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LABORATLABORATÓÓRIO DE VIROLOGIA RIO DE VIROLOGIA -- LIM 52LIM 52

Curso: Curso:

Marcadores Moleculares aplicados Marcadores Moleculares aplicados a organismos de interesse epidemiola organismos de interesse epidemiolóógicogico

SUCEN SUCEN –– Superintendência de Controle de EndemiasSuperintendência de Controle de Endemias

São Paulo 17 a 22 de agosto de 2009São Paulo 17 a 22 de agosto de 2009


Aula : PCR EM TEMPO REAL Aula : PCR EM TEMPO REAL

JosJoséé Eduardo Levi Eduardo Levi

Instituto de Medicina Tropical Instituto de Medicina Tropical -- USPUSP


POR QUE USAMOS PCR PARA DIAGNÓSTICO?POR QUE USAMOS PCR PARA DIAGNPOR QUE USAMOS PCR PARA DIAGNÓÓSTICO?STICO?

• SENSIBILIDADE ANALÍTICA

• PODE DETECTAR ORGANISMOS QUE NÃO PODEM SER ISOLADOS

• RAPIDEZ

• VERSATILIDADE DE AMOSTRAS

• SENSIBILIDADE ANALÍTICA

• PODE DETECTAR ORGANISMOS QUE NÃO PODEM SER ISOLADOS

• RAPIDEZ

• VERSATILIDADE DE AMOSTRAS

DESVANTAGENS DA PCRDESVANTAGENS DA PCRDESVANTAGENS DA PCR

• CONTAMINAÇÃO

• REPRODUTIBILIDADE

• EM ALGUNS CASOS POUCA CORRELAÇÃO CLÍNICA

• CONTAMINAÇÃO

• REPRODUTIBILIDADE

• EM ALGUNS CASOS POUCA CORRELAÇÃO CLÍNICA


POR QUE O PCR CONVENCIONAL NÃO POR QUE O PCR CONVENCIONAL NÃO ÉÉ UMA UMA TTÉÉCNICA QUANTITATIVA?CNICA QUANTITATIVA?

PCR SEMIPCR SEMI--QUANTITATIVO QUANTITATIVO -- DILUIDILUIÇÇÃO SERIADAÃO SERIADA


POR QUE O PCR CONVENCIONAL NÃO POR QUE O PCR CONVENCIONAL NÃO ÉÉ UMA UMA TTÉÉCNICA QUANTITATIVA?CNICA QUANTITATIVA?


O crescimento linear do número de cópias ocorre até um determinadonúmero de ciclos. A saturação ocorre quando a concentração de produto amplificado atinge ~ 10-8 M ou ~ 1012 moléculas por 100 l.

As causas do platô são várias:- Perda da atividade da enzima- Todas as enzimas disponíveis estão ocupadas com a síntese de DNA- Acúmulo de produtos amplificados que tendem a parear entre si, emdetrimento do pareamento com os “primers”. Aumenta possibilidadede amplificação de produtos inespecíficos.- Gasto dos reagentes, especialmente inativação da DNA polimerase- Acúmulo de pirofosfato (PiPi)- Competição com outros produtos que vinham sendo amplificadoscom eficiência menor mas também foram se acumulandoetc


COMO SE PROCUROU VENCER COMO SE PROCUROU VENCER ESTA LIMITAESTA LIMITAÇÇÃO? ÃO?

DILUIÇÃO SERIADA (“END-POINT” DILUTION)

PADRÃO EXTERNO

CONTROLE INTERNO

CONTROLE INTERNO COMPETITIVO


OS AVANOS AVANÇÇOS :OS :

NA QUNA QUÍÍMICA DE FLUORESCÊNCIAMICA DE FLUORESCÊNCIA

NAS TNAS TÉÉCNICAS DE MARCACNICAS DE MARCAÇÇÃO DE OLIGOSÃO DE OLIGOS

NOS LEITORES DE FLUORESCÊNCIA NOS LEITORES DE FLUORESCÊNCIA

NA TECNOLOGIA DE TERMOCICLADORESNA TECNOLOGIA DE TERMOCICLADORES

REAL-TIME PCR


1. INTERCALANTES 1. INTERCALANTES EX. BROMETO DE ETÍDIO, SYBR GREEN, ETC.VANTAGES: SIMPLES E BARATOSDESVANTAGENS: REQUER PADRONIZAÇÃO POISPRIMER-DIMERS TAMBÉM FLUORESCEM


CURVA DE MELTING TEMPERATURE C/ SYBR GREENCURVA DE MELTING TEMPERATURE C/ SYBR GREEN


MMÉÉTODOS DE DETECTODOS DE DETECÇÇÃOÃO2. SONDAS DE HIDR2. SONDAS DE HIDRÓÓLISE (TAQMAN)LISE (TAQMAN)


O sistema TaqMan também é utilizado para fazerdiscriminação e quantificação alélica


