Lignina

Ciência Rural, Santa Maria, v.31, n.5, p.917-928, 2001ISSN 0103-8478

Recebido para publicação em 26.11.99 Aprovado em 13.12.00

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LIGNINAS – MÉTODOS DE OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA

LIGNINS – ISOLATION METHODS AND CHEMICAL CHARACTERIZATION

Eloísa de Oliveira Simões Saliba1 Norberto Mário Rodriguez1 Sérgio Antônio Lemos de Morais2

Dorila Piló-Veloso3

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1Departamento de Zootecnia, Escola de Veterinária da Universidade Federal Minas Gerais (UFMG), CP 567, 30161-970, BeloHorizonte, MG. E-mail: [email protected]. Autor para correspondência.

2Departamento de Química, Universidade Federal de Uberlândia.3Departamento de Química, ICEx, UFMG.

RESUMO

Esta revisão apresenta uma pequena história sobreos estudos de ligninas. São apresentados também vários métodosde isolamento e quantificação de grupos funcionais de ligninaspor métodos químicos e físicos.

Palavras-chave: ligninas, isolamento de ligninas, caracterizaçãode ligninas.

SUMMARY

This review presents a short history of the study ofthe lignins. There are also various methods for isolation andquantification of functional groups in lignins by chemical andphysical methods being presented.

Key words: lignins, lignins isolation, lignins characterization.

INTRODUÇÃO

A palavra lignina vem do latim lignum,que significa madeira. Trata-se de um dos principaiscomponentes dos tecidos de gimnospermas eangiospermas, ocorrendo em vegetais e tecidosvasculares. Sabe-se que a lignina tem um importantepapel no transporte de água, nutrientes emetabólitos, sendo responsável pela resistênciamecânica de vegetais, além de proteger os tecidoscontra o ataque de microorganismos. Vegetaisprimitivos como fungos, algas e liquens não sãolignificados (FENGEL & WEGENER, 1984).

Em estudos realizados háaproximadamente 150 anos, foi possível verificar ointeresse científico e econômico sobre a lignina,concluindo-se que a lignina é uma substânciaamorfa, de natureza aromática e muito complexa, efaz parte da parede celular e da lamela média dosvegetais.

Apesar de todos os estudos realizados atéhoje sobre lignina, muitos pontos, relativosprincipalmente à sua estrutura, permanecem emdúvida. Isto decorre da grande diversidade daestrutura das ligninas quando se passa de umaespécie vegetal para outra ou, até mesmo, dentro damesma espécie, quando são analisadas partesdiferentes do vegetal. Pode-se observar emeucaliptos cultivados na Europa ou no Brasildiferenças na constituição de suas ligninas, devidas,principalmente, às diferentes condições de solo e declima. A lignina é um polímero de constituiçãodifícil de ser estabelecida, por causa não somente dacomplexidade de sua formação, baseada emunidades fenilpropanóides interligadas por diferentestipos de ligações, como também porque sofremodificações estruturais durante seu isolamento dasparedes celulares (MORAIS 1987, 1992).

Devido a abundância de resíduos decultura disponíveis e a natureza recalcitrante dalignina, que de alguma maneira inibe oaproveitamento dos carboidratos estruturais peloanimal, este trabalho tem como objetivo apresentar

Saliba et al.

Ciência Rural, v. 31, n. 5, 2001.

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uma revisão geral sobre os principais aspectosrelativos ao estudo de ligninas

2. LIGNINAS

2.1 DefiniçãoCabem aqui outras definições encontradas

na literatura, além da definição puramente química.Lignina é um polímero derivado de unidadesfenilpropanóides denominadas C6C3 ou,simplesmente, unidades C9, repetidas de formairregular, que têm sua origem na polimerizaçãodesidrogenativa do álcool coniferílico. A ligninadeve ser definida claramente de acordo com otrabalho em questão, devido à grande diversidade demaneiras de tratamento para seu isolamento.LAPIERRE (1993) classificou a lignina em core enão core, com base em sua susceptibilidade relativaà hidrólise.- Lignina não core: consiste de compostos fenólicosde baixo peso molecular, liberados da parede celularpor hidrólise, que é representada por ácidos p-hidroxicinâmico éster-ligados.- Lignina core: consiste de polímeros fenilpropanói-des da parede celular, altamente condensados emuito resistentes à degradação. Eles são compostosde unidades p-hidroxifenila (H), guaiacila (G) esiringila (S), em proporções diferentes, de acordocom sua origem.

