MIRIAN DE WAELE SOUCHOIS DE MARSILLAC

Lesão ativa de cárie em esmalte e perda mineral após o uso de

fluoretos em superfície oclusal: Estudo “in vitro”.

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia, do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Santa Catarina, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Odontologia - Área de concentração: Odontopediatria.

Orientador: Prof. Dr. Ricardo de Sousa Vieira

Florianópolis 2007

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2

Catalogação na fonte por: Vera Ingrid Hobold Sovernigo CRB-14/009

D278l De Marsillac, Mirian de Waele Souchois Lesão ativa de cárie em esmalte e perda mineral após o uso e fluoretos em superfície oclusal: estudo in vitro / Mirian de Waele Souchois De Marsillac; orientador Ricardo de Sousa Vieira. – Florianópolis, 2007. 180 f. ; il. Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Odontologia - Opção Odontopediatria. Inclui bibliografia.

1. Cárie dentária. 2. Microscopia, eletrônica de varredura; 3. Cimentos de Ionômeros de Vidro; 4. Fluoretos Tópicos. I.Vieira, Ricardo de Sousa. II. Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Odontologia. III. Título. CDU 616.314-053.2

3

Mirian de Waele Souchois de Marsillac

Lesão ativa de cárie em esmalte e perda mineral após o uso e fluoretos em superfície oclusal:

Estudo “in vitro”.

Esta tese foi julgada adequada para obtenção do título de “Doutor em Odontologia”, área de concentração Odontopediatria, e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal de Santa Catarina.

Florianópolis, 23 de novembro de 2007.

_________________________________________ Prof. Dr. Ricardo de Sousa Vieira

Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Odontologia

BANCA EXAMINADORA

____________________________________________ Prof. Dr. Ricardo de Sousa Vieira

Orientador

____________________________________________ Prof. Dr. Orlando Ayrton de Toledo

Membro

____________________________________________ Prof. Dr. Luiz Flávio Martins Moliterno

Membro

____________________________________________ Prof. Dr. Alberto Carlos Botazzo Delbem

Membro

____________________________________________ Prof. Dr. Luiz Henrique Maykot Prates

Membro

4

Epígrafe

“Em tudo, dai graças, porque esta é a vontade

de Deus em Cristo Jesus para convosco”.

1 Tessalonicenses 5.18

5

Dedico esta tese a

Deus.

6

Agradecimentos Especiais

Ao meu orientador, Prof. Dr. Ricardo de Sousa Vieira, pela a sua

paciência, presença constante, disponibilidade, confiança, amizade e sua

retidão.

À memória de minha mãe Arlene Adrienne de Waele Mello e de meu pai

Hilton Souchois de Albuquerque Mello. Agradeço a ambos não só pelo

maravilhoso exemplo de vida, mas também de profissionalismo no atendimento

ao paciente e na elaborção de aulas e textos. Meus primeiros professores de

caráter, humildade, sabedoria e de perseverança em Cristo. Meu amor por

vocês é sem fronteiras.

Ao meu marido Fernando de Marsillac Lapolli, pelo seu amor,

companheirismo, entrega, paciência, disposição, compreensão e colaboração.

Acho que todas as palavras escritas não conseguem expressar o meu amor por

você.

As minhas irmãs Vivian de Waele Mello Braz e Lilian de Waele Mello,

cunhados e sobrinhos e aos demais familiares, pelo amor e apoio.

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Aos parentes do meu marido, que me apoiaram, dividiram seu amor, me

receberam, em datas comemorativas ou não, e trouxeram esperança em

pequenos gestos. Vocês são jóias raras que Deus colocou no meu conívio.

As minhas amigas Profa. Dra. Hannelore Taschini Loevy, mestres

Gisele Caldas Alexandre e Maria Cristina Quelhas, e a Jacqueline Reifman,

pela presença, apoio e incentivo que vinham sempre por correio, e-mail ou

telefonema.

Aos professores da Disciplina de Odontopediatria do Departamento de

Estomatologia do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de

Santa Catarina, Dr. Ricardo de Sousa Vieira e Dras. Vera Lúcia Bosco, Maria

José de Carvalho Rocha, Izabel Cristina Santos Almeida, Joecí de Oliveira,

Sílvia Schaefer Tavares e Rosamaria Areal, pelos ensinamentos e troca de

informações, sempre fundamentados em evidências científicas. O esforço

dispendido com o curso de doutorado será sempre lembrado e a amizade

sincera de vocês é meu maior presente.

Aos professores e amigos da Disciplina de Odontopediatria da Faculdade

de Odontologia da Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Sônia Lúcia

Macedo Marçal, Vera Lúcia Campos Santos, Marialice Pentagna, Dr. Luiz

Flávio Martins Moliterno e as Dras. Branca Heloisa de Oliveira Martins

8

Vieira e Vera Sovieiro, pelo incentivo, paricipação e amor, mesmo estando tão

distantes.

À técnica em higiene dental Mirabel de Lima, com quem tive o prazer de

trabalhar no consultório particular, e também meus pais, por incansáveis anos.

Sei que poderei contar sempre com sua honestidade e senso de justiça.

Aos novos amigos e mestres Alice Mara Rodrigues Batista, Thais

Regina Kummer, Karin Faust, Fabiane Borges de Liz, Luciana Rodrigues

Vieira Batista, Fábio Luiz Andretti, Cleonice da Silveira Teixeira e aos

Doutores Meire Coelho Ferreira, Carla Moreira Pitoni, Ângela Scarparro

Caldo-Teixeira, Cláudia Fernandes Volpato, Naudy Brodbeck May, Luiz

Carlos Machado Miguel, Dircelene Colares de Souza, Cimara Fortes

Ferreira, Lizete Feuser e demais colegas do curso de Pós-Graduação em

Odontologia, pelo carinhoso convívio.

9

Agradecimentos

À Universidade Federal de Santa Catarina onde fui tão bem acolhida e

me possibilitou a oportunidade de realizar o curso de Doutorado em

Odontologia.

Ao Diretor do Centro de Ciências da Saúde, Prof. Dr. Cléo Nunes de

Souza, pela simpatia e interesse com que sempre tratou todos os alunos.

Ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia na pessoa do

Coordenador, Prof. Dr. Ricardo de Sousa Vieira e do Sub-Coordenador Prof.

Dr. Luiz Henrique Maykot Prates, pelo estímulo, confiança e apoio dedicados a

minha pessoa.

À Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ), através do

Programa de Capacitação Docente (PROCAD), por ter possibilitado o meu

afastamento da Disciplina de Odontopediatria da Faculdade de Odontologia da

Universidade do Rio de Janeiro e, assim, me auxiliar nessa empreitada para a

obtenção do título de Doutor em Odontologia.

Aos Chefes do Departamento de Odontologia Preventiva e Comunitária

da Faculdade de Odontologia do Estado do Rio e Janeiro nos anos de 2004-5,

10

Profa. Dra. Branca Heloisa de Oliveira Martins Vieira, e de 2006-7, Profa.

Dra. Flávia Raposo Gebara Artese, por terem apoiado minha escolha em

realizar o Curso de Doutorado na Universidade Federal de Santa Catarina,

permitindo o meu afastamento deste departamento.

Aos Professores Doutores Ricardo de Sousa Vieira, Izabel Cristina

Santos Almeida e Luiz Henrique Maykot Prates da Universidade Federal de

Santa Catarina, pela contribuição feita ao projeto de tese durante a banca

examinadora de qualificação do mesmo.

Aos Professores Doutores Ricardo de Sousa Vieira, Luiz Fávio Martins

Moliterno, Orlando Ayrton de Toledo, Alberto Carlos Botazzo Delbem, Luiz

Henrique Maykot Prates, e à suplente Profa. Dra. Izabel Cristina Santos

Almeida, pela paticição na minha banca examinadora de Tese de Doutorado

em Odontologia – Área de Concentração em Odontopediatria.

Ao Prof. Dr. Miguel Pedro Guerra e à funcionária Maria Luisa Peixoto,

do Laboatório de Fisiologia do Desenvolvimento e Genética Vegetal,

Departamento de Fitotecnia, Centro de Ciências Agrárias da Universidade

Federal de Santa Catarina, por cederem o estereomicroscópio e o microscópio

de luz polarizada para a confecção desta tese. É muito bom trabalhar com

pessoas acolhedoras e disponíveis como vocês.

11

À Profa. Dra. Ana Maria Maliska, a Mislene A. de Castro e a Keila

Christina Kleinjohann, do Laboratório de Caracterização Microestrutural do

Departamento de Engenharia Mecânica da Universidade Federal de Santa

Catarina, pela disponibilidade e carinho dispensados a mim durante a confecção

das fotomicrografias desta tese.

À Farmaceutica Dayane Nunes de Andrade, da Farmácia de

Manipulação Flor de Anis, pela formulação das soluções utilizadas nesta

pesquisa. Sua rapidez e o bom atendimento fizeram toda a diferença.

Aos Cirurgiões-dentistas Porfa. Vera Lúcia Campos Santos, Nivaldo

Nuernberg, Levy Rau, Simone Pigozzi Haro e Fernando Baca, que não

mediram esforços em contribuir com a doação e o envio dos terceiros molares

inclusos extraídos de seus pacientes.

