Marcadores Moleculares em Astronotus ocellatus para o...

INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA

NISLANHA ANA DOS ANJOS

ORIENTADOR: Prof. Dr. ADALBERTO LUIS VAL

CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. STEFAN SCHOLZ

MANAUS – AM 2008

Marcadores Moleculares em Astronotus ocellatus para o

Monitoramento Ambiental de Áreas Susceptíveis a Imp actos

causados pela Indústria de Petróleo

Tese de doutorado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Biologia

de Água Doce e Pesca Interior do Instituto

Nacional de Pesquisas da Amazônia.

Livros Grátis

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ii

INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA

NISLANHA ANA DOS ANJOS

ORIENTADOR: Prof. Dr. ADALBERTO LUIS VAL

CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. STEFAN SCHOLZ

MANAUS – AM 2008

Marcadores Moleculares em Astronotus ocellatus para o

Monitoramento Ambiental de Áreas Susceptíveis a Imp actos

causados pela Indústria de Petróleo

Tese de doutorado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Biologia

de Água Doce e Pesca Interior do Instituto

Nacional de Pesquisas da Amazônia.

iii

Dedico este trabalho

À minha amada mãe Izabel, por ter estado ao meu lado e ter me ensinado

e cobrado ser uma pessoa digna.

iv

Ficha Catalográfica

Nislanha Ana dos Anjos, 2008. Marcadores Moleculare s em Astronotus ocellatus

para o Monitoramento Ambiental de Áreas Susceptívei s a Impactos causados

pela Indústria de Petróleo. Manaus, INPA-UFAM. Tese de Doutorado. xxii

+160p.

1. petróleo; 2. cyp1a; 3. Astronotus ocellatus; 4. Danio rerio; 5. contaminação

aquática; 6. Amazônia Central; 7. expressão gênica.

SINOPSE A exploração da petrolífera de Urucu representa uma pressão contínua sobre os

ambientes aquáticos. Como os efeitos de qualquer contaminação se iniciam no

nível molecular, o objetivo principal deste trabalho foi estabelecer um marcador

molecular adequado em peixes amazônicos para detectar a exposição a

concentrações subletais de petróleo de Urucu na água. Foi utilizado primeiramente

um modelo totalmente caracterizado geneticamente e bem estabelecido para

análises toxicológicas: o embrioteste com Danio rerio. Foram testadas as

expressões dos genes marcadores ahr, cyp1a, hmox, hsp70, maft, mt e nrf2. A

expressão destes genes está relacionada a contaminantes ambientais e também

poderiam responder a exposição ao petróleo. O resultado dos testes desses genes

em D. rerio foi extrapolado para Astronotus ocellatus, uma espécie amazônica

abundante na região do Urucu. Exemplares de Astronotus foram expostos a

concentrações de óleo cru e fração solúvel, testando-se a expressão gênica de

marcadores apropriados. Foi feito também o fracionamento do petróleo de Urucu

por NP e RP-HPLC e a identificação dos compostos por GS-MS, para saber quais

substâncias tóxicas presentes no petróleo induziam o gene cyp1a.

Palavras-chave: petróleo; cyp1a; expressão gênica; Amazônia Central; Astronotus.

v

Agradecimentos

Ao meu orientador Dr. Adalberto Val pela orientação, confiança depositada, apoio, por

ser um exemplo de produção científica e pelo incentivo a explorar novas fronteiras.

À Dra. Vera Val por ter sempre incentivado, acreditado neste trabalho e por tudo que fez

para o sucesso do mesmo.

A PETROBRAS e ao Engenheiro Bruno Ladeira, pelo fornecimento do petróleo para os

experimentos de exposição.

A ETERNAL – Empresa de Reparos Terrestre e Naval Ltda. pelo recolhimento do

petróleo utilizado nos experimentos

Ao projeto PPI/PRJ # 0537, CNPq, Finep, FAPEAM – Pronex, Piatam III e IV pela

viabilidade financeira desse projeto e dos experimentos de exposição.

Às Dras. Maria de Jesus e Mônica Nozawa pela disposição na ajuda da correção

ortográfica deste trabalho.

Aos amigos Márcio Ferreira, Rafael Duarte, Katherine Lopez, André Santana, Alexandra

Bentes, Carolina Fernandez e Roziete Araújo na ajuda à coleta de tecidos e

organização dos experimentos de exposição; aos demais amigos do LEEM pelo

convívio e amizade.

Ao amigo MSc. Bruce Marshall pela ajuda e apoio com os detalhes da tese.

À guardiã do LEEM Nazaré Paula, às secretárias Raquel e Sylvia, à coordenadora

Angélica Laredo pela amizade e profissionalismo.

À Dra. Ângela Varella por ter com tanta competência coordenado o curso de Pós-

graduação em Biologia de Água Doce e Pesca Interior.

vi

A minha Mãe Izabel e toda minha família que sempre foram meu chão e mesmo de

longe, em todos os momentos me estimularam e apoiaram.

Aos amigos Carla Oran, Keylah Mara, Marinel Lorena, Roney Firmino e Socorro Rocha

que se envolveram de alguma forma ajudando-me na tese.

A Carminha e Elany por todo carinho, amizade e profissionalismo com que conduzem a

secretaria do curso.

Enfim, o meu profundo sentimento de gratidão a todos que me acompanharam e

ajudaram durante o período de doutoramento, no INPA, Brasil.

Na UFZ e Universidade de Leipzig, Alemanha:

Ao meu co-orientador Dr. Stefan Scholz pelo incentivo, aprendizado, por me permitir ter

explorado novas fronteiras, ter me ensinado a trabalhar com biologia molecular e por ter

acreditado neste trabalho desde o início, pelas discussões valiosas, paciência e

amizade.

À chefa do Departamento de Toxicologia Celular na UFZ, Dra. Kristin Schirmer, por ter

me recebido em casa, permitido estagiar em seu laboratório e pelo incentivo pessoal e

profissional.

Ao chefe do Departamento de Análises de Efeitos Diretos na UFZ, Dr. Werner Brack

pela oportunidade concedida de estágio, ensinamento e orientação na parte do

fracionamento.

Às queridas técnicas do Departamento de Toxicologia Celular, Sras. Peggy Wellner e

Nicole Stetefeld pelo aprendizado e acompanhamento durante o período de

aprendizagem com os embriões, e claro pela grande amizade.

vii

À equipe do Departamento de Análise de Efeitos Diretos: Urte Lübke, Ines Rein, Tobias

Schulze e Georg Streck pela ajuda no laboratório e aprendizado.

Ao DAAD pela concessão da bolsa, cuidado e incentivo aos alunos estrangeiros de

doutorado na Alemanha.

A minha Referat do DAAD Sra. Maria Salgado Martinez, por estar sempre

simpaticamente disponível e por ter ajudado na resolução dos problemas.

Ao projeto “Analyse toxischer Wirkungen auf der Basis veränderter Genexpression

im Danio rerio - Embryotest (Gen-DarT)” pela ajuda financeira em todas as análises

moleculares.

Ao projeto MODELKEY pelo apoio financeiro de toda a parte do fracionamento das

amostras de petróleo.

A minha primeira família alemã os Metzker, por terem me dado um lar e permitirem me

sentir em casa.

A minha segunda família alemã os Kluge, Marie Ackerman, Tobias Becker e Sarah

Steinfeld pelo carinho, amizade e participação nos momentos felizes e difíceis.

Aos colegas de trabalho Iva Sovanodinova, Alina Buraru, Till Luckenbach, Dana

Kühnel, Wibke Busch, Katja Scheffler, Doris Völker, Melanie, Sarah Hassanien,

Jackeline Gerhardt e Ulli Nallman, por todas as discussões, aprendizado e leituras

conjuntas de papers.

A todos que direta e indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.

viii

Abstract

The objective of this study was to identify a suitable molecular marker to detect fish

exposure to sub-lethal concentrations of Urucu petroleum in the water. The molecular

markers ahr, cyp1a, hmox, hsp70, maft, mt, nrf2 and ß-actina (the constitutive

control) were tested using an established toxicological model, the Danio rerio

embryotest. The cyp1a gene proved to be the most reliable of all the molecular

markers. In the experiments with over 0.39% of petroleum concentration, the

presence of pericardial edemas and absence of pigmentation were found. Applying

degenerated primers, the cyp1a gene was cloned and sequenced using RT-PCR in

order to analyze its expression in the liver of Astronotus ocellatus, an Amazonian fish

species. The Astronotus ocellatus individuals were exposed to sub-lethal

concentrations of petroleum and to the soluble fraction of petroleum for 96 hours,

using three different conditions: acid, hypoxic and normal. With an increase in

petroleum concentrations, there was a correspondent increase in expression of the

gene until 0.889% concentration, when a decrease in expression occurred. All of the

individuals exposed to 1.78% of petroleum in the hypoxic group died. In the

experiments using the soluble fraction, an increase in concentration resulted in an

increase in cyp1a gene expression, with the exception of a sharp decrease in

expression at 1.56% concentration in the hypoxic group. The compounds present in

the Urucu petroleum which strongly induce the cyp1a gene were also identified,

using the D. rerio embryotest. The fractionation was conducted by the multi-step

technique NP and RP-HPLC, with the use of GC-MS for identification. Eighteen

different compounds were identified; all of them PAHs.

ix

Resumo

O objetivo deste trabalho foi identificar um marcador molecular apropriado para

detectar as concentrações subletais de petróleo na água, para o monitoramento de

áreas como a região do Urucu, onde há intensa exploração de petróleo. Os

marcadores moleculares ahr, cyp1a, hmox, hsp70, maft, mt e nrf2 e ß-actina (usada

como controle constitutivo) foram testados em um modelo toxicológico bem

estabelecido, o embrioteste com Danio rerio. O gene cyp1a foi o mais promissor

para as análises. Nos experimentos acima de 0,39% houve presença de edemas

pericardiais e ausência de pigmentação. Com o uso de oligonucleotídeos

degenerados, clonou-se e seqüenciou-se o gene cyp1a para analisar a expressão

no fígado de indivíduos de Astronotus ocellatus, espécie amazônica, por RT-PCR,

expostos a concentrações subletais de petróleo e fração solúvel por 96 horas, em

três condições: acidificada, hipóxica e regular. Nos experimentos de exposição ao

petróleo a expressão do cyp1a aumentou com o aumento da concentração, porém

em 0,889%, essa expressão sofreu uma queda. Todos os indivíduos expostos a

1,78% de petróleo e hipoxia morreram. Experimentos utilizando a fração solúvel

apresentaram aumento da expressão do gene com o aumento da concentração,

continuamente, com exceção do experimento em hipoxia que na concentração de

1,56% houve queda brusca na expressão. Foi feita a identificação dos compostos

presentes no petróleo de Urucu que induziam o gene cyp1a, utilizando o embrioteste

com D. rerio. O fracionamento foi feito pela técnica mult-step NP e RP – HPLC com

o uso do GC-MS para identificação. Foram identificados 18 compostos, sendo todos

PAHs.

x

Sumário

Abstract.........................................................................................................................viii

Resumo...........................................................................................................................ix

Lista de Figuras.............................................................................................................xiv

Lista de Tabelas..........................................................................................................xviii

Abreviaturas...................................................................................................................xx

1. Introdução Geral ........................................................................................................1

1.1 O Ambiente Amazônico.........................................................................................1

1.2 A Amazônia e o petróleo da Reserva de Urucu....................................................5

1.3 A toxicidade do petróleo em peixes.......................................................................8

1.4 Biomarcadores.....................................................................................................14

1.5 Justificativa..........................................................................................................20

1.6 Objetivo Geral......................................................................................................22

1.6.1 Objetivos específicos....................................................................................22

Capítulo 1 “Identificação de Biomarcadores em Zebrafish, Danio rerio, para

contaminação aquática com petróleo de Urucu, Amazonas, Brasil”.............................24

1. Introdução .................................................................................................................25

1.1 A espécie.............................................................................................................26

2. Material e Métodos................................................................................................... 28

xi

2.1 Exposição do Danio rerio a concentrações subagudas de petróleo (Urucu)..... 28

2.2 Captação das imagens dos embriões de D. rerio................................................30

2.3 Estudos da expressão dos genes ahr, cyp1a, hmox, hsp70, maft, mt e nrf2 em

Danio rerio.....................................................................................................................30

2.4 Análise estatística................................................................................................34

3. Resultados.................................................................................................................35

3.1 Mortalidade..........................................................................................................35

3.2 Teratogênia..........................................................................................................35

3.3 Indução dos Biomarcadores por Exposição do Zebrafish a diferentes

concentrações do petróleo de Urucu.............................................................................39

4. Discussão..................................................................................................................43

4.1 Teratogênia…......................................................................................................43

4.2 Biomarcadores potenciais para concentrações subletais de petróleo na

água...............................................................................................................................48

5. Conclusões................................................................................................................56

Capítulo 2 “Marcadores moleculares para contaminação por petróleo no peixe

amazônico Astronotus ocellatus (Oscar)”......................................................................57

1. Introdução..................................................................................................................58

1.1 Objetivo Geral......................................................................................................61

1.2 Objetivos específicos ......................................................................................... 62

1.3 A espécie ........................................................................................................... 62

xii

2. Material e Métodos....................................................................................................64

2.1 Exposição do A. ocellatus a concentrações subagudas de petróleo...................64

2.2 Expressão dos marcadores em concentrações subagudas de petróleo.............68

2.3 Clonagem dos genes cyp1a e ß-actina do Astronotus ocellatus.........................73

2.4 Análise Estatística...............................................................................................76

3. Resultados.................................................................................................................78

3.1 Mortalidade..........................................................................................................78

3.2 RNA das amostras de fígado de A. ocellatus expostos ao petróleo e a fração

solúvel do petróleo.........................................................................................................79

3.3 Clonagem dos genes ß-actina e cyp1a1 para o Astronotus ocellatus.................80

3.4 Expressão dos genes cyp1a e ß-actina...............................................................83

4. Discussão .................................................................................................................91

4.1 Mortalidade..........................................................................................................91

4.2 Clonagem e expressão do gene cyp1a e ß-actina em indivíduos de A. ocellatus

expostos ao petróleo e a fração solúvel do petróleo de Urucu.....................................94

5. Conclusões..............................................................................................................102

Capítulo 3 “Fracionamento do Petróleo de Urucu e aplicação de Danio rerio zebrafish

embriotestes”...............................................................................................................104

1. Introdução................................................................................................................105

1.1 Objetivo .............................................................................................................108

2. Material e Métodos..................................................................................................109

xiii

2.1 Teste para escolha das colunas e eluentes utilizados na extração da fase sólida

da fração solúvel de petróleo de Urucu.......................................................................109

2.2 Extração da fase sólida da fração solúvel de petróleo utilizando Cromabond easy

e Metanol.....................................................................................................................110

2.3 Fracionamento com Fase Reversa (RP) C18 - Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência (HPLC)........................................................................................................111

2.4 Extração com Fase Normal – HPLC (NP – HPLC))..........................................112

2.5 Embriotestes com as frações do NP-HPLC.......................................................115

2.6 Identificação dos compostos que induziram a cyp1a por GC-MS.....................115

3. Resultados...............................................................................................................117

3.1 Extração da fase sólida da fração solúvel de petróleo de Urucu utilizando

Chromabond easy e metanol.......................................................................................117

3.2 Fracionamento com RP - HPLC C18 e expressão do gene cyp1a...................118

3.3 Fracionamento com NP – HPLC e expressão do gene cyp1a..........................119

3.4 Identificação dos compostos que induziram o gene cyp1a por GC-MS............121

4. Discussão................................................................................................................127

5. Conclusões..............................................................................................................134

Referências Bibliográficas .......................................................................................135

xiv

Lista de Figuras

Introdução Geral

Figura 1. Imagem LANDSAT da região do Urucu indicando a localização da Base de

Operações Geólogo Pedro de Moura - BOGPM.............................................................6

Capítulo 1. “Identificação de Biomarcadores em Zebr afish Danio rerio para

contaminação aquática com petróleo de Urucu ”

Figura 1. Exemplar de Danio rerio na fase adulta.........................................................26

Figura 2. Freqüência de mortalidade (%) nos embriotestes com D. rerio expostos as

diferentes concentrações da fração solúvel do petróleo de Urucu................................35

Figura 3. Efeitos da fração solúvel do petróleo de Urucu no desenvolvimento do D.

rerio. Indivíduos expostos por 48 horas às concentrações de 0,39% (B), 1,56% (C),

6,25% (D) e a Isowasser, controle (A)...........................................................................36

Figura 4. Presença de edemas no pericárdio dos embriões de D. rerio expostos a

diferentes concentrações da fração solúvel do óleo de Urucu. Controle (A, B, C);

0,39% (D, E, F); 1,56% (G, H, I) e 6,25% (J, L, M). As figuras 4A – 4L estão no

aumento de 20X, porém a 4M está no aumento de 8X, o que já seria o suficiente para

notar as anomalias na concentração exposta...............................................................37

Figura 5. Freqüência de edemas pericardiais em D. rerio em diferentes concentrações

de petróleo.....................................................................................................................38

Figura 6. Expressão de genes em embriões de zebrafish expostos 48 horas a fração

solúvel do petróleo de Urucu. Comparação entre os genes ahr, hmox, hsp70, maft e

nrf2t. A ß-actina foi usada como controle constitutivo (M= Marcador de peso molecular;

1 = controle; 2 = 0,0061%, 3 = 0,024%, 4 = 0,098%, 5 = 0,39%, 6 = 1,56% e 7 = 6,25%

de petróleo. A imagem representa um dos 3 experimentos. Cada banda representada

nos géis significa exposicao com 30 embriões..............................................................40


xv

solúvel do petróleo de Urucu. Comparação entre cyp1a e mt. A ß-actina foi usada

como controle constitutivo; (M= Marcador de peso molecular; 1= controle; 2= 0,0061%,

3= 0,024%, 4= 0,098%, 5= 0,39%, 6=1,56% e 7= 6,25% de petróleo..........................41

Figura 8. Expressão de gene em embriões de zebrafish expostos por 48 h a fração

solúvel do petróleo de Urucu (M = Marcador de peso molecular; 1 = controle; 2 =

0,001525%; 3 = 0,0061 %; 4 = 0,024 %; 5 = 0,098 %; 6 = 0,39 %; 7 = 1,56%; 8 =

6,25% de petróleo e A = PCR com água, para controle). A ß-actina foi usada como

controle constitutivo. A imagem representa um dos três experimentos usados para a

análise densintométrica com o programa Image J (ver Fig. 9). ....................................41

Figura 9. Normalização da expressão do mRNA da cyp1a em embriões de D. rerio

expostos a fração solúvel do petróleo de Urucu. A normalização foi feita após a análise

densitométrica usando o gene actina como referência (ver Fig. 8). n = 3 experimentos

com 30 embriões em cada, havendo diferença significativa (teste de Dunnet) em

relação ao controle (p<0,05)..........................................................................................42

Capítulo 2. “Marcadores moleculares para contaminaç ão por petróleo em peixe

amazônico Astronotus ocellatus (Oscar)”

Figura 1. Exemplar adulto de A. ocellatus.....................................................................63

Figura 2. Exemplos de amostras de RNA dos fígados de A. ocellatus expostos ao

petróleo de Urucu (A) e a fração solúvel do petróleo de Urucu (B). M = marcador de

peso molecular Ladder 100pb.......................................................................................79

Figura 3. Fragmentos do RT-PCR para clonagem dos genes ß-actina (A) e cyp1a (B)

do A. ocellatus utilizando oligonucleotídeos degenerados. M= marcador de peso

molecular Ladder 100pb................................................................................................80

Figura 4. Alinhamento da seqüência do gene ß-actina do Astronotus ocellatus (Ao),

Oreochromis niloticus (On), Oryzias latipes (Ol) e Onchorhynchus mykiss (Om). O

alinhamento dessas sequências homólogas foi feito pelo ClustalW. *= homologia entre

as bases........................................................................................................................82

Figura 5. Alinhamento da seqüência protéica do gene cyp1a de Astronotus ocellatus

xvi

(Ao), Oreochromis niloticus (On), Oryzias latipes (Ol) e Onchorhynchus mykiss (Om).

O alinhamento das sequências foi feito pelo ClustalW. *= homologia entre as bases..82

Figura 6. Expressão dos genes ß-actina e cyp1a de indivíduos de A. ocellatus

expostos a diferentes concentrações de petróleo, experimentos em condições

regulares; M = marcador de peso molecular Ladder 100 pb.........................................84

Figura 7. Normalização da expressão de mRNA de cyp1a em A. ocellatus expostos ao

petróleo em condições regulares...................................................................................84


expostos a diferentes concentrações de petróleo, experimentos em condições de

hipoxia. M = marcador de peso molecular Ladder 100pb.............................................85

Figura 9. Normalização da expressão de mRNA cyp1a em A. ocellatus expostos ao

petróleo em condições de hipoxia.................................................................................85

Figura 10. Expressão dos genes ß-actina e cyp1a em indivíduos de A. ocellatus

expostos a diferentes concentrações de petróleo, em condições ácidas. M = marcador

de peso molecular Ladder 100pb..................................................................................86


petróleo em condições ácidas.......................................................................................86


expostos a diferentes concentrações da fração solúvel do petróleo, experimentos em

condições regulares. M = marcador de peso molecular Ladder 100pb.........................87

Figura 13. Normalização da expressão de mRNA cyp1a em A. ocellatus expostos a

fração solúvel do petróleo em condições regulares......................................................88



condições de hipoxia. M = marcador de peso molecular Ladder 100 pb......................88


fração solúvel do petróleo em condições de hipoxia.....................................................89

xvii


expostos a diferentes concentrações de petróleo, experimentos em condições ácidas.

M = marcador de peso molecular Ladder 100pb...........................................................89


petróleo em condições ácidas.......................................................................................90

Capítulo 3. “Fracionamento do Petróleo de Urucu e a plicação de Danio rerio

zebrafish embriotestes”

Figura 1. Resultado em gel de agarose da expressão dos genes ß-actina (controle

constitutivo) e cyp1a: 1 - 6 = controle apenas com Isowasser; 7- 12 = 6, 25% de fração

solúvel do óleo de Urucu, réplica 1; 13 -18 = 6,25% da fração solúvel do óleo de

Urucu, réplica 2. M= marcador de peso molecular Ladder 100pb...............................117

Figura 2. Cromatograma mostrando os picos de absorção dos compostos do

fracionamento da fração solúvel do petróleo de Urucu (A); gel de agarose da

expressão do cyp1a e ß-actina em D. rerio (B) e a normalização do cyp1a em relação

à ß-actina (C)...............................................................................................................118

Figura 3. Resultado em gel de agarose do embrioteste do fracionamento NP-HPLC da

fração B. As regiões marcadas em cores se referem as frações que induziram

fortemente a expressão do gene cyp1a e usadas para identificação dos compostos por

GC-MS. C= controle. M= marcador de peso molecular Ladder 100pb.......................119


fração C. As regiões marcadas em cores indicam as frações que induziram fortemente

a expressão do gene cyp1a; e que foram usadas para identificação dos compostos por

GC-MS. C= controle. M = marcador de peso molecular Ladder 100 pb.....................120


fração E. As regiões marcadas em cores indicam as frações que induziram fortemente

a expressão do gene cyp1a e que foram usadas para identificação dos compostos por

GC-MS. C= controle. M = marcador de peso molecular Ladder 100 pb.....................121

xviii

Lista de Tabelas

Capítulo 1. “Identificação de Biomarcadores em Zebr afish Danio rerio para

contaminação aquática com petróleo de Urucu ”

Capítulo 2. “Marcadores moleculares para contaminaç ão por petróleo em peixe

amazônico Astronotus ocellatus (Oscar)”

Tabela 1. Concentrações utilizadas nos experimentos de exposição da espécie A.

ocellatus ao petróleo de Urucu.....................................................................................66


ocellatus à fração solúvel do petróleo de Urucu...........................................................67

Tabela 3. Genes selecionados para a análise e sequências dos oligonucleotídeos

degenerados Forward e Reverse. As letras R, K e Y na seqüência forward do gene

cyp1a indica a substituição de bases no momento da síntese; R= A ou G; K= G ou T;

Y= C ou T......................................................................................................................72

Tabela 4. Genes e seqüências dos oligonucleotídeos específicos Forward e Reverse

para a espécie Astronotus ocellatus.............................................................................76

Tabela 5. Mortalidade de exemplares de A. ocellatus expostos as diferentes

concentrações do petróleo de Urucu............................................................................78

Tabela 1. Concentrações de petróleo nos experimentos realizados com D. rerio........29


Forward e Reverse........................................................................................................33

xix

Capítulo 3. “Fracionamento do Petróleo de Urucu e a plicação de Danio rerio

zebrafish embriotestes”

Tabela 1. Embriotestes realizados com as colunas utilizadas para extrair a fase sólida

da fração solúvel de Urucu. Os experimentos foram feitos com réplica e um controle

para todos utilizando apenas a Isowasser...................................................................110

Tabela 2. Compostos identificados com GC-MS na fração B do NP-HPLC................122

Tabela 3. Compostos identificados com GC-MS na fração C do NP-HPLC...............124

Tabela 4. Compostos identificados com GC-MS na fração E do NP-HPLC................126

xx

Abreviaturas °C Graus Celcius

µg Micrograma

µg/g Micrograma por grama

µg/l Micrograma por litro

µl Microlitro

µm Micrômetro

µM Micro mol

a adenina

ACN acetonitrila

AM Amazonas

As Arsênio

ATP Adenina tri fosfato

BaP Benzo-a-pireno

BNF benzonaftoflavona

BPH benzopireno hidroxilase

BR bilirrubina

BV biliverdina

c Citosina

Ca2+ Cálcio

CaCl2 Cloreto de cálcio

Cd Cádmio

Cl Cloro

CL50 Concentração letal - 50% da população morre

cm Centímetro

CN cianopropil

Cr Cromo

Cu Cobre

CvO2 Concentração do O2 sanguíneo

DCM Diclorometano

DDT Dicloro-difenil-Tricloroetano

DMBA Dimetil-benzo-antraceno

DNA Ácido desoxirribonucleico

EROD Ethoxyresorufin O-deethylase

Fe Ferro

g Grama

xxi

g Guanina

GC cromatografia gasosa

GST Glutationa-s-transferase

GTP Guanosina trifosfato

H+ Íon hidrogênio

H2C=CH2 Etileno

H2SO4 Ácido sulfídrico

H3C-CH3 Etano

HC≡CH acetileno

Hmox Heme oxidase

hpf Horas após a fertilização

HPLC cromatografia líquida de alta eficiência

HSPs Heat shok proteins

HX Hexano

KCl Cloreto de potássio

kg Quilograma

km Quilômetro

m Metro

m3 Metros cúbicos

ME Metanol

mg Miligrama

mg/l Miligrama por litro

MgSO4 Sulfato de Magnésio

ml Mililitro

mm Milímetro

mM milimol

mRNA Ácido ribonucleico mensageiro

MS espectrometria de massa

mt Metalotioneína

N2 nitrogênio líquido

Na+ Sódio

NaHCO3, Bicarbonato de sódio

nm Nanômetro

NP Fase Normal

O2 Oxigênio molecular

PACs Compostos aromáticos policíclicos

xxii

PAHs Hidrocarbonetos poliaromáticos

Pb Chumbo

pb Pares de base

PCBs Bifenil policlorados

PCBs policlorinados planares

PCDDs/Fs dibenzo-p-dioxinas e furanos

PCNs naftalenos

PCR Reacao em cadeia da polimerase

PGC poro de carbono grafitizado

pH Potencial hidrogeniônico

PHH hidrocarbonetos planares halogenados

PYE etildimetilsilicato

R reverse

RHP Randon hexamers primers-

RNA Ácido ribonucleico

ROS espécies reativas de oxigênio

RP Fase Reversa

SFC espectroscopia infravermelha

SH Substâncias húmicas

t timina

TAE Tampão Tris-Acetato

TCDD 2,3,7,8-tetracloro dibenzo-p-dioxinas

TCDF 2,3,7,8 – tetracloro dibenzofurano

TM Temperatura média de anelamento

U.I. Unidades internacionais

UVA Ultra violeta A

1

1. Introdução

1.1 O ambiente amazônico

A região amazônica possui a maior bacia de drenagem do mundo, com cerca

de 7.000.000 km2 (Santos e Ferreira, 1999). É formada por uma diversidade de

corpos d’água, como grandes rios, lagos, paranás, igapós, várzea e inúmeros

pequenos riachos que constituem uma das redes hídricas mais densas do mundo.

