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1 DISSERTAÇÃO MAPEAMENTO DE LOCOS ASSOCIADOS À TOLERÂNCIA À SECA EM FEIJÃO COMUM JULIANA SANTA ROSA Campinas, SP 2013
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DISSERTAÇÃO
MAPEAMENTO DE LOCOS ASSOCIADOS À
TOLERÂNCIA À SECA EM FEIJÃO COMUM
JULIANA SANTA ROSA
Campinas, SP
2013
2
INSTITUTO AGRONÔMICO
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA
TROPICAL E SUBTROPICAL
MAPEAMENTO DE LOCOS ASSOCIADOS À
TOLERÂNCIA À SECA EM FEIJÃO COMUM
JULIANA SANTA ROSA
Orientadora: Dra. Luciana Lasry Benchimol Reis
Dissertação submetida como requisito
parcial para obtenção de grau de Mestre em
Agricultura Tropical e Subtropical, Área de
Concentração em Genética, Melhoramento
Vegetal e Biotecnologia.
Campinas, SP
Abril 2013
i
Ao meus pais Jair e Magali,
DEDICO
Ao meu namorado Diego, pelo apoio, compreensão e amor,
OFEREÇO
ii
AGRADECIMENTOS
- A Deus primeiramente, por permitir que eu conclua mais uma etapa da minha vida.
- À Dra. Luciana Lasry Benchimol Reis pela oportunidade deste estudo;
- Aos pesquisadores Dr. Alisson Fernando Chiorato e Dr. Sérgio Augusto Carbonell,
pelo auxílio prestado;
- Aos Drs. Paulo Mazzafera e Carlos Augusto Colombo por participarem da Banca
Examinadora;
- A todos os professores do curso, pelos ensinamentos;
- Aos funcionários da PG-IAC e do Centro de Recursos Genéticos Vegetais,
principalmente a Célia e Solange, por simplificarem as burocracias, sempre que
possível;
- Aos meus companheiros de Laboratório Bóris, Juliana, Paula, Deybe, Érika, Pâmela e
Caléo que contribuíram com sugestões e/ou trabalho técnico no decorrer do curso;
- Aos meus pais Jair e Magali e minha irmã Janaina, por sempre me apoiarem e
possibilitarem a realização de meus sonhos;
- Ao meu namorado Diego, por me apoiar sempre e ajudar com este trabalho e tantos
outros apresentados durante o curso;
- Às minhas amigas que sempre ouviram meus desabafos;
- Ao Instituto Agronômico, pela oportunidade oferecida para a realização deste estudo;
- A CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), pelo
suporte financeiro concedido durante alguns meses e pela FAPESP, pela concessão de
bolsa no restante do curso;
iii
SUMÁRIO
RESUMO ................................................................................................................................... v
ABSTRACT ............................................................................................................................. vii
LISTA DE SIGLAS..................................................................................................................vii
1 Introdução .............................................................................................................................. 1
2 Revisão de Literatura ............................................................................................................. 5
2.1 O Feijoeiro ........................................................................................................................ 5
2.1.1 Respostas do feijoeiro ao estresse hídrico ......................................................................... 7
2.2 Marcadores Moleculares ................................................................................................... 8
2.2.1 Marcadores Microssatélites (SSRs) .................................................................................. 9
2.2.2 Marcadores SNPs (Single Nucleotide Polimorphism).....................................................10
2.3 Populações de Mapeamento ............................................................................................ 12
2.4 Construção de mapas genéticos.......................................................................................14
2.5 Identificação de QTLs......................................................................................................18
2.6 Mapas de Ligação em Feijão Comum e mapeamento de locos associados à tolerância ao
déficit hídrico............................................................................................................................20
3 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................. 21
3.1 Material Vegetal .............................................................................................................. 21
3.2 Extração e Quantificação dos DNAs .............................................................................. 22
3.3 Avaliações quanto às características relacionadas ao estresse hídrico.............................22
3.3.1 Avaliações da parte aérea em vasos................................................................................22
3.3.1.1 Determinação da área foliar.........................................................................................23
3.3.1.2 Avaliação do rendimento dos genótipos......................................................................24
3.3.2 Avaliação do desenvolvimento das raízes em rizotrons em casa de vegetação..............24
3.3.3 Determinação das massas fresca e seca..........................................................................25
3.3.4 Análise de clorofila.........................................................................................................25
3.4 Análise de dados.................................................................................................................25
3.5 Genotipagem com marcadores SNPs..................................................................................26
iv
3.6 Caracterização e Genotipagem com marcadores Microssatélites...................................27
3.7 Construção do mapa genético AS...................................................................................28
3.8 Mapeamento dos locos associados ao estresse hídrico...................................................28
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................................... 29
4.1 Extração e Quantificação de DNA .................................................................................. 29
4.2 Caracterização dos microssatélites e Genotipagem da População de Mapeamento com
SSRs e SNPs ............................................................................................................................. 29
4.3 Construção do Mapa AS ................................................................................................. 32
4.4 Fenotipagem da População de Mapeamento...................................................................35
4.5 QTLs para a tolerância ao estresse hídrico.....................................................................39
5 CONCLUSÕES ................................................................................................................... 49
6 REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 50
7 ANEXOS.............................................................................................................................62
v
RESUMO
O feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) pode ser considerado uma cultura
amplamente difundida no Brasil, maior país produtor e consumidor do grão. Pesquisas
em todo o mundo vêm sendo realizadas visando melhorar os cultivares de feijões já
existentes, para resistência a vários patógenos e à seca, por exemplo. Neste contexto, o
presente trabalho teve por objetivo a construção do mapa genético utilizando
marcadores microssatélites e SNPs (Single Nucleotide Polimorphism), os quais
possibilitaram a localização de QTLs associados à tolerância à seca na população
segregante AND277 (Andino) x SEA5 (Mesoamericano) oriunda do CIAT (Colômbia)
a partir de avaliações quanto às características relacionadas ao estresse hídrico induzido
em experimento em casa de vegetação. A genotipagem feita com microssatélites
encontrou 150 marcadores polimórficos na população, enquanto que para SNPs foram
encontrados 288. O tratamento controle foi irrigado continuamente e o tratamento com
déficit hídrico foi irrigado até o ponto de ser considerado como crítico para o
desenvolvimento da cultura. Algumas das características avaliadas nas plantas foram o
conteúdo de clorofila, área foliar, massa seca e fresca das folhas e dos caules,
temperatura das folhas e rendimento. Segundo os resultados apresentados, os genitores
da população são contrastantes para a maioria das características avaliadas quando
submetidos a estresse hídrico. Foram identificados 41 QTLs em nove grupos de ligação
relacionados às características de tolerância à seca, dentre eles 22 obtidos do
experimento de vasos e 19 do experimento de rizotrons. Os QTLs de maior efeito na
variância fenotípica encontrados foram os de clorofila irrigada (32,8%) e não irrigada
(32,1%) e área superficial de raiz não irrigada (32,5%). Estes QTLs podem ser úteis
para a Seleção Assistida em programas de melhoramento e, portanto o presente estudo
representa uma importante contribuição para o melhoramento de feijão comum.
Palavras-chave: Phaseolus vulgaris L., microssatélites, mapeamento genético, estresse
hídrico e QTL.
vi
ABSTRACT
The common bean (Phaseolus vulgaris L.) can be considered a widespread culture in
Brazil, the largest producer and consumer of the grain. Research around the world have
been made to improve the existing varieties of beans, with resistance to multiple
pathogens and drought, for example. In this context, the present work aimed the
construction of a genetic map using microsatellite markers and SNPs (Single Nucleotide
polymorphism), which enabled the location of QTLs associated with drought tolerance
in segregating population AND277 (Andino) x SEA5 (Mesoamerican) derived from
CIAT (Colombia) from evaluations on the characteristics related to drought stress
induced in an experiment in greenhouses. The microsatellites genotyping found 150
polymorphic markers in this population, while for SNPs, it was found 288 polymorphic
markers. Phenotyping of the population was made in greenhouses in a randomized
block design experiment in the vessels and rhizotrons. The control treatment was
continuously irrigated and water deficit treatment was irrigated to the point to be
considered as critical for the development of culture. Some of the features were
evaluated plant chlorophyll content, leaf area, fresh and dry weight of leaves and stems,
leaves and temperature performance. According to the results, the parents of the
population are contrasting for most traits evaluated when subjected to drought. We
identified 41 QTLs for traits of drought tolerance, among them 22 vessels obtained from
the experiment and 19 of the experiment rhizotrons. The largest effect QTLs for
phenotypic variance in chlorophyll found were irrigated (32.8%) and irrigation (32.1%)
and root surface area without irrigation (32.5%). These QTLs may be useful for marker
assisted selection in breeding programs and, therefore this study represent an important
contribution to the improvement of common bean.
Keywords: Phaseolus vulgaris L., microsatellites, genetic mapping, water stress and
QTL.
vii
LISTA DE SIGLAS AFI/AFNI - Área foliar Irrigado/Não irrigado
AFLP - Amplified Fragment Lengh Polymorphism
APRI/APRNI - Área projetada de raízes (Irrigado/Não irrigado)
AS – “AND277 x SEA5”
ASO - alelo-específico
ASRI/ASRNI - Área superficial de raízes (Irrigado/Não irrigado)
BIC - Baysian Information Criterion
CI/CNI - Clorofila Irrigado/Não irrigado
cM - centiMorgans
CRI/CRNI - Comprimento de raízes (Irrigado/Não irrigado)
DArTs - Diversity Arrays Technology
DRI/DRNI - Diâmetro de raízes (Irrigado/Não irrigado)
FI/FNI - Dias até florescimento (Irrigado/Não irrigado)
GL – Grupo de ligação
LODscore - Logarithm of Odds
LRT – Linkelihood Ratio test
LSO - loco-específico
MFFI/MFFNI - Massa fresca folha (irrigado/Não irrigado)
MFCI/MFCNI - Massa fresca caule (irrigado/Não irrigado)
MSCI/MSCNI - Massa seca caule (irrigado/Não irrigado)
MSFI/MCFNI - Massa seca folha (irrigado/Não irrigado)
NSI/NSNI - Número de sementes (irrigado/Não irrigado)
NVI/NVNI - Número de vagens (irrigado/Não irrigado)
OPA - Oligo Pool Assay
PCR – Polimerase Chain Reaction
PSI/PSNI - Peso de 100 sementes (Irrigado/Não irrigado)
PSSI/PSSNI - Produtividade (Irrigado/Não irrigado)
PSVI/PSVNI - Peso seco de vagens (Irrigado/Não irrigado)
QTL - Quantitative Trait Loci
RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
RIL - Recombinant Inbred Line
SAM - Seleção Assistida por Marcadores
viii
SAR – Sum of Adjacent Recombination Coefficients
SMA - Análise por Marcas Individuais
SNP - Single Nucleotide Polimorphism
SPAD - Soil-Plant Analysis Development Section
SSD - Single Seed Descent
SSR – Simple Sequence Repeat
STS - sequence-tagged sites
SVI/SVNI - Número de sementes por vagem (irrigado/Não irrigado)
TII/TINI - Temperatura da folha (irrigado/Não irrigado)
UC – “IAC-UNA x CAL-143”
VRI/VRNI - Volume de raízes (Irrigado/Não irrigado)
1
1 INTRODUÇÃO
O feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) é uma planta anual, nativa da América
Central e pertencente à família Fabaceae (Cronquist, 1988) e pode ser considerada uma
cultura amplamente difundida no Brasil, maior país produtor e consumidor do grão.
Pesquisas em todo o mundo vêm sendo realizadas visando à melhoria dos
cultivares de feijões já existentes, inclusive gerar novos cultivares, mais produtivos,
com resistência a vários patógenos e à seca, por exemplo. A principal abordagem destas
pesquisas é a biotecnologia, utilizando dados genômicos para garantir a eficiência e
agilizar os programas de melhoramento do feijoeiro (Kelly et al., 2003).
O feijoeiro é considerado uma planta sensível ao estresse hídrico, principalmente
em virtude da baixa capacidade de recuperação após a deficiência hídrica e sistema
radicular pouco desenvolvido (Guimarães, 1992). O desenvolvimento de cultivares com
resistência a estresse biótico e abiótico é o principal objetivo dos programas de
melhoramento do feijoeiro no Brasil e no mundo. Enquanto a resposta a estresse biótico
tem sido mais bem estudada, a resistência a estresse abiótico é fisiologicamente e
geneticamente de natureza mais complexa e geralmente tem herança poligênica, pois
pode ser condicionado por múltiplos mecanismos interagindo ao mesmo tempo (Miklas
et al., 2006).
Com base em informações morfológicas, fisiológicas e bioquímicas, Singh et. al.
(1991) estabeleceram a hipótese de três centros de origem para o feijão (México e na
América Central- Mesoamericano, Andino e Colombiano). Recentemente, Bitocchi et
al. (2011) sugeriram que ambos os ‘pools’ gênicos se originaram de diferentes eventos
migratórios de populações mesoamericanas com características do México Central.
Atualmente, têm-se realizado estudos que utilizam tanto marcadores
morfológicos e agronômicos (Carbonell et al., 2010; Gonçalves et al., 2010), quanto
marcadores moleculares (Campos et al., 2011; Chen et al., 2010, Yu et al., 2010),
visando à obtenção de melhores resultados nos programas de melhoramento vegetal. Os
marcadores moleculares de DNA são abundantemente utilizados para estimar os níveis
de diversidade e heterozigosidade entre diferentes materiais, estimar o tipo de
distribuição espacial e temporal de populações em relação ao fluxo gênico (Schuster et
al., 2007), para mapeamento de QTLs (Quantitative Trait Loci, Liu et al., 2008), para
introgressão gênica (Herrera et al., 2002), entre outras aplicações.
2
Os marcadores microssatélites (SSRs – Simple Sequence Repeats, Tautz, 1989)
são constituídos de unidades repetidas em tandem, contendo de 1 a 6 pares de bases, que
estão distribuídas ao acaso no genoma de todos os seres vivos formando locos
polimórficos. Os SSRs possuem ampla utilização nos programas de melhoramento por
serem marcadores codominantes e multialélicos e fornecem elevado nível de
informação genética por loco, podendo ser analisados a partir de qualquer tipo de tecido
em qualquer estágio de desenvolvimento, sendo necessária pequena quantidade de DNA
(Sousa et al., 2011).
Dentre as várias aplicações da técnica, pode-se citar a construção de mapas
genéticos para a localização de genes de interesse econômico, a obtenção de
fingerprintings genômicos, a análise de divergência genética em populações e
germoplasmas, e o estabelecimento de relações filogenéticas (Ferreira & Gattapaglia,
1995). Mapas genéticos fornecem informações úteis para muitos estudos, tais como a
localização de regiões genômicas que controlam características fenotípicas, estudos de
sintenia e a clonagem de genes (Campos et. al., 2011).
