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11.. IINNTTRROODDUUÇÇÃÃOO

1.1 - Hematopoese

A hematopoese é o processo responsável pela formação do sangue

(Hoffbrand & Pettit, 1993). Nela, as células-tronco hematopoéticas dão

origem a elas mesmas e a células progenitoras mielóides e linfóides. Estas

darão origem a linhagens específicas, respondendo a fatores de transcrição

e de crescimento e estimulação de colônias (Gordon, 1993) (figura 1). As

linhagens mielóides e linfóide B se diferenciam na medula óssea sendo

lançadas na corrente sangüínea, enquanto os linfócitos T se diferenciam no

timo. Tanto linfócitos B como T adquirem maturidade funcional em órgãos

linfáticos secundários, como o baço e os linfonodos (Alberts e col., 1994).

As células-tronco hematopoéticas (CTH) pluripotentes apresentam o

fenótipo CD34+CD38- e representam uma minoria da população de células

hematopoéticas (1 em 105 células da medula óssea). Essas células são

capazes de reconstituir o sistema hematopoético completo e apresentam

divisões assimétricas (Mayani e col., 1993). Nestas ocorre a produção de

uma célula progenitora filha diferenciada e outra célula-mãe pluripotente

(Morrison e col., 1997).

As divisões das células-tronco hematopoéticas são controladas pelas

condições oferecidas por um microambiente constituído principalmente por

células do estroma da medula óssea. Este processo de proliferação e

diferenciação celular na hematopoese requer uma complexa rede de

comunicação celular, na qual fazem parte fatores de crescimento

2

específicos, presentes no microambiente medular (os quais através de

agentes transdutores de sinal são capazes de induzir a atividade gênica

diferencial), bem como de interações eficientes entre as células do estroma

e as hematopoéticas e dessas com outras células hematopoéticas.

Figura 1: esquema adaptado de hematopoese (© 2001 Terese Winslow, Lydia Kibiuk)

O desenvolvimento hematopoético ordenado depende não somente

da interação de progenitores hematopoéticos primitivos com componentes

celulares e extracelulares específicos do microambiente da medula óssea,

mas também do tráfego de progenitores hematopoéticos menos primitivos

para sítios específicos de diferenciação dentro da medula óssea, onde

fatores de crescimento hematopoéticos desempenham importantes funções.

A medula óssea é composta de células do estroma e de uma rede

microvascular, constituindo um meio adequado para crescimento e

desenvolvimento de células-tronco. As células do estroma compõem-se de

adipócitos, osteoblastos, fibroblastos, células reticulares, células endoteliais

3

e macrófagos, e secretam moléculas como o colágeno, fibronectina e

trombospondina, e glicosaminoglicanos, como o ácido hialurônico e

derivados condroitínicos. Além disso, secretam vários fatores de crescimento

necessários à sobrevivência da célula-tronco (Anjos e col, 2000).

Moléculas de adesão medeiam a interação de células precursoras da

medula, leucócitos e plaquetas a vários componentes da matriz extracelular,

ao endotélio e a outras superfícies (figura 2). As 3 principais famílias destas

moléculas são imunoglobulinas, selectinas e integrinas. As moléculas de

adesão são importantes no desenvolvimento e na manutenção da resposta

inflamatória e imunológica e nas interações de plaquetas e leucócitos com a

parede dos vasos. A expressão dessas moléculas pode ser aumentada por

indução de IL-1 (interleucina 1), TNF (tumor necrosis factor alpha),

IFN(interferon gama), ativação de células T, adesão a proteínas

extracelulares e infecções virais. Interações anormais entre células-tronco e

progenitoras hematopoéticas e o estroma da medula óssea levam, em parte,

a uma proliferação anormal e alteração no tráfego de progenitores

hematopoéticos, como é observado em uma variedade de doenças

malignas, entre elas as

Síndromes Mielodisplásicas

e as aplasias medulares.

Figura 2: esquema do

microambiente medular (Amanda

Maia)

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1.2 - Síndrome Mielodisplásica

A Síndrome Mielodisplásica (SMD) é uma doença clonal de célula-

tronco pluripotente e apresenta uma hematopoese ineficaz, levando a

defeitos na maturação celular (presença de displasias), apoptose

intramedular aumentada, e conseqüentes citopenias no sangue periférico. A

SMD é considerada primária quando o paciente não foi submetido a nenhum

tratamento prévio com medicamentos citotóxicos nem esteve em contato

com agentes mutagênicos, não havendo, portanto causa conhecida para o

aparecimento da doença. Na SMD secundária há uma causa conhecida,

normalmente sendo resultado de tratamentos para outras neoplasias.

A SMD primária pode apresentar formas brandas, com sobrevida alta

e baixa taxa de transformação leucêmica; no entanto cerca de 10 a 40% dos

casos evoluem para Leucemia Mielóide Aguda (LMA) (Oscier, 1997) e em

raros casos para leucemia linfóide ou bifenotípica, sendo a causa principal

de óbito a falência da medula óssea com infecções e hemorragias.

A maior incidência de SMD ocorre em pacientes com mais de 50 anos

de idade, sendo considerada rara na infância (Aul e col., 1998). Quando

presente nesta faixa etária, é geralmente acompanhada de aberrações

cromossômicas, associadas a prognóstico ruim (evolução para LMA).

As citopenias encontradas em SMD são anemia, neutropenia e

trombocitopenia. Encontram-se também displasias das linhagens eritróide,

granulocítica e megacariocítica. As linhagens linfóides também apresentam

alterações. Embora o número de células B esteja dentro do padrão, elas são

funcionalmente imaturas, havendo um descontrole na produção de

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imunoglobulinas. O número de células T em SMD é reduzido, principalmente

para células CD4+. As células NK (natural killer) também apresentam

número reduzido e são funcionalmente imaturas (Hamblin, 1992).

A medula óssea mantém-se normo ou hipercelular, havendo também

mais raramente casos de SMD com medula óssea hipocelular (SMDhipo)

(Aul e col., 1998). O aparente paradoxo entre medula óssea hipercelular e

sangue periférico com citopenias foi esclarecido quando se demonstrou que

pacientes com SMD apresentam taxas aumentadas de apoptose na medula

óssea, causando assim as citopenias no sangue periférico. Nos estágios

mais avançados da doença a taxa de apoptose diminui, permitindo o

acúmulo de células imaturas (blastos) e contribuindo para a transformação

leucêmica (Parker e col., 2000; Hellström-Lindberg, 2000).

Na SMD observa-se alteração da arquitetura normal da medula óssea

e distorção topográfica das células. Na medula normal, os precursores

eritróides e megacariocíticos têm uma distribuição focal e localizam-se

próximos à parede dos sinusóides da região central da medula, enquanto as

células granulocíticas em maturação têm uma distribuição aleatória, estando

os progenitores granulocíticos precoces próximos à superfície endosteal,

paratrabecular, e as formas maduras na área central, trabecular. Nas SMD,

os precursores eritróides e megacariocíticos são freqüentemente desviados

para o osso trabecular, enquanto os precursores granulocíticos podem ser

observados em agregados, com deslocamento das células granulocíticas

imaturas da região paratrabecular para a região central intratrabecular

(Krause, 1981). O termo ALIP (abnormal localization of immature precursors)

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é empregado nesse caso, definindo uma agregação de mieloblastos e

promielócitos fora da trabécula óssea (Tricot e col., 1984).

A presença de ALIP em biópsia de medula é útil para o diagnóstico de

SMD, porque apesar de ser uma característica predominantemente

reconhecida em tipos mais agressivos da doença (AREB – anemia refratária

com excesso de blastos e AREBt – anemia refratária com excesso de

blastos em transformação) e nas LMMC (leucemia mielomonocítica crônica)

com mais de 5% de blastos na medula, os ALIP podem ser evidenciadas

pela biópsia mais precocemente do que o excesso de mieloblastos pelo

mielograma, de modo que pacientes com AR (anemia refratária), ARSA

(anemia refratária com sideroblastos em anel) e LMMC com menos de 5%

de blastos também podem demonstrar a presença de ALIP e confirmar o

diagnóstico.

Além da dispoiese, a biópsia também permite uma avaliação mais

acurada da celularidade da medula óssea (de blastos), e da quantidade de

fibras reticulínicas.

O diagnóstico da SMD é feito inicialmente por um hemograma - o qual

indicaria a presença de uma ou mais citopenias no sangue periférico e

ausência de resposta para tratamento com vitamina B12 e ácido fólico -

seguido da análise de biópsia e mielograma de medula óssea para identificar

as displasias presentes, a possível presença de blastos em estágios mais

avançados da doença e a localização anormal de precursores imaturos

(ALIPs). A análise citogenética também é fundamental no diagnóstico, assim

como no prognóstico da doença (Vallespi e col., 1998).

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Em 1982 o grupo FAB (Grupo Francês Americano e Britânico,

especializado em leucemias) propôs uma classificação das SMD primárias

em 5 subtipos: anemia refratária (AR), anemia refratária com sideroblastos

em anel (ARSA), anemia refratária com excesso de blastos (AREB), anemia

refratária com excesso de blastos em transformação (AREB-t) e leucemia

mielomonocítica crônica (LMMC). Essa classificação leva em conta critérios

morfológicos e a percentagem de células blásticas no sangue periférico e na

medula óssea (tabela 1) (Bennett e col., 1982).

Classificação das SMD segundo os critérios propostos pelo grupo FAB em

1982

Subtipo Monócitos (ul)

SP

Sideroblastos em anel (%)

MO

Células blásticas

SP MO

Bastões de Auer

MO

AR normal < 15 < 1 < 5 ausente

ARSA normal > 15 < 1 < 5 ausente

AREB normal ausente < 5 5 – 20 ausente

AREB-t normal ausente > 5 20 – 30 presente ou ausente

LMMC > 1000 ausente < 5 < 20 ausente

Tabela 1: SP-sangue periférico; MO – medula óssea

Desde que foi introduzida em 1982, vários estudos comprovaram a

utilidade dessa classificação, tanto para o monitoramento de estudos

envolvendo um grande número de pacientes com SMD, permitindo

comparações entre diversos trabalhos, quanto para o tratamento de

pacientes, que antes acabavam sendo tratados como para outro tipo de

leucemia, como a LMA. No entanto, para a determinação de um prognóstico

preciso esta classificação ainda apresenta alguns problemas: distingue

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somente duas categorias de risco - baixo (AR e ARSA) e alto risco (AREB,

AREB-t e LMMC) - e dentro de um mesmo grupo FAB os pacientes mostram

grandes variações na evolução da doença e na sobrevivência,

especialmente dentro dos subgrupos AR e ARSA.

- A classificação WHO

A classificação WHO (World Health Organization) incorpora muito dos

conceitos e definições do sistema FAB, usando também estudos mais

recentes para melhorar a definição dos subtipos, assim como sua relevância

clínica. A maior diferença entre as duas classificações é o desaparecimento

do subtipo AREB-t, sendo esta considerada transformação para LMA a partir

de 20% de blastos na medula óssea.

As anemias refratárias com ou sem sideroblastos são divididas em AR

e ARSA, quando a medula óssea apresenta somente uma displasia, e em

anemia refratária com displasia multilinhagem (ARDM) e ARDM com

sideroblastos em anel (ARDM-SA), quando a medula óssea apresenta várias

displasias. Foram criados dois subtipos para AREB: AREB-1 (5 a 10% de

blastos na medula óssea) e AREB-2 (10 a 19% de blastos na medula

óssea).

A classificação WHO também reconhece a “síndrome do 5q-” como

uma entidade separada. Foi criada ainda uma categoria separada para

LMMC, a categoria “doenças mielodisplásicas/mieloproliferativas”, por ainda

existir polêmica sobre a natureza desta doença (Harris e col., 1999; Vartiman

e col., 2002).

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Apesar de ter como objetivo melhorar o valor prognóstico e clínico da

classificação FAB, esta nova classificação tem sido severamente criticada

(Hellström-Lindberg e col., 2000). As principais falhas apontadas foram a

criação de categorias imprecisas e sem bases biológicas, clínicas ou

genéticas, e a falta de precisão prognóstica.

- Alterações cromossômicas na SMD

Anormalidades cromossômicas são encontradas em SMD, sendo a

mais comum a perda de material genético. A freqüência de alterações

cromossômicas encontradas em pacientes com SMD primária varia de 30 a

50%, sendo as mais freqüentes a deleção intersticial ou final do braço longo

do cromossomo 5 [del(5q)], a monossomia do cromossomo 7 (-7), a

trissomia do cromossomo 8 (+8), a deleção do braço longo do cromossomo

20 [del(20q)] e cariótipos complexos (Nöel e col., 1993; Heim & Mitelman,

1995). O encurtamento dos telômeros e a inativação de alguns genes

supressores de tumor têm sido associados com a progressão da doença. A

presença de uma anomalia cromossômica geralmente não está associada a

um subtipo específico de SMD (Nöel e col., 1993; Fernandez e col., 2000).

Além da importância da citogenética no diagnóstico das SMD

primárias, estudos citogenéticos de acompanhamento da evolução de SMD

para LMA puderam demonstrar que anomalias cromossômicas simples

ocorrendo em subtipos de SMD são acrescidas de outras anomalias durante

a progressão da doença, estando envolvidas alterações em oncogenes e

genes supressores de tumor (Nowell, 1992).

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Estudos têm sido feitos para correlacionar alterações citogenéticas

com mutações em possíveis oncogenes ou genes supressores de tumor. A

freqüente deleção do braço longo do cromossomo 5, do braço longo do

cromossomo 7 entre outros em SMD (tabela 2) sugerem que nestes

segmentos cromossômicos poderiam estar mapeados alguns destes genes

(Sheridan e col., 1990; Fenaux e col., 1997).

Anormalidades citogenéticas mais comuns em SMD

Anomalia Incidência (%)

Perda parcial ou total do cromossomo 5 13

Perda parcial ou total do cromossomo 7 5

Trissomia do cromossomo 8 5

del(17p) <1

del(20q) 2

Perda do cromossomo X ou Y 2

Tabela 2 - Greenberg,1997

Como uma grande porcentagem de pacientes com SMD,

principalmente nos subtipos iniciais da doença, apresentam cariótipos

normais (AR 80% e ARSA 89%, Fernandez e col., 2000), vários

pesquisadores começaram a investigar o envolvimento de possíveis

oncogenes associados com o aparecimento e a evolução da doença.

Seguindo esta linha de raciocínio foram encontradas em cerca de 20 a 42%

dos casos de SMD mutações pontuais no proto-oncogene N-ras. Mutações

neste gene são freqüentes em vários tipos de tumor (Fernandez e col.,

1998). Uma mutação pontual no códon 12 foi observada em pacientes com

AR mesmo quando com cariótipo normal, bem como em outros subtipos,

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sem alterações citogenéticas precedentes. A diferença entre os subtipos

consiste no aumento do nível de expressão com a evolução da doença.

Sugere-se então que mutações em N-ras podem preceder a aquisição de

uma alteração cromossômica, ou mesmo agirem sozinhas, desregulando a

célula e promovendo instabilidade cromossômica. Assim, é provável que o

oncogene N-ras sozinho não seja suficiente para induzir a evolução

leucêmica, mas sua aquisição seja um passo no processo de

leucemogênese (Fernandez e col., 1998).

- Escalas Prognósticas e IPSS

A mais recente e mais utilizada classificação prognóstica é o Sistema

Internacional de Escala Prognóstica (IPSS, 1997). Após estudarem

retrospectivamente os dados citogenéticos, morfológicos e clínicos de 816

pacientes (o maior número já registrado em um estudo), foi concluído que a

porcentagem de blastos na medula óssea, o número de citopenias no

sangue periférico e a citogenética eram os fatores prognósticos de maior

importância, tanto em relação ao tempo de sobrevivência quanto à taxa de

transformação leucêmica.

Os sistemas de avaliação dos grupos de risco em SMD são

importantes devido à heterogeneidade da doença, facilitando a partir de uma

análise uniforme variada a aplicação das diferentes condutas terapêuticas

usadas no tratamento da doença.

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- Tratamento para SMD primária

Uma variedade de tratamentos vem sendo utilizada em pacientes com

SMD primária, com o objetivo de eliminar as citopenias e recuperar a

hematopoese. As opções terapêuticas incluem transfusões de hemácias

(profilaxia para anemia) e plaquetas (trombocitopenia e sangramentos),

antibióticos, fatores de crescimento, ciclosporina, ATG (globulina anti-

timocítica) e terapias semi-intensiva (pacientes de baixo risco) e intensiva

(pacientes de alto risco) com quimioterápicos ou radioterápicos (Cheson e

col, 2000).

O regime de tratamento para pacientes com LMA tem sido usado

também para mielodisplasia (fases mais avançadas – RAEB e RAEBt), sem

muito sucesso. Pacientes com mielodisplasia tendem a ter baixa taxa de

remissão da doença após o tratamento, com duração pequena da remissão

e alta taxa de recaída (Economopoulos e col., 1996). Os pacientes com

mielodisplasia que receberam regime padrão para LMA (incluindo

antraciclina e citarabina) têm taxa de remissão da doença entre 50 e 60% e

uma taxa de recaída de 90%, enquanto os com LMA (sem histórico prévio de

mielodisplasia) com o mesmo tratamento tem taxa de remissão de 70 a 80%

com taxa de recaída de 65 a 80%. Quando os pacientes são agrupados por

suas alterações citogenéticas, há uma diminuição na diferença de resposta

entre mielodisplasia e LMA.

O transplante de medula óssea (TMO) alogenêico tem sido

considerado o método mais próximo para a remissão total da doença, porém

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seu uso é limitado a pacientes jovens e que possuam doadores

histocompatíveis (Parker e col., 1998).