Com exceção dos rios maiores de águas brancas, cujas nascentes se encontram em

altas cadeias de montanhas andinas, quase todos os rios amazônicos resultam da

junção de pequenos riachos que drenam a floresta (Walker, 1991).

Essa grande diversidade de corpos d’água não está apenas relacionada a

forma e volume, mas também às características físico-químicas da água. Essas

podem ser classificadas em três tipos, de acordo com a sua cor, como água branca,

água clara e água preta (Wallace, 1989; Sioli, 1968, Lowe-McConnel, 1999):

Águas Brancas são águas turvas, mais ou menos da cor de barro, com

transparência entre 0,1 e 0,5 m. Elas nascem na região andina ou pré-andina; os

processos de erosão nas cabeceiras são fortes e a carga de sedimentos muito alta,

provocando a cor branca da água. Normalmente nas áreas onde a correnteza tem

baixa velocidade, os sedimentos são depositados e a transparência da água

aumenta, enquanto em outras áreas a correnteza invade os barrancos recebendo

novos materiais.

Nas proximidades de Manaus, um litro de água do Solimões-Amazonas

contem cerca de 0,1 g de sedimentos. As regiões andinas e pré-andinas são

formadas, em sua maioria, por sedimentos cretáceos, alcalinos e relativamente ricos

em sais minerais, refletindo na composição química da água, que é quase neutra

2

(pH= 6,5 a 7). São exemplos dessas águas os rios Solimões-Amazonas, Madeira,

Purus, Juruá, entre outros.

Águas Claras apresentam transparência entre 1,10 a 4,5 metros e coloração

variando de verde a verde-oliva, pois a maioria dos compostos húmicos presentes

nessas águas encontra-se adsorvidos (complexados) a partículas de argila e/ou

silte. Os rios de águas claras nascem nos maciços pré-cambrianos das Guianas e

do Brasil Central, em sua maior parte já fortemente erodidos. Como estas regiões

estão submetidas a estações secas e chuvosas bem marcadas, estes rios só

transportam quantidade apreciável de material em suspensão no período das

chuvas. De modo geral, o pH pode variar entre 5,5 e 7,0. Entre os rios podem ser

citados: Tapajós, Xingu, Trombetas etc.

Águas Pretas apresentam transparência entre 1,30 e 2,90 metros e

coloração variando de marrom claro a café. Ao contrário dos rios de água branca, os

de água preta não transportam material em suspensão em grandes quantidades.

Nascem nos escudos da Guiana e do Brasil Central ou nos sedimentos terciários, o

relevo é suave e pouco movimentado e os processos de erosão são poucos intensos

e reduzidos pela densa mata pluvial. Consequentemente, a carga de sedimentos é

baixa e os rios são transparentes. Por falta de cálcio e magnésio na maioria das

formações geológicas, as águas são ácidas (pH = 3,0 e 5,0), extremamente pobres

em sais minerais e baixa condutividade elétrica (8-20 µS/cm). Isto corresponde à

água destilada, com alguma impureza. A cor escura é provocada pela decomposição

do material orgânico produzido pelas florestas, resultando em vários produtos

solúveis como ácidos húmicos e fúlvicos que são causadores dessa coloração.

Apesar de serem conhecidos os agentes que originam a cor preta das águas, as

3

causas da sua produção na bacia amazônica são desconhecidas. São exemplos:

Rio Negro, Uatumã, Preto da Eva, Urubu, Cururu, entre outros (Sioli, 1984).

A Amazônia apresenta um grau elevado de compostos orgânicos - substâncias

húmicas (SH) - porém ainda não está claro o papel desses compostos para a região

amazônica (Matsuo e Val, 2003c). Estes compostos são responsáveis por parte da

acidez natural atribuída às águas pretas (Leenheer, 1980). A acidez destas águas é,

em parte, atribuída a determinados grupos funcionais das SH, notadamente os

compostos carboxílicos e hidroxil-fenólicos (Thurman, 1985a).

Como já foi citado, os corpos d’água preta são mais ácidos e abrigam uma

diversidade íctica especializada. Experimentos de laboratório com peixes amazônicos

indicaram que esses animais apresentam, quando expostos a águas ácidas, ajustes

fisiológicos semelhantes àqueles documentados em salmonídeos (Gonzalez et al.,

1998; Wood et al., 1998; Wilson et al., 1999), que toleram níveis de pH variável entre

4,0 e 5,0 (McDonald, 1983). Os peixes da Amazônia podem tolerar pHs ainda mais

ácidos (3,5 a 4,0) (Costa, 1995; Aride, 1998; Gonzalez et al., 1998; Matsuo, 1998;

Portela, 1998; Wood et al., 1998; Gonzalez e Preest, 1999; Wilson et al., 1999;

Ascón, 2000; Castro - Pérez, 2001; Gonzalez e Wilson, 2001; Gonzalez et al., 2002;

Matsuo e Val, 2002; Wood et al., 2002; 2003). Colossoma macropomum (tambaqui)

atinge o seu limite fisiológico para a tolerância ácida entre o pH 3,0 e 3,5 (Wood et al.,

1998; Wilson et al., 1999). Surpreendentemente, pH ácido pode ser uma vantagem

para esta espécie. Aride (1998) verificou que o tambaqui mantido cronicamente em

pH= 4,0, apresenta um maior ganho de peso em relação aos indivíduos em pH

neutro. Em exposição ao meio ácido, o tambaqui se alimenta mais para compensar

as perdas iônicas e, portanto, tem mais acesso à proteína para crescimento (Aride,

1998). A espécie neon tetra (Paracheirodon innesi) habita o rio Negro altamente e

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tolera águas ácidas, com distúrbios moderados e de curta duração quando submetida

a pH = 3,5 (Gonzalez e Preest, 1999). Resultados semelhantes foram encontrados

para o cardinal (Paracheirodon axelrodi), espécie endêmica do rio Negro (Gonzalez e

Wilson, 2001; Matsuo e Val, 2003b). Exemplares de Corydoras adolfoi, uma espécie

nativa de águas ácidas do alto rio Negro, apresentaram distúrbios iônicos quando

expostos a pH 3,5 (Matsuo e Val, 2002).

Um dos efeitos fisiológicos que ocorrem em peixes em pH baixo é que ocorre

inicialmente um efluxo difusivo de íons, principalmente Na+ e Cl-, ao mesmo tempo

em que o influxo é, geralmente, inibido (McDonald, 1983). As perdas difusivas

parecem ocorrer por meio de junções paracelulares situadas nas brânquias

(McDonald, 1983), devido à competição entre os íons H+ e Ca2+ pelos mesmos sítios

de interação na superfície branquial (Pagenkopf, 1983; Playle et al., 1993b).

Outro fato peculiar na Amazônia é que, devido à decomposição da abundante

matéria vegetal nas altas temperaturas prevalescente, ocorre desoxigenação

(hipoxia). A variação sazonal na disponibilidade de oxigênio e corpos d’água

amazônicos podem resultar em períodos de profunda hipoxia (< 2 mg/L O2) (Val et

al., 1985).

Soares (1993), Graham (1997) e Val e Almeida-Val (1995; 1997) em estudos

sobre a respiração aérea em peixes da Amazônia, sugeriram que a grande

diversidade desses mecanismos e outras adaptações desenvolvidas durante o

processo evolutivo, para se ajustar às oscilações de oxigênio na água, auxiliou

várias espécies de peixes a desenvolver estratégias para o problema da baixa

concentração periódica de oxigênio em ambientes aquáticos na Amazônia, o que os

torna muito dependentes da interface água-ar. Peixes de respiração aquática

utilizam-se de outros mecanismos como a RSA (respiração na superfície aquática)

5

para obter oxigênio em situação de hipoxia. Destacam-se: tambaqui (Colossoma

macropomum), matrinchã (Brycon erythropterum), pacu (Mylossoma duriventris),

entre outros (Braum e Junk, 1982; Val e Almeida-Val, 1995; Val, 1996), que

expandem o lábio inferior, para canalizar a camada mais superficial da água rica em

oxigênio, para as brânquias (Braum e Junk, 1982; Val, 1993; 1996; Val e Almeida-

Val, 1999). Essas estratégias são consideradas vantajosas, por exemplo, em casos

de contaminação do ambiente aquático por gás sulfídrico (Brauner et al., 1999),

mas, podem tornar-se prejudiciais em ambiente aquático contaminado por petróleo.

O fato da Amazônia abrigar o maior complexo hidrográfico (~20% da água

doce do planeta) e a maior biodiversidade do planeta, incluindo com freqüência

corpos d’água com baixa salinidade, baixa concentração de O2, águas ácidas,

presença de substâncias húmicas (não só em rios de águas pretas), entre outros,

torna a região frágil, particularmente em cenários envolvendo contaminação aquática

por petróleo.

1.2 A Amazônia e o petróleo da Reserva de Urucu

Desde 1953, a Petrobrás vem atuando na Amazônia, quase sempre às

margens dos grandes rios à procura de petróleo. Em 1986, na região do rio Urucu

(Coari, AM), às margens do rio Solimões (368 km de Manaus), foram concluídos os

levantamentos sísmicos que indicaram a presença de campos de petróleo e gás,

com uma reserva estimada de 92 bilhões de barris de óleo e 52,7 bilhões de metros

cúbicos de gás natural (Petrobrás, 1994). As atividades de extração do produto

intensificaram-se após 1988, e a produção de petróleo no Amazonas atingiu 58.000

barris de óleo/dia em 2002, equivalente a 3,8% da produção total no Brasil

(Petrobrás, 1994).

6

A Base de Operações Geólogo Pedro de Moura (BOGPM) está localizada a

700 km a sudoeste da cidade de Manaus (Figura 1). É uma área de exploração de

petróleo sob risco contínuo de poluição decorrente de derramamentos acidentais

com óleo cru ou água de formação. Os dutos que transportam petróleo dos locais de

extração até a estação de tratamento estão distribuídos por toda reserva do Urucu,

passam sobre os igarapés que deságuam no rio Urucu. Portanto, esses ambientes

aquáticos estariam totalmente susceptíveis aos rompimentos e vazamentos

acidentais destes dutos. O fato dos riachos serem ambientes espacialmente

restritos, oligotróficos e de águas ácidas, indica que os efeitos deletérios produzidos

por acidentes com petróleo podem ser intensos e prolongados, em função da

suposta baixa capacidade de resiliência do sistema (Junk e Fürch, 1985; Phillips e

Rainbow, 1994; Walker, 1995).

Figura 1. Imagem LANDSAT da região do Urucu indicando a localização da Base de

Operações Geólogo Pedro de Moura - BOGPM.

O rio Urucu, como todos os rios amazônicos, é caracterizado por flutuações

aeroporto

rio Urucu

BOGPM

4°45’ S

65° 30’ W 65°00’ W

5°00’ S

7

fortes no nível do rio Solimões. É designado como águas altas o período que vai

desde janeiro a junho, com um aumento médio de 10 metros sobre o período de

águas baixas. Evidentemente, isto tem uma forte influência na concentração dos

contaminantes e a mobilidade destes nos locais afetados. Devido a estas flutuações

ambientais, torna-se difícil calcular o impacto da poluição no ecossistema e os riscos

potenciais.

Embora haja teoricamente medidas de segurança adotadas para o transporte

do petróleo da reserva de Urucu para a refinaria REMAN em Manaus e outros

pontos de distribuição, bem como freqüente vistoria das áreas onde os oleodutos

passam no interior da reserva, o risco de acidentes ambientais é sempre uma

preocupação. O impacto do petróleo sobre os organismos, particularmente em

peixes, pode resultar em distúrbios severos, conforme indicam vários estudos que

avaliam as alterações nos parâmetros fisiológicos em espécies da ictiofauna

amazônica (Costa et al., 1996; Mendes e Val, 1997; Val, 1997; Duncan, 1998;

Brauner et al., 1999; Val e Almeida-Val, 1999; Almeida-Val et al., 2002; Matsuo et

al., 2002; Paula-Silva et al., 2002; Matsuo, 2004).

As características peculiares dos ambientes aquáticos da Amazônia, como a

elevada concentração de substâncias húmicas (SH), tanto nos sistemas de água

branca quanto nos de água preta, podem afetar a biodisponibilidade das frações

tóxicas do petróleo aos organismos. Há trabalhos que parecem indicar que as SH

formam complexos com as frações do petróleo, com redução de sua toxicidade

(Haitzer et al., 1998), análogo ao que ocorre com a toxicidade dos metais.

Entretanto, outros trabalhos sugerem que as SH aumentam a solubilidade dos

contaminantes hidrofóbicos, com potencialização de sua toxicidade aos peixes

(Boehm e Quinn, 1973; Chou et al., 1986).

A B

8

1.3 A Toxicidade do Petróleo em Peixes

A contaminação aquática com petróleo é um problema ambiental no nível

mundial (Atwood, et al., 1987; Teal et al., 1992; Erikson, 1995; Heath, 1995; Sell et

al., 1995; Alkindi et al., 1996; Ba-Akda, 1996; Anderson et al., 1997; Kingston, 2002).

Derrames acidentais de óleo são uma ocorrência comum em todo o mundo,

em particular nos países com intensa atividade de exploração, produção e transporte

de petróleo. A ocorrência de derramamentos acidentais de tanques de petróleo tem

sido um impacto muito difundido. Os maiores derrames ocorridos nos últimos 40

anos foram o do Torrey Canion no Canal Inglês em 1967, o Monte Urquiola na Costa

da Espanha em 1976, o Amoco Cadiz na Costa da Franca em 1978, o Exxon Valdez

no Alaska em 1989 e o Sea Empress no Reino Unido em 1996. Embora os grandes

derrames sejam os causadores das grandes catástrofes, os de menor escala

também somam um número alarmante - dados anuais revelam uma média

aproximada de 12 pequenos acidentes por dia (Fingus, 1995).

O petróleo é uma substância oleosa, inflamável, menos densa que a água,

com cheiro característico e de cor variável entre negro e castanho escuro. É uma

mistura complexa constituída por três fases: a) uma gasosa ou volátil; b) uma

líquida, denominada óleo cru e c) uma sólida ou semi-sólida de natureza asfáltica. A

fase líquida é constituída de uma fração insolúvel em água, o óleo cru, e uma fração

hidrossolúvel, composta por hidrocarbonetos poliaromáticos (PAHs) e alifáticos,

como o benzeno, o tolueno e quantidades significantes de enxofre, vanádio,

nitrogênio e níquel que se acumulam nos tecidos dos organismos e que são

extremamente tóxicos (Engelhardt et al., 1981; Buchanam e More, 1986; Malan,

1986; Page et al, 1989; Baker, 1991; Teal et al., 1992; Val, 1993; Sell et al., 1995;

Bah-Akda, 1996; Davies et al., 1997; Kingston, 2002). A fração insolúvel, que

9

permanece na superfície da coluna d’água, pode limitar a penetração de luz no

ambiente aquático e, por conseguinte, resultar num efeito direto na disponibilidade

de oxigênio, com alterações (modificações) nos organismos. Em ambos os casos, os

peixes são afetados (Teal et al., 1992; Erikson, 1995; Alkindi et al., 1996; Anderson

et al., 1997; Brauner et al., 1999; Val e Almeida-Val,1999).

Um acidente com petróleo em águas interiores da Amazônia pode

desencadear, em princípio, dois efeitos drásticos em peixes, decorrentes das

adaptações respiratórias. O primeiro está relacionado com o efeito do óleo cru que

permanece na superfície da coluna d’água, podendo causar danos aos animais que

captam oxigênio na interface água-ar ou diretamente do ar. Nas espécies com

respiração aérea facultativa e obrigatória há uma maior exposição do epitélio

responsável pela troca gasosa ao óleo cru, que resulta em sérios danos nesses

tecidos e em um comprometimento da regulação iônica (Alkindi et al., 1996, Maco,

1996; Brauner et al., 1999). O segundo efeito está relacionado à fração solúvel do

petróleo, que se difunde com a água e prejudica as espécies de respiração aquática

obrigatória, causando desnaturação e oxidação de proteínas relacionadas ao

transporte gasoso. Nestas condições, por exemplo, a hemoglobina é oxidada em

larga escala para meta-hemoglobina, que é incapaz de ligar-se com o oxigênio

(Jensen, 1990; 1991; Brauner et al., 1993; Paula-Silva, 1999).

Além disso, na Amazônia dada a diversidade de habitats aquáticos, um

acidente com petróleo pode ter seus efeitos ampliados. Essa região apresenta

cheias regulares, o que faz com que o óleo derramado, dependendo da época,

escape das calhas dos rios e atinja um grande número de habitats. O óleo

derramado pode persistir por dias ou anos no sistema, afeta a estrutura das

comunidades e causa impacto direto na fauna e na flora, devido às alterações físico-

10

químicas da água e do sedimento, bem como em decorrência dos processos de

bioacumulação, bioconcentração e biomagnificação (Gray, 2002).

Organismos aquáticos expostos a xenobióticos podem exibir respostas

bioquímicas, fisiológicas e/ou comportamentais adversas, desencadeando um efeito

cascata em todos os níveis tróficos (Hamilton e Lemly, 1999; Stevenson e Ng, 1999;

O’Connor e Paul, 2000). Os padrões de acumulação de xenobióticos são diferentes

para distintos organismos e dependem do balanço entre as taxas de assimilação e

metabolização e eliminação dos compostos químicos (Livingstone, 1993; 1998).

Uma vez no ambiente aquático, os xenobióticos podem ser absorvidos por quatro

vias: a) alimentação, b) ingestão de água, c) pela pele e/ou d) por meio das

brânquias (Heath, 1995; Roesjijadi e Robinson, 1994). Para os peixes amazônicos,

devido aos processos de osmorregulação, a alimentação e a tomada branquial são

as principais, conforme sugerido por Val e Almeida-Val (1997; 1999). A ingestão de

água é a principal via de contaminação para peixes marinhos, enquanto a via

cutânea é importante para peixes que se encontram em estado larval (Heath, 1995;

Roesjijadi e Robinson, 1994).

Vários são os distúrbios fisiológicos causados pela exposição crônica ou

aguda ao petróleo. Martin Jr. e Black (1996) estudaram os efeitos da contaminação

por uma refinaria de petróleo em bagres de canal (Ictalurus punctatus). Os autores

utilizaram um conjunto de biomarcadores para avaliação aguda por metais pesados,

e detectaram um aumento significativo nos níveis de glicose sangüínea e em dois

parâmetros hematológicos: hemoglobina e ácido α-aminolevulínico desidratase,

cujas alterações indicam estresse e foram associadas às altas concentrações de

chumbo encontradas em sedimento. Este metal inibe a enzima δ-aminolevulinato

desidratase (ALAD) requerida nos primeiros estágios da síntese de hemoglobina no

11

tecido hematopoiético; esses distúrbios são etapas iniciais causadas pela presença

deste elemento. Alkindi e colaboradores (1996), ao analisarem parâmetros

endócrinos, osmóticos, respiratórios e hematológicos em Pleuronectes flesus

expostos à fração solúvel de petróleo, constataram vários distúrbios fisiológicos

profundos, como um “dramático” declínio na concentração do O2 sangüíneo (CvO2),

que pareceu ser a causa do aumento de noradrenalina no plasma, seguida de um

aumento significativo do hematócrito e hemoglobina.

A exposição dos peixes da Amazônia Hoplosternum littorale e Colossoma

macropomum ao petróleo de Urucu resultou em uma redução drástica de até 87% na

concentração de oxigênio dissolvido no sangue (Val e Almeida-Val, 1999). A fusão

das lamelas branquiais e a proliferação de células de cloreto no epitélio respiratório

de Glyptoperichthys joselimaianus submetidos à exposição do petróleo sugerem que

a fração solúvel desse poluente induz não somente alterações respiratórias, como

também, distúrbios no nível da regulação iônica (Farias e Costa, 1996). Matsuo e

colaboradores (2006) observaram que a exposição aguda do tambaqui ao petróleo

resultou em um aumento no efluxo de Na+. Entretanto, a espécie foi capaz de se

contrapor a esse efeito a partir de um estímulo nas taxas de influxo do íon. No

mesmo trabalho os autores também verificaram que a atividade da EROD na

exposição aguda à fração do petróleo de Urucu (2,8%) foi capaz de aumentar em 14

vezes em relação ao controle.

A análise de metais pesados em peixes da região do Urucu mostrou que a

bioacumulação de elementos-traços foi diferenciada entre Liposarcus pardalis e

Cichla monoculus, uma espécie detritívora e predadora, respectivamente, não se

detectando biomagnificação com o aumento do nível trófico (Anjos, 2003). Esses

resultados sugerem que cada organismo, mesmo exposto à mesma concentração

12

de contaminante, apresenta respostas fisiológicas diferentes. Houve diferença dos

níveis de metais encontrados entre L. pardalis e C. monoculus nos tecidos

analisados; porém, nenhuma das espécies apresentou altos níveis de todos os

metais, indicando que o nível trófico, isoladamente, não explica a concentração dos

metais nos tecidos dessas espécies. Isso, particularmente, pode ser um reflexo de

vários fatores como o movimento do contaminante no meio ambiente, a forma

química do metal, a concentração do contaminante nos diferentes compartimentos

ambientais, as vias de ingestão, o caminho percorrido pelo metal no sistema

circulatório do peixe, os mecanismos de detoxificação, a ação de proteínas como

metalotioneína, entre outros.

Alguns xenobióticos têm alta afinidade por membranas biológicas e interferem

dessa maneira com a integridade celular (Corcoran et al., 1994; Dekant e Vamvakas,

1995) Eles podem ligar-se a proteínas de membrana alterando os processos

celulares, o status energético e os gradientes iônicos, dentre outras conseqüências,

conduzindo à interferência em importantes funções celulares.

Algumas proteínas que funcionam como fator de transcrição são ativadas por

contaminantes ambientais, por meio da indução à expressão de genes específicos.

Muitas substâncias agem via membrana. Essa toxicidade basal (conhecida como

narcose polar e apolar) responde por mais de 70% de todas as substâncias

acumuladas. O distúrbio da membrana celular também afeta os gradientes iônicos,

em particular o de Ca+2. O íon cálcio é parte de uma cascata de sinalização

intracelular. Enzimas, como as proteases, nucleases e lipases são reguladas via

nível intracelular de Ca2+. O aumento do nível de Ca2+ é associado com a indução de

apoptose e modificação da expressão de muitos genes e proteínas (Farber, 1990;

Nicotera et al., 1990; Reed, 1990; Pan et al., 2001; Ermak e Davies, 2002).

13

Esclarecer como os xenobióticos atuam em nível celular é importante para o

delineamento de estratégias para mitigação de danos ambientais.

Como se pode observar, as alterações causadas por presença de

componentes do petróleo no ambiente aquático atingem diretamente os peixes,

causando mudanças adversas nos mais variados níveis da organização biológica,

desde o nível molecular até o nível populacional (Oost et al., 2003). Porém, todos os

efeitos de um contaminante químico em um organismo vivo podem ser explicados

por um evento inicial no nível molecular/celular.

Contaminantes como os hidrocarbonetos aromáticos polinucleares se

acumulam em altas concentrações nos tecidos de invertebrados, pois as taxas de

assimilação excedem às de metabolização e eliminação. No entanto, estes mesmos

poluentes em vertebrados, onde o metabolismo e a eliminação podem superar a

taxa de assimilação, ou não acumulam ou não é significativo. Ao contrário,

contaminantes pouco metabolizados ou eliminados, como o DDT, se acumulam ao

longo das cadeias tróficas e são encontrados em altas concentrações em tecidos de

predadores do topo de cadeia (Livingstone, 1998).

Dadas estas diferenças nas formas de metabolizar os xenobióticos, existe

uma necessidade de se detectar e avaliar o impacto de poluentes nos organismos

expostos, e não somente avaliar a quantidade de poluentes presentes no ambiente e

nos animais. Esta necessidade dá origem ao estudo e desenvolvimento de

biomarcadores bioquímicos, fisiológicos, moleculares, morfológicos ou que reflitam

efeitos biológicos nos organismos.

1.4 Biomarcadores

Biomarcadores são utilizados para acompanhar o comportamento aquático de

14

contaminantes ambientais, por via de regra, substâncias tóxicas com baixos níveis

na água. A presença de uma combinação de xenobióticos (como o petróleo) em um

ambiente aquático gera efeitos deletérios em populações. Esses efeitos tendem a se

manifestar apenas depois de períodos mais longos de exposição. Quando há

evidência do processo destrutivo, o efeito pode ter ocorrido em nível crítico para

reversão, por meio de ações convencionais de recuperação. Desta forma, é

fundamental prever efeitos nos níveis hierárquicos mais altos, antes que ocorram e

isto pode ser evitado pela análise de mudanças nos processos biológicos em níveis

hierárquicos inferiores, com a identificação de biomarcadores de efeitos que se

constituem na realidade em sinais de advertência (Baker, 1991; Heath, 1995; Ba-

Akda, 1996; Kingston, 2002; Oost et al., 2003).

Livingstone (1993) considera como biomarcadores os fluídos corpóreos, as

células ou os tecidos que indicam, em termos bioquímicos ou celulares, a presença

de contaminantes. Também se consideram como biomarcadores, as respostas

fisiológicas, comportamentais ou energéticas dos organismos expostos. Existem

assim biomarcadores moleculares, celulares ou sistêmicos, sendo alguns deles

específicos para determinados poluentes.

De acordo com NRC (1987) e Who (1993) e revisão de Oost (2003), os

biomarcadores podem ser subdivididos em três classes:

1. Biomarcadores de exposição , que incluem a detecção e medem um substrato

endógeno, seu metabólito ou o produto de uma interação entre um agente

xenobiótico e algumas moléculas alvo ou células, medidas em um compartimento do

organismo. Citam-se como marcadores desse tipo as atividades de enzimas

antioxidantes e a concentração de metalotioneína.

15

2. Biomarcadores de efeito incluem medidas bioquímicas, fisiológicas, alterações

em tecidos ou nos fluídos corporais de organismos associados a um estabelecido ou

possível dano na saúde ou doença, como a peroxidação de lipídios ou o dano de

DNA.

3. Biomarcadores de susceptibilidade indicam a habilidade inerente ou adquirida

de um organismo, para responder ao desafio da exposição a uma substância

xenobiótica incluindo fatores genéticos e mudanças em receptores, os quais alteram

a susceptibilidade de um organismo para aquela dada exposição.

Uma das vantagens ao utilizar os biomarcadores em níveis baixos de

organização biológica é a possibilidade de detectar precocemente os efeitos

deletérios de poluentes, antes de alterações evidentes em níveis superiores da

organização biológica. Estudos no nível populacional e de comunidade também

fornecem informações sobre as mudanças que ocorrem; porém, estas somente são

detectadas quando a comunidade já foi impactada.

Dentre os vários biomarcadores existentes disponíveis para as mais variadas

análises, existem sete biomarcadores que foram classificados como potencialmente

habilitados para serem testados, que são os mais sensíveis à exposição aguda ou

crônica ao petróleo de Urucu. São eles:

AhR , o mecanismo de ativação bioquímica dos PAHs nos organismos, inclusive em

peixes, ocorre através do receptor Ah (AhR, aryl hydrocarbon receptor) presente no

citoplasma da célula. AhR em sua forma inativa, estável, encontra-se acoplado a

duas proteínas hsp90 (heat shock protein, de peso molecular de 90 kDa). Quando os

compostos de hidrocarbonetos poliaromáticos (PAHs) são absorvidos pelos peixes,

as hsp90 são ‘desacopladas’ do receptor e ocorre a formação do conjunto

PAH+AhR, o qual é movido para o interior do núcleo por meio de um translocador

16

(ARNT, aryl hydrocarbon nuclear translocator). Uma vez no núcleo da célula, ocorre

a ligação deste complexo uma região promotora conhecida como XRE (xenobiotic

region enhancer), onde ocorrerá a transcrição gênica resultando na expressão de

CYP1A (Hahn, 1998).