A maioria das estratégias de mapeamento de QTLs está baseada no uso de
populações segregantes tradicionalmente utilizadas para a construção de mapas
genéticos. Tais populações são ideais, pois maximizam a quantidade de desequilíbrio de
ligação entre marcadores e QTLs. As populações segregantes em feijão comum
oriundas de cruzamento entre genótipos do mesmo pool gênico, como por exemplo,
Mesoamericano x Mesoamericano, são as mais próximas das existentes às progênies
avaliadas nos programas de melhoramento do feijoeiro já que, aqui no Brasil, prioriza-
se os cruzamentos de genótipos Mesoamericanos com grãos pequenos. Em decorrência
disto, há uma restrição de variabilidade genética e para fins de mapeamento se torna
interessante a utilização de mais de um tipo de marcador, além dos marcadores
microssatélites, que possa explorar outros tipos de polimorfismo no genoma da espécie,
como é o caso dos marcadores genômicos DArTs (Diversity Arrays Technology;
http://www.diversityarrays.com), desenvolvidos para feijão comum (Briñez et al.,
2012).
Os cultivares de feijão apresentam uma grande diversidade na fenologia sendo
um fator determinante na adaptação aos ambientes de seca (White & Izquierdo, 1991).
O BAT 477 é uma linhagem reconhecida como tolerante à seca que também possui
resistência à podridão do colmo [Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid]. O SEA 5 é
uma linhagem desenvolvida para ser mais tolerante à seca do que o BAT 477 junto ao
3
CIAT (Centro de Agricultura Tropical, Cali, Colômbia). Isto foi atribuído
principalmente pela capacidade que este genótipo possui de concentrar os assimilados
na produção de grãos (Rao, 2001).
Segundo Terán & Singh (2002), em experimentos realizados em duas estações
(Janeiro a Março e Junho a Agosto) nos anos de 1998 e 1999, a linhagem SEA 5 foi
mais produtiva em relação genótipo BAT 477, em condições de estresse hídrico.
Polanía et al. (2009) avaliaram as diferenças fenotípicas no desenvolvimento e
distribuição das raízes em condições de seca, em 16 genótipos de feijão comum. Para
isto, desenvolveram um método utilizando tubos plásticos transparentes inseridos em
tubos de PVC, preenchidos com a mistura de solo, areia e fertilizantes nos níveis
recomendados. Nos resultados, as linhagens BAT 477, SEA 5 e SER 16 se destacaram
pelo bom desempenho na produção de raízes quando submetidas ao déficit hídrico. As
linhagens SEA 5 e BAT 477 se sobressaíram no comprimento total de raiz, mas também
tiveram valores baixos de comprimento específico da raiz, indicando o desenvolvimento
de raízes ligeiramente mais espessas. A linhagem BAT 477 se assemelhou ao da SEA 5,
sendo que esta última mostrou capacidade de produzir raízes a uma profundidade de 30
a 43 cm.
Segundo Porch et al. (2009), as linhagens SEC, SEN e SER são lançamentos
recentes de tolerância à seca nas pequenas classes de mercado de cores creme, preto e
vermelha, respectivamente, enquanto que as linhagens SEA foram previamente lançadas
para tolerância à seca. O experimento foi dividido em dois tratamentos, um com
condições de estresse hídrico e outro com esse estresse reduzido ou ausente, aplicados
no mês de janeiro de 2007 e 2008. A irrigação foi aplicada no tratamento de estresse
hídrico quando o teor de umidade do solo foi reduzido em 75% da capacidade do
campo. Na análise combinada entre os genótipos de feijoeiro comum, SER 21 mostrou
rendimentos mais elevados de sementes sob estresse hídrico, seguido por SER 16, SEA
5, SEA 15 e G21212. Os cinco principais genótipos de feijoeiro comum para cada
índice de rendimento também foram identificados. SEA 5, G 21212, SER 21, SEN 21 e
A 686 apresentaram as maiores taxas de tolerância ao estresse hídrico, enquanto SER
22, SER 21, SER 16, Maverick e SER 26 tiveram a menor redução de rendimento
médio de sementes sob estresse hídrico.
Portanto, o presente estudo visou contribuir com o melhoramento da cultura do
feijoeiro. Um novo mapa genético utilizando marcadores microssatélites e SNPs (Single
Nucleotide Polimorphism) foi gerado possibilitando a localização de QTLs associados à
4
tolerância à seca na população segregante AND277(Andino) x SEA5 (Mesoamericano)
com o auxílio das avaliações quanto às características relacionadas ao estresse hídrico.
5
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 O feijoeiro
As leguminosas (Fabaceae) incluem um grupo de espécies de maior importância
agrícola, depois dos cereais. Com cerca de 20.000 espécies, as leguminosas são a
terceira maior família de plantas superiores (Gepts, 2005). O gênero Phaseolus é
originário da América e contém 55 espécies, das quais cinco são amplamente
cultivadas: P. vulgaris L., P. lunatus L., P. coccineus L., P. acutifolius A., Gray var.
latifolius Freeman e P. polyanthus Greenman (Debouck, 1993). Dessas cinco espécies,
o feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) é a mais importante devido ao seu elevado teor
de proteínas e é considerada a principal cultura alimentar na África e na América Latina
(Yu e Bliss, 1978).
O feijão comum é uma planta diploide (2n = 2x = 22) e autógama, com taxa de
fecundação cruzada estimada em 3% a 5% (Burle et al., 2010). Com base em
informações morfológicas, fisiológicas e bioquímicas, Singh et al. (1991) estabeleceram
a hipótese de três centros de origem para o feijão (México e na América Central-
Mesoamericano, Andino e Colombiano). Maciel et al (2003) sugeriram alguma mistura
entre os dois principais pools gênicos (Mesoamericano e Andino), pois identificaram a
faseolina tipo ‘T’ no grupo mesoamericano, sabidamente encontrada somente em feijões
andinos.
Por meio de estudos com marcadores moleculares, Burle et al. (2010)
observaram que, apesar de o Brasil não ser um centro primário de diversidade do
feijoeiro, há uma ampla gama de variabilidade genética da espécie no país que é
justificada pelo histórico da domesticação da cultura em épocas de pré e pós
colonização européia. Dada a grande variabilidade observada, os autores sugerem que o
Brasil deve ser considerado um centro secundário de diversidade da espécie. Evidências
obtidas nos últimos anos sugere que o feijão comum foi domesticado na Mesoamérica e
nos Andes, mas seu centro secundário de diversidade genética se estendeu para o Brasil,
China e Europa (Santalla et al., 2010). Recentemente, Bitocchi et al. (2011) sugeriram
que os pools gênicos Mesoamericano e Andino se originaram de diferentes eventos
migratórios de populações mesoamericanas com características do México Central.
6
O feijão comum é um alimento rico sob o aspecto nutricional pelo fato de
possuir cerca de 20 a 30% de proteínas (Yin et. al., 2010), 65% de carboidratos (Ribeiro
et. al., 2009), vitaminas do complexo B e minerais (Ca, Fe, Cu, Zn, P, K e Mg)
(Armelin et. al., 2007), sendo bom constituinte de alimentos que contém proteína de
origem animal. O consumo diário de feijão está entre 50 a 100 g por dia/pessoa,
contribuindo com 28% de proteínas e 12% de calorias ingeridas (Sgarbieri, 1980)
Segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística - IBGE (2010), o Brasil é
o segundo produtor mundial de feijão do gênero Phaseolus e o primeiro na espécie
Phaseolus vulgaris L.
São realizadas três colheitas anuais, num sistema contínuo de cultivo, de acordo
com o zoneamento ecológico das regiões e as épocas de semeadura (safra das águas –
setembro a novembro, safra da seca ou “safrinha” – janeiro a março, safra de inverno –
maio a julho). A produção de feijão no Brasil na temporada 2011/2012 (décimo
levantamento- Tabela 1) em função das adversidades climáticas ocorridas
principalmente na região Nordeste, atingiu 1,24 milhão de toneladas, representando uma
redução de 26,2% comparada com a safra passada (CONAB, 2012).
A produtividade média da safra está estimada em 896 kg/ha, apresentando uma
redução de 4,2%. A produção consolidada das três safras está estimada em 2,93 milhões
de toneladas, representando um decréscimo de 21,4%, face ao observado na temporada
anterior.
Tabela 1. Área, produtividade e produção de grãos de feijão, safra 2011/12, das regiões
em todo o Brasil.
Região Área (mil ha)
Produtividade
(Kg/ha) Produção (mil ton)
Norte 161,1 838 135,0
Nordeste 1525,9 197 300,4
Centro-Oeste 342,3 1764 603,7
Sudeste 597,7 1636 978
Sul 646,6 1416 915,6
Brasil 3273,6 896 2932,8
Fonte: CONAB. Levantamento Julho/2012.
7
2.1.1 Respostas do feijoeiro ao estresse hídrico
As previsões ambientais apontam para o aumento do aquecimento global nas
próximas décadas e consequentemente um aumento dos períodos de seca certamente
acompanharão esse fenômeno. Assim, o desenvolvimento de cultivares mais tolerantes
a períodos de estresse hídrico, bem como novas tecnologias que auxiliem as plantas a
tolerar períodos prolongados de estiagem serão essenciais na manutenção da produção
agrícola brasileira e mundial em níveis que possam alimentar a população em constante
crescimento (Nepomuceno et al., 2008).
O feijoeiro é considerado uma planta sensível ao estresse hídrico, principalmente
em virtude da baixa capacidade de recuperação após a deficiência hídrica e sistema
radicular pouco desenvolvido (Guimarães, 1992). De acordo com Moreira et al. (1988),
o consumo de água pelo feijoeiro depende do estádio de desenvolvimento, das
condições do solo, época de cultivo e das condições climáticas durante todo o ciclo. A
necessidade de água do feijoeiro com ciclo de 60 a 120 dias, varia entre 300 a 500 mm
para obtenção de alta produtividade (Doorenbos & Kassam, 1979).
Didonet & Silva (2004) relataram que a cultura do feijoeiro, quando submetida
ao estresse hídrico, apresenta redução da área foliar e aumento da resistência estomática.
A fase reprodutiva é a mais sensível à deficiência hídrica, com vulnerabilidade do início
da floração até o início da formação de vagens (Fageria et al., 1991), sendo que o
período de 5 a 10 dias antes da antese é o mais crítico, podendo levar a uma redução de
produtividade superior a 50% (Norman et al., 1995).
A redução na produção do feijoeiro sob estresse hídrico decorre da baixa
porcentagem de vingamento das flores, quando ocorre floração, e ao abortamento de
óvulos produzindo vagens chochas (Ramirez-Vallejo & Kelly, 1998). O número de dias
em que o feijoeiro fica sujeito à redução de água no solo influencia a redução de
produtividade, proporcionando decréscimos de até 20% no rendimento (Magalhães &
Millar, 1978). Assim sendo, existe correlação positiva alta entre disponibilidade de água
no solo e alguns componentes de rendimento (Aguiar et al., 2008)
O desenvolvimento de cultivares com resistência a estresse biótico e abiótico é o
principal objetivo dos programas de melhoramento do feijoeiro no Brasil e no mundo.
Enquanto a resposta a estresse biótico tem sido mais bem estudada, a resistência a
estresse abiótico é fisiologicamente e geneticamente de natureza mais complexa e
geralmente tem herança poligênica, pois pode ser condicionado por múltiplos
8
mecanismos interagindo ao mesmo tempo (Miklas et al., 2006). A resposta da planta a
um estresse pode ser condicionada pela presença ou ausência de outros estresses. Sendo
assim, a baixa fertilidade do solo pode reduzir o crescimento da raiz e assim limitar o
potencial da planta em expressar a tolerância à seca.
As estratégias de resistência à seca podem variar com o clima e as condições de
solo e ainda, algumas plantas possuem adaptações que lhes permitem explorar
ambientes mais áridos. Alguns mecanismos de resistência à seca estão divididos entre
retardo da dessecação e tolerância à dessecação, que são referidas como tolerância à
seca sob potenciais hídricos alto e baixo, respectivamente, e escape da seca, que engloba
as plantas que completam seu ciclo durante a estação úmida, antes do início da seca. A
inibição da expansão foliar e o alongamento de raízes são os mecanismos mais sensíveis
aos déficits hídricos, além dos quais incluem o aumento da resistência ao fluxo da água,
aumento de depósito de cera na folha, fechamento estomático, pela indução do ácido
abscísico, que age reduzindo a perda de água pela planta e alteração da dissipação de
energia das folhas. O sorgo e a soja, por exemplo, possuem padrões de crescimento
indeterminado que permitem que essas espécies sejam beneficiadas com chuvas de
ocorrência tardia (Taiz & Zeiger, 2009).
A degradação de proteínas por proteases é fundamental para a resposta da planta
a estresses abióticos como a seca. Existe um grande número de genes que codificam
proteases em plantas. Apenas alguns dos genes envolvidos na resposta à seca foram
caracterizados, e a sua regulação ainda é mal compreendida. Foram identificadas duas
novas subtilases das folhas da cultivar Zorin de Phaseolus vulgaris L., a PvSLP1 e a
PvSLP2, resultados que sugerem um papel específico na resposta à seca e à senescência
de feijão comum (Budic et al., 2013)
2.2 Marcadores Moleculares
As diferenças na sequencia de DNA ao longo do genoma de uma determinada
espécie são traduzidas pelos marcadores moleculares. Estas variações são chamadas de
polimorfismos, sendo originadas por rearranjos cromossômicos, como inserções,
duplicações, deleções, mutações, entre outros. O polimorfismo dos marcadores
moleculares pode ser herdado de forma Mendeliana e ser acompanhado através das
gerações (Griffiths et al., 2006).
9
As diferenças nas sequencias de DNA podem ser devidas a um único
nucleotídeo (SNPs), a inserção ou deleções (INDELs), ou rearranjos (translocações ou
inversões). Apesar destes métodos de genotipagem terem contribuído grandemente para
a compreensão da organização genômica e variação genética, eles têm a aquisição de
dados limitadas num dado intervalo de tempo. Os métodos de detecção de polimorfismo
podem envolver o uso de uma endonuclease de restrição, hibridização de DNA, ou
ainda amplificação de DNA (Sachidanandam et al., 2001).
A escolha do tipo de marcador molecular é de grande importância na produção
de um mapa genético. O marcador influencia no método a ser adotado de genotipagem
da população de mapeamento, e principalmente no tipo de informação gerada no mapa.
Marcadores codominantes, que permitem a identificação do heterozigoto, favorecem
estudos de interações gênicas, revelando interações aditivas e de dominância. Por outro
lado, marcadores dominantes, que permitem a identificação apenas de homozigotos,
revelam somente interações gênicas de aditividade (Liu et al., 1998).
Os marcadores moleculares de DNA são abundantemente utilizados para estimar
os níveis de diversidade e heterozigosidade entre diferentes materiais, estimar o tipo de
distribuição espacial e temporal de populações em relação ao fluxo gênico (Schuster et
al., 2007), para mapeamento de QTLs (Quantitative Trait Loci, Liu et al., 2008), para
introgressão gênica (Herrera et al., 2002), entre outras aplicações. Além disso, podem
ser utilizados para estimar a proporção relativa de alogamia e autofecundação de uma
espécie, assim como determinar seus ancestrais no processo de evolução (Borém &
Miranda, 2005)..
A influência do número de marcadores genéticos está relacionada até quanto à
resolução pré-estabelecida pelo número de genótipos identificados será, de fato,
satisfeita. Tanto o grau de cobertura do genoma como a densidade do mapa a serem
construídos são funções diretas do número de marcadores (Coelho, 2000).