As anormalidades hematológicas que caracterizam as SMD refletem

uma alteração na regulação da proliferação e diferenciação das células

progenitoras com parada progressiva da diferenciação celular e,

eventualmente, bloqueio da maturação. O defeito inicial parece ser uma

alteração genética de uma célula-tronco multipotente (CD34+CD38-), com

progressiva substituição das células hematopoéticas normais pelo clone

anormal. A geração desse clone é um processo com várias etapas, que

requer o acúmulo de mutações no DNA da célula. Apesar de vários estudos

com enfoque nas alterações citogenéticas e moleculares em SMD, os

mecanismos iniciais do seu desenvolvimento permanecem desconhecidos.

- Síndrome Mielodisplásica hipocelular

A pancitopenia é geralmente classificada entre dois grupos: com

medula óssea hipoplásica – característica de Anemia Aplástica (AA) – ou

normocelular ou hipercelular – característica da SMD. Porém, cortes

histológicos de medula óssea de pacientes com SMD podem apresentar

baixa celularidade em 8 a 20% dos casos, e em casos extremos, menos de

30% (Maschek e col, 1993; Tuzuner e col, 1995). Vários autores se referem

a esses casos como SMD hipocelular (SMDhipo) (Nand & Gordwin, 1998;

Maschek e col, 1993; Tuzuner e col, 1995). A SMDhipo é de difícil distinção

da AA, pois as duas doenças possuem semelhanças clínicas, citológicas e

histológicas.

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Aberrações cromossômicas são consideradas critério diagnóstico

para esta distinção mas, no entanto, muitas AR não apresentam tais

alterações. Além disso, anormalidades cromossômicas podem ser

encontradas em AA, porém com uma frequência bem menor que em SMD

(Barret e col, 2000).

Trabalhos anteriores de nosso grupo também sugerem que a SMD

hipocelular é preferencialmente encontrada nos subtipos iniciais da

classificação FAB (AR e ARSA), e que o nível de apoptose encontrado nas

biópsias destes pacientes é muito baixo (Souza, J.M. ,2003).

Assim sendo, maiores estudos sobre a biologia da SMD hipocelular

são necessários na definição de parâmetros na escolha terapêutica.

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1.3 - Anemia Aplástica

A anemia aplástica (AA) é caracterizada pela diminuição acentuada

ou ausência da função da medula óssea com produção inadequada de

eritrócitos, granulócitos e plaquetas. Ela pode ser congênita ou adquirida e

variar de branda a fatal.

A anemia aplástica foi inicialmente descrita por Ehrlich em 1888

(Erlich, 1888). A incidência desta doença é de 2 a 4 casos por milhão por

ano nos Estados Unidos (Smick e col., 1964; Wallerstein e col., 1969), sendo

que um quarto destes casos ocorrem em pacientes com idade abaixo de 2

anos e um terço acima dos 60 anos (Alter e col., 1978). Mulheres e homens

são igualmente afetados.

A maioria dos casos de anemia aplástica é adquirida (AAA), sendo

que drogas (Yunis, 1973; Williams e col., 1973), químicos, toxinas, radiação

e infecção são descritos como causa da doença em 30% dos casos. Os

outros 70% são denominados de idiopáticos (tabela 3).

Tabela 3: etiologia e classificação de Anemias Aplásticas

Anemia Aplástica Adquirida Anemia Aplástica Herdada

Secundária

Produtos químicos (benzeno, inseticida, cola, solventes)

Drogas (agentes citotóxicos, anti-inflamatórios não-esteroidais,

anti-convulsivante, sais de ouro)

Radiação

Vírus (Epstein-Barr, hepatite e HIV)

Doenças imunes e hematológicas (GHVD, artrite reumatóide,

lupus)

PNH (paroxysmal nocturnal hemoglobinuria)

Gravidez

Anemia de Fanconi

Disqueratose congênita

Síndrome de Schwachman

Idiopática

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Formas congênitas da doença (AAC) são descritas incluindo anemia

de Fanconi, anemia aplástica familial e outras. Essas desordens ocorrem em

pacientes com predisposição genética. Na maioria dos casos a falha na

medula óssea ocorre na infância antes dos 10 anos e tem uma

predominância no sexo masculino (Alter e col., 1978).

A AAA pode se desenvolver a partir de uma infecção viral incluindo

vírus Epstein-Barr (mononucleose), rubéola, herpes-zoster, citomegalovírus

e outros.

A AAA pode ser definida como uma pancitopenia no sangue periférico

associada a uma medula hipocelular, substituída por gordura e células

estromais, sem a presença de células malignas ou aumento de fibrose. Pode

haver alguma diseritropoese e macrocitose das células vermelhas

circulantes. Os neutrófilos remanescentes apresentam granulação tóxica

sem outras alterações displásicas. Os megacariócitos estão reduzidos ou

ausentes. Há uma redução notável de progenitores hematopoéticos,

incluindo células-tronco, contribuindo para a hipocelularidade característica

da medula óssea (Bagby e col, 2004).

Diferentes condições levam ao quadro morfológico observado na

AAC. A anemia de Fanconi é a forma mais comum, sendo que seu

diagnóstico é baseado em história familiar, aparência morfológica e aumento

da susceptibilidade de quebra dos cromossomos nas células circulantes por

diepoxybutano (DEB) ou mitomicina C (Bagby e col, 2004).

A disqueratose congênita é outra AAC que pode apresentar falência

medular. Pacientes expostos a agentes citotóxicos ou radioterapia terão

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falência medular, sendo esta indistinguível de AAA, porém o histórico do

paciente exclui a hipótese.

A leucemia linfóide aguda (LLA) em jovens e a LMA podem

apresentar uma medula óssea altamente hipoplástica, sendo o diferencial

quando observada remissão da aplasia espontânea ou induzida por

esteróides, seguido do aparecimento da leucemia aguda.

A pancitopenia com medula hipocelular mediada por auto-anticorpos é

rara, mas bem definida, onde os pacientes respondem a tratamento com

corticosteróides, e a presença de anticorpos é logo detectada nas células

circulantes.

O curso clínico e o prognóstico dos pacientes são variáveis. Pacientes

com formas congênitas tem um curso gradual, mas a doença é normalmente

fatal. Já pacientes com AAA são divididos entre os que apresentam a

doença de forma branda a moderada e aqueles que tem anemia aplástica

severa (AAS) (Li e col., 1972; Lynch e col., 1975; Lohrmann e col., 1976;

Najean & Pecking, 1979) (tabela 4). O fator prognóstico mais importante é a

contagem absoluta de neutrófilos (CAN). Pacientes com CAN menor que 0,5

x 109/L tem maior risco de desenvolver infecções, e pacientes com menos

de 0,2 x 109/L tem pior prognóstico.

Pacientes com AAS tem prognóstico particularmente grave, sobrevida

média de menos de 6 meses e 80% dos pacientes morrem no intervalo de 1

a 2 anos. Atualmente o tratamento indicado inclui o transplante de medula

óssea, melhorando o índice de sobrevida livre de eventos em 6 anos para

80% (Bagby e col, 2004).

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Critério diagnóstico para Anemia Aplástica Severa

Pelo menos 2 características abaixo

Contagem absoluta de neutrófilo < 0,5 x 109/L

Contagem de plaquetas < 20 x 109/L

Anemia com contagem de reticulócito <1%

E uma das abaixo

Celularidade de medula óssea < 25%

Celularidade de medula óssea < 50% com menos de 30% de células hematopoéticas

Clinicamente a AAS idiopática é bastante semelhante à síndrome

mielodisplásica (Maciejewski e col., 1994) (SMD), particularmente com a

SMDhipo (Tuzuner e col., 1995). Em alguns casos somente a análise

citogenética é capaz de distinguir as duas entidades onde a presença de

uma alteração cromossômica clonal caracteriza uma SMD.

Nas formas mais brandas da doença, AR e ARSA, são encontradas

as medulas hipocelulares, fazendo com que a AR hipocelular seja o subtipo

que mais se assemelha a AAS.

Ambas as desordens são caracterizadas pelo baixo número de

células-tronco hematopoéticas e de progenitores capazes de formar as

diferentes linhagens. Estas deficiências ocasionam citopenias no sangue

periférico dos pacientes com ambas as doenças (Maciejewski e col., 1996;

Martinez e col., 2000; Asano e col., 1994; Sato e col., 1998).

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Principais critérios diagnósticos diferenciais entre AAS e SMDh

Tabela 5: resumo dos principais critérios diagnósticos diferenciais entre AAS e SMDh.

Apesar da SMD hipoplástica e AAS clinicamente poderem ser

confundidas, as bases moleculares das duas entidades diferem bastante.

1.4 - Similaridades e diferenças entre AAS e SMD

hipoplástica

Culturas de longa duração de células progenitoras obtidas de

pacientes com AAS ou SMD são incapazes de proliferar normalmente,

mesmo com a adição de citocinas. No entanto células da medula óssea de

pacientes com SMD mostram um potencial bem maior de capacidade de

proliferação do que as células de AAS, principalmente quando estimulados

por citocinas (Martinez e col., 2002). Essa observação aponta para um

defeito funcional dos progenitores hematopoéticos em AAS, que pode

envolver anormalidades na capacidade de resposta as citocinas.

Critérios

Mielograma

Biópsia

Alterações cromossômicas

AAS

Ausência de displasias

MO vazia

Ausência de ALIPs

Hipocelularidade acentuada

Ausência de alterações

-

SMD hipo

Presença de displasias MO quase vazia

Presença de ALIPs

Hipocelularidade

Presença de alteração

acentuada

Não clonal clonal

20

Por outro lado, células estromais de pacientes com AAS suportam a

hematopoese de células CD34+ normais, enquanto o estroma obtido de

indivíduos normais não é capaz de suportar a hematopoese quando células

CD34+ dos pacientes com AAS são cultivadas sobre ela (Marsh e col., 1991;

Novitzky & Jacobs, 1995).

Além disso, o estroma de pacientes com AAS produz quantidades

normais ou aumentadas de fatores de crescimento hematopoético (Kojima e

col., 1992; Gibson e col., 1995). O mesmo não ocorre em estroma de

pacientes com SMD onde, ao contrário, encontra-se uma baixa taxa de

secreção de fatores de crescimento hematopoético.

Estes resultados sugerem que enquanto na AAS os defeitos parecem

se concentrar nos progenitores hematopoéticos, na SMD além da célula-

tronco parecem existir deficiências no estroma medular, uma vez que sua

produção de fatores de crescimento hematopoéticos está diminuída e que

ensaios de cultura de longa duração de células provenientes de pacientes

com SMD mostram uma significativa diminuição da camada de células

aderentes.

A capacidade do estroma em suportar a hematopoese pode ser

correlacionada com a evolução clínica do paciente com SMD. Pacientes com

cultura de longa duração que mantiveram uma taxa de proliferação

relativamente normal morreram entre 12 e 41 meses, de doenças

relacionadas a SMD, enquanto mais da metade dos pacientes que falharam

em manter a cultura por mais de 4 semanas morreram entre 3 e 24 meses

de falência medular (Coutinho e col, 1990).

21

Apoptose intramedular é uma das características biológicas mais

marcantes em SMD e por muito tempo foi tida como a causa das citopenias

periféricas encontradas nesta síndrome. Hoje sabemos que a apoptose é um

evento fisiológico no qual o organismo tenta se livrar do clone displásico, e

que a evolução da doença coincide justamente com o bloqueio da apoptose

devido a superexpressão de Bcl2 (Parker e col, 2000).

Já em AAS, tem sido descrita uma alta taxa de apoptose devido à

produção elevada de TNF-, um inibidor de hematopoese (Philpott e col.,

1995; Martinez e col., 2001; Kitagawa e col., 1997). Alguns estudos mostram

o envolvimento nesses casos da expansão clonal de populações de células

T citotóxicas. Portanto, na AAS o mecanismo de apoptose parece ser uma

conseqüência do ataque imunológico do organismo às células progenitoras.

Tendo em vista as similaridades clínicas entre as duas doenças o

diagnóstico diferencial é importante, pois sendo as bases moleculares

distintas, o desenvolvimento de métodos terapêuticos deverá ser também

distinto. Hoje em dia, a melhor terapia para as duas entidades é o TMO,

mas esta modalidade terapêutica nem sempre é possível. Por outro lado, os

tratamentos para as duas doenças diferem, levando em consideração a

característica imunológica da AAS.

Assim sendo, a análise das características biológicas das células da

medula óssea nas duas doenças é essencial na tentativa de identificar novas

características que possam ser utilizadas como diagnóstico diferencial

(marcadores) e também para que possamos aprender mais sobre a biologia

de cada uma delas.

22

Uma característica interessante a ser explorada é a sinalização

estroma-célula-tronco, que parece interferir nas duas doenças, mas com

intensidades distintas. Esta sinalização, como dito anteriormente, ocorre pela

interação de moléculas de adesão como integrinas e de matriz extracelular

(MEC), como fibronectina e trombospondina.

Liesveld e col (1989, 1991) investigaram a interação in vitro dos

progenitores mielóides com o estroma da medula óssea, concluindo que um

subgrupo de células da medula óssea humana apresentava antígenos

CD34+ ligados à camada de estroma medular, e em menor extensão, à MEC

da medula, à fibronectina e à laminina. Em 1993 os mesmos autores

demonstraram que progenitores da linhagem mielóide, incluindo as células

normais CD34+ e células da LMA, apresentavam um padrão similar de

integrinas VLA (very late antigen). Usando uma linhagem leucêmica de

células monocíticas U937, Pucillo e col (1993) demonstraram que o

tratamento in vitro com TPA (12-O-tetradecainoil phorbol-13-acetato),

aumentou a expressão das integrinas , e a taxa de adesão desta

linhagem às moléculas de MEC (citado em Anjos e col, 2000).

Recentemente foi reportado a redução da expressão de em

células CD34+ de pacientes com SMD (Delforge e col., 2005). Eles

observaram que pacientes com baixo risco (AR e ARSA) e baixa taxa de

apoptose tinham níveis de expressão de integrina diminuídos em relação

ao controle. Kaito e col (2003) mostraram que células CD34+ de pacientes

com AAS não-tratados mostraram um aumento da expressão de

e. Após a recuperação hematológica dos mesmos, os níveis

destas integrinas voltaram ao comparado com os controles saudáveis.

23

1.5 - Integrinas

Integrinas são proteínas transmembrana tipo I, heterodímeros

compostos de uma subunidade não-covalentemente associada com uma

subunidade . Existem pelo menos 18 subunidades e 8 subunidades ,

levando a mais de 20 subtipos diferentes de integrinas. A maioria das

subunidades só se conjuga com uma subunidade específica, e a

especificidade do ligante é determinada pela porção (figura 3). A

expressão das integrinas VLA nas células hematopoéticas inclui: VLA-1,

VLA-2 e VLA-6 (CD49 a, b, e) presentes nas células T (Shimizu e col, 1990;

Long, 1992) e VLA-2 e VLA-6 presentes nas plaquetas (Soligo e col, 1990;

Long, 1992). No entanto são as integrinas (VLA-4 - CD49d/CD29) e

(VLA-5 - CD49e/CD29) as de maior expressão nas células

hematopoéticas, principalmente as progenitoras e as células-tronco

hematopoéticas.

Figura 3: diferentes associações possíveis entre a porção e das integrinas conhecidas até o momento.

24

As integrinas possuem um longo domínio extracelular de ligação -

formado tanto pela porção quanto um segmento transmembrana e uma

cauda citoplasmática curta.

As integrinas e são importantes na proliferação e

diferenciação de progenitores hematopoéticos normais. Experimentos in vivo

têm sugerido que existe um papel predominante da 1 integrina na retenção

de progenitores na medula óssea e no seu homing além do papel que ela

tem na regulação da proliferação e diferenciação dos progenitores

hematopoéticos (Potocnik e col, 2000).

Sendo proteínas transmembrana, as integrinas são capazes de

mediar tanto sinais de fora para dentro da célula (sinalização outside in)

quanto sinais de dentro para fora (sinalização inside out). Isto ocorre porque

além de regular a adesão celular por ligações com componentes da MEC, a

ativação das integrinas leva a uma integração com outras vias de

sinalização, principalmente àquelas correlacionada a sinalização de fatores

de crescimento e citocinas. Esta integração acarreta na modulação de

diversos processos biológicos como a reorganização do citoesqueleto, a

proliferação e a sobrevivência celular (Kumar, 1998).

Nas células-tronco hematopoéticas as caudas citoplasmáticas das

integrinas 1 se associam direta e indiretamente com várias proteínas de

citoesqueleto, incluindo -actinina, vinculina e tensina, para formar

complexos multimoleculares conhecidos como “adesões focais” (AF). Essas

interações resultam na ligação da MEC com fibras de F-actina e leva a um

rearranjo do citoesqueleto de actina. Além disso, proteínas de transdução de

sinal, como paxilina, e quinases, como Fak (focal adhesion kinase),

25

RAFTK/PYK2 e fosfatidilinositol-3-quinase (PI-3K) são recrutados para as AF

levando a ativação de vias de sinalização.

Isto faz com que além de mediar a adesão celular e a mobilidade

através da formação de adesões focais as integrinas transduzam sinais para

o interior da célula, levando a modificações na forma da célula, na expressão

gênica da mesma, assim como sua proliferação e sobrevivência (figura 4).

Figura 4: processos biológicos a ativação de integrinas pode influenciar.

Existem 2 tipos de sinalização por integrinas conhecidos. A primeira é

por sinalização direta, onde a estimulação de integrinas por proteínas da

MEC ou por anticorpos gera sinalização intracelular. A segunda é a

modulação da sinalização mitogênica, e nesse caso a ativação das

integrinas influencia a sinalização gerada por fatores de crescimento.

