Lección 6.1. Introducción al Módulo 6 · 2019. 3. 9. · Control de micotoxinas Prácticas...

Sergi Maicas PrietoDepartamento de Microbiología y EcologíaUniversitat de València

Lección 6.1. Introducción al Módulo 6

Biología molecular. Bases y aplicacionesMódulo 6. Aplicaciones de la biología

molecular en agricultura

Con el desarrollo de la biología molecular, algunas tecnologías basadas en el

DNA nos permiten:

• la mejora de cultivos p.e. aumento de productividad, mejora calidad

organoléptica, resistencia a sequia, plagas, …

• Identificación y conservación de las especies

vegetales en bancos de germoplasma

Algunas técnicas moleculares puestas a punto en otras áreas

(PCR, RFLP, RAPD, SNP, AFLP o SRAP)

fueron rápidamente implementadas para su uso en agricultura

Aplicaciones de la biología molecular en plantas para el aumento de

productividad (incremento o eliminación del número de semillas).

Micotoxinas

Entre los problemas de inocuidad de los alimentos, la presencia de especies

fúngicas capaces de producir metabolitos tóxicos en los productos

agroalimentarios ha adquirido una especial atención.

Las micotoxinas, compuestos de bajo peso molecular, son el resultado del

metabolismo secundario de los hongos toxigénicos.

Pueden tener actividad tóxica hacia las plantas, pero sobre todo representan

un serio riesgo para la salud humana y animal, ya que pueden acumularse en

muchos productos finales de cultivos y tienen una amplia gama de actividades

biológicas tóxicas.

O

OO

O O

OCH3H

H

Aflatoxin B11961

N O

OO

H

COOH

Cl

OH

HCH

Ochratoxin A (OTA)1965

O

O

OH

O

Patulin1941

• Alimento básico un enorme impacto económico y social.

• La comunidad científica requiere de nuevas herramientas de diagnóstico y

un conocimiento más profundo de la biología y la genética de los hongos

toxigénicos.

• Según un estudio de la Organización de las Naciones

Unidas para la Agricultura y la Alimentación,

aproximadamente el 25% de la producción mundial de

alimentos y piensos está contaminada por micotoxinas.

• Los cereales son los cultivos más

sensibles a la colonización de

especies fúngicas toxigénicas.

Acumulación de las micotoxinas en

los granos.

Control de plagas

• Bacillus thuringiensis (Bt) es conocido como el insecticida microbiano más

exitoso contra diferentes órdenes de plagas de insectos en la agricultura

• Alternativa biológica a los plaguicidas

• Los genes de toxina Bt también se han utilizado eficientemente para

aumentar la resistencia a plagas de insectos en cultivos modificados

genéticamente

• Ventajas

• El nivel de la expresión de toxinas puede ser

muy elevado. De esta manera se puede

suministrar una dosis adecuada a la plaga.

• La expresión de toxinas está dentro del

sistema de la planta, por lo que únicamente

afectan a aquellos insectos que se alimentan

de ella.

• La expresión de toxinas puede ser modulada

a través de promotores específicos de tejido,

y puede reemplazar el uso de plaguicidas

sintéticos.

Control biológico con bacterias o bacteriófagos

• Otra manera de combatir las plagas es con el uso de bacterias o

bacteriófagos.

• La aplicación de la biología molecular en este campo ha permitido el

desarrollo de estrategias innovadoras que facilitan el control de patógenos

bacterianos siendo además respetuosas con el medio ambiente.

• 2 lecciones diferentes estrategias moleculares aplicadas sobre bacterias

y fagos

• 6.2. Biología molecular con plantas

• 6.3. Identificación y cuantificación de hongos en el control de micotoxinas

• 6.4. Control de plagas

• 6.5. Biocontrol de enfermedades bacterianas de plantas mediante

bacteriófagos

• 6.6. Control biológico de bacteriosis en plantas mediado por agentes

bacterianos

Imágenes tomadas de www.wikipedia.org, www.pixabay.com y www.google.es

Biología molecular. Bases y aplicaciones

María Dolores Gómez JiménezInstituto de Biología Molecular y Celular de PlantasIBMCP (CSIC)

Lección 6.2. Biología molecular con plantas



¿Cómo utilizamos la Biología Molecular en el avance de

conocimiento en Biología Vegetal?