2.2.1 Marcadores Microssatélites (SSRs)
Numerosos métodos de marcadores ao nível de DNA foram desenvolvidos nas
últimas duas décadas incluindo RFLPs (Botstein et al. 1980), microssatélites (SSRs,
Tautz, 1989), RAPDs (Welsh & McClelland, 1990; Williams et al., 1990), AFLPs (Vos
et al., 1995) e SNPs (Kwok, 2003). Estes marcadores refletem diferenças nas seqüências
de DNA homólogos entre indivíduos.
10
Os marcadores microssatélites ou SSRs (Simple Sequence Repeats) são
combinações de 1 a 6 bases repetidas em tandem. A técnica é baseada na amplificação
das seqüências repetidas, utilizando-se primers ancorados às regiões flanqueadoras das
repetições, que são altamente conservadas e únicas. O comprimento do microssatélite
varia normalmente entre 15 e 50 pb (Petes et al., 1997). As repetições podem ser
simples perfeitas, simples imperfeitas, compostas perfeitas ou compostas imperfeitas
(Reddy et al., 2001). Os microssatélites baseiam-se no uso de pares de primers na
reação de PCR para detectar variações em locos destas seqüências repetitivas. A técnica
de SSRs revela polimorfismo em um loco devido a diferenças no número de vezes em
que um motivo se repete naquele loco. O conteúdo genético informativo de um loco
SSR é bastante alto, por se tratar de seqüências de alta taxa evolutiva. A sua natureza
multialélica e codominante permite o estabelecimento da genotipagem de indivíduos
dentro de populações ou entre genótipos relacionados, por isso, a técnica de
microssatélites tem sido usada para identificação individual, análise de diversidade,
estudos de evolução e de estrutura de populações de espécies relacionadas (Powell et
al., 1996). Além destas aplicações, os marcadores microssatélites são amplamente
utilizados no mapeamento genético e na análise de QTLs. Muitos microssatélites já
foram desenvolvidos para feijão comum (Yu et al., 1999; 2000; Gaitán-Solís, et al.,
2002; Métais et al., 2002; Blair et al., 2003; Guerra-Sanz, 2004; Buso et al., 2006, Grisi
et al., 2007; Hanai et al., 2007; Benchimol et al., 2007, Campos et al., 2007; Cardoso et
al., 2008; Blair et al., 2008). Entretanto, embora o número de marcadores
microssatélites tenha aumentado, o polimorfismo revelado em populações de genitores
oriundos do mesmo pool gênico é restrito, o que dificulta o mapeamento de locos de
interesse nas mesmas (Teles, 2007).
Por isso, é muito importante o uso de populações segregantes oriundas do
cruzamento de genitores advindos de pools gênicos contrastantes como Andino x
Mesoamericano. Neste sentido, na população do mapa UC (Campos et.al., 2011)
oriunda do cruzamento da variedade IAC-UNA (Mesoamericana) com a linhagem
CAL-143 (Andina), foi encontrado 28,5% de polimorfismo entre os genitores.
2.2.2 Marcadores SNPs (Single Nucleotide Polimorphism)
Os SNPs, definidos como variações em uma única posição nucleotídica em uma
única fita de DNA, compreendem uma nova geração de marcadores (Wang et al., 1998).
11
Estas variantes ocorrem entre diferentes indivíduos dentro de uma mesma espécie. Em
geral, os SNPs são a forma mais comum de polimorfismo presente entre os alelos no
DNA. Marcadores SNP são úteis em uma variedade de aplicações, incluindo a
construção de mapas de alta resolução, traços genéticos de mapeamento, diagnóstico
genéticos, a análise da estrutura genética de populações e análise filogenética (Rafalski,
2002). Seu aspecto binário e sua estabilidade de geração em geração, tornam os SNPs
passíveis de automatização gerando grande volume de resultados, e os tornam atraentes
para estudos de mapeamento de QTLs e de seleção assistida por marcadores em
programas de melhoramento de plantas. Métodos baseados na separação de produtos de
PCR em géis de agarose ou poliacrilamida para determinação dos SNPs incluem os
CAPS, AS-PCR, SSCP (Konieczny & Ausubel, 1993; Prosser, 1993). Estes métodos
têm limitação na sua capacidade de geração de dados/tempo. Estas limitações levaram
ao desenvolvimento de uma ampla gama de plataformas de alto desempenho de
genotipagem de SNPs que se utiliza de princípios de mini-sequenciamento, análise de
heteroduplex, e hibridização alelo específica (Henry, 2001). Há revisões na literatura
que discutem extensivamente as metodologias de SNPs (Syvänen, 2005).
Gaitán-Solís et al. (2008) identificaram SNPs em P. vulgaris L. comparando
sequências de regiões expressas e de regiões não-expressas obtidas no GenBank e no
DNA genômico do feijão. A análise das sequências foi conduzida utilizando 10
genótipos cultivados e genótipos selvagens, sendo que estes genótipos são de origem
Mesoamericana e Andina. Para os 10 genótipos avaliados, um total de 20.964 pb foram
analizadas em cada genótipo e comparadas. Esta avaliação resultou na descoberta de
372 novos SNPs em 41 STSs (sequence-tagged sites) diferentes.
Cortés et al. (2011) desenvolveram 94 SNPs e testaram estes marcadores em 70
genótipos de feijão comum que têm sido utilizados como genitores de populações de
mapeamento e que foram previamente avaliados com marcadores SSRs. Os autores
avaliaram 84 regiões gênicas e 10 locos não gênicos usando a tecnologia Kaspar. SNPs
apresentaram níveis elevados de diversidade genética, um excesso de polimorfismo de
frequência média, e uma distribuição de incompatibilidade dentro dos pools gênicos,
como esperado para as populações afetadas por súbitas expansões demográficas. Este
conjunto de marcadores foi útil para distinguir genótipos andino e mesoamericano, mas
menos útil para distinção dentro de cada gene. Os autores discutem
que o marcador genético ideal para fazer o mapeamento, diversidade e estudos de
12
associação em feijão deve considerar uma mistura de marcadores SNPs e marcadores
microssatélites.
No estudo de Souza et al. (2012), fragmentos de DNA que abrigam SNPs foram
identificados em amplicons de seis genótipos de P. vulgaris L. contrastantes dos pools
gênicos Andino (Jalo EEP 558, G 19833, e E 277) e Mesoamericano (BAT 93, DOR
364 e Rudá). O total de 677 SNPs foram identificados, incluindo 555 mudanças de uma
única base (295 transições e 260 transversões) e 122 pequenas inserções/eliminações de
nucleotídeos (indels). Estes SNPs são úteis para análise da diversidade e estudos de
microsintenia entre as espécies de leguminosas.
Hyten et al. (2010) descobriram em feijão comum, utilizando uma representação
reduzida de biblioteca, o total de 3487 SNPs que continha 2795 sequências genômicas
flanqueadoras suficientes para o desenvolvimento de ensaio SNP. Além disso, foi
elaborado um ensaio GoldenGate que continha 1.050 SNPs dos 3487 previstos. Um
total de 827 dos 1050 SNPs produziram um ensaio GoldenGate de trabalho (79%).
Concluíram que através da combinação de duas técnicas de sequenciamento de nova
geração, foi desenvolvido um método que permite a descoberta high-throughput de
SNPs em qualquer organismo diplóide, sem a necessidade da sequência de genoma
completo ou da criação de bibliotecas de cDNA normalizadas.
2.3 Populações de Mapeamento
A seleção da população para mapeamento envolve a escolha de genitores e a
determinação do tipo de cruzamento (F2, retrocruzamento, etc), sendo considerada uma
etapa crítica para o sucesso da construção do mapa (Staub et al., 1996).
Um aspecto que deve ser considerado para o desenvolvimento de um mapa
genético é a distância genética que separa as linhagens que darão origem da população
segregante: quanto mais próximas, mais difícil a obtenção de polimorfismos. Assim, a
escolha de linhagens sem ancestral comum ou mesmo cruzamentos interespecíficos para
espécies de autofecundação, têm sido utilizados em maior ou menor escala para permitir
ou aperfeiçoar o processo de análise de marcadores (Bonierbale et al., 1988; Tanksley et
al.,1988).
De modo geral, níveis moderados de polimorfismos podem ser detectados entre
pools gênicos mesoamericanos e andinos do feijão comum (Chase et al., 1991; Vallejos
13
et al., 1992; Nodari et al., 1993). No trabalho de Vasconcelos et al. (1996), a diversidade
genética de 28 cultivares de feijão comum foi analisada utilizando marcadores
moleculares RAPD. Com base nas distâncias genéticas, os cultivares foram separados
em dois grandes grupos: o grupo A abrangendo cultivares do Centro de Domesticação
Andino, e o grupo B, cultivares do Centro Mesoamericano.
A população segregante utilizada para o mapeamento é tradicionalmente
derivada do cruzamento entre duas linhagens puras, o qual origina a geração F1
essencialmente heterozigota em todos os locos. A F1 é autofecundada ou retrocruzada
de forma a produzir uma geração F2 ou RC1 segregante tanto para os marcadores
moleculares como para as características fenotípicas de interesse (Ferreira &
Grattapaglia, 1995).
Uma população de linhas endogâmicas recombinantes (Recombinant Inbred
Lines – RIL’s) pode ser utilizada alternativamente, derivada de uma F2 por meio de
sucessivas autofecundações ou uma população de linhagens duplo-haplóides obtidas a
partir da cultura de anteras ou de micrósporos de planta F1 (Ferreira, 1993).
Os tipos de populações utilizadas em mapeamento podem ser visualizados na
Tabela 2 a seguir, a qual permite avaliar as vantagens e desvantagens de cada tipo:
Tabela 2. Características de diferentes populações de mapeamento genético
Tipo de
população
Nº de gametas
informativos/
indivíduo
Nº de
eventos de
recombinação/
gameta
Nº de
genótipos
possíveis/
loco
Nº de
gerações
necessárias
para
obtenção
Replicação
Retrocruz. 1 X 2 2 assexuada
F2 2 X 3 2 assexuada
RIL’s 1 2X 2 6-8 Assexuada
e sexuada
Duplo-
haplóides 1 X 2 2
Assexuada
e sexuada
Fonte: Faleiro, 2000.
A população de RILs é obtida a partir de uma população F2, por meio de
sucessivas autofecundações pelo método do descendente de uma única semente ou SSD
(Single Seed Descent). As sucessivas autofecundações permitem que ao longo do
processo ocorra a fixação gênica, ou seja, a eliminação de locos em heterozigose. Ao
14
final do processo, todos os genes terão uma segregação de 1:1 (AA, aa). Sendo assim, é
possível avaliar interação genótipo x ambiente realizando repetições dos experimentos.
Permite, ainda, o estudo de diferentes características em uma mesma população. No
entanto, como essa população permite identificar apenas dois genótipos, impede a
identificação de relações de dominância entre os genes (Lynch & Walsh, 1998). Uma
desvantagem da utilização de RILs no mapeamento é o tempo requerido para a obtenção
da população segregante (6 a 8 gerações); entretanto, o desenvolvimento de RILs em
plantas autógamas, como o feijoeiro comum, é extremamente fácil, uma vez que estas
plantas reproduzem-se normalmente por autofecundação (Faleiro, 2000).
2.4 Construção de mapas genéticos
O entendimento do funcionamento de genomas, com o profundo conhecimento
dos genes que os compõe e as mais diversas interações entre eles, são o grande desafio
deste século (Flint-Garcia, 2003). Os estudos direcionados ao entendimento de como
genes e alelos controlam características fenotípicas complexas (QTLs) têm sido de
grande importância nesta busca. Uma ferramenta bastante usada, nesse contexto, é a
obtenção de mapas genéticos.
O desenvolvimento de mapas genéticos é considerado uma das aplicações de
maior impacto da tecnologia de marcadores moleculares na análise genética de espécies
e, potencialmente, no melhoramento de plantas. Os mapas genéticos possibilitam a
cobertura e análise completa de genomas, a decomposição de características genéticas
complexas nos seus componentes mendelianos, a localização de regiões genômicas que
controlam caracteres de importância, a quantificação do efeito dessas regiões na
característica estudada e a canalização de toda essa informação para uso em programas
de melhoramento (Faleiro et al., 2003).
A construção de mapas genéticos foi viabilizada após a descoberta, no início do
século passado, da ligação entre genes e de que estes se localizam nos cromossomos. O
ponto central da análise de ligação entre as marcas no genoma para a construção e
saturação de mapas genéticos é a existência de desequilíbrio de ligação entre estas
marcas. O desequilíbrio de ligação é decorrente do processo de recombinação homóloga
que ocorre entre cromátides irmãs durante a meiose, em geral de forma randômica ao
longo dos cromossomos (Liu, 1998; Carneiro & Vieira, 2002). O desequilíbrio de
ligação é determinado pela fração de recombinação (r) entre as marcas, que é a razão
15
entre as quantidades de gametas recombinantes e o total de gametas. Assim, se ‘r’ for
menor que 0,5, quer dizer que as marcas estão em desequilíbrio. Desta forma, podemos
inferir que as marcas analisadas estão ligadas. É desta relação entre ‘r’ e ligação física
que surgem os mapas genéticos (Liu, 1998).
A construção de mapas de ligação tem como base a análise de segregação de
centenas de marcadores e, por isso, é computadorizada. Programas como Mapmaker
(Lander et al., 1987), Linkage 1 (Suiter et al., 1983), Gmendel (Liu e Knapp, 1992),
JoinMap (Stam, 1993), Multimap (Matise et al., 1994), Outmap (Butcher et al.,2002),
AntMap (Iwata & Ninomiya, 2006) e OneMap (Margarido et al., 2007) foram
desenvolvidos para auxiliar na análise genética dos dados visando à construção de
mapas genéticos e estão disponíveis na internet (http://linkage.rockefeller.edu/).
Tais programas indicarão os marcadores ligados, formando os respectivos
grupos de ligação; qual a ordem correta entre essas marcas; e a distância em cM
(centiMorgans) entre elas. Para isso, devem-se seguir os seguintes passos: (1) verificar o
padrão de segregação Mendeliana esperada para o tipo de população de mapeamento
escolhido, chamado de teste de segregação; (2) realizar o teste de ligação, verificando a
frequência de recombinação entre cada par de marcas, o que possibilita identificar os
desequilíbrios de ligação e consequentemente formar os grupos de ligação, (3)
empreender a ordenação das marcas a partir das distâncias entre elas e (4) fazer a
conversão das distâncias em centiMorgans (Carneiro & Vieira, 2002).
O teste de segregação mais comumente utilizado é o teste estatístico
Quiquadrado (χ2), dado pela fórmula fo
fefoX
22 )(
em que: fo = frequência
observada em cada uma das classes; fe = frequência esperada em cada uma das classes
(proporção Mendeliana do modelo genético adotado). A hipótese (Ho) não admite a
ocorrência de distorção, ou seja, os dados genotípicos devem seguir a distribuição
Mendeliana esperada para a população de mapeamento adotado. Uma forma de verificar
a significância (α) estatística do χ2 é convertê-lo em seu respectivo p-valor, que pode
ser definido como a probabilidade de se observar uma amostra fora do padrão,
assumindo que a hipótese nula é verdadeira. Quanto menor o valor do p-valor, mais
forte é a evidência de rejeição de Ho (Liu, 1998).
