMANTE et al., 2009), pois muitas das substâncias citotóxicas mais potentes

17

atuam em fases específicas do ciclo celular e, consequentemente, só exercem a sua

atividade contra células que se encontram em processo de divisão, como as

tumorais. Além disso, a maioria dos fármacos é altamente tóxica para o paciente e

deve ser administrada com muito cuidado. As células em hipóxia, apesar de se

dividirem, apresentam ciclo celular prolongado e permanecem indefinidamente em

repouso, sendo interessante utilizar um fármaco capaz de agir por outros

mecanismos além da alquilação (BUSTAMANTE et al., 2009).

As células em hipóxia podem apresentar maior capacidade de redução do

que as células normalmente oxigenadas e esta característica poderia ser explorada

no desenvolvimento de agentes antineoplásicos, os quais só se tornariam citotóxicos

após ativação metabólica pelas nitroredutases celulares (GU et al., 2009). Estes

agentes biorredutíveis são pró-fármacos que, in vivo, sofrem metabolização,

geralmente pelo sistema redox celular, dando origem ao fármaco. A solubilidade e

difusibilidade adequadas, a redução a espécies reativas somente nas regiões de

células em hipóxia e a atividade apenas das espécies reduzidas são propriedades

fundamentais para o sucesso da atividade dos agentes antineoplásicos seletivos

para células em hipóxia (DENNY e WILSON, 1986). Um dos fatores que explica a

resistência de tumores sólidos à quimioterapia é a dificuldade do fármaco em

alcançar as células em hipóxia (BUSTAMANTE et al., 2009).

18

1.3.1. QUINONAS: ORIGEM NATURAL E EXEMPLOS

O interesse a cerca destas substâncias tem aumentado nos últimos anos,

tanto devido à sua importância nos processos bioquímicos vitais, como também pelo

destaque cada vez maior em variados estudos farmacológicos. As quinonas são

muito difundidas na natureza (SILVA et al., 2003), estando envolvidas em etapas

importantes do ciclo de vida de seres vivos, como as ubiquinonas e as

plastoquinonas, que são intermediários da cadeia respiratória e fotossíntese,

respectivamente (SILVA et al., 2003), e as naftoquinonas, como as vitaminas do tipo

K, que possuem ação controladora da coagulação sanguínea. As quinonas naturais

mais representativas são vitais para vegetais superiores, artrópodes, fungos,

líquens, bactérias, algas e vírus, o que sugere relevância em diversas funções

biológicas (SILVA et al., 2003).

Em decorrência de diferentes arranjos quinonoídicos, com um mesmo tipo de

anel pode-se ter diferentes quinonas, dependendo das disposições relativas das

carbonilas. Essas configurações influenciam as propriedades físicas, químicas e a

atuação biológica da quinona (SILVA et al., 2003).

Vários estudos farmacológicos mostram que as quinonas são capazes de

apresentar propriedades microbicidas, tripanossomicidas, virucidas, antitumorais e

inibidoras de sistemas reparadores celulares. Destaca-se o estresse oxidativo que

provocam, ao induzirem a explosão endógena de Espécies Reativas de Oxigênio

(ERO: HO•, O2•- e H2O2). Outra atividade marcante dessas substâncias é a inibição

do complexo das topoisomerases, ação que desencadeia a apoptose celular. A

interferência das quinonas na apoptose constitui-se hoje em pesquisa interdisciplinar

de fronteira na química medicinal, existindo grande expectativa quanto à delineação

19

de estratégias racionais visando o combate de neoplasias, principalmente as

relacionadas ao câncer de próstata (DONG et al., 2009).

Exemplos de quinonas muito utilizadas em tratamentos contra o câncer são

as quinonas antibióticas provenientes de fungos do gênero Streptomyces, como a

daunorubicina isolada de S. peucenticus que possui efeito terapêutico contra

leucemia humana e a adriamicina isolada de S. coeruleorubidus, utilizada na

quimioterapia de tumores sólidos, ambas sendo também ativas contra o sarcoma

180, o carcinoma ascítico de Ehrlich e outros tipos de carcinomas (SILVA et al.,

2003). A mitomicina C (MMC), isolada de S. caespitosus, utilizada na quimioterapia

de tumores sólidos, é a uma das únicas drogas efetivas contra o câncer cólon-retal

(SCHWARTZ et al., 1995; YAO et al., 1996; TOMASZ e PALOM, 1997; MARTIN et

al., 2002). Outros exemplos de quinonas são o lapachol e a �-lapachona, ambas de

origem vegetal, que ultimamente têm sido bastante estudadas quanto a seus

potenciais terapêuticos contra o câncer (HUSSEIN et al., 2007, ALMEIDA, 2009).

1.3.2 MODO GERAL DE ATUAÇÃO DAS QUINONAS

A citotoxicidade das quinonas leva a crer que existe uma propriedade química

intrínseca na unidade quinonoídica, associada com outros fatores estruturais, que

são responsáveis pela intensidade das atividades antitumorais. Foi observado que

muitas quinonas podem ser ativadas por redução das carbonilas quinonoídicas,

gerando intermediários alquilantes através da ação de flavoenzimas celulares

(SILVA et al., 2003). Estudos sobre seu mecanismo de atuação biológica destacam

a importância do grupo quinonoídico como o grupo indispensável para a

20

biorreatividade no nível das enzimas do tipo redutases, formando ERO pró-

apoptóticas (BARREIRO e FRAGA, 2001).

Um aspecto notável quanto à ação das quinonas é que elas podem ser

citotóxicas por vários mecanismos, com consequências benéficas ou deletérias,

como por alteração no ciclo redox, arilação de substratos, intercalação na dupla

hélice do DNA, geração de sítios radicalares específicos e interferência na

respiração mitocondrial por inibição enzimática (MONKS et al., 1992; MONKS e

JONES, 2002). São consideradas venenos respiratórios por competirem com a

coenzima Q (CoQ), localizada no complexo citocrômico bc1, ou ainda, através de

sua redução à hidroquinona, que por sua vez, pode promover alquilação de enzimas

requeridas pela CoQ, no caso da mitomicina C (MMC) (OTT et al., 2007). Em ambos

há inibição do processo respiratório mitocondrial pelo bloqueio do mecanismo de

transferência de elétrons de NADH ou FADH2 para o oxigênio molecular (DON e

HOGG, 2004; CHENG et al., 2007).

Do ponto de vista toxicológico, as quinonas possuem reatividade em sistemas

biológicos por serem oxidantes e eletrofílicas. No meio biológico, a redução pode ser

monoeletrônica, catalisada por enzimas como NAPH:citocromo P450 redutase

microssômica, NADPH:citocromo b5 redutase microssômica e NADPH:ubiquinona

oxidoredutase mitocondrial. O sistema enzimático propício à redução bieletrônica é o

NAD(P)H:quinona oxidoredutase (DE MOURA, 2008). A cinética desta redução

depende de vários fatores, incluindo o potencial de redução da quinona (SILVA et

al., 2003).

A completa redução de uma quinona à hidroquinona requer dois elétrons e

dois prótons. Quinonas são espécies que experimentam reações de protonação com

dificuldade. No entanto, após a protonação, são oxidantes mais fortes do que a

21

forma não protonada. Semiquinonas (Q•-) são geradas pela redução envolvendo um

elétron e não são suficientemente básicas para serem protonadas.

Consequentemente, muitas semiquinonas existem como ânions radicais em pH

fisiológico. Por causa da doação parcial de elétrons à quinona, um ânion-radical

semiquinônico é um oxidante muito mais fraco do que a quinona original. Assim, a

química redox das quinonas, semiquinonas e hidroquinonas está ligada à sua

química ácido-base e a formação de quinonas e hidroquinonas a partir de

semiquinonas é frequente. (DE MOURA, 2008).

A redução de um elétron pela ação de redutases de um substrato

quinonoídico (Q) resulta na formação do ânion semiquinona (Q•-) (Equação 1), que

pode reagir com o oxigênio molecular formando o ânion-radical superóxido (O2•-)

(Equação 2), que subsequentemente se transforma, tanto espontaneamente

(Equação 3) quanto após catálise enzimática pela superóxido dismutase (SOD)

(Equação 4), em peróxido de hidrogênio (H2O2). O ânion-radical superóxido também

pode reduzir Fe+3 a Fe+2. O H2O2 então reage com o Fe+2 para gerar o radical

hidroxila (HO•) (Reação de Fenton) que, provavelmente, é a espécie reativa

responsável pelo dano oxidativo, pois não há enzima presente no meio celular que a

capture (DE MOURA, 2008). O ânion-radical superóxido também pode gerar HO•

pela reação com H2O2. Embora o H2O2 não seja um radical livre, é uma substância

bastante reativa, podendo promover também a oxidação de algumas biomoléculas.

Em resumo, HO• e H2O2 são as principais espécies responsáveis pelo estresse

oxidativo celular (SILVA et al., 2003).

As células desencadeiam mecanismos de desintoxicação através dos agentes

antioxidantes intracelulares na tentativa de eliminar estas espécies oxidantes. Em

sistemas onde ocorre persistência do desequilíbrio redox ou na falta de mecanismos

22

de proteção, há aumento intracelular dos oxidantes O2•- e H2O2, danificando

componentes celulares vitais como membranas, através da peroxidação dos lipídios

e da diminuição da capacidade antioxidante celular. A atuação destas espécies

oxidantes leva a consequências adversas, por alteração do sinal da transcrição na

expressão de genes, mutagenicidade e/ou por ativação de fatores responsáveis pela

indução da apoptose (SILVA et al., 2003).

(red.) Q + e- � Q•- (Equação 1)

Q•- + O2 � O2•- (Equação 2)

2H+

O2•- + e- � H2O2 (Equação 3)

(SOD) 2 O2

•- + 2H+ � H2O2+O2 (Equação 4)

Figura 2: Formação de Espécies Reativas de Oxigênio (ERO) após redução de um substrato quinoídico.

Embora muito complexo, com etapas ainda desconhecidas, a influência das

quinonas sobre o ciclo redox tem sido o foco de estudos, pois a indução da apoptose

e os danos provocados pelo estresse oxidativo estão entre os principais efeitos que

as quinonas provocam em sistemas biológicos. Isto é importante, já que as espécies

O2•- e H2O2 estão sendo consideradas como dois importantes sinais reguladores de

condições intracelulares. Acredita-se que o aumento de suas concentrações

favoreça a apoptose (SILVA et al., 2003).

23

1.3.2.1 MITOMICINA C

As mitomicinas são um grupo de potentes antibióticos que foram descobertos

nos anos 50 por microbiologistas japoneses em culturas de fermentação de

Streptomyces, em particular, Streptomyces caespitosus, sendo, por esse motivo,

denominadas de antibióticos antitumorais naturais (HATA et al., 1956). Quatro

mitomicinas de origem natural são antibióticos efetivos contra bactérias Gram

positivas e Gram negativas, mas somente a mitomicina C (MMC) e a porfiromicina

apresentam atividade antitumoral. A MMC (Figura 3), por sua vez, é a mais

conhecida de todas as aziridilquinonas e, atualmente, é a mais relevante

clinicamente. Essencialmente, essa droga tem três grupamentos químicos

potencialmente ativos, que são uma quinona, uma aziridina não-usual (C1) e um

grupo carbamato (C10). Muitos estudos têm mostrado que os três grupamentos

funcionais são importantes na ação citotóxica da MMC, e os mecanismos de

ativação têm sido alvo de grande debate no meio científico (HARGREAVES et al.,

2000).