BiosíntesisGAs

GAs

Óvulo de Arabidopsis thaliana

ATS

DELLAs

ATSDELLAs

La Biología Molecular nos permite establecer

modelos como éste donde se refleja cómo la

hormona giberelina (GA), junto con reguladores

(DELLAs) y factores transcripcionales (ATS),

participa en el control del desarrollo de los

óvulos de Arabidopsis thaliana.

Técnicas como qPCR, Hibridación in situ de

mRNA , Y2H o BiFC son indispensables para

establecer las interacciones genéticas y

moleculares que se establecen en el esquema.

Giberelinas (GAs) DELLAs(GAI, RGA)

Respuesta a GAsen la planta

DATOS PREVIOS:

¿Cómo llegamos a establecer este modelo?

1.

2. Mutante ats-1ATS es un factor transcripcional

implicado en el desarrollo

adecuado de 5 capas celulares del

óvulo llamadas integumentos (i).

ats-1 produce óvulos con

integumentos más cortos que la

planta wild type (WT).

WildType

i

Mutante dellaOBSERVACIONES:

1. Los mutantes nulos della presentan un fenotipo

de óvulo similar al de ats-1.

2. Las plantas ats-1 germinan antes que las WT

por lo que podrían sintetizar más GAs.

HIPÓTESIS:

Teniendo en cuenta que las proteínas DELLA ejercen su función uniéndose a factores

transcripcionales (FTs) y que esta interacción permite o impide que los FTs se unan al

DNA, es posible que las proteínas DELLA interaccionen con el factor ATS posibilitando

su unión a sus genes diana.

EXPERIMENTOS PARA COMPROBAR HIPÓTESIS Y RESULTADOS:

SD/-Leu-Trp SD/-Leu-Trp-Ade-His

ATS.1 vs. GAIvs. RGA

vs. --

ATS.2 vs. GAIvs. RGA

vs. --

B

ATS.2

ATS.1 STOP

STOPATG

ATG

A

1. ¿Interaccionan físicamente las proteínas DELLA y el factor transcripcional ATS?

ATS.1 corresponde a la proteína

completa ATS y ATS.2, que utilizaremos

como control negativo en el Y2H, es la

proteína ATS truncada.

Y2H

La proteína completa (no ATS.2) interacciona

con las proteínas DELLA GAI y RGA

BiFC

100 µm 100 µmYFPN43-ATS.1 YFPN43-ATS.2

YFPC43-GAI

YFPC43-RGA

La interacción entre ATS y las proteínas DELLA también es positiva con BiFC lo

cual nos confirma que ambas proteínas podrían unirse para participar en el

desarrollo del óvulo.

2. ¿El mutante ats-1 tiene más GAs?

Ler

ats-1

RGA-GFP en óvulos

Expr

esió

n re

lativ

a

Lerats-1

0

1

2

3

4

GA20ox1 GA20ox2 GA3ox1 GA3ox2

ats-1 muestra incrementada la expresión de los genes de biosíntesis de GAs. Las GAs

provocan la degradación de las proteínas DELLAs por lo que en los óvulos ats-1 se observa

menor cantidad de la DELLA RGA marcada con GFP.

qPCR Microscopía confocal

• La suma de los resultados nos posibilita la creación del modelo inicial y apoyándonos

en éste, aumentar en trabajos posteriores el conocimiento sobre la formación de los

óvulos en una planta modelo. Si somos capaces de controlar el número de óvulos,

controlaremos el de semillas, característica importantes en cultivos de interés

agronómico.

GAsATS

ATSDELLAs

Resultados Modelo

Y2H y BiFC

qPCR y Microscopía confocal

Referencias bibliográficas y enlaces

Gómez et al. (2016) Plant Physiology 172, 2403-2415DOI: 10.1104/pp.16.01231

Lección 6.3. Identificación y cuantificación de hongos en el control de micotoxinas



Pedro Vicente Martínez CulebrasDepartamento de Medicina PreventivaUniversitat de València

Incorporación a la cadena alimentaria

ContaminaciónHongos

VIA PRIMARIA

VIA SECUNDARIA

Hongo filamentoso Micotoxinas(metabolitos secundarios)

Inmunotóxicas Genotóxicas Neurotóxicas Nefrotóxicas Carcinogénicas

¿Qué son las micotoxinas?