CYP1A, da subfamília do citocromo P4501A (CYP1A) monoxigenase tem atraído

atenção devido a sua importante função na biotransformação de alguns compostos

como dioxinas, furanos, PCBs e hidrocarbonetos poliaromáticos (PAHs). Estas

enzimas são importantes para o metabolismo destes contaminantes e na

carcinogênese produzida por esses agentes. A indução de CYP1A por exposição a

xenobióticos levou ao seu uso como um biomarcador em estudos de monitoramento

de poluição em ambiente aquático (Devaux et al., 1998; Cao et al., 2000; Leaver e

George, 2000; Sarasquete e Segner, 2000). Inúmeros estudos mostram claramente

que os níveis de CYP1A são elevados na maioria das vezes em peixes coletados

em ambientes poluídos, e em alguns casos, a atividade da EROD (Ethoxyresorufin

O-deethylase) ou o nível protéico de CYP1A podem ser diretamente correlacionados

com a distribuição de xenobióticos, como PAHs ou PCBs, no meio ambiente

(Devaux et al., 1998; Sarasquete e Segner, 2000; Billiard et al., 2002; Monk et al.,

2003; Racky et al., 2004).

Em ambiente natural a resposta da CYP1A pode ter a influência de diversos

fatores que podem confundir a interpretação dos dados. Esses fatores podem ser:

misturas complexas de xenobióticos; parâmetros exógenos como temperatura e

estação do ano; fatores endógenos como nível hormonal ou condições fisiológicas

do peixe e idade; entre outros (Goksøyr e Forlin, 1992; Achasi et al., 1994;

Sarasquete e Segner 2000; Ortiz Delgado et al., 2002, Abu-Bakar et al., 2005).

17

HMOX1 (heme oxigenase) é a enzima que degrada os grupos heme (Maines, 1997).

Sua isoforma induzível, hmox1, aumenta a resistência celular contra o estresse

oxidativo e diminui a inflamação e rejeição do enxerto em humanos (Jaworski e

Klapperich, 2006). Hmox1 (proteína de choque térmico 32 – HSP32) é expressa

especialmente no baço e fígado, mas também na maioria dos tecidos quando ocorre

exposição a radicais livres. Como resultado da expressão da hmox1, as células

adquirem a resistência contra uma segunda e letal exposição aos radicais livres

(estresse oxidativo) (Applegatte et al., 1991). Esta proteína é dependente do

NADPH, oxigênio e citocromo P450, para produzir quantidades equimolares de

biliverdina (BV), monóxido de carbono e ferro. Biliverdina é subsequentemente

convertida para bilirrubina (BR) pela biliverdina-redutase. Dois genes separados,

hmox1 e hmox2, codificam as duas isoformas em mamíferos (que são

cataliticamente ativas). A isoforma hmox1 é citoprotetora e é induzida pelo seu

substrato heme, lesão por agentes oxidantes, óxido nítrico, íons de metal de

transição, hipoxia e citoquinonas inflamatórias em tecidos de mamíferos, incluindo

as células do rim e células derivada do rim. Um alto nível do hmox1 é

freqüentemente detectado no rim sob condições patológicas. Entretanto, os

mecanismos subjacentes na indução do gene hmox1 por indutores múltiplos não são

somente célula e tecido específico, mas também espécie específica. (Appenzeller et

al., 2006; Jarwoski e Klapperich, 2006).

HSP70 (proteínas de choque térmico, heat shock proteínas) são proteínas celulares

altamente conservadas presentes em todos os organismos que se examinou até

hoje (Morimoto et al., 1990; Welch, 1993; Feder e Hofmann, 1999; Basu et al.,

18

2002), incluindo peixes (Iwama et al., 1998). Nas células não estressadas, essas

proteínas têm função constitutiva, essenciais em vários aspectos do metabolismo de

proteína (Morimoto et al., 1990; Hightower, 1991; Nover, 1991; Hendrick e Hartl,

1993; Welch, 1993; Fink e Goto, 1998). Embora a indução de HSPs tenha sido

inicialmente associada à exposição ao choque térmico, vários estudos já mostraram

que a indução de HSP70 ocorre em resposta a uma variedade de estressores,

inclusive contaminantes aquáticos (Ryan e Hightower, 1994; 1996; Williams et al.,

1996, Appenzeller et al., 2006). Das HSPs, a HSP70 tem sido a mais amplamente

estudada, e várias hipóteses têm sido apresentadas sobre seu mecanismo de ação

durante a resposta ao estresse celular. A HSP70 também está presente no nível

constitutivo das células e tem sido mostrado ser importante no seu funcionamento

normal (Hightower et al., 1994). Esta proteína também é conhecida por auxiliar o

envolvimento das cadeias polipeptídicas nascentes, que age como uma chaperona

molecular, e media o reparo e a degradação de proteínas alteradas ou desnaturadas

(Kiang e Tsokos, 1998; Basu et al., 2002).

MAFT, descoberta em 2004 em zebrafish (Tagaki et al., 2004), é uma proteína

pequena pertencente a um grupo de famílias que tem sido identificada nos

vertebrados, divididas entre as pequenas e grandes subfamílias da MAF. As grandes

proteínas MAF incluem c-Maf, MafB, Nrl e L-maf/MafA/S-maf que contem um

domínio ácido N-terminal, que serve como um domínio de transativação. Os outros

membros da família como MafF, MafG e MafK, constituem a pequena família

protéica Maf que possui um bZIP mediando a junção do DNA e formação do dímero

em comum, mas carece de domínios de efeito transcripcional reconhecíveis. A

principal função dos membros da família MAF é regulação do gene nrf2 e proteção

19

celular, mas são ainda poucos os estudos que se tem sobre esse membro MAFT

(Tagaki et al., 2004).

MT, metalotioneína, é outra proteína rica em cisteína, de baixo peso molecular,

capaz de fazer várias ligações com metais. Contaminação com metais de transição

como cádmio induz a expressão de MT indisponibilizando o metal para a célula.

Vários trabalhos usam essa proteína como indicador de contaminação aquática com

metais (Hogstrand e Haux, 1990; Hyllard et al., 1995; Soazig e Marc, 2003; Simes et

al., 2003).

NRF2 é uma proteína detoxificante da fase 2; sua indução é responsável pela

citoproteção quando o organismo é exposto a baixos níveis de estresse oxidativo e

eletrofílico. Estudos in vivo usando NRF2 de ratos deficientes, claramente indicaram

o NRF2 como uma proteína crítica na regulação da expressão de glutationa s-

transferase (GSTs) e NAD(P)H quinona oxiredutase. NRF2 mostrou controlar a

decodificação de genes de outras enzimas detoxificantes da fase 2, como UDP-

glucuronil transferase 1A6, aflatoxina B1 aldeído redutase, e epoxihicrolase

microssômica. Além disso, para as enzimas de detoxificação da fase 2, foi

demonstrado a indução de proteínas antioxidantes durante o estresse oxidativo,

depende da ativação do gene nrf2. Na categoria de genes, heme peroxi-redoxin1, a

cadeia leve e pesada de ferritin, catalase, glutationa peroxidase, superóxido

desmutase e tioredoxin mostraram também ser regulado pelo nrf2 (Tagaki et al.,

2004).

Devido às características apresentadas por cada um dos sete genes

mencionados anteriormente, estes foram selecionados nesse estudo para as

20

análises de expressão gênica em peixes amazônicos expostos ao petróleo da

Reserva Petrolífera de Urucu.

1.5 Justificativa

Nos últimos anos a comunidade científica de um modo geral e as populações

dos países mais industrializados, tem voltado suas preocupações para o impacto

ambiental causado por profundas modificações feitas pelo homem, em particular no

ambiente aquático. O interesse por esse assunto é um reflexo crescente da

consciência mundial de que a água doce é um recurso natural esgotável e suas

fontes cada vez mais escassas.

Apesar de seus múltiplos usos e de sua importância econômica, o petróleo

apresenta um grande potencial como contaminante ambiental, particularmente nos

ambientes aquáticos, onde são construídas plataformas de extração, oleodutos,

gasodutos e também onde trafegam os navios-tanque. As contaminações por

petróleo em menor escala, mas crônicas, resultam de procedimentos de rotina na

limpeza de tanques, pequenos vazamentos nos locais de extração, resíduos de

refinarias, etc. (Kupchella e Hyland, 1993).

Peixes são considerados um modelo conveniente para o estudo de impactos

ambientais causados por contaminação do ambientes com xenobióticos e

considerados modelos desenvolvidos, uma vez que muitas espécies têm fertilização

externa, facilitando assim experimentos com ovos e embriões.

Como já relatado, qualquer dano no organismo se inicia em nível molecular e

em particular, os efeitos abaixo da toxicidade subaguda podem ser detectados pelas

medidas de marcadores apropriados. Estes podem servir como indicadores de

21

contaminação (biomarcadores), mas também indicam uma exposição que pode ter

efeitos crônicos e de longo prazo em organismos e populações.

Assim, para monitorar os efeitos da contaminação aquática por petróleo, faz-

se necessário, estabelecer de marcadores moleculares em organismos indicadores

de contaminação subaguda. Peixes são organismos marcadores (biomarcadores)

bem estabelecidos, uma vez que (i) foram estudados extensivamente em muitas

áreas impactadas ao redor de todo o mundo; (ii) são de grande importância

econômica e nutricional para a população humana; (iii) estão expostos diretamente a

contaminantes lançados diretamente na água ou lixiviados; (iv) estão distribuídos no

início, meio e fim da cadeia trófica aquática e (v) vários biomarcadores do nível de

toxicidade de agentes químicos presentes no petróleo estão disponíveis.

Em Urucu, um programa de monitoramento foi iniciado para a detecção de

alguns metais componentes da água de formação e frações do petróleo (cádmio,

cromo, chumbo e selênio). Esses testes já foram realizados na água e no sedimento

coletados no campo de exploração, assim como nas espécies de peixe Cichla

monoculus e Liposarcus pardalis expostas a essas frações (Anjos, 2003). Pretende-

se neste estudo tornar claro o efeito biológico nos organismos que serão testados.

Adicionalmente aos perigos relacionados à extração e transporte de petróleo,

a existência de poucos estudos sobre a fisiologia de animais aquáticos presentes em

riachos reforça a necessidade e a urgência dos estudos nestes ambientes, uma vez

que se desconhece até que ponto alterações antrópicas podem afetar o

comportamento da comunidade aquática presente nesses ambientes.

1.6 Objetivo Geral

Identificar marcadores moleculares sensíveis à presença de concentrações

22

subagudas de componentes do petróleo para o monitoramento ambiental de áreas

susceptíveis à contaminação na Amazônia, por meio de experimentos laboratoriais.

1.6.1 Objetivos específicos

Capítulo 1. “Identificação de Biomarcadores em zebrafish Danio rerio para

contaminação aquática com petróleo de Urucu, Amazonas, Brasil”

1. Estimar a sensibilidade da espécie Danio rerio (organismo modelo) ao

petróleo de Urucu (fração solúvel e óleo cru) por meio de análises teratogênicas e

mortalidade;

2. Analisar a expressão dos marcadores moleculares ahr, cyp1a1, hmox1,

hsp70, maft, mt e nrf2, em exemplares de D. rerio expostos a concentrações

subagudas do petróleo (fração solúvel e óleo cru) de Urucu.

3. Selecionar entre os marcadores acima descritos o de maior sensibilidade

ao petróleo de Urucu, para poder testar sua expressão em exemplares de

Astronotus ocellatus (espécie amazônica) expostos a concentrações subagudas de

petróleo.

Capítulo 2. “Marcadores moleculares para contaminação por petróleo em peixe

amazônico Astronotus ocellatus (Oscar)”:

1. Estimar a sensibilidade da espécie A. ocellatus ao óleo cru e fração solúvel

do petróleo em condições regulares (temperatura ambiente, pH neutro e normoxia),

em ambiente acidificado (pH= 3,5, normoxia e temperatura ambiente) e em ambiente

hipóxico (pH neutro, temperatura ambiente, hipoxia);

2. Clonar e analisar a expressão dos genes (marcadores moleculares)

selecionados por meio do experimento com Danio rerio (capítulo 1, objetivo 3) em

23

exemplares de acará-açu, A. ocellatus, expostos a concentrações subagudas de

petróleo, em um modelo dose-resposta, nas condições experimentais descritas

acima (objetivo 1).

Capítulo 3. “Fracionamento do Petróleo de Urucu e aplicação em embrioteste

de Danio rerio”.

1. Identificar os compostos presentes no petróleo de Urucu que induzem a

expressão do gene selecionado para análise.

24

Capítulo 1

“Identificação de Biomarcadores em Zebrafish, Danio rerio,

para contaminação aquática com petróleo de Urucu,

Amazonas, Brasil”

25

1. Introdução

Biomarcadores são mudanças bioquímicas, fisiológicas, histológicas ou

moleculares que medem efeito ou exposição a compostos químicos tóxicos.

Ecotoxicologistas usam biomarcadores para esclarecer relações causa-efeito entre

efeitos tóxicos no nível fisiológico e populacional e para prover ferramentas para o

biomonitoramento.

O uso de técnicas moleculares para examinar a expressão de genes tem

levado ao desenvolvimento de biomarcadores que medem o acúmulo de mRNA

específicos nos tecidos (Levine e Oris, 1999; Bowman e Denslow, 2000; McClain et

al., 2003; revisto por Oost et al., 2003; Robert e Oris, 2004; Roberts et al., 2006).

Essas técnicas permitem determinar uma taxa semi-quantitativa de diferenças na

expressão de milhares de genes potenciais com uma pequena amostra de tecido

(<100 mg). A vantagem de marcadores moleculares é que o número de genes e vias

fisiológicas que podem ser afetadas por exposição a contaminantes podem ser

investigadas utilizando uma amostra de tecido. Os organismos geralmente reagem à

exposição química alterando os níveis de expressão de múltiplos genes. Por isso,

uma ampla variedade de mudanças moleculares deveria ser monitorada para prever

o efeito potencial tóxico e seus mecanismos. Análises globais de expressão de

genes podem ser usadas para avaliar a exposição química e os efeitos tóxicos

associados com a alteração da expressão do gene (Nakayama et al., 2006).

Neste estudo avaliou-se a expressão de genes de sete potenciais

biomarcadores: ahr, cyp1a, hmox1, hsp70, maft, mt e nrf2, em um bem estabelecido

modelo para análises toxicológicas, o Danio rerio embrioteste.

Estes biomarcadores foram selecionados por estarem, de alguma forma,

relacionados a respostas com exposição a contaminantes, sejam eles PAHs, metais

26

pesados ou drogas. O principal objetivo desta pesquisa, além de avaliar os efeitos

causados em embriões de zebrafish pela exposição ao petróleo de Urucu, foi de

encontrar em modelo bem estabelecido, o marcador ideal para ser usado na

avaliação de possíveis contaminações de petróleo na Reserva de Urucu, utilizando

um peixe amazônico, o Astronotus ocellatus, abundante no local.

Este modelo bem estabelecido, D. rerio embrioteste, têm sido amplamente

utilizado para avaliar as respostas a contaminantes, quer seja por expressão de

genes ou análises teratogênicas, por meio das quais se podem avaliar as mudanças

ocorridas fenotipicamente.

1.1 A espécie

Danio rerio

A espécie escolhida para este estudo foi o Danio rerio, zebrafish, da ordem

dos Cypriniformes, família Cyprinidae. É uma espécie amplamente conhecida e bem

estudada, nativa da Ásia, podendo alcançar 3,8 cm de comprimento padrão (CP) em

laboratório, de importância ornamental e sua população pode dobrar de tamanho em

um intervalo de tempo de 15 meses.

Figura 1. Exemplar de Danio rerio na fase adulta.

27

Esta espécie, devido a seu pequeno porte, é de fácil manutenção no

laboratório e tem seu genoma totalmente seqüenciado, o que a torna altamente

viável para análises de expressão de genes. Os embriões foram utilizados no

estádio de blástula que é o período de 2 ¼ -5 ¼ horas após a fertilização (hpf).

28

2. Material e Método

2.1 Exposição do Danio rerio a concentrações subagudas de petróleo (Urucu)

Os embriões de Danio rerio utilizados nestes experimentos foram

provenientes de aquários existentes no Departamento de Toxicologia Celular – UFZ,

Leipzig-Alemanha. Esses aquários estão localizados no porão do departamento,

numa pequena sala fechada, que possui sistema de aquecimento com temperatura

constante de 27+0,5°C e renovação constante da água nos aquários, o nde os

animais foram alimentados uma vez ao dia com ração comercial.

Os embriões eram coletados pela manha, por volta das 9:30h (o que equivale

a geralmente 2 horas após a fertilização - hpf), e então levados ao Laboratório,

onde, em Microscópio BMS 143, fez-se a seleção dos embriões para os

experimentos, que eram expostos no estágio de Blástula (2,5 – 5,2 hpf). Os

experimentos eram iniciados por volta de 10:30h da manhã.

Nesses experimentos com o zebrafish utilizou-se apenas a fração solúvel do

petróleo. Um litro de petróleo do Urucu foi transportado de Manaus para o

Departamento de Toxicologia Celular-UFZ. Em recipientes de 200 ml de vidro de cor

escura, para evitar a evaporação e fotodegradação, contendo 100 ml de

ISOWASSER (água que contém os nutrientes necessários para o bom crescimento

do zebrafish: 0,77 mM NaHCO3, 0,08 mM KCl, 1 mM MgSO4 e 2 mM CaCl2, era

acicionado o óleo cru nas concentrações desejadas (Tabela 1), que era mantida sob

agitação por 24 horas, em agitador TECNAL com magneto. Após esse período, a

agitação era cessada e aguardava-se 60 minutos para a separação das frações. Em

seguida, com uma seringa de 10 ml, colhia-se a fração solúvel do petróleo, ou seja,

a parte inferior, que era transferida para um outro recipiente de vidro armazenado a

4°C ao abrigo do calor e luz.

29

Tabela 1. Concentrações de petróleo nos experimentos realizados com D. rerio.

Concentração

(%)

Volume de Petróleo

(µl/100ml de Isowasser)

1 Controle Zero

2 0,001525 0,1525

3 0,0061 0,61

4 0,024 2,4

5 0,098 9,8

6 0,39 39

7 1,56 156

8 6,25 625

Em cada experimento eram coletados em média 240 embriões no estágio de

blástula. Os experimentos eram feitos em placas de Petri de vidro, contendo 10 ml

da fração solúvel do petróleo nas devidas concentrações, e adicionados 30

embriões, todos no mesmo estágio de vida (blástula). As concentrações utilizadas

nos experimentos com zebrafish foram baseadas nas concentrações encontradas

como subletais (CL50) para a espécie amazônica A. ocellatus. Essas concentrações

foram fatoradas por 4 para determinar os níveis de exposição de Danio rerio.

Após adicionar os embriões nas concentrações estabelecidas, as placas de

Petri eram mantidas em uma incubadora a 27°C por 48 horas, sendo revisadas após

24 horas para verificar possíveis mortalidades e anomalias. Após essa revisão, as

placas eram novamente colocadas em incubadora até o final dos experimentos, 48 e

96 horas, e então eram observadas as porcentagens de mortalidade nos

experimentos.

Deve-se esclarecer que poucos experimentos tiveram duração de 96 horas,

30

devido à rigidez das leis na Alemanha, que limitavam até 2006 a exposição à

contaminantes a um período máximo de 48 horas. A partir de 2006, essa lei foi

mudada sendo permitido experimentos mais longos, desde que não envolvam

animais adultos.

2.2 Captação das imagens dos embriões de D. rerio

Após o tempo de exposição, as placas com os embriões eram observadas

em um microscópio Leica com uma câmera MZ16F acoplada e imagens digitais

eram captadas e transferidas diretamente para o programa computacional Leica

Application suite v.2.4.0 Essa observação teve como objetivo verificar se a

exposição ao petróleo causava mutagênese em D. rerio.

2.3 Estudos da expressão dos genes ahr, cyp1a, hmox, hsp70, maft, mt e nrf2 em

Danio rerio

Estes estudos foram feitos pelo uso da técnica RT-PCR (amplificação por

Transcriptase Reversa – Reação de Cadeia Polimerase) utilizando oligonucleotídeos

específicos de D. rerio dos genes de ahr, cyp1a, hmox1, hsp70, maft, mt e nrf2. O

gene ß-actina foi usado como controle constitutivo. Todos esses genes estão

disponíveis no GenBank (Tabela 2).

O fato dos efeitos moleculares causados por exposição a elementos tóxicos

serem semelhantes em todas as espécies permite a extrapolação também para

espécies de peixes da Amazônia. O protocolo da técnica vai descrito a seguir.

2.3.1 Extração do RNA total

O RNA total foi extraído dos embriões de Danio rerio sobreviventes nos

31

experimentos de exposição por homogeneização das amostras de tecido em 500µl

de reagente TRIzol para cada 20-30 embriões sobreviventes.

Os tubos Eppendorfs (Eppis) de 2,0 ml, enumerados de acordo com a

concentração, receberam os embriões sobreviventes. Os tubos recebiam, então,

uma leve lavagem com água MilliQ. Em seguida, toda a água era substituída por 500

µl de TRIzol e as amostras eram homogeneizadas e mantidas à temperatura

ambiente por 5 minutos, seguido de adição de 100 µl de clorofórmio e mistura por

inversão a temperatura ambiente por 3 minutos. Após esse tempo a amostra era

centrifugada a 12.000g, 4°C, por 5 minutos para a s eparação das três fases líquidas:

o sobrenadante que continha o RNA; a fase abaixo do sobrenadante, fase meio

esbranquiçada e fina, continha DNA, e a interfase que contém os compostos

orgânicos. A fase de trabalho era o sobrenadante com RNA.

Do tubo de Eppendorf retirava-se cuidadosamente o sobrenadante

(aproximadamente 250-280 µl) com uma pipeta de 200µl, com muito cuidado para

não haver contaminação com o DNA, que era transferido para um novo tubo. Ao

novo tubo adicionava-se um volume igual de isopropanol (aprox. 250 µl), misturava-

se brevemente no Vortex e armazenava-se no freezer a -20°C por no mínimo 20

minutos. Em seguida centrifugava-se novamente a 12.000g, 4°C, por 5 minutos. Um

pellet de RNA, fracamente visível, era formado no fundo dos tubos. O sobrenadante

era retirado com muito cuidado para não retirar o pellet, e 500µl de etanol 75% era

adicionado, misturando-se por inversão três vezes e centrifugando-se novamente a

12.000g, 4°C por 10 minutos, com remoção do sobrena dante. O tubo era mantido a

temperatura ambiente por 10 minutos para evaporar o etanol, com adição, a seguir,

de 20µl de água e incubação por 5 minutos a 60°C para dil uição total do RNA.

Quantificação do RNA - O RNA diluído em água foi quantificado por

32

espectrofotometria NanoDrop λ = 260-280nm, utilizando 1,5 µl do RNA total.

Integridade do RNA - foi conferida por eletroforese em gel de agarose 1,5%

usando 500ng do RNA total de cada amostra, estocado em freezer a -800C até o

momento das análises.

Digestão de DNA - A digestão de possíveis contaminações com DNA foi feita

utilizando o seguinte mix: para cada amostra de 2µg de RNA dissolvido em 10µl de

água MilliQ, foram adicionadas 1µl de DNAse (RNAse-free, Roche), 2 µl de 10X D -

Tampão e 7 µl de água MilliQ e mantido em um termociclador Biometra T3000 a

25°C por 15 minutos com volume final de 20 µl, utilizando-se 10 µl para controle em

gel de agarose 1% para verificar as possíveis contaminações com proteínas. Os 10µl

restantes foram utilizados para a síntese do DNA complementar.

2.3.2 Síntese do DNA complementar (cDNA)

Para síntese do cDNA foi utilizado 1µg do RNA total (diluído em 10µl de

DNAse para retirada de possíveis contaminações) acondicionado em tubo de reação

PCR de 0,2 ml e adicionado 2µl de Oligo dT18 primer (10µM). Estes tubos foram

colocados em um termociclador Biometra T3000, aquecido a 70°C por cinco minutos

e em seguida resfriamento em gelo. O MasterMix RT foi preparado com 4µl de

tampão 5X, 2µl das dNTPs (10mM), 0,5µl de Inibidor Ribonuclease (recombinante

40u/µl) RNAse Out e 0,5µl de H2O MilliQ. Esse RT-MasterMix foi adicionado à

solução com RNA para desnaturação, incubado por 10 minutos a 37°C. Em seguida

foi adicionado 1µl da Transcriptase Reversa MMLV (200 U/µl, Revert Aid,

Fermentas), com um volume final de 20µl de reação. Essa reação era incubada por

75 minutos a 42°C e inativada (10 minutos a 70°C us ando o termociclador Biometra

T3000). Após essa reação obteve-se o cDNA, que foi então amplificado por PCR.

33

2.3.3 PCR utilizando oligonucleotídeos específicos

O MasterMix de PCR foi preparado para cada reação com 2,5µl de tampão

10X de RT-PCR, 1µl de dNTP-mix (10mM), 17,8 µl água, 0,2 µl deTaq-Polymerase,

1µl de oligonucleotídeo forward, 1 µl de oligonucleotídeo reverse dos genes

selecionados (Tabela 2). Após o preparo do MasterMix foi adicionado 1µl do cDNA,

com volume final de 25 µl.

O ciclo tinha início com 94°C por 45 segundos; o an elamento ocorreu a 60°C,

30s, a extensão a 72°C, 45s e a sua extensão final a 72°C por 10 min. Dependendo

do tamanho do fragmento esperado, eram calculados os números de ciclos

necessários para ver a expressão desses genes. Estes ciclos foram realizados no

termociclador Biometra T3000, algumas vezes utilizando o Biometra Tgradiente.


Forward e Reverse.

Genes Seqüência dos oligonucleotídeos S TM (°C)

N° de ciclos

Registro no

GenBank

Tamanho (pb)

ß-actina GCCAACAGAGAGAAGATGACACAG F 56 25

AF057041 471

ß-actina CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAG R

ahr TACAGACTTCCAAAGAGGCACAC F 53,4 35 NM131264 211

ahr TGACATCCCAGATACCAGATTG R

hmox GCTTCTGCTGTGCTCTCTATACG F 52 35 NM199678 210

hmox CTCTCAGTCTCTGTGCATATCG R

hsp70 ATCACCATTACCAACGACCAG F 54 35 BI709911 232

hsp70 ATCTTCTCCTCCACTGCCTTCT R

maft GAGGGACCAACAACATTTCAG F 51,5 35 AB167543 230

maft ATTCAGACCAATCACAGCACAA R

34

cyp1a ATGAGCACCTGCGAAGAGT F 55 35 AW342687 397

cyp1a TGGCCTTGTCCTTTCAAAA R

mt TTTTGGAACACTCTCACAGCAC F 52,5 35 AW173921 203

mt ATTGCCAGATAAAGCACCCTAT R

nrf2 GTTTGTCCCTAGATGCAAGTCC F 52 35 AB081314 203

nrf2 TCTTCAGCTTGTCTTTGGTGAA R

S=Sentido; F=Forward; R=Reverse; TM= temperatura média de anelamento; pb=número de pares de base do fragmento.

A concentração do produto foi determinada por eletroforese em gel de

agarose 1% em tampão 1X TAE , corado com brometo de etídio em TAE, 0,001%

por 20 - 30 minutos em cuba a 120 W, e visualizada a intensidade das bandas em

luz UV e em seguida fotografadas.

No caso de dificuldade para detectar as diferenças nas expressões, devido a

possíveis degradações, utilizava-se o programa computacional Image J para análise

dos géis. As diferenças existentes nas expressões dos genes foram determinadas

por densintometria.

2.4 Análise Estatística

Os valores foram inscritos numa planilha de dados e manuseados para sua

apresentação sob a forma de média e erro padrão da média. O nível de significância

aceito nos testes estatístico foi de p < 0,05. A significância das diferenças entre

médias foi determinada por análise de variância (ANOVA), com o uso do teste de

Dunnet para as comparações múltiplas, quando necessário.

35

3. Resultados

3.1 Mortalidade

Os experimentos com zebrafish foram repetidos 20 vezes para

aperfeiçoamento do protocolo a ser usado para avaliar a exposição aguda à fração

solúvel do petróleo de Urucu. Serão apresentadas sete repetições dos

experimentos, após aperfeiçoar todos os fatores.