À memória da funcionária Janete de Oliveira, auxiliar da Disciplina de

Cirurgia do Departamento de Estomatologia do Centro de Ciências da Saúde da

Universidade Federal de Santa Catarina, pelo incansável auxílio na doação dos

cisos inclusos removidos cirurgicamente nessa disciplina.

Ao apoio dos Doutores Professores Mônica Almeida Tostes Amaral,

Cinthia Pereira Machado Tabchoury, Jaime Aparecido Cury e Alberto

12

Carlos Botazzo Delbem, que me ajudaram, à distância através de e-mails, a

solucionar algumas questões metodológicas.

Aos amigos da turma de Doutorado em Odontopediatria, na área de

concentração de Odontopediatria, e atualmente Doutores, Ana Cristina Gerent

Petry Nunes, Ângela Scarparo Caldo-Teixeira, Carla Moreira Pitoni,

Eduardo Grigollo Patussi, Isabelita Azevedo Duarte, Meire Coelho Ferreira

e Michele da Silva Bolan, pelas experiências vividas e compartilhadas.

Aos amigos da turma de Mestrado em Odontopediatria, na área de

concentração de Odontopediatria, e atualmente Mestres, Alice Mara Rodrigues

Batista, Thais Regina Kummer, Ana Carolina Couto Robles, Karin Faust,

Núbia de Rosso Giuliani, pelo carinhoso convívio.

À Dra. Carla Moreira Pitoni, pelo auxílio com a revisão da análise

estatística desta pesquisa e pela nossa amizade.

À Mestra Karin Faust e Dras. Ângela Scarparo Caldo-Teixeira, Meire

Coelho Ferreira e Carla Moreira Pitoni, por terem compartihado

conhecimentos técnicos e laboratoriais tão importantes para a finalização desta

tese.

13

Ao Prof. Dr. Sérgio Fernando Torres Freitas, pelo auxílio em algumas

questões estatísticas.

Às secretárias da Disciplina de Odontopediatria, Elisabete Luz Caldeira

de Andrada e Ivalda Delmore dos Santos, pela prestimosidade e simpatia com

que sempre me trataram.

Às bibliotecárias Vera Ingrid Hobold Sovernigo, Maria Gorete Montguti

Savi e também às funcionárias Avani Feltz e Márcia Dietrich Santiago da

Biblioteca Setorial de Odontologia, pela disposição e o bom humor.

Ao funcionário Lauro Silva, do Labotório de Pesquisa da Odontologia,

pelo companheirismo e incansável auxílio.

À funcionária Ana Maria Vieira Frandolozzo, do Programa de Pós-

Graduação em Odontologia, e ao estagiário Diego André Caron, por estarem

sempre prontos a atender meus pedidos e resolver meus problemas.

À Profa. Márcia Rosena Soares Freccia, pela revisão do português, às

Profa. Sônia Lúcia Macedo Marçal e à Profa. Dra. Branca Heloisa de

Oliveira Martins Vieira, pelas revisões do inglês. Um texto bem redigido

simplifica a compreenção e traz satisfação ao ler.

14

Aos demais funcionários da Universidade Federal de Santa Catarina,

pelo convívio diário.

15

LISTA DE ABREVIATURAS Å: ångström

°C: grau Celsius

KHN: valor de dureza Knoop (“Knoop Hardness Number”)

kV: Kilovolt

litro: l

m/l: mililitro por litro

ml: mililitro

mm: milímetro

mm2: milímetro quadrado

μm: micrometro

μmol/l F: micromol por litro de íon flúor

M: molar

mM: milimolar

%: porcentagem

ppm F: parte por milhão de íon flúor

pH: potencial hidrogeniônico

rpm: rotações por minuto

®: Marca registrada

™: Marca registrada (“Trademark”)

x: vezes

16

SUMÁRIO Pg

Resumo 17

Abstract 20

Introdução Geral 22

Artigo 1 - Versão em Português

Lesão de mancha branca ativa, com erosão e/ou amolecimento

superficial, em esmalte dental humano produzida por ácido

lático.

28

Artigo 1 - Versão em Inglês

Artificial active white spot lesion with surface softening and/or

erosion in human dental enamel produced by lactic acid.

53

Artigo 2 - Versão em Português

Efeito de um cimento de ionômero vidro e um verniz fluoreto na

perda mineral de cárie artificial oclusal: Estudo in vitro.

76

Artigo 2 - Versão em Inglês

Effect of a glass ionomer cement and a fluoride varnish on

mineral loss of artificial occlusal caries: In vitro study.

107

Referências 136

Apêndices 145

Anexos 156

17

Resumo

18

De Marsillac, Mirian de Waele Souchois. Lesão ativa de cárie em esmalte e perda mineral após o uso e fluoretos em superfície oclusal: Estudo in vitro. 2007. 180f. Tese (Doutorado em Odontologia – Área de concentração Odontopediatria) – Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis.

RESUMO

O presente estudo in vitro foi dividido em dois artigos. O primeiro artigo foi realizado para avaliar através de microscopia eletrônica de varredura (MEV) e pelo teste de microdureza interna (MI) se a metodologia descrita neste experimento pode ser utilizada na indução de lesão de mancha branca ativa (MBA) em esmalte dentário humano. Dez molares permanentes humanos foram utilizados neste experimento in vitro onde foram induzidas lesões de MBA em superfície lisa e não abrasionadas de esmalte. Uma amostra de superfície lisa de cada dente foi recoberta com duas camadas de esmalte para unhas, exceto por uma área medindo 2,5 mm x 1 mm (2,5 mm2), delimitada no centro da amostra. Cada amostra foi exposta individualmente a 10,4 ml de uma solução desmineralizadora contendo: 0,1 mol/l de ácido lático tamponado; 0,2% de ácido poliacrílico; 0,03 ppm F; e a solução foi saturada com 50% de hidroxiapatita em pH 5,0 durante 42 dias (37oC) sem agitação. As amostras foram seccionadas no centro das lesões de MBA e uma metade foi analisada ao MEV e a outra foi submetida a teste de MI. Resultados: A média de profundidade da lesão de MBA foi de 80 μm (dp = 78,8) e foi possível detectar ao olho nu uma superfície branca rugosa e sem brilho. As fotomicrografias feitas com o MEV demonstraram que embora algumas áreas na superfície das lesões de MBA aparentassem estar relativamente intactas, outros locais da lesão apresentavam erosão. Um padrão prismático de dissolução, com o aumento das bainhas dos prismas de esmalte, foi observado em todas as amostras. Em algumas amostras também foram observados locais de destruição do centro dos prismas de esmalte. Essa metodologia pode ser utilizada para induzir lesões de MBA em esmalte dental humano, porém, quando forem realizados testes de MI, deve ser levada em consideração a erosão na superfície das mesmas. O segundo artigo determinou a perda mineral (∆Z) de lesões de MBA artificiais: apenas expostas a um desafio cariogênico de alto risco (DCAR) ou previamente tratadas com um cimento de ionômero vidro (CIV) ou um verniz fluoretado (VF), passando depois pelo mesmo DCAR. Sessenta terceiros molares humanos não irrupcionados foram secionados na superfície occlusal, em sentido buco-lingual, e desmineralizados por 42 dias. Uma metade oclusal de cada dente foi alocada para o grupo controle (D), e a outra foi destinada para grupos experimentais: A (ciclagem de pH); B (CIV + ciclagem de pH); e C (VF + ciclagem de pH). O teste de microdureza interna foi realizado. O teste de ANOVA de um critério (p=0.008) e o teste de Tukey (95%) determinou haver diferença estatística entre os grupos. Os valores médios para ∆Z foram de 4.983,53 para o grupo A(b); 3.090,93 para B(a); 4.303,29 para C(ab); e 4505.61 para o grupo D(b). Lesões de MBA, quando expostas a um DCAR, sofrem uma perda mineral considerável. Quando essas

19

lesões foram tratadas com CIV obtiveram os menores resultados para ∆Z enquanto o VF promoveu resultados intermediários. Implicações clínicas: Os produtos fluoretados testados podem diminuir a perda mineral de lesões naturais de MBA em superfícies oclusais.

Palavras-chave: Cárie Dentária; Esmalte Dentário, ultraestrutura; Microscopia, eletrônica de varredura; Cimento de Ionômero de Vidro; Cárie Dentária; Fluoretos Tópicos.

20

Abstract

21

De Marsillac, Mirian de Waele Souchois. Enamel active white spot lesion and mineral loss after the use of fluorides in occlusal surface: An in vitro study. 2007. 180f. Thesis (PhD in Dentistry – Pediatric Dentistry) – Post-graduate Program in Dentistry, Federal University of Santa Catarina, Florianópolis.