Consumo por el hombre

Piensos contaminados

Efectos tóxicos

1

1

Son acumulativas y el daño se produce a largo plazo

Aspergillus

Penicillium

Fusarium

Hongos productores y micotoxinasMás de 300 micotoxinas producidas por más de 150 hongos diferentes.

3 géneros de hongos producen las micotoxinas de mayor relevancia

CH3CH3

O

OOHO

HO

O

OOHO

HO

O

O

OH

OH OH

NH2

Fumonisin FB11988

O

OO

O O

OCH3H

H

Aflatoxin B11961

N O

OO

H

COOH

Cl

OH

HCH


k !

O

O

OH

O

Patulin1941

N O

OO

H

COOH

Cl

OH

HCH


k !

Cereales Frutos secos Café y cacaoUva

ManzanaCereales

Cereales

Aflatoxinas Ocratoxina

Patulina

Fumonisinas ZearalenonaTricotecenos

Operaciones Cultivo

Operaciones postcosecha

(almacenamiento)

Operaciones industriales

Control de micotoxinas

Prácticas agrícolas

Tratamientos fitosanitarios

SecadoLimpieza

- Control temperatura- Control humedad- Control de insectos

SelecciónLimpiezaMolienda

Descontaminación y detoxificación-Físicos: calor, irradiación, absorción-Químicos y biotecnológicos

Variedades resistentes

Control de los hongos productores

1. Determinar la distribución de especies responsables de la contaminación

a) Identificación de los hongos productores a nivel de especie

b) Evaluación de la capacidad productora de micotoxinas

2. Detección y cuantificación de los hongos productores

Una vez en la cadena alimentaria es difícil de eliminarlasLa mejor medida de control es la prevención de la contaminación

Phialides

Conidiophore

MetulaeVesicle

Foot cell

PhialidesConidia

Morfología y color de las colonias Tamaño y forma de los conidióforos Tamaño y forma de los conidios

Identificación de hongos

Criterios clásicos Métodos moleculares

Identificación de especies rápida y precisaEs necesario mucho tiempo y no es posible diferenciar entre algunas especies

Ejemplo: especies de Aspergillus negros productoras de OTA en vino

A. niger A. tubingensis A. tubingensis-like A. aculeatus A. carbonarius

Extracción DNA

PCR región ITS del rDNA Digestión del fragmento amplificado

Detección y cuantificación de la producción de ocratoxina A (OTA) de las cepas aisladas

Identificación de especies Incidencia y % cepas productoras

Aspergillus carbonarius es el mayor responsable de la contaminación del vino con OTA

Producción de OTA

Detección y cuantificación de Aspergillus carbonarius mediante qPCR

Real Time PCR

A. carbonarius

A. nigerA. tubingesnisA. aculetusA. foetidusA. helicotrixA. phoenicis

Se podría utilizar para la detección y cuantificación temprana de A. carbonarius con fines preventivos, y así optimizar el momento de efectuar los tratamientos fitosanitarios.

Baltasar Escriche SolerDepartamento de GenéticaUniversitat de València

Lección 6.4. Control de plagas



Las plagas

• La agricultura ha generado ecosistemas

vegetales con pocas o una sola especie.

• Las plantas tienen numerosos sistemas de

defensa, de tal forma que los fitófagos están

especializados.

• En un cultivo, los fitófagos de esa especie

vegetal se ven favorecidos de forma que

incrementan su número exponencialmente

constituyendo lo que denominamos una

plaga.

• Las plagas son debidas principalmente a

artrópodos (especialmente insectos) por sus

características biológicas.

Control de plagas

• Los daños originados en el cultivo pueden

ser directos o indirectos.

• El umbral económico resulta transcendental

para el tratamiento de una plaga.

• El control de plagas se realiza mediante

diferentes estrategias (directas o indirectas).

• Actualmente se intentan combinar varias

estrategias con sistemas de control

integrados.

• El control directo se realizó inicialmente con

diferentes sustancias hasta la revolución de

los insecticidas de síntesis química.