A mortalidade nos experimentos com embriões de zebrafish variou de 0 a

20%, não apresentando diferença estatística significativa entre as diferentes

concentrações testadas (Figura 2).

0

20

40

60

80

100

Controle 0,0061 0,024 0,098 0,39 1,56 6,25 25

Concentrações de petróleo (%)

Mor

talid

ade

(%)

Figura 2. Freqüência de mortalidade (%) nos embriotestes com D. rerio expostos as

diferentes concentrações da fração solúvel do petróleo de Urucu.

3.2 Teratogênia

Os embriões de D. rerio usados nos experimentos apresentaram anomalias

facilmente visíveis ao microscópio, como por exemplo, redução na pigmentação

(Figura 3), severos edemas pericardiais (Figura 4) e redução nos batimentos

cardíacos, os quais foram observados pela contagem em microscópio.

36

Foi observado redução na pigmentação em indivíduos expostos a partir da

concentração de 0,39%. Na concentração de 6,25% havia ausência total de

pigmentação em todos os indivíduos (30 embriões). Nos três experimentos

comparados ao controle não havia qualquer pigmentação pelo corpo. Neste estágio

os indivíduos encontravam-se em 52 hpf (Figura 3).

Figura 3. Efeitos da fração solúvel do petróleo de Urucu no desenvolvimento do D.

rerio. Indivíduos expostos por 48 horas às concentrações de 0,39% (B), 1,56% (C),

6,25% (D) e a Isowasser, controle (A).

Outro efeito causado nos embriões de D. rerio expostos à fração solúvel do

petróleo de Urucu foi a presença de edemas pericardiais nos indivíduos expostos à

concentrações superiores a 0,39% (Figura 4).

37

Figura 4. Presença de edemas no pericárdio dos embriões de D. rerio expostos a

diferentes concentrações da fração solúvel do óleo de Urucu. Controle (A, B, C);

0,39% (D, E, F); 1,56% (G, H, I) e 6,25% (J, L, M). As figuras 4A – 4L estão no

aumento de 20X, porém a 4M está no aumento de 8X, o que já seria o suficiente

para notar as anomalias na concentração exposta.

A Figura 5 mostra a freqüência desses edemas pericardiais em indivíduos

expostos às diferentes concentrações. Vale ressaltar que nas concentrações de

0,001525%; 0,0061%; 0,024%; 0,098% e na condição controle, os embriões não

38

apresentaram nenhum dos efeitos aqui mencionados. Os experimentos para avaliar

os efeitos teratogênicos nos indivíduos de zebrafish foram repetidos quatro vezes,

com 30 embriões por concentração, para se dar consistência aos resultados, e os

resultados foram semelhantes nos quatro experimentos. Ressalta-se que na

concentração 0,098% e nas frações inferiores a esta, não houve presença de

edemas pericardiais em nenhum dos indivíduos, e por isso não foram apresentados

no gráfico.

Figura 5. Freqüência de edemas pericardiais em D. rerio em diferentes

concentrações de petróleo.

Nota-se claramente que quanto maior a concentração de petróleo, maior a

freqüência das anomalias no pericárdio (Figura 4 e 5), quando comparados ao

controle. Na concentração 1,56% de petróleo, todos os indivíduos apresentaram

edemas, maiores que os encontrados na concentração anterior. Todos os embriões

expostos a 6,25% de petróleo apresentaram edemas de grande porte, o que pode

0

20

40

60

80

100

1 2 3 4 5Fre

quên

cia

de e

dem

a pe

ricar

dial

(%

)

controle 6,25%

1,56 0,39 0,098

Concentrações de petróleo (%)

39

ser notado nitidamente nas figuras 4J, 4L e 4M. A figura 4M é um exemplo típico:

grandes edemas pericardiais e ausência de pigmentos no corpo.

3.3 Indução de Biomarcadores por Exposição do Zebra fish a diferentes

concentrações do petróleo de Urucu

Vários foram os genes utilizados para avaliar quais os melhores para detectar

a presença de concentrações subletais de petróleo de Urucu na água. O gene que

se mostrou mais promissor e adequado para dar continuidade com as análises foi o

gene cyp1a. Os outros genes, apesar da indução na presença da fração solúvel do

petróleo de Urucu, não possibilitaram uma interpretação consistente. Nesses

experimentos utiliza-se sempre um gene constitutivo para se certificar da integridade

da amostra. Neste estudo utilizou-se o gene ß-actina.

Nos genes ahr, hsp70, maft e nrf2 não foi observada relação de aumento da

expressão com o aumento da concentração de petróleo nas quais os embriões

estavam expostos. Na realidade a expressão desses genes nas diferentes

concentrações mostrou-se indiferente, sendo que alguns se expressaram até

mesmo no controle, como foi o caso do maft, sem diferença significativa em relação

às demais concentrações (Figura 6).

O gene hmox, que é um gene que responde a várias drogas e é usado para

análises farmacológicas e na área de cosmetologia, mostrou-se também

interessante. Esse gene expressou-se no controle, apresentou discreto aumento de

expressão até a concentração de 0,024%, diminuindo em seguida e, novamente,

voltando a aumentar até a concentração 6,25%, tendo sido observado os mesmos

resultados nas três repetições experimentais.

40


solúvel do petróleo de Urucu. Comparação entre os genes ahr, hmox, hsp70, maft e

nrf2t. A ß-actina foi usada como controle constitutivo (M= Marcador de peso

molecular; 1 = controle; 2 = 0,0061%, 3 = 0,024%, 4 = 0,098%, 5 = 0,39%, 6 =

1,56% e 7 = 6,25% de petróleo. A imagem representa um dos 3 experimentos. Cada

banda representada nos géis significa exposição com 30 embriões.

O gene mt também seria um bom marcador; porém, este gene só apresentou

uma forte expressão na concentração de 1,56% de petróleo; cyp1a nos mesmos

experimentos mostrou-se bem mais sensível que o mt, sendo expresso em

concentrações a partir de 0,0061% e aumentando a expressão conforme o aumento

da concentração (Figura 7).

ß-actina

41


solúvel do petróleo de Urucu. Comparação entre cyp1a e mt. A ß-actina foi usada

como controle constitutivo; (M= Marcador de peso molecular; 1= controle; 2=

0,0061%, 3= 0,024%, 4= 0,098%, 5= 0,39%, 6=1,56% e 7= 6,25% de petróleo.

Devido a esses resultados fizemos também outras três exposições para

certificar o efeito sobre o gene cyp1a e ainda adicionamos a concentração subletal

de 0,001525%, onde também se observou a expressão do gene cyp1a (Figura 8).

Para certificação foi feita a normalização do gene cyp1a em relação à actina (Figura

9).

ß-actina cyp1a

Figura 8. Expressão de gene em embriões de zebrafish expostos por 48 h a fração

solúvel do petróleo de Urucu (M = Marcador de peso molecular; 1 = controle; 2 =

0,001525%; 3 = 0,0061 %; 4 = 0,024 %; 5 = 0,098 %; 6 = 0,39 %; 7 = 1,56%; 8 =

6,25% de petróleo e A = PCR com água, para controle). A ß-actina foi usada como

controle constitutivo. A imagem representa um dos três experimentos usados para a

análise densintométrica com o programa Image J (ver Fig. 9).

M 1 2 3 4 5 6 7 8 A M 1 2 3 4 5 6 7 8 A

42

Figura 9. Normalização da expressão do mRNA da cyp1a em embriões de D. rerio

expostos a fração solúvel do petróleo de Urucu. A normalização foi feita após a

análise densitométrica usando o gene actina como referência (ver Fig. 8). n = 3

experimentos com 30 embriões em cada, havendo diferença significativa (teste de

Dunnet) em relação ao controle (p<0,05).

expressão relativa do gene cyp1a

0

20

40

60

80

100

120

Contro

l

0.00

1525

%

0.00

61%

0.02

4%

0.09

8%

0.39

%

1.56

%

6.25

%

contaminação com petróleo

área

da

band

a (p

ixel

s)

* *

*

*

* *

43

4. Discussão

Neste capítulo, foram avaliados os efeitos da fração solúvel do petróleo de

Urucu no desenvolvimento de embriões de Danio rerio. As análises teratogênicas

foram totalmente qualitativas, com o intuito de mostrar que mesmo sem grandes

esforços percebe-se que ocorrem mudanças fenotípicas visíveis, quando o animal

está exposto a estes contaminantes. Como o nosso interesse estava focado no

efeito químico no nível celular causado em peixes, fez-se o isolamento da fração

insolúvel (uma vez que esta apesar de também tóxica, representa mais uma barreira

física que química para os peixes) e utilizou-se apenas a fração solúvel do petróleo

nos experimentos. Analisou-se a expressão de biomarcadores que sao geralmente

utilizados para avaliar os efeitos de vários contaminantes como PAHs, PCBs,

temperatura, metais pesados, dispersantes, entre outros, em modelo para análises

toxicológicas, o Danio rerio embrioteste expostos a fracao soluvel do petróleo de

Urucu. Nosso principal objetivo era definir qual seria o biomarcador mais indicado

para avaliar o efeito de concentrações subletais do petróleo de Urucu sobre os

peixes.

4.1 Teratogênia

Enquanto existe uma extensa literatura descrevendo os efeitos de

contaminantes em animais adultos ou juvenis, há poucos estudos sobre os efeitos

de contaminantes como PAHs, metais pesados, dioxinas, etc. em embriões. Estudos

acerca do efeito de misturas mais complexas de contaminantes, como o petróleo,

sobre embriões e estágio larval de peixes inexistem. Esse primeiro estágio de vida

pode estar particularmente susceptível à exposição a PAHs, especialmente para D.

rerio, cujo habitat se sobrepõe aos ambientes com intensas pressões antrópicas.

44

Tem sido registrado que espécies de pequeno porte, ou indivíduos em seu

estado larval tendem a acumular mais metais, bem como outros contaminantes

(Heath, 1995; Incardona et al., 2004; Van Meter et al., 2006). Isto está

provavelmente associado ao fato de que espécies de pequeno porte possuem o

metabolismo mais acelerado e a área de contato com o contaminante (superfície

cutânea) é maior, estando assim mais expostos aos contaminantes (Heath, 1995).

Além disso, indivíduos em estado larval realizam suas trocas gasosas pela pele e a

superfície do seu corpo é susceptível à entrada de metais e outros contaminantes

(Roesijadi e Robinson, 1994; Heath, 1995). Embriões de zebrafish expostos à fração

solúvel do petróleo de Urucu apresentaram dois tipos de distúrbios: disfunções

cardíacas, com redução dos batimentos cardíacos e edema pericardial, e redução

de pigmentação.

Uma série de estudos laboratoriais e de campo foi realizada após o histórico

derramamento de petróleo Exxon Valdez ocorrido em 1989, que contaminou áreas

próximas aos locais de desova do arenque pacífico (Clupea pallasi) e do salmão

rosa (Oncohynchus gorbuscha). Os estudos focalizando o efeito de PAHs no

desenvolvimento de C. pallasi e O. gorbuscha (Brown et al., 1996; Carls et al., 1999;

Heintz et al., 1999; Hose et al., 1996; Kocan et al., 1996; Marty et al., 1997; McGurk

e Brown, 1996; Middaugh et al., 1998; Norcross et al., 1996; Spies et al., 1996),

juntamente com estudos sobre estes contaminantes em outras espécies de peixes

(Coulliard, 2002; Middaugh et al., 1996, 2002; Polino e Holdway, 2002), mostraram o

que parece ser um conjunto comum de defeitos no desenvolvimento de embriões de

teleósteos expostos as misturas de PAHs derivados do petróleo. Os efeitos mais

comuns foram: má formações resultante da exposição a PAHs, incluindo edemas

pericardiais e no saco vitelínico, redução da mandíbula e defeitos no esqueleto,

45

descritos como lordose e escoliose (curvatura dorsal). Foram também observadas

redução na taxa de batimentos cardíacos e arritmia cardíaca. Há relatos de que o

aumento da temperatura do óleo cru muda a composição de PAHs,

predominantemente de dois anéis (naftalenos) para três anéis (fenantreno),

causando um aumento da toxicidade e resultando num aumento da freqüência de

deformidades (Carls et al., 1999; Heintz et al., 1999). Efeitos subletais significativos

também foram observados em outros níveis da organização biológica. No nível

comportamental, por exemplo, embriões de salmão rosa expostos ao aumento de

temperatura do óleo cru, foram quando juvenis liberados e retornaram, quando

adultos, em número significantemente reduzido (Heintz et al., 2000). Os mecanismos

de ação de PAHs ainda continuam desconhecidos.

Os peixes, especialmente os primeiros estágios de vida, estão entre os

vertebrados mais sensíveis à toxicidade de hidrocarbonetos planares halogenados

(PHHs), particularmente ao 2,3,7,8 tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD) (Walker e

Peterson, 1991; Teraoka et al., 2003). Sensibilidade diferencial de peixes nos

primeiros estágios de vida (ELS) a toxicidade de dioxinas tem sido estudado em

salmonídeos e outras espécies (revisado por Elonen et al., 1998; Hahn, 2001). A

sensibilidade de peixes em seu estado embrio-larval a compostos como dioxinas faz

desses organismos excelentes modelos de estudo do efeito de PHH para espécies

aquáticas e seu risco para a saúde humana (Stegeman e Hahn, 1994).

Toxicidade devido a PAHs e contaminantes similares variam entre espécies e

depende grandemente da forma do contaminante, da via de exposição e do estágio

de vida do organismo (Hall, 1980). Exposição crônica ou aguda de PAHs ou petróleo

causa problemas de saúde e reprodutivos em várias espécies de animais

(Steyermark, 1999; Klerks et al., 1997; Jenssen, 1996; Alam e Brim, 2000).

46

Exposição a concentrações sub-agudas de hidrocarbonetos derivados do petróleo

originados de um derrame, pode não ser suficiente para causar efeitos biológicos

imediatos nos animais domésticos e silvestres, mas poderiam produzir efeitos sutis,

causando danos de longo-prazo para os animais aquáticos.

Enzimas microssomais que metabolizam PAHs para outros compostos, os

quais podem ser até mais tóxicos que o composto original, estão presentes em

embriões de vertebrados e outros eucariontes (Hoffman e Gay, 1981; Varanasi,

1989). Hoffman e Gay (1981) registraram que pequenas quantidades (0,02-0,5%) de

benzo(a)pireno (BaP), criseno e 7,12 dimetil-benzo(a)antraceno (DMBA) em

misturas de hidrocarbonetos de petróleo, causaram significante diminuição na

viabilidade de ovos incubados, bem como um aumento na mortalidade e numerosas

deformidades severas em embriões de patos selvagens (Anas platyrhynchos). Estes

PAHs são constituintes de óleo cru e refinado.

Deformidades severas decorrentes da exposição ao petróleo também foram

descritos por autores em trabalhos com outros vertebrados. Bishop e colaboradores

(1996; 1998) identificaram deformidades em embriões e juvenis de tartarugas

coletados em Ontário, Canadá e sugeriram que as deformidades estavam

relacionadas à exposição dessa espécie a toxinas no ambiente, como pesticidas

organoclorados e similares. Além disso, embora um embrião juvenil possa parecer

normal anatomicamente, danos causados por toxinas podem afetar o mecanismo

neurológico e fisiológico dos mesmos (Steyermark e Spotia, 2000). Van Meter e

colaboradores (2006) detectaram uma ampla variedade de deformidades nos

embriões e juvenis da tartaruga Chelidra serpentina expostos ao petróleo e PAHs.

Essas deformidades foram classificadas de acordo com o grau de severidade: baixa

(pequena deformidade na cauda), moderada (ausência ou desenvolvimento

47

assincrônico dos membros) e letal (deformidades no trato digestivo, falta de dois ou

mais membros, crânio fundido). Exposição a petróleo, BaP e DMBA tem um efeito

detrimental em sobrevivência e desenvolvimento de embriões de tartarugas (Van

Meter et al., 2006).

Polino e Holdway (2002) encontraram deformidades em embriões de peixe

arco-íris (Melanotaenia fluviatilis) após exposição a óleo cru e seus PAHs. As

deformidades mais severas foram edema pericardial, anomalias na mandíbula e

desvio na coluna em vertebrados. Acúmulo dos componentes do petróleo no saco

vitelínico de larvas foi sugerido como um mecanismo de teratogênese contínua no

desenvolvimento larval. Wassenberg e colaboradores (2002) verificaram

anormalidades similares (edema pericardial) no desenvolvimento embrionário em

Fundulus heteroclitus expostos a várias concentrações de BaP. Dessa forma

constata-se que as deformidades causadas pela exposição ao petróleo e seus

componentes são similares em vários grupos de répteis, aves e peixes.

Também são descritos efeitos severos em várias espécies de peixes

coletados no Rio Elisabeth na Virgínia, que apresentaram câncer, cataratas e

ulcerações na pele como resultados da exposição a concentrações extremamente

altas de PAHs em várias áreas ao longo deste rio (Hugget et al., 1992) .

Em zebrafish centenas de genes que estão envolvidos na formação de

virtualmente todos os órgãos e têm sido identificados em larga-escala por “varredura

mutagênica” (Haffter et al., 1996). Conseqüentemente, os fenótipos resultantes da

perda da função do gene por meio de mutação, pode ser comparado a má

formações que resultam da exposição dos embriões a contaminantes. Esse enfoque

“genético químico” foi usado recentemente para identificar mecanismos específicos

de toxicidade no desenvolvimento (Peterson et al., 2000; 2001).

48

A redução na pigmentação encontrada neste trabalho foi um evento único,

que ainda não foi observado em outros trabalhos com embriões até o momento. O

mecanismo de ação dos elementos tóxicos presentes no petróleo que causa

ausência ou redução dos elementos pigmentantes não está claro. Supõe-se que

alguma substância, ou a combinação de algumas delas, agem diretamente nos

genes responsáveis pela pigmentação, suprimindo esses genes, não ocorrendo

assim a pigmentação no corpo do embrião. Porém, esta parte do estudo necessita

de muito mais informações para que se possa entender os mecanismos envolvidos

na despigmentação ou supressão dos genes envolvidos nesse processo.

4.2 Biomarcadores potenciais para concentrações sub letais de petróleo na

água

A maioria dos estudos sobre toxicidade do petróleo e tratamentos com

dispersantes está relacionada a efeitos em invertebrados, presumidamente por que

eles são relativamente mais fixos quando comparados a peixes, e de mais fácil

manuseio e manutenção em laboratório. Entretanto, esse fato tem sido mudado nos

últimos anos. Vários estudos têm sido desenvolvidos para definir uma espécie como

modelo, que poderia ser aplicada com grande facilidade a testes de toxicologia,

dando respostas rápidas e facilitando a repetição quando preciso.

O zebrafish é uma espécie modelo amplamente usada em todo o mundo em

testes de toxicidade, diferentemente dos nossos peixes amazônicos, esta espécie

está totalmente caracterizada do ponto de vista genético. Os testes em embriões de

D. rerio (embrioteste) têm sido empregados nos mais diversos estudos, que vão

desde monitoramente de ambientes aquáticos a testes da indústria de cosméticos

na Europa (a L’Oreal, Paris adotou recentemente o “D. rerio embrioteste”, devido a

49

proibição de experimentos com animais). Todos os biomarcadores utilizados neste

estudo estão registrados no GenBank, o que facilitou bastante as análises. Foram

escolhidos os genes levando-se em consideração as respostas desses genes

quando os organismos eram expostos a diferentes estressores. O estressor utilizado

neste trabalho foi a fração solúvel do petróleo de Urucu em diferentes

concentrações, pelo fato do petróleo ser uma mistura complexa de vários compostos

cuja composição está relacionada com a origem geológica do óleo. O fato de o

experimento ter sido conduzido com uma mistura complexa pode ter gerado

respostas múltiplas de expressões dos genes. Contudo, o gene que realmente

mostrou-se mais promissor foi o cyp1a, o que já parcialmente esperava-se.

O petróleo é uma mistura complexa, formada por hidrocarbonetos

poliaromáticos (PAHs) e alifáticos e quantidades significativas de metais pesados

(Kingston, 2002). No contexto de toxicologia aquática, tem-se que os PAHs agem

como contaminantes do tipo “baseline” ou não específicos através do modo de ação

de narcose apolar, ou pela ativação da via do receptor Aril (AhR) que leva à indução

do gene da cyp1a.

A toxicidade de PHH também é pensada ser dependente do AhR em todos

vertebrados. Estudos usando AhR de ratos tem confirmado que o AhR é um pré-

requisito para toxicidade de PHH. AhR tem um papel crítico no desenvolvimento do

fígado, ciclo celular e remodelamento vascular, que é independente de ligas

administradas via exógena (Lahvis et al., 2000; Hestermann et al., 2002). Estudo

sobre a função do AhR usando ratos deficientes tem revelado que o gene ahr pode

ser responsável por muitos, senão por todos, os efeitos tóxicos causados por TCDD,

por meio de biotransformação, além da indução do gene cyp1a e outros genes

induzidos pelas dioxinas.

50

O gene ahr, por estar relacionado com a expressão de genes como cyp1a,

poderia ser um promissor biomarcador na contaminação aquática com petróleo.

Embora este gene tenha sido expresso em todas as concentrações e não expresso

no controle (Figura 5), não se notou uma progressão e nem diferença na expressão

entre as diferentes concentrações. Ao se reduzir o número de ciclos do PCR, notou-

se que realmente a expressão era igual em todas as concentrações e, portanto,

tornou-se inviável utilizá-lo como biomarcador neste caso.

A expressão do hmox1 parece ser uma resposta geral para o estresse

oxidativo na pele, porque é induzido pela radiação UVA e pelo tratamento com

peróxido de hidrogênio (Appenzeller et al., 2006). A regulação do hmox1 parece

estar relacionada com a resposta inicial do sistema imune e controle da cicatrização

de feridas (Jaworski e Klapperich, 2006). Esta enzima também está envolvida com o

catabolismo do grupo heme que produz o pigmento de biliverdina (BV) e seu

metabólito bilirrubina (BR). Além disso, a enzima também possui propriedades

citoprotetoras e tóxicas. Em altas concentrações, BR prejudica a função mitocondrial

e inibe várias enzimas. Em contraste, nas concentrações fisiológicas, BR e seus

glucuronídeos são anti-oxidantes potentes (Abu-Bakar et al., 2005; Jaworski e

Klapperich, 2006). Foi observada a inducao dos genes cyp2a5 e hmox1 em fígados

de camundongos expostos ao cádmio, onde a indução máxima ocorreu 3 horas após

o tratamento (um aumento de 31 vezes em comparação com o controle) e diminuiu

drasticamente 6 horas depois (Abu-Bakar et al., 2005). O gene hmox está sendo

amplamente utilizado, principalmente em humanos, pois está relacionado à resposta

ao estresse oxidativo, é uma proteína protetora do sistema nervoso e está

diretamente relacionada a reparos ocorridos na pele (Turcanu et al., 1998; Abu-

Bakar et al., 2005; Jaworski e Klapperich, 2006). Este gene foi selecionado para

51

estas análises por supor-se que haveria resposta imediata com a exposição à fração

solúvel de petróleo em embriões, uma vez que esses estariam com a superfície do

corpo diretamente exposta ao contaminante e, além disso, serem as trocas gasosas

realizadas via cutânea. Este gene foi expresso no controle, porém em baixa

concentração, mostrando um comportamento adequado, e por isso foi escolhido

como o biomarcador de exposição. Pretende-se dar continuidade em trabalhos

futuros, em uma análise mais acurada. Em ambientes como a Amazônia, seria

interessante avaliar o efeito da exposição ao petróleo juntamente com os efeitos da

radiação UVA, a expressão do gene hmox.

Antigamente acreditava-se que as proteínas de choque térmico (HSPs)

tinham apenas a função de manter as propriedades de dobramento de proteínas

celulares, isto é, agirem como chaperonas. No entanto, em vários estudos foi

constatado que a concentração de HSPs muda quando a célula é atingida por

qualquer estressor químico ou físico (Morimoto et al., 1990; Hightower, 1991; Nover,

1991; Hendrick e Hartl, 1993; Welch, 1993; Fink e Goto, 1998, Iwama et al., 1998,

Basu et al., 2002). Em peixes a indução de HSPs tem sido registrada em cultura

primária de células, assim como em vários tecidos desses animais e de outros

(Iwama et al., 1998). O mecanismo detalhado de indução das HSPs não é

conhecido. Estudos de HSP70 são os mais extensos e tem demonstrado que a

regulação da expressão do gene da hsp70 ocorre principalmente no nível

transcripcional (Fink e Goto, 1998).

Sanders e Martin (1993) registraram que os níveis de HSP70 em amostras de

peixes de áreas poluídas tinham altos níveis como na área controle. Resultados

similares foram mostrados por Ryan e Hightower (1994; 1996), indicando a indução

de HSP70 em sistema de culturas de células de fígado de linguado (Pleuronectes

52

americanus) após estresse causado pela exposição a metais pesados. Há registros

de que os níveis de HSP70 aumentaram em brânquias de juvenis truta arco-íris

Oncorhynchus mykiss, após exposição a cádmio, cobre, chumbo e zinco na água e

na alimentação (Williams et al., 1996). Avaliação da concentração de metil mercúrio

no músculo e brânquias de Esox lucius, Lota lota, Coregonus nelsoni, Thymallus

arcticus e Stenodus lencichthys, mostraram também um aumento da concentração

de HSP70 com o aumento da concentracao de metil mercúrio nestas espécies (Duffy

et al., 1999).

Uma vez que o gene induzível das HSP não contém introns, o RNA

mensageiro é rapidamente traduzido para a proteína nascente em minutos após a

exposição ao estressor. Por tudo isso, HSP70 poderia ser um bom biomarcador

molecular para exposição a concentrações subletais de petróleo na água, induzindo

assim rapidamente o mRNA HSP na presença deste contaminante, entretanto exibiu

comportamento irregular nas diversas concentrações analisadas. Essa variação não

o favorece para seleção como um bom biomarcador. Por isso este gene também foi

descartado.

Recentemente identificado em zebrafish, o nrf2 regula a expressão dos genes

citoprotetores em peixes juntamente com os genes da família MAF, incluindo a

pequena proteína MAFT. A sobre expressão dos genes maft e nrf2 sinergicamente

ativou o MARE (elemento de reconhecimento da família MAF) servindo de

intermediário na expressao de genes em embriões do zebrafish. Há indicações que

maft seja um novo membro das pequenas proteínas MAF e estão envolvidas na

regulação do gene nrf2-dependente no sistema de defesa celular (Takagi et al.,

2004). Esses genes a princípio mostravam-se promissores nesse estudo, por duas

razoes: co-relacionados entre si e envolvidos diretamente com a proteção celular,

53

porém ambos não demonstraram ser bons biomarcadores para exposição à fração

solúvel do petróleo de Urucu e não exibiram correlações entre si nas expressões de

genes, e ambos foram descartados.

O petróleo contém quantidades significativas de metais pesados como Pb,

Cd, Cr, Se, Cu entre outros. Estudos do impacto causado por resíduos de petróleo

em lagostinha, Procamburus clarkii, na Baia Trepagnier, analisando a

bioacumulação dos metais pesados As, Cr, Pb e hidrocarbonetos policíclicos como

contaminantes em sedimentos, reportaram que houve um grande acúmulo de

chumbo no hepatopâncreas e brânquias e presenca de cromo nas brânquias e

sangue. Os estudos concluíram então que os metais presentes no petróleo tornam-

se disponíveis para as espécies no ambiente aquático, sendo assim, não só os

PAHs são os grandes “vilões” num derrame de petróleo, mas também os metais,

como é o caso do As, Cd e Pb que, em baixas concentrações, podem ser

carcinogênicos (Anderson et al., 1997).

Diversos autores relatam que grande parte da indução de metalotioneína

ocorre no fígado e a absorção de metais pela superfície branquial pode ter, também,

uma importante influência nos níveis totais de metal (Heath, 1995; Canli e Furness,

1993a,b; Roesijadi e Robinson, 1994). A indução de metalotioneína por níveis

dietários elevados de metais foi inicialmente relacionada com o aumento da

absorção e o acúmulo desses metais em órgãos internos como fígado e rim.