26

Na sinalização direta a interação do ligante e a conseqüente

agregação de integrinas ativam proteínas quinases intracelulares. A

agregação de integrinas ativa a auto-fosforilação da FAK, a qual pode

recrutar quinases da família Src para as adesões focais. Esses eventos de

fosforilação e ativação de quinases levam a fosforilação de outras proteínas.

Além de FAK, a agregação de integrinas pode ativar elementos da via Ras-

MAP-quinase, incluindo MEKs e Raf (citado em Kumar, 1998).

Em fibroblastos, a perda da ancoragem leva a uma parada do ciclo

celular, levada aparentemente por uma diminuição da expressão de ciclina

D1, aumento da expressão de proteínas inibitórias p21 e p27 e diminuição

da atividade dos complexos ciclinas D-CDK4/CDK6. Em células epitelias e

endoteliais a perda da ancoragem de integrinas ativam um programa de

morte celular conhecido como “anoikis”.

A integrina, o receptor de fibronectina, tem um complexo e

interessante papel na regulação do crescimento de tumores. Estudos

anteriores usando tanto linhagens celulares de CHO (Chinese ovary

hamster) com vários níveis de expressão de quanto sua

superexpressão em células CHO transfectadas, mostraram uma correlação

inversa entre os níveis de expressão de e o crescimento celular

independente de ancoragem in vitro. Em células epiteliais tumorais

parecem ter um efeito negativo no crescimento. No entanto, no mesmo tipo

celular, a participa na sobrevivência da célula. Quando células de

carcinoma de cólon são privadas de soro, elas rapidamente entram em

apoptose, o que pode ser revertido com a superexpressão de (Zhang e

col, 1995).

27

Também células CD34+ e progenitores hematopoéticos em G0/G1

cultivadas com BSA (albumina sérica bovina) ou PLL (poli-L-lisina) entraram

em apoptose, ao contrário das mesmas cultivadas em presença da camada

de fibronectina, sugerindo o envolvimento de integrina 1 no ciclo celular

destas células e possivelmente na manutenção da sobrevivência (Dalton e

col, 1992).

1.6 – Sobrevivência celular X apoptose

Interações entre células e MEC são essenciais para a sobrevivência

da célula, e a perda dessas interações pode resultar na apoptose das

mesmas, como visto em células endoteliais e epiteliais. A habilidade da MEC

em promover a sobrevivência da célula parece ser mediada por pelo menos

duas vias de sinalização: a via de Ras e a via de PI-3K.

Células expressando Src ou Ras ativos são capazes de crescer

mesmo na ausência de contatos com a matriz extracelular. Evidências têm

demonstrado que tanto quanto outros receptores da mesma família são

ligados a via de sinalização de Ras através da proteína SHC (citado em

Kumar, 1998). Esta proposta está de acordo com o papel importante que

SHC parece ter na proteção da apoptose (Kumar, 1998).

A outra via de sinalização importante na sobrevivência celular não

depende da via clássica de Ras e Erk. Nesta segunda sinalização a ativação

de PI-3K independentemente de fatores séricos leva a ativação de AKT, que

bloqueia a entrada em apoptose (Kumar, 1998) (figura 5).

28

Figura 5: vias de sinalização mediadas por integrinas levando a proliferação e sobrevivência

da célula. A ativação da via de sinalização de Ras-ERK por integrinas envolve o

recrutamento de SHC via uma proteína adaptadora de membrana. A sobrevivência celular é

promovida por integrinas via Ras–ERK e AKT. Jnk pode inibir a sobrevivência celular se

ERK não estiver ativo. Adaptado de Kumar, 1998.

A supressão da apoptose pode ser pela indução da expressão de

Bcl2 e/ou ICE (enzima conversora de IL-1). Zhang e col (1995)

demonstraram que a ancoragem de células CHO em fibronectina via

integrina protegia a célula de entrar em apoptose em privação de soro. Eles

também demonstraram que esse efeito poderia ser mediado por Bcl2.

Em SMD e em AAS tem sido proposto que a apoptose possa ser

mediada pela expressão aumentada de Fas nas células CD34+ (Timeus e

col, 2005). Nos dois casos essa superexpressão pode ser o resultado da

indução por IFN e TNF.

29

Em AAS tem sido também sugerido uma mediação da apoptose pelo

óxido nítrico (NO). O bloqueio da produção de NO parece bloquear o efeito

pró-apoptótico de TNF, IFN e Fas nas células CD34+. Tanto a apoptose

mediada por Fas quanto a mediada pelo NO podem ser inibidas por sinais

anti-apoptóticos como Bcl2.

Como as vias de sinalização que levam a sobrevivência e as que

induzem a apoptose são moduladas por integrinas e seus ligantes é ainda

uma questão em aberto.

1.7 – Ligantes de integrinas e seu papel na sinalização

celular

A MEC pode ser definida como a organização de diversas proteínas

estruturais e polissacarídeos nos tecidos conjuntivos, compreendendo

colágeno, glicoproteínas não colagenosas, proteoglicanos,

glicosaminoglicanos, elastina e ácido hialurônico, que preenchem os

espaços extracelulares. As células depositam na MEC componentes como

colágeno, fibronectina, laminina, trombospondina, hemonectina,

proteoglicanos e ácido hialurônico, produzidos principalmente pelos

fibroblastos e distribuídos em uma rede organizada em íntima associação

com a superfície da célula que a produziu (Anjos e col, 2000).

Vários componentes da matriz extracelular são ligantes específicos de

integrinas participando em processos biológicos importantes. Assim, a

laminina é descrita como ligante de integrina, colágeno como ligante de

30

, fibronectina como ligante de e vitronectina como ligante de

Todas estas ligações são capazes, em diferentes tipos celulares, de ativar a

sinalização Ras-Erk através da proteína adaptadora SHC.

Apesar da fibronectina ser descrita como o ligante de em

células-tronco hematopoéticas, recentemente verificou-se a ligação desta

integrina com uma outra proteína de matriz extracelular, a trombospondina

(Sottile & Hocking, 2002).

A trombospondina (TSP-1) é uma glicoproteína de matriz que tem

funções na agregação plaquetária, resposta inflamatória, na regulação da

angiogênese durante o fechamento de feridas e no crescimento tumoral

(Lawler & Detmar, 2004).

Ela faz parte de uma família com 5 membros, todos contendo

repetições internas altamente conservadas. Essas repetições são

importantes na mediação de interações proteína-proteína entre TSP-1 e o

fator de crescimento tumoral (TGF), a metaloproteinase de matriz 9

(MMP9) e a proteína de membrana CD36 (Lawler & Detmar, 2004).

Todas estas interações estão envolvidas na supressão do

crescimento tumoral por TSP-1. Basicamente TSP-1 inibe o crescimento

celular inibindo a angiogênese. Vários estudos têm demonstrado que tanto

TSP-1 como TSP-2 são altamente expressos em fibroblastos estromais e em

células endoteliais de tumores (Adams & Lawler, 2004). Para TSP-1 essa

expressão é aumentada em resposta a fatores de crescimento, como PDGF,

FGF e TGF1 e reprimida em resposta a IL-1b e TNF. Interessantemente

a transcrição de TSP-1 também é inibida por proto-oncogenes como c-fos, c-

jun, v-src, Ras e myc.

31

Estes dados são extremamente interessantes quando correlacionados

com doenças como as aplasias medulares (SMDhipo e AAS). Tanto em AAS

como em SMD é relatado o aumento da expressão de TNF por células da

medula óssea.

A possibilidade de que na medula óssea TSP-1 se ligue a integrinas

mediando sinalizações entre o estroma medular e a célula-tronco

hematopoética sugere um possível papel para esta molécula nas alterações

das vias de sinalização importantes para a manutenção da medula óssea.

32

22 -- OOBBJJEETTIIVVOO

Objetivo principal

Identificar marcadores que auxiliem no diagnóstico diferencial entre

Síndrome Mielodisplásica hipoplástica (SMDhipo) e Anemia Aplástica

Severa (AAS) .

Objetivos secundários

Estudar a expressão de moléculas de adesão como e integrina

em cortes de biópsia de pacientes diagnosticados com SMDhipo e

AAS

Estudar a expressão da molécula de matriz extracelular

trombospondina em cortes de biópsias de pacientes diagnosticados

com SMDhipo e AAS

Estudar o nível de apoptose em cortes de biópsias de pacientes

diagnosticados com SMDhipo e AAS

Estudar a expressão gênica diferencial entre pacientes com SMDhipo,

AAS e doadores de medula óssea saudáveis.

33

33 -- MMEETTOODDOOLLOOGGIIAA

3.1 - Critérios de inclusão de pacientes

As análises foram realizadas em amostras provenientes de pacientes

e doadores do Centro de Transplante de Medula Óssea (CEMO) do Instituto

Nacional do Câncer (INCA). Os paciente selecionados para o estudo

constavam no Sistema de Gestão do CEMO (SGC) e apresentavam quadro

de aplasia medular, tendo sido diagnosticado como Anemia Aplástica Severa

ou Síndrome Mielodisplásica hipocelular.

Para os ensaios de imunohistoquímica foi realizada uma análise

retrospectiva dos pacientes no SGC. Somente os pacientes que tinham

diagnóstico citogenético confirmado tiveram seus blocos de parafina de

medula óssea analisados.

As amostras “frescas” dos pacientes com SMDhipo e AAS, bem como

amostras de doador de medula óssea para transplante foram provenientes

do Centro de Transplante de Medula Óssea – CEMO, do Instituto Nacional

do Câncer, no Rio de Janeiro. Os dados clínicos e laboratoriais foram

obtidos do SGC e da Intranet/INCA. Os dois pacientes externos vieram do

Hospital Amaral Carvalho, de Jaú.

Todos os pacientes foram notificados e assinaram o termo de

consentimento para doação de material biológico para pesquisa.

As análises citogenéticas foram realizadas pelo Laboratório de

Citogenética do CEMO, e a avaliação clínica foi realizada pela equipe

médica do mesmo.

34

3.2 - Detecção de moléculas de adesão e de matriz

extracelular por imunohistoquímica em corte histológico de

medula óssea

A detecção das integrinas 5 e 1 e da trombospondina foi realizada

utilizando-se o VECTASTAIN Elite ABC kit® (Vector Laboratories, Inc.), e

seguiu os procedimentos recomendados pelo fabricante.

3.2.1 - Preparação da amostra

Os blocos de parafina contendo biópsias de medula óssea foram

cortados em micrótomo em fatias com espessura de 4,0 m e aderidos a

lâminas tratadas previamente com 1% de gelatina 0,05% de alúmen de

cromo. Resumidamente as lâminas foram lavadas em água com detergente,

em água destilada e em etanol 70% e foram postas para secar. Um grama

de gelatina foi dissolvido em 100 mL de água bi-destilada previamente

aquecida a 50oC, com adição posterior de 0,05 g de alúmen de cromo. Essa

solução foi aplicada duas vezes sobre as lâminas que em seguida foram

postas para secar.

Para a desparafinização, as lâminas com os cortes de medula óssea

foram aquecidas a 60oC em estufa seca, lavadas duas vezes em xylol por 15

min, rehidratadas por banhos de 5 min em etanol a 100, 95, 90 e 80% e, por

fim, lavadas duas vezes com PBS e colocadas para secar. As lâminas foram

tratadas com proteinase K (20 g/mL) durante 15 min, lavadas e

permeabilizadas em gelo.

35

3.2.2 - Detecção das moléculas de adesão

As lâminas foram postas em uma solução de peróxido de hidrogênio a

0,3% em água, ficaram 20 min em temperatura ambiente e posteriormente

foram lavadas com PBS e incubadas com SBF (soro bovino fetal) 5%

durante 20 min. Lavadas com PBS, as lâminas foram incubadas com

anticorpo monoclonal primário em PBS - anti-integrina 5 humana (clone II A

1, BD/PharMingen) em diluição 1:20, anti-integrina 1 humana (clone MAR4,

BD/PharMingen) em diluição 1:20 e anti-trombospondina em diluição 1:100

(clone TSP-B7, Sigma) por uma noite em câmara úmida. No dia seguinte, as

lâminas foram lavadas com PBS e incubadas com uma solução com

anticorpo secundário biotinilado anti-camundongo (1:100), incubadas por 1 h

e lavadas com PBS durante 1 h. Trinta minutos antes de terminar a lavagem,

foi preparada uma solução AB do kit Vector, com 5,0 L da solução A em 1,0

mL de PBS e 5,0 L de solução B. As lâminas foram deixadas em incubação

por mais meia hora, lavadas 2 vezes com PBS por 5 min e reveladas com

diaminobenzeno (DAB) por 5 min. Após a interrupção da reação com PBS,

as lâminas foram contracoradas com corante de Giemsa, lavadas com água,

secas e montadas com bálsamo do Canadá para análise em microscópio

ótico (Olympus). O controle negativo foi feito sem o anticorpo primário.

A avaliação da expressão levou em conta a intensidade da expressão

e a representatividade das células expressando a molécula.

36

3.3 - Detecção de apoptose por TUNEL em cortes

histológicos de medula óssea

A presença de apoptose foi verificada utilizando-se a técnica de

TUNEL (Terminal dUTP Nick End Labeling), com o auxílio do kit de detecção

de morte celular in situ (In situ cell death detection kit AP® - Boehringer

Mannhein). Neste kit a transferase desoxinucleotidil transferase terminal

(TdT) cataliza a polimerização de nucleotídeos para extremidades 3´-OH

DNA livre, de uma forma molde-independente, sendo utilizada para marcar

as fitas de DNA quebradas. A fluoresceína incorporada é detectada em

microscópio de fluorescência ou pelo anticorpo anti-fluoresceína conjugado

com fosfatase alcalina e coloração pelo método de Giemsa.

3.3.1 - Preparação da amostra

Para detecção de apoptose, o preparo das lâminas foi realizado como

descrito no tópico anterior, com a aderência de cortes de 4m do bloco de

parafina contendo medula óssea às lâminas tratadas com 1% de gelatina,

0,05% de alúmen de cromo. Depois de montados os cortes foram, então,

desparafinizados.

Para o preparo da solução TUNEL, 50 L da solução 1 contendo a

enzima deoxinucleotidil terminal transferase foram adicionados ao recipiente

da solução marcadora (solução 2), contendo 550 L de uma mistura de

nucleotídeos em solução tampão. Foram aplicados 20 L por lâmina.

37

Cobertas por lamínulas, as lâminas foram deixadas em uma câmara

úmida durante 60 min a 37oC e, posteriormente, lavadas com PBS e

contracoradas com Giemsa.

3.3.2 - Detecção de apoptose

A análise foi realizada em microscópio ótico com fluorescência. Foram

interpretadas como células positivas àquelas marcadas que se mostraram

fluorescentes quando analisadas em microscópio de fluorescência. Para o

controle negativo foram utilizadas 50 L da solução marcadora sem

transferase terminal.

38

3.4 - Análise da expressão gênica diferencial usando a

técnica de Differential Display

3.4.1 - Separação de células de medula óssea

Para a obtenção de células mononucleares de medula óssea, as

amostras dos aspirados medulares em seringa heparinizada dos doadores e

pacientes foram diluídas e submetidas a uma centrifugação em gradiente de

densidade Ficoll-Hypaque PLUS®® (GE/Amersham Biosciences) na

proporção de 1:1 a 2.000 rpm, por 30 min, a temperatura ambiente.

O concentrado de células localizado na interface plasma-sangue foi

transferido para um novo tubo e lavado com 4 volumes de solução de PBS

tratada com DEPC. Depois foi submetido à nova centrifugação e seu

sobrenadante foi descartado. O concentrado de células foi então submetido

à extração de RNA.

3.4.2 - Isolamento de RNAm

O RNAm das células mononucleares do aspirado de medula óssea foi

extraído de acordo com o QuickPrep mRNA Purification Kit®

(GE/Amersham/Pharmacia Biotech). Resumidamente, o concentrado de

células foi ressuspendido em 0,4 mL de tampão de extração (solução

aquosa de guanidina tiocianato e N-lauril sarcosina) e 0,8 mL de tampão de

eluição (10mM Tris-HCl pH 7,5; 1mM EDTA). Após centrifugação a 12.000xg

por 1 min, o homogenato claro foi transferido para outro tubo, contendo 1,0

mL de oligo dT celulose (25 mg/mL). A solução contendo o RNA e o oligo dT

foi homogeneizada por 3 min. Após centrifugação o sobrenadante foi

39

descartado e com o pellet foram feitas 5 lavagens com uma solução de alta

concentração salina (10mM Tris-HCl pH 7,5; 1mM EDTA; 0,5 M NaCl),

seguida de mais 3 lavagens com solução de baixa concentração salina

(10mM Tris-HCl pH 7,5; 1mM EDTA; 0,1 M NaCl). O pellet de oligo com o

RNAm foi ressuspenso com 0,5 mL da solução salina de baixa

concentração, lavado 3 vezes em coluna de Microspin e eluído com 0,2 mL

de tampão de eluição (10mM Tris-HCl pH 7,5; 1mM EDTA) previamente

aquecido a 65oC, por duas vezes. A solução de RNAm obtida foi precipitada

com 10 L de Glicogênio (Invitrogen - 10 mg/mL), 40 L de Acetato de

Potássio (2,5 M pH 5,0) e 1,0 mL de etanol 100% e acondicionada a –80oC.

3.4.3 - Transcrição reversa e amplificação por PCR

Para todas as reações de PCR neste projeto foi usada o

Thermocycler Omn-e (Hybaid). Nesta máquina faz-se necessário o uso de

óleo mineral no mesmo volume da reação final sobre a reação, para que a

mesma não evapore e se mantenha da temperatura desejada. Todos os

procedimentos a seguir relacionados com preparação de reação de PCR

foram procedidos no gelo.