Control de plagas

• Se observaron efectos nocivos en la salud y

el ambiente tras el uso masivo de productos

de síntesis.

• Se han usado diferentes alternativas ante

esta situación, entre las que destaca el uso

de patógenos naturales específicos de las

plagas.

• Especialmente en insectos, ha resultado de

una enorme eficacia el uso de preparados

basados en la bacteria Bacillus thuringiensis.

Bacillus thuringiensis

• B. thuringiensis es una bacteria gram+

presente en todos los lugares que cuando

esporula produce un acumulo proteico con

actividad principalmente insecticida.

• Esta especie fue aislada a principios del siglo

XX de larvas de insectos con síntomas de

infección.

• Rápidamente se inició su uso comercial que

fue temporalmente desplazado por los

insecticidas de síntesis.

• Actualmente, esta considerado el producto

biológico con mayor cuota de mercado.

Proteínas Cry

• Cada proteína Cry es tóxica para un limitado

número de especies, característica muy

importante para evitar efectos en especies

no diana.

• Su efecto se basa en producir daños en el

intestino de los insectos que finalmente

originan su muerte.

• Se ha determinado la existencia de al menos

70 familias diferentes proteínas Cry.

• Las bacterias pueden ser modificadas para

que expresen combinaciones de proteínas

para plagas específicas.

• Las proteínas pueden ser modificadas para

mejorar su efectividad y espectro de acción.

Plantas mejoradas

• El uso de agentes externos para el control

de plagas resulta mejorado por su

producción por la propia planta para

autoprotegerse.

• Las técnicas de mejora vegetal basadas en

procesos naturales como es la infección por

Agrobacterium permiten la producción en la

planta de estos compuestos.

• El empleo desde hace 20 de años de

cultivos de este tipo ha permitido una

reducción considerable del empleo de

productos de síntesis y una mejora de la

productividad.

Futuras plantas mejoradas

• Diferentes proteínas de tipo Cry y Vip se

encuentran expresándose en los cultivos

actuales.

• Se está evaluando la expresión de otras

proteínas de origen vegetal (p.e. lectinas) o

bacteriano (p.e. quitinasas).

• Desde hace una década se están

estudiando nuevas aproximaciones, como es

la expresión de iRNA para silenciar genes

vitales de las plagas o inhibir sus mecanismo

de tolerancia a productos tóxicos de la

planta.

Caballero, P. & J. Ferré. 2001. Bioinsecticidas: fundamentos y aplicaciones de Bacillusthuringiensis en el control integrado de plagas. Phytoma-España y Universidad Pública deNavarra, Valencia y Pamplona.Chakroun, M., Banyuls, N., Bel, Y., Escriche, B. & Ferre, J. 2016. Bacterial VegetativeInsecticidal Proteins (Vip) from Entomopathogenic Bacteria. Microbiology and MolecularBiology Reviews 80: 329-350.Li, Y., Hallerman, E.M., Liu, Q. & Wu, K. 2016. The development and status of Bt rice in China.Plant Biotechnology Journal14: 839–848Peng, Y. Melo, A. L., Soccol, V. T., & Soccol, C. R. 2016. Bacillus thuringiensis: mechanism ofaction, resistance, and new applications: a review. Critical Reviews in Biotechnology 36: 317-326Kim, Y. H., Soumaila Issa, M., Cooper, A. M. & Zhu, K.Y. 2015. RNA interference: Applicationsand advances in insect toxicology and insect pest management. Pesticide Biochemistry andPhysiology 120:109–117Vilas-Bôas, G.T., A.P. Peruca & O.M. Arantes. 2007. Biology and taxonomy of Bacillus cereus,Bacillus anthracis, and Bacillus thuringiensis. Canadian Journal of Microbiology, 53: 673-687.Williams, G.M., A. Faraji, I. Unlu, S.P. Healy, M. Farooq, R. Gaugler, G. Hamilton & D.M.Fonseca. 2014. Area-wide group applications of Bacillus thuringiensis var. israelensis forcontrol of Aedes albopictus in residential neighborhoods: from optimization to operation. PLoSOne, 9(10): e110035.