Metalotioneína ligada com metais tende a acumular no intestino. Mais que isso, há

evidências de que a indução de metalotioneína aumentaria a liberação de Cd vindo

do intestino e sua acumulação em órgãos internos como o fígado (Roesijadi e

Robinson, 1994). O mecanismo de ação da MT no estágio larval é desconhecido.

Assim, decidiu-se avaliar a expressão do gene mt, por sua relação com o

54

transporte de metais, tanto essencial como o Cu, como os não essenciais. Este

marcador mostrou-se promissor, mas apenas quando exposto a concentrações de

petróleo “relativamente” altas como 1,56% e 6,25% e, por este motivo, as análises

foram descontinuadas com este gene, uma vez que o objetivo do trabalho era

buscar um biomarcador para concentrações subletais de petróleo na água.

Vários estudos em peixes estão focados na função mista do sistema oxidase

P450, por sua função na detoxificação de compostos xenobióticos (Goksøyr e Forlin,

1992; Achasi et al., 1994; Devaux et al., 1998; Cao et al., 2000; Leaver e George,

2000; Sarasquete e Segner, 2000; Billiard et al., 2002; Ortiz-Delgado et al., 2002,

Monk et al., 2003; Racky et al., 2004). O gene citocromo P450 1A (cyp1a) é um

biomarcador em peixes muito usado na avaliação da contaminação do ambiente

aquático (William et al., 1998; Moore et al., 2003; Fent, 2003; Oost et al., 2003), para

identificar os efeitos de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, inclusive suspeitas

de causar desordem química-endócrina (EDCs) (Schlezinger e Stegeman, 2001).

Vijayan e colaboradores (1997) relataram que β-naftoflavona (BNF) foi um potente

indutor da CYP1A em fígado da truta arco-íris.

Estudos de impactos causados pelo derrame de óleo do Exxon Valdez em

embriões e larvas de salmão e arenque revelaram exposição e toxicidade crônica in

situ. A coincidência de desova e a deposição de óleo em rochas em locais de

desova resultou na indução da CYP1A, assim como doenças causadas por fungos e

falhas no recrutamento. Esses efeitos foram associados com a exposição a frações

de hidrocarbonetos poliaromáticos (PAHs) (Carls et al., 1999). Foi sugerido que a

exposição a PAHs pode ser facilmente estimada por uma padronização de

bioensaios laboratoriais que poderiam avaliar a indução da CYP1A em juvenis de

truta arco íris, uma vez que esse gene já se mostrava altamente promissor na

55

avaliação de exposição a contaminantes provenientes do petróleo (Hodson et al.,

1996)

A análise de exemplares de Anoplarchus purpurescens expostos a efluentes

de petróleo em três áreas de coleta localizadas em British Columbia, mostrou que

ambos os níveis de P-glicoproteína e expressão do gene cyp1a foram elevados

nessa espécie, quando comparado com a área controle (Bard et al., 2002). Como

exposto, são vários trabalhos que relatam o uso do gene cyp1a como biomarcador

nas contaminações aquáticas com petróleo. Neste estudo, realmente este foi o

gene, dentre todos os outros, o mais promissor para uso na avaliação dos efeitos de

concentrações subagudas do petróleo da região de Urucu na água (Figuras 7 e 8).

O gene cyp1a mostrou uma relação direta entre aumento da concentração da

exposição ao petróleo e aumento da expressão. Baseado nos resultados obtidos

neste estudo recomenda-se o uso da cyp1a como biomarcador molecular promissor

para detectar concentrações subletais do petróleo de Urucu na água e teste em

espécies amazônicas da região do Urucu.

56

5. Conclusões

• A fração solúvel do petróleo não causa mortalidade significativa nos embriões

de Danio rerio expostos por 96 horas a concentrações entre 0,0061% e 25%;

• Embriões de D. rerio expostos a concentrações superiores a 0,39% da fração

solúvel do petróleo apresentam redução da pigmentação e edemas

pericardiais;

• Embriões de D. rerio expostos a fração solúvel do petróleo nas concentrações

acima de 6,25% apresentam ausência total de pigmentação;

• Os genes ahr, hsp70, maft, e nrf2 não são biomarcadores para detectar

concentrações sub-letais de petróleo na água, apesar de haver a expressão

quando há exposição de embriões de zebrafish, pois não apresentam uma

relação positiva crescente entre o aumento da expressão do gene com o

aumento da concentração de petróleo;

• O gene hmox apresenta potencial como biomarcador para concentrações

subletais da fração solúvel de petróleo na água;

• O gene mt apresentou uma alta expressão em zebrafish quando expostos a

fração solúvel do petróleo em concentrações superiores a 1,56%;

• O cyp1a é o gene mais apropriado para detectar concentrações sub-letais de

petróleo na água.

57

Capítulo 2

“Marcadores moleculares para contaminação por petróleo no

peixe amazônico Astronotus ocellatus (Oscar)”

58

1. Introdução

Apesar dos múltiplos usos e sua importância econômica, o petróleo apresenta

um grande potencial como contaminante ambiental, particularmente nos ambientes

aquáticos. Na maioria das vezes, é este o ambiente de destino final da substância

contaminante, mesmo quando os resíduos são de solos, pois chuva e lixiviação

levam tais resíduos aos corpos aquáticos. Tais ambientes estão mais suscetíveis

aos perigos de contaminação pela presença de plataformas de extração, oleodutos,

gasodutos e pelo tráfego de navios-tanque (Page et al., 1989; Owens et al., 1999;

Baker, 1991; Kingston, 2002; Georgiades et al., 2006).

Os acidentes que envolvem um grande volume de petróleo derramado são

noticiados com muita ênfase, como é o caso notório do derramamento do petroleiro

Exxon Valdez em 1989, que resultou em 42 milhões de litros de óleo derramados na

Baía de Prince William Sound no Alasca. Até os dias de hoje existem estudos

naquela área para mensurar os efeitos causados pelo derrame (Erikson, 1995; Al-

Yakoob et al., 1996; Brown et al., 1996; Hose et al., 1996; Kocan et al., 1996;

McGurk e Brown, 1996; Middaugh et al., 1996, 2002; Norcross et al., 1996; Sharp et

al., 1996; Spies et al., 1996; Marty et al., 1997; Middaugh et al., 1998; Carls et al.,

1999; Heintz et al., 1999; Peterson, 2001; Coulliard, 2002; Polino e Holdway, 2002;

Feeger et al., 2003).

As contaminações por petróleo também podem ser contínuas, decorrente de

procedimentos de rotina, tais como: limpeza de tanques, pequenos vazamentos nos

locais de extração, resíduos de refinarias, etc. (Freedman, 1989; Kupchella e

Hyland, 1993; Kingston, 2002).

Embora existam medidas de segurança observadas tanto no transporte do

petróleo da Reserva de Urucu para a refinaria REMAN em Manaus, quanto na

59

própria Reserva de Urucu, o risco de potenciais acidentes ambientais envolvendo a

contaminação de águas amazônicas é sempre uma preocupação, devido à presença

dos dutos de distribuição e da movimentação das balsas com petróleo ao longo de

um trecho grande do rio Solimões.

Desde 1995, estudos sobre o impacto que um derramamento do petróleo de

Urucu e seus componentes causaria sobre as espécies de peixes amazônicos vêm

sendo realizados, particularmente no que se refere a parâmetros fisiológicos (e.g.,

Costa et al., 1996; Mendes & Val, 1997; Val, 1997; Duncan, 1998; Brauner et al.,

1999; Val & Almeida-Val, 1999; Almeida-Val et al., 2002; Matsuo et al., 2002; Paula-

Silva et al., 2002; Anjos, 2003; Oliveira, 2003; Matsuo, 2004). No entanto, poucos

estudos avaliaram os efeitos moleculares causados nos peixes expostos ao petróleo

ou seus derivados (Pinheiro 2007; Araújo, 2007). A elucidação das alterações

causadas pelos xenobióticos no metabolismo celular é importante para o

delineamento de estratégias para mitigação de danos ambientais. A avaliação dos

níveis de mRNA de genes que codificam proteínas e enzimas ligadas ao

metabolismo de xenobióticos em situações de risco ambiental, permitiria a

identificação de biomarcadores.

As características peculiares dos ambientes aquáticos da Amazônia, como a

elevada concentração de substâncias húmicas (SH), tanto nos sistemas de água

branca quanto de água preta, podem afetar a biodisponibilidade das frações tóxicas

do petróleo aos organismos (Haitzer et al., 1998). A acidez das águas é outra

característica relevante das águas amazônicas, principalmente na região do rio

Negro, porém Paolis e Kukkonen (1997) sugeriram que este fator não deva

influenciar na solubilidade e disponibilidade dos contaminantes orgânicos.

60

Outro aspecto particular dos ambientes aquáticos amazônicos é a baixa

concentração de oxigênio. Existem diversos estudos sobre a toxicidade do petróleo

e o seu impacto na respiração dos organismos aquáticos, uma vez que a película do

óleo formada entre na interface ar-água pode representar uma barreira física,

afetando a difusão natural do oxigênio (Duncan, 1998). Val e Almeida-Val (1999)

demonstraram que a exposição de Hoplosternum littorale e Colossoma

macropomum ao óleo cru, oriundo da região de Urucu, acarretou uma redução

drástica (aproximadamente 87%) na concentração de oxigênio dissolvido no sangue

dos animais expostos em relação aos não expostos ao óleo cru. A fusão das lamelas

branquiais e a proliferação de células de cloreto no epitélio respiratório de

Glyptoperichthys joselimaianus expostos ao petróleo, reforçam a hipótese de que a

fração solúvel do petróleo induz não somente alterações respiratórias, como também

distúrbios do mecanismo de regulação iônica (Farias e Costa, 1996).

A busca de marcadores moleculares em peixes da Amazônia ainda é um fato

recente; são poucos os estudos sobre a aplicabilidade destes indicadores na

avaliação dos impactos ambientais causados por contaminantes lipofílicos como as

frações do petróleo em peixes.

O biomarcador que se mostrou promissor para a avaliação de contaminação

aquática com petróleo em Danio rerio, descrito no Capítulo 1, foi o gene cyp1a, da

superfamília citocromo P450, família 1, subfamília A. Este biomarcador vem sendo

amplamente utilizado no monitoramento da contaminação por compostos

específicos como os PAHs (hidrocarbonetos poliaromáticos), PCBs (policlorinados

planares), TCDD (2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxinas), TCDF (2,3,7,8-tetracloro

dibenzofuranos), BNF (benzonaftoflavona), pesticidas, entre outros. A indução da

expressão de CYP1A por estes compostos indica que pode ser relacionada à

61

exposição a estes contaminantes como um biomarcador permitindo uma análise

quantitativa e qualitativa da toxicidade destes compostos (Goksøyr e Förlin, 1992;

Goksøyr e Husøy, 1992; McCarthy e Shugart, 1990).

As enzimas do sistema P450 atuam no metabolismo destes compostos por

meio de reações de mono oxigenação na fase I. Nelas, o composto original é

modificado, supostamente para resultar em uma forma menos tóxica e mais

hidrossolúvel, facilitando sua excreção direta ou associada ao metabolismo da fase

II, que envolve processos de conjugação com compostos como a glutationa s-

transferase (GST) para aumentar a solubilidade destes xenobióticos e

conseqüentemente eliminá-los (Stegeman e Livingstone, 1998).

Apesar da grande importância do conhecimento em nível molecular dos

danos causados por compostos derivados do petróleo em peixes, especialmente

sobre espécies de águas doces tropicais, os estudos nesta área são ainda

incipientes. A avaliação do uso de biomarcadores levando em consideração os

fatores ambientais também é algo relativamente novo e, na Amazônia devido a suas

peculiaridades ambientais, esses fatores devem ser levados em consideração, uma

vez que podem afetar diretamente a biodisponibilidade do contaminante, tornando-o

tóxico ou não.

A maioria dos estudos avalia as conseqüências de um grande derrame de

petróleo. No entanto, os estudos que buscam prever ou detectar concentrações

subletais de petróleo na água antes de se tornarem uma grande catástrofe, são

ainda recentes.

1.1 Objetivo geral

Este estudo tem como objetivo geral identificar marcadores moleculares

62

sensíveis à presença de concentrações subagudas de componentes das frações do

petróleo para o monitoramento ambiental de áreas suscetíveis a contaminação por

estes compostos na Amazônia. Vários genes considerados marcadores moleculares

foram testados primeiramente com o Danio rerio exposto ao petróleo de Urucu

(Capítulo 1). O marcador que se mostrou mais viável no estudo com o D. rerio foi o

cyp1a. Esse marcador foi testado em uma espécie amazônica abundante na região

do Urucu, expondo subletalmente a espécie ao petróleo, a fim de avaliar a

expressão deste gene para futuramente mensurar se nesta região está havendo ou

não contaminação.

1.2 Objetivos específicos:

1. Avaliar a sensibilidade da espécie A. ocellatus ao óleo cru e fração solúvel

do petróleo em condições regulares (temperatura ambiente, pH neutro e normoxia),

em ambiente acidificado (pH 4, normoxia e temperatura ambiente) e em ambiente

hipóxico (pH neutro, temperatura ambiente, hipoxia);

2. Clonar os genes (marcadores moleculares) selecionados a partir do

experimento com Danio rerio (capítulo 1, objetivo 3) em acará – açu (A. ocellatus) e

analisar a expressão destes genes em animais expostos às concentrações

subagudas de petróleo, num modelo dose-resposta, nas condições experimentais

descritas acima.

1. 3 A espécie

Astronotus ocellatus

Astronotus ocellatus (Cuvier, 1829) conhecido vulgarmente como acará-açu,

é uma espécie pertencente à família Cichlidae, subfamília Astronotinae e tribo

63

Astronotini, abundante e nativa da Amazônia. Essa espécie se distribui nos sistemas

lênticos das bacias dos rios Orinoco, Amazonas e Paraguai (Ferreira et al., 1998).

Considerada uma espécie de médio porte, alcança cerca de 30 cm de comprimento.

O corpo desta espécie apresenta manchas escuras verticais não alinhadas, com a

presença de um ocelo no ramo superior da base da nadadeira caudal.

Figura 1. Exemplar adulto de A. ocellatus.

Esta espécie desperta interesse econômico tanto para fins ornamentais

quanto para alimentação humana. A espécie vive em cardumes, forma casais na

época de reprodução e atinge a maturidade sexual com cerca de 10 a 12 meses de

idade. Sua desova ocorre mais de uma vez por ano, com número de ovos variando

entre 1500 a 2000 por desova (Ferreira et al., 1998). Estes animais vivem em lagos

e zona marginal dos rios, ou mesmo entre a vegetação flutuante, com acentuada

preferência por ambientes lênticos. Apresentam geralmente hábitos diurnos e não

realizam migrações (Santos et al., 1984).

A espécie Astronotus ocellatus é caracterizada como tolerante a hipoxia

(Almeida-Val e Hockachka, 1995). Experimentos mostraram que os indivíduos

adultos podem tolerar até 6 h de anoxia a 28°C em f unção da redução da sua taxa

metabólica (Muusze et al., 1998). O Astronotus é um animal agressivo e territorial

com alta capacidade de natação, direcionada para defesa do ninho e filhotes.

64

2. Material e Métodos

2.1 Exposição de exemplares de A. ocellatus a concentrações subagudas de

petróleo

2.1.1 Experimentos utilizando o óleo cru da Reserva de Urucu

A CL50-96 horas é a concentração na qual uma substância tóxica provoca a

parada total dos movimentos respiratórios, locomotores, perda de equilíbrio e

ausência de resposta a estímulos de 50% da população dos animais expostos por

96 horas a um agente agressor (Sprague, 1990). A CL50-96 horas do petróleo de

Urucu para a espécie A. ocellatus é de 36,3ml /L de água, em temperatura ambiente

(28-32°C), pH (5-7) e oxigênio (5 – 6,5mg O 2/L ). Esse valor da CL50-96 horas foi

calculado a partir de experimentos realizados no LEEM - INPA em 2003 (dados não

publicados).

Em Dezembro de 2004, no LEEM, foram realizados experimentos de

exposição de A. ocellatus nas concentrações subletais por 96 horas. Os valores das

concentrações do petróleo de Urucu utilizadas neste trabalho foram baseados no

valor da CL50-96 horas do A. ocellatus. Indivíduos da mesma espécie foram

expostos a 50%, 25%, 12,5% e 6,25% dos valores da CL50 96 horas para o A.

ocellatus.

Os animais foram adquiridos em estação de piscicultura. No LEEM foram

aclimatizados em um tanque com capacidade de 1000L por duas semanas: fez-se a

limpeza desse tanque a cada dois dias e os peixes foram alimentados diariamente

com ração comercial. A alimentação dos animais foi suspensa 48 horas antes do

início dos experimentos e os peixes foram transferidos individualmente para

recipientes plásticos de 15 L, permanecendo nestes recipientes por 24 horas sem

alimentação. Os animais utilizados nos experimentos mediam 10,5 + 2,85 cm.

65

Seis animais foram expostos individualmente em recipientes plásticos de 15

L; após as primeiras 24 horas foi adicionado óleo cru suficiente para as

concentrações desejadas (Tabela 1). O petróleo utilizado nestes experimentos foi

fornecido pela Petrobrás, proveniente de Urucu, Amazonas. Os peixes

permaneceram nos recipientes por um período de 96 horas, sendo avaliada a

mortalidade e monitorados pH, oxigênio e temperatura.

Devido à diversidade de ambientes existentes na Amazônia, os experimentos

foram realizados em três condições com a finalidade de verificar possíveis

diferenças na expressão gênica frente aos diferentes ambientes. As condições

utilizadas foram:

1. Ambiente regular: temperatura ambiente (28° - 30° C), pH neutro (5 a 7) e

normoxia (5 – 6,5mg O2/L).

2. Ambiente hipóxico: temperatura ambiente (28° - 30° C), pH neutro (5 a 7),

hipoxia (1,5 mg O2/L).

3. Ambiente acidificado: temperatura ambiente (28° - 30° C), pH ácido (3,5),

normoxia (5 – 6,5 mg O2/L).

Nos experimentos de hipoxia a entrada de O2 foi reduzida, até estabilizar-se a

1,5mg de O2/L. Para baixar o pH nos experimentos acidificados, foram utilizados 4ml

de H2SO4 (96-98%) diluído em 5 L de água, e foram utilizadas alíquotas pequenas

para o ajuste; essa solução estabilizava o pH por 12 horas.

Após 96 horas de exposição os animais foram anestesiados com ácido etil

ester 3-aminobenzóico (SIGMA) e foram retiradas amostras de fígado. As amostras

de fígado foram masceradas em Nitrogênio líquido e colocadas em tubos Eppendorf

(Eppis) de 2 ml e estocadas em freezer -80°C até o transporte em gelo seco para o

Departamento de Toxicologia Celular no Centro de Pesquisas Ambientais – UFZ,

66

Leipzig - Alemanha. Após o transporte, as amostras foram acondicionadas em

freezer -80°C até o momento das análises.


ocellatus ao petróleo de Urucu.

Experimento 1 – óleo cru

Concentração

de Petróleo

% real de

petróleo na água

óleo (ml) / 12 l

de água

Exp. 1 –

condições

regulares (n)

Exp. 2 –

hipoxia

(n)

Exp. 3 -

ácido (n)

1 Controle 0 0 4 4 4

2 6,25% da CL50 0,224 27,24 6 6 6

3 12,5% da CL50 0,449 54,36 6 6 6

4 25% da CL50 0,889 108,9 6 6 6

5 50% da CL50 1,780 218,04 6 6 6

2.1.2 Experimentos utilizando a fração solúvel do p etróleo de Urucu

Em fevereiro de 2007 foram efetuados novos experimentos com o A. ocellatus

expostos à fração solúvel do petróleo proveniente de Urucu, e as concentrações

utilizadas foram baseadas nos experimentos com o Danio rerio (Capítulo 1). As

concentrações de fração solúvel utilizadas nestes experimentos (Tabela 2) foram

menores que as concentrações utilizadas nos experimentos com o óleo cru (Tabela

1).

Para obtenção da fração solúvel do petróleo de Urucu, em um recipiente de 5

L de vidro escuro com tampa (para evitar a evaporação e foto-oxidação) utilizou-se a

proporção óleo: água destilada de 1:2. Essa solução foi mantida sob agitação por 24

67

horas (agitador TECNAL) sem aquecimento com magneto. Após esse período a

agitação foi interrompida. Após uma hora, para completar a separação das frações,

foi coletada a fração solúvel do petróleo (parte inferior), transferida para outro

recipiente de vidro escuro e armazenada a 4°C ao ab rigo da luz.

Similar aos experimentos com petróleo, foram realizadas três diferentes

condições experimentais para a fração solúvel do petróleo: 1) Ambiente regular; 2)

Ambiente hipóxico e 3) Ambiente acidificado. A coleta de fígado também foi

realizada como descrita anteriormente, porém coletados em Eppis de 2 ml contendo

500µl de RNALater. As amostras foram armazenadas a 4°C por 12 horas. Após a

absorção do RNALater pelo fígado, as amostras foram transferidas para o freezer -

80°C, até o momento do transporte para o Departamen to de Toxicologia Celular –

UFZ, Alemanha.


ocellatus à fração solúvel do petróleo de Urucu.

Experimento 2 – fração solúvel do petróleo

Concentração da fração solúvel do petróleo

óleo (ml) / 12 l de água *

Exp. 1 – condições

regulares (n)

Exp. 2 - hipoxia (n)

Exp. 3 - ácido (n)

1 Controle Zero 4 4 4

2 0,0061% 1,46 6 6 6

3 0,024% 5,85 6 6 6

4 0,098% 23,4 6 6 6

5 0,39% 93,6 6 6 6

6 1,56% 374,4 6 6 6

* como houve inicialmente a diluição de 1:2 do petróleo na água para obter-se a fração solúvel, aqui esses valores foram multiplicados por 2.

68

2.2 Expressão dos marcadores em concentrações subag udas de petróleo

2.2.1 Estudos da expressão do gene cyp1a em Astronotus ocellatus

Antes de propormos a utilização da expressão de determinados genes como

marcadores para monitoramento de amostras de campo, foi necessário testá-los sob

condições laboratoriais para verificar se os mesmos responderiam a tratamentos

químicos apropriados.

Estes estudos foram feitos pela técnica RT-PCR (Amplificação por

Transcriptase Reversa – Reação de Cadeia Polimerase) a princípio com

oligonucleotídeos degenerados dos genes ß-actina e cyp1a desenhados a partir de

seqüências de várias espécies de peixes disponíveis no GenBank (Tabela 3). O fato

dos efeitos moleculares causados por exposição a elementos tóxicos serem

semelhantes em todas as espécies nos permite sugerir que essas informações

poderão ser extrapoladas para as demais espécies de peixes da Amazônia.

O protocolo da técnica foi semelhante ao usado para os embriões de

zebrafish (vide Capítulo 1), com algumas modificações, para análise do fígado dos

animais, tendo em vista a degradação das amostras no transporte até o

Departamento de Toxicologia Celular.

2.2.1.1 Extração do RNA total

O RNA total foi extraído dos fígados dos indivíduos da espécie A. ocellatus

sobreviventes nos experimentos de exposição, por meio de homogeneização de 20-

30 mg das amostras em 500µl de reagente TRIzol.

Amostras de fígado dos animais sobreviventes foram transferidas para Eppis

de 2 ml, e submetidas a uma breve lavagem com água MilliQ. Em seguida, retirava-

se o excesso de água com pipeta e se adicionava 500µl de TRIzol. Procedeu-se a

69

homogeneização das amostras, que foram mantidas à temperatura ambiente por 5

minutos, centrifugadas para a separação de gordura, sangue e outras proteínas, e

transferidas para um novo tubo Eppendorf de 2 ml, ao qual foram adicionados 100µl

de clorofórmio. Os tubos foram agitados por inversão, mantendo-se à temperatura

ambiente por 3 minutos. Após esse tempo, a amostra foi centrifugada a 12.000g, a

4°C por 5 minutos, para separação das três fases lí quidas: o sobrenadante continha

o RNA; a fase abaixo do sobrenadante, esbranquiçada e fina, contendo DNA; e a

interfase que continha os compostos orgânicos. A parte que nos interessava era o

sobrenadante com RNA. Se a amostra se mostrasse turva, escura ou muito

esbranquiçada, fazíamos novamente uma centrifugação com mais 100 µl de

clorofórmio e retirávamos apenas o sobrenadante.

Deste Eppendorf retiramos cuidadosamente o sobrenadante

(aproximadamente 250-280 µl) com uma pipeta de 200µl, evitando contaminação

com o DNA, e transferimos para um novo tubo. Neste tubo foi adicionado um volume

igual de isopropanol (aproximadamente 250 µl) efetuando uma breve mistura que foi

mantida no freezer -20°C, por no mínimo, 20 minutos . Em seguida, a mistura foi

centrifugada novamente a 12.000g, a 4°C por 5 minut os e como resultado obteve-se

o pellet de RNA. Ao pellet adicionamos 500 µl de etanol 75%, homogeneizamos por

três vezes e centrifugamos novamente a 12.000g, a 4°C por 10 minutos, removendo

novamente o sobrenadante e mantendo o pellet à temperatura ambiente por 10

minutos para evaporar todo o etanol. Em seguida, 50 a 100µl de água MilliQ

autoclavada foram adicionados e as amostras incubadas por 5 minutos em 60°C

para diluição total do RNA.

Quantificação do RNA - o RNA diluído foi quantificado por

espectrofotometria em 260-280nm (NanoDrop), utilizando 1,5 µl do RNA total.

70

Integridade do RNA - foi checada por eletroforese em gel de agarose 1,5%

usando apenas 500ng do RNA total de cada amostra e o restante de RNA era

estocado em freezer a -80°C até o momento das análi ses.

Digestão de DNA – foi feita para evitar possíveis contaminações com DNA

nas amostras. Para cada amostra de 2µg de RNA dissolvida em 10µl de água MilliQ

foram adicionados: 1µl de DNAse (RNAse-free, Roche), 2 µl de Tampão 10X D e 7

µl de água MilliQ, mantidos em termociclador Biometra T3000 a 25°C por 15

minutos, com volume final igual a 20µl. Deste volume utilizava-se 10 µl para controle

em gel de agarose 1%, para verificar se ainda havia possíveis contaminações com

proteínas, sendo os 10 µl restantes utilizados para fazer a síntese do DNA

complementar (cDNA).

2.2.1.2 Síntese do DNA complementar (cDNA)

Para a síntese do cDNA foram utilizamos 1 µg do RNA total acondicionado

em tubo de reação PCR de 0,2 ml.

As amostras de RNA da espécie A. ocellatus nos experimentos do petróleo e

fração solúvel do petróleo estavam parcialmente degradadas e, por isso, ao invés de

usarmos apenas o Oligo dT18 Primer, utilizamos também, os oligonucleotídeos

hexamêros randômicos (Randon hexamers primers- RHP).

A cada 10 µl de RNA tratado com DNAse foram adicionados 2µl de Oligo

dT18 primer (10µM) e 0,025µl de RHP (250ng/reação). Estes tubos foram colocados

em um termociclador Biometra T3000, aquecido a 70°C por 5 minutos e em seguida

resfriado em gelo. O MasterMix RT foi preparado com 4µl de tampão 5X, 2µl dos

dNTPs (10mM), 0,5µl de Inibidor Ribonuclease (40u/µl) RNAse Out e 0,5µl de água

MilliQ. Esse MasterMix RT foi adicionado à solução com RNA para desnaturar, e as

71

amostras foram mantidas por dez minutos a 37°C. Em seguida foi adicionado 1µl da

Transcriptase Reversa MMLV (200u/µl, Revert Aid, Fermentas), para um volume

final de 20µl de reação. Essa reação foi incubada por 75 minutos a 42°C e inativada

por dez minutos a 70°C usando o termociclador Biome tra T3000. Após essa reação

obteve-se o cDNA, que foi amplificado por PCR.