SARKANEM & LUDWIG (1971)observaram que a quantidade relativa da fraçãomolar de aldeídos produzidos pela reação deoxidação com nitrobenzeno é um indicador daabundância relativa das unidades C9 (H, G e S).Assim, numa classificação inicial de ligninassegundo a presença dessas unidades, tem-se que:ligninas de madeiras duras, ou angiospermas, sãoformadas principalmente de unidades G e S; ligninasde madeiras moles, ou gimnospermas, são formadasfundamentalmente de unidades G; ligninas degramíneas compreendem G-S-H. Porém, existemligninas de certas espécies de gimnospermas e degramíneas que apresentam abundância de G e S(CHEN, 1991).

Ligninas de plantas herbáceas são do tipoS-G, sendo mais parecidas com a ligninas deangiospermas que de gimnospermas (SARKANEN& LUDWIG, 1971). Portanto, em uma conceituaçãomais precisa, as ligninas são classificadas nosseguintes grupos: Tipo G; Tipo G-S; e Tipo H-G-S(CHen, 1991; PILÓ-VELOSO et al., 1993). Emestudos realizados por SALIBA et al. em 1999a,pode se verificar que a lignina da folha do milho édo tipo H-G-S.

Em plantas herbáceas, a lignina não podeser definida apenas como proveniente de derivadosácidos fenólicos. Deve-se trabalhar com as definiçõescore e não core para descrever o material residual eos componentes ácidos hidrocinâmicos liberadosdurante a hidrólise, respectivamente. Assim, essasdefinições, segundo RALPH & HELM (1993), sãoconvenientes para investigações dentro do aspectonutricional das forragens, bem como para comparar acomposição das plantas, pois esta terminologiadiscute aspectos moleculares da estrutura da lignina.Portanto, somente derivados do ácido hidrocinâmico,que estão covalentemente ligados aos polímeros daparede celular, são liberados durante a hidrólise,constituindo a chamada lignina não core.Conseqüentemente, derivados de ácidoshidrocinâmicos que compõem a lignina através deligações inter-resistentes a hidrólise, pela definição,constituem as ligninas core.

2.2 NomenclaturaO sistema mais comum de nomenclatura

na química da lignina é o que se fundamenta naunidade básica fenilpropanóide, C6C3, designando oscarbonos da cadeia alifática, C3, como α, no caso docarbono benzílico, e β e γ, seqüencialmente, para osdemais átomos. O anel aromático é numerado,iniciando-se a contagem pelo carbono ligado àcadeia alifática1, C3.

O anel aromático é denominado, deacordo com seus substituintes ,como:Guaiacila (G) → R1 = OH, R2 = H e R3 = OCH3

Siringila (S) → R1 = OH e R2 = R3 = OCH3 ep - Hidroxifenila (H) → R1 = OH e R2 = R3 = H

Ligninas – Métodos de obtenção e caracterização química.


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As ligações entre os monômeros paraformar dilignóis e trilignóis podem ser identificadasbaseando-se na numeração dos monômeros,utilizando-se para distingui-los números marcados.Como exemplo, o dilignol abaixo apresenta ligaçõesβ-5' e α-0-4′

As primeiras tentativas de proposição deuma estrutura para a lignina foram feitas porFREUDENBERG & NEISH (1968), combinando

resultados da reação de polimerizaçãodesidrogenativa do álcool coniferílico com dadosanalíticos obtidos até então.

GLASSER & GLASSER (1981) tambémpropuseram um esquema e estrutura para a ligninade madeiras moles. Para tal, foram necessáriasanálises elementares, determinação de açúcares ecinzas, determinação de grupos funcionais porespectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear(RMN) de 1H e reação de oxidação compermanganato seguida da análise dos produtosformados por cromatografia gasosa ligada àespectrometria de massa (CGMS) e porcromatografia de permeação em gel (CPG). Osresultados dessas análises, associados aos dados daliteratura e à simulação por computador dos modospossíveis de acoplamento dos radicais dos derivadosdo álcool cinamílico, possibilitaram a formulação deum esquema para a estrutura dessas ligninas.

Foi publicado por NIMZ (1974) umesquema estrutural para a lignina da faia (Fagussilvatica), incluindo dados obtidos por RMN de 13C.PILÓ-VELOSO et al. (1993) propuseram umesquema estrutural para a lignina da madeira moídade Eucalyptus grandis, apresentado a seguir, a partirdos estudos de seus grupos funcionais e análiseelementar.