Elena González BioscaDepartamento de Microbiología y EcologíaUniversitat de València

Lección 6.5. Biocontrol de enfermedades bacterianas de plantas mediante bacteriófagos



Impacto de las enfermedades bacterianas de plantas

• Las bacterias patógenas de plantas son una de las

principales limitaciones de la producción agrícola

mundial y una grave amenaza para la sostenibilidad

del suministro de alimentos.






• Estas bacterias causan efectos devastadores en el

crecimiento y desarrollo de las plantas y en sus

frutos, siendo responsables de importantes

pérdidas económicas en distintos cultivos.






• Estas bacterias causan efectos devastadores en el

crecimiento y desarrollo de las plantas y en sus

frutos, siendo responsables de importantes

pérdidas económicas en distintos cultivos.

• El desarrollo de estrategias innovadoras de

control de estos patógenos bacterianos

respetuosas con el medio ambiente constituye un

desafío a alcanzar en el siglo XXI.

Principales bacterias patógenas de plantas (Mansfield et al., 2012).

Posición Patógeno bacteriano Enfermedad

1 Pseudomonas syringae Manchas foliares, necrosis y chancros en numerosos huéspedes

2 Ralstonia solanacearum Marchitez bacteriana ypodredumbre parda de la patata y

otras solanáceas3 Agrobacterium tumefaciens Tumores de frutales y rosal

4 Xanthomonas oryzae pv. oryzae Bacteriosis vascular del arroz

5 Xanthomonas campestris Manchas foliares, necrosis y chancros en numerosos huéspedes

Tumores en raíz(Clemson University,

Wikimedia Commons)

Manchas foliares(Scot Nelson,

Wikimedia Commons)

Necrosis en frutos(Chris Smart.

Wikimedia Commons)

Marchitez bacteriana(EG Biosca)

Bacteriosis del arroz(Donald Groth

Wikimedia Commons)

Posición Patógeno bacteriano Enfermedad

6 Xanthomonas axonopodispatovares

Chancros y manchas bacterianas de distintos cultivos. Cancrosis.

7 Erwinia amylovora Fuego bacteriano de las rosáceas

8 Xylella fastidiosa Enfermedad de Pierce en viña, clorosis variegada en cítricos, decaimiento rápido del olivo, ...

9 Dickeya dadantii y D. solani Marchitez y podredumbre blanda de patata y otras hortícolas

10 Pectobacterium carotovorum y P. atrosepticum

Podredumbre blanda de patata y otras especies hortícolas

Fuego bacteriano en peral (Ninjata-coshell, Wikimedia Commons)

Clorosis variegada en cítricos(A. Purcelll, Wikimedia Commons)

Podredumbre blanda (Scot Nelson, Flickr)

Cancrosis de los cítricos(Scot Nelson, Flickr)

Principales bacterias patógenas de plantas (Mansfield et al., 2012).

Métodos de control de bacteriosis de plantas• El control de las enfermedades bacterianas

(bacteriosis) de plantas mediante tratamientos

químicos o físicos:

• no suele ser eficaz

• genera resistencias a agroquímicos

• es costoso

• tiene gran impacto ambiental






• es costoso


• Son necesarios nuevos métodos de control

eficaces y respetuosos con el medio ambiente como

el control biológico basado en bacteriófagos.






• es costoso





• Bacteriófagos (fagos): virus que sólo infectan

bacterias (no afectan a células animales ni

vegetales). Son predadores naturales de bacterias.






• es costoso





• Bacteriófagos (fagos): virus que sólo infectan

bacterias (no afectan a células animales ni

vegetales). Son predadores naturales de bacterias.

La mayoría de bacteriófagos

tienen cápsidas (cabezas

icosaédricas con genomas de

DNA de doble cadena) y

cola.

Placa basal

Cápsida

Cola

Fibras de la cola

Biocontrol de bacteriosis de plantas basado en fagos

• Los fagos, según su ciclo de vida, pueden ser:

• líticos o virulentos, se multiplican dentro de la

bacteria huésped que infectan y la destruyen

por lisis.

fago bacteria huésped

Lisis bacteria y liberación fagos

fago lítico





por lisis.

• lisogénicos o atemperados, integran su

genoma en el de la bacteria huésped,

pudiéndole transferir genes no deseados.