O RNA foi centrifugado a 12.000 xg e ressuspenso em 100 L de

H2O mQ/DEPC. Para a verificação da integridade do RNA, amplificamos as

amostras por RT-PCR para G3PDH (gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase),

um gene que está expresso constitutivamente na célula eucariótica e,

portanto, atesta a integridade do material. Utilizamos o kit SuperScrit One-

Step RT-PCR System® (Invitrogen).

40

Iniciador senso 5´- TCC ACC ACC CTG TTG CTG TAG – 3´

Iniciador anti-senso 5´- GAC CAC AGT CCA TGA CAT CAC C – 3´

Resumidamente aproximadamente 100 ng de RNAm foram

amplificados em um volume final de reação de 50 L, contendo 25 L de

tampão 2X Reaction Mix (0,4 mM de cada dNTP; 2,4 mM MgSO4), 100

pMoles de cada iniciador de G3PDH e 0,5 L de SuperScript II RT/Taq Mix.

A reação consistiu de 1 ciclo de 30 min a 50oC e 2 min a 94oC, onde a

síntese de cDNA e a pré desnaturação foram feitas; 40 ciclos de: 30 seg a

94oC, 30 seg a 59oC e 1 min a 72oC, para amplificação; 1 ciclo de: 30 seg a

94oC, 30 seg a 59oC e 10 min a 72oC, para extensão final.

3.4.4 - Análise dos produtos de PCR

Os produtos do PCR foram resolvidos em um gel de agarose a 1,5%

em TAE 1X, corado com brometo de etídio (0,5 g/mL). Foi utilizado como

padrão de peso molecular o padrão 100pb (Invitrogen®).

3.4.5 – Differential Display

Para a análise dos transcritos diferencialmente expressos foi utilizado

o kit RNAimage (GenHunter Corp®) para Differential Display (RT-DD). O RT-

DD é baseado em um PCR competitivo de baixa estringência que utiliza

pares de iniciadores que amplificam os terminais 3´ dos RNAs mensageiros.

A técnica resumidamente consistiu em retro-transcrever os RNAm com

iniciadores com cauda poliT (H-T11n), seguido de um PCR radioativo de

baixa estringência na presença de iniciadores menores que os primeiros (H-

41

APn), os quais possuiam sequências randômicas. O PCR foi feito com baixa

estringência para que os RNAs mensageiros diferencialmente expressos

fossem amplificados, gerando fragmentos de tamanhos diferentes que foram

separados em gel de poliacrilamida 6% desnaturante. Após ser retirado da

cuba, o gel foi secado a vácuo e exposto por no mínimo 24 h. O filme e o gel

possuíam buracos marcadores, pois após a revelação do primeiro filme o gel

foi re-exposto a um segundo autoradiograma, e a esse ficou preso depois de

revelado, pois serviu de molde para a retirada dos fragmentos de interesse.

Estes foram fervidos, centrifugados e precipitados, e depois foram

novamente amplificados, seqüenciados e identificados como descrito nos

ítens a seguir.

As combinações utilizadas

neste trabalho foram :

INICIADORES RANDÔMICOS

H-AP2 (5´ - AAGCTTCGACTGT - 3´)

H-AP3 (5´ - AAGCTTTGGTCAG – 3´)

H-AP6 (5´ - AAGCTTGCACCAT – 3´)

H-AP7 (5´ - AAGCTTAACGAGG - 3´)

H-AP8 (5´ - AAGCTTTTACCGC - 3´)

INICIADORES DE ANCORAGEM

H-T11A (5´ - AAGCTTTTTTTTTTTA – 3´)

H-T11C (5´ - AAGCTTTTTTTTTTTC – 3´)

H-T11G (5´ - AAGCTTTTTTTTTTTG – 3´)

H-T11A

H-AP2

H-AP6

H-AP7

H-AP8

H-T11C

H-AP2

H-AP6H-AP6

H-T11G

H-AP2

H-AP3H-T11A

H-AP2

H-AP6

H-AP7

H-AP8

H-T11A

H-AP2

H-AP6

H-AP7

H-AP8

H-T11C

H-AP2

H-AP6

H-T11C

H-AP2

H-AP6H-AP6

H-T11G

H-AP2

H-AP3

H-AP6

H-T11G

H-AP2

H-AP3

42

3.4.5.1 - Transcrição e amplificação radioativa

Os RNAs foram transcritos em cDNA utilizando iniciadores contendo

oligo dT (que ancoram na cauda poliA dos RNAm). Os cDNAs dos doadores

foram misturados, gerando um pool de fragmentos. Com isso tentamos

diminuir o polimorfismo intrínseco a cada indivíduo.

Como descrito no kit, na transcrição reversa aproximadamente 200 ng

dos RNAm originais das amostras foram acrescidos a uma solução contendo

4,0 L de tampão 5X RT buffer (125 mM Tris-HCl pH 8,3; 188 mM KCl; 7,5

mM MgCl2 e 25 mM DTT), 1,6 L do dNTP mix (250 M) e 2,0 L do

iniciador de ancoragem correspondente (H-T11n; 2 M na solução estoque),

completando com dH2O para 19 L.

A reação consistiu de 5 min à 65oC, 60 min à 37oC, 5 min à 75oC e

depois deixar à 4oC. Na temperatura de 37 oC, após 10 min parou-se o

termociclador e adicionou-se 1,0 L da enzima MMLV transcriptase reversa,

para depois continuar a seqüência de incubação.

Os RNAm dos pacientes e doadores foram transcritos reversamente

utilizando-se os iniciadores de ancoragem específicos para que as

populações de cDNA fossem subdivididas, aumentando assim a

possibilidade de combinações a serem feitas com os iniciadores aleatórios

durante o PCR radioativo e a identificação do maior número possível de

transcritos.

No PCR com marcação radioativa 2,0 L dos cDNA originados da

reação anterior foram amplificados em uma solução contendo 2,0 L de

tampão 10X PCR buffer (100 mM Tris-HCl pH 8,4; 500 mM KCl; 15 mM

MgCl2 e 0,01% de gelatina), 1,6 L do dNTP mix (25M), 2,0 L do iniciador

43

de ancoragem da reação anterior (2,0 M na solução estoque) e 2,0 L do

iniciador randômico de interesse (H-APn , 2,0 M na solução estoque), 0,5

L de -[32P] dCTP (1 mCi/mmole; 10% de decaimento) e 0,3 L de

Platinum Taq DNA Polymerase® (Invitrogen) e H2O mQ para o volume final

de 20 L.

A reação consistiu de 40 ciclos de: 30 seg à 94oC, 2 min à 40oC e 30

seg à 72oC, seguidos de 5 min à 72oC e repouso a 4oC. As amostras ficaram

guardadas a –20oC por 12 h.

3.4.5.2 - Eletroforese e recuperação dos fragmentos de interesse

Para a eletroforese foi usado o sistema de Eletroforese Modelo S2, da

Gibco BRL®, de acordo com as instruções do RNAimage®. As placas de

vidro foram previamente lavadas com detergente e a menor foi siliconizada

com dimetil diclorosilano, na capela. Depois de montado o sistema, um gel

de poliacrilamida 6% desnaturante (60 mL de solução de sequenciamento –

145 g Uréia 7M, 52,2 ml Bis-acrilamida 40% e 35 mL de tampão TBE 10X

para 350 mL de H2O destilada - , 60 L de TEMED e 300 L de persulfato de

amônia 10% (APS)) foi feito. Após sua polimerização, foi verificada ausência

de bolhas no gel e realizou-se uma pré-corrida por aproximadamente 30 min

em tampão TBE 0,5X (estoque em 10X: 108 g de Trizma base, 55 g de ácido

bórico e 3,7 g de EDTA, para 1L), aplicando-se 3 L de “tampão de corrida”

(95% formamida; 10 mM EDTA pH 8,0; 0,09% de xyleno-cianol FF; 0,09%

de bromofenol blue) alterando os espaços. Com isso, a placa e o gel foram

aquecidos, e também foram verificados possíveis vazamentos entre os

espaços.

44

Cerca de 3,5 L dos produtos de PCR radioativo foram acrescidos de

2,0 L do “tampão de corrida” e aquecidos à 80oC por 2 min. Esta mistura foi

aplicada no gel, agrupada por combinação, e a eletroforese ocorreu a 1500V

por 2:30 h, até o corante de xyleno-cianol alcançar o final da placa.

Depois de retirada do sistema e aguardar até alcançar a temperatura

ambiente, a placa menor foi removida e papel 3M foi colocado sobre o gel.

Depois de pressionado contra o papel, o gel aderiu ao mesmo e foi retirado

da placa, envolvido com plástico próprio e seco a vácuo à 80oC por 2 h sem

fixação.

O gel, juntamente com filme radiográfico KODAK X-OMAT, foi

posicionado em um cassete, em câmara escura. O gel e o filme foram

furados para localizar espacialmente os fragmentos gerados e expostos por

pelo menos 24 h. Após esse período o filme foi revelado e re-exposto,

novamente com os furos.

3.4.5.3 - Recuperação dos fragmentos de interesse

Os 125 fragmentos diferencialmente expressos que nos interessaram

foram cortados do sistema filme/gel, colocados em microtubos de 1,5 mL,

acrescidos de 100 L de H2O mQ por 24 h. Após esse período (quando o

cDNA já havia soltado do gel/papel) os tubos contendo os pedaços de gel

foram furados na tampa, fervidos por 15 min, centrifugados a 12.000 xg e

seu sobrenadante precipitados com 4,5 L de glicogênio (Invitrogen;

10mg/mL), 30 L de acetato de sódio (3,0 M pH 5,3) e 1,2 mL de etanol

100% e acondicionados à 70oC.

45

3.4.5.4 - Re-amplificação dos fragmentos selecionados

Com o objetivo de aumentar a “massa” de cDNA e verificar o tamanho

dos fragmentos, estes foram re-amplificados. Os tubos com os cDNA

precipitados foram centrifugados a 12.000 xg, a 4oC, por 20 min. O

sobrenadante foi descartado e o pellet foi ressuspenso em 10 L de H2O

mQ. Para reamplificação de 4,0 L do cDNA recuperado foram adicionados

4,0 L de tampão 10X PCR buffer (100 mM Tris-HCl pH 8,4; 500 mM KCl; 15

mM MgCl2 e 0,01% de gelatina), 3,2 L do dNTP mix (250 M), 4,0 L do

iniciador de ancoragem (2,0 M na solução estoque) e 4,0 L do iniciador

randômico correspondente (H-APn , 2,0 uM na solução estoque), 0,5 L de

Platinum Taq DNA Polymerase® (Invitrogen) e H2O mQ para o volume final

de 40 L. A reação de PCR foi a mesma do DD, sendo 40 ciclos de: 30 seg

à 94oC, 2 min à 40oC e 30 seg à 72oC, seguidos de 5 min à 72oC e repouso

a 4oC.

3.4.5.5 - Seqüenciamento dos fragmentos re-amplificados

Após a confirmação da re-amplificação com a visualização em gel de

agarose 1,5%, os fragmentos foram seqüenciados diretamente com o kit

DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencig Kit for MEGABACE DNA

Analysis Systems® (Amersham Biosciences). Esse kit contém

dideoxinucleotídeos marcados com corantes fluorescentes para detecção

automática. As quatro terminações – ddG, ddA, ddT e ddC – são marcadas

com 2 corantes – fluoresceína e uma das quatro diferentes rodaminas

(rhodamine 110, rhodamine-6-G, tetramethyl rhodamine e rhodamine X). Um

premix contendo os dideoxinucleotídeos, a enzima Thermo Sequenase II

46

DNA polymerase e tampão foi adicionado ao cDNA de interesse e ao

iniciador correspondente. A reação de PCR foi modificada para 40oC na

temperatura de anelamento, de acordo com o PCR radioativo do DD.

Para a reação de sequenciamento automático foi utilizada uma placa

de 96 poços, específica para o aparelho MEGABACE. A reação consistiu de

4,0 L do premix, 2,5 L do produto de PCR re-amplificado, 2,5 L do

iniciador de ancoragem (H-T11n; 2 M) e 1,0 L de H2O mQ. A ciclagem do

PCR foi de 30 ciclos: 20 seg à 95oC, 15 seg a 40oC e 60 seg a 60oC, e

repouso a 4oC.

Após a reação de sequenciamento as amostras foram precipitadas

segundo instruções do fabricante: adicionou-se 1,0 L de acetato de amônia

(7,5 M) e 27,5 L de etanol absoluto, a placa foi agitada em vórtex e a

mesma foi centrifugada por 30 min, a 2250 xg, 4oC. Após o descarte do

sobrenadante adicionou-se 150 L de etanol 70% e centrifugou-se 10 min,

2250 xg, 4oC. Descartou-se novamente o sobrenadante e foi realizada uma

rápida centrifugação com a placa invertida e sem o lacre, para a retirada

completa do etanol. Após esse passo, a placa secou a temperatura ambiente

e adicionou-se 10 L de tampão de corrida (70% formamida, 1mM EDTA),

foi agitada em vórtex e após uma rápida centrifugação (somente para baixar

a solução ao fundo da placa) a placa foi mantida ao abrigo da luz e a -20oC

até o uso.

O seqüenciamento dos fragmentos reamplificados foi realizado no

Laboratório de Metabolismo Macromolecular, no Instituto de Biofísica Carlos

Chagas Filho (IBCCF/UFRJ).

47

3.4.6 - Análise das seqüências geradas

As seqüências geradas foram pesquisadas em diversos bancos de

dados para sua identificação e correlação com a doença.

O banco de dados genômicos virtual utilizado foi GeneBank, e a

ferramenta de busca foi o BLAST (Basic Location Alignment Search Tool),

do NCBI (National Center for Biotechnology Information);

www.ncbi.nlm.nih.gov.

48

44 -- RREESSUULLTTAADDOOSS

Neste trabalho tivemos como objetivo principal identificar marcadores

moleculares que auxiliem na diferenciação de SMD hipoplástica de AAS.

Para isto inicialmente seriam analisados, em um número elevado de

pacientes com estas doenças, diferentes aspectos moleculares das células

afetadas. No entanto, devido à raridade das duas entidades estas análises

tiveram de ser em grande parte realizadas retrospectivamente.

Assim sendo, este trabalho foi realizado em duas partes. A primeira

consistiu de uma análise retrospectiva da expressão das integrinas 5 e 1

e da molécula de matriz extracelular trombospondina. Também foram

realizados ensaios de TUNEL para detecção de apoptose nestas amostras.

Para tanto, quinze pacientes foram selecionados, sendo sete pacientes com

SMDhipo e oito com AAS. Na segunda parte as células de medula óssea

dos pacientes internados durante o período de tese foram analisadas para

identificação de genes diferencialmente expressos em ambas as doenças,

sendo dois pacientes com SMDhipo e dois com AAS.

Os resultados obtidos nestas análises são descritos a seguir.

49

4.1 - Estudo retrospectivo da expressão das moléculas de

adesão 5 integrina e 1 integrina e da molécula de matriz

extracelular trombospondina em biópsias de medula óssea

por imunohistoquímica

Quinze biópsias de medula óssea dos pacientes incluídas em parafina

foram cortadas em cortes finos (4,0 m) e processadas de acordo com a

metodologia descrita para os ensaios de imunohistoquímica. Como controle

negativo foi utilizada uma medula óssea obtida de paciente com linfoma o

qual não mostrou infiltração da doença na medula óssea.

4.1.1 - Características morfológicas e citogenéticas dos pacientes em análise

Os pacientes analisados neste estudo compreenderam 8 indivíduos

com AAS e 7 com SMD hipocelular, com mediana de idade de 35 anos e

prevalência do sexo feminino. Como podemos verificar na tabela 6, os

pacientes com AAS apresentaram cariótipo normal em 5 casos. O paciente

1302665 possuía um marcador, que se verificou ser constitutivo, e 2

pacientes apresentaram alteração cromossômica, sendo uma del(12)(p13) e

outra del(6)(q21). Estes casos foram considerados AAS pela sua morfologia.

Dentre os pacientes com SMD três apresentaram anormalidades

cromossômicas, sendo dois com uma del(17p) e um com uma del(7p).

Os dados morfológicos da biópsia de medula óssea mostram que nos

pacientes com AAS a celularidade ficou abaixo de 20%, enquanto os

pacientes com SMD hipocelular mostraram celularidade de 30% a 80%.

51

Com estas amostras foram então realizados os experimentos para detecção

por imunohistoquímica para 5 integrina, 1 integrina e trombospondina.

4.1.2 – Padrão de expressão de 5 integrina em biópsias de medula óssea

Sobre os cortes de biópsia de medula óssea dos pacientes

selecionados foram realizados ensaios de imunohistoquímica utilizando o

anticorpo monoclonal para integrina humana (clone IIA1,

BD/PharMingen).

Na figura 6 temos a marcação sobre a amostra controle. Esta figura

representa a região central (trabecular) da medula óssea, na qual 80% das

células apresentaram marcação moderada para integrina. Na região

paratrabecular (região mais externa da medula) foi observada uma

marcação mais intensa (foto não mostrada). Tendo em vista que nesta

região localizam-se as células progenitoras mais imaturas, a maior

intensidade de marcação é compatível com o descrito na literatura.

O corte de medula óssea do paciente 1173567, que tem SMD, está

fragmentado, mas é possível notar sua hipocelularidade, com alguns

agregados celulares e infiltrado de hemácias (não mostrado). A marcação

para 5 integrina é observada com intensidade moderada, como é possível

notar na figura 7.

Na figura 8 podemos observar a marcação na medula óssea do

paciente 1395226, com SMD. A biópsia apresenta células com marcação

intensa para 5 integrina em aproximadamente 50% delas. Apresenta

também quantidade considerável de adipócitos e não apresenta fibras.

