LZT0310 - Biotecnologia

Luiz Lehmann Coutinho

Laboratório de Biotecnologia

ESALQ – USP

llcoutinho@usp.br

Organização do Curso

• Dois tópicos serão abordados durante o curso:

– Estratégias para identificação de genes de interesse

biotecnológico

– Aplicações da biotecnologia

• Conteúdo:

– Aulas

– Seminários (2)

– Trabalho de revisão (1)

– Aulas práticas (disciplina optativa LZT0693 Técnicas

experimentais em biotecnologia)

Programa

• 02/08 Introdução

• 12/08* Estratégias: Gene candidato; Como elaborar uma revisão de literatura

• 16/08 Estratégias: Mapeamento de QTL; Entrega do tema da revisão (Seminário 2)

• 23/08 Estratégias: Transcriptoma;

• 02/09* Estratégias: Proteoma

• 06/09 Feriado Semana da Pátria (não haverá aula);

• 13/09 Estratégias: Genoma

• 20/09 Estratégias: Integração; Apresentação do levantamento bibliográfico

• 27/09 Seminário 1: Trabalhos de identificação de genes de interesse;

• 04/10 Seminário 1: Trabalhos de identificação de genes de interesse;

• 11/10 Aplicações: Reprodução

• 21/10* Aplicações: Conservação; Entrega da primeira versão da revisão

• 25/10 Bioinformática

• 01/11 Aplicações: Transgenese Animal

• 08/11 Aplicações: Transgenese Vegetal;

• 15/11 Feriado

• 22/11 Patente

• 29/11 Seminário 2: Aplicação da Biotecnologia;

• 06/12 Seminário 2: Aplicação da Biotecnologia;

• Avaliação semanal sobre textos;

• Dois seminários e um trabalho: Seminário 1 - Apresentação de

seminário sobre identificação de genes de interesse. O tempo de

apresentação será de 15 minutos por grupo. Cada grupo com 3 alunos.

No dia da apresentação um aluno do grupo será sorteado para

apresentar o seminário.

• Trabalho e Seminário 2: Trabalho de revisão de literatura sobre

aplicação da biotecnologia. Cada grupo com 3 alunos. Etapas: Entrega

do tema da revisão (dia 16/8); Apresentação do levantamento

bibliográfico (20/09); Entrega da primeira versão (21/10); Entrega da

versão final e Apresentação oral (29/11 e 06/12).

• Monitora: Simone Pértile s.pertile@zootecnista.com.br

Definição de Biotecnologia

• Ereky (1919): “A ciência e os métodos que permitem a

obtenção de produtos a partir da matéria-prima, mediante a

intervenção de organismos vivos”

• OECD - Organisation for Economic Co-Operation and

Development: A aplicação dos princípios da ciência e da

engenharia no tratamento de matérias por agentes

biológicos na produção de bens e serviços (1982).

• OTA – Office of Technology Assessment: Biotecnologia,

de uma forma abrangente, inclui qualquer técnica que

utiliza organismos vivos (ou partes deles) para obter ou

modificar produtos, melhorar plantas e animais, ou

desenvolver microrganismos para usos específicos (1984).

Definições de Biotecnologia

• EFB - European Federation of Biotechnology: Uso integrado da bioquímica, da microbiologia e da engenharia para conseguir aplicar as capacidades de microrganismos, células cultivadas animais ou vegetais ou parte dos mesmos na indústria, na saúde e nos processos relativos ao meio ambiente (1988).

• E.H. Houwink: o uso controlado da informação biológica (1989).

• Biotechnology Industry Organization: em sentido amplo, Biotecnologia é "bio" + "tecnologia", isto é o uso de processos biológicos para resolver problemas ou fazer produtos úteis (2003).

Qual a sua definição?

Campo da Biotecnologia

Setores da Biotecnologia

• ENERGIA: Etanol, biogás e outros combustíveis (a partir de

biomassa)

• INDÚSTRIA: Butanol, acetona, glicerol, ácidos, vitaminas etc.

Numerosas enzimas para outras indústrias (têxtil, de

detergentes etc.)

• MEIO AMBIENTE: Recuperação de petróleo, biorremediação

(tratamento de águas servidas e de lixo, eliminação de

poluentes)

• AGRICULTURA: Adubo, silagem, biopesticidas,

biofertilizantes, mudas de plantas livres de doenças, mudas de

árvores para reflorestamento. Seleção genética, plantas com

características novas incorporadas (transgênicas): maior valor

nutritivo, resistência a pragas e condições de cultivo adversas

(seca, salinidade, etc.)