No causan lisis bacteria

fago lítico

fago lisogénico





por lisis.

• lisogénicos o atemperados, integran su

genoma en el de la bacteria huésped,

pudiéndole transferir genes no deseados.

• Los bacteriófagos líticos son interesantes como

potenciales agentes antimicrobianos frente a

patógenos bacterianos debido a su efecto

bactericida.



fago lítico

fago lisogénico

fago lítico

bacteria huésped

lisis

efectobactericida

aumento númerofagos en presencia

bacteria diana

No causan lisis bacteria


• Los fagos deben ser específicos de la especie bacteriana diana para no causar

efectos adversos sobre la microbiota del huésped a proteger ni sobre el medio

ambiente.

Fago lítico y específico de una bacteria patógena

lisisAcción lítica específica


• Los fagos deben ser específicos de la especie bacteriana diana para no causar

efectos adversos sobre la microbiota del huésped a proteger ni sobre el medio

ambiente.

Fago lítico y específico de una bacteria patógena

lisis

• Los fagos líticos y específicos frente a un patógeno bacteriano pueden ser

utilizados para la eliminación selectiva del mismo.

Acción lítica específica


• Ventajas:

1. Antimicrobianos naturales con acción bactericida

2. Alta especificidad por la bacteria huésped.

3. Multiplicación sólo en la bacteria huésped.

4. Inocuidad para otros seres vivos, incluida microbiota

beneficiosa de plantas a proteger.

5. Menor impacto ambiental.

6. Costes reducidos de producción.

7. Cóctel de fagos minimiza aparición de resistencias.

8. Menores restricciones legales para su uso.

9. Pueden combinarse con otras estrategias de control y/o

biocontrol.

10. Agricultura más ecológica y sostenible

Biocontrol de bacteriosis de plantas basado en bacteriófagos: ejemplos

Patógeno Huésped Reducción enfermedad

Referencia

E. amylovora manzano 56%(+antagonista) Boulé et al., 2011P. carotovorum patata 80-95% Czajkowski et al., 2015

R. solanacearumª tomate 50% Bhunchoth et al., 2015 R. solanacearum tomate 100% González-Biosca et al., 2017

X. fastidiosa vid significativa Das et al., 2015ª Ensayos realizados con cepas no pertenecientes a la actual especie R. solanacearum (Álvarez & Biosca, 2017).

Biocontrol de bacteriosis de plantas basado en bacteriófagos: ejemplos

Patógeno Huésped Reducción enfermedad

Referencia

E. amylovora manzano 56%(+antagonista) Boulé et al., 2011P. carotovorum patata 80-95% Czajkowski et al., 2015

R. solanacearumª tomate 50% Bhunchoth et al., 2015 R. solanacearum tomate 100% González-Biosca et al., 2017

X. fastidiosa vid significativa Das et al., 2015

Plantas de vid inoculadas con X.

fastidiosa tratadas (A) o no (B) con

fagos frente al patógeno (Das et al.,

2015)

A B B

ª Ensayos realizados con cepas no pertenecientes a la actual especie R. solanacearum (Álvarez & Biosca, 2017).

Otras aplicaciones biotecnológicas:

• Terapia fágica en medicina y veterinaria

• La aparición de bacterias patógenas multirresistentes a la

mayoría de los antibióticos supone una grave amenaza para la

salud pública y animal.

• La terapia fágica (uso de fagos como agentes terapéuticos

frente a infecciones bacterianas del ser humano y animales) es

una alternativa prometedora y respetuosa con la microbiota

propia beneficiosa y el medio ambiente.

Otras aplicaciones biotecnológicas:

• Terapia fágica en medicina y veterinaria

• La aparición de bacterias patógenas multirresistentes a la

mayoría de los antibióticos supone una grave amenaza para la

salud pública y animal.

• La terapia fágica (uso de fagos como agentes terapéuticos

frente a infecciones bacterianas del ser humano y animales) es

una alternativa prometedora y respetuosa con la microbiota

propia beneficiosa y el medio ambiente.

• Biocontrol de patógenos en alimentos con fagos

• Para reducir el riesgo de contaminación de alimentos con

bacterias patógenas, particularmente en productos frescos.