52

A medula óssea do paciente 1393552, que tem SMD, é altamente

hipocelular, com aproximadamente 70% de tecido adiposo. Os grupos

celulares presentes apresentam forte marcação para 5 integrina, como

pode ser observado na figura 9.

A medula óssea do paciente 1394440, com diagnóstico de SMD, tem

aproximadamente 60% da sua área preenchida por tecido adiposo. A

marcação para 5 integrina está presente em cerca de 40% das células, de

forma intensa, predominantemente na região paratrabecular. A figura 10

mostra marcação na região trabecular.

A medula óssea do paciente 1410146, com SMD, apresenta várias

regiões preenchidas por adipócitos e baixa celularidade, concentrada em

grupos. A marcação para 5 integrina está fraca e presente em menos de

10% das células (setas indicando células marcadas no campo da figura 11).

A medula óssea do paciente 1410139, que tem SMD, apresenta

grande quantidade de adipócitos e hipocelularidade marcante. Na figura 12

observamos a marcação para 5 integrina, que apresenta-se moderada, em

aproximadamente 70% das células.

A medula óssea do paciente 1417933, que foi diagnosticado com

SMD, tem aparência densa e fibrótica. Este caso é de difícil diagnóstico,

tendo em vista a baixa celularidade e aumento de fibras. No entanto a

presença de micromegacariócito na biópsia indica uma SMD. O ensaio de

imunohistoquímica apresentou marcação moderada para 5 integrina em

aproximadamente 90% de fibras e em pelo menos 60% das células

presentes na região paratrabecular (figura 13), enquanto que na região

trabecular menos de 30% das células apresentam marcação.

53

A biópsia da medula óssea do paciente 1302665, que tem AAS,

apresentou escasso fragmento constituído de tecido adiposo e trabéculas

ósseas, com raras células. A marcação para 5 integrina apresentou-se

moderada em fibras, e de fraca a moderada nas poucas células presentes,

como pode ser visto na figura 14.

O paciente 1286882, que foi diagnosticado com AAS, apresentou

biópsia de medula óssea com 5% de celularidade e fragmentada. A

marcação para 5 integrina mostrou-se moderada na região trabecular e

intensa em fibras principalmente na região paratrabecular (detalhe na figura

15).

O paciente 1320360, diagnosticado com AAS, apresentou medula

óssea altamente hipocelular (menos de 10%), com grande quantidade de

adipócitos e marcação para 5 integrina moderada em 20 a 30% das células

(figura 16) .

A biópsia de medula óssea do paciente 1314885, com AAS,

apresentou-se praticamente sem células, com apresentação fibrocelular e

infiltrado hemorrágico. A marcação para 5 integrina mostrou-se intensa nas

fibras presentes, como pode ser observado no detalhe na figura 17.

A medula óssea do paciente externo 7163, diagnosticado com AAS,

estava quase que totalmente preenchida por adipócitos, com raras células. A

marcação para 5 integrina estava de fraca a moderada nas raríssimas

células e nas gotas de gordura, como podemos notar na figura 18.


apresentou-se com baixíssima celularidade (menos de 10%), com células

maduras e raras células com marcação de fraca a moderada para 5

54

integrina (figura 19). Marcação fraca a moderada também em torno das

gotas de gordura.

A medula óssea do paciente 1390384, com AAS, mostrou-se

altamente hipocelular e com abundante tecido adiposo; marcação para 5

integrina de fraca a moderada em 60% das células presentes, evidenciado

na figura 20.



adipócitos e marcação para 5 integrina fraca em menos de 10% das

células (detalhe de célula marcada na figura 21) .

Estes resultados estão resumidos na tabela 7, a seguir.

64

44..11..33 –– PPaaddrrããoo ddee eexxpprreessssããoo ddee iinntteeggrriinnaa eemm bbiióóppssiiaass ddee mmeedduullaa

óósssseeaa



anticorpo monoclonal para integrina humana (clone MAR4,

BD/PharMingen).

A medula óssea do paciente usado como controle apresentou

marcação moderada a forte para 1 integrina em praticamente 100% das

células na região paratrabecular, e em 40% das células na região trabecular.

A figura 22 mostra um detalhe da região paratrabecular.

A medula óssea do paciente 1173567, diagnosticado com SMD,

apresentou baixa celularidade em agregados, com marcação forte para 1

integrina em 60% das células presentes, como pode ser observado na figura

23.

Na figura 24 observamos a medula óssea do paciente 1395226, com

SMD. Ela apresentou marcação de moderada a intensa para 1 integrina em

aproximadamente 60% das células.

Na figura 25 podemos observar a medula óssea do paciente 1393552,

que tem SMD e apresentou grande quantidade de adipócitos e baixa

celularidade. A marcação para 1 integrina apresentou-se moderada em

cerca de 60% das células, principalmente na região paratrabecular.


mostrou-se densa e repleta de adipócitos. A marcação para 1 integrina foi

mais intensa em fibras e células da região paratrabecular (figura 26),

65

enquanto que na região trabecular a marcação mostrou-se de moderada a

intensa em 40% das células.


apresentou marcação para 1 integrina de moderada a forte em 40% das

células, como pode ser visto na figura 27.

A medula óssea do paciente 1410139, com SMD, apresentou

marcação de fraca a moderada para 1 integrina, em 10 a 20% das células

(figura 28).


marcação moderada em aproximadamente 40% das células e nas fibras,

como pode ser observado na figura 29.

A medula óssea do paciente 1302665, diagnosticado com AAS,

apresentou marcação moderada a intensa em 80% das células e em fibras

presentes, como mostrado na figura 30.

A medula óssea do paciente 1286882, que tem AAS, apresentou

marcação de moderada a intensa para 1 integrina nas poucas células

presentes e em 70% das fibras (detalhe na figura 31).


marcação para 1 integrina moderada em 40% das células presentes (figura

32) e principalmente em fibras.

A medula óssea do paciente 1314885, com diagnóstico de AAS,

praticamente acelular e com infiltrado de hemácias, apresentou marcação

para 1 integrina forte somente nas fibras presentes (detalhe na figura 33).

A medula óssea do paciente externo 7163, diagnosticada com AAS,

apresentou marcação para 1 integrina fraca a moderada em adipócitos, e

66

raríssimas células, principalmente na região paratrabecular, como observado

na figura 34.

A medula óssea do paciente externo 5930, diagnosticada com AAS,

apresentou marcação para 1 integrina fraca em adipócitos e em raras

células maduras, como podemos notar na figura 35.


marcação moderada a intensa para 1 integrina em 50% das células

(detalhe na figura 36).


marcação moderada para 1 integrina em 40% das células (detalhe na figura

37 com seta apontando para células marcadas).

Os resultados acima estão resumidos na tabela 8.

76

4.1.4 – Padrão de expressão de trombospondina em biópsias de medula

óssea



anticorpo monoclonal para trombospondina humana (clone TSP-B7, Sigma).

A medula óssea do controle apresentou intensa marcação para

trombospondina, principalmente em fibras na região paratrabecular, mas

também apresentando marcação em 40% das células da região trabecular.

Na figura 38 detalhe de marcação em células da região paratrabecular.


marcação para trombospondina intensa em fibras e células (detalhe na

figura 39). Marcação em 60% das células presentes.

Na figura 40 observamos a medula óssea do paciente 1395226,

diagnosticado como SMD, que apresentou forte marcação para

trombospondina em aproximadamente 70% das células.

A medula óssea do paciente 1393552, diagnosticado como SMD,

apresentou marcação forte para trombospondina em cerca de 80% das

células, principalmente na região paratrabecular (detalhe da marcação na

região trabecular na figura 41).

Na figura 42 observamos a medula óssea do paciente 1394440, que

tem SMD e apresentou marcação para trombospondina moderada a forte em

40% das células, principalmente na região trabecular.

Na figura 43 vemos que a medula óssea do paciente 1410146, que

tem SMD, está fortemente marcada para trombospondina em 50% das

células.

77


mostrou marcação fraca para trombospondina em aproximadamente 20%

das células (maduras) como pode ser observado no detalhe da figura 44.

A figura 45 mostra a medula óssea do paciente 1417933, que possui

SMD, e apresentou marcação para trombospondina intensa em 40% das

fibras e de moderada a intensa em 60% das células. A marcação está

concentrada na região paratrabecular.


marcação para trombospondina de moderada a intensa em 80% das células

e 90% das fibras, como pode ser observado na figura 46.


mostrou marcação presente em 80% das células com intensidade moderada

a forte e em 100% das fibras (figura 47).

O paciente 1320360, que tem AAS, apresentou forte marcação para

trombospondina em toda o corte da medula óssea, como podemos notar na

figura 48.


apresentou marcação intensa em 100% das fibras presentes, como visto na

figura 49.


apresentou marcação para trombospondina em adipócitos de forma

moderada, como pode ser observado na figura 50.


apresentou marcação para trombospondina forte em adipócitos,

78

principalmente na região paratrabecular, como podemos observar na figura

51.


diagnosticado com AAS, a qual apresentou forte marcação para

trombospondina em 80% das células presentes e em 100% das fibras.


diagnosticado com AAS, a qual apresentou marcação de fraca a moderada

para trombospondina em 10% das células.

Estes resultados estão sumarizados na tabela 9, a seguir.

88

4.2 - Detecção de apoptose por TUNEL em cortes

histológicos de medula óssea de pacientes com Anemia

Aplástica Severa e Síndrome Mielodisplásica hipocelular

Os cortes de biópsia de medula óssea dos pacientes selecionados

foram também utilizados em experimentos de detecção de apoptose por

TUNEL (In situ cell death detection kit AP® - Boehringer Mannhein).

Na figura 54 temos a marcação sobre a amostra controle. Em (A) está

representada a região paratrabecular da medula óssea, na qual 20% das

células apresentaram marcação indicando apoptose (setas pretas). Na

região trabecular (B) foi observada uma marcação aleatória em algumas

células.

O corte de medula óssea do paciente 1173567, que foi diagnosticado

com tendo uma SMD, está fragmentado, mas é possível notar que há uma

marcação pronunciada em 60% das células (B), principalmente na região

paratrabecular (A), como pode ser observado na figura 55.

Na figura 56 podemos observar a marcação na medula óssea do

paciente 1395226, com SMD, que apresenta quantidade considerável de

adipócitos. A biópsia apresenta de 10 a 20% de células com marcação para

apoptose.

A medula óssea do paciente 1393552, que tem SMD, é altamente

hipocelular, com aproximadamente 70% de tecido adiposo. Os grupos

celulares presentes apresentam marcação para apoptose (aproximadamente

40% das células) como pode ser observado na figura 57 (A e B).

89

A medula óssea do paciente 1394440, diagnosticado como SMD, tem

aproximadamente 60% da sua área preenchida por tecido adiposo. A

marcação para apoptose está presente em cerca de 60% das células, de

forma intensa, predominantemente na região trabecular (Figura 58, A e B).

A medula óssea do paciente 1410146, com SMD, apresenta várias

regiões preenchidas por adipócitos e baixa celularidade, concentrada em

grupos. A marcação está presente em 10% das células (figura 59) Em (A)

observamos que mesmo na coloração com GIEMSA é possível notar células

sem marcação em núcleo (em apoptose). Em (B) a mesma é observada com

fluroescência (seta).

A medula óssea do paciente 1410139, que tem SMD, apresenta

grande quantidade de adipócitos e hipocelularidade marcante. Na figura 60

observamos a marcação em menos de 10% das células (seta; coloração

com Giemsa em A e C).

A medula óssea do paciente 1417933, que foi diagnosticado como

SMD, tem aparência densa e fibrótica. O ensaio para detecção de apoptose

apresentou marcação intensa em pelo menos 60% das células (figura 61).

A biópsia da medula óssea do paciente 1302665, que tem AAS,

apresentou escasso fragmento constituído de tecido adiposo e trabéculas

ósseas, com raras células. A marcação apresentou-se em aproximadamente

40% das células. A marcação pode ser observada nas setas da figura 62.

O paciente 1286882, que foi diagnosticado com AAS, apresentou

biópsia de medula óssea com 5% de celularidade e fragmentada. A

marcação estava presente em praticamente todas as células

hematopoéticas (detalhe nas setas da figura 63).

90



adipócitos e marcação presente em praticamente todas as células

hematopoéticas (figura 64).

Na biópsia de medula óssea do paciente 1314885, com AAS,

mostrada na figura 65, foi observada marcação para apoptose, presente em

praticamente todas as células hematopoéticas.


estava quase que totalmente preenchida por adipócitos, com raras células

na região paratrabecular. Um intenso background foi evidenciado por toda a

lâmina, sugerindo que toda a região era anteriormente preenchida por

células hematopoéticas. A marcação típica para apoptose apresentou-se

somente na célula indicada pela seta (figura 66).


apresentou-se com baixíssima celularidade (menos de 10%), com células

maduras. O mesmo tipo de background pôde ser observado. Não houve

marcação típica para apoptose a não ser pela célula indicada pela seta

(figura 67).

A medula óssea do paciente 1390384, com AAS, mostrou-se

altamente hipocelular e com abundante tecido adiposo. Não houve

marcação para apoptose a não ser por raras células evidenciadas pelas

setas em lilás (figura 68).



91

adipócitos e marcação para apoptose em aproximadamente 60% das células

presentes (figura 69).

Estes resultados estão resumidos na tabela 10, a seguir.

Os resultados obtidos na detecção da expressão das moléculas de

adesão integrina, integrina e da proteína de MEC trombospondina por

imunohistoquímica sugerem que a expressão da integrina está

aumentada em cortes de biópsias de pacientes com SMDhipo e diminuída

em pacientes com AAS, em relação ao controle. Já as expressões de

integrina e de trombospondina são mostraram variações significativas

sugestivas de expressão diferencial entre pacientes com AAS e SMDhipo.

A detecção da apoptose nos cortes de biópsias de pacientes com

SMDhipo apresentou-se mais baixa que resultados anteriores do nosso

grupo em SMD normocelular e hipercelular. Já a análise nos cortes de

pacientes com AAS sugere que nestes a apoptose está elevada em relação

ao controle e e relação à SMDhipo.

Estes dados indicam que a interação entre células progenitoras

hematopoéticas e o estroma medular está preservado em SMDhipo, levando

assim à uma baixa taxa de apoptose.

93

A B

Figura 54: corte histológico de biópsia de medula óssea do controle. Detecção de

apoptose por TUNEL. Em (A) aumento de 20X; em (B) aumento de 100X.

10 m20 m

Figura 55: corte histológico de biópsia de medula óssea do paciente 1173567,

diagnosticado com SMD. Detecção de apoptose por TUNEL. Em (A) aumento de 20X;

em (B) aumento de 40X.

A B20 m 20 m

94


diagnosticado com SMD. Detecção de apoptose por TUNEL. Aumento de 20X.


diagnosticado com SMD. Detecção de apoptose por TUNEL. Em (A) e (B) aumento de

20X;setas destacando células com marcação para apoptose.

20 m

20 m 20 mA B

95




A B20 m 20 m


diagnosticado com SMD. Detecção de apoptose por TUNEL. Em (A) aumento de 20X

e coloração com GIEMSA, em (B) aumento de 20X com fluorescência;setas

destacando células com marcação para apoptose.

A B20 m 20 m

96

C D20 m 20 m


diagnosticado com SMD. Detecção de apoptose por TUNEL. Em (A) e (C) coloração

com GIEMSA e aumento de 40X e 20X, respectivamente; em (B) e (D) campo com

fluorescência e aumento de 40X e 20X, respectivamente;setas destacando células

com marcação para apoptose.

A B 20 m20 m

97




A B20 m 20 m


diagnosticado com AAS. Detecção de apoptose por TUNEL. Em (A) aumento de 20X



A B20 m 20 m

98


diagnosticado com AAS. Detecção de apoptose por TUNEL. Em (A) coloração com

GIEMSA e aumento de 20X; em (B) campo com fluorescência e aumento de


A 20 m

B20 m

99





A B20 m 20 m

20 m


diagnosticado com AAS. Detecção de apoptose por TUNEL. Aumento de 20X.

100

Figura 66: corte histológico de biópsia de medula óssea do paciente extra 7163,




A B20 m 20 m

Figura 67: corte histológico de biópsia de medula óssea do paciente extra 5930,




A B 20 m20 m

101


diagnosticado com AAS. Detecção de apoptose por TUNEL. Aumento de 20X;setas



diagnosticado com AAS. Detecção de apoptose por TUNEL. Aumento de 20X;setas


20 m

20 m

102

4.3 - Análise da expressão gênica diferencial entre células

mononucleares de medula óssea de pacientes com Anemia

Aplástica Severa, Síndrome Mielodisplásica hipocelular e

indivíduos normais

Foram coletadas células mononucleares de aspirados de medula

óssea de pacientes diagnosticados com AAS e SMDhipo e de doadores

saudáveis de medula óssea para TMO. Com a finalidade de procurar genes

diferencialmente expressos nestas células entre os pacientes selecionados e

entre eles e doadores saudáveis utilizamos a técnica de Differential Display.

Nesta abordagem fragmentos de cDNA que são diferencialmente expressos

em células de diferentes indivíduos são recuperados, seqüenciados e

identificados. Este é um ensaio no qual podemos identificar genes já

conhecidos, mas que também pode nos revelar genes que ainda não foram

identificados quanto a sua função.

Para tanto, os aspirados de medula óssea de doadores e pacientes

foram processados como descrito na metodologia. As células

mononucleares foram separadas com gradiente de FICOLL, lavadas e

submetidas à extração de RNAm com o Quick Prep mRNA Purification kit®.