Saliba et al.


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2.3 MÉTODOS DE OBTENÇÃO

A avaliação da lignina core in situ énormalmente feita através do extrato livre de paredecelular, o qual pode ser obtido após extração préviacom solventes orgânicos para eliminar os componentessolúveis. Isto é importante para minimizar osproblemas de interferência entre a lignina core e outrosfenólicos solúveis (MORAIS et al. 1991).

A preparação da lignina livre decontaminantes pode ser obtida por vigorosotratamento, o qual modifica a estrutura da lignina(SARKANEN & LUDWIG, 1971). A maisfreqüente fração de lignina solúvel usada paraestudos analíticos é a preparada de amostras moídas(Björkman 1954, apud LAPIERRE 1993;SARKANEN & LUDWIG, 1971). SALIBA et al.(1998) verificaram que a lignina moída e isoladacom solventes orgânicos é a ideal para estudos decaracterização, pois sofre poucas modificações.

2.3.1 HidróliseA lignina de hidrólise é obtida durante a

hidrólise da madeira a uma temperatura de 180-190ºC, sob pressão de 12-14atm, e com solução deH2SO4 de 0,5 a 1,0%. Devido às condições deextração, ocorre uma transformação da matéria-prima vegetal, na qual os polissacarídeos sãoconvertidos a monossacarídeos (pentoses e hexoses),restando um produto insolúvel (rendimento de 25 -40%) denominado lignina técnica bruta (LTB).

2.3.2 IsolamentoO isolamento de lignina envolve o

preparo de amostras livres de extrativos. A técnicaempregada não deve causar alterações de naturezaquímica, ocasionando mudanças estruturais, em quea lignina resultante difere da original presente novegetal, chamada protolignina.São três os processos básicos de isolamento(FENGEL & WEGENER, 1984):- como resíduo;- como derivado;- como extrativo;a) como resíduo - É o método de Klason, no qualpela hidrólise ácida, os polissacarídeos sãoremovidos e a lignina é liberada como resíduo.b) como derivado - neste método, o vegetal, aoser tratado com determinados reagentes, formaprodutos solúveis que serão separados.b)1. Processo organossolve - Envolve reação comum álcool (metanol, isobutanol, ciclo hexanol ouálcool benzílico) e ácido acético. Os álcooiscombinam com a lignina na presença de ácidosminerais formando a lignina alcoólica, solúvel, comrendimento de 30%.b)2. Processo do ácido tioglicólico - Este ácidoreage com a lignina na presença de HCl diluídoformando o ácido ligno-tioglicólico. O componente

principal da lignina que participa desta reação é oálcool benzílico (reação de substituiçãonucleofílica).b)3. Derivado da indústria de celulose - Daindústria de papel são obtidos dois tipos de ligninacomo subprodutos. a lignina sulfítica e a Kraft(sulfática). A lignina sulfítica é obtida pelotratamento da madeira com hidróxido de sódio esulfito de sódio; a sulfática é produzida pelareação da madeira com sulfeto de sódio em meiobásico.c) como extrativo - A lignina é obtida pelaextração com solventes orgânicos a partir do vegetalfinamente moído. Como mencionado anteriormente,a lignina obtida por este método assemelha-se maiscom a protolignina. Os principais tipos de ligninasobtidas por extração são:- lignina nativa, ou de Brauns;- lignina liberada enzimaticamente;- lignina de madeira moída (LAI & SARKANEN,1971).c)1. Lignina nativa (LN), ou de Brauns (LB) - Noprocedimento original, a madeira do vegetal erafinamente moída e a extração inicial era feita cométer, seguindo-se uma extração com água fria e,após, com etanol 95%. Neste último extrato, alignina era precipitada pela adição de H2O. Apurificação final consistia na dissolução doprecipitado em dioxano e na reprecipitação poradição de éter etílico. O rendimento dessa lignina émuito baixo, representando de 2 a 4% da ligninatotal presente na madeira.c)2. Lignina liberada enzimaticamente - Empartículas do vegetal com dimensões de 60 mesh,faz-se a extração com éter e água. Posteriormente,o material pré-extraído é submetido a uma culturade determinados tipos de fungos por um períodode 13 a 15 meses. Os fungos atacam somente ospolissacarídeos, propiciando uma hidróliseenzimática e liberando a lignina intacta. A ligninaé, então, extraída do meio com etanol 95% epurificada, como no caso da lignina nativa, tendo-se um rendimento de 20% do teor da lignina totalda madeira.c)3. Lignina de madeira moída (LMM) - Esta é umadas mais estudadas para a análise estrutural, pois alignina não sofre grandes transformações químicas,representando, assim, a composição média dalignina do vegetal. Sua obtenção é feita a partir dovegetal livre de extratos finamente triturado emmoinho de bolas por dois ou três dias. Faz-se, então,a extração desse pó com mistura dioxano-água (9:1)ou acetona: água (9:1), que resulta em soluçãocontendo a LMM. Após remoção do solvente, oextrato é purificado pela solubilização em ácidoacético e precipitado por adição de água. Essalignina pode ainda ser purificada por solubilizaçãoem NaOH 0,1 N e por precipitação por adição deHCl 0,3 N. Por este método, é possível extrair até