ABSTRACT The present in vitro experiment was divided in to two articles. The first article was made to assess trough scanning electron microscopy (SEM) and by cross-section microhardness test (CSMH) whether the methodology exposed in this experiment can be used to induce active white spot lesion (WSL) in human dental enamel. Ten human permanent molars were used in this in vitro experiment to create artificial active WSLs on smooth and unabraided enamel surfaces. One section of each tooth was double coated with nail varnish except for a limited area sized 2.5 mm x 1 mm (2.5 mm2) at the center of the surface. Each specimen was individually exposed to 10.4 ml of a demineralizing solution containing: 0.1 mol/l lactic acid buffer; 0.2% polyacrilic acid; 0.03 ppm F; and 50% saturated with hydroxyapatite at pH 5.0, during 42 days (37oC) without agitation. Samples were sectioned in the center of the artificial WSL and one half was analyzed in SEM and the other half was submitted to CSMH test. The mean depth of the active WSL was 80 μm (sd= 78.8) and a white dull rough surface could be detected by the unaided eye. SEM images demonstrated that although some surface areas of the active WSL appeared to be relative intact erosion was present. A prismatic pattern of dissolution was observed in all samples with an enlargement of the prism sheaths. In some samples there were also sites of destruction of prism cores. This methodology can be used to induce an active WSLs in human dental enamel but surface erosion has to be taken into account when performing CSMH test.The second article was an experiment sought to determine the mineral loss (∆Z) of artificially induced active WSLs: exposed to a high risk cariogenic challenge (HRCC) using pH cycling; treated with a glass ionomer cement (GIC) or a fluoride varnish (FV) and submitted to the same HRCC. Sixty unerupted human third molars were sectioned buccolingually on the occlusal surface and demineralized for 42 days. One half of each tooth was allocated to a control group (D) and the other were used as experimental groups: A (pH cycling); B (GIC + pH cycling); and C (FV + pH cycling). Cross sectional microhardness test was performed and ∆Z was assessed. One way ANOVA (p=0.008) and Tukey´s test (95%) determined statistical difference among groups. Mean values for ∆Z were 4983.53 for group A(b); 3090.93 for B(a); 4303.29 for C(ab); and 4505.61 for group D(b). HRCC promoted a greater mineral loss in active WSLs. Lesions treated with GIC had the lowest ∆Z improving the mineral content of WSLs while FV had intermediate results. The fluoride products tested might be able to improve mineral loss on natural occlusal WSLs. Key words: Dental Caries; Dental Enamel, ultrastructure; Microscopy, electron scanning; Glass Ionomer Cement; Dental Caries; Topical Fluorides.

22

Introdução

23

INTRODUÇÃO

Analisando dados obtidos no Projeto SB Brasil 2000 para crianças,

adolescentes e adultos, é possível verificar que a cárie dentária ainda é um

problema de saúde pública no nosso país (BRASIL, 2004).

A cárie dentária é associada com maior freqüência a determinados dentes

e à morfologia dentária específica, sendo os sulcos e fissuras os prinicipais

locais onde a doença predomina. Estratégias para avaliação do risco à cárie

dentária devem ser realizadas para uma população específica, indivíduos e

determinados sítios dentários (ANDERSON, 2002).

A face oclusal dos primeiros molares permanentes possui uma tendência

maior à cárie dentária (LI et al., 1993; WORKSHOP ON GUIDELINES FOR

SEALANT USE: RECOMMENDATIONS, 1995; BLAYNEY e HILL, 1967). Esses

dentes são de fundamental importância para o correto desenvolvimento da

oclusão nos seres humanos (TAVARES et al., 2002). Os primeiros molares

permanentes irrompem na boca da criança em torno dos seis anos de idade

(LUNT e LAW, 1974) e, geralmente, são um dos primeiros dentes permanentes

a fazê-lo. Esses elementos dentários levam em torno de 12 meses, desde o

primeiro aparecimento na gengiva, até a completa oclusão funcional

(CARVALHO; EKSTRAND; THYLSTRUP, 1991; SATO, 1991). Dentes não

irrupcionados possuem porosidades no esmalte externo que podem facilitar a

difusão de ácidos oriundos da placa bacteriana, enquanto esses não

completarem sua maturação pós-irruptiva (FEJERSKOV; JOSEPHSEN; NYVAD,

24

1984). Além disso, o potencial de risco à doença cárie nos primeiros molares

permanentes é maior que nos outros dentes devido a sua macromorfologia

oclusal. O acúmulo de placa bacteriana nas fóssulas e fissuras oclusais desses

dentes têm uma redução significativa, quando os mesmos atingem uma oclusão

funcional (EKSTRAND et al., 1993). Sua limpeza pode ficar prejudicada pela

falta de uma adequada higiene bucal. Entretanto, um programa de higiene bucal

individualizado para primeiros molares permanentes em irrupção, com consultas

de retornos para limpeza profissional e motivação, uma escovação diferenciada

e o auxílio dos responsáveis, duas vezes ao dia, foram capazes de reduzir a

placa bacteriana e o número de lesões de mancha branca ativa (MBA) nesses

dentes, durante o período de um ano (CARVALHO; EKSTRAND; THYLSTRUP,

1991).

A utilização de fluoretos é um método reconhecidamente eficaz na

prevenção e na remineralização de lesões iniciais de cárie no esmalte dentário

(TEN CATE e FEATHERSTONE, 1991; FEATHERSTONE, 2000;

FEATHERSTONE, 2004). O uso de fluoretos deve ser baseado no risco de cárie

do paciente (TINANOFF e DOUGLAS, 2002). Para aumentar a possibilidade de

contato do fluoreto tópico à superfície dentária, o mesmo foi adicionado ao

verniz odontológico (VF) a fim de que pudesse, então, permanecer durante

períodos prolongados (MURRAY, 1992; BLINKHORN e DAVIES, 1998). O uso

de vernizes fluoretados é encorajado pela literatura odontológica (ISMAIL, 1998;

BELTRÁN-AGUILAR; GOLDSTEIN; LOCKWOOD, 2000; AMERICAN

ACADEMY OF PEDIATRIC DENTISTRY, 2006-7). Os VFs podem prevenir a

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=9803034&query_hl=12&itool=pubmed_docsum

25

desmineralização do esmalte em dentes decíduos (MURRAY; WINTER; HURST,

1977; WEINSTEIN et al., 1994; WEINTRAUB et al., 2006) e permanentes

(HOLM; HOLST; MEJÀRE, 1984; MURRAY; WINTER; HURST, 1977). Os VFs

também podem retardar a progressão e remineralizar as lesões de MBA em

esmalte dental de decíduos (WEINSTEIN et al., 1994; AUTIO-GOLD e

COURTS, 2001; QUEIROZ et al., 2003), dentes permanentes (ÖGAARD;

RÖLLA; HELGELAND, 1984; HOLMEN et al., 1986; ADRIAENS; DERMAUT;

VERBEECK, 1990), incluindo superfícies de sulcos e fissuras de molares

permanentes (FLÓRIO et al., 2001).

Outra forma de intervir de maneira não invasiva é através do uso de

selantes de fóssulas e fissuras. Os selantes resinosos possuem uma grande

resistência ao deslocamento em relação aos selantes de cimento de ionômero

de vidro (CIV) (WORKSHOP ON GUIDELINES FOR SEALANT USE:

RECOMMENDATIONS, 1995; AMERICAN ACADEMY OF PEDIATRIC

DENTISTRY, 2006-7). Os selantes resinosos são efetivos na prevenção de cárie

dentária, desde que sua integridade marginal e sua retenção no local sejam

mantidas intactas (GWINNETT et al., 1982). Um estudo clínico demonstrou que

lesões de cárie oclusal, quando seladas com selante resinoso, tornavam-se

inativas desde que o mesmo permanecesse sem infiltração, rachadura e/ou

perda (MERTZ-FAIRHURST; SCHUSTER; FAIRHURST, 1986). Quanto à

retenção do selante de CIV, alguns autores o consideram com uma pequena

capacidade em permanecer retido nos sulcos e fissuras dos dentes (ÖVREBÖ e

RAADAL, 1990; WILLIAMS et al., 1996). Por outro lado, vários estudos clínicos

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Dermaut%20LR%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstractPlushttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Verbeeck%20RM%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

26

utilizando os selantes de CIV têm demonstrado sua efetividade na prevenção de

cárie e uma boa retenção, em consultas de retorno até dois (MCLEAN e

WILSON, 1974), três (HOLMGREN et al., 2000; FRENCKEN; MAKONI;

SITHOLE, 1998) e cinco anos (PARDI et al., 2003; TAIFUR et al., 2003; BARJA-

FIDALGO et al., 2005). Dentes que receberam um selante de CIV e são

expostos novamente ao meio bucal, devido à perda do selamento, possuem

chances menores de desenvolver cárie dentária (WILLIAMS et al., 1996;

BEIRUTI et al., 2006). Esse fato pode ser resultado da combinação do efeito

conjunto da aquisição de fluoreto naquela superfície, oriundo do selante de CIV,

e da presença desse material como resíduo no interior das fóssulas e fissuras

(MEJÀRE e MJÖR, 1990; SEPPÄ e FORSS, 1991). Por isso, Williams et al.

(1996) recomendam o uso do selante de CIV como um material odontológico

capaz de liberação de fluoreto ao invés de um simples obliterador de fóssulas e

fissuras. Esses autores também o indicam em situações onde podem ocorrer

certa presença de umidade, em casos onde o paciente tenha pouca idade ou

não possua capacidade para colaborar.

É necessário que o profissional utilize os conceitos modernos de

diagnóstico de cárie (PITTS, 2004) para fazer observação e controle da lesão

inicial em esmalte dentário ou ainda optar por outros tratamentos não invasivos.