O fato de realizar o χ2 repetidas vezes, uma para cada marca, gera um problema
intrínseco deste tipo de análise: erros ditos do tipo I (Benjamini & Hochberg, 1995), ou
seja, falsos positivos (Liu, 1998).
16
Deste modo, usa-se uma correção que elimina os erros do tipo I baseado em
valores de significância dos testes de segregação derivados de cada marca. A mais usada
é a correção de Bonferroni (Lynch & Walsh, 1998), que assume uma significância
individual (α), a partir da razão da significância total pelo número de testes: α
, em
que α2
= nível de significância global e = número de testes independentes, que
correspondem ao número de marcadores utilizados.
Embora não se conheça a causa da distorção no desvio de segregação de locos
ao longo do genoma, trabalhos recentes mostram a importância desses locos na
identificação de QTL a partir de mapas genéticos. Xu (2008) estabelece uma teoria para
o surgimento de locos com desvio de segregação, e afirma que o poder de detecção de
QTL pode ser sutilmente reduzido quando se faz as análises ignorando os locos com
desvio, mas também ressalta que se o mapa for bem saturado, e tais locos apresentarem
distribuição randômica no genoma, as perdas são insignificantes. Finalmente, o autor
defende que estes locos com desvio de segregação sejam utilizados na obtenção de
mapa genéticos e identificação de QTL.
A mensuração da frequência de gametas recombinantes entre dois locos constitui
o procedimento a partir do qual se realiza o mapeamento (Staub et al., 1996). Diversos
tratamentos estatísticos podem ser usados para estimar a frequência de recombinantes,
entre eles, o método dos momentos, o método dos quadrados mínimos e o da máxima
verossimilhança. De modo geral, pelo método dos momentos, obtêm-se os parâmetros
igualando-se os valores observados às suas expectativas, em termos de esperanças
matemáticas. Pelo método dos quadrados mínimos, obtêm-se as estimativas para os
parâmetros de modo que a soma de quadrados dos desvios entre os valores observados e
os estimados seja mínima, enquanto pelo método de máxima verossimilhança obtêm-se
as estimativas de modo que os valores observados representem o caso mais provável de
ocorrência (Weir, 1996; Liu, 1998).
Estatisticamente, ligação genética é definida como a associação de genes ligados
em um mesmo cromossomo, ou seja, que segregam juntos durante a meiose. Assim, um
grupo de ligação (GL) é formado por marcadores genéticos que possuam menos de 50%
de recombinação (r ) com pelo menos um dos marcadores do grupo (Liu, 1998).
Uma vez conhecidas as frações de recombinação entre cada par de marcadores e
já discriminados os grupos de ligação, deve-se determinar a melhor ordem para os
marcadores dentro de cada grupo. Weir (1996) sugere a ordenação de três locos, A, B, e
C, feita pela soma dos coeficientes de recombinação adjacentes (sar – sum of adjacent
17
recombination coefficients). Esse processo propõe que a ordem correta entre os locos
seja aquela que possibilite o mínimo valor de sar. O valor de sar sob a ordem incorreta
será sempre maior que a correta. Esse método pode ser empregado para qualquer
número de locos.
Estabelecidas as frações de recombinação entre cada marcador, estes valores
devem ser convertidos em centiMorgans, unidade usada para distância entre locos em
mapas genéticos, em homenagem a Thomas Hunt Morgan que estabeleceu a relação em
frequência de recombinação e distância entre genes (Griffiths et al., 2006).
A fim de estabelecer critérios para inferir se dois locos estão, ou não, ligados é
necessário definir a frequência máxima de recombinação e o LOD score mínimo. LOD
score (Logarithm of Odds - Lynch & Walsh, 1998) é um teste baseado na razão de
verossimilhança, que testa a hipótese de dois locos estarem ligados, e utiliza o logaritmo
na base 10 para facilitar o entendimento. Assim sendo, se um LOD score com valor de
três indica que a ocorrência de ligação é mil vezes mais provável do que a segregação
independente (Carneiro & Vieira, 2002).
O teste que realiza esta análise é chamado de teste de Dois-Pontos. Para este
teste a ligação é detectada testando a independência entre cada par de marcas na
população segregante. A melhor forma de se estabelecer a ordem dos locos é por meio
da “Busca Exaustiva”, que como o nome sugere, verifica todas as ordens possíveis e
define como melhor aquela de menor comprimento. No entanto, este método apresenta
uma limitação computacional, pois há um grande número de possíveis ordens quando
um GL possui um grande número de locos. Assim, os métodos computacionais e/ou
algorítmicos, para ordenação exata das marcas, são limitados a um pequeno número de
locos por GL. Alternativa muito usual para GL grandes é o teste de Três-Pontos,
baseada na ideia central do teste de Busca Exaustiva, porém ao invés de realizar os
cálculos com todos os locos, dois a dois, a ordem é formada em pequenos grupos de três
em três. Ou seja, o teste é feito a cada três marcas em sequencia, com sobreposição,
montando-se assim a ordem final (Liu, 1998).
Embora a frequência de recombinantes indique a medida de distância entre dois
locos ao longo de determinado cromossomo, o ideal é que as distâncias usadas na
construção de mapas genéticos sejam totalmente aditivas, de modo que, ao atribuir
novos locos (marcadores) ao mapa, não seja necessário ajustar as distâncias já
estabelecidas. Entretanto, as frequências de recombinação não são aditivas; são,
18
portanto, inadequadas como medida direta de distâncias entre dois locos a serem
mapeados (Staub et al., 1996; Lynch & Walsh, 1998).
Assim, as funções de mapeamento transformam as frequências de recombinação
em distâncias aditivas. A função de Haldane admite que a ocorrência de permuta se dê
de modo independente (ausência de interferência), seguindo uma distribuição de
Poisson (Haldane, 1919). A função de Kosambi (Kosambi, 1944) admite a ocorrência
de permutas próximas como eventos não independentes. Esta função admite
interferência completa entre regiões arbitrariamente próximas, que decresce com o
aumento da distância, sendo nula para locos independentes (Schuster & Cruz, 2008;
Hanai, 2008). Desta forma, torna-se mais apropriado o uso desta função de mapeamento
quando se trabalha com marcas distribuídas ao longo do genoma, como é o caso de
marcadores moleculares.
2.5 Identificação de QTL
Os caracteres quantitativos são aqueles que não permitem a classificação dos
indivíduos em classes distintas, ou seja, não há uma diferenciação marcante entre os
tipos segregantes. Esses caracteres são determinados por muitos genes (poligênicos), o
efeito de cada alelo sobre o caráter é pequeno e, normalmente, o efeito do ambiente
sobre o mesmo é grande, o que faz com que a herdabilidade destes seja pequena (Allard,
1999).
Um caráter poligênico é um sistema de locos no qual a segregação contribui para
a variação genética associada à variação de uma variável contínua (Thoday, 1977). QTL
(loco de um caráter quantitativo) é a denominação sugerida para qualquer loco que tem
contribuído para a variância do caráter (Gelderman, 1975).
Com o desenvolvimento dos marcadores moleculares foi proporcionada a
construção de mapas genéticos de ligação, os quais permitiram mapear e estimar a
magnitude dos efeitos dos QTLs (Paterson et al., 1991; Paterson et al., 1988).
Uma vez detectados os marcadores ligados a uma determinada característica de
interesse, é possível selecionar os indivíduos com base no fenótipo do marcador, sem
que haja a necessidade de avaliar o fenótipo da característica. Essa abordagem é
conhecida como seleção assistida por marcadores (SAM). É importante, principalmente,
nos casos em que a característica de interesse é de avaliação difícil e cara, nos estudos
de espécies perenes de ciclo longo, e para características fenotípicas de herdabilidade
19
baixa, o que pode significar redução no tempo e nos custos de programas de
melhoramento (Souza, 2001).
No entanto, os dados obtidos tanto do mapa genético quanto das análises
fenotípicas devem ser avaliados a fim de fornecer as posições, a magnitude dos efeitos
de cada região genômica e indicar as interações gênicas entre elas. Dentre os programas
mais utilizados para este fim estão QTLCartographer vs.2.5 – WinQTLCart (Wang et
al., 2005) e QGENE 3.05 (Nelson, 1997).
Inicialmente, a identificação dos QTLs era feita por uma relação direta entre o
genótipo de marcadores dos indivíduos da população de mapeamento com suas
características fenotípicas. Este método é denominado Análise por Marcas Individuais
(SMA), podendo ser baseado no método de máxima verossimilhança, ou ainda em
análises de regressão linear. Como limitação, há o fato de quanto maior for a distância
entre o QTL e o marcador, menor será a probabilidade de detectá-lo em vista da
possibilidade de recombinação entre o gene marcador e o QTL. Além disso, a
magnitude do QTL, pelo mesmo motivo, é normalmente subestimada. Outro
inconveniente é que não é possível determinar a posição do QTL no genoma (Lynch &
Walsh, 1998; Schuster & Cruz, 2008).
Como alternativa para aumentar o poder de detecção das associações, permitindo
estimar o efeito e a posição dos QTLs, o método de mapeamento com base em intervalo
(interval mapping) foi proposto por Lander e Botstein (1989). Esse método analisa a
existência de QTL a cada intervalo entre dois marcadores, ao invés de a cada único
marcador. Uma desvantagem atribuída ao mapeamento fundamentado em intervalo é a
de que os outros QTLs fora do intervalo são ignorados, o que pode resultar na
diminuição da precisão das estimativas e do poder dos testes.
O mapeamento por intervalo composto foi proposto para solucionar essas
questões. Trata-se de um método em que se consideram os QTLs fora do intervalo em
questão por um modelo de regressão linear múltipla. Além de proporcionar maior
resolução no mapeamento, permite o uso de dados obtidos em vários ambientes, para
avaliar os efeitos da interação QTLs vs. ambientes (Jansen, 1993; Zeng, 1993, 1994).
O método mais recente é o mapeamento por intervalo múltiplo (Kao et al., 1999)
mas ainda não muito utilizado na maioria dos trabalhos, porque incorpora parâmetros de
epistasia ao modelo e por isso apresenta algumas vantagens potenciais como maior
eficiência e precisão na identificação de QTLs; seus efeitos são estimados sem viés e, ao
20
contrário de outros modelos, pode aumentar a eficiência da seleção assistida,
considerando os efeitos epistáticos.
Outra importante aplicação dos mapas é o mapeamento comparativo
(comparative mapping ou synteny mapping) que se constitui na comparação das
estruturas genômicas de diferentes espécies, do ponto de vista de homologia de genes,
conservação de distâncias e da ordem de ligação nos cromossomos. Esta comparação
contribui para o entendimento sobre a evolução dos genomas (Tanksley et al., 1988b).
2.6 Mapas de Ligação em Feijão Comum e mapeamento de locos associados à
tolerância ao déficit hídrico
Os trabalhos de mapeamento genético do feijoeiro-comum tiveram início com o
primeiro mapa de ligação publicado por Lamprecht (1961). Outros mapas de ligação
têm sido desenvolvidos para esta cultura (Basset, 1991; Vallejos et al., 1992; Nodari et
al. 1993; Adam- Blondom, 1994; Freyre et al., 1998; Ariyarathne et al., 1999; Blair et
al., 2003, Grisi et al., 2007; Blair et al., 2008; Blair et al., 2010; Campos et al., 2011;
Asfaw & Blair, 2012). Os mapas de Vallejos et al. (1992), Gepts et al. (1993), Nodari et
al. (1993) e Adam-Blondom et al. (1994) foram baseados primariamente em marcadores
RFLPs. Freyre et al. (1998) descreveram o primeiro mapa consenso para feijão comum
(Core Map), no qual 550 marcadores moleculares do tipo RFLP e RAPD foram
mapeados na população BAT93 x Jalo EEP558 (BJ). Porém, nesta população existe um
reduzido número de linhagens endogâmicas recombinantes (RILs), o que acaba
limitando a chance de encontrar recombinações e, portanto, a robustez do mapa genético
é diminuída. Algumas regiões não apresentaram saturação, como por exemplo, os
grupos G2, G3, G8 e G10, havendo discrepâncias com mapas anteriores. Assim, tem-se
buscado a integração dos novos marcadores moleculares a este mapa consenso (Yu et
al., 2000; Blair et al., 2003; Blair et al., 2006). O mapa de Grisi et al. (2007) adicionou
novos marcadores SSRs ao Core Map de feijão, totalizando 199 marcas SSR em 13
grupos de ligação, com 1358 cM e distância mínima de 7,23 cM entre duas marcas. Os
autores também obtiveram o primeiro mapa de feijão exclusivamente de microssatélites,
com 106 marcas distribuídas em 606,8 cM, totalizando 12 grupos de ligação.
Blair et al. (2008) mapearam 45 novos locos de microssatélites na população
DOR364 x G19833 e houve uma distribuição preferencial dos microssatélites ATA nos
grupos GL2, GL9 e GL11.
21
Hanai (2008) também desenvolveu dois mapas para feijão comum, para a
população CFM (população gerada a partir do cruzamento entre os genitores Carioca e
Flor de Mayo) e BJ (população derivada do cruzamento entre ‘Bat 93’ e ‘Jalo
EEP558’), os quais foram alinhados. Onze marcadores SSR-EST e outros 9 SSR
genômicos foram mapeados tanto numa população quanto na outra. O mapeamento
comparativo dos mapas das duas populações permitiu identificar, no mapa CFM, oito
dos 11 grupos de ligação do mapa consenso BJ e determinar a orientação de cinco deles.
Cordoba et al. (2010) realizaram a integração do mapa físico e genético de feijão
comum, cuja importância está na capacidade de localizar fisicamente loci que são
conhecidos por ser polimórficos.
Blair et al. (2010) mapearam com marcadores AFLP, RAPD e SSR a população
DOR364 9 BAT477 e foram encontrados 49 QTLs para rendimento e componentes de
rendimento sob condições de estresse hídrico e de irrigação.
Campos et al. (2011) mapearam a população UC oriunda do cruzamento da
variedade IAC-UNA com a linhagem CAL-143 com 198 marcadores microssatélites. O
comprimento total do mapa foi de 1865,9 cM, com um comprimento médio de ligação
entre os 11 grupos mapeados de 170,5 cM. Este mapa foi gerado pelos esforços do
programa de melhoramento do feijoeiro do IAC e é um dos mais robustos em literatura
pelo tamanho amostral da população de mapeamento (384 RILs), bem como pelo
número de SSRs posicionados. A partir do mapa UC, foi possível o mapeamento com
alta precisão de locos de resistência à mancha angular (Oblessuc, 2009) e à antracnose
(Baroni, 2010).
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material Vegetal
A população de mapeamento AS (AND277 X SEA5) utilizada no trabalho é
oriunda do CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical, Cali, Colômbia).