Aprovada pelo Food and Drug Administration (FDA) como droga anti-câncer

em 1974, a MMC foi, e continua sendo, usada amplamente no tratamento contra

câncer de cabeça e pescoço, bexiga, estômago, pâncreas, pulmão e próstata, sendo

também uma das poucas drogas efetivas contra câncer cólon-retal (SCHWARTZ et

al., 1995; YAO et al., 1996; TOMASZ e PALOM, 1997; MARTIN et al., 2002). Além

de sua atividade antitumoral, a MMC apresenta uma variedade de efeitos biológicos

específicos em células de mamíferos ou microorganismos, incluindo a inibição

seletiva da síntese de DNA, recombinação, indução de aberrações e quebras

cromossômicas, trocas entre cromátides-irmãs, e indução do reparo de DNA

24

(resposta SOS) em bactérias, além de ser utilizada para diagnóstico de anemia de

Fanconi (IYER e SZYBALSKI, 1964; CARRANO et al., 1979; BAKSHI et al., 1998).

Figura 3: Estrutura química da molécula da mitomicina C (MMC) (TOMASZ e PALOM, 1997).

Em nível molecular, a MMC age como um agente alquilante, produzindo

espécies reativas capazes de gerar radicais de oxigênio através de um ciclo redox,

assim como biadutos inter-hélice (crosslinks) e uma variedade de monoadutos na

curvatura menor do DNA. Há evidência que a sua citotoxicidade se deve,

primariamente, à formação de adutos do que aos radicais de oxigênio, em particular,

os obstrutivos crosslinks (PALOM et al., 2002). In vivo, a atividade da MMC para

formar crosslinks no DNA foi primeiramente descoberta por Iyer e Szybalski (1963)

em bactérias, usando a curva de renaturação do DNA e técnicas de sedimentação

para detectar DNA contendo crosslinks. Um único crosslink por genoma é suficiente

para causar a morte de uma célula bacteriana sensível (IYER e SZYBALSKI, 1964),

além do crosslink ser muito mais tóxico do que uma alquilação monofuncional

(BRENDEL e RUHLAND, 1984; PRATT et al., 1994).

Para que as moléculas de MMC formem adutos no DNA, elas precisam ser

enzimaticamente reduzidas dentro da célula. O grupamento quinona deve passar

por uma redução, sendo a droga transformada em um alquilante altamente reativo, o

25

que foi primeiramente descrito por Iyer e Szybalski (1964). O átomo do anel

aziridínico C1 e o átomo C10 ligado à função carbamato são posições que reagem

com a posição N2 da guanina do DNA. O deslocamento subseqüente por dois

nucleófilos no DNA resulta em um crosslink MMC-DNA. Essa hipótese mostrou ser

extremamente útil, iniciando investigações experimentais do mecanismo de ação da

MMC, que continuam até hoje.

O biaduto intra-hélice de MMC foi descoberto por Bizanek e colaboradores

(1992). As estruturas dos principais adutos MMC-DNA estão representadas nas

figuras 4A, 4B e 4C.

(A) Monoaduto Guanina

(B) Biaduto inter-hélice

Guaninas

26

(C) Biaduto intra-hélice

Guaninas

Figura 4: Adutos formados entre a MMC e os sítios N2 em guaninas no DNA: (A) monoaduto (B) biaduto inter-hélice (crosslink) e (C) biaduto intra-hélice (TOMASZ e PALOM, 1997).

Como mostrado a seguir na figura 5, inicialmente, com a redução da quinona,

a MMC se liga covalentemente por C1 (originalmente parte do anel aziridínico) ao

DNA, formando o monoaduto MMC-DNA na posição N2 da guanina (Figura 4A). Se

duas guaninas estão adequadamente próximas em um DNA duplex, servindo como

substratos para ambas funções ativas de uma molécula de MMC, o átomo C10

portando a função carbamato termina por liga-se ao DNA e forma um biaduto intra-

hélice ou inter-hélice MMC-DNA, na posição N2 dessa outra guanina (Figura 4C).

Não havendo a condição de proximidade espacial necessária para a conversão do

monoaduto em biadutos, o grupamento carbamato em C10 reage com a água

(BOROWY-BOROWSKI et al., 1990b), gerando um monoaduto MMC-DNA de

decarbamoil-mitomicina C, na posição N2 da guanina. Há ainda monoadutos não

diretamente formados pela MMC ativada. Ao invés disso, são produtos de alquilação

feitos pelo metabólito da MMC, 2,7-diaminomitoseno, que é formado in situ agindo

por ele próprio como um alquilante monofuncional de DNA (PALOM et al., 2002).

27

Figura 5: A cascata redutora de ativação da MMC e sua ligação às guaninas do DNA (adaptado de TOMASZ, 1995).

Além da alta seletividade por N2 de guaninas, as monoalquilações do DNA

promovidas pela MMC ocorrem em média de 5 a 10 vezes mais na sequência 5'

CpG que nas outras três seqüências dinucleotídicas 5'NpG (TOMASZ e PALOM,

1997). Revelou-se que não é o resíduo 5'C que aumenta a reatividade da guanina

adjacente com a MMC, mas sim o resíduo de guanina na hélice oposta. Foi proposto

que o grupo 2-amino da guanina da fita oposta forma uma ligação de hidrogênio

específica com o anel da função carbamato em C10 da MMC ativada e que essa

interação promove a ligação covalente com o grupo 2-amino da guanina alvo

(TOMASZ e PALOM, 1997).

Entretanto, na segunda alquilação, para formação de crosslinks (Figura 3B), a

especificidade é absoluta à sequência duplex de DNA 5' CpG•CpG 3' (TENG et al.,

28

1989; BOROWY-BOROWSKI et al., 1990a). A restrição para formação de crosslink

aumentada para sequências 5' CpG•CpG 3' em relação à restrição para as

monoalquilações se dá por um alinhamento específico do monoaduto de guanina na

curvatura menor do DNA, não tendo a ver com a seqüência contexto (TOMASZ e

PALOM, 1997). Isto dependeria da orientação em que o monoaduto se ligaria, de

forma a se adequar na curvatura menor do DNA (Figura 6).

Figura 6: Formação exclusiva de crosslink na seqüência 5’CG•CG3’ pelo monoaduto de MMC (TOMASZ e PALOM, 1997).

1.3.2.2 LAPACHOL

Dentre as naftoquinonas naturais destaca-se o lapachol, 2-hidroxi-3(3-metil-2-

butenil)-1,4-naftoquinona (Figura 7), que pode ser considerado um dos principais

representantes do grupo de quinonas. Tem sido encontrado como constituinte de

várias plantas das famílias Bignoniaceae, Verbenaceae, Proteaceae, Leguminosae,

29

Sapotaceae, Scrophulariaceae e Malvaceae. Entretanto, sua ocorrência é maior na

família Bignoniaceae, no gênero Tabebuia SP (HUSSAIN et al., 2007)

Figura 7: Estrutura química da molécula de lapachol (HUSSAIN et al., 2007).

O lapachol é de fácil extração da serragem da madeira de várias espécies de

ipê, plantas do Brasil e da fronteira com a Argentina (SILVA et al., 2003).

Uma avaliação dos efeitos terapêuticos do lapachol começou no final dos

anos 60 (RAO, McBRIDE e OLESON,1968). Depois deste estudo, muitos outros

confirmaram a eficácia desta naftoquinona como um agente antineoplásico.

Entretanto, as concentrações elevadas necessárias para que esta droga atue como

um agente quimioterápico eficaz no câncer humano resultaram em efeitos

secundários muito tóxicos, sendo interrompidos novos estudos sobre a ação do

lapachol como um agente antineoplásico. Nenhum destes estudos considerou os

efeitos do lapachol em nível molecular (SILVA et al., 2003).

No Brasil, em 1952, o professor Osvaldo Gonçalves de Lima (UFPE) e

colaboradores estudaram o efeito anti-tumoral do lapachol, que demonstrou

atividade significante contra tumores em ratos e pacientes humanos. Estudos iniciais

30

conduzidos no Departamento de Antibióticos da UFPE em 1973 demonstraram forte

ação contra bactérias Gram-positivas (ALMEIDA, 2009). O Prof. B. Gilbert da UFRJ,

começou seus estudos a partir da década de 70 e, desde então, vários outros

pesquisadores, como o Prof. A.V. Pinto, do NPPN-UFRJ e o grupo da Profa. M.O.F.

Goulart (UFAl) dedicam-se ao estudo destas quinonas (SILVA et al., 2003).

O principal interesse no lapachol está na sua capacidade de induzir o

estresse oxidativo através da formação intracelular de ERO, como H2O2, O2•- e HO•,

os quais podem danificar componentes celulares importantes, tanto de células

normais como de malignas (SILVA et al., 2003, ALMEIDA, 2009). Esta interferência

altera o balanço natural de sinais que interferem nos checkpoints ou pontos de

checagem da divisão celular. A alteração da normalidade pode induzir a apoptose

como alternativa, caso a célula não consiga se recuperar do estresse oxidativo

(SILVA et al., 2003, ALMEIDA, 2009).

Apesar de possuir estágios de atuação biológica não muito conhecidos, o

lapachol deve atuar por diferentes mecanismos. Em relação à quimioterapia, o

lapachol age no fenômeno da apoptose sobre células do câncer, as quais possuem

crescimento desordenado (MAKIN e DIVE, 2001; HICKMAN, 2002). Acredita-se que

a atividade antitumoral do lapachol pode ser devida à sua interação com ácidos

nucléicos (ALMEIDA, 2009). Adicionalmente tem sido proposto que ocorreria a

interação do lapachol entre pares de base da hélice do DNA com inibição posterior

de replicação do DNA e de síntese do RNA (HUSSAIN et al., 2007).

31

1.3.2.3 �-LAPACHONA

O lapachol foi matéria prima para as sínteses de muitas outras substâncias de

distintas biodinamicidades. Uma das mais ativas foi a �-lapachona (3,4-dihidro-2,2-

dimetil-2H-naftol(1,2-b)pirano-5,6-diona) (Figura 8). Esta orto-piranonaftoquinona

também é encontrada em pequenas quantidades in natura, e pode ser obtida

através de uma semi-síntese a partir do lapachol através de ação controlada do calor

(D’ALBUQUERQUE, 1968). Tal qual o lapachol, mostra uma diversificada ação

farmacológica envolvendo principalmente desequilíbrio do ciclo redox.

Figura 8: Estrutura química da molécula de �-lapachona (HUSSAIN et al., 2007).

Em 1966, Gonçalves de Lima observou que havia a progressiva diminuição

de atividade antibiótica à medida que aumentava o grau de pureza do lapachol,

obtido do cerne do ipê roxo, chegando a isolar um dos componentes responsáveis

pela maior atividade do lapachol bruto, a �-lapachona, dando início a várias

pesquisas sobre essa nova descoberta. Mais tarde foi evidenciado que após a

absorção gastrintestinal, por administração oral em ratos, o lapachol é rapidamente

32

metabolizado e grande parte transformado em �-lapachona, o que impulsionou ainda

mais as pesquisas direcionadas para este novo fitofármaco (NAYAK et al., 1968).