Esses conceitos também auxiliam o profissional a avaliar o desfecho para

qualquer um dos dois procedimentos adotados. A adesão do paciente é sempre

um fator primordial a ser considerado pelo profissional, qualquer que seja o

procedimento adotado por ele. Os fatores etiológicos que impelem o processo

27

carioso devem ser modificados, caso contrário qualquer tratamento não invasivo

ou invasivo que o profissional adote jamais será efetivo a longo prazo. Quando

uma lesão de esmalte é diagnosticada em seu início, o equilíbrio no processo

dinâmico entre a desmineralização e a remineralização pode acarretar em

cavitação, reparo, reversão ou manutenção da situação. O ideal seria que

pequenas concentrações de fluoreto estivessem presentes na interface dente e

fluidos bucais ou entre fluido da placa bacteriana e o dente. O fluoreto altera o

equilíbrio fisiológico entre a perda mineral e o reparo em favor do último (TEN

CATE; FEATHERSTONE, 1991; FEATHERSTONE, 2000).

O presente estudo teve dois objetivos: a) Avaliar por intermédio de

microscopia eletrônica de varredura (MEV) e pelo teste de microdureza interna

(MI) se a metodologia descrita neste experimento pode ser utilizada na indução

de lesão de mancha branca ativa (MBA) em esmalte dentário humano; b)

Determinar a perda mineral (∆Z) de lesões artificiais de MBA, produzidas em

oclusal de terceiros molares inclusos extraídos, apenas expostas a um desafio

cariogênico de alto risco (DCAR) ou previamente tratadas com um CIV ou ainda

um VF, posteriormente também submetidas ao mesmo DCAR.

28

Artigo 1: Versão em Português

29

Lesão de mancha branca ativa, com erosão e/ou amolecimento superficial, em esmalte dental humano produzida por ácido lático.

1. Mirian de Waele Souchois de Marsillac, Mestrado em Odontologia, Aluna

do Doutorado em Odontologia da Universidade Federal de Santa

Catarina, Florianópolis e Professora Assistente da Disciplina de

Odontopediatria da Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Brasil.

2. Ricardo de Sousa Vieira, Doutor em Odontologia, Professor Associado I

na Disciplina de Odontopediatria da Universidade Federal de Santa

Catarina, Florianópolis, Brasil.

Contato com autor:

Mirian de Waele Souchois de Marsillac

Endereço: Boulevard 28 de setembro, 157/ sala 226, Vila Isabel, Rio de Janeiro

– RJ. CEP 20.551-030

e-mail: mwsm63@terra.com.br

Telefone/Fax: (21) 2587-6372

mailto:mwsm63@terra.com.br

30

Resumo:

Objetivo: Avaliar através de microscopia eletrônica de varredura (MEV) e pelo teste de microdureza interna (MI) se a metodologia descrita neste experimento pode ser utilizada na indução de lesão de mancha branca ativa (MBA) em esmalte dentário humano. Metodologia: Dez molares permanentes humanos foram utilizados neste experimento in vitro onde foram induzidas lesões de MBA em superfície lisa e não abrasionadas de esmalte. Uma amostra de superfície lisa de cada dente foi recoberta com duas camadas de esmalte para unhas, exceto por uma área medindo 2,5 mm x 1 mm (2,5 mm2), delimitada no centro da amostra. Cada amostra foi exposta individualmente a 10,4 ml de uma solução desmineralizadora contendo: 0,1 mol/l de ácido lático tamponado; 0,2% de ácido poliacrílico; 0,03 ppm F; e a solução foi saturada com 50% de hidroxiapatita em pH 5,0 durante 42 dias (37oC) sem agitação. As amostras foram seccionadas no centro das lesões de MBA e uma metade foi analisada ao MEV e a outra foi submetida a teste de MI. Resultados: A média de profundidade da lesão de MBA foi de 80 μm (dp = 78,8) e foi possível detectar ao olho nu uma superfície branca rugosa e sem brilho. As fotomicrografias feitas com o MEV demonstraram que embora algumas áreas na superfície das lesões de MBA aparentassem estar relativamente intactas, outros locais da lesão apresentavam erosão. Um padrão prismático de dissolução, com o aumento das bainhas dos prismas de esmalte, foi observado em todas as amostras. Em algumas amostras também foram observados locais de destruição do centro dos prismas de esmalte. Essa metodologia pode ser utilizada para induzir lesões de MBA em esmalte dental humano, porém, quando forem realizados testes de MI, deve ser levada em consideração a erosão na superfície das mesmas. Relevância clínica: As lesões de MBA induzidas artificialmente foram capazes de se assemelhar às lesões de MBA naturais. As imagens obtidas com o MEV do esmalte dentário poderiam ajudar o clínico a compreender a real extensão da doença e facilitar nos experimentos in situ que estivessem relacionados com a remineralização de lesões de MBA. Palavras-chave: Cárie Dentária; Esmalte Dentário, ultraestrutura; Microscopia, eletrônica de varredura.

31

INTRODUÇÃO:

O primeiro sinal visual da cárie dentária é comumente conhecido como

uma “lesão de mancha branca”. As etapas iniciais dessa lesão não podem ser

detectadas ao olho nu. O diagnóstico clínico desse tipo de lesão só pode ser

realizado quando o dente está limpo, seco e bem iluminado.1,2 A superfície do

esmalte que está envolvida nessa lesão perde o brilho e se torna esbranquiçada,

macia e com uma textura áspera. Algumas vezes essa lesão pode se tornar

pigmentada por material exógeno que é absorvido nessa região porosa.3,4,5

Embora a lesão de MBA seja considerada por muitos como uma lesão

incipiente, essa é um estágio relativamente tardio do processo carioso no

esmalte dentário.6

Alguns estudos in vivo relatam modificações no aspecto clínico e

histológico da superfície do esmalte dentário durante a inativação de uma lesão

de MBA.7,8,9 Tem sido mostrado que as lesões de MBA no esmalte dentário com

uma aparência esbranquiçada, sem brilho e rugosa, quando se tornaram inativas

adquiriram um aspecto de superfície brilhante, lisa e dura.

Antes mesmo que a lesão cariosa se torne visível ao olho nu, essa já

envolveu a dissolução da microestrutura externa do esmalte dentário. A

embebição de amostras de esmalte dentário em quinolina para a observação em

microscopia de luz polarizada, demonstrou que a dissolução era identificada

como uma zona translúcida.3 A liberação de componentes químicos, pela

dissolução parcial da periferia dos cristalitos7,10, para a fase líquida que os

circunda11,12, é uma reação inicial importante entre o ácido oriundo da placa

32

bacteriana e a superfície do esmalte dentário. Quando o ácido lático é utilizado

para o estudo de lesão artificial de MBA, fase líquida da lesão permanece

saturada em relação aos diferentes íons durante o ataque carioso. A

desmineralização de um dente consiste em dois processos: a dissolução do

mineral no limite mais interno da mesma (zona de vanguarda da lesão) e a

difusão dos íons de ácido do metabolismo bacteriano, sendo que os íons

minerais são transportados para fora da matriz do esmalte. Geralmente, a

difusão é um processo mais lento que a dissolução.12 A difusão do ácido da

placa bacteriana ocorre predominantemente nos espaços interprismáticos e

intercristalinos (ou poros) do esmalte dentário preenchidos com água e

proteínas. Vários estudos têm demonstrado que a zona de superfície da lesão é

mais porosa que o esmalte dentário sadio circunjacente ao mesmo. O aumento

das bainhas dos prismas são vias estruturais de passagem do ácido da

superfície do esmalte dentário para a lesão de subsuperfície em formação. O

esmalte dentário abaixo dessa zona afetada é mais poroso que a sua superfície.

Conseqüentemente, essa superfície ou zona de esmalte dentário afetada não é

uma área intacta e mostra uma tendência clara à desmineralização de

subsuperfície.5,7,10,11,13,14,15,16

Um experimento in vivo demonstrou que a dissolução direta da superfície

do esmalte dentário era observada em todos os estágios de desenvolvimento da

lesão, promovendo um aumento dos espaços intercristalinos.7 Com o progresso

da lesão, a erosão direta dessa superfície se torna mais evidente e pode ser

detectada clinicamente como uma MBA. Quando comparado ao esmalte sadio a

33

lesão de MBA possui uma superfície rugosa, esbranquiçada e sem brilho ou com

um aspecto de “branco giz”. Dois fenômenos podem ser relacionados às

características clínicas citadas: uma delas é a desmineralização de

subsuperfície devido ao aumento da porosidade interna do esmalte dentário e a

outra é causada pela erosão direta do esmalte superficial. A superfície irregular

e erodida juntamente com a lesão de subsuperfície geram as características

clínicas já mencionadas típicas da lesão de MBA.10,16

O objetivo do presente estudo in vitro foi de avaliar por microscopia

eletrônica de varredura (MEV) e pelo teste de microdureza interna (MI) se a

metodologia aplicada neste experimento pode ser utilizada para a indução de

lesão artificial de MBA no esmalte dentário humano.

MATERIAIS E MÉTODOS:

Dez molares humanos irrupcionados foram utilizados neste experimento.