Os RNAm dos pacientes selecionados (2 com AAS - PC1 e PC2, e 2

com SMDhipo – PC3 e PC4, e 3 doadores saudáveis) foram previamente

quantificados e testados para a expressão do gene constitutivo G3PDH,

como descrito na metodologia.

Os produtos de PCR foram resolvidos em um gel de agarose 1,5%

corado com brometo de etídio (0,5 g/mL). O tamanho do fragmento

103

esperado correspondente a G3PDH é de 500 pb, presente em todas as

amostras, como pode ser observado no exemplo mostrado na figura abaixo.

Figura 70: Análise de fragmentos de PCR amplificados para G3PDH em

gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídio (0,5L/mL). hind:

padrão de peso molecular; PC1 – paciente externo 5930; PC2 – paciente

externo 7163; PC3 – paciente 1414607; PC4 – paciente 1417933.

Tendo verificado a integridade dos RNAm estes foram utilizados no

ensaio de DD utilizando o kit da GenHunter. Para este ensaio foram

utilizadas as seguintes combinações de iniciadores: H-T11A com H-AP2, H-

AP6, H-AP7 e H-AP8, H-T11C com H-AP2 e H-AP6 e H-T11G com H-AP2, H-

AP3 e H-AP6, conforme descrito na metodologia.

Os produtos de PCR obtidos foram então resolvidos em géis de

poliacrilamida 6% desnaturante e estes foram, após secagem, expostos a

autoradiografias. Os resultados desses géis podem ser vistos na figura 71.

104

H-T11C / H-AP2

PC 1 PC 2 PC 3 PC 4 DO

12

13

14

15

8

9

10

11

16

17

H-T11A / H-AP2


6

7

2

3

4

1

5

Figura 71: autoradiograma do gel de poliacrilamida 6%

desnaturante, da análise de DD, com a combinaçãoH-T11A/H-

AP2.PC1-paciente extra 5930-AAS;PC2-paciente extra 7163–

AAS;PC3-paciente 1414607–SMDh;PC4-paciente 1417933–

SMDh;DO-pool de doadores


desnaturante, da análise de DD, com a combinaçãoH-T11C/H-




H-T11C / H-AP2


12

13

14

15

8

9

10

11

16

17

H-T11C / H-AP2


12

13

14

15

8

9

10

11

16

17

H-T11A / H-AP2


6

7

2

3

4

1

5

H-T11A / H-AP2


6

7

2

3

4

1

5











105

H-T11G / H-AP2


21

18

19

20

27

2829

23

30

31

24

25

22

26


H-T11A / H-AP2


desnaturante, da análise de DD, com a combinaçãoH-T11G/H-









H-T11G / H-AP2


21

18

19

20

27

2829

23

30

31

24

25

22

26


H-T11A / H-AP2











106

33

35

35

32

34


H-T11A / H-AP6

38

40

41

46

42

39

37

43

44

45

H-T11A / H-AP7












33

35

35

32

34


H-T11A / H-AP6

33

35

35

32

34


H-T11A / H-AP6

38

40

41

46

42

39

37

43

44

45

H-T11A / H-AP7


38

40

41

46

42

39

37

43

44

45

H-T11A / H-AP7












107

50

54

51

55

52

5356

47

49

48

57

58

59

60

62

61

H-T11A / H-AP8


77

78

63

76

64

75

74

65

66

67

68

69

70

72

73

H-T11C / H-AP6












50

54

51

55

52

5356

47

49

48

57

58

59

60

62

61

H-T11A / H-AP8


50

54

51

55

52

5356

47

49

48

57

58

59

60

62

61

H-T11A / H-AP8


77

78

63

76

64

75

74

65

66

67

68

69

70

72

73

H-T11C / H-AP6


77

78

63

76

64

75

74

65

66

67

68

69

70

72

73

H-T11C / H-AP6












108

93

80

83

92

79

125

87

86

82

124

89

90

91

88

8184

122

85

H-T11G / H-AP2


98

107

108

99

100

93

109

110

111

112

116

115

94

95

101

113

11496

102

103

123

104

10597

H-T11G / H-AP3












93

80

83

92

79

125

87

86

82

124

89

90

91

88

8184

122

85

H-T11G / H-AP2


93

80

83

92

79

125

87

86

82

124

89

90

91

88

8184

122

85

H-T11G / H-AP2


98

107

108

99

100

93

109

110

111

112

116

115

94

95

101

113

11496

102

103

123

104

10597

H-T11G / H-AP3


98

107

108

99

100

93

109

110

111

112

116

115

94

95

101

113

11496

102

103

123

104

10597

H-T11G / H-AP3












109

116

115

117

118

119

120

121

H-T11G / H-AP6







116

115

117

118

119

120

121

H-T11G / H-AP6


116

115

117

118

119

120

121

H-T11G / H-AP6







110

Nestes autoradiogramas foram identificados 120 fragmentos de

cDNA diferencialmente expressos. Destes foi possível recuperar 95

fragmentos, como pode ser observado na figura 80, os quais 68 foram

seqüenciados com sucesso. A reamplificação é necessária para confirmação

do tamanho do fragmento em relação ao gel de poliacrilamida e para

aumento da “massa” do cDNA para posterior sequenciamento. O

seqüenciamento e análise das seqüências resultantes mostraram que alguns

destes cDNAs foram detectados em somente uma das amostras de

pacientes, sugerindo possíveis polimorfismos. Outros cDNAs foram

detectados somente no pool de doadores, sugerindo a perda de expressão

possivelmente devido às doenças. Finalmente, alguns cDNA se mostraram

expressos diferencialmente entre os vários pacientes e o pool de doadores.

A tabela 11 mostra em que amostras cada um dos cDNA diferencialmente

expressos se mostrou mais intenso.

Figura 80: Análise de amplificação de cDNAS identificados por DD e recuperados, em gel

de agarose com TAE a 1,5% corado com brometo de etídio (etídio (0,5L/mL). (A) 1-padrão

de peso molecular de 100pb; 2-frag.108(320pb); 3-frag.109(310pb); 4-frag.110(300pb); 5-

frag.111(300pb); 6-frag.112(300pb); 7-frag.113(230pb); 8-frag.114(200pb); 9-frag.115(não

amplificado); 10-frag.122(400pb); 11-frag.123(180pb). (B) 1-padrão de peso molecular de

100pb; 2-frag.49(180pb); 3-frag.50(não amplificado); 4-frag.51(400pb); 5-frag.52(300pb); 6-

frag.53(180pb); 7-frag.54(180pb); 8-frag.55(não amplificado); 9-frag.56(300pb); 10-

frag.57(200pb); 11-frag.58(200pb); 12-frag.59(200pb); 13-frag.60(180pb); 14-frag.51(120pb).

111

Na busca de marcadores capazes de diferenciar as duas doenças

identificamos quais cDNAs eram expressos nas amostras de PC1 e PC2

(AAS) e quais eram expressos nas amostras de PC3 e PC4 (SMDh). Como

podemos ver na tabela 11 poucos transcritos foram identificados nesta

categoria. Por outro lado, transcritos expressos em alguns pacientes e no

pool de doadores puderam ser identificados assim como transcritos comuns

a um paciente com AAS e outro com SMDh. Os transcritos expressos pelas

diferentes combinações de pacientes e doadores estão descritos nas tabelas

12, 13 e 14.

116

55 –– DDIISSCCUUSSSSÃÃOO

O objetivo deste trabalho foi identificar marcadores que auxiliem no

diagnóstico diferencial entre a Síndrome Mielodisplásica hipoplásica

(SMDhipo) e a Anemia Aplástica Severa (AAS). Estas duas entidades

clínicas podem muitas vezes apresentar quadros semelhantes de aplasia

medular que dificultam o diagnóstico diferencial.

Sendo a SMD uma doença considerada pré-neoplásica, um dos

critérios de diferenciação entre as duas entidades tem sido o da clonalidade.

Portanto a identificação de alterações cromossômicas clonais sugere um

diagnóstico de SMD. Entretanto, sendo as duas entidades relacionadas a

uma baixa celularidade medular e a uma baixa taxa de proliferação celular, a

obtenção de mitoses para análise citogenética pode representar um

problema na definição do diagnóstico. Além disso, alguns casos com

morfologia típica de AA demonstraram ser doenças clonais por estudos de

inativação do cromossomo X (Melenhorst e col, 1996).

Outra característica bastante utilizada na diferenciação das duas

entidades é a presença de displasia multilinhagem encontrada nas SMD. Da

mesma forma a baixa celularidade muitas vezes mascara este critério de

diferenciação, e também focos com células hematopoéticas displásicas (hot

pockets) já foram descritos em AA (Kansu e col, 1976).

Por outro lado, as SMDhipo raramente têm sido estudadas em suas

características biológicas como uma entidade separada. Portanto os critérios

utilizados para as SMDhipo são os convencionados para as SMD de forma

117

geral. Isto faz com que cresça a importância do estudo da biologia

especificamente deste subtipo.

As SMDhipo são em geral encontradas nos subtipos iniciais da

doença como AR e ARSA, mas foram também descritas em pacientes com

RAEB ou RAEB-t. Nestes subtipos iniciais da doença a presença de uma

anormalidade cromossômica varia de 10 a 20%, dependendo do número de

pacientes analisados e os critérios de escolha. Nestas séries as alterações

mais freqüentemente encontradas são a deleção do braço longo do

cromossomo 5 [del(5q)], a perda do cromossomo Y, rearranjos envolvendo a

11q23 e a deleção do braço curto do cromossomo 17 [del (17p)].

Em nosso estudo dos sete pacientes com SMDhipo três apresentaram

alterações cromossômicas, sendo a del(17p) encontrada em 2 pacientes e a

del(7p) em outro. Por outro lado, dos oito pacientes com AAS, um mostrou

um cromossomo marcador que não foi identificado. Sendo constatada sua

presença em células somáticas normais, foi sugerido que este marcador seja

constitutiva. Dois outros pacientes apresentaram del(12p) e del(6q),

respectivamente.

Apesar da série analisada ser muito pequena é sugestiva a

porcentagem de alterações cromossômicas encontrada. Estudos envolvendo

um número maior de pacientes de forma consecutiva devem ser realizados

para que a porcentagem de alterações cromossômicas em SMDhipo e AAS

seja estabelecida.

É importante ressaltar que os diagnósticos de SMDhipo ou AAS não

foram efetuados somente pela presença de alteração cromossômica clonal,

118

mas levaram em consideração outros critérios como celularidade, displasias

e curso clínico.

Neste sentido, é interessante ver que os pacientes diagnosticados

com SMD apresentam celularidade de 30 a 80% enquanto os com AAS

apresentaram celularidade menor que 20%, e que as dismorfias estavam

sempre presentes nos pacientes com SMD e ausentes nos pacientes com

AA. Isto ocorreu por termos selecionado somente os pacientes com AAS, de

modo a não sobrepormos as duas entidades.

Estes aspectos podem ser bem evidenciados nos experimentos de

imunohistoquímica, nos quais as diferenças morfológicas entre as diferentes

biópsias ficam bem evidenciadas.

Uma situação interessante foi a da biópsia do paciente 1417933

(figura 13). Este paciente apresentou na biópsia regiões onde a arquitetura

da medula óssea estava completamente destruída, com raras células

espalhadas. Outras poucas regiões mostram uma arquitetura normal

hipocelular, com um aumento de adipócitos. O diagnóstico de SMDhipo só

foi conferido pelo achado de um micromegacariócito (dismorfia). Portanto

este caso exemplifica bem a dificuldade de diagnóstico entre as duas

entidades.

A comparação entre as várias biópsias selecionadas para este estudo

mostra que estágios avançados de AAS perdem completamente a estrutura

medular, apresentando-se cheios de fibras com poucas células espalhadas.

Por outro lado, as biópsias de SMDhipo apresentam um aumento de

adipócitos, mas sem perda da estrutura medular. Isto representa uma

situação ideal para o estudo a que nos propusemos, tendo em vista que

119

pudemos separar as duas entidades por critérios já existentes para

podermos definir outros marcadores a serem testados posteriormente em

situações não tão bem caracterizadas.

Adesão e proliferação

Na proliferação e maturação que ocorre na hematopoese normal, as

células do estroma medular têm papel fundamental, seja pela produção de

fatores difusíveis que regulam a hematopoese, seja através das interações

celulares entre progenitores hematopoéticos e o estroma.

Estas interações ocorrem entre moléculas de adesão posicionadas na

membrana das células, como integrinas, e moléculas de matriz extracelular,

como fibronectina e trombospondina. Vários têm sido os relatos de alterção

de integrinas em aplasias e mielodisplasias. Kaito e col (2003) verificaram

que pacientes com AA apresentaram níveis mais elevados de expressão de

(CD49d) e (CD49e) nas células CD34+ que em controles normais.

Após uma terapia imunossupressiva os mesmos pacientes mostraram níveis

normais destas moléculas de adesão, após recuperação imunológica. Por

outro lado, Delforge e col (2005) reportaram a redução da expressão de

em células CD34+ de pacientes com SMD.

Tendo em vista estes relatos, nós analisamos em cortes finos de

biópsia de medula óssea dos pacientes selecionados a expressão das

integrinas e . Esta análise, realizada com metodologia diferente das

apresentadas acima, não restringiu a análise às células CD34+ , mas tentou

ter uma análise completa da medula que, como dito anteriormente, pode

120

apresentar variações consideráveis em sua estrutura dependendo do

compartimento focalizado.

A expressão da integrina foi variável no indivíduo controle, sendo

de fraca a moderada na região trabecular e restrita a membrana da célula,

enquanto na região paratrabecular esta expressão se mostrou mais forte e

tomando todo o citoplasma da célula. Em relação a esta expressão as

biópsias de medula óssea dos pacientes diagnosticados com SMDhipo

apresentaram um nível elevado de expressão de integrina, exceto pelo

paciente 1410146, que apresentou níveis quase nulos desta expressão.

De forma geral a região paratrabecular apresentou uma expressão

maior que a região trabecular, o que estaria de acordo com a expressão

mais elevada em precursores hematopoéticos mais imaturos. A marcação na

região trabecular foi mais intensa em eritroblastos, sendo freqüentemente

visualizadas em adesões focais na membrana.

Quando comparamos a expressão de integrina nos cortes de

biópsias de pacientes com AAS, foi possível verificar que o nível de

expressão é menor, apesar do pequeno número de células que pudemos

avaliar.

A expressão de também mostrou estar associada na maioria dos

casos a membrana das células. Em dois dos oito pacientes praticamente

não foi possível detectar a expressão em células hematopoéticas,

dificultando uma conclusão final sobre a expressão de em AAS. No

entanto, nossos resultados são sugestivos de que exista uma diferença na

expressão de integrina nas duas entidades, sendo que em SMDhipo

existe uma ativação da expressão e em AAS existe uma inibição.

121

Na análise da expressão de integrina a não ser nos dois casos de

AAS em que não foi possível detectar sua expressão em células

hematopoéticas, não houve diferenças marcantes entre os níveis de

expressão em SMDhipo e em AAS em relação ao controle. Em todas as

amostras analisadas a expressão de mostrou-se de moderada a forte.

Assim sendo, nossos resultados sugerem que proteína está

superexpressa em SMDhipo e inibido em AAS, uma vez que a molécula

funcional necessita que haja uma heterodimerização entre as unidades e

. Estes resultados estão em contradição com a literatura. Se pensarmos

que estes foram obtidos por citometria de fluxo analisando somente a

população de células CD34+ ainda assim os dados estariam discordantes.

Nas SMDhipo há um aumento evidente de na região paratrabecular, onde

estão localizados os precursores CD34+ , portanto mesmo se analisarmos a

expressão somente nessas células ainda assim teríamos um aumento de

em SMDhipo.

As conclusões em relação as AAS são um pouco mais difíceis, pois

as biópsias analisadas têm sua estrutura bastante alterada e com um

número de células hematopoéticas baixo. Algumas biópsias, como as dos

pacientes 1320360 (figura 16) e 1390384 (figura 20) são mais ilustrativas,

pois apesar das alterações estruturais, a medula ainda mostra sua

arquitetura preservada e o número de células é razoável. Nestes dois casos

uma análise mais focalizada mostra uma expressão de integrina

moderada e restrita à membrana das células o que confirmaria a sugestão

de que em AAS a expressão de ou é normal ou está diminuída podendo

122

chegar a praticamente zero em casos como a do paciente 7163, que apesar

de ter células hematopoéticas não apresenta expressão de integrina.

Levando-se em consideração que a interação - matriz

extracelular acontece com fibronectina ou trombospondina, e que a

importância da fibronectina na montagem da membrana basal e sua

regulação com o acoplamento e desacoplamento celular já estão bem

caracterizados, nós resolvemos nos deter na análise de expressão da

trombospondina (TSP1). Neste caso, levamos em consideração resultados

anteriores de nosso grupo que haviam detectado um aumento de expressão

de TSP1 em biópsias de pacientes com SMD hipercelular ou normocelular

(Souza, J.M., 2003). Também Borojevic e col (2004) sugerem que TSP1

esteja superexpressa no estroma medular de crianças com RAEBt.

A análise da expressão de TSP1 em nossa coorte de pacientes

sugere que TSP1 tenha um alto nível de expressão em todos os casos

analisados, inclusive o controle. Portanto TSP1 não pode ser considerado

um marcador diferencial.

Interessantemente uma forte marcação para TSP1 foi detectada em

fibras, especialmente nos cortes de pacientes com AAS. Se esta marcação é

um artefato ou se tem um fundo biológico.

É sabido que TSP1 é altamente expresso em megacariócitos e

plaquetas, tendo um papel importante na agregação plaquetária. Isto nos

leva a perguntar se o padrão fibrilar marcado nas biópsias de AAS poderiam

ser restos de megacariócitos e de plaquetas mortos por apoptose.