A �-lapachona exibe variados tipos de atividade contra diferentes linhagens

de células in vitro, principalmente células humanas malignas de pulmão, mama,

cólon e reto, próstata, epitélio e sangue. Entretanto, ainda há muito para se

esclarecer em relação ao exato mecanismo de ação da �-lapachona e seu alvo

intracelular. O que se observa é que dependendo do tipo de célula e da

concentração utilizada de �-lapachona, o grau do seu efeito inibitório é diferente e a

atuação ocorre sobre moléculas e por mecanismos diferentes. No que diz respeito à

pesquisa sobre o uso da �-lapachona em tratamentos contra câncer, há muita

indefinição nestes quesitos. Provavelmente, sua atuação deve ser diversificada

(SILVA et al., 2003).

Em pesquisas in vitro com T. cruzi verificou-se que células tratadas com �-

lapachona apresentavam-se com a cromatina arranjada de forma anormal,

alterações das membranas citoplasmáticas, nuclear e mitocondrial, com inchaço nas

mitocôndrias, sugerindo a redução na taxa respiratória e inibição da oxidação da

glicose e do piruvato (DOCAMPO et al., 1977). Em células infectadas com T. cruzi

foi observado que a �-lapachona possui capacidade de gerar oxi-radicais, induzindo

a liberação de O2•- e H2O2 (DOCAMPO et al.,1978). Além disso, foi visto que

dependendo da concentração utilizada, a �-lapachona possui capacidade de

desarranjar as cromátides do T. cruzi, provocando degradações de DNA, RNA e

proteínas, irreversíveis ou não (GOIJMAN e STOPPANI, 1985).

Na área da virologia, é sabido que a �-lapachona bloqueia a transcrição do

vírus da imunodeficiência humana 1 (HIV-1), através de um mecanismo que bloqueia

seletivamente a expressão gênica da repetição longa terminal viral (LTR) (LI et al.,

33

1993). Da mesma forma, é um potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos

vírus mieloblastose aviária (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV). A ação

inibitória sobre estas enzimas revelou-se específica se comparada com a de outros

inibidores conhecidos (SILVA et al., 2003)

A combinação da �-lapachona com outras substâncias que atuam em

diferentes mecanismos celulares pode ser uma boa alternativa quimioterápica.

Boothman e colaboradores em 1987 observaram um sinergismo entre a �-lapachona

e radiosensibilizadores halogenados de pirimidina em células de carcinoma

epidermóide de laringe humano (HEP-2), por inibição do reparo de DNA aumentando

assim a letalidade das células. Há relatos que a �-lapachona combinada com o

taxol, base do fármaco antineoplásico Taxotere de uso clínico, constitui-se em uma

associação muito efetiva contra tumores humanos do ovário e da próstata,

implantados em ratos imunossuprimidos, sugerindo uma possível quimioterapia em

humanos baseada na combinação destas duas drogas (SILVA et al., 2003).

Também foi verificado um aumento de sensibilidade de células neoplásicas aos raios

X, semelhante ao que acontece com a camptotecina, que é um inibidor específico da

topoisomerase I (BOOTHMAN, TRASK e PARDEE, 1989).

A indução da apoptose pela �-lapachona parece ser independente da

expressão de p53 e p21 e da super expressão ectópica da proteína bcl-2, um

mecanismo diferente da radiação ionizante e quimioterapia convencional, o que

pode significar maior dificuldade para que as células tumorais desenvolvam

resistência ao tratamento com �-lapachona (LI et al., 1995).

Existem evidências que indicam a participação da enzima NQO1

(NAD(P)H:quinona oxidoredutase 1) no processo de ativação da �-lapachona na

apoptose, aumentando a citotoxicidade. Esta enzima é mais expressa em vários

34

tipos de tumores, incluindo os de mama, pulmão e cólon-retal, do que em tecidos

normais, podendo se constituir em uma nova estratégia para a quimioterapia de

alguns tipos de câncer, como o de próstata (SILVA et al., 2003).

A �-lapachona parece ter induzido danos aos cromossomos de células do

ovário de hamsters chineses (CHO), sugerindo interação com a enzima poli (ADP

ribose) polimerase (PARP) (SILVA et al., 2003). Tipicamente, PARP-1 facilita o

reparo de DNA pela religação de quebras de fita simples (HUSSAIN et al., 2007).

A �-lapachona também age como inibidora das topoisomerases I e II. Há

aumento do efeito inibitório pela incubação direta desta substância com a

topoisomerase I antes da adição de DNA como substrato, o que sugere a interação

direta da �- lapachona com a topoisomerase I. Observou-se que esta ação depende

da presença de NQO1-redutase. Este modo de atuação é diferente em relação ao

de outras substâncias inibidoras das topoisomerases, como a camptotecina e o

topotecan. (SILVA et al., 2003).

Para um efeito citotóxico sinergístico ambas as enzimas topoisomerases

devem ser inibidas. Observou-se que na redução eletroquímica da �- lapachona na

presença dsDNA e ssDNA não houve danos diretamente no DNA, indicando que a

sua atuação é direta nas DNA toposisomerases (SILVA et al., 2003).

Em sua ação natural, as topoisomerases ligam-se na estrutura do DNA por

uma supertorção topológica, e quando fazem cortes permitem que as funções de

transcrição, reparação, replicação e estruturação do cromossomo ocorram

normalmente. Após estes processos, as células se dividem seguindo uma série de

etapas do ciclo celular (G1, S, G2 e M). Qualquer alteração no balanço entre estas

enzimas é suficiente para induzir a apoptose (SILVA et al., 2003).

35

A possibilidade de uma ação direta da �-lapachona no ciclo catalítico das

enzimas da topoisomerase I e II e a geração endógena de O2•- e H2O2 são decisivos

para o desencadeamento da apoptose. Entretanto, não se deve considerar a

toxicidade elevada desta quinona como um fator limitante ao uso clínico. Há

expectativas de que estudos futuros da relação atividade biológica versus estrutura

química possam levar à diminuição da toxicidade (SILVA et al., 2003).

1.4 REPARO DE DNA

Ao longo da vida de um organismo são produzidas células alteradas, mas os

mecanismos de defesa possibilitam a interrupção desse processo, com sua

eliminação subsequente. As alterações que permanecem no DNA são denominadas

mutações. Elas podem ser resultado tanto de erros durante a duplicação do DNA, na

divisão celular, quanto de danos causados por agentes externos diretamente no

DNA. Ocorrem em todos os seres vivos, sendo fundamentais para a evolução e

diversificação das espécies (RIBEIRO et al., 2003).

Somente quando ocorrem em genes específicos as alterações podem evoluir

para um crescimento celular desordenado. Genes específicos são aqueles que

estão relacionados com a estimulação e inibição da proliferação celular. Somente

quando há um determinado número de alterações nesses genes, é que surgem as

células neoplásicas, já que os danos no DNA além de irreversíveis são cumulativos.

Os agentes mutagênicos podem acelerar ou aumentar o aparecimento de mutações

que se associam ao surgimento de neoplasias (RIBEIRO et al., 2003).

36

1.4.1 CICLO CELULAR E A INDUÇÃO DO REPARO DE DNA

As células possuem redes complexas de sinalização celular que monitoram

cuidadosamente a integridade do genoma durante as fases do ciclo celular, para que

somente células sadias entrem em mitose. Embora seja somente parte da

maquinaria celular que reconhece e responde aos danos no DNA, a cascata de

sinalização que regula especificamente a parada do ciclo celular após o dano no

DNA pode ser considerada como uma rede complexa de caminhos interconectados

que consistem em três componentes principais: sensores, transdutores de sinal, e

efetores. Eles formam o que se chama de checkpoints ou pontos de checagem

(O’DRISCOLL e JEGGO, 2006).

Os danos no DNA provocam o recrutamento de complexos multiprotéicos

(sensores) que então ativam os transdutores ATM (ataxia telangiectesia mutated

protein) e ATR (ATM e Rad3 related protein), os quais pertencem à família PIKK

(phosphoinositide 3 kinase-like kinase family). Em geral é aceito que a ativação de

ATR seja conduzida por quebras simples no DNA formadas em consequência de

forquilhas de replicação paradas, enquanto ATM é o iniciador principal da resposta

às quebras duplas no DNA resultantes da radiação ionizante e de outros tipos de

dano de DNA. Uma vez ativadas, ATM e ATR fosforilam substratos, iniciando uma

cascata que resulta na parada do ciclo celular e reparo de DNA. (O’DRISCOLL e

JEGGO, 2006).

37

1.4.2 REPARO DE DNA POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS EM CÉLULAS DE

MAMÍFEROS

A reparação por excisão de nucleotídeos consiste em uma série de reações

enzimáticas requeridas para remover virtualmente qualquer lesão do DNA, incluindo

a maioria, senão todas, as removíveis pela reparação por excisão de bases. Os

nucleotídeos lesados são excisados como fragmentos de tamanho fixo,

independentemente da natureza da lesão. O mecanismo é constituído de 5 etapas

gerais: reconhecimento da lesão, abertura local da dupla-fita de DNA, dupla incisão,

síntese de reparo e ligação. (LEITÃO et al., 2005).

O sistema é constituído de dois subcaminhos denominados Reparo Global do

Genoma (GGR) e Reparo Acoplado à Transcrição (TCR), diferindo apenas nos

passos iniciais do reconhecimento do dano de DNA. O GGR remove lesões de

partes do genoma que não estão sendo transcritas. O TCR promove a remoção de

danos nos genes ativamente transcritos, sendo o molde transcrito reparado mais

rapidamente que o não transcrito. Além disto, em humanos, o TCR ocorre somente

nos genes transcritos pela RNA polimerase II (Figura 9). (LEITÃO et al., 2005)

38

Figura 9: Esquema ilustrativo do reparo por excisão de nucleotídeos (NER) e suas subdivisões, GGR (Reparo Global do Genoma) e TCR (Reparo Acoplado à Transcrição). (Adaptado de http://www.rndsystems.com/mini_review_detail_objectname_MR03_DNADamageResponse.aspx)

Reconhecimento da lesão

Abertura local

Dupla incisão

Síntese de DNA

Ligação

39

Existem genes implicados em NER, XP-A, B, C, D, E, F e G, cuja deficiência

provoca a doença xeroderma pigmentosum, e a deficiência em XP-V, uma forma

variante, provoca uma apresentação clínica similar à de pessoas que portam

xeroderma pigmentosum, mas que é causada por defeitos na DNA polimerase �

(eta) envolvida em síntese translesão. A DNA polimerase � é uma polimerase

especializada em sintetizar frente a uma lesão instalada na fita de DNA molde,

evitando que a replicação seja interrompida e uma lacuna seja gerada, pois as DNA

polimerases de extensão � (delta) e � (épsilon), não são capazes de reconhecer a

lesão e sintetizar sobre ela (LEITÃO et al., 2005, MUNIANDY et al., 2010 ).

GGR requer a proteína XP-C para o reconhecimento da distorção provocada

pela lesão, enquanto TCR é iniciado quando a RNA polimerase II pára em uma lesão

no DNA, pois este evento serve como um sinal para reconhecimento de dano. Os

passos seguintes são realizados da mesma forma, com a entrada de XP-A, TFIIH

(fator de transcrição humana II), RPA, assim como as nucleases ERCC1-XPF e XPG

para a incisão da lesão (LEITÃO et al., 2005, MUNIANDY et al., 2010).

No GGR, o complexo XP-C-HHR23B se liga ao DNA simples-fita numa

extensão de 30 nucleotídeos em torno da lesão e sua afinidade por DNA danificado

é consideravelmente maior que para DNA não-danificado. A proteína XP-A também

tem habilidade em se ligar ao DNA, mas não parece participar exatamente no

primeiro passo de reconhecimento do dano de DNA. Entretanto, é essencial para a

formação do complexo de pré-incisão no sítio danificado na preparação para a

reação de dupla-incisão. XP-A se liga parcialmente com considerável eficiência ao

duplex de DNA a substratos de fita simples do mesmo tamanho (LEITÃO et al.,

2005, MUNIANDY et al., 2010).