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cerca de 50% da lignina total do vegetal (FENGEL& WEGENER, 1984).

3 CARACTERIZAÇÃO DE LIGNINAS

A estrutura das ligninas deve serdeterminada a partir de uma amostra pura, ou seja,livre de carboidratos e outros extrativos. Éimportante também definir a escolha doprocedimento de extração para que a ligninaresultante tenha propriedades físicas e químicassemelhantes à protolignina in situ original,presente no vegetal. A seguir, determina-se opercentual de grupos metoxílicos e outros gruposfuncionais, por métodos químicos eespectroscópicos no infravermelho (IV), deressonância magnética nuclear (RMN de 1H e13C). Faz-se também o estudo de reações dedegradação e oxidação com permanganato depotássio e nitrobenzeno, assim como dedegradação por pirólise. Os produtos dadegradação e oxidação são, então, analisados porcromatografia gasosa acoplada à espectrometriade massa. Emprega-se ainda cromatografia depermeação em gel, para determinar a distribuiçãodos pesos moleculares de fragmentos quecompõem a lignina (NASCIMENTO et al., 1992).

3.1 ESTUDO DE LIGNINAS NOINFRAVERMELHO (IV)

A chamada radiação IV corresponde àregião do espectro eletromagnético situada entre aregião do visível e a das microondas. A porção demaior utilidade para o estudo de moléculas orgânicassitua-se entre 4000 e 400cm-1.. O espectro no IV écaracterístico da substância como um todo, mascertas ligações de grupos de átomos dão origem abandas que ocorrem mais ou menos na mesmafreqüência, independentemente da estrutura damolécula. É justamente a presença dessas bandascaracterísticas de ligações de determinados gruposque permite a obtenção, mediante simples exame doespectro e consulta a tabelas, de informaçõesestruturais úteis (SILVERSTEIN et al., 1979).

A espectroscopia no infravermelho émuito utilizada para a caracterização dosconstituintes da cadeia polimérica, pois, permitedeterminar os tipos de ligações e grupos funcionais.A região de interesse no espectro IV de ligninas étambém a mais comum para substâncias orgânicasem geral, compreendida entre 4000 e 700cm-1 (2,5 a14,3µm). A literatura também mostra trabalhosfeitos no IV próximo, entre 7000 - 4000cm-1 (1,42 -2,5µm). (SARKANEN & LUDIWIG, 1971). Acaracterização de picos de absorção no IV se fazprincipalmente de modo qualitativo, por comparaçãocom dados tabelados. Entretanto, alguns estudos têmsido desenvolvidos a fim de avaliar

quantitativamente alguns picos de absorçãoobservados (TAI et al., 1990; MORAIS et al., 1994;SALIBA et al., 1998).

Devido ao fato de ser a da lignina materialamorfo e constituído de monômeros de estruturaquímica de grande complexidade, de distribuiçãovariável no polímero ou, mesmo formada dediferentes frações de macromolécula, não é possívelaplicar a teoria de grupo para a interpretação de seusespectros IV (MORAIS, 1987). Na metodologia deinterpretação de espectros IV de ligninas, sãoempregados compostos-modelo que podem serusados como padrões ou então para relacionaralguns picos de absorção. Assim, atribuições dospicos de absorção IV de ligninas não são feitasapenas a partir de um simples espectro mas, sim,estudando comparativamente também os espectrosIV de alguns de seus derivados e de compostos-modelo (TAI et al., 1990). Esses derivados sãoobtidos por reações de metilação, acetilação eredução com borohidreto de sódio e hidreto de lítio ealumínio.