123

Apoptose

A apoptose tem sido descrita como um mecanismo fisiológico em

SMD, no qual o organismo tenta se livrar de células do clone maligno. Esse

processo de intensa apoptose intramedular tem sido bem, documentado em

SMD e explica porque apesar da medula óssea ser em geral normocelular

ou hipercelular, no sangue periférico citopenias são encontradas (Parker e

col, 2000). Alguns autores já demonstraram que a inibição desta apoptose

se correlaciona à superexpressão de bcl2 e evolução da doença.

Várias citocinas já foram relacionadas à regulação da apoptose

medular em SMD. Kitagawa e col (1997) e Stifter e col (2005) demonstraram

que pacientes com SMD apresentam superexpressão de TNF em

macrófagos e precursores eritróides.

TNF e seus receptores são conhecidos por regular várias

sinalizações em células hematopoéticas (Rusten e col, 1995). Em particular

TNF regula duas atividades antagônicas: um efeito destrutivo e um efeito

protetor. A sinalização citotóxica envolve a interação do death domain e

caspases, levando à apoptose, enquanto que o efeito protetor envolve a

ativação de fatores de transcrição entre eles NF-B.

Também Fas e FasL estão superexpressos em células

hematopoéticas e em macrófagos de pacientes com SMD, provavelmente

ativados por TNF. A óxido nítrico sintase (iNOS) também é superexpressa

em macrófagos medulares dos mesmo pacientes com SMD (Gupta e col,

1999; Kitagawa, 1999). Portanto a indução da apoptose em SMD parece ser

um processo complexo que pode se valer de várias vias de sinalização.

124

Estes mecanismos, como dissemos anteriormente, foram estudados

em SMD, principalmente normocelular ou hipercelular, com poucas

referências específicas à SMDhipo. Por outro lado, vários trabalhos discutem

o papel da apoptose em AA.

Em AA o aumento da apoptose de progenitores na medula óssea tem

sido relacionado a uma superexpressão de citocinas inibitórias (Philpott e

col, 1995; Callera & Falcão, 1997). Neste caso a apoptose não parece ser

um mecanismo fisiológico, mas sim o resultado de uma agressão por células

T ativadas que produzem IFN e TNF (Welsh e col, 2004).

Recentemente Dubey e col (2005) demonstraram que além de um

aumento da secreção de IFN e TNF no plasma medular, em AAS pode-se

observar um aumento intracelular de IFN em células CD3+ da medula.

Kasahara e col (2002) também reportaram que a expressão dos receptores

de TNF estava aumentada em progenitores CD34+ da medula óssea de

pacientes com AA, e que esta expressão poderia ser utilizada na

diferenciação de SMDhipo e AAS.

Nas nossas análises investigamos através da técnica de TUNEL a

apoptose intramedular nos 7 pacientes com SMDhipo e nos 8 pacientes com

AAS utilizando cortes finos de biópsias de medula óssea. Nossos dados

confirmaram resultados anteriores de nosso grupo, que indicavam baixa taxa

de apoptose em pacientes com SMDhipo (Souza, J.M., 2003). Enquanto os

pacientes com SMDhipo apresentaram baixos níveis de apoptose medular,

os pacientes com AAS mostraram altíssimas taxas de apoptose,

confirmando os dados da literatura.

125

Estes achados estão de acordo com Kasahara e col (2002), que

mostrou um aumento de TNFR1 e TNFR2 em células CD34+ de pacientes

com AAS em relação aos com SMDhipo.

Portanto apesar da secreção de TNF estar aumentada nos dois tipos

de pacientes, somente em AAS as células-tronco são sensíveis a esta

sinalização, que irá inibir a hematopoese. Nossos resultados parecem

indicar que além de inibir a hematopoese esta sensibilização também de

alguma forma induz a apoptose. Como esta sinalização se processa, se a

via de Fas está implicada e como a sinalização de TNF interage com a via

do IFN são questões em aberto que necessitam ainda ser investigadas.

Tem sido relatado na literatura que tanto TNF como IFN e a

ativação células T induzem a expressão de moléculas de adesão (Welsh e

col, 2004). Tanto em SMDhipo como em AAS estas situações existem,

portanto nos dois casos deveríamos encontrar um aumento na expressão de

integrinas. No caso de SMDhipo é o que verificamos, sendo possível que o

aumento de integrina encontrado nesta entidade seja devido ao aumento

da secreção de TNF pelo estroma medular. No entanto, este aumento de

, que em princípio deveria levar a uma maior adesão das células

hematopoéticas ao estroma não está bem documentada em SMDhipo.

Como o receptor de TNF (TNFR) está superexpresso em SMD do tipo

AR, mas esta expressão diminui em subtipos mais agressivos da doença, é

esperado que em AR as células hematopoéticas sejam sensíveis a

sinalização de TNF. Isto é o que ocorre provavelmente nas SMDhipo (nas

AR).

126

Portanto é possível que em SMDhipo o acoplamento

estroma/progenitores hematopoéticos ocorra normalmente ao contrário do

que ocorre em SMD normocelular ou hipercelular (Aizawa e col, 1999). Isto

de certa forma explicaria o baixo nível de apoptose encontrado nas

SMDhipo.

Por outro lado a falta de estroma medular é visível em AAS em todas

as biópsias analisadas. Este fato e a baixa expressão de em biópsias

dos pacientes com AAS sugerem um baixo acoplamento estroma/progenitor

e portanto altos níveis de apoptose como encontrado em nossas análises.

Expressão Gênica Diferencial

Apesar das dificuldades encontradas ao longo deste trabalho,

principalmente ao que diz respeito às amostras para análise, foi possível

durante o período de tese obter algumas amostras “frescas” de SMDhipo e

AAS. Com estas amostras realizamos uma análise de expressão gênica

diferencial utilizando a técnica de RT-DD, com o objetivo de identificar novos

biomarcadores.

Nesta análise 125 fragmentos de cDNA foram identificados como

sendo diferencialmente expressos. Vários destes cDNA foram expressos em

somente uma das amostras constituindo prováveis polimorfismos de

expressão (tabela 13). Fragmentos de cDNA comuns a dois ou três

pacientes também foram identificados (tabelas 14 e 15), e finalmente alguns

fragmentos de cDNA estavam presentes em todos os pacientes e ausente

do pool de indivíduos controle enquanto alguns cDNA estavam presentes

127

somente no pool de doadores. As amostras PC1 e PC2 são referente a

pacientes com AAS, enquanto as PC3 e PC4 são SMDhipo.

É interessante notar que a amostra PC4 foi a que apresentou um

padrão mais parecido com o do pool de doadores de medula. Este paciente

é o de no 1417933, que foi o paciente com análise morfológica na biópsia de

medula óssea com SMD mais próximo de AAS.

Tendo em vista que estávamos buscando marcadores diferenciais

entre AAS e SMDhipo os fragmentos de cDNA que interessavam eram os

presentes exclusivamente em cada grupo estudado, ou seja, somente em

doadores, ou somente em pacientes com AAS ou exclusivamente em

pacientes com SMDhipo.

Em doadores foram identificados 6 cDNA únicos sendo 4 anotados

nos bancos de dado do genoma humano. O único que nos chama a atenção

é a perda de expressão de um gene homólogo ao MLL (mixed lineage

leukemia), localizado no cromossomo 10. O gene MLL foi identificado

primeiramente em LLA da infância com a t(4;11). Este gene está alterado em

uma série de neoplasias, onde tem um papel preponderante na regulação da

hematopoese.

Em SMD, alterações envolvendo a região 11q23 (MLL) são

freqüentes. No entanto, até o momento nenhum relato do envolvimento

deste outro gene homólogo ao MLL localizado no cromossomo 10 foi feito. A

perda de expressão de um gene como o MLL pode ser tão deletéria como

sua expressão aumentada ou alterada.

Alguns cDNA foram expressos somente nos pacientes PC3/PC4, que

tinham SMDhipo. O gene CAPON (C-terminal PDZ domain ligand of

128

neuronal nitric oxide synthase) pode ter um papel importante na SMDhipo,

uma vez que em SMD a óxido nítrico sintase tem sido descrita como

superexpressa nos macrófagos da medula óssea e parece ter um papel

importante de sinalização para a apoptose. Como nas SMDhipo a apoptose

apresentou-se bem menor ao que é esperado para os subtipos iniciais da

doença, é possível que isto se deva a uma superexpressão de CAPON, que

se ligaria à óxido nítrico sintase, inibindo a sinalização para apoptose.

Outro gene interessante superexpresso em SMDhipo é o LHX9(LIM

homeobox 9). Sendo um gene com domínio LIM, pode ser um regulador

transcricional de vários outros genes, inibindo-os ou ativando-os. Uma

análise em um número maior de amostras de SMDhipo poderá confirmar a

superexpressão destes dois genes que poderiam servir de biomarcadores.

No entanto, a função que estes genes realizam nas células normais e o

papel que esta superexpressão tem na doença terão que ser profundamente

investigados.

Poucos foram os cDNA superexpressos somente em PC1/PC2/DO e

somente um foi superexpresso somente em PC1/PC2. Infelizmente este

cDNA não pode ser seqüenciado. Dos encontrados em PC1/PC2/DO dois

cDNA chamam a atenção. Um é um transcrito variante de um vírus e o outro

um transcrito para proteína ligante de fibronectina. A presença de um

transcrito viral é curiosa no pool de doadores, mas seria de grande interesse

se estivesse presente somente nos pacientes com AAS. Neste caso a

sugestão de uma causa viral para a doença seria razoável. No entanto a

presença deste transcrito no doador invalida esta hipótese.

129

Interessantemente seis transcritos foram identificados nas quatro

amostras estando ausente no pool de doadores. Entre estes seis transcritos

se destacam o gene Pax5 (paired box gene 5), o gene FANCC (Fanconi

anemia complementation group C), e um gene homólogo ao Rb

(Retinoblastoma; Rb-like1). Todos os três genes têm grande possibilidade de

ter um papel importante nas duas doenças.

Este resultado é compatível com a hipótese de que em algum

momento do curso das duas doenças elas têm mecanismos comuns.

Os resultados encontrados neste trabalho são ainda muito

preliminares. No entanto foi possível verificar que em biópsias de medula

óssea pode-se distinguir as duas entidades, levando-se em conta não só os

achados morfológicos como também o nível de expressão de 5 integrina

detectado por imunohistoquímica. Também a apoptose por TUNEL pode ser

utilizada na diferenciação das duas doenças. Os dois marcadores em

conjunto devem ser capazes de diferenciar com certa acuracidade as duas

doenças.

Além disso, novos biomarcadores foram evidenciados no estudo de

expressão gênica diferencial e deverão ser testados num número maior de

pacientes.

É interessante notar que todos os potenciais marcadores de

diferenciação identificados são fatores de transcrição envolvidos nos

processos de proliferação, diferenciação, reparo e apoptose, processos

esses de certa forma implicados na origem das duas doenças.

130

66 -- CCOONNCCLLUUSSÕÕEESS

A expressão de 5 integrina parece estar aumentada em SMDhipo e

diminuída em AAS, em relação ao controle.

A expressão de 1 integrina não mostrou variação significativa entre

as doenças e o controle.

A expressão de trombospondina se mostrou uniforme em todas as

amostras analisadas.

A apoptose mostrou-se reduzida em SMDhipo em relação à SMD

hipercelular, enquanto a apoptose em AAS se mostrou elevada.

Estes dados são compatíveis com a hipótese de que a interação entre

células progenitoras hematopoéticas e o estroma na SMDhipo está

preservada, levando a uma baixa taxa de apoptose.

Foram encontrados possíveis biomarcadores diferenciais entre

doadores e pacientes com aplasia como um homólogo ao MLL

(somente em doador), Pax 5, FANCC e RB-like1 (em todos os

pacientes), e CAPON (presente em SMDhipo e ausente em AAS).

131

77 -- RREEFFEERRÊÊNNCCIIAASS

ADAMS, J.C. & LAWLER, The thrombospondins. Int J Biochem Cell Biol. 36(6):961-

8, 2004.

AIZAWA, S.; NAANO, M.; IWASE, O.; YAGUCHI, M.; HIRAMOTO, M.; HOSHI, H et

al. Bone marrow stroma from refractory anemia of myelodysplastic syndrome is

defective in its ability to support normal CD34-positive cell proliferation and

differentiation in vitro. Leuk Res 23: 239-46, 1999.

ALBERTS, B.; BRAY, D.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WATSON, J.D..

Renewal by Pluripotent Stem Cells: Blood Cell Formation. In: The Molecular Biology

of the Cell. Garland Publishing, Inc. NY & London, 2a ed., p. 1161-75, 1994.

ALTER, B.P.; POTTER, N.U.; LI, F.P. Classification and aetiology of the aplastic

anemias. Clin Haematol 7(3): 431-65, 1978.

ANJOS, A.R.; ALVARES-SILVA, M.; BORELLI, P..Matriz Extracelular e Leucemia.

Rev. Bras. Hematol. Hemoter. 22(3):404-12, 2000.

ASANO, H.; HOTTA, T.; ICHIHARA, M.; MURATE, T.; KABAYASHI, M.; SAITO, H.

Growth analysis of marrow CD34-positive hematopoietic progenitor cells in patients

with myelodysplastic syndromes. Leukemia 8: 833-8, 1994.

AUL, C.; BOWEN, D.T.; YOSHIDA, Y.. Pathogenesis, etiology and epidemiology of

myelodysplastic syndromes. Haematologica, 83:71-86, 1998.

132

BAGBY, G.C.; LIPTON, J.M.; SLOAND, E.M.; SCHIFFER, C.A.. Marrow failure.

Hematology (Am Soc Hematol Educ Program): 318-36, 2004.

BARRET, J.; SAUNTHARARAJAH, Y.; MOLLDREM, J.. Myelodysplastic sydrome

and aplstic anemia: distinct entities or diseases linked by a common

pathophisiology? Seminars in Hematology 37:15-29, 2000.

BENNET, J.M.; CATOVSKY, D.; DANIEL, M.T.; FLANDRIN, G; GALTON, D.A.G.;

GRALNICK, H.R & SULTAN, C.. The French-American British (FAB) Co-operative

Group. Proposals for the Classification of the Myelodysplastic Syndrome. Br J

Haematol 51: 189-99, 1982.

BOROJEVIC, R.; ROELA, R.A.; RODARTE, R.S.; THIAGO, L.S.; PASINI, F. S.;

CONTI, F. M.; ROSSI, M.I.D.; REIS, L.F.L.; LOPES, L.F.; BRENTANI, M. M.. Bone

marrow stroma in childhood myelodysplastic syndrome: composition, ability to

sustain hematopoiesis in vitro, and altered gene expression. Leuk Res 28 (8): 831-

844, 2004.

CALLERA, F. & FALCÃO,R.. Increased apoptotic cells in bone marrow biopsies

from patients with aplastic anemia. Br J. Haem. 98: 18-20, 1997.

CHESON, B.D.; BENNETT, J.M.; KANTARJIAN, H.; PINTO, A.; SCHIFFER, C.A.;

NIMER, S.D.; LOWENBERG, B.; BERAN, M., de WITTE, T.M., STONE, R.M.,

MITTELMAN, M; SANZ, G.F.; WIJERMANS, P.W.; GORE, S.; GREENBERG, P.L..

World Health Organization (WHO) international working group. Report of an

international working group to standardize response criteria for myelodysplastic

syndromes. Blood 96(12):3671-4, 2000.

133

COUTINHO, L.H.; GEARY, C.G.; CHANG, J.; HARRISON, C.; TESTA, N.G..

Functional studies of bone marrow haemopoietic and stromal cells in the

myelodysplastic syndrome (MDS). Br J Haematol 75(1):16-25, 1990.

DALTON, S.L.; MARCANTONIO, E.E.; ASSOIAN, R.K.. Cell attachment controls

fibronectin and alpha 5 beta 1 integrin levels in fibroblasts. Implications for

anchorage-dependent and -independent growth. J Biol Chem. 267(12):8186-91,

1992.

DELFORGE,M.; RAETS, V.; VAN DUPPEN, V.; VANDENBERGHE, P.;

BOOGAERTS, M.. CD34+ marrow progenitors from MDS patients with high levels of

intramedullary apoptosis have reduced expression of and integrins.

Leukemia 19: 57-63, 2005.

DUBEY, S.; SHUKLA, P.; NITYANAND, S.. Expression of interferon and tumor

necrosis factora in bone marrow T cells and their levels in bone marrow plasma in

patients with aplastic anemia. Annals of Hematology 84(9): 572-577, 2005.

ECONOMOPOULOS, T.; PAPAGEORGIOU, E.; STATHAKIS, N.;

CONSTANTINIDOU, M.; PARHARIDOU, A.; KOSTOUROU, A.; DERVENOULAS,

J.; RAPTIS, S. Treatment of high risk myelodysplastic syndromes with idarubicin

and cytosine arabinoside supported by granulocyte-macrophage colony-stimulating

factor (GM-CSF). Leuk Res. 20(5):385-90, 1996.

EHRLICH, P. Uber einen Fall von Anämie mit Bemerkungen über regenerative

Veränderungen des Knochenmarks. Charité-Annalen 13: 300-9, 1888.

134

FENAUX, P.; PREUDHOMME, C.. Molecular abnormalities and clonality in

myelodysplastic syndrome. Path. Biol., 45(7):556-60, 1997

FERNANDEZ, T.S.; SOUZA, J.M.; SILVA, M.L.M.; TABAK, D.; ABDELHAY, E..

Correlation of N-ras point mutations with specific chromossomal abnormalities in

primary myelodysplastic syndrome. Leuk. Res., 22(2):125-134, 1998.