40

A proteína RPA (Replication Protein A) é composta por três subunidades

(RPA1, 2 e 3), liga-se à fita simples de DNA e é também um componente essencial à

formação do complexo de pré-incisão do DNA danificado. RPA interage com muitos

fatores NER, incluindo XP-A, e é provável que seja parte da holoenzima DNA

polimerase que sintetiza nas lacunas de excisão para completar o processo NER

(LEITÃO et al., 2005, MUNIANDY et al., 2010).

O TFIIH possui atividade DNA helicase (dependente de ATP), necessária

para produzir complexos abertos de DNA durante a iniciação da transcrição pela

RNA polimerase II e para NER. Ele consiste de 10 subunidades, dentre elas XP-B e

XP-D. Ambas proteínas são ATPases dependentes de DNA e possuem atividade

helicase (LEITÃO et al., 2005, MUNIANDY et al., 2010).

ERCC1 e XPF formam um complexo heterodimérico. Possuem atividade

nuclease estrutura-específica, e cortam junções de DNA entre um duplex e uma fita

simples no lado 5’ da lesão, uma vez que a dupla-hélice tenha sido aberta no sítio da

lesão. A proteína XPG corta muitos tipos de estruturas de DNA contendo junções

entre DNA não pareado e duplex, no lado 3’ da lesão. Desta forma, ocorre a dupla-

incisão, onde é gerado um fragmento de DNA de 27 a 30 nucleotídeos contendo a

lesão, que será retirado da dupla-hélice. Após a dupla-incisão, algumas subunidades

permanecem no complexo pós-incisão, de tal maneira que não haja uma lacuna em

fita simples como intermediário e só serão retiradas pelas proteínas de síntese de

reparo (LEITÃO et al., 2005, MUNIANDY et al., 2010).

Para finalizar o reparo, DNA polimerases realizam a síntese de reparo que

consiste em sintetizar na lacuna gerada pelas incisões, um novo fragmento de DNA.

Esse processo requer RPA, DNA polimerase � (delta) e � (épsilon), PCNA

(Proliferating Cell Nuclear Antigen) e RFC (Replication Factor C). O fator RFC atua

41

como casamenteiro para PCNA, conduzindo-o ao DNA e então conferindo

processividade às DNA polimerases. RFC/PCNA parecem dissociar o complexo pré-

incisão e formar um local de entrada para a síntese de reparo, possivelmente de

maneira análoga à replicação. A lacuna é fechada de maneira precisa pela DNA

ligase I (LEITÃO et al., 2005, MUNIANDY et al., 2010).

No TCR, como já foi mencionado, somente o início da reparação é diferente.

Duas proteínas são necessárias para fazer a ligação transcrição-reparo, CS-A e CS-

B. A deficiência em uma dessas proteínas provoca a síndrome de Cockayne. A

proteína CS-B, mas não a CS-A, interage diretamente com a RNA polimerase II.

Quando a DNA polimerase II é bloqueada no sítio da lesão, CS-A e CS-B ativam

TCR. Após a iniciação do TCR, todo o restante do reparo ocorre da mesma forma

que em GGR (LEITÃO et al., 2005, MUNIANDY et al., 2010).

1.4.3 REPARO DE CROSSLINKS EM CÉLULAS DE MAMÍFEROS

Crosslinks, se não removidos, podem provocar quebra cromossômica,

rearranjos ou morte celular. Seu acúmulo contribui para a instabilidade genômica e

envelhecimento de tecidos e órgãos. Por causa da sua toxicidade aumentada em

células proliferativas em comparação a agentes formadores de monoadutos, drogas

que promovem crosslinks têm recebido aplicação extensiva como drogas anti-

câncer. Por serem lesões que acoplam ambas as fitas da dupla-hélice, múltiplas vias

de reparo estão envolvidas, e o reparo é mais complexo que para monoadutos

(MUNIANDY et al., 2010).

42

A hipersensibilidade a agentes formadores de crosslinks é um aspecto

comum de células derivadas de indivíduos com desordens de instabilidade genômica

como anemia de Fanconi. (TANAGUSHI e D'ANDREA, 2006)

A anemia de Fanconi pode ser dividida pelo menos em 12 grupos de

complementação (A, B, C, D1, D2, E, F, G, I, J, L, e M), e 11 dos 12 genes

responsáveis pela doença foram identificados (TANAGUSHI e D'ANDREA, 2006). As

proteínas codificadas por esses genes (proteínas FA) incluem uma ubiquitina ligase

(FANC-L/PHF9/POG), uma proteína monoubiquitinada (FANC-D2), uma helicase

(FANC-J/BACH1/BRIP1), uma proteína com motivos de helicase e um motivo de

nuclease (FANC-M), e uma conhecida proteína de susceptibilidade aos cânceres de

mama e de ovário (FANC-D1/BRCA2). As proteínas FA (que incluem BRCA2) e

outra conhecida proteína de susceptibilidade aos cânceres de mama e de ovário,

BRCA1, cooperam em um processo comum de reparo de crosslinks no DNA,

parecendo existir uma rede anemia de Fanconi-BRCA. Além disso, a interação

molecular e funcional de proteínas FA com proteínas responsáveis para outras

síndromes genéticas raras da instabilidade cromossômica na resposta de dano do

DNA está mais bem entendida (TANAGUSHI e D'ANDREA, 2006).

Consequentemente, a via FA parece atuar na regulação do reparo de DNA (Figura

10).

43

Figura 10: Esquema ilustrativo relacionando muitas proteínas que parecem participar no reparo de crosslinks (adaptado de TANAGUSHI e D'ANDREA, 2006).

Cromatina

crosslink

44

O reconhecimento de um crosslink ligado ao DNA pode ocorrer de diferentes

formas, dependendo da fase do ciclo celular em que a célula se encontra, e do local

do genoma onde se formou (MUNIANDY et al., 2010)

Como mostrado na a seguir na figura 11, no contexto de um DNA que não

está se replicando, a distorção da estrutura helicoidal do DNA causada pela lesão

atrai as proteínas envolvidas na fiscalização global de dano do DNA. Este processo

envolve proteínas da via GGR, com XP-C conduzindo o reconhecimento inicial. A

parada da RNA polimerase no local da lesão durante a transcrição pode igualmente

servir como meio do reconhecimento de crosslink no DNA que não está se

replicando, envolvendo proteínas da via TCR. Após a formação do complexo de pré-

incisão, ocorre a incisão nos dois lados da lesão em uma das fitas da dupla-hélice

pelo complexo XPF-ERCC1 e por XP-G (não mostrado na figura), gerando uma

estrutura aberta onde polimerases especializadas podem realizar síntese translesão

a partir do molde contendo lesão. A estrutura que compreende uma das fitas ligada

pelo monoaduto gerado ao fragmento de DNA incisado, pode ser reconhecida por

DDB (DNA damage-binding protein) e talvez igualmente por glicosilases tais como

MPG ou Neil1 (MUNIANDY et al., 2010). Novamente, haverá processamento por

NER, que removerá o aduto restante na fita oposta.

Um crosslink também pode impedir a progressão de uma forquilha de

replicação simples ou dupla, o que é um atrativo às proteínas da via da anemia de

Fanconi, dentre outras. O reconhecimento inicial provavelmente é mediado pelo

complexo FANCM-FAAP24, que se torna parte do complexo FA. O complexo FA é

necessário para recrutar as proteínas de FANCD2 e de FANCI que são modificadas

através de ubiquitinação e de fosforilação. O crosslink é incisado por XPF-ERCC1 e

por Mus81-EME1 na fita principal, gerando uma quebra de fita dupla na forquilha. No

45

caso das forquilhas convergentes, o primeiro ciclo da incisão pode ocorrer em

qualquer uma das fitas. A estrutura aberta será preenchida por polimerases de

síntese translesão. Quando uma forquilha simples é interrompida, as polimerases

estenderão uma fita parental para preencher a abertura. Quando duas forquilhas

convergem em um crosslink, a fita-filha líder será estendida para contornar a lesão.

Após remoção do aduto restante na fita oposta pela via NER, a forquilha quebrada

será reconstruída por recombinação (MUNIANDY et al., 2010).

46

Figura 11: Esquema representativo das possíveis vias de reparo de crosslinks (adaptado de MUNIANDY et al., 2010).

Crosslink

Duplex de DNA Transcrição Replicação Convergência da forquilha de replicação

47

1.4.4 MECANISMOS DE REPARO DE DNA: ALVOS IMPORTANTES NAS QUIMIOTERAPIAS ANTI-TUMORAIS

A habilidade das células de reparar crosslinks é uma causa crítica

determinante da sensibilidade e os estudos clínicos recentes indicam que a

capacidade do reparo do DNA está implicada fortemente na sensibilidade inerente

do tumor e na resistência adquirida à drogas. Uma compreensão detalhada dos

mecanismos celulares que atuam para eliminar estas lesões críticas do DNA é

claramente importante. Sabe-se que desde bactérias, leveduras até células de

mamíferos, os crosslinks são eliminados pela ação coordenada de diversos

caminhos do reparo de DNA. Este conhecimento pode permitir o desenvolvimento de

alternativas para a resposta do tumor a agentes intercalantes e deve igualmente

ajudar no desenho de agentes mais eficazes que evadem o reparo de DNA. Além

disso, as proteínas que medeiam as reações do reparo representam potenciais alvos

para a intervenção terapêutica (McHUGH et al., 2001).

48

1.5 CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA

Mesmo que a atividade pró-oxidativa da mitomicina C tenha sido considerada

menos importante para a geração de sua citotoxicidade, essa propriedade comum às

quinonas pode ter sido uma das causas da morte rápida de pacientes com câncer de

pulmão no Hospital Pedro Ernesto/UERJ, após aplicação de quimioterapia com

MMC (comunicação pessoal feita pelo Dr. Marcos Paschoal, HUCFF/UFRJ, abril de

2006). Esta hipótese tem por base a grande perfusão de oxigênio do tecido

pulmonar, que teria aumentado a formação de radicais de oxigênio após a ativação

enzimática da MMC, gerando um quadro grave de estresse oxidativo em todo o

pulmão.

O lapachol e a �-lapachona são grandes promessas no que diz respeito a

novas abordagens quimioterápicas no tratamento contra o câncer. Muitos estudos

têm mostrado que ambas podem agir de várias formas após reduzidas

enzimaticamente dentro das células. Entretanto, sua capacidade de induzir estresse

oxidativo limita sua utilização (SILVA et al, 2003).

Por outro lado, a possibilidade da resistência de tumores à quimioterapia pela

ação de mecanismos de reparo de DNA, nos leva a buscar maior entendimento

desses mecanismos, o que futuramente, pode auxiliar na criação de novos

protocolos para tratamentos quimioterápicos (COMEN e ROBSON, 2010).

Ao comparar os efeitos entre essas naftoquinonas com os efeitos da MMC, no

ciclo e na viabilidade celular de linhagens estabelecidas de células humanas

deficientes e proficientes em genes de reparo de DNA, poderemos ter uma noção da

citotoxicidade relativa entre elas e se, como a MMC, são genotóxicas.

.