Setores da Biotecnologia

• PECUÁRIA: Embriões, seleção genética, animais com

características novas (transgênicos), vacinas e

medicamentos para uso veterinário e humano

• ALIMENTAÇÃO: Panificação (pães e biscoitos),

laticínios (queijos, iogurtes e outras bebidas lácteas),

bebidas (cervejas, vinhos e bebidas destiladas) e aditivos

diversos (shoyu, monoglutamato de sódio, adoçantes etc.);

proteína de célula única (PUC) para rações, alimentos de

origem transgênica com propriedades novas

• SAÚDE: Antibióticos e medicamentos para diversas

doenças, hormônios, vacinas, reagentes e testes para

diagnóstico, tratamentos novos etc

Biotecnologia: Um avanço ou um

atraso?

• A biotecnologia é uma tecnologia. O que

deve ser discutido é o uso que fazemos dela

Marcos da Biotecnologia:

• Antiguidade: Preparação e conservação de

alimentos e bebidas por fermentação (pão,

queijo, cerveja, vinho e vinagre)

• cultivo de plantas (batata, milho, cevada,

trigo etc.), domesticação de animais

• tratamento de infecções (com produtos de

origem vegetal tais como pó de crisântemo

e derivados de soja com fungos).

Marcos da Biotecnologia:

• Idade Moderna: Início da produção

comercial de cerveja; extração de metais

por ação microbiana na Espanha; cultivo de

fungos na França; Hooke descobre a

existência de células (1665).

Marcos da Biotecnologia:

• Idade Contemporânea: Pasteur inventa um

processo para conservar alimentos sem alterar suas

propriedades organolépticas (Pasteurização,

1863), identifica a levedura como o agente

responsável pela fermentação alcoólica (1876),

usa microrganismos atenuados para obter vacinas

contra o antraz e a cólera (1881), faz os primeiros

testes de uma vacina contra a raiva (1881).

Marcos da Biotecnologia:

• 1928 F. Griffith descobre a transformação, isto é a

transferência de informação genética de uma

linhagem bacteriana a outra

• 1944 Produção em grande escala da penicilina

(descoberta por Fleming em 1928, desenvolvida

por Florey e Chain)

• 1951 Inseminação artificial de gado utilizando

sêmen congelado

Marcos da Biotecnologia:

• 1953 Watson e Crick propõem um modelo da

estrutura do ADN

• 1973 Havendo desenvolvido técnicas de corte e

reunião do DNA, Cohen e Boyer transferem um

gene a um organismo de outra espécie. Lançado

no Brasil o programa de produção de álcool a

partir de biomassa (Pró-Álcool)

Marcos da Biotecnologia:

• 1975 A Conferência de Asilomar pede ao National

Institute of Health (NIH) que sejam estabelecidas

normas para a regulação dos experimentos com

DNA-recombinante, o que acontecerá meses mais

tarde.

• 1976 Utilização da técnica de hibridização

molecular no diagnóstico pré-natal da alfa

talassemia.

Marcos da Biotecnologia:

• 1978 Genentech, Inc., a primeira empresa

biotecnológica obtém a somatostatina (hormônio

de crescimento) mediante a tecnologia do DNA

recombinante

• 1980 A Suprema Corte de Justiça dos EUA aprova

o princípio de patentes para as formas de vida de

origem recombinante. As primeiras patentes são

de um microrganismo para biorremediação de

petróleo

Marcos da Biotecnologia:

• 1980 Mullis inventa a técnica da Reação em

Cadeia de Polimerase (PCR) cuja patente será

obtida por Cetus, Inc. em 1985 e vendida em 1991

a Hoffman-LaRoche, Inc. por 300 milhões de

dólares.

• 1982 A insulina humana recombinante da

Genentech, Inc. é comercializada.

• 1982 A primeira vacina de DNA-recombinante

para o gado é comercializada na Europa.

Marcos da Biotecnologia:

• 1987 FDA aprova o fator ativador de

plasminogênio recombinante para o tratamento de

ataques cardíacos.

• 1988 Harvard obtém patente de um rato

transgênico para o estudo do câncer

• 1989 Criação do National Center for Human

Genome Research e inicio do mapeamento do

genoma humano.

Marcos da Biotecnologia:

• 1990 Primeira experiência de terapia gênica para

uma doença rara (ADA) em uma menina de quatro

anos

• Pfizer comercializa Chy-Max TM, enzima

recombinante para a preparação de queijos

• GenPharm International, Inc. consegue uma vaca

transgênica que produz no leite proteínas humanas

para alimentação infantil

Marcos da Biotecnologia:

• 1993 Aprovada a utilização do hormônio de

crescimento bovino rBGH/rBST, para aumentar da

produção de leite (Monsanto)

• 1994 Lançamento no mercado do tomate

FlavSavr®, que, devido à inativação de um gene,

amadurece na planta

• 1995 Decifrado o primeiro genoma de uma

bactéria, Haemophilus influenzae.

Marcos da Biotecnologia:

• 1997 Nascem Dolly, uma ovelha clonada, e, meses

mais tarde, uma segunda ovelha, Polly, clonada e

geneticamente modificada.