Na tabela 1, são mostrados os principaispicos de absorção característicos no IV para ligninasde madeira dura, que são do tipo guaiacila-siringila,ligninas de madeiras moles, que são do tipoguaiacila (G); e gramíneas, que são do tipoguaiacila-siringila-p-hidroxifenila (G-S-H).

Tabela 1 - Principais atribuições dos picos de absorção no IV deligninas.

COMPRIMENTO DE ONDA (CM-1)

Madeira Madeira Gramínea AtribuiçãoMole (G) Dura (G-S) (G-S-H)

3400 3400 3400 Grupos hidroxílico3000 3000 3000 C-H aromático2936 2936 2936 C-H alifático2850 2850 2850 C-H alifático

1720-1700 1720-1690 C = Onão conjugada

1675-1660 1660-1650 C = OConjugada

1656 C = O Cetonas conjugadasp-substituídas

1673 Ácido p-cumárico1470-1460 1470-1460 1470-1460 C-H de grupos metílicos1430-1415 1430-1415 C-C de anéis aromáticos

C-H de grupos metílicos1270 1275 1265 C-O de anéis guaiacílicos

1240-1230 C-O de anéis siringílicosC-O de anéis guaiacílicosC-O de fenóis

1235 Unidades sinapila ep-cumarila

1140 1085 C-O de álcoois secundários865-815 915-815 870 C-H aromáticos

Tabela adaptada de:- SARKANEN & LUDWIG (1971) H = P - hidroxifenila- JUNG & HIMMELSBACH (1989) G = Guaiacila- MORAIS (1992) S = siringila

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3.2 ESTUDO DE LIGNINAS PORRESSONÂNCIA MAGNÉTICANUCLEAR (RMN):

Os maiores comprimentos deonda da radiação eletromagnética estãoenvolvidos no chamado espectro deRMN. As amostras são submetidas acampos magnéticos fortes e irradiadaspor radiofreqüências cujos valoresdependem do nucleo do átomoestudado. O estudo do espectro RMNdá uma idéia das vizinhanças e dosarranjos relativos desses componentes.

A espectroscopia de RMNtem sido grandemente utilizada emmuitos estudos de análise estrutural de ligninas(HIMMELSBACH & BARTON II, 1980;HIMMELSBACH et al., 1983; BARTON II, 1988;JUNG & HIMMELSBACH, 1989; SALIBA, 1998).

ANÁLISE DE LIGNINAS POR RMN DE 1H

As ligninas são substâncias de alto pesomolecular (PM). Portanto, assim como os polímeros,são problemáticas para a análise por RMN. Formamsoluções viscosas, nas quais as moléculas possuempouca mobilidade, não permitindo a obtenção de umbom sinal. Seus espectros apresentam bandasbastante largas e de difícil identificação, podendoconter em suas constituições hidrogênios blindadospor determinados grupos químicos. A RMN de 1Haplicada ao estudo de ligninas tem sua principalvantagem na possibilidade do cálculo, a partir doespectro, do número total de hidrogênios ligados acadeias alifáticas e aos núcleos aromáticos. Pode-se,ainda, obter uma estimativa do número dehidrogênios hidroxílicos alifáticos e aromáticos,assim como do número de hidrogênios metoxílicos(PILÓ-VELOSO et al., 1991; CHEN & ROBERT,1988). Devido à dificuldade de solubilização deligninas nos solventes usualmente empregados paraa obtenção de espectros de RMN de 1H, procede-se àsua acetilação. Uma vez acetilada a lignina, oderivado obtido torna-se totalmente solúvel nossolventes orgânicos (MORAIS, 1992). Emespectrômetros que operaram em altas freqüências(270-400 MHZ), podem-se observar segmentos deestruturas presentes em pequenas proporções e,portanto, os sinais de hidrogênios de gruposaldeídicos e de estruturas formadas por ligaçõescomuns em ligninas do tipo β-5, β-β, β-4, etc.

A tabela 2 mostra as oito regiõesprincipais do espectro de RMN de 1H de ligninas.

3.2.2 ANÁLISE DE LIGNINAS POR RMN DE13C

Nimz (1976) apud MORAIS, 1992, emestudos de lignina de madeira moída (LMM) da Faia(Fagus silvatica), introduziu a RMN de 13C paraauxiliar na caracterização de ligninas. Como naRMN de 1H, para um estudo da atribuição dosdeslocamentos químicos em unidades δ, relativosaos sinais de 13C da molécula, foi necessário o usode compostos-modelo, os quais possibilitamcaracterizar os vários tipos de ligações encontradasna estrutura das ligninas. Esta metodologia tem sidode grande emprego na caracterização de ligninas porRMN (FERREIRA et al., 1993 e 1995; PILÓ-VELOSO et al., 1993; DRUMOND, 1992, ALVES,1995; SALIBA, 1998).