49

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Estudar a forma de atuação das quinonas �-lapachona e lapachol em

linhagens estabelecidas de células humanas normais e deficientes em mecanismos

de reparo de DNA, através da comparação com a atuação da quinona MMC.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Verificar a possibilidade das quinonas �-lapachona e lapachol agirem de

forma genótoxica.

Comparar as quinonas em estudo quanto à sua citotoxicidade.

50

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 LINHAGENS CELULARES

Foram utilizadas linhagens estabelecidas de fibroblastos humanos normais e

deficientes em genes que codificam proteínas atuantes no Reparo por Excisão de

Nucleotídeos (NER) em mamíferos: MRC5 (normal), XP12RO (XP-A), XP4PA (XP-

C), XP6BE (XP-D), XP30RO (XP-V) e CS3BES3G1 (CS-A), e linfoblastos humanos

normais e deficientes no gene que codifica uma das proteínas atuantes na via de

reparo de crosslinks em mamíferos: HSC536 (normal) e HSC536NEO (FANC-C).

As linhagens de fibroblastos foram inicialmente cedidas pelo Dr. Alain Sarasin

(Laboratory of Genetic Instability and Cancer – Centre National de la Recherche

Scientifique – CNRS – France) e então repassadas pelo Dr. Carlos Frederico Martins

Menck (Laboratório de Reparo de DNA – Departamento de Microbiologia – Instituto

de Ciências Biomédicas – Universidade de São Paulo – USP). As linhagens de

linfoblastos foram cedidas pelo Dr. Felippo Rosselli (Laboratory of Genetic Instability

and Cancer – Centre National de la Recherche Scientifique – CNRS – France).

51

QUADRO 1 - Linhagens celulares humanas utilizadas

Linhagem Fenótipo Origem

MRC5 normal fibroblasto

XP12RO XP-A fibroblasto

XP4PA XP-C fibroblasto

XP6BE XP-D fibroblasto

XP30RO XP-V fibroblasto

CS3BES3G1 CS-A fibroblasto

HSC536 (LIU) normal linfoblasto

HSC536NEO (NEO) FANC-C linfoblasto

As linhagens de fibroblastos foram imortalizadas por transformação com SV40

(Simian vacuolating virus 40 ou Simian virus 40). A linhagem de fibroblasto normal

(MRC5) é originária de tecido pulmonar normal, enquanto as linhagens deficientes

XP12RO (XP-A), XP4PA (XP-C), XP6BE (XP-D) e XP30RO (XP-V) são originárias

da pele de indivíduos com a doença xeroderma pigmentosum e CS3BES3G1 (CS-A)

da pele de indivíduos com a doença síndrome de Cockayne.

As linhagens linfoblastóides foram imortalizadas por transformação com EBV

(Epstein-Barr Virus). Ambas as linhagens, normal HSC536 e deficiente

HSC536NEO, são originárias do sangue de indivíduo com a doença anemia de

Fanconi, sendo que a linhagem normal foi transformada com cDNA contendo o gene

que codifica a proteína FANCC e a deficiente, com cDNA vazio.

52

3.2 ESTOCAGEM E MANUTENÇÃO DAS LINHAGENS CELULARES

As linhagens de fibroblastos e linfoblastos eram estocadas na concentração

de 106 a 107 células/mL de meio de congelamento (90% de soro fetal bovino

(Cultilab) e 10% de DMSO (Sigma)). As suspensões de células em meio de

congelamento eram colocadas em criotubos e mantidas congeladas em tanque de

nitrogênio líquido. Depois de serem descongeladas, as linhagens eram mantidas em

meios de cultura específicos de acordo com suas exigências, em estufa na

temperatura de 37º.C, com 95% de umidade e 5% de CO2.

Os fibroblastos eram cultivados em DMEM (Dulbecco's Modified Eagle’s

Medium - Sigma) suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1% de L-glutamina

(58,4g/L) e 1% de antibióticos (penicilina e estreptomicina), até formarem uma

monocamada em estágio de semi-confluência, ou seja, até ocuparem cerca de 80%

da superfície da garrafa de cultura, momento em que podem ser utilizadas para

experimento. Os repiques de manutenção dessas culturas eram realizados a cada 3

dias, sendo feito primeiro uma lavagem das células com solução salina (Sigma),

para retirar o excesso de meio de cultura, depois a retirada das células da superfície

da garrafa pela adição de solução de tripsina/ EDTA (2,5 g/L tripsina e 1 g/L EDTA)

aquecida a 37ºC, e então as células eram ressuspensas em DMEM. Dessa

suspensão de células era retirada a alíquota a ser repicada. As culturas de

fibroblastos eram mantidas na diluição de 1/10 (1 mL de células para 10 mL de

cultura). Depois de descongelados, os fibroblastos eram mantidos em cultura até a

oitava repicagem, sendo então descartados e descongelado outro criotubo.

Os linfoblastos eram cultivados em RPMI 1640 (Sigma) com 12% de soro fetal

bovino e 1% de antibióticos (penicilina e estreptomicina), e os repiques eram feitos

em dias alternados por contagem em câmara de Neubauer através de microscópio

53

invertido das células não-coradas (viáveis) presentes na cultura pelo corante azul de

Trypan (método de exclusão) (Equação 5). Com o intuito de manter as células na

concentração final de 4X105 células/mL, era adicionado à cultura o volume de RPMI

1640 necessário (Equação 6). Os linfoblastos eram mantidos em culturas por até 3

meses.

(5)

Equação 5: Fórmula utilizada para a contagem de células viáveis em câmara de Neubauer,

possibilitando conhecer sua concentração na cultura (Ci).

(6)

Equação 6: Fórmula utilizada para calcular o volume de meio a ser adicionado à garrafa (V final = V

inicial da cultura + V a ser adicionado) e também para calcular o volume de cultura a ser retirado da

garrafa (Vi), quando do momento do plaqueamento.

3.3 QUINONAS E TRATAMENTO DAS CÉLULAS

O lapachol (PM 242,26 g/mol) e a �-lapachona (PM 242,27g/mol) foram

fornecidos pelo Prof. Dr. Antonio Ventura Pinto, do Núcleo de Pesquisas de Produtos

Naturais – UFRJ. Ambos foram diluídos em DMSO absoluto para uma concentração

final de 5 mg/mL. A mitomicina C (PM 334,33 g/mol – Sigma) foi diluída em água

destilada estéril, para uma concentração final de 1 mg/mL, e depois a solução foi

esterilizada com membrana de 0,22�m (Millipore). As alíquotas das soluções-

54

estoque foram guardadas a uma temperatura de -20ºC, sendo descongeladas

apenas no momento da utilização.

O tratamento das células com as quinonas era realizado a partir da diluição

das soluções-estoque em meio de cultura sem soro nas concentrações de 0,5, 1, 2, 4

e 8 µM para mitomicina C e �-lapachona, e 0,5, 1, 2, 5, 10 e 20 µM para lapachol. O

tempo de incubação das células com mitomicina C era de 1 hora e com �-lapachona

e lapachol era de 4 horas. As concentrações e o tempo de incubação com as

quinonas foram escolhidas de acordo com a literatura (DIATLOFF-ZITO et al., 1986;

PARK et al., 2005)

3.4 EXPERIMENTOS DE VIABILIDADE CELULAR ÀS QUINONAS

3.4.1 MÉTODOS COLORIMÉTRICOS

Os ensaios de viabilidade celular ao tratamento com quinonas foram

realizados com dois tipos de métodos colorimétricos em placas de 96 poços: os

testes da redução do sal de tetrazólio (MTT) e da incorporação do corante vital

vermelho neutro. O primeiro avalia a atividade celular em nível mitocondrial, pois

após a sua absorção, o MTT (3-(4,5-Dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H brometo de

tetrazolium) de cor amarela é reduzido pela enzima succinil-desidrogenase presente

nas mitocôndrias, uma enzima que é somente ativa nas células com um

metabolismo e cadeia respiratória intactos, a um produto chamado formazan de cor

púrpura, permitindo quantificar a porcentagem de células vivas (MOSMMANN,

1983). O outro avalia a viabilidade celular em nível lisossomal. Somente as células

viáveis são capazes de reter o corante, pois possuem lisossomos funcionais. O

vermelho neutro é um corante catiônico fraco que se acumula nos lisossomos das

55

células viáveis porque se liga a sítios aniônicos na matriz lisossomal (pH lisossomal

< pH citoplasmático). As mudanças da superfície da célula ou da membrana

lisossomal causadas pela ação do do xenobióticos resultam em uma diminuição da

entrada e da ligação do vermelho neutro (BORENFREUND e PUERNER, 1985).

No caso dos ensaios com os fibroblastos foi possível realizar os dois testes,

pela característica da aderência sobre superfícies. Como as quinonas sofrem

redução intracelular ao se ativarem, poderia haver uma alteração do metabolismo

mitocondrial, o que influenciaria nas respostas obtidas com o método MTT, sendo

estes resultados confrontados com os resultados obtidos com o método da

incorporação do corante vital vermelho neutro. No caso dos linfoblastos, que

crescem em suspensão, foi realizado somente o método do MTT. A solução-estoque

de MTT (5 mg/mL) e de vermelho neutro (1 mg/mL) foram feitas em tampão PBS

estéril, filtradas em membrana de 0,22 �m (Millipore) e mantidas em geladeira

protegidas da luz.

O protocolo de MTT consistia em colocar 30 µL nos poços com fibroblastos e

10 µL nos poços com linfoblastos de solução diluída de MTT (0,5 mg/mL), deixar as

placas protegidas da luz em estufa a 37ºC durante 3 horas e diluir o formazan com

100 µL de DMSO.

O protocolo de vermelho neutro consistia em colocar 30 µL de solução diluída

de vermelho neutro (0,05 mg/mL) nos poços com fibroblastos, deixar as placas

protegidas da luz em estufa a 37ºC durante 3 horas, retirar a solução de vermelho

neutro dos poços, retirar o excesso do corante por lavagem com tampão PBS e

então romper as células e diluir o corante internalizado com 100 µL de solução

solubilizadora (50% de metanol, 1% de ácido acético e água destilada).

56

A leitura das absorvâncias eram realizadas em leitor espectrofotométrico de

microplacas (SoftMax Pro 4.3LS – Espectra Max 190) a 490nm. A partir das leituras

de absorvância foram calculadas as porcentagens de viabilidade celular. Estes

dados foram representados em gráfico em função da concentração de quinona,

tendo como padrão 100% um controle de células na mesma microplaca (Equação 7).

(7)

Equação 7: Cálculo da porcentagem de células viáveis a cada concentração de tratamento.

3.4.2 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS

Nas placas de 96 poços, eram plaqueados em triplicata, 100 µL de cultura por

poço na concentração de 104 células/mL. Após 24 horas, eram realizados os

tratamentos. Após o tratamento com as quinonas, as células eram mantidas em

recuperação com DMEM fresco por 72 horas em estufa a 37ºC, seguindo-se então

os protocolos de MTT ou vermelho neutro e posterior leitura de absorvâncias em

leitor espectrofotométrico de microplacas.

Em alguns ensaios em que somente a linhagem normal (MRC5) foi utilizada, a

recuperação era feita em DMEM fresco contendo 1 mM de cafeína (PM 194,09

g/mol). A solução-estoque de cafeína (77 mM) foi feita em água destilada estéril,

esterilizada com membrana de 0,22 �m (Millipore) e armazenada à temperatura

ambiente.