2.2.1.3 PCR utilizando oligonucleotídeos degenerado s e específicos

O MasterMix de PCR foi preparado para cada reação contendo: 2,5µl de

tampão 10X de RT-PCR, 1µl de dNTP-mix (10mM), 17,8 µl de água MIlliQ, 0,2 µl de

Taq - Polymerase, 1µl de oligonucleotídeos Forward (20mM), 1 µl de

oligonucleotídeos Reverse (20mM) dos genes selecionados (Tabela 3). Esses PCRs

foram inicialmente feitos com oligonucleotídeos degenerados desenhados a partir

das seqüências das espécies Danio rerio, Oreochromis niloticus, Liza aurata,

Dicentrarchus labrax, Pleuronectes yokohamae e Limanda limanda. As seqüências

dos oligonucleotídeos degenerados estão na tabela 3. Com a clonagem dos genes

ß-actina e cyp1a em Astronotus ocellatus, foram construídos oligonucleotídeos

específicos para esta espécie, uma vez que com a clonagem houve acesso a

seqüência desses genes.

Após o preparo do MasterMix foram adicionados 1µl do cDNA, o que no

volume final seriam 25 µl por tubo de reação. O ciclo tinha início com 94°C em 45 s;

o anelamento com 60°C em 30 s e a extensão com 72°C em 45 s e a sua extensão

final com 72°C em 10 min. Dependendo do tamanho do fragmento esperado, eram

calculados os números de ciclos necessários para ver a expressão desses genes

(Tabela 3).

72


degenerados Forward e Reverse. As letras R, K e Y na seqüência forward do gene

cyp1a indica a substituição de bases no momento da síntese; R= A ou G; K= G ou T;

Y= C ou T.

A concentração do produto foi determinada por eletroforese em gel de

agarose 1,5 - 2% (devido ao tamanho dos fragmentos) em tampão 1XTAE, corado

com brometo de etídio em TAE 0,001% por 20 - 30 minutos. A eletroforese foi

realizada a 120 W. Os fragmentos foram visualizados sobre luz UV e em seguida

fotografados.

Com a ajuda do programa computacional Image J foi possível detectar as

diferenças nas expressões de genes. Devido às degradações parciais havia

dificuldade para se fazer isso apenas visualmente. Utilizamos a densintometria,

fazendo a normalização da cyp1a em relação a seu controle constitutivo o gene ß-

actina.

2.3. Clonagem dos genes cyp1a e ß-actina do Astronotus ocellatus

Como todas as amostras de fígado do Astronotus ocellatus expostos no

LEEM ao petróleo estavam parcialmente degradadas, adquirimos em aquário

Genes Seqüência de oligonucleotídeos degenerados

S TM (°C) N° de ciclos na

PCR

Tamanho do fragmento

(pb)

ß-actina TGTTGACAACGGATCCGGTAT F 60°C 30 1741

ß-actina GGCCAACCTGTACACTGACT R

cyp1a1 AGRAAGCTKGCCTACAGTGCYC F 55°C 40 834

cyp1a1 TGTGTCTTCATCAATCAGTGGCA R

S=Sentido F=Forward; R=Reverse; TM= temperatura média de anelamento; pb=número de pares de base do fragmento.

73

comercial na Alemanha, um exemplar da mesma espécie, que foi utilizado para a

clonagem dos genes ß-actina e cyp1a. Esse exemplar foi mantido em aquário por

dois dias e, então, sacrificado para a coleta de 20 mg de fígado e extração de RNA

com TRIzol, seguida da digestão de DNA, e síntese de cDNA, utilizando o protocolo

padrão, descrito anteriormente. Para a clonagem foram utilizados 4µl de cDNA para

ß-actina e cyp1a, utilizando-se os oligonucleotídeos descritos na Tabela 3.

O produto do PCR foi visualizado em luz UV onde observamos a presença de

banda. Essas bandas tinham o tamanho esperado e foram recortadas do gel e

guardadas no freezer -20°C em tubos de Eppendorf de 2,0 ml novos e autoclavados,

até ser feita a recuperação do DNA em gel.

A recuperação do DNA a partir gel de agarose foi feita utilizando o Kit da

QIAGEN® – QIAquick gel extraction kit Protocol (www.qiagen.com) segundo o

protocolo fornecido pela firma. Em gel de agarose 1% foi recuperado 80mg de gel

com ß-actina e 200mg de gel com cyp1a. Esses pedaços de gel foram purificados

resultando cada um em 50 µl de solução de DNA. Foram utilizados 15 µl foi para

verificar a integridade do DNA em gel de agarose 1%.

Clonagem dos fragmentos de PCR com o kit clonagem T OPO TA INVITROGEN®

Em Eppendorf de 2 ml foi feito o mix de ligação (mix ligation) com os componentes

do kit:

- 1 µl do tampão de ligação; - 1 µl do VECTOR TOPO®; - 4µl do produto do PCR

Esse mix foi agitado brevemente e incubado por 30 minutos à temperatura

ambiente. Após 25 minutos, as células competentes JM109 (previamente

preparadas) de E. coli foram descongeladas em gelo. Adicionou-se 2 µl do mix de

ligação ao tubo das células competentes e misturou-as cuidadosamente, incubando-

74

as por 30 minutos em gelo. Em seguida foi dado um choque de temperatura por 30

segundos a 42°C em banho-maria. Após o choque térmi co, adicionou-se 250µl do

meio SOC (fornecido pelo fabricante) e as células bacterianas foram incubadas por 1

hora a 37°C sem agitação.

Após uma hora de incubação das células a 37°C, es sa solução foi espalhada com

uma espátula, autoclavada sobre as placas contendo Meio LB sólido, já contendo de

X-gal (é um glicosídeo contendo galactose, usado para indicar se a bactéria

expressa a enzima ß-galactosidase, a qual é codificada pelo gene LacZ) deixada por

uma noite em incubadora a 37°C.

Cultivo para a extração do DNA plasmidial - as quatro placas (duas para cada

gene) foram retiradas da incubadora e com uma pipeta de 200µl foram retiradas as

colônias brancas fazendo furos nas placas e adicionando ao tubo de ensaio

juntamente com a ponteira. Foram selecionadas 10 colônias, às quais foram

adicionadas 5ml de meio de cultura contendo 5 µl de ampicilina.

Estes tubos foram colocados em agitador com rotação de 250 rpm, durante

12 horas a 37°C. Após esse tempo verificaram-se os tubos para observar se havia

ocorrido o crescimento dos clones bacterianos, indicado por coloração turva do meio

de cultura e se um pellet estava presente. Os tubos foram homogeneizados por

Vortex.

Foi feito um PCR convencional para cada colônia de bactéria. Nas reações de

PCR foram usados 2µl do meio de cultura contendo a bactéria e, para cada reação

em tubos de Eppendorf de 200 µl, foram adicionados: 2,5 µl de tampão 10X; 1,0 µl

de dNTP mix (10mM); 0,12 µl de TaqPolimerase (5U/µl); 17,38 µl água DEPC; 1µl de

oligonucleotídeos foward; 1µl de oligonucleotídeos reverse e 2µl de bactéria.

O PCR foi realizado como descrito em 2.3.3 e após a visualização em gel de

75

agarose, fez-se a seleção dos melhores tubos para dar continuidade à análise.

Estocagem do DNA plasmidial : foram adicionados em tubos Eppendorf de 2,0 ml,

500µl de glicerina pura e 500 µl de bactéria do clone bacteriano selecionado, agitado

em Vortex brevemente e, então, armazenado em freezer -80°C.

Extração do DNA plasmidial : foram adicionados 2,00 ml da suspensão de

bactérias em tubos Eppendorf, que foram centrifugados a 8000 rpm por 3 minutos.

Houve formação de um pellet branco no fundo e o sobrenadante foi descartado.

Esse pellet foi utilizado para a extração do DNA plasmidial seguindo o kit QIA PREP.

O kit QIA PREP-SPIN QIAGEN® é constituído de três tampões: no tubo Eppendorf

contendo o pellet foi adicionado 250µl do tampão P1, 250µl do tampão P2 e 350µl

do tampão N3, misturando-se por inversão seis vezes. Após a mistura, esta solução

foi centrifugada por dez minutos a 13.000 rpm, o pellet foi formado novamente e o

sobrenadante foi retirado e aplicado o QIA PREPSPIN COLUMN. Em seguida foi

centrifugado novamente por 1 minuto. Descartou-se o líquido filtrado, e recuperou-se

o filtro com o material de interesse ligado a ele. O filtro que foi lavado com 500µl do

tampão PB e centrifugado por 1 minuto, descartando-se novamente o líquido filtrado.

Lavou-se a coluna (ou filtro) com 750µl de tampão PE centrifugando-se duas vezes

por 1 minuto e o descarte do líquido remanescente. O filtro de coluna foi retirado do

tubo Eppendorf e transportado para novo tubo. Para eluir o DNA, adicionou-se 50µl

do tampão EB, e manteve-se a coluna em repouso por 1 minuto, sendo centrifugada

por 1 minuto a 12.000 x g, e finalmente se descartou o filtro. O DNA se encontrava

eluído da coluna no tubo, sendo estocado a -20°C.

Posteriormente o DNA foi liofilizado e enviado para sequenciamento pela

MWG-Biotech. Após o sequenciamento dos genes da ß-actina e cyp1a do A.

ocellatus, as seqüências foram submetidas a buscas por sequências homólogas no

76

programa Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi), e pelo programa

ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) foi feito o alinhamento de sequências

múltiplas para testar a similaridade com as de outras espécies.

Após certificação de que as sequências encontradas eram da ß-actina e

cyp1a, com o auxílio do programa Primer3 (www.primer3.com), selecionou-se

oligonucleotídeos específicos para otimização das análises das amostras de A.

ocellatus. Os oligonucleotídeos foram desenhados para a obtenção de fragmentos

com menor tamanho (Tabela 4), visto que as amostras estavam parcialmente

degradadas. Esses oligonucleotídeos específicos com tamanho menor de fragmento

foram utilizados para avaliar todos os indivíduos de A. ocellatus expostos tanto ao

petróleo quanto a fração solúvel do petróleo; os oligonucleotídeos degenerados

(Tabela 3) foram utilizados apenas para a clonagem.

Tabela 4. Genes e seqüências dos oligonucleotídeos específicos Forward e Reverse

para a espécie Astronotus ocellatus.

Genes Seqüência de oligonucleotídeos específicos

S TM (°C)

N° de ciclos da PCR

Tamanho dos fragmentos

(pb)

ß-actina TGCAGTTTCATCTGGGGTTT F 55°C 40 231

ß-actina CAGCCTTCACAGAGGCAAT R

cyp1a AGCTGGACGAGAATGCAAAT F 55°C 37 144

cyp1a AGGAAGGGCAAGTTGTTCCT R

S=Sentido; F=Forward; R=Reverse; TM= temperatura média de anelamento; pb=número de pares de base do fragmento.

77

2.4 Análise Estatística

Os indivíduos de A. ocellatus tiveram seus tecidos analisados e comparados

entre as diferentes concentrações de petróleo e controle. Os dados foram inscritos

numa planilha e manuseados para sua apresentação sob a forma de média e erro

padrão da média. O nível de significância aceito foi de p < 0,05. A significância das

diferenças entre médias foi feita por análise de variância (ANOVA), com o teste de

Dunnet para as comparações múltiplas.

78

3. Resultados

3.1 Mortalidade

3.1.1 Experimentos com o petróleo de Urucu

Nos experimentos realizados com o A. ocellatus após 96 horas de exposição

ao petróleo (concentrações citadas na Tabela 1) foram selecionados 28 indivíduos

em três condições (regular, hipoxia e acidificado), totalizando 84 indivíduos. Destes

indivíduos apenas 61 sobreviveram ao final das 96 horas. Não houve mortalidade

de nenhum indivíduo do controle nos três experimentos.

Os exemplares de Astronotus apresentaram uma alta mortalidade quando

expostos a condições de hipoxia. Morreram três indivíduos expostos a 0,449% de

petróleo, e todos os indivíduos expostos à concentração 1,78% morreram antes de

se completar 72 horas (Tabela 5). Os indivíduos do experimento acidificado também

apresentaram mortalidade superior aos indivíduos expostos a condições regulares.

Tabela 5. Mortalidade de exemplares de A. ocellatus expostos as diferentes

concentrações do petróleo de Urucu.

Experimentos / Concentrações Controle 0,224% 0,449% 0,889% 1,78%

Condições regulares 0 1 1 0 2

Condições de hipoxia 0 0 3 2 6

Condições acidificadas 0 2 2 1 3

3.1.2 Experimentos com a fração solúvel do petróleo de Urucu

Foram expostos 34 indivíduos em cada experimento com a fração solúvel do

petróleo (quatro como controle e seis em cada concentração), totalizando 102

79

indivíduos. A mortalidade nos experimentos com A. ocellatus expostos à fração

solúvel do petróleo foi nula em todos os experimentos e em todas as concentrações.

3.2 RNA das amostras de fígado de A. ocellatus expostos ao petróleo e a fração

solúvel do petróleo

As amostras de RNA de fígado dos indivíduos expostos tanto ao petróleo

quanto à fração solúvel do petróleo estavam parcialmente degradadas (Figura 2),

isso talvez se devesse ao longo tempo de transporte. No primeiro experimento as

amostras de fígado foram transportadas em gelo seco, no segundo experimento

devido a proibição do transporte de gelo seco em avião, os fígados dos animais

foram transportados em gelo, com as amostras de fígado submersas em RNALater.

Foi necessária a padronalização do protocolo padrão e teste de vários

oligonucleotídeos para a expressão gênica da ß-actina e cyp1a.

Figura 2. Exemplos de amostras de RNA dos fígados de A. ocellatus expostos ao

petróleo de Urucu (A) e a fração solúvel do petróleo de Urucu (B). M = marcador de

peso molecular Ladder 100pb.

3.3 Clonagem dos genes ß-actina e cyp1a1 para o Astronotus ocellatus

Como as amostras de RNA dos exemplares de A. ocellatus estavam

parcialmente degradadas, foi necessária a aquisição de um exemplar da mesma

A B M M

80

espécie em aquário comercial, e com o RNA do fígado deste indivíduo foi feita a

reação de PCR com os oligonucleotídeos degenerados, para a clonagem. Obteve-se

a seqüência dos genes ß-actina (usada como controle constitutivo) (Figura 3A) e

cyp1a (Figura 3B). São mostradas as seqüências dos genes para a espécie: ß-

actina e cyp1a, com fragmentos de 1741 e 834 pares de base, respectivamente.

Figura 3. Fragmentos do RT-PCR para clonagem dos genes ß-actina (A) e cyp1a (B)

do A. ocellatus utilizando oligonucleotídeos degenerados. M= marcador de peso

molecular Ladder 100pb.

Em seguida usou-se o BLAST para comparar as seqüências obtidas com as

seqüências dos mesmos genes em outras espécies. Os resultados mostraram uma

homologia de 76,33 % para a ß-actina e 77,34% para cyp1a entre as espécies, o

que confirmou a veracidade de ambas as sequências. Enfatiza-se que as

seqüências de A. ocellatus dos genes ß-actina (Figura 4) e cyp1a (Figura 5)

mostraram alta homologia com Oreochromis niloticus, Oryzias lapides e

Oncorhynchus mykiss. As seqüências dos genes do A. ocellatus foram identificadas

por sequenciamento do fragmento de RT-PCR obtido com oligonucleotídeos

degenerados. O número de acesso no GenBank das seqüências de A. ocellatus dos

genes ß-actina e cyp1a são: EU553593 e EU553595, respectivamente.

M M

81

Ol CCAC---CCAAAGTTTAGCCATGGATGATGACATTGCCGCACTGGTTGTTGACAACGGAT 116 On CAAAA--CCAAAAGTTCAAAATGGAAGATGAAATCGCCGCACTGGTTGTTGACAACGGAT 101 Ao --------------------------------------------- TGTTGACAACGGAT 14 Om CTAAGAAGCCAACATGTGTGACG-ACGATGAGACTACCGCCCTTGTGTGCGACAACGGCT 115 * * * ** * *** ** * ******** * Ol CTGGCATGTGCAAAGCCGGATTCGCTGGAGACGATGCCCCTCGTGCTGTCTTTCCCTCCA 176 On CCGGTATGTGCAAAGCCGGATTCGCCGGAGATGACGCGCCTCGGGCTGTCTTCCCCTCCA 161 Ao CCGGTATGTGCAAGGCCGGATTCGCCGGAGACGACGCCCCTCGTGCTGTCTTCCCCTCCA 74 Om CCGGCCTGGTGAAGGCTGGCTTCGCCGGAGACGATGCCCCCAGGGCCGTGTTCCCCTCTA 175 * ** ** ** ** ** ***** ***** ** ** ** * ** ** ** ***** * Ol TCGTTGGTCGCCCCAGGCACCAGGGTGTCATGGTGGGTATGGGCCAGAAAGACAGCTACG 236 On TCGTCGGGCGTCCCAGGCATCAGGGAGTGATGGTTGGGATGGGCCAGAAAGACAGCTACG 221 Ao TCGTCGGTCGCCCCAGACATCAGGGTGTGATGGTGGGTATGGGCCAGAAAGACAGCTATG 134 Om TCGTCGGCCGTCCCCGCCACCAGGGTGTCATGGTCGGTATGGGTCAGAAGGACTCCTACG 235 **** ** ** *** * ** ***** ** ***** ** ***** ***** *** *** * Ol TAGGAGATGAAGCCCAGAGCAAGAGGGGTATCCTGACCCTGAAGTATCCCATTGAGCACG 296 On TGGGAGACGAGGCTCAGAGCAAGAGGGGCATCCTGACCCTGAAGTACCCCATTGAGCATG 281 Ao TTGGTGATGAGGCCCAGAGCAAGAGAGGTATCCTGACCCTGAAGTACCCCATCGAGCACG 196 Om TCGGTGACGAGGCCCAGAGCAAGAGGGGTATCCTCACTCTGAAGTACCCCATTGAGCACG 295 * ** ** ** ** *********** ** ***** ** ******** ***** ***** * Ol GTATTGTTACCAACTGGGATGACATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGC 356 On GCATCGTCACCAACTGGGACGACATGGAGAAGATCTGGCATCACACCTTCTACAACGAGC 341 Ao GTATTGTGACCAACTGGGATGACATGGAGAAGATCTGGCATCACACCTTCTACAACGAGC 254 Om GCATCATCACCAACTGGGACGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAACGAGC 355 * ** * *********** ** ***************** ************** **** Ol TGAGAATTGCCCCTGAGGAGCACCCTGTCCTGCTCACTGAAGCCCCCTTGAACCCCAAAG 416 On TGAGGGTGGCTCCAGAGGAGCACCCCGTCCTGCTCACAGAGGCCCCCCTCAACCCCAAAG 401 Ao TGAGAGTTGCCCCTGAGGAGCACCCTGTCCTGCTCACAGAGGCTCCCCTGAACCCCAAAG 316 Om TGAGAGTGGCCCCCGAGGAGCACCCCACCCTGCTCACTGAGGCCCCACTGAACCCCAAGG 415 **** * ** ** *********** ********* ** ** ** * ******** * Ol CCAACAGGGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACAGCCCTGCCATGTACG 476 On CCAACAGGGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCTGCCATGTACG 461 Ao CCAACAGGGAGAAGATGACTCAGATCATGTTCGAGACGTTCAACACCCCAGCCATGTACG 374 Om CCAACAGGGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACGTCCCTGCCATGTATG 475 ******************* *********** ***** ****** *** ******** * Ol TTGCCATCCAGGCTGTGCTGTCCCTGTATGCCTCTGGTCGTACCACTGGTATCGTCATGG 536 On TGGCCATCCAGGCCGTGTTGTCCCTGTACGCCTCTGGCCGTACCACCGGTATCGTCATGG 521 Ao TTGCCATTCAGGCTGTGCTGTCCCTGTATGCCTCTGGTCGTACCACTGGTATCGTCATGG 434 Om TGGCCATCCAGGCTGTGCTGTCCCTGTACGCTTCCGGCCGTACCACTGGTATTGTGCTGG 535 * ***** ***** *** ********** ** ** ** ******** ***** ** *** Ol ACTCTGGTGATGGTGTGACCCACACAGTGCCCATCTACGAGGGCTACGCTCTGCCCCACG 596 On ACTCCGGTGACGGCGTGACCCACACAGTACCCATCTACGAGGGCTACGCTCTGCCCCACG 581 Ao ACTCCGGTGATGGTGTGACCCACACAGTGCCCATCTATGAGGGTTATGCCCTGCCCCACG 494 Om ATGCTGGTGATGGTGTGACCCACAACGTCCCAGTCTATGAGGGTTACGCCCTGCCCCACG 595 * * ***** ** ********** ** ** **** ***** ** ** ********** Ol CCATCCTGCGTCTGGACTTGGCCGGCCGCGACCTTACAGACTACCTCATGAAGATCCTGA 656 On CCATCCTGCGTCTGGATCTGGCCGGCCGCGACCTCACAGACTACCTGATGAAGATCCTGA 641 Ao CCATCCTGCGTCTGGACCTGGCTGGCCGTGACCTCACAGACTACCTCATGAAGATCCTGA 554 Om CCATCATGCGTCTGGACCTGGCTGGTCGCGATCTGACCGACTACCTGATGAAGATCCTGA 655 ***** ********** **** ** ** ** ** ** ******** ************* Ol CGGAGCGTGGCTACTCCTTCACCACCACAGCCGAGAGGGAAATTGTCCGTGACATCAAGG 716 On CGGAGCGCGGTTACAGCTTCACCACCACGGCCGAGAGGGAAATCGTACGAGACATCAAGG 701 Ao CAGAGCGTGGCTATTCCTTCACCACCACAGCTGAGAGGGAAATCGTGCGTGACATCAAGG 614 Om CTGAGCGTGGCTACTCCTTCGTGACCACTGCCGAGCGTGAGATCGTGCGTGACATCAAGG 715 * ***** ** ** **** ***** ** *** * ** ** ** ** ********** Ol AGAAGCTGTGCTACGTCGCCCTGGACTTCGAGCAGGAGATGGGCACCGCTGCCTCCTCTT 776 On AGAAGCTGTGCTACGTGGCGCTGGACTTTGAGCAGGAGATGGGCACCGCTGCCTCCTCTT 761

82

Ao AGAAGCTGTGCTACGTTGCCCTGGACTTCGAGCAGGAGATGGGTACCGCTGCCTCCTCCT 674 Om AGAAGCTGTGCTATGTGGCTCTGGACTTCGAGAACGAGATGGCCACCGCTGCCTCCTCCT 775 ************* ** ** ******** *** * ******* ************** *

Figura 4. Alinhamento da seqüência do gene ß-actina do Astronotus ocellatus (Ao),

Oreochromis niloticus (On), Oryzias latipes (Ol) e Onchorhynchus mykiss (Om). O

alinhamento dessas sequências homólogas foi feito pelo ClustalW. * = homologia

entre as bases.

Ao QN------SPLEAG---------YSALRSFSTLEGTTPEYSCALEEHVSKEAEYLIKELN 48 On NDGKSLSFSTDQAGIWRARRKLAYSALRSFSNLEGTTPEYSCALEEHISKEAEYLIKELN 75 Ol NDGKSLAFSTDQAGVWRARRKLAYSALRSFSSLEGSNAEYSCMLEEHICKETEHLVKEIE 180 Om NDGNSLAFSTDKAGVWRARRKLAMSALRSFATLEGTTPEYSCALEEHVCKEGEYLVKQLT 180 :: *. :** ******:.***:..**** ****:.** *:*:*:: Ao TVMKSEGSFDPFRYVVVSVANVICGMCFGRRYNHHDDELVGLVTLSDDFVKVVGSGNPAD 108 On TVMKTKGSFDPFRYVVVSVANVICGTCFGRRYDHHDDELVSLVNLSDDFVKVVGSGNPAD 135 Ol KVMKTEGKFDPYRYIVVSVANVICGMCFGRRYDHHDQELVGLVNLSEDFVQVTGSGNPAD 240 Om SVMDVSGSFDPFRHIVVSVANVICGMCFGRRYSHDDQELLGLVNMSDEFGQVVGSGNPAD 240 .**. .*.***:*::********** ******.*.*:**:.**.:*::* :*.******* Ao FIPLLQYLPSATMKKFVSLNVRFNKFVQKLVSEHYATFDKENIRDITDSLIDHCEDRKLD 168 On FIPLLQYLPSTKMKKFVSLNARFSKFVQKLVTEHYATFDKDNIRDITDSLIDHCEDRKLD 195 Ol FIPALRYLPSKAMKKFVEINNRFQCFVQKIVNEHYATYDKDNIRDITDSLIDHCEDRKLD 300 Om FIPILRYLPNRTMKRFMDINDRFNNFVQKIVSEHYESYDKDNIRDITDSLIDHCEDRKLD 300 *** *:***. **:*:.:* **. ****:*.*** ::**:******************* Ao ENANIQMSDEKIVGIVNDLFGAGFDTISTALSWSLMYFVAYPEIQDRLFEEIKEKVGLDR 228 On ENANIQMSDEKIVGIVNDLFGAGFDIISTALSWSLMYFCGLPRDQNRLFEEMKEKVGLDR 255 Ol ENSNIQMSDEKVVGIVNDLFGAGFDTISTALSWAVGYLVAYPDIEKRLFEEIKENIGLNR 360 Om ENANIHVSDEKIVGIVNDLFGAGFDTISTALSWAVVYLVAYPEIQERLHQELKEKVGMIR 360 **:**::****:************* *******:: *: . * :.**.:*:**::*: * Ao TPVISDRNNLPFLEAYILELFRHSSYLPFTIPHCTTKDTSLNGYFIPKDTCVFINQWQR- 287 On MPVFSDRNNLPLLEAYILELFRHSSYLPFTIPHCTTKDTSLNGYFIPKDTCVFINQWQIN 315 Ol NPTISDRSNLPLTEAFILEIFRHSSFLPFTIPHCTTRDTSLNGYYIPKDTCVFINQWQIN 420 Om TPRLSDKINLPLLEAFILEIFRHSSFLPFIIPHCTIKDTSLNGYFIPKDTCVFINQWQVN 420 * :**: ***: **:***:*****:*** ***** :*******:*************

Figura 5. Alinhamento da seqüência protéica do gene cyp1a de Astronotus ocellatus

(Ao), Oreochromis niloticus (On), Oryzias latipes (Ol) e Onchorhynchus mykiss (Om).

O alinhamento das sequências foi feito pelo ClustalW. *= homologia entre as bases.

83

3.4 Expressão dos genes cyp1a e ß-actina

3.4.1 Exposições com o petróleo de Urucu

Nas análises de expressão gênica das amostras parcialmente degradadas,

não foi possível visualizar diretamente os resultados no gel. Foi necessário o auxílio

do programa computacional Image J, que analisa a densintometria pelo número de

pixels da imagem para normalizar a expressão da cyp1a em relação à ß-actina. Uma

vez que a ß-actina é o controle constitutivo, admite-se que a expressão deste gene é

100% e a expressão real do gene cyp1a é o valor calculado. Os fragmentos obtidos

em todas as amostras tiveram o tamanho esperado: ß-actina = 231pb e cyp1a =

144pb.

Os experimentos de exposição por 96 horas em condições regulares,

hipóxicas e acidificadas, de indivíduos adultos de A. ocellatus, mostraram a mesma

tendência na expressão do gene cyp1a, isto é, expressão crescente seguida de

queda. O eixo y nas figuras 7, 9, 11, 13, 15 e 17 representa a normalização das

áreas das bandas do gene cyp1a em relação à ß-actina (controle constitutivo). O

valor é dado em pixels.

No experimento de exposição ao petróleo em condições regulares não foi

observada a expressão do gene cyp1a nos indivíduos do controle. O gene foi

expresso a 0,224%, mostrou-se mais alto a 0,449% atingindo o pico de expressão a

0,889%. Em 1,78% houve uma redução na expressão (Figuras 6 e 7). Cada banda

na Figura 6 representa um indivíduo.

84



regulares; M = marcador de peso molecular Ladder 100 pb.

Um resumo de todas as concentrações por análise densintométrica está

exposto na Figura 7. A normalização foi feita pela análise densintométrica do gel

usando ß-actina como referência (ver Fig. 6).

Normalização da expressao do gene cyp1a

0

10

20

30

40

50

0 0,224% 0,449% 0,889% 1,788%

Percentual de contaminação com petróleo

n=4

SEM

n=5

**

n=5 n=6 n=4

Figura 7. Normalização da expressão de mRNA de cyp1a em A. ocellatus expostos

ao petróleo em condições regulares.