FERNANDEZ, T.S.; ORNELLAS, M.H.; CARVALHO, L.O.; TABAK, D.; ABDELHAY,

E.. Chromosomal alterations associated with evolution from myelodysplastic

syndrome to acute myeloid leukemia. Leuk. Res., 24(10):839-48, 2000.

GALLAGHER, A.; DARLEY, R.L.; PADUA, P.. The molecular basis of

Myelodysplastic Syndromes. Haematologica, 82:1991-204, 1997.

GASGUEN, J.E. & BENNETT, J.M.. Classification and morphologic features of the

myelodysplastic syndromes. Seminars in Oncology, 19(1):4-13, 1992.

GIBSON, F.M.; SCOPES, J.; DALY, S.; BALL, S.; GORDON-SMITH, E.C..

Haemopoietic growth factor production by normal and aplastic anemia stroma in

long-term bone marrow culture. Br J Haematol 91: 551-61, 1995.

GORDON, M.Y.. Human Haematopoietic Stem Cell Assays. Blood Reviews,7:190-7,

1993.

GREENBERG, P.; COX, C.; LE BEAU, M.M.; FENAUX, P.; MOREL, P.; SANZ, G.;

SANZ, M.; VALLESPI, T.; HAMBLIN, T.; OSCIER, D.; OHYASHIKI, K.; TOYAMA,

K.; AUL, C.; MUFTI, G.; BENNET, J.. International Scoring System for Evaluation

Prognosis in Myelodysplastic Syndrome. Blood, 89:2079-88, 1997.

135

GUPTA, D.; NIEHANS, G.A.; LEROY, S.C.; GUPTA, K.; MORRISON, V.A.;

SCHULTZ, C.. Fas ligand expression in the bone marrow in myelodysplastic

syndromes correlates with FAB subtype and anemia predicts survival. Leukemia

13:44-53, 1999.

HAMBLIN, T.. Immunologic Abnormalities in Myelodysplastic Syndromes. In:

Koeffler, H.P. (ed.). Hematology/Oncology Clinics of North America. W.B. Saunders

Company, 6(3):571-86, 1992.

HARRIS, N.L.; JAFFE, E.S.; DIEBOLD, J.; FLANDRIN, G.; MULLER-HERMELINK,

H.K.; VARDIMAN, J.; LISTER, T.A.; BLOOMFIELD, C.D.. The Wolrd Health

Organization Classification of the Hematologic Malignancies Report of the Clinical

Advisory Comittee Meeting, Airlie House, Virginia, November. J. Clin. Oncol.,

17:3835-49, 1999.

HELLSTRÖM-LINDBERG, E.; WILLMAN, C.; BARRETT, A.; SAUNTHARARAJAH,

Y.. Achievements in Understanding and Treatment of Myelodysplastic Syndromes.

American Society of Hematology (Am Soc Hematol Educ Program): 110-132, 2000.

HEIM, S. & MITELMAN, F.. Myelodysplastic Syndromes. In: Cancer Cytogenetics,

2nd ed., Willey-liss, NY,p.141-179, 1995.

HOFFBRAND, A.V. & PETTIT, J.E.. Blood Cell Formation (Haematopoiesis). In.:

Essential Haematology, Blackwell, 3rd ed., p.1-11, 1993.

KAITO, K.; OTSUBO, H.; OGASAWARA, Y.; SHIMADA, T.; USUI, N.; KOBAYASHI,

M..Adhesion molecule expression by bone marrow CD34-positive cells in aplastic

anemia before and after immunosuppressive therapy. Clin. Lab. Haem. 25: 393-396,

2003.

136

KANSU, E. & ERSLEV, A.J..Aplastic anaemia with 'hot pockets'. Scand J Haematol.

17(5):326-34, 1976.

KASAHARA, S.; HARA, T.; , H.; ANDO, K.; TSUNUMI, H.; SAMADA, M.; YAMADA,

T.; OHNISHI, H.; MORIWAKI, H..Hypoplastic myelodysplastic syndromes can be

distinguished from acquired aplastic anemia by bone marrow stem cell expression of

the tumor necrosis factor receptor. Br J Haem 118: 181-188, 2002.

KITAGAWA, M.; SAITO, I.; KUWATA, T.; YOSHIDA S.; YAMAGUCHI, S.;

TAKAHASHI, M.; TANIZAWA, T.; KAMIYAMA, R.; HIROKAWA, K. Overexpression

of tumor necrosis factor (TNF)- by bone marrow cells from patients with

myelodysplastic syndromes. Leukemia 11: 2049-54, 1997.

KOJIMA, S.; MATSUYAMA, T.; KODERA, Y.. Hematopoietic growth factors

released by marrow stromal cells from patients with aplastic anemia. Blood 79:

2256-61, 1992.

KRAUSE, J.R.. Bone marrow biopsy of pre-leukemia. Krause JR ed . Bone Marrow

Biospy. Edinburg: Churchill Livingstine, 1981.

KUMAR, C.C.. Signaling by integrin receptors. Oncogene 17 (11):1365-73, 1998.

LAWLER, J. & DETMAR, M.. Tumor progression: the effects of thrombospondin-1

and –2. Int. J. Biochem. Cell Biol. 36: 1038-45, 2004.

LI, F.P.; ALTER, B.P.; NATHAN, D.G. The mortality of acquired aplastic anemia in

children. Blood 40: 153-62, 1972.

137

LIESVELD, J.L.; ABBOUD, C.N.; DUERST, R.E. et al.. Characterization of human

marrow stromal cells: role in progenitor cell binding and granulopoiesis. Blood

73:1794-1802, 1989.

LIESVELD, J.L.; WINSLOW, J.M.; KEMPSKI, M.C.; RYAN, D.H.; BRENNAN, J.K.;

ABBOUD, C.N. Adhesive interactions of normal and leukemic human CD34+

myeloid progenitors: role of marrow stromal, fibroblast, and cytomatrix components.

Exp Hematol. 19: 63-70, 1991.

LIESVELD, J.L.; WINSLOW, J.M.; FREDIANI, K.E.; RYAN, D.H.; ABBOUD, C.N..

Expression of integrins and examination of their adhesive function in normal and

leukemic hematopoietic cells. Blood 81(1):112-21, 1993.

LOHRMANN, H-P; KERN, P.; NIETHAMMER D.; HEIMPEL, H. Identification of

high-risk patients with aplastic anemia in selection for allogeneic bone-marrow

transplantation. Lancet 2: 647-50, 1976.

LONG, M.J.. Blood cell cytoadhesion molecules. Exp Hematol. 20:288-290, 1992.

LYNCH, R.E.; WILLIAMS, D.M.; READING, J.C.; CARTWRIGHT, G.E. The

prognosis in aplastic anemia. Blood 45: 517-28, 1975.

MACIEJEWSKI, J.P.; ANDERSON, S.; KATEVAS, P.; YOUNG, N.S.. Phenotypic

and functional analysis of bone marrow progenitor cell compartment in bone marrow

failure. Br J Haematol 87: 227-34, 1994.

138

MACIEJEWSKI, J.; SELLERI, C.; SATO, T.; ANDERSON, S.; YOUNG, N.S. A

severe and consistent deficit in marrow and circulating primitive hematopoietic cells

(long-term culture initiating cells) in acquired aplastic anemia. Blood 88: 1983-91,

1996.

MARSH, J.C.W.; CHANG, J.; TESTA, N.G.; HOWS, J.M.; DESTER, T.M.. In vitro

assessment of marrow “stem cell” and stromal cell function in aplastic anemia. Br J

Haematol 78: 258-67, 1991.

MARTINEZ-JARAMILLO, G.; SÁNCHEZ-VALLE, E.; GÓMEZ-MORALES, E.;

MONTESINOS, J.J.; VALENCIA, I.; PIZZUTO-CHAVEZ, J.; MAYANI, H. Sequential

variations in the content of bone marrow colony-forming cells in individual patients

with aplastic anemia before and after immunosuppressive therapy. Hematology 5:

247-55, 2000.

MARTINEZ-JARAMILLO, G.; FLORES-FIGUEROA, E.; GÓMEZ-MORALES, E.;

SANCHEZ-VALLE, E.; MAYANI, H. Tumor necrosis factor- levels in long-term

marrow cultures from patients with aplastic anemia: modulation by granulocyte-

macrophage colony-stimulating factor. Am J Hematol 68: 144-8, 2001.

MARTINEZ-JARAMILLO, G.; FLORES-FIGUEROA, E.; SÁNCHEZ-VALLE, E.;

GUTIÉRREZ-ESPÍNOLA, G.; GÓMEZ-MORALES, E.; MONTESINOS, J.J.;

FLORES-GUZMÁN, P.; CHÁVEZ-GONZÁLEZ, A.;ALVARADO-MORENO, J.A.;

MAYANI, H.. Comparative analysis of the in vitro proliferation and expansion of

hematopoietic progenitors from patients with aplastic anemia and myelodysplasia.

Leuk Res 26: 955-63, 2002.

139

MASCHEK, H.; KALOUTSI, V.; RODRIGUEZ-KAISER, M.; WERNER, M.;

CHORITZ, H.; MAINZER, K.; DIETZFELBINGER, M. & GEORGII, A.. Hypoplastic

myeloblastic syndrome: incidence, morphology, cytogenetics, and prognosis. Annals

of Hematology 66:117-122, 1993

MAYANI, H.; DRAGOWSKA, W.; LANSDORP, P.M.. Lineage commitment in human

hemopoiesis involves assymetric cell division of multipotent progenitors and does

not appear to be influenced by cytokines. J. Cell Physiol., 157:576-9, 1993.

MELENHORST, J.J.; FIBBE, W.E.; SMITS, S.; WILLEMZE, R.; LANDEGENT, J.E..

Aplastic anaemia patients with clonal X-chromosome inactivation pattern in

haemopoietic cells exhibit polyclonal TCRgamma and IgH gene rearrangements.Br

J Haem. 93(2):326-32, 1996.

MORRISON, S.J.; SHAM, N.M.; ANDERSON, D.J.. Regulatory Mechanisms in

Stem Cell Biology. Cell, 88:287-98, 1997.

NAJEAN, Y.; PECKING, A. For the Cooperative Group for the Study of Aplastic and

Refractory Anemia. Prognostic factors in acquired aplastic anemia: a study of 352

cases. Am J Med 67: 564-71, 1979.

NAND, S & GODWIN, J.E.. Hypoplastic myelodysplastic syndrome. Cancer 62:958-

694, 1988.

NÖEL, P.; TEFFERI, A.; PIERRE, R.V.; JENKINS, R.B.; DEWALD, G.W..

Karyotyping Analisys in Primary Myelodysplastic Syndrome. Blood Reviews, 7:10-

18, 1993.

140

NOWELL, P.C.. Chromosome abnormalities in Myelodysplastic Syndromes.

Seminars in Oncology, 19(1):25-33, 1992.

NOVITZKY, N.; JACOBS, P.. Immunosuppressive therapy in bone marrow aplasia:

the stroma functions normally to support hematopoiesis. Exp Hematol 23; 1472-7,

1995.

OSCIER, D.G.. ABC of clinical haematology. The myelodysplastic syndromes. BMJ

314(7084):883-6, 1997.

PARKER, J.E.; FISHLOCK, K.L.; MIJOVIC, A.; CZEPULKOWSKI, B.; PAGLIUCA,

A.; MUFTI, G.J.. Low-risk myelodysplastic syndromes is associated with excessive

apoptosis and increased ratio of pro-versus anti-apoptotic bcl-2 related proteins. Br.

J. Haematology, 103:1075-82, 1998.

PARKER, J.E.; MUFTI, G.J.; RASOOL, F.; MIJOVIC, A.; DEVEREUX, S.;

PAGLIUCA, A.. The Role of Apoptosis, Proliferation, and the Bcl-2 related Proteins

in the Myelodysplastic Syndromes and Acute Myeloid Leukemia Secondary to MDS.

Blood, 96(12):3932-38, 2000.

PHILPOTT, N.J.; SCOPES, J.; MARSH, J.C.W.; GORDON-SMITH, E.C.; GIBSON,

F.M. Increased apoptosis in aplastic anemia bone marrow progenitor cells: possible

pathophysiologic significance. Exp Hematol 23: 1642-8, 1995.

POTOCNIK, A.J.; BRAKEBUSCH, C.; FASSLER, R.. Fetal and adult hematopoietic

stem cells require beta1 integrin function for colonizing fetal liver, spleen, and bone

marrow. Immunity 12(6):653-63, 2000.

141

PUCILLO, C.E.; COLOMBATTI, A.; VITALE, M.; SALZANO, S.; ROSSI, G.;

FORMISANO, S.. Interactions of promonocytic U937 cells with proteins of the

extracellular matrix. Immunology 80(2):248-52, 1993.

RUSTEN LS, JACOBSEN SE. Tumor necrosis factor (TNF)-alpha directly inhibits

human erythropoiesis in vitro: role of p55 and p75 TNF receptors. Blood

15;85(4):989-96, 1995.

SATO, T.; KIM, S.; SELLERI, C.; YOUNG, N.S.; MACIEJEWSKI, J. Measurement of

secondary colony formation after 5 weeks in long-term cultures in patients with

myelodysplastic syndrome. Leukemia 12: 1187-94, 1998.

SHERIDAN, B.L. & REIS, M.D.. Oncogene involvment in myelodysplasia and acute

myeloid leukemia. Tumor Biol., 11(Suppl 1):44-58, 1990.

SHIMIZU, Y.; VAN SEVENTER, G.A.; HORGAN, K.J.; SHAW, S.. Regulated

expression and binding of three VLA (1) integrin receptors on T cells. Nature

345:250-55, 1990.

SILVERMAN,L.R.. Myelodysplastic Syndromes. In: Lea & Febiger (ed). Cancer

Medicine. London, 3rd ed. Vol.2:1888-1906, 1993.

SMICK, K.M.; CONDIT, P.K.; PROCTOR, R.L.; SUTCHER, V. Fatal aplastic

anemia: an epidemiological study of its relationship to the drug chloramphenicol. J

Chronic Dis 17: 899-914, 1964.

142

SOLIGO, D.; SCHIRO, R.; LUKSCH, R.; MANARA, G.; QUIRICI, N.; PARRAVICINI,

C.; LAMBERTENGHI DELILIERS, G.. Expression of integrins in human bone

marrow. Br J Haem 76(3):323-32, 1990.

SOTTILE, J. & HOCKING, D.C.. Fibronectin polymerization regulates the

composition and stability of extracellular matrix fibrils and cell-matrix adhesions. Mol

Biol Cell. 13(10):3546-59, 2002.

SOUZA, J.M.. Aspectos Biológicos e genéticos das síndromes mielodisplásicas

primárias e suas relações com a sobrevida. Tese de Doutorado, IBCCF/UFRJ,

2003.

STIFTER G, HEISS S, GASTL G, TZANKOV A, STAUDER R. Over-expression of

tumor necrosis factor-alpha in bone marrow biopsies from patients with

myelodysplastic syndromes: relationship to anemia and prognosis. Eur J Haematol.

75(6):485-91, 2005.

TIMEUS, F.; CRESCENZIOM, N.; DORIA, A.; FOGLIA, L.; LINARI, A.; GIACCONE,

M.; PASTORE, G.; DI MONTEZEMOLO, L.C.; RAMENGHI, U.; SARACCO, P.. Flow

cytometric evaluation of circulating CD34+ cell counts and apoptotic rate in children

with acquired aplastic anemia and myelodysplasia. Exp Hematol. 33(5):597-604,

2005.

TRICOT, G; DE WOLF-PEETERS, C.; HENDRICKX, B.; VERWILGHEN, R.L.. Bone

marrow histology in myelodysplastic syndrome. I. Histological findings in

myelodysplastic syndromes and comparison with bone marrow smears. Br J

Haematol. 57; 423-30, 1984.

143

TUZUNER, N.; COX, C.; ROWE, J.M.; WATRONS, D.; BENNETT, J.M.

Hypocellular myelodysplastic syndromes (MDS): new proposals. Br J Haematol 91:

612-7, 1995.

VARTIMAN, J.W.; HARRIS, N.L.; BRUNNING, R.D.. The World Health

Classification (WHO) of the Myeloid Neoplasms. Blood, 100:2292-2302, 2002.

VALLESPI, T.; IMBERT, M.; MECCUCI, C.; PREUDHOME, C.; FENAUX, P..

Diagnosis, classification, and cytogenetics of myelodysplastic syndromes.

Haematologica, 83:258-75, 1998.

WALLERSTEIN, R.O.; CONDIT, P.K.; KASPER, C.K.; BROWN, J.W.; MORRISON,

F.R. Statewide study of chloramphenicol therapy and fatal aplastic anemia. JAMA

208: 2045-50, 1969.

WELSH, J.P.; RUTHERFORD, T.R.; FLYNN, J.; FOUKANELI, T.; GORDON-

SMITH, E.C.; GIBSON, F.M.. In vitro effects of interferon and tumor necrosis

factor on CD34+ bone marrow progenitor cells from aplstic anemia patients and

normal donors. The Hematology Journal 5: 39-46, 2004.

WILLIAMS, D.M.; LYNCH, R.E.; CARTWRIGHT, G.E. Drug-induced aplastic

anemia. Sem Hematol 10: 195-223, 1973.

YOUNG, N.S.. The problem of clonality in aplastic anemia: Dr. Dameshek´s riddle

restated. Blood 79: 1385-92, 1992.

YUNIS, A.A.. Chloramphenicol-induced bone marrow suppression. Semin Hematol

10(3):225-34, 1973.

144

ZHANG, Z.; VUORI, K.; REED, J.C.; RUOSLATHI, E.. The integrin supports

survival of cells on fibronectin and up-regulates Bcl2 expression. Proc Natl Acad Sci

92: 6161-6165, 1995.

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