MMÉÉTODOS DE DETECTODOS DE DETECÇÇÃOÃO3. SONDAS FRET 3. SONDAS FRET

FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)

using adjacent hybridization probes

FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)

using adjacent hybridization probesusing adjacent hybridization probes

FITC

Red 640

P

FRET Emission

P

Excitation

Amplicon

Phosphate

MMÉÉTODOS DE DETECTODOS DE DETECÇÇÃOÃO4. MOLECULAR BEACONS 4. MOLECULAR BEACONS

Reporter

Non-fluorescent Quencher

Amplicon

A

B

C

FRET

Excitation

ANNEALING


Aplicações

• Detecção de agentes infecciosos

• Caracterização do agente (tipagem)

•• DeterminaDeterminaççãoão dada cargacarga viral viral ((quantificaquantificaççãoão))


0

10

20

30

40

50

1 2 3 4 5 6

Concentration log 10

Th

resh

old

Cycl

e

0.5

1.5

2.5

0 10 20 30 40 50 60 70

Cycles

F2

/F

1

Test Sample

Threshold

Threshold Cycle

Threshold Cycle = 35Load = 103.8 copies/ml

CURVA DE CALIBRAÇÃO(STANDARD)


0.5

1.5

2.5

0 10 20 30 40 50 60 70

Cycles

F2

/F

1

NEG

10

100

1000

10000

100000

1000000

Threshold Cycle

DeterminaDeterminaççãoão dada CargaCarga


RELARELAÇÇÃO ENTRE CARGA VIRAL E DOENÃO ENTRE CARGA VIRAL E DOENÇÇAA

HIV

““MellorsMellors JW JW QuantitationQuantitation ofof HIVHIV--RNA in plasma RNA in plasma predictspredicts outcomeoutcomeafterafter seroconversionseroconversion. . AnnAnn InternIntern MedMed, 122:573, 122:573--579, 1995.579, 1995.

““ VIRAL COUNTS COUNT ON HIV INFECTIONVIRAL COUNTS COUNT ON HIV INFECTION””DAVID HO, SCIENCEDAVID HO, SCIENCE

DEMONSTRADEMONSTRAÇÇÃO EMPÃO EMPÍÍRICA QUE A CARGA VIRAL RICA QUE A CARGA VIRAL DE HIV TEM CORRELADE HIV TEM CORRELAÇÇÃO COM O PROGNÃO COM O PROGNÓÓSTICO STICO DO PACIENTEDO PACIENTE


PROGRESSORES RPROGRESSORES RÁÁPIDOS= 20%PIDOS= 20% NÃONÃO--PROGRESSORES = 5%PROGRESSORES = 5%

PROGRESSORES TARDIOS E INTERM. = 75%PROGRESSORES TARDIOS E INTERM. = 75%

1010

221010

66

88

1010

101088

CARGA VIRAL E HISTCARGA VIRAL E HISTÓÓRIA NATURAL DA DOENRIA NATURAL DA DOENÇÇAA

HIV

221010

661010

LABORATLABORATÓÓRIO DE VIROLOGIA RIO DE VIROLOGIA -- LIM 52LIM 52HBV-DNA basal (cópias/mL)

R.E.V.E.A.L. study - Iloeje UH, et al. Gastroenterology 2006

Incidência cumulativa de cirrose após 11 anos de seguimento de acordo com HBV-DNA basal

HBV 36,2%

23,5%

9,8%5,9%4,5%

0

5

10

15

20

25

30

35

40

<300 300-10.000 10.000-100.000

100.000-1.000.000

>1.000.000


Incidência cumulativa de HCC após 11 anos de seguimento de acordo com HBV-DNA basal

14,9%12,2%

3,4%1,4%1,3%

0

5

10

15

20

<300 300-10.000 10.000-100.000

100.000-1.000.000

>1.000.000

HBV-DNA basal (cópias/mL)

R.E.V.E.A.L. study - Iloeje UH, et al. Gastroenterology 2006

HBV


DengueDengue

Quais as diferenças que levam a apresentações clínicas tão distintascomo a Febre da Dengue (DF) e a Febre Hemorrágica da Dengue (DHF)e a Síndrome do Choque da Dengue (DSS) ?

As hipóteses abordam características do hospedeiro (HLA, Nutriçãoestado imune) e fatores virais (sorotipo/genótipo, CARGA VIRAL)


DengueDengue


Carga viral em DengueCarga viral em Dengue


Carga viral em DengueCarga viral em Dengue

DEN-1DEN-3

DEN-2


HGV X HIV


JOSÉ EDUARDO LEVI ( DUDI)E-MAIL : [email protected]

ADRIANA FUMIE TATENOADRIANA FREIRE MACHADO

CÉLIA RODRIGUES SYNARA DE ARAÚJO

DR. CLÁUDIO SÉRGIO PANNUTI

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