Nos experimentos de exposição ao petróleo com o Astronotus em condições

de hipoxia, houve um aumento da expressão do gene cyp1a com o aumento da

concentração do petróleo, com início a 0,224%, aumentado a 0,449% e na

concentração de 0,899% houve uma queda na expressão. Os indivíduos expostos a

1,78% de petróleo morreram antes de 72 horas de exposição (Figuras 8 e 9). Cada

ß-actina

cyp1a

85

banda na Figura 8 representa um indivíduo.


expostos a diferentes concentrações de petróleo, experimentos em condições de

hipoxia. M = marcador de peso molecular Ladder 100pb.



usando ß-actina como referência (ver Fig. 8).

Normalização da expressão do gene cyp1a

0

30

60

90

120

150

180

Control 0,224% 0,449% 0,899%Percentual de contaminação com petróleo

n=4 n=5n=3n=6


0

30

60

90

120

150

180

Control 0,224% 0,449% 0,899%Percentual de contaminação com petróleo

n=4 n=5n=3n=6


petróleo em condições de hipoxia.

Os indivíduos de Astronotus expostos ao petróleo por 96 horas em águas

ácidas apresentaram comportamento similar quanto à expressão de genes nos

experimentos anteriores. O aumento da expressão da cyp1a foi proporcional ao

aumento da concentração de petróleo. Igualmente ao experimento em condições

ß-actina

cyp1a

86

regulares, a expressão do gene cyp1a aumentou até a concentração de 0,449% de

petróleo e, a partir de 0,899%, a expressão gênica da cyp1a diminuiu drasticamente

(Figuras 10 e 11). Cada banda na Figura 10 representa um indivíduo.


expostos a diferentes concentrações de petróleo, em condições ácidas. M =

marcador de peso molecular Ladder 100pb.



usando a ß-actina como referência (ver Fig. 10).


0

10

20

30

40

50

60

70

Controle 0,224% 0,449% 0,899% 1,78%Percentual de contaminação com petróleo

n=4 n=4 n=4 n=5 n=3


0

10

20

30

40

50

60

70

Controle 0,224% 0,449% 0,899% 1,78%Percentual de contaminação com petróleo

n=4 n=4 n=4 n=5 n=3


petróleo em condições ácidas.

ß-actina

cyp1a

87

3.4.2 Fração solúvel do petróleo de Urucu

Os experimentos realizados com a fração solúvel do petróleo de Urucu com

indivíduos de Astronotus expostos por 96 horas quanto à mortalidade e expressão

do gene cyp1a, mostraram-se diferentes nos resultados em relação aos indivíduos

desta espécie expostos nas mesmas condições ao óleo cru. Não houve mortalidade

em nenhum dos experimentos de exposição às cinco concentrações.

Nos indivíduos expostos à fração solúvel do petróleo de Urucu em condições

regulares não houve expressão da cyp1a no controle e 0,0061%; nos indivíduos

expostos a 0,024% houve uma expressão muito baixa, com aumento gradativo até a

concentração de 1,56%. Diferentemente dos experimentos com o óleo cru, não

houve uma diminuição da expressão da cyp1a quando as concentrações eram

relativamente altas (Figuras 12 e 13). Cada banda na Figura 12 representa um

indivíduo.



condições regulares. M = marcador de peso molecular Ladder 100pb.




Controle 0,0061% 0,024% 0,098% 0,39% 1,56%

ß-actina

cyp1a

M

Controle 0,0061% 0,024% 0,098% 0,39% 1,56%

ß-actina

cyp1a

Controle 0,0061% 0,024% 0,098% 0,39% 1,56%Controle 0,0061% 0,024% 0,098% 0,39% 1,56%Controle 0,0061% 0,024% 0,098% 0,39% 1,56%

ß-actina

cyp1a

M

88

Normalização do gene cyp1a

0

10

20

30

40

50

60

Controle 0,0061% 0,024% 0,098% 0,39% 1,56%

Percentual de contaminação com a fração solúvel do petróleo

n=4 n=6n=6 n=6 n=6 n=6


0

10

20

30

40

50

60

Controle 0,0061% 0,024% 0,098% 0,39% 1,56%

Percentual de contaminação com a fração solúvel do petróleo

n=4 n=6n=6 n=6 n=6 n=6

n=4 n=6n=6 n=6 n=6 n=6


fração solúvel do petróleo em condições regulares.

As exposições utilizando a fração solúvel de petróleo com indivíduos de A.

ocellatus em condições de hipoxia apresentaram uma tendência similar aos

experimentos realizados com o óleo cru na mesma condição. Os indivíduos não

apresentaram expressão do gene cyp1a no controle, porém houve expressão deste

gene em indivíduos expostos às concentrações de 0,0061%, 0,024%, 0,098% e

0,39%. No entanto, na concentração 1,78% houve uma diminuição brusca na

expressão deste gene, que foi menor que a expressão na concentração 0,0061%

(Figuras 14 e 15). Cada banda na Figura 14 representa um indivíduo.



condições de hipoxia. M = marcador de peso molecular Ladder 100 pb.

M

Controle 0,0061% 0,024% 0,098% 0,39% 1,56%

ß-actina

cyp1a

M

Controle 0,0061% 0,024% 0,098% 0,39% 1,56%

ß-actina

cyp1a

M

Controle 0,0061% 0,024% 0,098% 0,39% 1,56%

ß-actina

cyp1a

89





0

10

20

30

40

50

60

Controle 0,0061% 0,024% 0,098% 0,39% 1,56%

Percentual de contaminação com a fração solúvel do Petróleo

n=4 n=6

n=6

n=6 n=6n=6


0

10

20

30

40

50

60

Controle 0,0061% 0,024% 0,098% 0,39% 1,56%

Percentual de contaminação com a fração solúvel do Petróleo

n=4 n=6

n=6

n=6 n=6n=6

n=4 n=6

n=6

n=6 n=6n=6


fração solúvel do petróleo em condições de hipoxia.

A expressão do gene cyp1a em indivíduos de A. ocellatus expostos a fração

solúvel do petróleo em condições de acidez, também foi crescente a partir da

concentração de 0,0061% a 1,56% resultados idênticos aos encontrados em

indivíduos expostos à fração solúvel em condições regulares (Figuras 16 e 17).

Cada banda na Figura 16 representa um indivíduo.



ácidas. M = marcador de peso molecular Ladder 100pb.

ß-actina

cyp1a

90

Um resumo de todas as concentrações por análise densintométrica está exposto na

Figura 17. A normalização foi feita pela análise densintométrica do gel usando a ß-

actina como referência (ver Fig. 16).


0

20

40

60

80

100

Controle 0,0061% 0,024% 0,098% 0,39% 1,56%Percentual de contaminação com a fração solúvel do Petróleo

n=4 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6


0

20

40

60

80

100

Controle 0,0061% 0,024% 0,098% 0,39% 1,56%Percentual de contaminação com a fração solúvel do Petróleo

n=4 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6


petróleo em condições ácidas.

91

4. Discussão

4.1 Mortalidade

Quando são liberados poluentes no ambiente aquático é possível que

ocorram efeitos tóxicos na biota aquática. Efeitos diretos variam com a intensidade

e duração da exposição ao contaminante, e vêm sendo freqüentemente estudados

com o objetivo de estimar o risco e estabelecer níveis permissíveis de

contaminação, baseando-se nas respostas de algumas espécies (Long et al., 1995).

Esses critérios são baseados em testes de toxicidade em laboratório, que

normalmente empregam espécies modelos, expostas a contaminantes simples. O

efeito direto dos contaminantes reduz a abundância dos organismos, seja pela

mortalidade, seja por alterações na fecundidade (Fleeger et al., 2003).

O histórico caso do derramamento de petróleo pelo navio Exxon Valdez

resultou na liberação de 258.000 barris de óleo cru em águas da baía de Príncipe

William em 1989. Sharp e colaboradores (1996) verificaram que, no local, após esse

derrame, as populações de ostra preta Haematopus bachmani tiveram sua

reprodução reduzida. Pequenas aves também apresentaram alta mortalidade,

comparadas à área escolhida como controle. Al-Yakoob e colaboradores (1996)

analisaram os efeitos do petróleo no peixe marinho Menidia beryllina e constataram

mudanças nas taxas de sobrevivência e crescimento da espécie.

Os indivíduos de A. ocellatus expostos diretamente ao petróleo apresentaram

mortalidade, diferente dos indivíduos expostos à fração solúvel do mesmo petróleo,

particularmente no caso dos indivíduos expostos também a hipoxia. Isso seria

facilmente explicado pelas características químicas e físicas do petróleo: houve uma

barreira na entrada de luz e passagem de oxigênio via difusão, processos com

efeito negativo mais rápido para a espécie. Embora haja registro que o Astronotus

92

tenha alta resistência a hipoxia e resiste até seis horas em anoxia total a 28°C

(Muuzse et al., 1998), quando estes fatores estão ligados à presença de petróleo na

água, tornam-se fatais, particularmente nas concentrações subletais acima de

0,224%. Com a deficiência de O2 na água, os peixes de respiração estritamente

aquática tendem a aumentar a freqüência dos batimentos operculares a fim de

suprir a necessidade de O2 e, com isso, o bombeamento de água contaminada com

petróleo é maior, resultando na aceleração do processo de contaminação do

indivíduo. Embora a mortalidade nos experimentos com a fração solúvel tenha sido

nula, isto não quer dizer que a fração solúvel seja menos nociva que o petróleo,

porque o petróleo representa além da barreira física, a nocividade dos seus

compostos, enquanto a fração solúvel por sua vez representa uma alta

concentração de hidrocarbonetos poliaromáticos, alifáticos e metais pesados de alto

poder cancerígeno, que são rapidamente absorvidos por peixes. No caso particular

da Amazônia, devido às suas flutuações no nível de água nos rios com períodos de

cheia e seca, fartura e escassez de alimento, os indivíduos tendem a acumular uma

grande quantidade de gordura no corpo o que facilita a bioacumulação destes

compostos que tem afinidade por lipídeos, o que permite sugerir que embora a

fração solúvel seja altamente tóxica devido aos seus componentes, o petróleo

apresenta, além disso, uma barreira na superfície da água, prejudicando

diretamente a respiração.

Wood e McDonald (1982) revisaram estudos em salmonídeos e descreveram

os ajustes fisiológicos dos peixes às águas ácidas resultantes da ação antrópica.

Esses autores mostraram que em baixos pHs ocorre inicialmente um efluxo difusivo

de íons, principalmente Na+ e Cl-, ao mesmo tempo em que o influxo é inibido. O

influxo de Na+ é inibido devido ao excesso de H+ relacionado à acidez, isto reverte o

93

funcionamento do sistema de troca entre Na+/H+ nos canais de Na+ localizados nas

brânquias (Lin e Randall, 1995). Assim, ao invés de bombear Na+ para o interior da

célula, a bomba apical passa a transportar H+. Os efeitos decorrentes deste evento

são a inibição do transporte de Na+ e, principalmente, o aumento no efluxo difusivo

resultante da diminuição da concentração de íons plasmáticos, reduzindo o volume

dos fluídos corpóreos. A liberação de novos eritrócitos na corrente sangüínea

contribui para o processo de hemoconcentração devido ao aumento da viscosidade

sanguínea, tornando difícil o bombeamento do sangue no sistema circulatório do

peixe. Além disso, ocorre, também, a competição do íon H+ com os canais de Ca2+,

reduzindo a entrada deste íon no sistema, prejudicial a uma série de ajustes

fisiológicos no peixe. Porém, segundo Paolis e Kukkonen (1997) a acidez das

águas, somada à presença de contaminantes aquáticos, parece não ter efeitos

negativos na solubilidade e disponibilidade desses contaminantes orgânicos.

Matsuo (2004) descreveu que, no caso de exposição ao cobre, há uma redução da

forma livre do metal na água, reduzindo, assim, a toxidade para os peixes

estudados. No presente trabalho com exemplares de A. ocellatus expostos ao

petróleo em condições de acidez (pH=3,5), não foi observada grande diferença com

relação à mortalidade ao compararmos os indivíduos nas condições regulares e

expostos às mesmas concentrações (houve morte de um indivíduo a mais em cada

concentração). Resultados semelhantes foram obtidos por Matsuo (2004) ao

estudar tambaqui (Colossoma macropomum).

94

4.2 Clonagem e expressão do gene cyp1a e ß-actina em indivíduos de A.

ocellatus expostos ao petróleo e a fração solúvel do petróle o de Urucu

O petróleo já foi descrito como um indutor de diversas alterações fisiológicas,

entre as quais se podem citar alterações na regulação iônica (Bastos e Val, 1995;

Menezes e Val, 1995; Farias e Costa, 1996; Mendes e Val, 1997; Brauner et al.,

1999), na respiração (Menezes e Val, 1995; Mendes e Val, 1996; Brauner et al.,

1999; Almeida-Val et al., 2002) e no sistema imune (Oliveira e Val, 1996; Matsuo et

al., 2002).

Os efeitos causados pelo petróleo em peixes são decorrentes de respostas

rápidas. Levine e Oris (1999) descreveram que a exposição a um relativamente

curto período (48 horas) seria suficiente para que os organismos apresentassem

respostas para esses contaminantes em tecidos internos como o fígado. Brauner e

colaboradores (1999) descreveram que a exposição a 12,5% da fração solúvel do

petróleo da reserva de Urucu por apenas 45 minutos já resulta em um aumento

significativo na freqüência respiratória da espécie Hoplosternum littorale, assim

como a ingestão do óleo por esta espécie também resulta em significativa redução

nas proporções de ATP e GTP: Hb.

Os efeitos adversos devido à presença de componentes do petróleo no

ambiente aquático atingem diretamente os peixes, desde o aspecto molecular até

suas populações. Nos estudos citados anteriormente, diferentes metodologias foram

utilizadas para a avaliação dos parâmetros fisiológicos; entretanto nenhum foi

conduzido com base na avaliação da expressão do gene cyp1a.

O citocromo P450 (CYP1A) é uma família multigene (Nelson et al., 1996) e o

gene do cyp1a é um biomarcador amplamente usado na avaliação da contaminação

do ambiente aquático, principalmente para identificar efeitos de hidrocarbonetos

95

policíclicos aromáticos, incluindo suspeitas de interrupção química endócrina (EDCs)

(Schlezinger e Stegeman, 2001; Moore et al., 2003; Fent, 2003). Porém, anticorpos

e seqüências desse gene, estão disponíveis para algumas espécies, normalmente

as mais comerciais ou as espécies modelo usadas em vários experimentos

toxicológicos tais como carpa, medaka, salmão, truta e zebrafish.

CYP1A é comumente expressa em células epiteliais de vários órgãos:

intestino, fígado, rim, brânquias, gônadas, tecido nervoso, células endócrinas etc..

Apesar disso, sua maior atividade ocorre no fígado quando comparada a outros

órgãos (Sarasquete et al., 1999). Lee e colaboradores (2005), ao analisarem a

expressão do gene cyp1a em cérebro, olho, gônadas, intestino, fígado, músculo e

pele de adultos da espécie de peixe Rivulus marmoratus, verificaram o que o gene

cyp1a foi expresso em todos os tecidos testados, com exceção do olho, cuja

expressão foi baixa. Sarasquete e Segmar (2000) também confirmaram, por

ensaios enzimáticos, que CYP1A está presente em vários tecidos, porém seu maior

local de expressão em peixes teleósteos é no fígado.

Análise do cérebro de Sparus aurata expostos por dois dias ao 2,3,7,8

tetraclorodibenzo -p- dioxina (TCDD) mostrou que os níveis de mRNA hepático de

cyp1a foram significativamente elevados quando comparados ao controle em todas

as concentrações testadas e a resposta era aumentada com o tempo de exposição

(Ortiz - Delgado et al., 2002). Roberts e colaboradores (2006), ao analisarem a

expressão do gene cyp1a em brânquias de salmão coho na baía de Príncipe

William (Alaska), verificaram que houve um aumento da expressão em amostras de

locais onde houve derramamento de petróleo, atingindo expressão entre 5 e 10

vezes maiores que nas amostras da mesma espécie coletadas na área controle.

96

A enzima CYP1A catalisa a hidroxilação de PAHs a formas hidrossolúveis

para que sejam excretadas pela bile, o que a caracteriza como um biomarcador

eficiente em peixes (McCarty et al., 2002). Experimentos com embriões avaliaram a

toxicidade crônica de hidrocarbonetos com 3-5 anéis, derivados de petróleo,

mostrando que a toxicidade crônica pode, também, ser avaliada por meio da

CYP1A (Brinkworth et al., 2003). Ramanchadran e colaboradores (2006) também

observaram a indução da CYP1A em peixes expostos à fração solúvel do petróleo

com uma grande quantidade de PAHs.

Até o presente momento existem poucos estudos em espécies de água doce

que utiliza a CYP1A na sua forma enzimática, protéica ou mRNA como

biomarcador. A expressão do gene cyp1a tem sido avaliada após a exposição dos

organismos a hidrocarbonetos de petróleo e os resultados têm se mostrado

similares tanto em corpos d’água como em sedimento contaminados.

Neste trabalho a expressão do gene cyp1a foi analisada em fígados de peixes

adultos da espécie amazônica Astronotus ocellatus, exposta às concentrações

subletais de petróleo variando de 0,224 a 1,78%. Avaliamos também a espécie

exposta a concentrações subletais da fração solúvel do petróleo variando de 0,0061

a 1,56%. Em ambos os experimentos foram utilizadas três condições ambientais:

normal, hipóxica e ácida. Encontramos induções do gene cyp1a em todas as

concentrações analisadas, sendo que o gene cyp1a demonstrou ser um bom

marcador quando os indivíduos da espécie são expostos a concentrações subletais.

No entanto, em altas concentrações de petróleo (1,78%) em condições regulares e

ácidas houve uma diminuição da expressão deste gene. O mesmo ocorreu no

experimento de exposição à fração solúvel do petróleo em condições de hipoxia.

Neste experimento a 1,56% da fração solúvel do petróleo em condições de hipoxia,

97

essa expressão foi menor que na primeira concentração (0,224% de petróleo e

0,0061% da fração de óleo cru). Isso sugere que em altas concentrações do

contaminante o organismo não consigue mais responder à entrada de

contaminantes, resultando na supressão deste gene ou na falta de expressão, que

pode ser devido à debilidade do organismo. É provável que a ativação de outros

genes responsáveis pela desintoxicação, ou mesmo a supressão de outros genes

juntamente com o cyp1a, tenha resultado num colapso do organismo. Porém isto

não está claro na literatura. Respostas como estas variam de espécie para espécie;

os embriões de zebrafish expostos às mesmas concentrações da fração solúvel do

petróleo de Urucu apresentaram expressão crescente da cyp1a a 1,56% (Capítulo

1). Por outro lado, Polino e Holdway (2003) observaram que a atividade da CYP1A

em peixe arco-íris de água doce, declinou a níveis inferiores aos do controle após a

exposição do peixe a altas concentrações da fração solúvel dispersa em petróleo.

Esses resultados mostram que a espécie amazônica Astronotus ocellatus é

mais responsiva que os embriões de zebrafish à fração solúvel do petróleo. No caso

de peixes adultos, a primeira via de tomada e excreção dos hidrocarbonetos,

freqüentemente por difusão, são as brânquias (Thomas e Rice, 1981); portanto

compostos altamente solúveis em lipídeos seriam rapidamente absorvidos pelas

brânquias. Talvez, por esta razão, os animais adultos fossem mais prejudicados que

os embriões, pois estes realizam suas trocas gasosas adicionalmente por via

cutânea. Entretanto era esperado que os efeitos nos embriões fossem mais nocivos

por estes apresentarem uma relação superfície/volume maior para a absorção dos

PAHs. Como se observa os resultados são controversos.

Existem vários estudos que registram a presença dos hidrocarbonetos de

petróleo no ambiente. Entretanto, o efeito tóxico de exposição a concentrações

98

subletais de hidrocarbonetos de petróleo ainda são incertos (Steadman et al., 1991,

Al-Yakoob et al., 1996).

Um derrame acidental de petróleo não apresenta conseqüências drásticas

apenas por si mesmo, mas, sobretudo porque além do efeito do óleo, as

conseqüentes ações do homem para remover ou dispersar este óleo são também

danosas ao ambiente e organismos aquáticos. Os processos de remediação não

apresentam uma solução de limpeza do ambiente ou estado menos sujo que

anterior ao acidente. Essas técnicas de remediação, baseadas no uso de

dispersantes para contornar os problemas como um derrame de óleo, em grande

parte dos casos, é uma alternativa mais tóxica que os derramamentos (Cohen e

Nugegoda, 2000). Ramanchadran e colaboradores (2006) relatam em brackfish que

o uso de dispersantes aumentaria a exposição a PAHs em 250 vezes em ambiente

de água doce, mas apenas 10 vezes em ambiente marinho. Uma das principais

razões é o aumento da solubilidade de PAHs em baixa salinidade, especialmente os

PAHs de baixo peso molecular com dois e três anéis homólogos. Outra técnica

utilizada para remediação é a de queimar o petróleo, o que também não é eficaz,

uma vez que estudos baseados nas concentrações de hidrocarbonetos totais no

petróleo, mostrou que o óleo cru parcialmente queimado é mais tóxico para a

espécie de peixe Menidia beryllina que o óleo cru. Não existe ainda uma técnica

que se mostre totalmente eficaz na remediação, elas podem sim, visualmente

“limpar” o ambiente, porém os efeitos se perpetuam de alguma forma.

Outro problema é que a maioria das refinarias libera grandes volumes de

efluentes (por exemplo, água de formação) diretamente nos ambientes aquáticos.

Pode-se afirmar que, diariamente, a média de descarga de efluentes de uma

99

refinaria típica de Ontário era de 11.370 m3 em 1989 (Chapman e Loo-sy, 1990),

resultando em uma poluição crônica, altamente prejudicial aos organismos.

Embora seja registrado na literatura que a similaridade da seqüência da

CYP1A entre espécies de peixes não é muito alta (Cousinou et al., 2000), e, talvez,

devido à dificuldade de encontrar e confirmar esta seqüência, haja poucos trabalhos

que descrevem a expressão do gene cyp1a, o presente trabalho teve sucesso na

obtenção da seqüência e, além disso, confirmou-se a similaridade com outras

seqüências de outras espécies de peixes. Embora a Amazônia possua uma grande

diversidade de espécies de peixes, a maior do planeta, o conhecimento genético

que se tem sobre essas espécies é pequeno e os estudos geralmente concentram-

se em espécies migradoras como o tambaqui, Colossoma macropomum. Em se

tratando de bioindicador de contaminação com petróleo, uma espécie migradora

não seria muito desejável, pois ela tem a capacidade de fugir rapidamente do

ambiente contaminado. Por isso estudamos o A. ocellatus, peixe de hábito

territorial.

A relação entre as características físico-químicas dos ecossistemas

aquáticos e a toxicidade do petróleo no contexto de ambientes amazônicos ainda é

pouco entendida. Dados da literatura indicam que a presença de compostos

orgânicos na água como as substâncias húmicas (SH) afeta a solubilidade e a

biodisponibilidade de contaminantes lipofílicos. Dentro do contexto dos sistemas de

água preta ou branca da Amazônia, a concentração de SH é, provavelmente, um

dos fatores químicos de maior relevância, modulando a toxicidade do petróleo aos

organismos, porém esses mecanismos ainda não estão completamente

esclarecidos (Matsuo, 2004).

100

PAHs são compostos hidrofóbicos e no ambiente aquático eles aderem

rapidamente ao sedimento e a outras partículas (Varanasi, 1989), o que causa

muita preocupação na região do Urucu, uma vez que este rio é um tributário do Rio

Solimões, altamente rico em material em suspensão. No caso de um derramamento

de petróleo, esses PAHS adeririam facilmente a essas partículas e seriam

depositadas no sedimento ou ficariam disponíveis para a tomada por organismos

aquáticos.

A luz solar pode iniciar ou induzir efeitos tóxicos. Em determinados

ambientes, a fototoxicidade provoca alterações nos PAHs causando

mutagenicidade e carcinogenicidade. Portanto, a toxicidade (aguda ou sub-letal)

destas substâncias podem aumentar significativamente se os organismos estão

expostos a radiação UV. Esta fototoxicidade pode ocorrer mesmo se os organismos

são removidos da exposição química antes da radiação, indicando que a atividade é

devida à absorção ou acúmulo de moléculas (Allred e Giesy, 1985; Ankley et al.,

1994; Wernersson e Dave, 1998). A fototoxicidade induzida por PAHs tem sido

observada em vários organismos aquáticos, incluindo peixes (Kagan et al., 1985,

1987; Weinstein et al., 1997), zooplâncton (Trucco et al., 1983; Allred e Giesy,1985;

Holst e Giesy, 1989) e anfíbios (Kagan et al., 1984, 1985, 1987; Hatch e Burton,

1998); assim como em células humanas (Kagan et al., 1989; Mauthe et al., 1995) e

plantas (Zweig e Nachtigall, 1975; Huang et al., 1993; Ren et al., 1994, 1996; Krylov

et al., 1997).

O desequilíbrio ecológico causado por um derramamento de petróleo

também é outro motivo de preocupação. Avaliação em algumas áreas onde houve

derramamento de petróleo como no caso do petroleiro Exxon Valdez, observou-se

que macro-algas dominantes e invertebrados sésseis e raspadores, que vivem em

101

substratos rochosos, sofreram alta mortalidade devido ao efeito do óleo.

Conseqüentemente, outras espécies de algas cresceram abundantemente devido à

ausência dos invertebrados raspadores (Peterson, 2001). A observação deste boom

de algas após esse derrame tem sido atribuída à mortalidade seletiva dos

raspadores de algas, ocorrendo, assim, um desequilíbrio ecológico total.

Na Amazônia um derrame de petróleo seria uma grande catástrofe. As

peculiaridades deste ambiente de água doce serviriam como potencializadoras dos

efeitos causados por petróleo. Por exemplo, a baixa salinidade e as oscilações na

concentração de O2, as presenças de luz UV intensa e de SH, agravariam esses

efeitos, seja eles causados por um derramamento na forma de óleo cru ou fração

solúvel. Desta forma, estudos sobre biomarcadores moleculares de exposição às

frações subletais são necessários a fim de se detectar uma exposição a esse tipo

de contaminante, quando ainda podemos tomar medidas de mitigação. Um

derramamento no “local errado” ou na “hora errada” poderia colocar em risco a

existência de espécies endêmicas e causar sua extinção.

O presente trabalho mostrou claramente que o gene Cyp1A pode ser um

forte aliado no acompanhamento da qualidade do ambiente no que se refere à

presença de petróleo. A espécie Astronotus ocellatus, usada no presente estudo,

responde de forma significativa condições de baixas de contaminação ambiental por

petróleo.

102

5. Conclusões

Exposição ao óleo cru:

• Exemplares de Astronotus ocellatus apresentam alta mortalidade quando

expostos a concentrações de óleo cru a partir de 0,449% em condições de

hipoxia;

• Em concentrações superiores a 1,78% de óleo cru em condições de hipoxia,

não há sobrevivência de indivíduos de A. ocellatus;

• Indivíduos de Astronotus ocellatus expostos ao petróleo em condições

acidificadas apresentam mortalidade acentuada em relação ao grupo

controle.

Exposição a fração do petróleo:

• Não há mortalidade dos indivíduos de A. ocellatus expostos à fração solúvel

do petróleo nas concentrações entre 0,0061% e 1,56% por 96 horas em

diferentes condições ambientais: regulares, hipóxicas e acidificadas;

• Astronotus expostos ao óleo cru em condições ambientais regulares e

acidificadas apresentam uma crescente expressão do gene cyp1a em

concentrações de até 0,449%; em concentrações superiores, há queda da

expressão, devido a debilidade do organismo;

• Indivíduos de Astronotus expostos ao óleo cru em condições de hipoxia

apresentam uma crescente expressão do gene cyp1a em concentrações de

103

até 0,449%, sendo que na concentração de 0,899% há queda da expressão,

em concentrações superiores, há a morte do indivíduo;

• Indivíduos de Astronotus expostos 96 horas a fração solúvel do petróleo nas

concentrações entre 0,024% e 1,56% em condições ambientais regulares

apresentaram expressão crescente do gene cyp1a;

• Indivíduos de Astronotus expostos por 96 horas a fração solúvel do petróleo

em condições de hipoxia apresentam expressão do gene cyp1a em

concentrações entre 0,0061% e 0,39%;

• Ambientes hipóxicos aumentam a indução da cyp1a em relação a ambientes

em condições regulares;

• Em concentrações acima de 1,56% de fração solúvel do petróleo em

condições ácidas, indivíduos de Astronotus expostos por 96 horas

apresentam queda brusca na expressão do gene cyp1a;

• Indivíduos de Astronotus expostos a fração solúvel do petróleo em ambientes

com baixo pH apresentam expressão da cyp1a a partir da concentração sub-

letal de 0,0061%.