Na tabela 3, estão relacionados os valoresde deslocamentos químicos 13C em δ e suasrespectivas atribuições para ligninas.

Na figura 1, apresentam-se os compostos-modelo, juntamente com a proposta estrutural para alignina da Faia, onde são representados carbonosque possibilitam as atribuições da tabela 1.4. Mante-ve-se a numeração estabelecida pelos autores paraunidades estruturais e compostos-modelo.

3.3 ESTUDO DE GRUPOS FUNCIONAIS E DEFÓRMULAS MÍNIMAS

Os grupos funcionais presentes na ma-cromolécula da lignina que sobressaem são: hidro-xílicos alifáticos e aromáticos, éteres, carbonilas emetoxilas, além de unidades dos tipos siringila,guaiacila e p-hidroxifenila. Para o estudo de cada umdesses grupos funcionais e unidades, envolve-se acombinação de métodos químicos e espectroscópi-cos. Como a lignina, por definição, é um polímerocomposto de unidades do tipo fenilpropanóides (C9),

Tabela 2 - Atribuição dos sinais de hidrogênio em oito regiões do espectro de RMN de1H de ligninas.

Região δ Tipo de hidrogênio responsável pelo sinal

1 8,00 - 11,50 Carboxílico e aldeídico2 6,28 - 8,00 Aromáticos e vinílicos3 5,74 - 6,28 β-vinílico e benzílicos4 5,18 - 5,74 Benzílico5 2,50 - 5,18 Metoxílicos e muitos outros hidrogênios ligados à cadeia C3,

que podem ser α,β e γ6 2,10 - 2,50 Acetoxílicos aromáticos7 1,58 - 2,10 Acetoxílicos difáticos e acetocílicos aromáticos orto à ligação

bifenílica8 0,38 - 1,53 Alifáticos altamente blindados

Fonte: MORAIS (1992)



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determina-se a sua fórmula mínima tomando comobase tais unidades (FENGEL & WEGENER, 1984). Énecessário o conhecimento da porcentagem de C, H, Oe de grupos metoxila (OCH3) presentes na lignina parase ter a fórmula mínima em termos dessas unidadesfenilpropanóides (PILÓ-VELOSO et al., 1991).

3.3.1 DETERMINAÇÃO DE GRUPOSMETOXÍLICOS

As ligninas são formadas a partir de três precursoresbásicos, que são os álcoois p-cumarílico, coniferílicoe sinapílico.

Tabela 3 - Lista de atribuições dos sinais de RMN de 13C para ligninas.

DESLOCAMENTOS (δ) ATRIBUIÇÕES

195,2 C-α- em 1, 5', 10, 16, 25; C-γ em 15192,7 C-α em vanilina174,4 -COOH alifático em 26, 27, 28172,6 -COOH alifático em 29, 30171,8 O-C=O em ésteres alifáticos em 13 e 20162,0 C4 em 10'; C5 em 25154,5 C3 e C5 em 2,3, 5, 5', 9', 11, 12, 19, 21, 22, 24; C4 em 16,; C-α em 15152,9 C4 em 6', 18150,6 C4 em 4, 8, 13, 14, 20, 24; C3 em 1, 16148,5 C3 em 4, 6', 7, 8, 9, 13, 14, 18, 20, 23, 24, C3 e C5 em 6,17; C4 em 9146,6 C3 em 7, 15, 23, 25'144,8 C3 em 25, 25'; C4 em 5'138,7 C4 em 2, 3, 5, 11, 12, 9', 21, 22, 24, C1 em 2, 11, 21, 24', 25'; C3 em 15; C6 em 25'136,0 C1 em 4, 9, 13, 14, 20, 24; C4 em 6, 7133,6 C1 em 3, 5, 6, 7, 9, 12 ,17, 19, 23132,7 C1 em 1, 6', 8, 10, 10', 18; C-β em 15, 8; C2 em 10, C-α em 18130,2 C1 em 15, 16, 15', C-α em 6'129,0 C5 em 9; C2 e C6 em 10'; C6 em 10126,7 C6 em 1, 16; C1 em 25120,1 C6 em 4, 7, 13, 14, 20, 23, 24117,5 C6 em 15115,6 C5 em 7, 23; C2 em 8; C3 e C5 em 10'113,8 C5 em 8, 6'; C2 em 1112,0 C2 em 6', 7, 9, 18, 23, 25'107,1 C2 e C6 em 3, 5', 12, 24'; C6 e, 25105,1 C2 em C6 em 2, 5, 6, 9', 11, 17, 19, 21, 2288,1 Cα em 14, 2486,8 Cβ em 4, 9, 13, 17, 20, 23; Cα em 6, 21, 22, 2581,0 Cβ em 1, 5', 10, 16, 2575,0 Cα em 2, 7, 1173,3 Cα em 4, 9, 13, 17, 20, 23; Cγ em 6, 9', 10', 21, 2263,8 Cγ em 1, 5', 6', 10, 16, 18, 25; Cβ em 2, 7, 1161,3 Cα em 4, 9, 13, 17, 20, 2356,3 OCH3; Cα em 24'54,5 Cβ em 6, 21, 22, 25'54,0 Cβ em 14, 24, 24'46,8 Cβ em 9', 10'34,5 Cα - (em G-CH2-CH2-COOH) em 3231,5 Cβ- (em G-CH2-CH2-COOH) em 3228,6 -CH2 (em C5-CH2-C5) em 3326,5 -CH2- ou -CH3