O parecer consubstanciado do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres

Humanos da Universidade Federal de Santa Catarina (Brasil) aprovou o

desenvolvimento desta pesquisa. Os dentes usados neste estudo foram

extraídos por motivos alheios à mesma e as razões para tal estavam

especificadas no prontuário odontológico do paciente. Todos os pacientes eram

adultos, residentes em local com água de abastecimento fluoretada (1 ppm F), e

foram atendidos na Universidade Federal de Santa Catarina. Inicialmente todos

os dentes foram limpos com água corrente e detergente, com uma escova

34

dental. Qualquer tecido mole foi removido dos dentes empregando-se uma

cureta dental. Em seguida, foi realizada uma profilaxia com taça de borracha e

uma mistura de pedra-pomes e água deionizada em baixa rotação. Todos os

espécimes foram lavados com água deionizada e o seccionamento das raízes

dentárias foi efetuado com um disco diamantado (no 11-4254, serie 15 LC,

Buehler – Lake Bluff Illinois - EUA) acoplado a uma cortadeira elétrica

(ISOMET™ 1000, Buehler - Lake Bluff, Illinois – EUA) refrigerada com água

deionizada. O tecido pulpar foi removido das coroas dentárias e essas foram

seccionadas duas vezes no longo eixo da coroa dental gerando quatro

amostras. Todas as amostras obtidas foram inspecionadas em um

estereomicroscópio (Olympus SZH10 - Olympus Optical do Brasil, Ltda., São

Paulo, SP - Brasil) acoplado a um sistema de captura de imagem digital

(Olympus DP12 - Olympus Optical do Brasil, Ltda., São Paulo, SP - Brasil) para

excluir exemplares contendo defeitos de superfície, rachaduras, cárie dentária

e/ou alterações de coloração (25x). Apenas uma das amostras de cada dente foi

selecionada.

Todas as superfícies lisas e não abrasionadas foram isoladas com duas

camadas de um esmalte vermelho para unhas, exceto por uma área limitada

com papel adesivo medindo 2,5 mm x 1 mm (2,5 mm2). Após total secagem do

esmalte para unhas em temperatura ambiente, foi removido o papel adesivo e as

amostras foram submersas em 10,4 ml17,18 de uma solução desmineralizadora a

37oC sem agitação. A solução desmineralizadora foi preparada baseada em

White17 e continha: 0,1 mol/l de ácido láctico tamponado; 0,2% de ácido

35

poliacrílico (Carbopol® 980 – DEG Importadora de Produtos Químicos Ltda., São

Paulo, SP - Brazil); 0,03 ppm F19; essa solução foi saturada com 50% de

hidroxiapatita (Gen-phos HA - Hospitália Cirúrgica Catarinense Ltda.,

Florianópolis Santa Catarina - Brasil) em pH 5,0.

As amostras permaneceram em 10,4 ml de solução desmineralizadora

durante 42 dias, sendo que uma nova solução era preparada e trocada a cada

14 dias. Para evitar o crescimento de fungos foi acrescentado 0,18% de

metilparabeno a essa solução.20

Após a desmineralização, cada amostra foi lavada com água deionizada

durante 10 segundos. Todas as amostras foram seccionadas no centro da lesão

de MBA artificial utilizando-se o mesmo disco diamantado em uma cortadeira

elétrica ISOMET 1000. Esse procedimento foi realizado com refrigeração de

água deionizada em baixa rotação (100 rpm). As amostras foram, então, limpas

em frascos individualizados com água deionizada em um aparelho de ultra-som

(Ultrasonic Cleaner 1440D - Odontobrás Indústria de Equipamentos Médicos e

Odontológicos, Ribeirão Preto, SP – Brasil), por 20 minutos, e secadas em

temperatura ambiente sobre papel absorvente. Dez das amostras seccionadas

foram submetidas a teste de microdureza interna (MI) do esmalte dentário e as

outras respectivas secções foram observadas em microscópio eletrônico de

varredura (MEV).

Antes de efetuar o teste de MI as amostras foram incluidas em resina de

poliéster (Central do Fiber Glass, Florianópolis, SC - Brasil) e após a sua presa

foram lixadas e polidas em uma politriz da marca DP10 Struers machine22

36

(Panambra Industrial e Técnica SA, São Paulo, SP - Brasil). O teste de MI do

esmalte dentário foi realizado com um indentador Knoop em um microdurômetro

Shimadzu Micro Hardness Tester, Serie HMV-2 (Shimadzu Corporation Testing

& Weighing equipment division, Kioto - Japão), como descrito previamente por

Argenta et al.21 e De Marsillac et al.22 (em apreciação). Tanto a área da lesão de

MBA quanto o esmalte sadio circunjacente, coberto pelo esmalte para unhas,

foram submetidos ao teste de MI. Após a obtenção das médias de MI, em cada

uma das sete profundidades para o esmalte sadio e da lesão, esses valores

foram transformados em porcentagem do volume mineral segundo a fórmula de

Featherstone et al.23 A profundidade da lesão foi definida por Djikman et al.24

baseada, a partir da parte externa do esmalte, no teor de até 95% do valor de

conteúdo mineral do esmalte sadio.

As amostras submetidas ao MEV requerem desidratação em

concentrações crescentes de etanol.25 Todas as amostras foram cobertas com

uma camada de ouro de cerca de 300 Å de espessura5 em um aparelho Sputter

Coater, Bal-Tec SCD005 (BAL-TEC AG, Balzers - Principado de Liechtenstein) a

vácuo. A superfície externa do esmalte dentário foi observada e fotografada com

um MEV (Philips XL30, Eindhoven - Holanda), de maneira randomizada, nos

seguintes aumentos: 16, 60, 250 e 400 vezes e, em alguns espécimes, um

aumento de 8.000x foi utilizado. Uma visão sagital (interna) do esmalte dentário

com lesão de MBA foi analisada com aumentos de 120, 200 e, em algumas

ocasiões, de 400 vezes. O aparelho de MEV foi operado em 10 ou 20 kV.

37

RESULTADOS:

A tabela 1 contém a média da MI Knoop e o respectivo valor de

porcentagem mineral juntamente com o desvio padrão (dp) obtido em cada

profundidade analisada na lesão de MBA ou no esmalte hígido. Devido à erosão

ou a uma grande perda de substância mineral (amolecimento) na superfície da

lesão de MBA, todas as amostras tiveram um valor de dureza Knoop muito baixo

ou perda da superfície externa em até 20 μm. Sempre que houver um valor

muito baixo de dureza Knoop, esse não poderá ser medido de forma adequada

no monitor do computador. Ainda nessa tabela, a profundidade média da lesão

de MBA foi de 100 μm (80,3 e dp = 12,1).

Table 1 – Valores de microdureza Knoop para esmalte sadio e para a lesão de MBA, volume de porcentagem mineral e desvio padrão (dp) em cada profundidade avaliada.

Esmalte Sadio (N=10) Lesão de MBA (N=10) Profundidade Média Knoop

(dp) % de volume mineral (dp)

Média Knoop (dp)

% de volume mineral (dp)

20 μm 295,8 (39,5) 85,1 (5,1) ---------- ---------- 40 μm 307,8 (44,2) 86,6 (5,5) 29,75 (13,5) 34,4 (3,8) 60 μm 321,7 (58,8) 88,1 (7,2) 116,4 (58,8) 54,4 (17,3) 80 μm 324,1 (39,5) 88,6 (4,8) 231,9 (78,8) 75,9 (10,8) 100 μm 332,8 (30,5) 89,7 (3,7) 265,2 (30,5) 80,3 (12,1) 120 μm 345,6 (33,0) 91,2 (3,8) 307,7 (33,2) 86,6 (3,8) 140 μm 352,3 (23,5) 92,0 (2,7) 327,5 (25,4) 89,1 (2,8)

Tabela 2 (APÊNDICE A) mostra o número de amostras com um baixo

valor Knoop (amolecimento) ao teste de MI ou perda de estrutura do esmalte

(erosão) em todas as profundidades avaliadas.

38

As fotomicrografias feitas com auxílio do MEV foram realizadas de forma

aleatória das áreas de lesão de MBA em cada uma das dez amostras. O local da

amostra exposto a solução desmineralizadora pôde ser distinguido ao olho nú e

também em aumento de 16x ao MEV (figura 1). As imagens demonstraram que,

em aumentos menores (16x ou 60x), algumas áreas da lesão de MBAestavam

erodidas e outras pareciam aparentemente intactas quando comparadas ao

esmalte sadio circundante (figura 1).

Figura 1 – Fotografia da amostra do dente número 4 em estereomicroscópio (7x) demonstrando a área do esmalte dentário exposta à solução desmineralizadora na porção superior direita da imagem. Aspecto da mesma amostra em pequeno aumento (16x) ao MEV.

39

Um padrão prismático de destruição foi observado em todas as amostras

que foram analisadas em áreas erodidas e nas áreas de esmalte aparentemente

intacto. Esse padrão origina um aumento da bainha do prisma (figura 2).

Algumas áreas superficiais foram acometidas por erosão, onde foram

evidenciadas pericimatias subjacentes se sobrepondo no esmalte dentário

(figura 2).