Composta por sementes de 105 linhagens endogâmicas recombinantes (RILs), incluindo
os genitores de feijoeiro comum foi originada do cruzamento entre a cultivar AND277 e
a cultivar SEA5, em casa de vegetação. Foi avançada até a geração F8 utilizando o
método SSD (Single Seed Descent). A linhagem SEA5 pode ser considerada uma
linhagem avançada selecionada para tolerância à seca, por isto a denominação SE A, de
22
série de “Seca Avançada”. É considerado um genótipo de pool gênico Mesoamericano,
utilizado para estudos no CIAT para resistência a doenças, tolerância à seca e outros
(Blair et al., 2006). Esta é uma linhagem superior ao BAT477 (Asfaw & Blair, 2011)
que é uma cultivar anterior em termos de lançamento no programa de melhoramento do
CIAT. O genitor SEA5 é uma linhagem avançada do cruzamento inicial (BAT 477 x
SanCristobal) x (Guanajuato 31 x Rio Tibagi), possui tamanho pequeno de semente, de
cor creme, hábito de crescimento III indeterminado e é sabidamente reconhecida como
tolerante à seca (Szilagyi et al., 2011). Isto foi atribuído principalmente pela capacidade
que este genótipo possui de concentrar os assimilados na produção de grãos (Rao,
2001).
O genitor andino AND277 (Vidigal et al., 2011) possui ainda o alelo Co-14 que
confere resistência à antracnose e o gene Phg-1, que confere resistência à mancha
angular (Pseudocercospora griseola) e a antracnose (Colletotrichum lindemuthianum)
além de ser suscetível ao déficit hídrico.
3.2 Extração e Quantificação de DNA
Amostras de folhas de cada uma das 105 linhagens recombinantes F8 e dos
genitores SEA5 e AND277 foram coletadas. Depois de congeladas em nitrogênio
líquido, as amostras foram liofilizadas e moídas. Em seguida, foi feita a extração do
DNA de acordo com a metodologia do CTAB descrita por Hoisington et al. (1994).
A quantificação do DNA final das 105 linhagens foi feita em gel de agarose 1%
por comparação de intensidade das bandas com o padrão de fago λ (Invitrogen) e
também feita pelo equipamento de quantificação NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).
Posteriormente, as amostras de DNA foram diluídas em solução tampão TE (Tris pH
8,0, 10mM; EDTA pH 8,0, 1 mM), para uma concentração final de 100ng/µl, e
estocadas à 4ºC.
3.3 Avaliações quanto às Características Relacionadas ao Estresse Hídrico
3.3.1 Avaliações da parte aérea em vasos
Em experimento em casa de vegetação, sementes das 105 linhagens da
população AND277 x SEA5 e dos genitores foram semeadas em delineamento de
blocos casualizados, com quatro repetições, no Centro Experimental Central do Instituto
Agronômico, em Campinas, de coordenadas geográficas, latitude de 22° 54’ 20’’ e
23
longitude de 47° 03’ 39’’. As sementes foram plantadas em vasos de 14 litros com duas
sementes em cada vaso. A população foi plantada em duas casas de vegetação (Figura
1) com dois regimes de água diferentes, sendo uma irrigada com 80% da capacidade de
campo e a outra exposta a estresse terminal na fase vegetativa V3/V4. Todos os vasos
foram irrigados com um sistema individual de irrigação. No total, foram instalados 30
sensores (Watermark) a uma profundidade de 20 cm para medir o potencial matricial da
água no solo nos tratamentos submetidos ao déficit hídrico. A cada dois dias foram
monitorados no interior da casa de vegetação a temperatura ambiental, umidade relativa
do ar, temperatura das folhas e o potencial matricial do solo durante todo o
desenvolvimento da cultura. A avaliação do perfil fenotípico da população de
mapeamento quanto aos caracteres relacionados à tolerância à seca foi realizada com
estresse hídrico e sem estresse (1ª e 2ª avaliação), em duas avaliações separadas
(repetições). Após 20 dias de estresse (suspensão da irrigação), as plantas apresentaram
abscisão, senescência foliar e potencial matricial da água no solo de 199 kPa. Análises
fenotípicas foram realizadas avaliando vários caracteres como temperatura superficial
das folhas e o número de dias até o florescimento das plantas.
Figura 1. Casas de vegetação localizadas na Fazenda Santa Elisa, no Centro
Experimental Central do Instituto Agronômico; a) Tratamento não irrigado (estresse
hídrico); b) Tratamento irrigado.
3.3.1.1 Determinação da área foliar
A área foliar foi obtida pela mensuração de folhas completamente expandidas.
Foram determinadas nos tratamentos por meio de um integrador de área, modelo LI-
24
COR e os resultados foram expressos em centímetros quadrados de área foliar.
3.3.1.2 Avaliação do rendimento dos genótipos
No estádio de maturação fisiológica (R9), as plantas foram colhidas
individualmente e avaliados o número de vagens por plantas, número de sementes por
vagem, rendimento total da planta corrigido para 13% de umidade relativa (g/planta),
número de sementes por planta, peso de 100 sementes e peso da vagem. O índice de
intensidade de seca (DII) foi calculado como
, onde Xds e Xns são o número de
sementes médio de todos os genótipos sob os tratamentos de estresse hídrico (ds) e sem
estresse (ns).
3.3.2 Avaliação do desenvolvimento das raízes em rizotrons em casa de vegetação
Estes experimentos foram conduzidos em rizotrons mantidos em casa de
vegetação (Figura 2). Este equipamento tem por finalidade avaliar a profundidade do
sistema radicular dos genótipos no decorrer do seu desenvolvimento (Magalhães Filho
et al., 2008). Os rizotrons foram preenchidos com 12 kg de uma mistura de solo
latossolo vermelho amarelo e areia na proporção 2:1, os quais teve sua acidez e
fertilidade corrigidas aos níveis adequados de nutrientes (Kg/ha de 80 N, 50 P, 100 K,
101 Ca, 29,4 Mg, 20 S, 2 Zn, 2 Cu, 0,1 B e 0,1 Mo), conforme análise química para a
cultura do feijoeiro. Foram realizadas três repetições. Antes das sementes serem
colocadas para germinar, em papel germitex, foram esterilizadas em hipoclorito de
cálcio a 5%, por um período de 5 minutos. Após 48 horas de germinação, as sementes
foram transplantadas para cada rizotron. O tratamento controle foi irrigado
continuamente e o tratamento com déficit hídrico foi irrigado até o ponto a ser
considerado como crítico para o desenvolvimento da cultura quando impostos nestas
condições de estresse. Foram mensurados em ambos os tratamentos o comprimento das
raízes por método não destrutivo durante o desenvolvimento da cultura, a área total das
raízes, o volume e o diâmetro. Neste experimento de rizotron o delineamento foi
também inteiramente casualisado e foram adicionalmente avaliados o conteúdo de
clorofila presentes nas folhas, temperatura, área foliar e a massa seca e fresca.
25
Figura 2. Detalhe do rizotron – equipamento que permite avaliação de raízes de feijão
comum e da casa de vegetação na qual estes equipamentos foram instalados para o
experimento, localizada na Fazenda Santa Elisa, no Centro Experimental Central do
Instituto Agronômico.
3.3.3 Determinação das massas fresca e seca
Para a determinação da massa fresca foram pesadas amostras de folhas, caules e
raízes. Posteriormente, as amostras foram embaladas em sacos de papel e secas em
estufa com circulação de ar forçada à temperatura de 60°C. Após atingir o peso
constante, foi determinada a massa seca.
3.3.4 Análise de clorofila
A estimativa do conteúdo de clorofila na folha, por meio da medida da coloração
verde, foi feita pelo método não destrutivo utilizando o medidor portátil SPDA-502
(Soil-Plant Analysis Development Section, Minolta). Foram feitas cinco leituras em
cada folha amostrada, às quais as médias foram expressas em Unidades SPAD.
3.4 Análise de dados
Análises de variância (ANOVA) das variáveis nos tratamentos irrigado e não
irrigado foram realizadas utilizando o pacote estatístico SAS v.8.2 (Instituto SAS, Cary,
26
NC, EUA) para cada característica avaliada, a nível de probabilidade de 0,05 foi
considerado estatisticamente significativo. Foi aplicado o teste de Tukey para
comparação das médias das amostras.
3.5 Genotipagem com marcadores SNPs
A genotipagem para os 384 SNPs foi conduzida via tecnologia Vera Code® em
plataforma BeadXpress (Illumina) no Laboratório de Biotecnologia da Embrapa Arroz e
Feijão (Goiás, GO). Um conjunto de 384 marcadores SNPs, validados através do Prelim
file (https://icom.illumina.com/Custom/UploadOpaPrelim/), previamente identificados
para Phaseolus vulgaris (Müller et al. em elaboração) e derivados do polimorfismo
entre as linhagens BAT477, de origem Mesoamericana, e Jalo EEP558, de origem
Andina, foram selecionados para compor o Oligo Pool Assay (OPA) de marcadores
SNPs. Foi realizado um teste de polimorfismo na população AS. Durante o
procedimento de detecção dos SNPs na plataforma BeadXpress foram utilizados três
oligonucleotídeos, sendo dois alelo-específicos (ASO) para cada uma das variações de
um mesmo SNP e o terceiro loco-específico (LSO), ligando-se à região 3’ do fragmento
de DNA contendo o SNP alvo. Após a hibridização, o processo consistiu na extensão
das regiões entre o ASO e o LSO, seguido pela fusão das mesmas a partir de uma
enzima ligase formando, assim, um único fragmento alelo-específico. Posteriormente
esse fragmento foi amplificado utilizando a enzima Titaniun Taq DNA polimerase e
primers complementares à região ASO marcados com as fluorescências Cy3 e Cy5. Ao
final, os produtos derivados da PCR foram hibridizados através da complementaridade
da região LSO com as seqüências presentes na superfície das beads holográficas. A
genotipagem dos SNPs foi realizada por meio do programa GenomeStudio versão 1.8.4
(Illumina, EUA) utilizando valores de Call Rate variando de 0,80 a 0,90 e GenTrain ≥
0,26 para o agrupamento dos SNPs. A clusterização (agrupamento) para a chamada dos
alelos referente a cada SNP foi feita, a priori, de modo automatizado com base na
intensidade dos sinais emitidos a partir dos fluoróforos Cy3 e Cy5, os quais foram
agrupados em três classes de genótipos representativas dos grupos de homozigotos para
os alelos AA ou BB e heterozigoto AB. Para a análise dos dados, os agrupamentos
foram individualmente e manualmente ajustados determinando os melhores clusters
com base no perfil dos genitores. Ao todo foram avaliadas 98 amostras, compostas
pelos dois genitores avaliados em duplicata e 94 RILs.
27
3.6 Caracterização e Genotipagem com marcadores Microssatélites
Inicialmente, para verificar quais microssatélites eram polimórficos para os
genitores SEA5 e AND277, foram utilizados um total de 594 marcadores
microssatélites, em sua grande maioria com a temperatura de anelamento já obtida na
literatura e alguns sendo caracterizados por gradiente.
Cada par de primer foi caracterizado quanto à temperatura ideal de anelamento
para PCR. As reações de amplificação foram realizadas com 30 ng de DNA, 1U de Taq-
DNA polimerase, 1,5 mM de cloreto de magnésio, 0,15 mM de cada dNTP, 0,8
pmol/μL de cada primer (direto e reverso) e 1x de tampão da enzima, num volume total
de 15 μL. As condições de amplificação utilizadas para os SSRs genômicos foram: 1)
94ºC, 1 min.; 2) 94ºC, 1 min.; 3) temperatura de anelamento (Ta) específica para cada
SSR por 1 min.; 4) 72ºC, 1 min., 5) volta ao passo 2 por 30 vezes; 6) 72ºC, 5 min.; 7)
15ºC, incubação final. O termociclador MyCycler (BioRAD) foi utilizado. Para os
microssatélites que não possuíam temperatura de anelamento definida, as amplificações
foram realizadas em gradiente de temperatura, de acordo com as seguintes condições: 1)
94oC, 1 min; 2) 94oC, 1 min; 3) temperatura de anelamento (Ta) de 45ºC-56ºC ou
56ºC-65ºC por 1 min.; 4) 72oC, 1 min, 5) volta ao passo 2 por 30 vezes; 6) 72ºC por 5
min.; 7) 15ºC, incubação final.
Para verificar a qualidade das amplificações, primeiramente os produtos das
reações de amplificação foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 3%, corado
com GelRed™ 1X (Biotium, Inc. Hayward, CA) para visualização das bandas. Os locos
que apresentaram padrão adequado de amplificação foram submetidos à eletroforese em
gel de poliacrilamida denaturante 6%, corados com nitrato de prata, de acordo com
Creste et al. (2001).
Os géis de poliacrilamida 6% foram feitos a partir de solução de poliacrilamida
6% (150 mL de acrilamida 40%, 420 g de uréia, 200 mL de TBE 5X, volume completo
para 1L) filtrada e polimerizada por aproximadamente 2h com 960 μL de PSA
(Persulfato de Amônio) e 60 μL de TEMED. Após aquecimento do gel em cuba de
eletroforese (Nucleic Acid Sequencing Systems – CBS Scientific Company, INC) por 20
min. à 900 V, 5 L de reação de cada amostra foram aplicados no gel, preparados a
partir de 15 L de produto de PCR com 5 L de formamida. Foram feitas duas entradas
por placa, sendo que uma placa continha 54 amostras de DNA mais o ladder de 50
28
pares de base (Invitrogen) e a outra, 53 amostras mais o ladder, utilizando-se uma placa
para genotipar cada microssatélite para as 105 linhagens e os dois genitores. A corrida
foi de aproximadamente 4h a 800- 900V.
3.7 Construção do mapa genético AS
As análises de segregação dos SNPs e SSRs das 105 linhagens recombinantes F8
e dos genitores SEA 5 e AND 277 foram realizadas utilizando o teste de Qui-quadrado,
pela equação: fo
fefoX
22 )(
, em que: χ2 = valor calculado do Qui-Quadrado; fo =
freqüência observada em cada uma das classes; fe = freqüência esperada em cada uma
das classes. Os valores obtidos do Qui-Quadrado foram convertidos em seus respectivos
p-valores através do programa estatístico “R” (version 2.5.1 – The R Foundation for
Statistical Computing, 2007). Os marcadores foram inseridos um a um pelo comando
“try” no mapa, checando a posição mais favorável a cada inserção de uma nova marca.
Para refinar as análises, primeiro foram testados os marcadores mais informativos, que
não apresentaram desvio de segregação. As estimativas de fração de recombinação e
consequente formação dos grupos de ligação foram feitas através da análise Multiponto,
adotando-se um valor de limite de detecção (LOD-score) de 3,0 e uma freqüência
máxima de recombinação de 40 (r = 0,40), assumindo distância de mapeamento de
Kosambi (Kosambi, 1944).
A distância do mapa foi obtida através da conversão da fração de recombinação
entre as marcas em distância de mapa, ou seja, cM. Os cálculos foram baseados em
análises Multiponto, que utilizam todas as informações de fração de recombinação entre
as marcas de cada grupo. Por fim, o desenho de cada grupo de ligação com os
marcadores em suas respectivas ordem e distância foi feito através do programa
MapChart 2.2 (Voorrips, 2002), para formar o mapa.