24,6 -CH2- ou -CH3

20,5 -CH3 ou CH3-C=017,8 Cγ em 3413,6 Cγ'em 34

Adaptada de MORAIS, 1987

Saliba et al.


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Figura 1 - Fragmentos de esquema estrutural de lignina e compostos-modelo utilizados para atribuições dos sinais de RMN de 13C, natabela 3.



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As razões molares entre esses trêsconstituintes dependem do tipo de vegetal. Ocomposto (1) não possui metoxila, o (2) e o (3)possuem, respectivamente, 1 e 2 grupos por mol. Ogrupo metoxílico é considerado um grupo funcionalcaracterístico de ligninas e seus derivados, sendo degrande importância a determinação do seu conteúdona análise da macromolécula (Sarkanen & Fengel,1984 apud FENGEL & WEGENER, 1984;MORAIS, 1992).

A presença marcante dos gruposmetoxílicos na maioria das unidadesfenilpropanóides da lignina leva a que sejamexpressos como parte integrante da fórmula mínimade ligninas, a qual é baseada na unidadefenilpropanóide. A porcentagem de metoxilas emmadeiras moles varia de 12 a 16% e nas madeirasduras de 18 a 22%. Segundo SALIBA et al. (2000),a porcentagem de metoxila para a lignina da palhade milho é 6,67 e 1,79% para a da palha de soja.

Zeisel (1985) apud PILÓ-VELOSO et al.(1993) desenvolveu um dos primeiros métodos paraa determinação de grupos metoxílicos. Por outrolado, Viebock e colaboradores desenvolveram umatécnica para a determinação de metoxilas, a qualpode ser utilizada para amostras com enxofre.

Segundo NASCIMENTO (1989), ossinais devidos a grupos metoxila são claramenteobservados na região do espectro RMN de 1Hcompreendida entre δ = 3,5 - 4,0. Através da curvade integração desses sinais, as metoxilas podem seravaliadas semiquantitativamente. A presença degrupos metoxila em ligninas pode também seravaliada por RMN de 13C. Esses grupos apresentamsinais de ressonância do 13C situados na regiãocompreendida entre δ = 55 a 57.

3.3.2 METODOLOGIA USUAL PARA OESTUDO DA FÓRMULA MÍNIMA DELIGNINAS

Freudemberg & Neih (1968)desenvolveram uma série de cálculos que permitemo estudo de fórmulas mínimas de ligninas. Os gruposmetoxila são expressos como uma unidade separadados demais átomos de C, H e O da molécula. Poresta razão, subtrai-se o conteúdo de C, H e Ocorrespondente à metoxila do total encontrado paraesses átomos.