Figura 2 – Amostra do dente número 4 demonstrando a erosão da superfície evidenciando pericimatias subjacentes (60x) na imagem superior direita. As setas na imagem de maior aumento (250x) apontam para a sobreposição das pericimatias. Na mesma fotomicrografia pode ser distinguido um padrão prismático de destruição.

40

Algumas vezes o aumento das bainhas dos prismas criou uma estrutura

em forma de “arcos” (seta na figura 3). Todas amostras apresentaram destruição

do centro dos prismas (figura 3) em áreas de erosão superficial.

Figura 3 – No quadro da maior imagem (400x) a amostra do dente número 3 mostra um padrão prismático de destruição da superfície do esmalte e a seta indica a estrutura em forma de arco. A destruição do centro do prisma pode ser vista na fotomicrografia no canto superior direito (8.000x).

41

Vias estruturais, promovidas pela difusão da solução desmineralizadora,

são observadas nos espaços interprismáticos e intercristalinos em um local de

padrão prismático de desmineralização em uma área não erodida na amostra do

dente 6 (figura 4).

Figura 4 – Amostra do dente número 6 no canto superior direito (8.000x) mostra um local sadio de esmalte dentário e na imagem maior as setas destacam as áreas de dissolução intercristalina e interprismática no mesmo dente, em um local onde não havia erosão da MBA (8.000x).

42

A fotomicrografia da porção interna da lesão de MBA também mostra

algumas partes de perda da superfície externa do esmalte (figura 5).

Figura 5 – Secção transversal da lesão de MBA da amostra do dente número 4 onde as chaves delimitam a porção erodida da superfície do esmalte dentário (120x).

DiSCUSSÃO:

Uma solução de ácido lático tamponada foi utilizada neste experimento

para produzir lesão de cárie em amostras de esmalte dentário humano,17,18

porque esse ácido representa 90% ou mais da sacarose e/ou glicose fermentada

pelos Streptococcus.26,27 Esses são os microorganismos predominantes no início

43

da colonização da placa dental em esmalte ou superfícies radiculares28 em

indivíduos cárie ativos ou não.29

A solução desmineralizadora empregada neste estudo foi capaz de criar

cárie artificial em molares humanos extraídos que se assemelham à lesão

natural de MBA de superfície lisa quando comparados a literatura. O ácido

poliacrílico foi usado nessa formulação para restringir a difusão do ácido láctico

no esmalte dentário e criar lesões de subsuperfície.17,30,31 Uma pequena

concentração de fluoreto19 também foi utilizada para auxiliar na criação da zona

de superfície da lesão de MBA e evitar uma grande erosão do esmalte

dentário.32 Outros estudos laboratoriais têm utilizado diferentes métodos para

restringir a difusão do ácido na superfície do esmalte e criar lesões de

subsuperfície em esmalte dentário humano ou bovino como: sistemas de

géis33,34; soluções desmineralizadoras enriquecidas com cálcio e fosfato

contendo fluoretos35,36,37 ou sem fluoreto38,39; soluções desmineralizadoras com

protetores de superfície e enriquecidas com cálcio e fosfato contendo ou não

fluoretos.11,17,18 As substâncias mais utilizadas como protetores de superfície na

formação de lesões artificiais de subsuperfície em esmalte dentário são ou o

Metano hidroxidifosfonato (MHDP)11 ou o ácido carboxílico (Carbopol™).17 O

MHDP pode interagir com o ácido lático tamponado através da competição com

os locais contendo cálcio no esmalte dentário e o ácido poliacrílico possui uma

ação independente30. O ácido poliacrílico é um excelente protetor de superfície

para o esmalte dentário e ainda permite que os ácidos orgânicos se difundam

44

pela zona de superfície do mesmo, promovendo uma lesão de subsuperfície.

Essa substância química é comercializada com maior facilidade que o MHDP.31

A média da profundidade da lesão artificial de MBA obtida neste estudo in

vitro foi de 100 μm (80,3 e dp = 12,1). Essa pode não ser uma lesão muito

profunda, porém, ela pode ser detectada ao olho nu e como smalte úmido

devido ao somatório dos efeitos da superfície erodida e à lesão de subsuperfície.

Um experimento in vitro realizado por Margolis et al.32 também utilizou uma

solução de ácido lático (0,1 M), parcialmente saturada em relação ao mineral do

esmalte dentário, em pH 4,3, e baixas concentrações de fluoreto. Essa solução

desmineralizadora não possuía um agente protetor de superfície como a usada

no presente estudo e por isso as imagens ao MEV evidenciaram que, após 72

horas, as soluções contendo 0,004 e 0,009 ppm F apresentaram cavitações na

superfície do esmalte. Outras soluções desmineralizadoras contendo 0,024;

0,054 e 0,154 ppm F formaram uma superfície de esmalte dentário

aparentemente intacto após o mesmo período. O exame visual dessas amostras

apresentava um aspecto esbranquiçado, embora nas fotomicrografias com

aumento de 500x não tenha havido diferença entre a área afetada e o esmalte

sadio.

Caso uma lesão de MBA seja detectada após secagem, provavelmente

ela deve estar limitada a uma discreta dissolução da superfície do esmalte

dentário e a uma desmineralização da subsuperfície na sua porção externa.

Quando uma lesão de MBA é visível em uma superfície dentária úmida, a

mesma já penetrou mais na superfície do esmalte dentário1,16. As características

45

de uma lesão de mancha branca com uma superfície de coloração

esbranquiçada, sem brilho e rugosa indicam um estágio avançado da lesão

cariosa no esmalte dentário e é então denominada de MBA.7,8,9,10,16,40 É por isso

que Ekstrand2 sugeriu que as pesquisas clínicas registrassem essas diferenças

nas lesões de mancha branca em esmalte carioso utilizando um critério visual

que possibilitasse constatar a atividade e a profundidade das lesões em faces

oclusais.

As amostras de lesão de MBA obtidas neste experimento apresentaram

dois graus de envolvimento da superfície do esmalte mesmo em aumento de

apenas 16x (figura 1): áreas de erosão e áreas aparentemente

intactassemelhante ao esmalte sadio circundante. Esses locais distintos da

lesão de MBA também demonstraram possuir diferentes graus de dissolução do

esmalte. Nos locais de esmalte dentário aparentemente intacto foi possível

detectar um acometimento inicial do esmalte dentário devido ao acentuamento

das características anatômicas superficiais com: maior definição nas áreas de

sobreposição das pericimátias e aprofundamento das depressões referentes aos

processos de Tomes. Segundo Holmen et al.7 isso já caracteriza uma dissolução

inical do esmalte pelo processo carioso.

Um padrão prismático de desmineralização, com um aumento das

bainhas dos prismas, foi detectado em algumas partes da lesão de MBA (figuras

2 e 3). Esse padrão pôde ser visualizado tanto em locais aparentemente intactos

como nas áreas de erosão de todas as amostras. Estes achados corroboram

com os de Haikel et al.5 , Holmen et al.7, e Frank15 que analisaram lesões de

46

MBA naturais. Alguns autores5,15 consideram que o padrão prismático de

desminerlização seja um dos graus iniciais do processo carioso. Nos locais de

erosão da lesão de MBA também foram observadas áreas onde o padrão

prismático apresentava dissolução do centro dos prismas (figura 3). Segundo

Haikel et al.5 e Frank15 isso indica um grau mais avançado de comprometimento

do esmalte dentário pelo processo carioso.

O presente estudo não teve como foco principal evidenciar a

microestrutura interna da lesão de MBA e sim a superfície da mesma.

Entretanto, o aspecto interno da superfíice erodida do esmalte com lesão de

MBA pode ser verificado na figura 5. Frank15 também estudou ao MEV a porção

interna da lesão natural de MBA em esmalte dentário humano após o

seccionamento. Ele evidenciou que o aumento das bainhas dos prismas também

ocorria nessa porção interna da lesão.

Alguns “buracos ou orifícios focais” foram encontrados em locais de lesão

de MBA e de esmalte sadio nas amostras observadas nessa pesquisa in vitro.

Haikel et al.5 detectaram que apenas 10% das suas amostras apresentaram

“buracos ou orifícios focais” na superfície de lesões naturais de MBA ou nas

lesões cariosas pigmentadas de dentes decíduos ou permanentes. De acordo

com esses autores, os “buracos ou orifícios focais” podem ser encontrados no

esmalte dental sadio ou em lesões de MBA, entretanto, eles não parecem ser

uma característica especial do processo carioso no esmalte dentário.

A figura 4 compara um local com superfície de esmalte sadio a um local

não erodido da superfície de lesão de MBA com padrão prismático de

47

desmineralização de uma mesma amostra usando o mesmo aumento (8.000x).

A imagem maior dessa figura demonstra as vias de difusão criadas pela solução

desmineralizadora nos espaços intercristalinos e interprismáticos. É através

desses espaços que o ácido da placa bacteriana tem acesso a subsuperfície do

esmalte dentário como relatam outros autores. 4,6,9,10,12,14,15

A metodologia apresentada nesta pesquisa pode promover uma

adequada fonte de estudo para o processo carioso de lesões de MBA em

esmalte dentário humano. O teste de MI e as fotomicrografias avaliadas na atual

pesquisa in vitro demonstraram que a solução desmineralizadora utilizada foi

capaz de criar lesão artificial de MBA em esmalte dentário humano de maneira

semelhante à lesão cariosa natural. Contudo, a erosão superficial dessas lesões

deve ser levada em consideração quando forem realizados teste de MI.