3.8 Mapeamento dos locos associados à tolerância ao estresse hídrico
A partir do mapa genético gerado no MapChart 2.2 e dos dados fenotípicos da
população de mapeamento, as análises para identificação dos locos ligados à tolerância
ao estresse hídrico foram realizadas pelo programa QTL Cartographer vs.1.17 (Basten
et al., 2005).
29
Para estimar as posições e os efeitos genéticos de interação dos QTLs
(dominância e epistasia) foi utilizada a metodologia de Mapeamento por Intervalo
Composto (Kao et al., 1999), que utiliza a estatística de Critério de Informação
Baysiano (Baysian Information Criterion – BIC), como recomendado por Zeng et al.
(1999), para a escolha do melhor modelo, incluindo ou excluindo os efeitos principais
dos QTLs e de epistasia. A significância dos efeitos e a presença dos QTLs foi
verificada utilizando o teste da razão de Máxima Verossimilhança.
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Extração e Quantificação de DNA
As extrações de DNA das 105 linhagens endogâmicas da população de
mapeamento do tipo RIL, gerada a partir do cruzamento entre ‘AND277’ x ‘SEA5’ e
dos genitores foi feita com a população em F8. Os DNAs foram visualizados em gel de
agarose 1% e quantificados pelo NanoDrop 2000 (Figura 3). Para a genotipagem com
os microssatélites, foram utilizados os DNAs na sua concentração original.
Figura 3. Quantificação de DNA em gel de agarose 1%. Amostras de feijão da
população AS extraídas em sua concentração original.
4.2. Caracterização de microssatélites e genotipagem da população de mapeamento
com SSRs e SNPs
Antes da genotipagem da população de mapeamento e da construção do mapa
genético AS foram realizadas avaliações de polimorfismo com os microssatélites no
DNA dos genitores AND277 e SEA5 em gel de poliacrilamida 6% (Figura 4). Também
foi feita a caracterização dos microssatélites que não haviam temperatura de anelamento
definida em gel agarose 3% (Figura 5).
30
Figura 4. Teste de avaliação de polimorfismo no DNA dos genitores AND277 e SEA5
de feijão comum com microssatélites. Gel de poliacrilamida 6% corado com nitrato de
prata com microssatélites de temperatura de anelamento 60ºC dos DNAs dos genitores
AND277 e SEA5, respectivamente.
Figura 5. Caracterização dos SSRs em gel de agarose 3% em feijão comum. PCR
realizada em gradiente nas temperaturas de 45°C à 55°C. Cada coluna representa um
microssatélite, sendo o DNA do genitor AND277 amplificado.
31
No total, 594 marcadores foram genotipados no DNA dos genitores e apenas os
microssatélites que apresentaram polimorfismo entre os genitores foram utilizados na
genotipagem da população de mapeamento AS para a avaliação do polimorfismo em gel
poliacrilamida 6%. Os microssatélites utilizados são provenientes da literatura
(Benchimol et al., 2007; Blair et al., 2003; Blair et al., 2006; Blair et al., 2008; Blair et
al., 2009; Buso et al., 2006; Caixeta et al., 2005; Campos et al., 2007; Campos et al.,
2011; Cardoso et al., 2008; Perseguini et al., 2011; Gaitán-Solís et al., 2002; Grisi et al.,
2007; Guerra-Sanz, 2004; Hanai et al., 2007).
As 105 linhagens da população de mapeamento F8, mais os genitores, foram
colocados em ordem crescente, sendo 54 amostras na primeira linha debaixo e 53 na
segunda, incluindo os genitores no final desta segunda linha como padrão de tamanho
dos alelos (Figura 6). A utilização de duas entradas foi muito importante, pois acelerou
o tempo gasto para cada SSR, facilitando a leitura dos géis e barateando o processo. As
bandas foram lidas em relação ao tamanho do alelo dos genitores AND277 (A) e SEA5
(B).
Figura 6. Genotipagem das 105 linhagens da população de mapeamento AS, com o
microssatélite PVM11. Gel de poliacrilamida 6% corado com nitrato de prata com duas
aplicações. A primeira linha contém 54 amostras e na segunda, 53 amostras, além do
DNA dos genitores. “A” referente ao genitor AND277 e “B” ao genitor SEA5.
Somente 188 microssatélites apresentaram perfil polimórfico entre os genitores e
destes, somente 150 apresentaram padrão de leitura nítida nas linhagens da população,
revelando 79,7% de aproveitamento. O número de microssatélites monomórficos foi de
32
306 e o restante de marcadores (100) que não amplificaram ou não apresentaram padrão
de bandas nítidas para leitura entre os genitores.
Quanto à genotipagem com os marcadores SNPs, foram encontrados 288 SNPs
polimórficos e estes foram utilizados na construção do mapa genético AS.
4.3. Construção do Mapa AS
Foi construído um mapa genético com marcadores microssatélites e SNPs
genotipados na população AS.
Os marcadores foram submetidos ao teste de segregação via p-valor com auxílio
do programa “R”. Todas as marcas apresentaram segregação Mendeliana esperada de
1:1.
Do total de 438 marcadores, 27 SNPs não foram utilizados nas análises por se
tratarem de SNPs heterozigotos, restando 411 marcadores para a construção do mapa.
Após as análises de ligação, 331 marcas ligaram-se aos onze grupos de ligação
formados que foram mantidas com alto grau de confiabilidade em relação ao
cromossomo e posição de mapa. Destas marcas, 79 locos correspondem aos
microssatélites e 252 aos SNPs (Figura 7).
Figura 7. Mapa genético para feijão comum, derivado das análises de ligação entre 79
marcadores microssatélites e 252 SNPs genotipados na população segregante AND277
X SEA5 (AS). Os locos previamente mapeados em outras populações e ancorados em
seus respectivos grupos de ligação encontram-se sublinhados.
33
Figura 7. Mapa genético para feijão comum, derivados das análises de ligação entre 79
marcadores microssatélites e 252 SNPs genotipados na população segregante AND 277
X SEA 5 (AS). Os locos previamente mapeados em outras populações e ancorados em
seus respectivos cromossomos encontram-se sublinhados.
A cobertura do genoma foi de 1.515,2 cM, com densidade média de mapa de 4,5
cM entre marcas. O tamanho dos grupos de ligação variou de 63,1 cM (grupos de
ligação 10) a 221,2 cM (grupos de ligação 1). O número de locos ligados variou de 23
(grupos de ligação 4) a 40 (grupos de ligação 3). Na tabela 3, encontram-se as principais
características do mapa obtido com 331 locos mapeados com microssatélites e SNPs.
34
Tabela 3 – Distribuição dos SSRs e SNPs, mapeados nos 11 grupos de ligação de feijão
comum, no mapa genético desenvolvido a partir da população AND277 x SEA5 (AS).
A saturação, comprimento de distância média entre os marcadores para cada grupo de
ligação é descrita.
Grupos de
ligação1
Nº Loci
ligados
Nº Loci
ancorados/ligados
Comprimento
(cM)
Distância
(cM) entre
loci3
1 36 7 221,2 6,1
2 32 9 161,4 5,0
3 40 7 159,4 3,9
4 23 4 128,4 5,5
5 27 4 147,2 5,4
6 27 5 148,3 5,4
7 30 7 179,6 5,9
8 29 4 86,7 2,9
9 24 4 112,4 4,6
10 28 3 63,1 2,2
11 35 2 107,5 3,0
Média 30 5 137,7 4,5
Total 331 56 1515,2 49,9
1 Ordenação dos grupos de ligação de acordo com o Core Map (Freyre et al., 1998).
3 Média Aritmética.
Segundo informações obtidas (Rosana Brondani, Embrapa Arroz e Feijão,
Goiás, comunicação pessoal, dados não publicados), os SNPs ficaram ligados
corretamente nos respectivos cromossomos deste mapa, pois já tinham sido mapeados
em outra população, a “BAT93 X Jalo EPP558” da Embrapa Arroz e Feijão (Goiânia,
GO) e também realizado BLAST no genoma de feijão comum disponível no site
Phytozome (www.phytozome.net).
Os marcadores SNPs ficaram distribuídos em todos os grupos de ligação,
variando de 17 (grupo nove) a 31 SNPs (grupo onze) e os marcadores SSRs variaram de
4 (grupo onze) a 10 (grupo um, dois e três).
Os grupos de ligação que não apresentaram subdivisões foram re-ordenados com
os locos ancorados inseridos ao final da ordenação. Desta forma, foram obtidos grupos
de ligação concisos, uma vez que foi possível retirar com confiança locos que não
apresentaram nível de ligação satisfatório (LOD ≥ 3,0). A identificação deste tipo de
35
loco indica a necessidade de uma maior saturação dos grupos de ligação, uma vez que a
marca se encontra ligada ao grupo de ligação, contudo não possui um loco próximo o
suficiente para posicioná-la com confiança em relação às demais marcas.
O grupo de ligação 3 foi o que apresentou maior saturação, com 40 marcas
ligadas, entre elas 30 SNPs e 10 SSRs. O GL1 foi o grupo de ligação com maior
distância de mapa encontrado, portando 221,2 cM e um total de 36 marcas ligadas.
Em relação ao GL3, que apresentou um grande número de marcas ligadas, a
ordem entre elas foi mantida ao longo do grupo de ligação se comparado com trabalhos
anteriores (Campos et al., 2011; Garcia et al., 2011, Córdoba et al., 2010)
No GL 2 foi mapeado o loco FJ37, resultado também encontrado por Hanai
(2008) em sua tese sobre mapeamento com a população BJ e SSRs derivados de ETSs
advindos do BEST (Banco de EST de feijão, Melotto et al., 2005).
Os trabalhos de Blair et al. (2010) e de Galeano et al. (2009) mapearam nas
populações DOR364 X BAT477 e DOR364 × G19833, respectivamente, os locos
“ATA” (Blair et al., 2008) nos mesmos grupos de ligação que o mapa AS (GLs 2 e 10).
A co-localização dos marcadores em comparação com outros mapas de feijão e
também no genoma de feijão disponível no Phytozome, inclusive em relação à suas
respectivas posições mantidas nos 11 grupos de ligação mapeados, relevam a robustez e
confiabilidade do mapa genético AS gerado neste trabalho. Isso faz com que as marcas
mapeadas tornem-se importantes alvos em trabalhos de melhoramento, uma vez que,
independentemente da população de mapeamento utilizada, ou seja, independentemente
do genótipo analisado para construção dos mapas de ligação, essas marcas representam
locos bem caracterizados e conservados na espécie.
Além disso, foi possível ligar um grande número de novos locos, com distâncias
inferiores a 37,5 cM (gaps), o que não somente possibilita maior saturação em relação a
outros mapas já desenvolvidos (Campos et al., 2011, Garcia et al., 2011, Córdoba et al.,
2010, Oblessuc et al. 2012, Blair et al., 2010), como também disponibiliza uma nova
ferramenta para o mapeamento de características agronomicamente importantes, úteis
em estudos de seleção assistida, ou ainda estudos de mapeamento fino e clonagem
posicional.
4.4. Fenotipagem da população de mapeamento
Durante o experimento de estresse hídrico aplicado nas casas de vegetação em
vasos, a média de temperatura e umidade da casa de vegetação do tratamento irrigado
36
foi de 32,1ºC e 52,9% e, da casa de vegetação não irrigada foi de 34,5ºC e 45,2%,
respectivamente. As análises de variância apresentaram diferenças estatisticamente
significativas (P < 0,001) no tratamento irrigado nos genitores para as características de
massa seca das folhas, temperatura das folhas, dias até o florescimento, número de
vagens, número de sementes/vagem, rendimento, número de sementes, peso de 100
sementes e peso de vagens. Nas médias das RILs F8, resultantes do cruzamento
‘AND277 x SEA5’, houve diferenças estatisticamente significativas para o caráter
conteúdo de clorofila, massa fresca das folhas, massa fresca dos caules, massa seca das
folhas, massa seca do caule e termometria no tratamento irrigado. Já no tratamento não
irrigado, as médias das RILs apresentaram diferenças estatisticamente significativas
para as características de clorofila, área foliar, massa fresca e seca do caule e
temperatura da folha (Tabela 4).
Tabela 4: Estatística descritiva para as medidas de características quantitativas na
população AND277 x SEA5 de feijão comum e dos genitores do experimento de
tratamentos irrigado e não irrigado nos vasos, em casa de vegetação.
Características Irrigado Não irrigado
Genitores
Média
das RILs h2
g Genitores
Média
das RILs h2
g
SEA
5
AND
277 Diff
SEA5
AND
277 Diff
Clorofila 42,46 43 ns 41,69* 0,54 23,85 26,96 ns 26,81* 0,71
Área foliar 2099 2315.3 ns 1402,59* 0,74643 390,25 149 * 303,96* 0,87394
Massa fresca da folha 32,83 37,5 ns 26,59* 0,93 4,75 1,83 * 3,17ns
0,21
Massa fresca do caule 23,83 24,66 ns 17,07* 0,89 5,87 4,16 ns 4,92* 0,56
Massa seca da folha 4 6,83 * 3,47* 0,64 1,87 1 * 1,01ns
0,12
Massa seca do caule 3,33 4,33 ns 2,04* 0,36 1,25 1,5 ns 1,18* 0,39
Temperatura da folha 23 30,33 * 28,25* 0,61 33,33 35,5 * 34,63* 0,44
Dias até o
florescimento 31 37,75 * 36,77* 0,92 38 36 * 36,37* 0,94
Número de vagens 13 5,25 * 10,56* 0,49 13 5 * 14,53* 0,53
Número de
sementes/vagem 4,23 2,32 * 2,8* 0,64 4,5 2,7 * 2,75* 0,73
Rendimento (g /
planta) 9,46 4,6 * 6,67* 0,9 11,99 3,52 * 7,74* 0,95
Número de sementes 53,33 12,25 * 27,79* 0,35 48 10,5 * 37,65* 0,46
Peso das sementes
(g/100 sem.) 21,88 38,68 * 22,02* 0,84 23,18 12,47 * 23,89* 0,73
peso de vagem 4,14 1,14 * 2,28* 0,28 4,33 2,12 * 3,87* 0,68
* Diferenças significativas à probabilidade de 0,05, ns: não significativo, Diff: diferenças entre os
genitores, h2g: herdabilidade no sentido amplo
37
Segundo os resultados apresentados, os genitores da população são contrastantes
para a maioria das características avaliadas quando submetidos a estresse hídrico. Para
as RILs, sob essas mesmas condições, as características clorofila, área foliar, massa
fresca do caule, massa seca do caule, temperatura da folha, dias até o florescimento,
número de vagens por plantas, número de sementes por vagem, rendimento total da
planta (g/planta), número de sementes por planta, peso de 100 sementes e peso da
vagem serão úteis para o mapeamento de QTLs associados ao déficit hídrico na
população ‘AND277 x SEA5’. Algumas características não apresentaram diferenças
estatisticamente significativas para esta população segregante, mas apesar de não
apresentarem contraste também foram mapeadas.