No caso das linhagens linfoblastóides, o experimento era realizado em placas

de 6 poços. Eram plaqueados em duplicata, 2 mL de cultura na concentração de

4X105 células/mL. Como estas células crescem em suspensão, o tratamento era

57

realizado no mesmo dia. Após o tratamento, a droga era retirada e as células eram

incubadas em 2 mL de RPMI fresco em placa de 6 poços para as 72 horas de

recuperação. Para ser realizada a leitura das absorvâncias em leitor de microplacas,

de cada poço da placa eram retiradas três alíquotas de 100 µL para triplicata em

placa de 96 poços, onde então era realizado o protocolo de MTT.

Cada gráfico de viabilidade celular foi obtido a partir da média de três

experimentos distintos e os desvios-padrão calculados utilizando o programa

Microsoft Office Excel 2007. Nos gráficos, a porcentagem de células viáveis às

quinonas em cada concentração de tratamento foi obtida em função da viabilidade

dos controles negativos (meio de cultura puro ou com DMSO � 0,1%). No eixo das

ordenadas (eixo y) estão as porcentagens de células viáveis e no eixo das abscissas

(eixo x), a concentração das quinonas (µM).

3.5 EXPERIMENTOS DE CICLO CELULAR E MORTE CELULAR ÀS QUINONAS

3.5.1 CITOMETRIA DE FLUXO

Esta técnica rápida e objetiva é utilizada para se determinar diferentes

características das partículas biológicas. O citômetro de fluxo mede as propriedades

de células em suspensão, orientadas num fluxo laminar e interceptadas uma a uma

por um feixe de laser. O princípio da citometria de fluxo se baseia no fato de que,

quando a luz da fonte de excitação incide nas partículas em movimento, a luz é

desviada e ocorre emissão de fluorescência que é detectada por filtros de detecção

adequados para determinados comprimentos de onda, o que permite identificar as

células pelo seu tamanho (FSC – Forward Scatter) e granulosidade interna (SSC –

Side Scatter). Os fótons gerados, ao atingirem detectores específicos, são

58

convertidos em impulsos elétricos proporcionais ao número de fótons recebidos, os

quais são convertidos em sinais digitais podendo oferecer os resultados em

diferentes formas de análise tais com histogramas, dot-plot, tabelas, entre outros. O

citômetro tem capacidade de processar milhares de eventos individuais em questão

de segundos, o que torna a citometria de fluxo uma ferramenta das mais importantes

Os ensaios deste estudo se basearam no uso de iodeto de propídio (PI),

composto que se liga ao DNA. Este composto emite alta fluorescência vermelha

somente quando excitado pelo laser de argônio (488nm) e ligado ao DNA. A

intensidade de fluorescência emitida é diretamente proporcional a quantidade de

DNA existente na célula, permitindo assim diferenciar o DNA celular nas diferentes

fases do ciclo celular, G1, S e G2, do DNA fragmentado, pertencente a células que

já não estão se dividindo, ou seja, estão mortas (geralmente chamadas de células

em sub-G0 ou sub-G1). A fragmentação de DNA produz pedaços menores desse

material que irão apresentar baixa fluorescência quando comparados ao DNA

íntegro das células controle.

3.5.2 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS

Os ensaios de citometria foram feitos com as linhagens de fibroblastos normal

(MRC5) e XP30RO (XP-V). Essas linhagens eram plaqueadas em placas de 60 mm

na concentração de 2,5X104 células/mL. No dia seguinte ao plaqueamento, eram

feitos os tratamentos seguidos do período de recuperação com meio fresco por 72

horas. Após a recuperação, as células eram retiradas das placas e resuspensas em

500 µL de uma solução de PI (20 µg/mL de PI, 200 µg/mL de RNAse A (Sigma),

0,1% v/v de Triton X-100 (Sigma) e PBS). As amostras eram colocadas em tubos de

citometria, protegidas da luz e eram analisadas por citometria de fluxo, sendo

59

adquiridos 10 mil eventos por amostra. Nestes ensaios as células eram

permeabilizadas pelo detergente presente no tampão (Triton X-100), permitindo a

entrada do PI e seu intercalamento entre os pares de bases do DNA.

As aquisições foram feitas num citômetro BD FACSCalibur™ e as análises no

BD CellQuest Pro software. Os histogramas de ciclo e morte celular (número de

células versus intensidade de fluorescência – FL2) obtidos através da marcação feita

com PI do conteúdo de DNA foram gerados pela fragmentação do DNA presente na

amostra (vide APÊNDICE). Para comparar mais facilmente as amostras controle

com as amostras teste, os dados de ciclo e morte celular foram plotados em gráficos

de colunas (% de células versus concentração (µM)).

3.6 ANÁLISES ESTATÍSTICAS

Os dados foram obtidos a partir da média entre três experimentos distintos e

foram calculados os desvios-padrão. Para as análises estatísticas foram aplicados o

teste de Kruskal-Wallis e ANOVA – 2 fatores através do programa SPSS (Statistical

Package for the Social Sciences) v.12.0. Valores com nível de significância de 5%

(p� 0,05) foram considerados estatisticamente significativos.

60

4 RESULTADOS

4.1 VIABILIDADE CELULAR DAS LINHAGENS FIBROBLÁSTICAS DEFICIENTES

EM REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS (NER) AO TRATAMENTO COM

DIFERENTES QUINONAS

Como o objetivo era o de verificar se o lapachol e a �-lapachona provocam

lesões no DNA que exijam atividade de proteínas envolvidas em reparo de DNA,

buscamos realizar experimentos de viabilidade celular com linhagens de fibroblasto

deficientes em genes de reparo por excisão de nucleotídeos (NER) e no gene XP-V,

e comparamos estes resultados com os obtidos com a MMC, agente que promove

lesões covalentes no DNA, como crosslinks. Os experimentos foram feitos com MTT

e vermelho neutro, para observarmos se a ação oxidante das quinonas influenciaria

no resultado.

Primeiramente, não houve diferença entre os resultados obtidos nos

experimentos de viabilidade celular pelo método de redução do MTT e de

incorporação de corante vital vermelho neutro para nenhuma das quinonas (Figuras

12, 13 e 14).

Para a MMC, a maioria das linhagens deficientes em reparo de DNA

apresentou crescente inativação com o aumento da concentração de tratamento,

atingindo na concentração máxima de 8 µM de droga, mais de 60% de inativação

(Figuras 12A e12B). No experimento de viabilidade celular utilizando MTT (Figura

12A), a porcentagem de células viáveis para as linhagens XP12RO (XP-A), XP6BE

(XP-D), XP30RO (XP-V) e CS3BES3G1 (CS-A) foram aproximadamente 28,5%,

21,6%, 33,3% e 28,9%, respectivamente, enquanto que para a linhagem normal

(MRC5) e XP4PA (XP-C), a porcentagens de viabilidade foram de aproximadamente

61

70,5% e 64,1%. No experimento de viabilidade celular utilizando vermelho neutro

(Figura 12B), as porcentagens de viabilidade para as linhagens XP12RO (XP-A),

XP6BE (XP-D), XP30RO (XP-V) e CS3BES3G1 (CS-A) foram de aproximadamente

27,9%, 20,6%, 45,9% e 34,3%, respectivamente, enquanto que para a linhagem

normal (MRC5) e XP4PA (XP-C), as porcentagens de viabilidade foram de

aproximadamente 74% e 55,3%.

Através da comparação entre as curvas de inativação, observa-se que quanto

maior as concentrações de tratamento com MMC, maior a inativação das linhagens

deficientes em XP-A, XP-D, XP-V e CS-A em relação à linhagem normal (MRC5),

enquanto que a linhagem deficiente em XP-C não apresenta aumento de inativação

com o aumento da concentração de tratamento (p=0,0001).

62

12. A)

12. B)

Figura 12: Gráficos de viabilidade celular da linhagem normal (MRC5) e das linhagens deficientes em NER para MMC. A) MTT, B) vermelho neutro (Viabilidade Celular (%) versus concentração (µM)). Os experimentos foram feitos em triplicata e os valores expressos por médias ± desvio padrão (p=0,0001).

63

Para a quinona lapachol, todas as linhagens de uma maneira geral, se

situaram acima da faixa de 60% de viabilidade, mesmo na concentração mais de

duas vezes maior (20 µM) em relação à máxima concentração utilizada para MMC

(8µM), não sendo observada inativação diferencial entre as linhagens, tanto no

experimento realizado com MTT (figura 13A) como o realizado com vermelho neutro

(figura 13B). A linhagem XP12RO (XPA) no experimento feito pelo método do

vermelho neutro apresentou cerca de 45% de viabilidade nas concentrações de 10 e

20 µM (figura 13B).

No caso da quinona �-lapachona, sendo utilizadas concentrações

equimolares às de MMC, observa-se crescente e similar inativação da linhagem

normal (MRC5) e das linhagens deficientes em reparo, de acordo com o aumento da

concentração de tratamento (Figura 14). Na concentração de 8 µM de �-lapachona,

no experimento feito com MTT (Figura 14A), a linhagem normal (MRC5) apresenta

28,3% de viabilidade e as linhagens XP12RO (XP-A), XP4PA (XP-C), XP6BE (XP-

D), XP30RO (XP-V) e CS3BES3G1 (CS-A) apresentam aproximadamente 32,8%,

31%, 31%, 31% e 27% de viabilidade, respectivamente. No experimento feito com

vermelho neutro (Figura 14B), a linhagem normal (MRC5) apresenta 36% de

viabilidade e as linhagens XP12RO (XP-A), XP4PA (XP-C), XP6BE (XP-D), XP30RO

(XP-V) e CS3BES3G1 (CS-A) apresentam aproximadamente 32%, 36%, 36%, 26%

e 41% de viabilidade, respectivamente.

64

13. A)

13. B)

Figura 13: Gráficos de viabilidade celular da linhagem normal (MRC5) e das linhagens deficientes em NER para lapachol. A) MTT, B) vermelho neutro (Viabilidade Celular (%) versus concentração (µM)). Os experimentos foram feitos em triplicata e os valores expressos por médias ± desvio padrão.

65

14. A)

14. B)

Figura 14: Gráficos de viabilidade celular da linhagem normal (MRC5) e das linhagens deficientes em NER para �-lapachona. A) MTT, B) vermelho neutro (Viabilidade Celular (%) versus concentração (µM)). Os experimentos foram feitos em triplicata e os valores expressos por médias ± desvio padrão.

66

4.2 VIABILIDADE CELULAR DA LINHAGEM NORMAL (MRC5) AO TRATAMENTO

COM DIFERENTES QUINONAS E RECUPERAÇÃO EM MEIO DE CULTURA

CONTENDO 1 mM DE CAFEÍNA

Relatos na literatura afirmam que a cafeína potencializa efeitos mutagênicos e

letais de agentes genotóxicos, entretanto não se conhece exatamente como ocorre

esse efeito sinérgico. Cortez e colaboradores (2003) sugerem que a cafeína atuaria

prevenindo a fosforilação e ativação das quinases ATM e ATR in vitro, que regulam

os pontos de checagem do ciclo celular pela fosforilação múltipla de substratos

incluindo as quinases CHK1 e CHK2 e p53, e acelerando as respostas de checagem

do ciclo celular in vivo.

Para observar se a �-lapachona e o lapachol podem promover lesões sobre o

DNA, a linhagem normal (MRC5) foi incubada em meio contendo cafeína na

concentração de 1 mM, após o tratamento com as três quinonas, concentração esta

que aparentemente promove inibição de ATM e ATR (SARKARIA et al., 1999). Ou

seja, se houver maior sensibilidade da linhagem normal (MRC5) ao tratamento após

incubação com cafeína, provavelmente, o agente em questão danifica o DNA.