Denominam-se Cp, Hp e Op asporcentagens individuais dos elementos contidos nametoxila. O conteúdo total na macromolécula desseselementos é expresso por %C, %H e %O, asporcentagens resultantes são dadas pelas relações:

%C' = %C - Cp

%H '= %H - Hp

%O' = %O - Op

Se essas relações são expressas emnúmeros relativos, resultantes da divisão pelasrespectivas massas (M), tem-se a fórmula mínimarepresentada por:

Cx Hy Oz (OCH3)d

Se a fórmula mínima para a lignina forconsiderada como função de sua unidade básica C6

C3, ou C9, pode ser escrita:

(Cx Hy Oz (OCH3)d)n onde X . n = 9.

que, reescrita em termos de unidades C9, resulta em:

C9 Hy 9 O 9 (OCH3)d 9 x x x

Substituindo x, y, z e d na equação acima, tem-se:

HIDROGÊNIO:

276,60 (% H) - 27,00 (% OCH3)H = _________________________________________

2,584 (% C) - % OCH3

OXIGÊNIO:

17,46 (% O) - 9 (% OCH3)O = ________________________________

2,584 (% C) - % OCH3

METOXILA :

9 (% OCH3)OCH3 = ____________________________

2,584 (%C)-% OCH3

A partir das porcentagens de C, H e O,determinadas pela análise elementar, é possível

Saliba et al.


926

determinar a fórmula mínima para a lignina, basea-da em unidades C9.

3.3.3 DETERMINAÇÃO DE HIDROXILASTOTAIS

As hidroxilas são o segundo grupofuncional mais estudado em ligninas, que podemestar presentes tanto como hidroxilas fenólicasquanto como hidroxilas alifáticas (MORAIS, 1987).

A técnica de titulação condutivimétrica ébastante conveniente para a determinação daconcentração de hidroxilas em ligninas, por ser deutilização fácil e rápida (Sarkanen & Schuerch,1955) apud PILÓ-VELOSO et al., 1993. A reaçãoenvolvida nesta titulação constitui-se em umareação de neutralização de carboxilas e de fenóiscom hidróxido de lítio. O ponto de equivalência édeterminado facilmente (MORAIS, 1987).

3.3.4 DETERMINAÇÃO DE CARBONILASEM LIGNINAS

Este grupo funcional está presente emtodos os tipos de ligninas, podendo serdeterminado por várias técnicas:

- redução com boroidreto de sódio em meioalcalino, estimando-se o consumo de boroidretode sódio durante a reação;

- estudo da absorção no IV de compostos-modelo;- hidrogenação;- reação de oximação.

Na figura 2, constam as principaissubestruturas que contêm carbonilas, presentes emligninas.

3.3.5 ESTUDOS QUÍMICOS DEDEGRADAÇÃO DE LIGNINAS POROXIDAÇÃO COM NITROBENZENO

ADLER (1977), em revisão, cita que aoxidação de ligninas com nitrobenzeno foiintroduzida por Freudemberg e colaboradores em1939. Segundo a literatura, a oxidação de madeirasmoles produz como produto principal a vanilina (4).A oxidação de madeiras duras tem como produtos avanilina e o siringaldeído (5). No caso dasgramíneas, além desses dois aldeídos, é produzido op-hidroxibenzaldeído (6).

Além dos aldeídos, a oxidação comnitrobenzeno dá origem também, em quantidadesmuito inferiores, aos respectivos ácidos:

A relação molar dos aldeídos e ácidosproduzidos depende da natureza, espécie econstituição da macromolécula da lignina.

Em estudos feitos por Lapierre et al.(1987) apud MORAIS (1992), foi verificado quenesta reação, sob catálise básica, ocorre inicialmente orompimento das ligações alquil-arila, formando osíons fenolatos e, na seqüência, acontece a quebra dasligações C α C β, dando origem a aldeídos.Entretanto, o mecanismo dessa reação não é bementendido. Uma informação importante que se podetirar dessa oxidação refere-se ao teor total de aldeídose ácidos formados. Verificado por SALIBA et al.(1999b) os aldeídos obtidos através da oxidação comnitrobenzeno, interferem diferentemente na digestãodos carboidratos das plantas nos animais.

A análise de grupos funcionais tais comometoxilas, hidroxilas e carbonilas e a determinaçãode grupos siringila, guaiacila e p-hidroxifenila,presentes na estrutura da macromolécula, sãofundamentais para um conhecimento aprofundado danatureza de uma lignina. A partir desseconhecimento, pode-se interferir quimicamente, senecessário, em seus grupos funcionais, a fim de seobtere derivados que possam ser utilizados emdiferentes aplicações (MORAIS, 1992).

Figura 2 – Principais subestruturas que contêm carbonila, presentes emlignina.



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Parte dos objetivos deste trabalho foicaracterizar quimicamente as ligninas dos resíduosagrícolas de milho (RM) e de soja (RS) e verificarcomo as mesmas afetam a digestibilidade doscarboidratos estruturais.

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