• Ejemplo de productos comerciales basados en fagos:

• Listex™ P100: reduce presencia de Listeria

monocytogenes en distintos alimentos frescos.

Abedon et al., 2017. Front Microbiol. doi: 10.3389/fmicb.2017.00981.

Álvarez & Biosca, 2017. Front. Plant Sci. doi: 10.3389/fpls.2017.01218

Bhunchoth et al. 2015. J. Appl. Microbiol. 118: 1023-1033. doi: 10.1111/jam.12763.

Boulé et al. 2011. Can.J.Plant Pathol. 33:308-317. doi: 10.1080/07060661.2011.588250

Buttimer et al. 2017. Front. Microbiol. 8: 1-15. doi: 10.3389/fmicb.2017.00034

Colavecchio & Goodridge. 2017. Microbiol Spectr. doi: 10.1128/microbiolspec.PFS-0017-2017

Czajkowski et al. 2015. PLoS One. 10(3):e0119812. doi: 10.1371/journal.pone.0119812.

Das et al. 2015: doi: 10.1371/journal.pone.0128902PMCID: PMC4479439

González-Biosca E, López M M, Álvarez B. 2017. Patente ES2592352 B2.

Kazi & Annapure. 2016. J Food Sci Technol. 53(3):1355-62. doi: 10.1007/s13197-015-1996-8.

Mansfield et al., 2012. Mol Plant Pathol. 13(6):614-29. doi: 10.1111/j1364-3703.2012.00804.x.

http://www.bancodepatentes.gva.es/patentes/-/asset_publisher/xoxK0ZQPxN2u/content/procedimiento-de-control-biologico-de-la-marchitez-causada-por-ralstonia-solanacearum-a-traves-del-uso-de-bacteriofagos-especificos-para-ello

Las imágenes y figuras utilizadas son propias o libres de derechos de autor.


Belén ÁlvarezDepartamento de Investigación Aplicada y Extensión AgrariaInstituto Madrileño de Investigación y Desarrollo Rural, Agrario y Alimentario (IMIDRA)



Lección 6.6. Control biológico de bacteriosis en plantas mediado por agentes bacterianos

Introducción• Las estrategias de control de enfermedades vegetales

por acción de bacterias pueden ser muy diferentes y cabe

destacar que el desarrollo de la Biología Molecular ha

contribuido a muchas de ellas.

• La obtención de mutantes avirulentos derivados del tipo salvaje patógeno proporciona

agentes de control biológico adaptados al mismo nicho ecológico que la cepa parental,

que pueden desplazar al patógeno de su huésped susceptible.

• La Biología Molecular permite la comprensión de los

mecanismos de patogénesis bacteriana y los genes

implicados, posibilitando el desarrollo de nuevos agentes

de control biológico, genéticamente modificados a partir

del tipo salvaje patógeno, por eliminación o adición de

uno o más genes.

• Las propiedades antagonistas de un agente de control biológico se pueden incrementar

haciendo que exprese nuevos productos antimicrobianos efectivos contra el patógeno.

Control biológico de tumores causados por Agrobacterium (I)

• Agrobacterium tumefaciens es una especie bacteriana

que produce tumores en más de 600 especies de

plantas, con distribución mundial.

• Suele penetrar en la planta a través de las raíces.

Durante la infección, un fragmento de ADN (el ADN-T)

presente en un plásmido de virulencia (plásmidoTi) de

la bacteria, se transfiere al ADN de la planta.

• Este ADN integrado codifica enzimas que catalizan la

sobreproducción de auxinas y citoquininas en las

células vegetales transformadas, resultando en una

división celular desregulada y formación del tumor.

• Además, el ADN-T integrado codifica enzimas para la

síntesis de opinas, que sirven como fuente de nutrientes

para el patógeno, facilitando su multiplicación.

Control biológico de tumores causados por Agrobacterium (II)• En muchos casos, los tumores se pueden controlar con la cepa

K84 de Agrobacterium radiobacter, una bacteria no patógena

estrechamente relacionada con A. tumefaciens.

• La capacidad de control se debe principalmente a la biosíntesis

de una bacteriocina, la agrocina 84, junto con una eficiente

colonización de la raíz del huésped.