A partir da análise dos gráficos de viabilidade celular para esses ensaios

(Figuras 15, 16 e 17), observa-se que apenas para a MMC, a linhagem normal

apresenta maior inativação com o aumento da concentração de tratamento, tanto no

experimento feito com MTT, quanto para o experimento feito com vermelho neutro.

Para a MMC, sem incubação com cafeína, a linhagem normal (MRC5)

apresenta cerca de 70,5% de viabilidade e com cafeína, apresenta cerca de 26,8%

de viabilidade no experimento feito com MTT (Figura 15A), enquanto no experimento

feito com vermelho neutro, apresenta cerca de 74% e 40,8% de viabilidade,

respectivamente (Figura 15B) (p=0,0001).

67

Para lapachol, a normal (MRC5) sem incubação com cafeína apresenta cerca

de 62% de viabilidade e com cafeína, apresenta cerca de 60% para o experimento

feito com MTT (Figura 16A). enquanto para o experimento feito com vermelho

neutro, sem cafeína, apresenta cerca de 69% de viabilidade, e com cafeína

apresenta cerca de 73% de viabilidade (Figura 16B).

Para �-lapachona, a linhagem normal (MRC5) sem incubação com cafeína

apresenta cerca de 28,3% de viabilidade e com cafeína, apresenta cerca de 26% de

viabilidade, no experimento feito com MTT(Figura 17A), enquanto no experimento

feito com vermelho neutro, apresenta cerca de 36% e 41% de viabilidade,

respectivamente (Figura 17B).

68

15. A)

15. B)

Figura 15: Gráficos de viabilidade celular da linhagem normal (MRC5) com e sem incubação com cafeína (1 mM) após o tratamento com MMC. A) MTT, B) vermelho neutro (Viabilidade Celular (%) versus concentração (µM)). Os experimentos foram feitos em triplicata e os valores expressos por médias ± desvio padrão (p=0,0001).

69

16.A)

16.B)

Figura 16: Gráficos de viabilidade celular da linhagem normal (MRC5) com e sem incubação com cafeína (1 mM) após o tratamento com lapachol. A) MTT, B) vermelho neutro (Viabilidade Celular (%) versus concentração (µM)). Os experimentos foram feitos em triplicata e os valores expressos por médias ± desvio padrão.

70

17. A)

17. B)

Figura 17: Gráficos de viabilidade celular da linhagem normal (MRC5) com e sem incubação com cafeína (1 mM) após o tratamento com �-lapachona. A) MTT, B) vermelho neutro (Viabilidade Celular (%) versus concentração (µM)). Os experimentos foram feitos em triplicata e os valores expressos por médias ± desvio padrão.

71

4.3 VIABILIDADE CELULAR DA LINHAGEM LINFOBLÁSTICA DEFICIENTE EM

REPARO DE CROSSLINKS HSC536NEO (NEO) AO TRATAMENTO COM

DIFERENTES QUINONAS

Para verificar a promoção especificamente de crosslinks no DNA pela �-

lapachona e pelo lapachol, foram feitos experimentos de viabilidade celular com uma

linhagem linfoblastóide deficiente no gene FANC-C (HSC536NEO (NEO)) e uma

linhagem normal (HSC536 (LIU)) para reparo de crosslinks.

Observa-se inativação crescente da linhagem sensível a crosslinks (NEO) à

MMC com o aumento da concentração de tratamento, apresentando na

concentração máxima de 2 µM, cerca de 28,4% de viabilidade, enquanto a linhagem

normal (LIU) apresenta cerca de 61,7% de viabilidade para a mesma concentração

(Figura 18A) (p=0,0001).

Para o lapachol até a concentração máxima de 20 µM e para a �-lapachona

até a concentração máxima de 2µM, parece não haver inativação considerável da

linhagem sensível a crosslinks (NEO), sendo obtido 78% e 94% de viabilidade ao

lapachol para LIU e NEO respectivamente (Figura 18B), e 77,6% e 79,8% de

viabilidade à �-lapachona para LIU e NEO, respectivamente (Figura 18C). Neste

caso, os experimentos foram feitos apenas com MTT pela característica de

crescimento em suspensão das linhagens inviabilizar a utilização do protocolo de

vermelho neutro.

72

18. A)

18. B)

18.C)

Figura 18: Gráficos de viabilidade celular da linhagem normal (LIU) e da linhagem deficiente (NEO) no gene FANCC a A) MMC (p=0,0001), B) lapachol e C) �-lapachona (Viabilidade Celular (%) versus concentração (µM)). Os experimentos foram feitos em triplicata e os valores expressos por médias ± desvio padrão.

73

4.4 ANÁLISE DO CICLO E MORTE CELULAR DAS LINHAGENS NORMAL (MRC5) E XP30RO (XP-V) AO TRATAMENTO COM DIFERENTES QUINONAS

Com intuito de observar comparativamente a ação das quinonas sobre o ciclo

celular foram feitos ensaios de citometria de fluxo por marcação do conteúdo total de

DNA com PI (iodeto de propídio), sendo também observada a morte celular, das

linhagens normal (MRC5) e XP30RO (XP-V), com concentrações equimolares de

cada quinona. Isto poderia indicar se as quinonas �-lapachona e lapachol promovem

lesões no DNA, através da observação de indução ou não de parada do ciclo

celular, e da taxa de morte celular após os tratamentos. Se houver lesões no DNA

que por algum motivo não foram reparadas, o DNA sofrerá fragmentação, e através

de histogramas obtidos pelo tamanho dos fragmentos, podemos saber a quantidade

de células vivas em cada fase do ciclo celular e de células mortas.

A linhagem normal (MRC5) foi escolhida, pois através da linhagem proficiente

em todos os genes de reparo, seria possível observar mudanças no ciclo celular,

como acúmulo de células em uma determinada fase para reparação de danos no

DNA, assim como a recuperação das lesões no DNA pela quantidade de células

viáveis e mortas após os tratamentos.

Com a linhagem XP30RO (XP-V), deficiente na DNA polimerase �, seria

possível observar se as quinonas lapachol e �-lapachona promovem ou não dano no

DNA, impedindo a continuação da síntese de DNA. Esta polimerase realiza síntese

translesão, sintetizando DNA frente uma fita-molde contendo lesão. Provavelmente,

na ausência dessa polimerase, se a droga provoca lesões no DNA, a linhagem

XP30RO (XP-V) apresentaria sensibilidade, já que não seria possível a ocorrência

da síntese translesão impedindo a formação de lacunas (MUNIANDY, et al., 2010,

CRUET-HENNERQUART et al., 2010).

74

Nas concentrações testadas, a MMC foi a única quinona que modificou o

ciclo celular das linhagens e provocou a morte celular (Figuras 19, 20 e 21).

Na figura 19A podemos observar que para a MMC o ciclo celular da linhagem

normal (MRC5) em 1 µM sofre ligeira modificação em seu ciclo celular, com

diminuição da quantidade de células na fase G1 e maior acúmulo de células na fase

G2. Já em 2 µM, além da diminuição da quantidade de células na fase G1,

observamos acúmulo de células na fase S (G1, p=0,001; S, p=0,0001; G2, p=0,004).

Estas modificações não são observadas para as duas outras quinonas, lapachol

(Figura 20A) e �-lapachona (Figura 21A). Na figura 19A, observamos também que

para MMC a linhagem normal (MRC5) apresenta pequeno aumento da morte celular

com o aumento da concentração de tratamento, entretanto, não há aumento da

morte celular com o aumento da concentração de tratamento no caso do lapachol

(Figura 20A) e da �-lapachona (Figura 21A).

No caso da linhagem XP30RO (XP-V), observamos que também só houve

mudança no ciclo celular e morte celular quando esta foi tratada com MMC (Figuras

19B, 20B e 21B). Para a linhagem XP30RO (XP-V), houve acúmulo considerável de

células em relação à linhagem normal (MRC5) na fase S em 2 µM de MMC (G1,

p=0,0001; S, p=0,0001; G2, p=0,002) e aumento de morte celular com o aumento da

concentração de tratamento (p=0,0001). Na concentração de 2 µM de MMC, houve

cerca de 50 vezes mais morte celular da linhagem XP30RO (XP-V) em relação ao

controle (Figura 19B), e cerca de 5 vezes mais morte celular em relação à linhagem

normal (MRC5) para a mesma concentração (Figura 19A).

75

19.A)

19.B)

Figura 19: Gráficos representativos dos histogramas de ciclo celular e morte celular das linhagens A) normal (MRC5) e B) XP30RO (XP-V) para o tratamento com MMC (% de células versus concentração (µM)). Os experimentos foram feitos em triplicata e os valores expressos por médias ± desvio padrão (MRC5 ciclo celular – G1, p=0,001; S, p=0,0001; G2, p=0,004/ XP-V ciclo celular – G1, p=0,0001; S, p=0,0001; G2, p=0,002/ XP-V morte celular – p=0,0001).

0

10

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76

20.A)

20.B)

Figura 20: Gráficos representativos dos histogramas de ciclo celular e morte celular das linhagens A) normal (MRC5) e B) XP30RO (XP-V) para o tratamento com lapachol (% de células versusconcentração (µM)). Os experimentos foram feitos em triplicata e os valores expressos por médias ± desvio padrão.

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células mortas

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77

21.A)

21.B)

Figura 21: Gráficos representativos dos histogramas de ciclo celular e morte celular das linhagens A) normal (MRC5) e B) XP30RO (XP-V) para o tratamento com �-lapachona (% de células versusconcentração (µM)). Os experimentos foram feitos em triplicata e os valores expressos por médias ± desvio padrão.

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células mortas

células vivas

78

5 DISCUSSÃO

Os resultados obtidos com os protocolos de redução de MTT e de

incorporação de vermelho neutro utilizados para verificação da viabilidade celular

foram semelhantes. Isto pode indicar que apesar das quinonas serem pró-oxidativas

e poderem desequilibrar a captação de elétrons na cadeia respiratória, os possíveis

efeitos sobre as membranas e sobre o metabolismo mitocondrial não influenciaram

no resultado obtido por tais métodos. Muitos trabalhos já utilizaram estes dois

métodos para medir a viabilidade celular à quinonas e não reportaram interferência

nos resultados (DIATLOFF-ZITO et al., 1986; HU, et. al., 2000, PARK et al., 2005,

PEREIRA, et al., 2006).

5.1 RELEVÂNCIA DO REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS (NER) NA VIABILIDADE DE CÉLULAS HUMANAS TRATADAS COM QUINONAS

De um modo geral, os resultados dos ensaios parecem indicar que entre as

três quinonas utilizadas neste estudo, a MMC deve ser a única capaz de promover

adutos com o DNA, dentre estes, os crosslinks.

Somente para a MMC foi observada a formação de um gradiente entre as

curvas de inativação das linhagens normal (MRC5) e as linhagens deficientes nos

genes de reparo por excisão de nucleotídeos, XP-A, XP-C, XP-D e CS-A, e a

linhagem XP-V, deficiente em DNA polimerase �. Este fenômeno não ocorre para a

�-lapachona e o lapachol. (Figuras 12,13 e 14).

A quinona lapachol, como já havia sido relatado por Silva e colaboradores

(2003), parece ser menos efetivo, sendo necessárias altas concentrações para

promover algum efeito citotóxico, pois mesmo nas concentrações mais altas

utilizadas (10 µM e 20 µM) não ocorreu inativação considerável de nenhuma

79

linhagem. Além disso, o lapachol não promoveu formação de um gradiente entre as

curvas de inativação das linhagens normal (MRC5), deficientes em reparo por

excisão de nucleotídeos (NER) e a linhagem deficiente XP-V, provavelmente por

também não promover um efeito genotóxico (Figura 13), fato este que contradiz a

literatura (HUSSAIN et al., 2007, ALMEIDA, 2009).