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53

Artigo 1: Versão em Inglês

54

Artificial active white spot lesion with surface softening and/or erosion in human dental enamel produced by lactic acid.

1. Mirian de Waele Souchois de Marsillac, DDS, MSc, PhD candidate at the

Department of Pediatric Dentistry from the Federal University of Santa

Catarina, Florianópolis and Assistant Professor, Department of

Community and Preventive Dentistry, State University of Rio de Janeiro,

Brazil.

2. Ricardo de Sousa Vieira, DDS, MSc, PhD, Associate Professor at the

Department of Pediatric Dentistry from the Federal University of Santa

Catarina, Florianópolis, Brazil.

Corresponding author:

Mirian de Waele Souchois de Marsillac

Address: Boulevard 28 de setembro, 157/ sala 226, Vila Isabel, Rio de Janeiro –

RJ. CEP 20.551-030

e-mail: mwsm63@terra.com.br

Telephone/Fax: (21) 2587-6372

mailto:mwsm63@terra.com.br

55

Artificial active white spot lesion with surface softening and/or erosion in

human dental enamel produced by lactic acid. Abstract:

Purpose: To assess trough scanning electron microscopy (SEM) and

cross-sections microhardness (CSMH) test whether the methodology exposed in

this experiment can be used to study active white spot lesion (WSL) in human

dental enamel. Methods: Ten human permanent molars were used in this in vitro

experiment to create artificial active WSLs on smooth and unabraided enamel

surfaces. One section of each tooth was double coated with nail varnish except

for a limited area sized 2.5 mm x 1 mm (2.5 mm2) at the center of the surface.

Each specimen was individually exposed to 10.4 ml of a demineralizing solution

containing: 0.1 mol/l lactic acid buffer; 0.2% polyacrilic acid; 0.03 ppm F; and

50% saturated with hydroxyapatite at pH 5.0, during 42 days (37oC) without

agitation. Samples were sectioned in the center of the artificial WSL and one half

was analyzed in SEM and the other half was submitted to CSMH. Results: The

mean depth of the active WSL was 80 μm (sd= 78.8) and a white dull rough

surface could be detected by the unaided eye. SEM images demonstrated that

although some surface areas of the active WSL appeared to be relative intact

erosion was present. A prismatic pattern of dissolution was observed in all

samples with an enlargement of the prism sheaths. In some samples there were

also sites of destruction of prism cores. This methodology can be used to induce

active WSLs in human dental enamel but surface erosion has to be taken into

account when performing CSMH test.

Clinical Significance: Artificial induced active WSLs resembled natural ones. The

SEM images of active WSLs on enamel would help the clinician understand the

actual extent of the disease and could facilitate in situ experiments that deal with

remineralization of enamel lesions.

Key words: Dental Caries; Dental Enamel, ultrastructure; Microscopy, electron scanning.

56

INTRODUCTION:

The first visual clinical sign of dental caries is commonly known as a “white

spot lesion” (WSL). Early stages of this lesion cannot be detected with an

unaided eye. Clinical diagnosis of this kind of lesion can only be performed on a

clean, dried and well illuminated tooth. 1,2 The enamel surface involved in this

lesion looses its gloss and turns whitish, soft and with a roughened texture.

Sometimes this lesion becomes stained by exogenous material adsorbed to the

porous region.3,4,5 Although the white spot lesion is considered by many as an

incipient carious lesion it is actually a relatively late stage of the carious process

in enamel.6

Clinical aspects and histological features of surface enamel changes

during the arrestment of active carious lesions in vivo have been reported.7,8,9 It

has been shown that active carious enamel lesions with a whitish opaque

appearance and a rough surface, when transformed into an inactive stage obtain

a smooth and hard surface.

Before the lesion becomes macroscopically visible to the naked eye it

already involves the dissolution of the external microsurface. Imbibition in

quinoline and observation under a polarized light microscope demonstrated that

this dissolution was identified as a translucent zone.3 An important initial reaction

between the acid from the dental plaque and the enamel surface is the partial

dissolution of the crystallites peripheries,7,10 liberating these chemical

components to the surrounding water phase.11,12 When using lactic acid to study

artificial WSL the fluid within the lesion remained saturated with respect to

57

different ions during caries attack. Demineralization of a tooth consists in two

processes: dissolution of the mineral at the advancing front of the lesion, and

diffusion of acid ions from bacteria metabolism and solubilized mineral ions that

are transported out of the lattice. Generally, diffusion is the slowest of these two

processes.12 Acid diffusion from the dental plaque occurs predominantly in the

interprismatic and intercrystalline spaces (or pores) filled with water and proteins.

A number of studies have demonstrated that the surface zone of the lesion has

more porous than the surrounding sound enamel. Enlargement of prism sheaths

are structure pathways from the enamel surface to the forming sub-surface

lesion. The enamel underneath this affected zone is more porous than the latter.

Consequently, this is not an almost intact surface area as some professionals

assume. Moreover, it clearly shows a tendency to subsurface

demineralization.5,7,10,11,13,14,15,16

An in vivo experiment demonstrated a direct dissolution of the enamel

surface observed in every stage of lesion development, and leading to an

enlargement of intercrystalline space.7 As the lesion progresses the direct

surface erosion becomes more evident and can be clinically detected as an

active WSL. Clinical characteristics of this active lesion are the rough, white dull

(without surface luster) or chalky appearance with a distinct level from the sound

enamel to the affected zone. Two phenomena are related to this clinical

characteristic, one is the subsurface demineralization due to the increased

internal enamel porosity and the other one is caused by the direct surface

58

erosion. Both, the irregular eroded surface and the subsurface lesion, generates

the clinical aspects that are characteristics of a WSL cited above. 10,16

The aim of the present in vitro study was to determine by SEM and cross-

sectional microhardness (CSMH) test whether the methodology used in this

experiment can be use to induce artificial active WSL on human dental enamel.

MATERIAL AND METHODS

Ten extracted irrupted molars were used in this study which had ethical

approval by the Committee of Ethics in Human Being Research of the Federal

University of Santa Catarina (Brazil). These teeth were extracted for reasons

specified at the patient’s dental record forms and had no relation to this

experiment. All patients were adults, living on a water fluoridated area (1 ppm F),

and attending the Federal University of Santa Catarina Dental School. Initially all

teeth were cleaned under running tap water with detergent and a toothbrush. Any

soft tissue was removed from the teeth with the aid of a dental scaler. A

prophylaxis was performed with pumice slurry and a mechanic rotating cup and,

subsequently the teeth were washed with deionized water. Roots were sectioned

with a wafering diamond blade (#11-4254, Series 15 LC, Buehler - Lake Bluff,

Illinois – USA) on a cutting machine (ISOMET™ 1000, Buehler - Lake Bluff,

Illinois – USA) refrigerated with deionized water. Pulp tissues were discharged

and the crowns were sectioned twice on the occlusal surface, trough its long

axis, giving rise to four samples. All samples were visually inspected on a

59

stereomicroscope (Olympus SZH10 - Olympus Optical do Brazil, Ltda., São

Paulo, SP - Brazil) coupled to a digital imaging capturing system (Olympus DP12

- Olympus Optical do Brasil, Ltda., São Paulo, SP - Brazil) for enamel defects

such as cracks, caries or discolorations (x25). Only one sample from each tooth

was selected for the experiment.

All smooth and unabraided surfaces were painted with two coats of a red

nail varnish except for an area limited with an adhesive paper, sized 2.5 mm x 1

mm (2.5 mm2). The adhesive paper was removed after the nail varnish had dried

completely at room temperature and samples were individually immersed in 10.4

ml17,18 of a demineralizing solution without agitation at 37oC. The demineralizing

solution was prepared based on White17 containing: 0.1 mol/l lactic acid buffer;

0.2% polyacrilic acid (Carbopol® 980 – DEG Importadora de Produtos Químicos

Ltda., São Paulo, SP - Brazil); 0.03 ppm F19 and 50% saturated with

hydroxyapatite (Gen-phos HA - Hospitália Cirúrgica Catarinense Ltda.,

Florianópolis Santa Catarina - Brazil) at pH 5.0. Samples remained in 10.4 ml of

demineralizing solution for 42 days and within every 14 days the solutions were

changed for a new freshly prepared one. To avoid fungal growth in the

demineralizing solution 0.18% methylparaben was added to it. 20

After demineralization, each surface was washed in deionized water for 10

seconds and sectioned in half at the center of the lesion utilizing ISOMET 1000

cutting machine and a diamond wafering blade. This procedure was performed

under deionized water cooling and with a low rotating speed of 100 rpm. All

specimens were ultrasonicated (Ultrasonic Cleaner #1440D - Odontobrás

60

Indústria de Equipamentos Médicos e Odontológicos, Ribeirão Preto, SP –

Brazil) for 20 minutes in individual vials containing deionized water and were left

to dry at room temperature on top of an absorbent paper. Ten halves were

submitted to cross-sectional microhardness (CSMH) test and the other ten

halves were observed on a scanning electron microscope (SEM).