• Tanto los genes de la biosíntesis de la agrocina 84, como los

que confieren inmunidad a ésta y los genes que confieren

capacidad de transferencia por conjugación (genes tra), se

localizan en un plásmido de 47,7 kb de la cepa K84,

denominado pAgK84.

• La agrocina 84 es un análogo estructural del nucleósido de

adenosina, entra en la célula del patógeno a través de una

permeasa de agrocinopina y actúa inhibiendo la síntesis del

ADN.

Control biológico de tumores causados por Agrobacterium (III)

• Sin embargo, la transferencia de pAgK84 desde la cepa K84 a A. tumefaciens podría

producir cepas del patógeno resistentes a la agrocina 84.

• Para evitarlo, se construyó la cepa K1026 de

A. radiobacter, en la que se suprimió la región

tra del pAgK84.

• Se observó que la capacidad de la cepa

K1026 de colonizar raíces y controlar tumores

en planta era la misma que la de la cepa K84.

Control biológico de tumores causados por Agrobacterium (IV)

• Además de la agrocina 84, las cepas K84 y

K1026 de A. radiobacter también producen

agrocina 434, un análogo estructural del

nucleósido de citidina, constituyendo un factor

adicional al control biológico de los tumores.

• Este control biológico podría

incluso mejorarse si se

incrementara el número de

agrocinas producidas por las

cepas K84 y K1026, o bien si

se creara una nueva cepa

que fuera capaz de producir

más agrocinas.

Control biológico de marchitez causada por Ralstonia solanacearum (I)• Ralstonia solanacearum es una especie bacteriana

que produce marchitez en más de 400 especies de

plantas, entre ellas cultivos básicos para la

alimentación humana.

CitosolBacteriano

Factores de patogenicidad

Enzimashidrolíticas

Exopolisacárido Sistema de secreciónde tipo III

Genes de respuestahipersensible y patogenicidad (hrp)

EfectoresMotilidad

• Es un patógeno vascular que entra en el huésped a

través de las raíces, se multiplica a medida que

asciende por el xilema y marchita por colapso de los

vasos conductores.

• Para ello, cuenta con numerosos factores de

patogenicidad que forman parte de una compleja red

coordinada por el regulador transcripcional PhcA.

• La mayor parte de los genes de patogenicidad que

codifican para estos factores se encuentran en un

megaplásmido que, junto con el cromosoma,

conforman la totalidad del genoma de este patógeno.

Control biológico de marchitez causada por Ralstonia solanacearum (II)• Se ha ensayado el control biológico de esta bacteria con

mutantes avirulentos, tanto naturales como inducidos en

alguno de los genes de estos factores de patogenicidad.

• Lo más frecuente ha sido inducir una mutación en los

genes hrp, más de 20 genes agrupados en una región de

20-25 kb del megaplásmido bacteriano.

• Los mutantes hrp- fueron invasivos, pero colonizaron

menos que la cepa parental virulenta.

• En mezclas de cepas virulentas y sus mutantes, las

virulentas no pudieron colonizar eficientemente.

• El pretratamiento con mutantes hrp- redujo la

incidencia de la enfermedad.

• La capacidad para excluir cepas patógenas de su

huésped sugiere que los mutantes hrp- podrían ser

utilizados como agentes endófitos de control biológico.

Control biológico de marchitez causada por Ralstonia solanacearum (III)• También se ha propuesto para el control

biológico de esta bacteria el tratamiento con

cepas patógenas que, tras la infección con un

bacteriófago lisogénico, han perdido su

virulencia.

• Así, se observó que el marco abierto de lectura

orf15 del bacteriófago ϕRSM3 puede reprimir el

gen phcA del patógeno, impidiendo la aparición

de la enfermedad.

• La aplicación en planta de determinadas cepas

del patógeno infectadas con los bacteriófagos

lisogénicos ϕRSM1 o ϕRSM3 se ha patentado

para prevenir la marchitez bacteriana, ya que

las plantas tratadas con estas cepas avirulentas

son más resistentes al patógeno.

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Lección 6.1. Introducción al Módulo 6 · 2019. 3. 9. · Control de micotoxinas Prácticas...

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