• 2000 O rascunho do sequenciamento do genoma

humano é anunciado por Collins, do Consórcio do

Genoma Humano, e Venter, da Celera Inc.

• Sequenciado o genoma de uma bactéria que ataca

os citros (Xylella fastidiosa).

Marcos da Biotecnologia:

• 2003 A venda, como mascote, do GloFish, um

peixe transgênico que brilha na escuridão,

originalmente criado para detectar poluentes.

• 2008 Pesquisadores japoneses desenvolvem a

primeira rosa azul (OGM). Cultivam-se plantas

transgênicas em 25 países, incluídos sete da União

Européia.

• 2008 Yamanaka anuncia a obtenção de células

pluripotentes induzidas utilizando um plasmídeo

como vetor.

• 2010 Sequenciamento de nova geração

Filme

Pontos de discussão 1) A situação relatada no filme é real?

2) No futuro?

3) Quais as fontes de material genéticos?

4) É possível sequenciar um genoma de um ser humano? E o custo?

5) Sequenciar o DNA resolve os problemas?

6) Qual o problema?

7) É possível predizer o futuro?

8) DNA determina o fenótipo?

9) Impacto no seguro saúde?

10) Qual a importância de biotecnologias da reprodução no filme?

11) Que outras aplicações poderiam surgir do sequenciamento de DNA

• Como a biotecnologia pode

continuar a auxiliar o nosso

desenvolvimento?

• Quais são os principais problemas?

• Qual é o fator limitante?

Fator limitante

• Quais são os genes que controlam

as características de interesse?

Aplicação

• Uma vez identificado o gene de

interesse, com utilizar esta

informação?

O que poderia ser feito ?

• Testes genéticos

• Seleção assistida por marcadores

• Produção in vitro de proteínas de interesse comercial

• Organismos geneticamente modificados

Como identificar os genes de

interesse ?

Estratégias:

• Genes candidatos

• Procura em todo o genoma

• Expressão gênica

Princípios

Sequenciamento de DNA

Atalho para 3D Animations - Disease Mutation Sickle Cell Dolan DNA Learning Center.lnk

Gene candidato: Um exemplo de

sucesso

Polimorfismo:

Cromossomo 5

ATAAC GCGC AAT CACACACA........ CTGACTGATATGTA

TATTGCGCGTTAGTGTGTGT........GACTGACTATACAT

Cromossomo 5’

ATAAC G T GC AAT CACACACA CACA CTGACTGATATGTA

TATTGCACGTTAGTGTGTGTGTGTGACTGACTATACAT

RFLP

Digestão com enzima que reconhece a seqüência GCGC:

Cromossomo 5

GC AAT CACACACA........ CTGACTGATATGTA

CGTTAGTGTGTGT........GACTGACTATACAT

ATAAC G C

TATTGCG

Cromossomo 5’

ATAAC G T GC AAT CACACACA CACA CTGACTGATATGTA

TATTGCGCGTTAGTGTGTGTGTGTGACTGACTATACAT

Cromossomo 5

ATAAC GCGC AAT CACACACA........ CTGACTGATATGTA

TATTGCGCGTTAGTGTGTGT........GACTGACTATACAT

Cromossomo 5’

ATAAC G T GC AAT CACACACA CACA CTGACTGATATGTA

TATTGCACGTTAGTGTGTGTGTGTGACTGACTATACAT

Identificar genes responsáveis pela

prolificidade em suínos.

• Estratégia: Genes Candidatos

– Análise de genes conhecidos com base em

informações de fisiologia (hormônio ou

receptores ligados a reprodução).

– Mutações observadas em outras espécies.

– Resultados observados em animais

transgênicos.

Prolificidade em suínos

• Animais da raça Meishan chinesa tem um

maior número de leitões por leitegada.

• Investigação de genes ligados ao sistema

reprodutivo, por exemplo: ESR1

• Detecção do polimorfismo por PCR e digestão

com enzima de restrição.

1) Identificação da sequencia do gene.

2) Desenho de primers e amplificação do gene.

3) Sequenciamento em diversos indivíduos para detecção de

polimorfimsos.

Detecção de SNP

5. Estudo do efeito do polimorfismo na prolificidade.

Bovino com fenótipo de musculatura dupla

Efeito da ausência de expressão do gene da miostatina em camundongos (McPherron et al., 1997)

McPherron et al., Nature e PNAS 1997

Musculatura dupla em bovinos

Anemia Falciforme

Resultados e limitações

• Esta estratégia tem gerado bons resultados.

• Pode gerar muitos falso positivos

• Depende de um conhecimento prévio do

gene de interesse.

Implicações

• Desenvolvimento de testes genéticos para

diagnóstico

• Uso em seleção genética

Exemplos com humanos