Os resultados mostraram que os padrões de resposta a nível fisiológico e
morfológico ao déficit hídrico foram avaliados aos 33 dias, quando as plantas da casa de
vegetação com o tratamento ‘estresse hídrico’ atingiram, em média 160 kPa de
potencial hídrico do solo, e nestas condições, a umidade foi menor na casa de vegetação
sob estresse e as temperaturas foliares mostraram quase o mesmo padrão, com valores
mais altos na casa de vegetação sob estresse hídrico (Figura 8).
Figura 8. Parâmetros ambientais medidos durante o ciclo da população AND277 x
SEA5 de feijão comum (a) potencial matricial do solo, (b) umidade da casa de
vegetação, (c) temperatura foliar
38
A análise de variância dos padrões de resposta à seca detectou diferenças
significativas entre os genitores e RILs para a maioria das características. Na casa de
vegetação irrigada, os genitores SEA5 e AND277 diferiram quanto aos descritores
massa seca de folha, temperatura da folha, dias até o florescimento, número de vagens,
número de sementes por vagem, rendimento, número de sementes, peso de sementes e
peso de vagem. Entre as RILs, todas as características foram estatisticamente
significativas. Os dois genitores foram semelhantes em termos de clorofila, área foliar,
massa fresca de folhas e de caule e massa seca de caule. A herdabilidade foi menor para
peso de vagem (0,28) e maior para massa fresca de folhas (0,93).
Por outro lado, na casa de vegetação sob estresse hídrico, os genitores diferiram
para área foliar, massa fresca de folhas, massa seca de folhas, temperatura da folha, dias
para o florescimento, número de vagens, número de sementes por vagem, rendimento,
número de sementes, peso de sementes e peso de vagens. Entre as RILs, para os
caracteres massa fresca e massa seca de folhas, não houve diferenças significativas. A
herdabilidade no sentido amplo foi menor para o peso da folha de massa seca (0,12) e
maior para rendimento de grãos (0,95).
No tratamento irrigado, a produtividade média de todos os genótipos foi 2,84
g/planta e 1,97 g/planta, no tratamento sob estresse hídrico. Este resultado mostrou uma
redução de 30% na produção de grãos, devido ao índice de intensidade de seca
calculado.
Como o experimento da fenotipagem dos vasos foi realizado em duas casas de
vegetação separadas para os dois tratamentos aplicados, os valores de herdabilidade no
sentido amplo foram elevados, portanto para promover a diminuição da herdabilidade e
do erro experimental sugere-se que a aplicação dos dois tratamentos seja feita em
apenas uma casa de vegetação.
Segundo os resultados apresentados no experimento em casas de vegetação sob
condições de estresse hídrico, com a finalidade de avaliação do desenvolvimento das
raízes (Tabela 5), os genitores da população também são contrastantes para os
caracteres: área foliar, massa fresca da folha, massa seca do caule, temperatura da folha,
comprimento total de raízes, área superficial radicular e volume de raízes. Algumas
características não apresentaram diferenças estatisticamente significativas entre as RILs,
como massa fresca da folha, massa fresca do caule, massa seca da folha, massa seca do
caule e diâmetro de raízes. As características clorofila, área foliar, temperatura da folha,
39
comprimento total de raízes, área de superfície radicular e volume de raízes foram
estatisticamente significativos para esta população segregante.
Tabela 5. Análise de variância para características quantitativas dos genitores SEA5,
AND277 e das linhagens recombinantes da população AS de feijão comum em casa de
vegetação irrigada e não irrigada nos rizotrons.
Característica Irrigado Não irrigado
Genitores
média das
RILs h
2g
Genitores
média das
RILs h
2g
SEA5
AND
277 Diff
SEA 5 AND277 Diff
Clorofila 40,55 40,1 ns 39,84* 0,85 42,63 36,25 ns 38,17* 0,61
Área foliar 485 594,8 ns 391,99* 0,78 410,63 179,1 * 217,47* 0,30
Massa fresca da folha 5,68 7,25 ns 4,23* 0,75 3,61 1,82 * 1,99ns
0,05
Massa fresca do caule 4,55 4,48 ns 4,13ns
0,17 2,31 3,23 ns 2,20ns
0,01
Massa seca da folha 0,81 1,9 * 0,93ns
0,13 1,41 0,78 ns 0,66ns
0,11
Massa seca do caule 0,41 0,98 ns 0,7ns
0,06 0,73 1,59 * 0,53ns
0,13
Temperatura da folha 19,5 19 ns 19,08ns
0,2 21,66 19 * 20,86* 0,40
Comprimento total de
raízes (m planta-1) 1248 2222,5 ns 1847,81ns
0,07 2371,4 1079,6 * 1775,72* 0,3
Área de superfície
radicular 135,62 205,33 ns 181,97* 0,45 239,63 93,89 * 198,54* 0,82
Volume de raízes
(cm3 planta
-1) 1,17 1,5 ns 1,49* 0,64 1,41 0,59 * 0,95* 0,21
Diâmetro de raízes
(mm) 0,35 0,29 ns 0,3ns
0,01 0,26 0,25 ns 0,26ns
0,07
* Diferenças significativas à probabilidade de 0,05, ns: não significativo, Diff: diferenças entre os
parentais, h2g: herdabilidade no sentido amplo
4.5 QTLs para a tolerância ao estresse hídrico
Para os dados fenotípicos obtidos no experimento dos vasos e dos rizotrons das
105 linhagens recombinantes da população AND277 x SEA5 (AS), foram realizados
testes estatísticos para verificar se eles estavam ou não normalizados, a fim de utilizá-
los nas análises de mapeamento de QTL. Os testes utilizados para esta avaliação foram
o Skewness, Kurtosis e Shapiro (Tabelas 6 e 7).
40
Tabela 6. Estatísticas descritivas para características quantitativas avaliadas na
população AND 277 X SEA 5 do experimento realizado em vasos em casa de
vegetação.
Características Skewness Kurtosis Shapiro-wilk p valor
CI 0,2521 2,3155 0,9743 <0,0001*
CNI 0,3265227 0,5741205 0,987999 0,0056*
AFI 3,2192017 51,74894 0,668798 <0,0001*
AFNI 0,2524645 1,2333302 0,981124 0,0003*
MFFI 0,6048856 3,3423528 0,958267 <0,0001*
MFFNI 0,3104951 0,8344974 0,985677 0,0045*
MFCI 0,5038602 2,0778767 0,968003 <0,0001*
MFCNI 0,5471411 0,3567925 0,980573 0,0002*
MSFI 0,2278624 2,1416397 0,976136 <0,0001*
MSFNI 0,2124753 -0,434425 0,989543 0,0216ns
MSCI 0,385813 1,2699492 0,984967 0,0021*
MSCNI 0,0430564 -0,292912 0,993814 0,1802ns
TII 0,0003301 -0,602149 0,989967 0,0281ns
TINI 0,162045 -0,248152 0,994755 0,2955ns
NVI 0,4427387 3,2771693 0,962555 <0,0001*
NVNI 0,5490551 1,7796124 0,974562 0,0001*
SVI 1,2567547 17,002439 0,865663 <0,0001*
SVNI 0,0109032 2,5221149 0,961073 <0,0001*
NSI 0,8686761 5,4055397 0,950637 <0,0001*
NSNI 0,5657035 1,3434045 0,978579 0,0005*
PSI 1,0914729 6,0948002 0,901571 <0,0001*
PSNI 0,1329638 17,375184 0,830788 <0,0001*
FI -1,014628 4,6333071 0,879631 <0,0001*
FNI -1,71401 11,76586 0,645045 <0,0001*
PSVI 0,4873849 1,977694 0,9745 <0,0001*
PSVNI 0,4259785 2,526472 0,950539 <0,0001*
PSSI 2,5860714 20,334402 0,810543 <0,0001*
PSSNI -0,224504 0,483523 0,989632 0,0504ns
CI/CNI: Clorofila Irrigado/Não irrigado, AFI/AFNI: Área foliar Irrigado/Não irrigado, MFFI/MFFNI:
Massa fresca folha irrigado/Não irrigado, MFCI/MFCNI: Massa fresca caule irrigado/Não irrigado,
MSFI/MCFNI: Massa seca folha irrigado/Não irrigado, MSCI/MSCNI: Massa seca caule irrigado/Não
irrigado, TII/TINI: temperatura da folha irrigado/Não irrigado, NVI/NVNI: Número de vagens
irrigado/Não irrigado, SVI/SVNI: Número de sementes por vagem irrigado/Não irrigado, NSI/NSNI:
Número de sementes irrigado/Não irrigado, PSI/PSNI: Peso de 100 sementes Irrigado/Não irrigado,
FI/FNI: Dias até florescimento Irrigado/Não irrigado, PSVI/PSVNI: Peso seco de vagens Irrigado/Não
irrigado, PSSI/PSSNI: Produtividade Irrigado/Não irrigado.
* Nível de significância corresponde a p < 0,01.
ns: não significativo
41
Tabela 7. Estatísticas descritivas para características quantitativas medidas na
população AND277 X SEA5 do experimento em casa de vegetação em rizotrons.
Característica Skewness Kurtosis
Shapiro-
wilk p valor
CI -0,107757 0,7549668 0,98015 0,0077*
CNI 0,0423237 -0,035853 0,994268 0,5673ns
AFI -0,006149 1,2081877 0,978912 0,0059*
AFNI 0,0667326 1,0597483 0,98107 0,004*
MFFI 0,0711364 0,2302449 0,97863 0,0056*
MFFNI 0,1064899 27,584026 0,759573 <0,0001*
MFCI 0,043923 28,895651 0,721645 <0,0001*
MFCNI 0,0460647 0,4398309 0,991738 0,2241ns
MSFI 0,1792994 1,6944576 0,92579 <0,0001*
MSFNI 0,2537405 0,5475163 0,982651 0,0183ns
MSCI 0,258925 3,6340647 0,898345 <0,0001*
MSCNI 0,3612703 4,1237391 0,940278 <0,0001*
TII 0,5038891 2,4018606 0,937107 <0,0001*
TINI -0,412564 1,6829834 0,929508 <0,0001*
CRI 0,437326 1,5561357 0,977555 0,0026*
CRNI 0,1341793 0,5587391 0,991498 0,2126ns
ASRI 0,137251 3,3291797 0,960749 <0,0001*
ASRNI 0,4091746 2,2150666 0,96551 <0,0001*
VRI 0,0282132 1,2924399 0,982619 0,0142ns
VRNI 0,1383549 1,8750819 0,964718 <0,0001*
DRI 0,0973758 2,6351945 0,966574 0,0001*
DRNI 0,9989349 6,0990852 0,870029 <0,0001*
CI/CNI: Clorofila Irrigado/Não irrigado, AFI/AFNI: Área foliar Irrigado/Não irrigado, MFFI/MFFNI:
Massa fresca folha irrigado/Não irrigado, MFCI/MFCNI: Massa fresca caule irrigado/Não irrigado,
MSFI/MCFNI: Massa seca folha irrigado/Não irrigado, MSCI/MSCNI: Massa seca caule irrigado/Não
irrigado, TII/TINI: temperatura da folha irrigado/Não irrigado, CRI/CRNI: Comprimento de raízes
Irrigado/Não irrigado, ASRI/ASRNI: Área superficial de raízes Irrigado/Não irrigado, APRI/APRNI:
Área projetada de raízes Irrigado/Não irrigado, VRI/VRNI: Volume de raízes Irrigado/Não irrigado,
DRI/DRNI: Diâmetro de raízes Irrigado/Não irrigado.
* Nível de significância corresponde a p < 0,01.
ns: não significativo
Os valores significativos foram submetidos à transformação Box-cox (Osborne,
2010) com auxílio do programa estatístico R, a qual gera curvas para a normalização
dos dados para os dois experimentos (Anexos 1 e 2). O objetivo dessa normalização é
que os valores esperados das observações transformadas sejam descritos por um modelo
42
de estrutura simples, a variância seja constante e as observações estejam normalmente
distribuídas. Os valores não significativos foram mantidos, pois já estavam
normalizados.
A partir do parâmetro lambda (λ) indicado nestas curvas, foi escolhido o modelo
de normalização mais adequado a ser aplicado nos valores dos dados fenotípicos.
Para os dados obtidos no experimento de vasos para as características AFI, CI,
CNI, MFFNI, MSCI, NVNI, NSI, NSNI, PSI, PSVI, PSVNI e PSSI, a curva de
normalização se posicionou em 0,50 (λ= 0,50) revelando a necessidade de se aplicar a
transformação, elevando os valores a ½. Para as características de AFNI, MFCI, MSFI e
NVI, a curva de normalização ficou em 0,25 (λ= 0,25), tendo-se que elevar os valores a
1/4. Na característica de SVI, a curva posicionou em -0,50 (λ= -0,50), então os valores
foram elevados a (-½). As curvas de MFFI e PSNI ficaram em 0,33 (λ= 0,33), então os
valores foram elevados a 1/3. As características de FI e FNI, as curvas se posicionaram
em 1,5 (λ= 1,5), necessitando transformar os valores com log. Por fim, para as
características de SVNI e MFCNI, as curvas posicionaram em 0 (λ= 0) e os valores
também foram transformados em log. Os valores de MSFNI, MSCNI, TII, TINI e
PSSNI foram mantidos, já que λ= 1,0, revelando a não necessidade de normalização
neste conjunto específico de dados.
Para os dados obtidos no experimento de rizotrons para as características CI,
MSFI, CRI, ASRI, DRI e TINI a curva de normalização se posicionou em 0,50 (λ=
0,50) revelando a necessidade de se aplicar a transformação, elevando os valores a ½.
Para as características AFNI, MFFNI, MFCI e ASRNI a curva de normalização ficou
em 0,25 (λ= 0,25), tendo-se que elevar os valores a 1/4. As curvas de AFI, MFFI,
MSCI, MSCNI e VRNI ficaram em 0,33 (λ= 0,33) e os valores foram elevados a 1/3.
Para a característica DRNI, a curva ficou em -1,0 (λ= -1,0), então os valores sofreram
transformação recíproca inversa. Os valores de CNI, MFCNI, MSFNI, CRNI, VRI e TII
foram mantidos, já que λ= 1,0, revelando a não necessidade de normalização neste
conjunto específico de dados.
Após os dados das 105 linhagens serem normalizados, histogramas dos valores
de cada característica foram construídos para os dois experimentos (Anexo 3 e 4). E os
valores puderam ser utilizados para a as análises de mapeamento de QTL.
O mapeamento dos QTLs foi realizado para o experimento em casa de vegetação
com vasos e com rizotrons, separadamente. Os valores de threshold obtidos pelas
análises de permutação foram próximos ao LOD 3,0, sendo este o valor estabelecido
43
para identificação dos QTLs (Anexo 5). No total, 22 QTLs foram obtidos para o
experimento de vasos e 19 QTLs para o experimento de rizotrons, totalizando 41 QTLs
relativos à tolerância à seca, nomeados conforme a característica relacionada (Tabela 8).
Tabela 8 – Descrição dos QTLs relacionados à tolerância à seca encontrados via análise
de Mapeamento por Intervalo Composto (CIM), utilizando o mapa genético AS de
feijão comum. Os QTLs identificados foram nomeados conforme a característica do
QTL encontrado no experimento de vasos e rizotrons. O intervalo no mapa AS (cM) e o
marcador do pico dos gráficos de cada QTL, em seus respectivos grupos de ligação, o
LOD de cada pico, efeitos aditivos e efeitos na variância fenotípica (R2) de cada QTL
também são revelados.