O que podemos observar a partir das curvas de inativação para o caso da �-

lapachona é que, ao contrário do que ocorre para o lapachol, esta quinona parece

ser altamente citotóxica. Isto devido ao fato de que assim como todas as outras

linhagens deficientes, a linhagem normal (MRC5) sofreu severa inativação, não

parecendo ser necessária proficiência em reparo de DNA ou em DNA polimerase �

(Figura 14).

A inativação similar das linhagens deficientes em reparo por excisão de

nucleotídeos (NER) XP-A, XP-D e a CS-A, linhagem deficiente no reconhecimento

pelo reparo por excisão de nucleotídeos acoplado à transcrição (TCR), e a

resistência da linhagem XP-C, deficiente no reconhecimento pelo reparo global do

genoma por excisão de nucleotídeos (GGR) à MMC em comparação com a

linhagem normal (MRC5), indicam a exigência de reparo pela via acoplada à

transcrição (TCR), o que é condizente com a presença de crosslinks, adutos que

promovem a interrupção da transcrição, por se intercalarem entre as fitas da dupla-

hélice de DNA, impedindo sua abertura. E ainda, a crescente inativação da linhagem

deficiente XP-V pode indicar que a DNA polimerase � deve atuar na síntese

translesão frente às lesões causadas pela MMC (Figura 12).

Em estudos realizados pelo nosso grupo (VIDAL et al., 2006) observamos que

a cepa deficiente no gene uvrB, que codifica a proteína UvrB em E. coli,

correspondente à XPD em mamíferos (BIENSTOCK et al., 2003), apresenta

80

hipersensibilidade à MMC. Neste trabalho observamos que a linhagem XP-D foi uma

das linhagens que apresentou maior sensibilidade à MMC, evidenciando que estas

proteínas possuem funções importantes na reparação das lesões causadas por esta

quinona.

5.2 AVALIAÇÃO DA AÇÃO GENOTÓXICA DAS QUINONAS ATRAVÉS DA INCUBAÇÃO COM CAFEÍNA

Nos ensaios de viabilidade celular realizados utilizando somente a linhagem

normal (MRC5) para verificar a ação da cafeína sobre o efeito da �-lapachona e do

lapachol em comparação com ação já esperada sobre o efeito da MMC, pois esta é

reconhecidamente genotóxica, observamos que houve ação sinergística apenas

sobre o efeito da MMC, o que parece indicar que a �-lapachona e o lapachol não

são genotóxicos. Mesmo em altas concentrações (10 e 20 µM) de lapachol, não foi

observada ação potencializadora de efeito pela cafeína (Figuras 15, 16 e 17).

5.3 INVESTIGAÇÃO SOBRE A FORMAÇÃO DE CROSSLINKS PELAS QUINONAS

Nos ensaios realizados a fim de observar se a �-lapachona e o lapachol

possuem capacidade de formação de crosslinks como a MMC, utilizamos

concentrações equimolares baixas (0,5, 1 e 2 µM), pois se estas promovem tais

adutos tão críticos para a viabilidade celular, em baixas concentrações já

poderíamos teoricamente observar inativação da linhagem sensível a crosslinks

utilizada (HSC536NEO-(NEO)). Esta linhagem é deficiente no gene FANC-C, que

codifica a proteína FANC-C participante do complexo FA de reconhecimento de

parada de forquilha de replicação por lesões obstrutivas na dupla-hélice de DNA. A

81

linhagem NEO, sensível a crosslinks, apresentou inativação apenas à MMC (Figura

18A), fenômeno já esperado, o que não ocorreu para o lapachol (Figura 18B) e a �-

lapachona (Figura 18C), indicando ser improvável a formação de crosslinks por

estas quinonas, o que de certa forma também poderia ser esperado já que pelos

resultados dos outros ensaios, estas quinonas não parecem ter efeito genotóxico.

5.4 INFLUÊNCIA DAS QUINONAS SOBRE O CICLO CELULAR

Quanto aos ensaios de ciclo celular e morte celular para MMC foi possível

observar uma alteração do ciclo celular da linhagem deficiente no gene XP-V, que

codifica a DNA polimerase �, de forma mais acentuada que a alteração observada

no ciclo celular da linhagem normal (MRC5), com acúmulo de células na fase S do

ciclo celular, principalmente na concentração de 2µM. Este fenômeno reflete a

indução de checagem do DNA, onde ocorrerá a possibilidade de reparo de DNA ou

de morte celular. Como a linhagem normal é proficiente em reparo de DNA, o

resultado foi como o esperado, em que ao ocorrer o processo de checagem, o DNA

é reparado e a viabilidade das células ainda permanece alta (Figura 19A).

Para a linhagem deficiente no gene XP-V, há acúmulo de células na fase S

em 2µM, e este é mais que o dobro do acúmulo que ocorre na linhagem normal para

a mesma concentração, sendo que a viabilidade diminui com o aumento da

concentração de tratamento (Figura 19B). Isto ocorre provavelmente pela deficiência

na DNA polimerase �, que promove síntese translesão, permitindo a continuação do

processo de replicação quando as polimerases não-especializadas ficam impedidas

de continuar a síntese pela existência de lesões, evitando a formação de lacunas no

DNA (MUNIANDY, et al., 2010, CRUET-HENNERQUART et al., 2010).

82

A parada do ciclo celular na fase S, provavelmente está relacionada à

formação de lesões obstrutivas na dupla-hélice que impedem a passagem da

forquilha de replicação. Sabendo-se que a MMC promove crosslinks no DNA, é

provável que sejam estes adutos os responsáveis pelo fenômeno de parada do ciclo

na fase S.

As outras duas quinonas �-lapachona e lapachol não promoveram

modificação no ciclo celular da linhagem normal (Figuras 20A e 21A) nem da

linhagem deficiente em DNA polimerase � (Figuras 20B e 21B). Também não há

morte celular acentuada da linhagem XP-V provocada por estas drogas. Este

resultado corrobora os resultados obtidos nos ensaios anteriores, onde parece não

haver ação genotóxica por parte da �-lapachona e do lapachol, indicando que �-

lapachona e o lapachol não devem promover lesão no DNA.

83

CONCLUSÕES

- A MMC apresenta-se como a melhor quinona para inativação celular,

especialmente marcante na ausência de XP-A, XP-D e XP-V.

- A �-lapachona tem um efeito tóxico geral indistinto para as diferentes linhagens

deficientes em reparo de DNA, indicando uma ação não-genotóxica, mas citotóxica.

Provavelmente seu efeito oxidativo geral prevaleça sobre algum possível mecanismo

de ligação ao DNA.

- O lapachol parece, como a �-lapachona, ter um efeito tóxico geral indistinto para as

diferentes linhagens deficientes em reparo de DNA, indicando uma ação não-

genotóxica. Além disso, parece também não agir eficientemente de forma citotóxica.

84

PERSPECTIVAS

- Havendo possibilidade de silenciar pelo menos um dos genes que parecem ser

relevantes para a remoção de lesões provocadas por MMC, XP-A, XP-D ou CS-A

em células tumorais, será possível criar um protocolo mais eficiente para

quimioterapia por MMC com doses gerais mais reduzidas e, portanto, menos tóxicas.

- Visto que a �-lapachona provavelmente tem seu efeito citotóxico geral prevalente

sobre algum possível mecanismo de ligação ao DNA, a principal perspectiva seria a

de trabalhar com mecanismos pró-oxidantes em terapêutica coadjuvante, uma vez

que essa quinona tem fácil e barata obtenção.

- O lapachol não parece ser eficiente em promover ação citotóxica nem genotóxica,

sendo uma quinona não muito promissora. Modificações em sua estrutura química

podem aumentar sua eficiência.

85

REFERÊNCIAS

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Open Nat. Prod. J., v.2, p.42-47, 2009.

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Ação dos Fármacos. Porto Alegre: Artmed, 2001.

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97

APENDICE

APÊNDICE A - Histogramas representativos do ciclo celular e da morte celular da linhagem normal (MRC5) após o tratamento com mitomicina C. a) controle b) 1µM de mitomicina C c) 2µM de mitomicina C (histograma de Ciclo Celular (quantidade de DNA X intensidade (FL2-A) - M1- fase G1, M2 - fase S, M3 - fase G2 e histograma de fragmentação de DNA (quantidade de DNA X intensidade (FL2-H) - M1- DNA fragmentado de células mortas, M2 - DNA íntegro de células vivas).

a)

b)

c)

98

APENDICE B - Histogramas representativos do ciclo celular e morte celular da linhagem XP30RO (XP-V) após o tratamento com mitomicina C. a) controle b) 1µM de mitomicina C c) 2µM de mitomicina C (histograma de Ciclo Celular (quantidade de DNA X intensidade (FL2-A) - M1- fase G1, M2 - fase S, M3 - fase G2 e histograma de fragmentação de DNA (quantidade de DNA X intensidade (FL2-H) - M1- DNA fragmentado de células mortas, M2 - DNA íntegro de células vivas).

a)

b)

c)

99

APENDICE C - Histogramas representativos do ciclo celular e morte celular da linhagem normal (MRC5) após o tratamento com �-lapachona. a) controle b) 1µM de �-lapachona c) 2µM de �-lapachona (histograma de ciclo celular (quantidade de DNA X intensidade (FL2-A) - M1- fase G1, M2 - fase S, M3 - fase G2 e histograma de fragmentação de DNA (quantidade de DNA X intensidade (FL2-H) - M1- DNA fragmentado de células mortas, M2 - DNA íntegro de células vivas).

a)

b)

c)

100

APENDICE D - Histogramas representativos do ciclo celular e morte celular da linhagem XP30RO (XP-V) após o tratamento com �-lapachona. a) controle b) 1µM de �-lapachona c) 2µM de �-lapachona (histograma de Ciclo Celular (quantidade de DNA X intensidade (FL2-A) - M1- fase G1, M2 - fase S, M3 - fase G2 e histograma de fragmentação de DNA (quantidade de DNA X intensidade (FL2-H) - M1- DNA fragmentado de células mortas, M2 - DNA íntegro de células vivas).

a)

b)

c)

101

APENDICE E - Histogramas representativos do ciclo celular e morte celular da linhagem normal (MRC5) após o tratamento com lapachol a) controle b) 1µM de lapachol c) 2µM de lapachol (histograma de ciclo celular (quantidade de DNA X intensidade (FL2-A) - M1- fase G1, M2 - fase S, M3 - fase G2 e histograma de fragmentação de DNA (quantidade de DNA X intensidade (FL2-H) - M1- DNA fragmentado de células mortas, M2 - DNA íntegro de células vivas).

a)

b)

c)

102

APENDICE F - Histogramas representativos do ciclo celular e morte celular da linhagem XP30RO (XP-V) após o tratamento com lapachol. a) controle b) 1µM de lapachol c) 2µM de lapachol (histograma de Ciclo Celular (quantidade de DNA X intensidade (FL2-A) - M1- fase G1, M2 - fase S, M3 - fase G2 e histograma de fragmentação de DNA (quantidade de DNA X intensidade (FL2-H) - M1- DNA fragmentado de células mortas, M2 - DNA íntegro de células vivas).

a)

b)

c)

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