Before accomplishing CSMH test all samples were embedded in polyester

resin (Central do Fiber Glass, Florianópolis, SC - Brazil) and after its cure they

were grounded and polished22 on a Politriz DP10 Struers machine22 (Panambra

Industrial e Técnica SA, São Paulo, SP - Brazil). CSMH test was performed with

a Knoop indenter on a Shimadzu Micro Hardness Tester, HMV-2 Series

(Shimadzu Corporation Testing & Weighing equipment division, Kioto - Japan),

as previously described by Argenta et al.21 and De Marsillac et al.22 (In press).

Both active WSL and sound enamel area beneath the nail varnish were

submitted to this test. After obtaining the mean values of CSMH test on each of

the seven tested depths these findings were transformed into volume percent

mineral trough the formula used by Featherstone et al.23 The depth of the lesion

has been defined as up to 95% of the mineral content of the sound enamel.24

SEM analysis required dehydration with increasing concentrations of

ethanol.25 All specimens were coated with a layer of gold-palladium of about 300

Å of thickness5 in a Sputter Coater, Bal-Tec SCD005, machine (BAL-TEC AG,

Balzers - Principality of Liechtenstein) under vacuum. Enamel outer surface was

observed and photographed, at random, with the aid of a scanning electron

microscopy (Philips XL30, Eindhoven - Netherlands) using magnifications of 16,

61

60, 250, 400 times and in some specimens a 8.000 magnification was also used.

Sagital (internal) view of the artificial WSL in the enamel was studied with

magnifications of 120, 200 and sometimes x400. The SEM was operated at 10 or

20kV.

RESULTS:

Table 1 indicates the mean Knoop hardness number and its volume

percent mineral along with their standard deviation obtained on each depth of the

CSMH test in WSL or sound and enamel. Due to surface erosion or to a great

loss of mineral substance (softening) on the surface of the WSLs all samples had

either a very low Knoop value or lost the outer 20 μm enamel structure.

Whenever there is a very low Knoop value it cannot be adequately measured on

the computer monitor. Table 1 also shows that the mean depth of the active WSL

was 100 μm (80.3 and dp = 12.1).

Table 1 - Sound and enamel active WSL’s Knoop hardness value, volume

percent mineral and standard deviation (sd) for each depth evaluated.

Sound Enamel (N=10) WSL (N=10) Mean Knoop

(sd) Volume %

mineral (sd) Mean Knoop

(sd) Volume %

mineral (sd) 20 μm 295.8 (39.5) 85.1 (5.1) ---------- ---------- 40 μm 307.8 (44.2) 86.6 (5.5) 29.75 (13.5) 34.4 (3.8) 60 μm 321.7 (58.8) 88.1 (7.2) 116.4 (58.8) 54.4 (17.3) 80 μm 324.1 (39.5) 88.6 (4.8) 231.9 (78.8) 75.9 (10.8) 100 μm 332.8 (30.5) 89.7 (3.7) 265.2 (30.5) 80.3 (12.1) 120 μm 345.6 (33.0) 91.2 (3.8) 307.7 (33.2) 86.6 (3.8) 140 μm 352.3 (23.5) 92.0 (2.7) 327.5 (25.4) 89.1 (2.8)

62

Table 2 (APPENDIX A) shows the number of samples with a low Knoop

value (softening) for CSHM test and loss of enamel structure (erosion) in every

depth evaluated.

SEM photographs were made at random from WSL areas on each of the

ten samples. Areas exposed to the demineralizing solution could be

distinguished to the naked eye and in x16 magnification on SEM (figure 1) in all

samples. These images also demonstrated that at smaller magnifications (x16 or

x60) some areas of the active WSL appeared to be relative intact compared to

the sound enamel surrounding it (figure 1).

Figure 1 – Sample tooth number 4 photographed on a stereomicroscope (x7) showing the area exposed to the demineralizing solution (upper right image) and a SEM image with a small magnification (x16) of this sample.

63

A prismatic pattern of surface destruction was observed in all of the

samples in both eroded and/or apparently intact areas (figure 2). This pattern

creates a widening of the prism sheaths. Some surface areas were undertaken

by erosion and exposed underneath perikymata overlapping (figure 2).

Figure 2 – Sample tooth number 4 showing surface erosion with exposed underlying perikymata (x60) on the upper right image. Arrows in the larger image point out the overlapping perikymata (x250). In the same image a prismatic pattern of surface destruction can be noticed.

64

Some times the widened prism sheaths created an “arcade-formed”

structure (arrow in figure 3). All samples showed destruction of prism cores

(figure 3) related to areas with surface erosion.

Figure 3 – Sample tooth number 3 with prismatic pattern of surface destruction (x400) on the larger picture with an “arcade-formed” structure (arrow). The upper right image shows the destruction of prism cores in magnifications (x8,000).

65

Diffusion pathways through intercrystalline and interprismatic spaces can

be detected on a non eroded area with a prismatic pattern of demineralization

from tooth sample number 6 (figure 4).

Figure 4 – Sample tooth number 6 showing a sound enamel surface on the upper right image (x8,000). On the larger image arrows pointing out some of the areas with dissolution of crystallines and interprismatic area on an active WSL in the same sample tooth (x8,000).

66

The SEM image of the internal aspect of the active WSL also shows the

loss of some parts of the superficial enamel (figure 5).

Figure 5 – Cross-sectional view (x120) of sample tooth number 4 showing the internal aspect of the surface erosion delimitated by brackets.

DISCUSSION:

A lactate buffer was used to produce artificial caries lesions in human

enamel specimens17,18 due to the fact that this acid represents 90% or more of

the sucrose and/or glucose fermented by Streptococci.26,27 These are the

67

dominant microorganisms in the early colonization of dental plaque in enamel or

root surfaces28 whether in caries active or inactive individuals.29

The demineralizing solution used in this study was able to create artificial

caries on extracted human molar teeth resembling a natural active WSL in

smooth surface. In order to restrict lactic acid diffusion on the enamel and create

caries-like subsurface lesions a polyacrilic acid was used.17,30,31 A small

concentration of fluoride19 was also employed to help create a surface zone in

the WSL and avoid greater surface erosion.32 Other laboratory works have used

different methods to create WSLs in human or bovine teeth as: gel systems33,34;

demineralizing solutions enriched with calcium and phosphate with fluoride35,36,37

or without it38,39; demineralizing solutions with surface protectors, enriched with

calcium and phosphate with or without fluoride.11,17,18 Methane

hydroxydiphosphonate (MHDP)11 or polyacrylic acid (Carbopol™)17 are the most

used surface protectors substances used for in vitro subsurface caries formation.

MHDP might interact with lactate buffer by competition of calcium sites in the

enamel and polyacrylic acid acted independently.30 Polyacrylic acid is an

excellent surface protector for the enamel and it still enables the organic acids to

diffuse through the surface zone generating a subsurface lesion. This chemical

substance is more easily purchased than MHDP.31

The mean depth of artificial active WSL obtained in this in vitro study was

100 μm (80.3 e dp = 12.1). This is not a very deep lesion but it could be detected

by the naked eye and with a humid surface because of the added effect of

eroded surface and the subsurface lesion. A in vitro study performed by Margolis

68

et al.32 also employed a lactate solution (0.1 M) partially saturated with respect

to enamel mineral with a 4.3 pH and low levels of fluoride. This solution did not

have a surface protector agent as the one used in the present study therefore

they found cavitations on SEM images at the surface enamel after 72 hours with

0.004 and 0.009 ppm F demineralizing solutions. Other solutions containing

0.024, 0.054 and 0.154 ppm F formed an apparently intact enamel surface in the

same time interval. Visually the enamel surface appeared whitish although in

SEM photographs with a x500 magnification there was no difference between the

affected area and sound enamel.

If a WSL is detected after air drying it is probably limited to a discrete

dissolution of the enamel surface and to a subsurface demineralization in the

outer enamel. Whenever a WSL is visible on a wet tooth surface it has been

penetrated more into the enamel surface.1,16 The whitish, without luster and

rough surface feature on the surface of the artificial WSL denotes an advanced

stage of the lesion and it is called active WSL.7,8,9,10,16,40 That is why Ekstrand2

suggests that clinical trials record these differences in WSL by using visual

criteria to asses the depth and the activity of occlusal caries.

Even at small magnification as x16 (figure 1) artificial WSLs induced in this

experiment demonstrated two types of enamel surface involvement: areas of

erosion and other areas apparently intact, when compared to the sound enamel

surrounding it. These two distinct sites of the WSL also presented different levels

of enamel dissolution. An initial dissolution pattern was detected in areas with

apparently intact enamel where anatomical features were more pronounced such

69

as perikymata overlappings and deepened Tomes´ process pits. According to

Holmen et al.7 these accentuations of developmental features characterizes an

initial stage of enamel dissolution due to the carious process.

A prismatic pattern of demineralization, with an enlargement of the prism

sheaths, was detected on some parts of the active WSL. It was present either on

apparently intact or eroded areas in every sample (figure 2 and 3). This finding

corroborates to what Haikel et al.5, Holmen et al.7, and Frank15 saw on natural

active WSLs. Some authors5,15 consider that