CARACT
/
TRATA
GLB QTL EXPC INTERVALO
(cM)
MARCADOR* LOD EFEITO
ADITIVO
R2(%)
CI
1
1
3
5
CI 1.1
CI 1.2
CI 3.1
CI 5.1
Vasos
Vasos
Rizotron
Rizotron
96,83-111,08
114,7-140,7
120,3-138,9
46,6-67,8
BAR3454 (2 cM)
BAR3651 (0,0 cM)
BAR5055 (0,0 cM)
IAC227 (0,0 cM)
3,47
9,83
4,52
3,26
-0,208
0,359
-0,252
-0,152
11,2
32,8
15,6
10,5
CNI 6
11
CNI 6.1
CNI 11.1
Vasos
Vasos
95,54-140,45
56,23-78,68
BAR5885 (0,0 cM)
BAR3594 (0,0 cM)
10,83
4,3
-3,874
2,139
32,1
11,4
AFNI 1
AFNI 1.1
Rizotron
111,7-140,7 PVBR3 (0,0 cM) 6,52
-0,701
20,2
MFCI
1
1
3
3
3
6
7
MFCI 1.1
MFCI 1.2
MFCI 3.1
MFCI 3.2
MFCI 3.3
MFCI 6.1
MFCI 7.1
Vasos
Rizotron
Rizotron
Rizotron
Rizotron
Rizotron
Vasos
81,43-102,44
111,7-140,7
6,3-33
50,9-70,9
82,6-108,2
38,1-57
65,3-105,92
IAC11 (0,0 cM)
PVBR3 (0,0 cM)
BM189 (0,0 cM)
BAR5192 (16 cM)
BAR3353(2,0 cM)
BAR4089 (0,0 cM)
BAR4417 (0,0 cM)
3,27
7,67
3,7
3,5
5,12
4,14
3,75
0,066
-0,117
0,077
0,117
-0,123
0,089
0,076
10,2
21,7
9,2
15,8
15,7
10,9
13,2
MFCNI 3
MFCNI
3.1 Vasos 72,55-98,25 BM159 (2 cM)
4,14
-0,109
18,2
MFFI 1
7
MFFI 1.1
MFFI 7.1
Rizotron
Vasos
107-140,7
65,3-101,92
PVBR3 (0,0 cM)
BAR3122 (0,0 cM)
8,92
4,06
-0,261
0,131
26,6
13,6
MSFI 1
7
MSFI 1.1
MSFI 7.1
Rizotron
Vasos
111,7-140,7
71,3-103,92
BAR4423 (0,0 cM)
BAR4417 (1 cM)
5,18
3,03
-0,129
0,039
16,8
11,2
CRI
2 CRI 2.1 Rizotron 50,6-72,7 PVBR25 (0,0 cM) 5,58 -6,325 19,2
CRNI 1
6
CRNI 1.1
CRNI 6.1
Rizotron
Rizotron
131,7-156,1
0-34
ATA3 (0,0 cM)
BM3 (10 cM)
3,19
3,28
-3,117
4,365
9,7
19,1
ASRI 1
ASRI 1.1
Rizotron
111,7-140,7
PVBR3 (0,0 cM)
5,02
-1,960
18,6
ASRNI
6
ASRNI
6.1
Rizotron
0-57
BM3 (13 cM)
5,18
0,332
32,5
MSCI 1
3
MSCI 1.1
MSCI 3.1
Rizotron
Rizotron
113,7-140,7
5,3-34
PVBR3 (0,0 cM)
BM189 (0,0 cM)
6,4
3,1
-0,120
0,064
22,1
9,8
VRI 6 VRI 6.1 Rizotron 0-49 FJ20 (8 cM) 3,31 0,403 16,6
DRI 6 DRI 6.1 Rizotron 47-85,7 PVBR5 (1 cM) 3,49 0,012 13,6
TII 4 TII 4.1 Vasos 11,41-42,23 BAR4881 (0,0 cM) 3,35 0,613 12,3
TINI 7 TINI 7.1 Vasos 140,9-171,98 BAR2897 (6 cM) 3,04 0,572 14,0
NVI 7 NVI 7.1 Vasos 73,3-102,92 BAR3682 (0,0 cM)
3,21 -0,061 12,6
44
NSI 6
NSI 6.1 Vasos 77,71-102,54 PVM21 (5 cM)
3,3 -0,378 12,8
NSNI 7
8
NSNI 7.1
NSNI 8.1
Vasos
Vasos
29-54,34
39,86-63,42
BAR3045 (3 cM)
BAR4250 (8 cM)
4,07
4,07
-0.519
-0.038
15,5
0.0
PSI 5 PSI 5.1 Vasos 42,67-116,38 BAR4677 (5 cM) 3,91 -0,290 14,4
PSNI 1 PSNI 1.1 Vasos 54,88-76,87
BAR3474 (0,0 cM) 4,39 -0,120 17,3
FI 1
3
FI 1.1
FI 3.1
Vasos
Vasos
117,7-140,76
74,55-159,28
BAR4823 (0,0 cM)
BAR3097 (0,0 cM)
3,17
5,09
-0,014
-0,016
10,8
14,3
PSVNI 11 PSVNI
11.1 Vasos 56,23-77,52 BAR3100 (0,0 cM) 3,48 -0,155 14,1
PSSI 1
11
PSSI 1.1
PSSI 11.1
Vasos
Vasos
81,43-98,87
50,03-75,83
BAR3084 (0,0 cM)
BAR4938 (0,0 cM)
3,17
3,49
0,190
-0,192
10,0
11,8 A
Característica/Tratamento; B
Grupo de ligação; C Experimento;
* Entre parênteses está a distância do marcador ao pico do QTL; 2Coeficiente de determinação fenotípica.
Neste trabalho, foram identificados QTLs em todos os grupos de ligação, exceto
nos GLs 9 e 10 (Figura 9). Foram encontrados QTLs que controlam várias
características simultaneamente, como alguns dos do GL 1 (CI 1.2, AFNI 1.1, MFCI
1.2, MSFI 1.1, ASRI 1.1, MSCI 1.1 e FI 1.1).
No GL 1 foi encontrado o QTL para peso de 100 sementes, que também foi
identificado no trabalho de Broughton et al. (2003) para o mesmo grupo de ligação.
Porém, estes autores identificaram dois QTLs para ‘peso de sementes’ no GL 7,
enquanto no mapa AS foram identificados apenas QTLs relacionados à seca para os
caracteres número de sementes e temperatura das folhas. Além destes, QTLs que
controlam número de vagens foram encontrados nos GLs 1 e 8 pelos mesmos autores,
enquanto neste trabalho foi encontrado apenas um QTL da mesma característica no GL
7. QTLs para o caráter ‘número de dias até o florescimento’ estão localizados nos GLs 1
e 3, enquanto no trabalho de Broughton et al. (2003) estes QTLs foram posicionados
nos GLs 1 e 8.
Do total de 41 QTLs encontrados, apenas 12 QTLs foram identificados no mapa
AS no tratamento sob estresse hídrico e 29 na condição irrigada. Os QTLs mais
interessantes são os encontrados sob condição de seca que controlam as características:
área foliar, comprimento de raiz, peso de 100 sementes, massa fresca do caule, área
superficial de raiz, clorofila, temperatura das folhas, número de sementes e peso seco de
vagens.
Estes QTLs encontrados são interessantes na medida em que controlam
características que se alteram sob a condição de seca, ou seja, refletem as respostas do
feijão comum para o seu desenvolvimento apesar da falta de água.
45
Figura 9 – Mapa genético AS de feijão comum mostrando a localização dos 41 QTLs
encontrados relacionados às características de tolerância à seca. Os QTLs em verde são
derivados do experimento em casa de vegetação com vasos. Os QTLs em vermelho são
derivados dos experimentos em casa de vegetação com rizotrons. Os QTLs de seca
estão identificados como NI (não irrigados).
46
Figura 9 – Mapa genético AS de feijão comum mostrando a localização dos 41 QTLs
encontrados relacionados às características de tolerância à seca. Os QTLs em verde são
derivados do experimento em casa de vegetação com vasos. Os QTLs em vermelho são
derivados dos experimentos em casa de vegetação com rizotrons. Os QTLs de seca
estão identificados como NI (não irrigados).
Foram detectados QTLs relacionados à raiz nos grupos de ligação 1, 2 e 6
(ASRN1.1, CRNI1.1, CRI2.1, CRNI6.1, ASRNI6.1, VRI6.1 e DRI6.1), porém no
trabalho de Asfaw & Blair (2012) foram detectados QTLs de massa seca de raiz e
comprimento de raiz no GL 11.
Os QTLs de maior efeito para variância fenotípica foram associados aos
caracteres: clorofila irrigado (CI 1.2) e clorofila não irrigado (CNI 6.1), obtidos no
experimento de vasos, com os valores respectivos de 32,8% e 32,1%. O QTL de maior
47
efeito obtido no experimento de rizotrons é o de área superficial de raiz não irrigado
(ASRNI 6.1), com o valor de 32,5% (Tabela 9).
Estes QTLs de maior efeito na variância fenotípica são mais interessantes para
seleção assistida em condições de estresse hídrico a fim de ser adotado em programas de
melhoramento.
Tabela 9 – Descrição dos QTLs significativos para tolerância à seca com maiores
valores de efeito na variância fenotípica e os marcadores que envolvem estes QTLs,
encontrados via análise de Mapeamento por Intervalo Composto (CIM) utilizando o
mapa genético AS de feijão comum. Os QTLs identificados foram nomeados conforme
a característica do QTL encontrado no experimento de vasos e rizotrons.
QTL GLA EXPB MARCADORES R2(%)
CNI 6.1
CNI 11.1
6
11
Vasos
Vasos
UNA155
IAC132
BAR5885
IAC287
BAR5262, BAR4303,
BAR5330, BAR4938,
BAR3140, BAR5610,
BAR4184, BAR3439,
BAR4026, BAR3777,
BAR3131, BAR6352,
BAR5268, BAR3100,
BAR3594, BAR4506,
BAR3566, BAR3416,
BAR3294, BAR3020,
BAR4876, BAR3967,
BAR3319, BAR3700,
BAR3194
32,1
11,4
AFNI 1.1
1
Rizotron
PVBR3
PVBR218
BAR3651
BAR4423
BAR4823
20,2
MFCNI
3.1
3
Vasos
BAR3239
BM159
BAR4979
BAR4496
BAR3353
18,2
CRNI 1.1
CRNI 6.1
1
6
Rizotron
Rizotron
ATA3
BM3
9,7
19,1
ASRNI
6.1
6
Rizotron
BM3
FJ20
BAR4089
32,5
TINI 7.1 7 Vasos
BAR2897
BM160
14,0
48
NSNI 7.1
7
Vasos
IAC232, BAR6129,
BAR5944, BAR4097,
BAR3298, BAR3840,
BAR3814, BAR3822,
BAR5575, BAR3950,
BAR4020, BAR3413,
BAR5288, BAR3045
15,5
PSNI 1.1 1 Vasos
BAR3474
17,3
PSVNI
11.1 11
BAR5262, BAR4303,
BAR5330, BAR4938,
BAR3140, BAR5610,
BAR4184, BAR3439,
BAR4026, BAR3777,
BAR3131, BAR6352,
BAR5268, BAR3100,
BAR3594, BAR4506,
BAR3566, BAR3416,
BAR3294, BAR3020,
BAR4876, BAR3967,
BAR3319, BAR3700,
BAR3194
14,1
A Grupo de ligação;
B Experimento
2Coeficiente de determinação fenotípica.
49
5 CONCLUSÕES
O mapa genético AND277 x SEA5 (AS) foi obtido altamente saturado e sem
gaps com o uso de marcadores SSRs e SNPs.
Os marcadores microssatélites e SNPs mapeados tiveram distribuição
homogênea no genoma do feijoeiro e com bom nível de polimorfismo, tendo sido
posicionados em todos os grupos de ligação.
Segundo as avaliações fenotípicas, os genitores são contrastantes e isto tornou
favorável a identificação dos QTLs relacionados às características de tolerância à seca,
que foram mapeadas nos grupos de ligação, exceto nos GLs 9 e 10.
Um grande número de QTLs relacionados à tolerância à seca foi mapeado,
confirmando padrão de herança poligênica de tolerância para esta deficiência.
Este estudo apresentou uma importante contribuição para o melhoramento, por
ter revelado os QTLs de maior efeito na variância fenotípica sob condições de estresse
hídrico e que são indicados na Seleção Assistida por Marcadores Moleculares adotados
em programas de melhoramento.
Há necessidade de novos experimentos de fenotipagem para tolerância ao
estresse hídrico em outro ambiente, que possibilitem isolar os efeitos ambientais dos
efeitos genéticos, e melhorar a detecção do efeito genético para cada QTL detectado e
verificar a estabilidade dos QTLs de maior efeito.
50
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62
7 ANEXOS
Anexo 1. Curvas de normalização dos dados fenotípicos das características avaliadas no
experimento em casa de vegetação feita em vasos das linhagens recombinantes da
população segregante AND277 X SEA5 (AS). AFI (λ= 0,50), AFNI (λ= 0,25), CI (λ=
0,5), CNI (λ= 0,5), FI (λ= 1,5), FNI (λ= 1,5), MFCI (λ= 0,25), MFCNI (λ= 0), MFFI
(λ= 0,33), MFFNI (λ= 0,50), MSCI (λ= 0,50), MSFI (λ= 0,25), NSI (λ= 0,50), NSNI
(λ= 0,50), NVI (λ= 0,25), NVNI (λ= 0,50), PSI (λ= 0,50), PSNI (λ= 0,33), PSSI (λ=
0,50), PSVI (λ= 0,50), PSVNI (λ= 0,50), SVI (λ= -0,50), SVNI (λ= 0). 95% confiança.
63
64
65
66
Anexo 2. Curvas de normalização dos dados fenotípicos das características avaliadas no
experimento em casa de vegetação feita em rizotrons das linhagens recombinantes da
população segregante AND277 X SEA5 (AS). AFI (λ= 0,33), AFNI (λ= 0,25), CI (λ=
0,5), CRI (λ= 0,5), ASRI (λ= 0,5), ASRNI (λ= 0,25), DRI (λ= 0,5), DRNI (λ= -1,0),
MFCI (λ= 0,25), MFFI (λ= 0,33), MFFNI (λ= 0,25), MSCI (λ= 0,33), MSCNI (λ=
0,33), MSFI (λ= 0,50), TII (λ= 1,0), TINI (λ= 0,50) e VRNI (λ= 0,33). 95% confiança.
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Anexo 3. Histogramas dos valores normalizados das características avaliadas na
população AS durante o experimento em casa de vegetação em vasos em ambiente
irrigado e não irrigado.
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Anexo 4. Histogramas dos valores normalizados das características avaliadas na
população AS durante o experimento em casa de vegetação em rizotrons em ambiente
irrigado e não irrigado.
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Anexo 5. Gráficos dos valores de LOD encontrados pela análise de CIM para a
identificação dos QTLs relacionados à seca em experimento realizados em vasos e em
rizotrons.
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