104

Capítulo 3

“Fracionamento do Petróleo de Urucu e aplicação em

embriotestes de Danio rerio”

105

1. Introdução

O petróleo é uma mistura complexa formada por inúmeros compostos de

carbono, sendo que os hidrocarbonetos constituem mais de 75% da fração dos

óleos cru e refinado (Neff, 1979; Hoffman et al., 1995). Os hidrocarbonetos podem

ser de diversos tipos, tais como: parafínicos, monoaromáticos, poliaromáticos,

isoprenóides, entre outros. Importante salientar que o petróleo varia na sua

composição de hidrocarbonetos, dependendo da sua fonte geológica.

Os derramamentos de petróleo são uma das principais fontes de

hidrocarbonetos poliaromáticos (policíclicos aromáticos, PAHs) no ambiente

aquático. Esses constituem uma das frações mais tóxicas do petróleo, que são

solúveis na água, apesar de relativamente voláteis (Alkindi et al., 1996). A

toxicidade dos PAHs deve-se ao seu potencial carcinogênico/genotóxico. Uma vez

absorvidos, são metabolizados pelos organismos, ativando seu metabolismo, o que

geralmente resulta na produção de formas ainda mais reativas do que o composto

original (Stegeman, 1993).

Hidrocarbonetos são quantitativamente os mais importantes compostos

existentes no petróleo e podem ser classificados em três grupos com variadas

subclasses (Freedman, 1989):

1. Hidrocarbonetos alifáticos são compostos saturados de cadeia aberta.

Moléculas insaturadas têm uma dupla ou tripla ligação. Isso está ilustrado pela

seguinte série de dois carbonos alifáticos: etano (H3C-CH3); etileno (H2C=CH2) e

acetileno (HC≡CH). Alifáticos saturados são conhecidos como parafinas ou alcanos

e são quimicamente mais estáveis que os insaturados alifáticos. Esses últimos não

estão presentes no óleo cru, mas podem ser produzidos secundariamente durante o

processo de refinamento industrial, ou fotoquimicamente após um derramamento.

106

2. Hidrocarbonetos alicíclicos têm alguns ou todos seus átomos de

carbono arranjados em uma estrutura de anel e eles podem ser saturados ou

insaturados.

3. Aromáticos são hidrocarbonetos que contém no mínimo um anel de seis

carbonos na estrutura molecular. O anel básico é conhecido como benzeno.

É importante salientar que o tamanho do derrame de petróleo não

necessariamente está relacionado com o potencial do dano que pode causar no

ambiente. Mesmo um pequeno vazamento em um ambiente ecologicamente

sensível, como por exemplo, na Ilha de Galápagos onde existem espécies raras,

pode causar danos severos. Adicionalmente, a composição do petróleo pode

influenciar fortemente os danos (Freedman, 1989).

Em geral, frações leves são mais solúveis na água que as pesadas e os

compostos aromáticos são muito mais solúveis que alcanos. Hidrocarbonetos leves

são mais solúveis na água e têm alta toxicidade. A grande parte dos danos

ecológicos após um derramamento de petróleo está muitas vezes relacionada a

frações leves (Wang et al., 1999; Wang e Fingas, 2003).

Vários estudos recentes têm tentado derivar uma relação empírica entre as

propriedades físico-químicas de hidrocarbonetos e sua toxicidade. Uma importante

observação que tem emergido desses estudos é que a toxicidade de determinados

hidrocarbonetos está relacionada à sua estrutura química e hidrofobicidade

(Hermens et al., 1985).

O petróleo contém diferentes compostos orgânicos. Uma ampla variedade de

técnicas instrumentais e não instrumentais são atualmente utilizadas nas análises

de hidrocarbonetos, as quais incluem cromatografia gasosa (GC), cromatografia

gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC-MS), cromatografia líquida de alta

107

eficiência (HPLC), espectroscopia infravermelha (SFC), ultravioleta (UV) e

espectroscopia fluorescente, espectrometria de massa e métodos gravimétricos

(Wang et al., 1999; Wang e Fingas, 2003). De todas essas técnicas, GC é a mais

usada. Comparada com medidas moleculares de algumas décadas atrás, existe

agora uma técnica mais sofisticada a GC-MS capilar, a qual é capaz de analisar

compostos específicos do óleo e hidrocarbonetos poliaromáticos.

A composição do petróleo varia amplamente e depende da fonte de carbono

da qual o óleo foi gerado e do ambiente geológico. Compostos aromáticos

policíclicos (PACs) são emitidos por processos industriais e combustão ou se

originam de combustíveis fósseis (Brack e Schirmer, 2003; Laflamme e Hites,

1978). Eles ocorrem como misturas complexas no ambiente e são muitas vezes

caracterizados por sua baixa solubilidade na água, havendo tendência para aderir à

matéria orgânica suspendida ou sedimentos no ambiente aquático.

Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAHs) bem como seus derivados

como alquil, oxi, hidroxil, amino e nitro-PAHs, policíclicos quinonas, hidroxiquinonas

e compostos heterocíclicos contendo nitrogênio, oxigênio e enxofre no sistema

aromático são conhecidos por exibir uma grande amplitude de efeitos de risco como

toxicidade aguda, citotoxicidade, efeitos narcóticos e genotóxicos (mutagênico,

carcinogênico, teratogênico) (Delistraty, 1997). Adicionalmente, um número de

PAHs e compostos policlorados como bifenil policlorados (PCBs), naftalenos

(PCNs), dibenzo-p-dioxinas e furanos (PCDDs/Fs) são bem conhecidos pelo seu

potencial de induzir EROD (Ethoxyresorufin O-deethylase) e citocromo P450 (Fent e

Bätscher, 2000). A expressão dessas enzimas pode levar à formação de

metabólitos mutagênicos pela biotransformação oxidativa de compostos contendo

sistema aromático e que então contribuem para o risco carcinogênico.

108

O isolamento de efeitos diretos e identificação de mutagênicos PACs

requerem sofisticados fracionamentos de propriedades físico-químicas dos

compostos que são relevantes para a toxicidade devido à complexidade das

amostras de petróleo. Nos estudos iniciais diferentes métodos foram utilizados com

essa finalidade, incluindo multi-passos líquido-líquido (mult-steps liquid-liquid) e

extração da fase sólida, técnicas de HPLC fase normal e reversa, assim como a

combinação dessas técnicas (Marvin et al., 1995; Meyer et al., 1999; Niederer,

1998; Wesp et al., 2000).

Procedimentos de fracionamento multi-passos em diferentes colunas de

HPLC (Brack et al., 2002) foram usados com sucesso para fracionar extratos de

sedimentos e como tentativa inicial para procedimentos de fracionamento (Zebühr

et al., 1993). Métodos multi-passos têm mostrado o seu potencial para isolar

individualmente PACs, que representam misturas ambientais altamente complexas

com milhares de compostos individuais, em extratos de sedimento (Bandh et al.,

1996; Brack et al., 2002; Brack e Schirmer, 2003). A combinação em série de

diferentes colunas de HPLC possibilita a separação de compostos de acordo com

diferentes propriedades físico-químicas em um único passo. Esta metodologia reduz

o risco de perdas e formação de artefatos devido ao uso de vidraria, mudanças na

concentração e troca de solventes.

1.1 Objetivo

O objetivo principal deste trabalho foi identificar os componentes presentes

na fração solúvel do petróleo de Urucu, os quais induzem fortemente a expressão

do gene cyp1a, pela técnica de fracionamento multi-passos e testar em embriões de

zebrafish.

109

2. Material e Métodos

2.1 Teste para escolha das colunas e eluentes utili zados na extração da fase

sólida da fração solúvel de petróleo de Urucu

Foram testadas três diferentes colunas de extração da fase sólida:

Chromabond Easy; Lichrolut RP-18 e Bakerbond C18 Polar Plus. Além da coluna de

extração da fase sólida também foram testados em cada coluna dois eluentes para

determinação do mais eficaz. Desta forma foram feitos embriotestes testando cada

coluna em dois eluentes: Metanol (ME) e Diclorometano (DCM). Também foram

efetuados controles com água nestas colunas e eluentes, para certificação de que

eles não induziriam o gene cyp1a.

Foram utilizados 20 ml da fração solúvel do petróleo de Urucu (6,25%),

eluídos a vácuo nas colunas acima citadas. Primeiramente fez-se a eluição com

10ml de ME e em seguida com 10ml de DCM. Essas soluções foram concentradas

em rotavapor por cerca de 3 horas. Ao estarem totalmente secas eram adicionados

20ml de Isowasser (água utilizada nos embriotestes, vide composição capítulo 1) e

então essa solução era armazenada a 4°C por 48 hora s. Utilizou-se, então, esses

20 ml para os embriotestes, perfazendo um total de 18 testes (Tabela 1). Em cada

placa havia 30 embriões de D. rerio com 10 ml de solução expostos por 48 horas.

Após a exposição foi feita a extração de RNA e RT-PCR para verificar a indução do

gene cyp1a e decidir qual a melhor coluna e eluente a serem usados nos

experimentos de fracionamento.

Todos os embriotestes com Danio rerio realizados neste capítulo foram

similares ao realizados no capítulo 1, onde está mais detalhada a técnica, mudando

apenas o agente estressor.

110

Tabela 1. Embriotestes realizados com as colunas utilizadas para extrair a fase

sólida da fração solúvel de Urucu. Os experimentos foram feitos com réplica e um

controle para todos utilizando apenas a Isowasser.

Controle – Isowasser Réplica 1 - Fração solúvel Rép lica 2 - Fração solúvel

Backerbond + ME (BMB) Backerbond + ME (BM1) Backerbond + ME (BM2)

Backerbond + DCM (BDB) Backerbond + DCM (BD1) Backerbond + DCM (BD2)

Chromabond + ME (CMB) Chromabond + ME (CM1) Chromabond + ME (CM2)

Chromabond + DCM (CDB) Chromabond + DCM (CD1) Chromabond + DCM (CD2)

Lichrolut + ME (LMB) Lichrolut + ME (LM1) Lichrolut + ME (LM2)

Lichrolut + DCM (LDB) Lichrolut + DCM (LD1) Lichrolut + DCM (LD2)

ME= metanol; DCM= diclorometano.

2.2 Extração da fase sólida da fração solúvel de pe tróleo utilizando

Cromabond easy e Metanol

2.2.1 Preparação da fração solúvel do petróleo de U rucu

Para o fracionamento foi requerido um grande volume de fração solúvel de

petróleo. Desta forma foram adicionados 4687,5 ml de Isowasser (capítulo 1) em

312,5 ml de petróleo (5 L de volume total, que seria 6,25% de petróleo).

Esta mistura foi mantida sob agitação por 24 horas à temperatura ambiente,

ao abrigo da luz para evitar a fotodegradação. A agitação foi realizada em frasco de

vidro com capacidade para 5 L com auxílio de hélice. Após este período a mistura

ficou em repouso por 1 hora, para a separação da fase sólida e líquida do petróleo,

cuidadosamente retirou-se apenas a fase líquida, a qual foi armazenada a 4°C ao

abrigo de luz.

111

Foram extraídos 4.150 ml da fração solúvel do petróleo de Urucu a 6,25%.

Para a extração da fase sólida foi utilizada uma coluna de Chromabond easy, que

foi primeiramente tratada com 100 ml de ME por cerca de 3 horas, para retirada de

qualquer impureza contida na coluna, seguida mais uma vez com água MilliQ, para

retirar o excesso do ME e então foi adicionado o volume de 4.000 ml de fração

solúvel. A eluição da fração solúvel durou cerca de 6 dias, sendo que as

substâncias ficaram contidas na coluna. Depois essa coluna foi tratada com 100 ml

de ME para eluir as frações ligadas à coluna. Para evaporação do ME foi utilizado o

rotavapor em banho-maria com pressão de 337mbar, a 60-70 rpm durante 7 horas.

Esse volume foi reduzido a 4ml. Porém, como o frasco de vidro foi lavado por 3 X

1ml de DCM, obteve-se um volume total de 7ml, esta fração foi conservada em

frasco de vidro âmbar estéril e foi mantida a 4°C a o abrigo da luz.

2.3 Fracionamento com Fase Reversa (RP) C18 - Croma tografia Líquida de

Alta Eficiência (HPLC)

O extrato contendo ME/DCM foi colocado em uma coluna de HPLC-RP C18

e foi eluído com 400 ml de acetonitrila (ACN). Este extrato foi separado em 40

diferentes frações (10ml cada). Esse fracionamento resultou em um volume final foi

de 4000 ml. Esse primeiro fracionamento separa os compostos de acordo com a

sua polaridade. A tendência é começar o fracionamento por compostos mais

polares e terminar com os menos polares.

2.3.1 Embrioteste com as frações do Fracionamento c om RP - HPLC C18

Foram utilizados 10 ml de cada fração seca em nitrogênio líquido (N2). Para

evaporar toda a ACN, foram adicionados 5 ml de Isowasser. Os embriotestes foram

112

feitos com as 40 frações resultantes do RF-HPLC; foi realizado um embrioteste a

cada duas frações contínuas (Fração 1 e 2, Fração 3 e 4... Fração 39 e 40). No total

foram realizadas 20 exposições e dois controles. Os embriotestes continham 10 ml

da solução Isowasser (que continham duas frações de 5 ml cada) em cada placa de

Petri juntamente com 30 embriões de zebrafish (detalhes sobre o embrioteste estão

descritos no Capítulo 1), expostos por 48 horas (2hpf a 50 hpf). Após 48 horas

foram feitas as extrações do RNA e RT-PCR para analisar a expressão do gene

cyp1a (detalhes no capítulo 1). Essas frações foram divididas em regiões para

facilitar as análises: cinco regiões chamadas de A, B, C, D e E. Foram selecionadas

três regiões (B, C e E) que induziram fortemente a expressão do gene cyp1a; as

demais análises foram realizadas apenas com estas três regiões.

Como o petróleo é uma mistura complexa de vários compostos, essa

separação não permitiu a identificação dos compostos por GC-MS (cromatografia

gasosa acoplada à espectrometria de massa), foi necessário realizar um segundo

fracionamento, utilizando a fase normal – HPLC para as frações que induziram

fortemente a cyp1a.

2.3.2 Extração da fase sólida das Frações B, C, e E

As regiões B, C, e E referentes ao fracionamento em NP-HPLC foram

diluídas em ACN; fez-se a extração da fase sólida utilizando novamente o

Chromabond Easy (5g) e ME como eluente. O procedimento foi idêntico ao descrito

em 2.1 e cada região foi diluída em 100ml de ME sendo as frações armazenadas a -

20°C até o momento da análise.

113

2.4 Extração com Fase Normal – HPLC (NP – HPLC)

Foram utilizados 25 ml de cada fração (B, C e E) diluídas em ME. Esses 25

ml de fração foram concentrados em rotavapor a 337pa, com temperatura da água

a 40°C e 50 rpm. Essas frações foram evaporadas até o volume de cerca de 1 ml e

repassadas para um frasco de vidro de 10 ml em forma de funil. A cuba de rotação

foi lavada com 1ml de Diclorometano (DCM), que era adicionado ao vidro. Essas

frações foram secas em N2 e depois de totalmente secas, acrescentava-se 3ml de

Hexano (HX): DCM (9:1). A solução era mantida em frascos de vidro âmbar e

armazenadas a 4°C.

Essa solução de 3ml HX:DCM (9:1) foi injetada na coluna NP-HPLC, e foram

feitas 2 lavagens sucessivas do recipiente com 1 ml de HX:DCM (9:1) para retirada

de qualquer traço de solução no vidro, e então aplicado novamente.

A separação foi feita por um sistema de HPLC composto de: três bombas de

alta pressão (Varian Pro Star, modelo 410, Varian, inc., Palo Alto, EUA); um

autoamostrador (Varian Pro Star, modelo 210, Varian, inc.); um DAD detector

(Varian Pro Star PDA detector modelo 330, Varian, inc.) operado de 200 nm a 400

nm. Adicionalmente foram incluídas 4 válvulas de 6 entradas (I-Valve, ERC GmbH,

Riemerling, Alemanha) e uma válvula de seleção de solvente (Vici Valco

Instruments, Houston, EUA).

Foram usados quatro tipos de coluna de aço inoxidável: (i) nitrofenilpropil

sílica (NO) (21x250 mm, 5 µm Nucleosil 100-5 NO2, Machery e Nagel, Düren,

Alemanha), (ii) cianopropil sílica (CN) (21x250 mm (CN1) e 21x125 mm (CN2), 5 µm

Nucleosil 100-5 CN, Machery e Nagel), (iii) 2-(1-pirenil)-etildimetilsilicato (PYE)

(10x250 mm, 5 µm Cosmosil PYE, média de diâmetro de poro de 120 Å, Nacalai

Tesque, Kyoto, Japão) e (iv) uma coluna de poro de carbono grafitizado (PGC)

114

(Hypersil PGC 10x50 mm, 7 µm, Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, EUA).

Além disso, duas colunas analíticas foram usadas: CN (4x250 mm) e NO

(21x250mm), preenchidas com a mesma fase estacionária descrita acima.

O sistema de NP-HPLC é muito eficiente, por que enquanto a RP-HPLC

separa os compostos de acordo com a polaridade o NP-HPLC separa os compostos

levando em consideração vários outros critérios, que serão vistos a seguir. Um

sistema automático NP-HPLC baseado no procedimento de fracionamento foi

desenhado para seguir a separação de alcanos, PCBs, PCDDs/Fs e PCNs, PAHs,

oxi, hidroxi, nitro-PAHs, e outros compostos polares. Isto é feito por uma

combinação em série de três diferentes colunas, operadas em modo de fluxo e

refluxo.

O princípio das características de retenção de quatro diferentes fases

estacionárias e sua posição no fracionamento automatizado é o seguinte:

compostos polares são retidos na fase CN, a primeira fase estacionária no

procedimento de coluna. Analitos são principalmente separados de acordo com sua

polaridade e habilidade de se ligar ao hidrogênio. Compostos apolares como PAHS

e PACs clorados eluem rapidamente e são de fácil separação dos PACs mais

polares.

A fase NO está localizada na segunda posição e se ligam a ela compostos

poliaromáticos apolares como PAHs e alquilados PAHs, S e O-heterocíclicos,

enquanto que (clorados) a-, mono- e compostos diaromáticos eluem direto para a

fase PGC/PYE. No sistema que não contém elétron π, o grupo nitrofenil age como

aceptor de elétron e retém analitos com sistemas aromáticos ricos em elétrons,

como PAHs. As colunas PYE ou PGC estão arranjadas na terceira posição, onde

115

são retidos basicamente compostos diaromáticos clorados incluindo PCBs, PCNs,

PCDDs/Fs.

Um procedimento de separação em série que segue grupos específicos no

fracionamento de uma ampla variedade de compostos pelo gradiente de eluição e

troca de colunas foi desenvolvido e avaliado. Para esta proposta, quatro diferentes

fases estacionárias foram primeiramente avaliadas por sua capacidade de retenção.

O segundo método de fracionamento foi desenvolvido incluindo o protocolo do

sistema HPLC, troca de colunas, composição do solvente, janelas de gradiente e

fracionamento. Em seguida, foram determinados os parâmetros: recuperação de

massa e compostos, assim como a reprodutibilidade do tempo de retenção. Ao

mesmo tempo o controle do solvente das quatro colunas foi efetuado no

procedimento de fracionamento por meio de testes de efeitos mutagênicos, para

evitar o uso de controles tóxicos e tornar possível o uso das colunas.

2.5 Embriotestes com as frações do NP-HPLC

Ao final da NP-HPLC obteve-se um total 72 frações, sendo 18 de cada

amostra B, C, E e mais 18 controles referentes a RP-HPLC. Essas frações foram

mantidas em freezer -20°C. Cada uma das 72 frações foi reduzida 1,5 ml e desse

volume foram retirados 100 µl expostos ao N2 a fim de secar e então foi adicionado

10ml de Isowasser, permanecendo à temperatura de 4°C por 48 horas, procedendo-

se à análise dos embriotestes. Foram expostos 30 embriões de zebrafish em cada

placa por 48 horas, com 10 ml de cada fração. Após a exposição foi feita a extração

de RNA e RT-PCR para identificação das frações que induziriam fortemente a

expressão do gene cyp1a, para a continuidade da análise por GS-MS.

116

2.6 Identificação dos compostos que induziram a cyp1a por GC-MS

Foi usado para determinação de recuperação um cromatógrafo Agilent 6890

(Agilent Technologies, Santa Clara, EUA) acoplado a um detector seletivo de massa

Agilent 5973 (Agilent Technologies). A GC foi equipada com um HP5MS (Agilent

Technologies) fundido a coluna capilar de sílica (31,8 m x 0,25 mm i.d., 0,25 µm) e

um autoamostrador Agilent 7683 Series (Agilent Technologies). O gás transportador

foi o hélio com fluxo constante de 1,3 ml min-1. Foi injetada 1 µl de amostra

diretamente a 250°C de temperatura no injetor. A te mperatura do forno foi

programada de 60°C a 150°C com uma taxa de 30°C min -1 seguida da taxa de 6°C

min-1 até 186°C, e subseqüente aquecimento para 280 °C c om 4 °C min -1 mantido

por 21,5 min. O detector seletivo de massa foi operado em modo scan ou em

monitoramento simples (SIM).

117

3. Resultados

3.1 Extração da fase sólida da fração solúvel de pe tróleo de Urucu utilizando

Chromabond easy e metanol

Foram testados 20 ml de fração solúvel do petróleo de Urucu em cada

coluna: Chromabond Easy juntamente com os eluentes ME e DCM; testando a

eficiência para dar continuidade com os 4.150 ml de fração solúvel 6,25%. Esses 20

ml foram utilizados nos embriotestes com réplica, com o objetivo de verificar quais

das colunas e eluentes continham as substâncias indutoras do gene cyp1a em D.

rerio. Os resultados com as expressões mais fortes indicavam a coluna e o eluente

capazes de reter essas substâncias. As expressões foram mais fortes nas

extrações com Chromabond easy usando o metanol como eluente (Figura 1).

Figura 1. Resultado em gel de agarose da expressão dos genes ß-actina (controle

constitutivo) e cyp1a: 1 - 6 = controle apenas com Isowasser; 7- 12 = 6, 25% de

fração solúvel do óleo de Urucu, réplica 1; 13 -18 = 6,25% da fração solúvel do óleo

de Urucu, réplica 2. M= marcador de peso molecular Ladder 100pb.

LichrolutRP 18

Chromabondeasy

Bakerbond C18

ME (1, 7, 13)

DCM (2, 8, 14)

ME (3, 9, 15)

DCM (4, 10, 16)

ME (5, 11, 17)

DCM (6, 12, 18)

LichrolutRP 18

Chromabondeasy

Bakerbond C18

ME (1, 7, 13)

DCM (2, 8, 14)

ME (3, 9, 15)

DCM (4, 10, 16)

ME (5, 11, 17)

DCM (6, 12, 18)

ME (1, 7, 13)

DCM (2, 8, 14)

ME (1, 7, 13)

DCM (2, 8, 14)

ME (3, 9, 15)

DCM (4, 10, 16)

ME (3, 9, 15)

DCM (4, 10, 16)

ME (5, 11, 17)

DCM (6, 12, 18)

ME (5, 11, 17)

DCM (6, 12, 18)

M

118

3.2 Fracionamento com RP - HPLC C18 e expressão do cyp1a

Após extrair a fase sólida da fração solúvel do petróleo de Urucu com a

coluna Chromabond easy e ME, efetuou-se então o primeiro fracionamento pela

técnica de RP-HPLC, resultando em 40 diferentes frações, que foram separadas de

acordo com a polaridade, sendo que os compostos apolares mostraram-se

indutores da expressão do gene cyp1a nos embriotestes. O cromatograma

mostrando os picos do fracionamento, o resultado dos embriotestes e a

normalização do gene cyp1a em relação à ß-actina estão expostos na Figura 2.

Figura 2. Cromatograma mostrando os picos de absorção dos compostos do

fracionamento da fração solúvel do petróleo de Urucu (A); gel de agarose da

expressão do cyp1a e ß-actina em D. rerio (B) e a normalização do cyp1a em

relação à ß-actina (C).

Normalisiert

0,00E+00

2,00E-03

4,00E-03

6,00E-03

8,00E-03

c1 c2 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 w Fraktionierung

Trans

kripte (Molek

üle/µl)

Transcripto

(molécula/ul)

Normalizacao cyp1a

Fracao

Normalisiert

0,00E+00

2,00E-03

4,00E-03

6,00E-03

8,00E-03


Trans

kripte (Molek

üle/µl)

Transcripto

(molécula/ul)

Normalizacao cyp1aNormalisiert

0,00E+00

2,00E-03

4,00E-03

6,00E-03

8,00E-03


Trans

kripte (Molek

üle/µl)

Transcripto

(molécula/ul)

Normalizacao cyp1a

Fracao

-300

-200

-100

0

100

200

300

400

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Fraktionen 13-21

Fra

ktion

29

Chromatogramm wässriger Ölextrakt

cyp1a

actina

Lipofílicos

B C E mais lipofílicosmais polares

Abso

rcao

UV

-300

-200

-100

0

100

200

300

400

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Fraktionen 13-21

Fra

ktion

29


cyp1a

actina

-300

-200

-100

0

100

200

300

400

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Fraktionen 13-21

Fra

ktion

29


cyp1a

actina

Lipofílicos

B C E mais lipofílicosmais polares

Abso

rcao

UV

A

C

B

119

As regiões B, C e E (Figura 2) foram selecionadas para o fracionamento por

NP-HPLC, uma vez que não foi possível identificar os compostos individualmente,

devido a sua complexidade. Foi realizada a extração da fase sólida mais uma vez

com a coluna Chromabond easy usando 100 ml de ME em cada fração B, C e E.

3.3 Fracionamento com NP – HPLC e expressão do gene cyp1a

O fracionamento pela técnica NP-HPLC foi realizado com sucesso. As

frações B, C e E resultaram cada uma em 18 frações, nas quais foram realizados

embriotestes, afim de saber quais dessas frações induziam fortemente o gene

cyp1a. Na fração B, as frações que mais induziram a expressão da cyp1a nos

embriotestes de D. rerio foram 10-12 e 16-18, regiões onde estão localizados

compostos com ligações apolares poliaromáticas (PAHs) e área que contém

compostos de polaridade média com ligações aromáticas (PAHs oxidados) (Figura

3).

Figura 3. Resultado em gel de agarose do embrioteste do fracionamento NP-HPLC

da fração B. As regiões marcadas em cores se referem as frações que induziram

fortemente a expressão do gene cyp1a e usadas para identificação dos compostos

por GC-MS. C= controle. M= marcador de peso molecular Ladder 100pb.

120

As frações C (Figura 4) e E (Figura 5) apresentaram o mesmo

comportamento em relação à expressão da cyp1a nos embriotestes com o D. rerio.

As frações que apresentaram as expressões mais fortes foram 10 e 15-18, frações

onde estão localizados compostos com ligações apolares poliaromáticas (PAHs) e

área que contém compostos de polaridade média a polares com ligações

aromáticas (PAHs oxidados).


da fração C. As regiões marcadas em cores indicam as frações que induziram

fortemente a expressão do gene cyp1a; e que foram usadas para identificação dos

compostos por GC-MS. C= controle. M = marcador de peso molecular Ladder 100

pb.

121


da fração E. As regiões marcadas em cores indicam as frações que induziram

fortemente a expressão do gene cyp1a e que foram usadas para identificação dos

compostos por GC-MS. C= controle. M = marcador de peso molecular Ladder 100

pb.

3.4 Identificação dos compostos que induziram o gen e cyp1a por GC-MS

A identificação dos compostos presentes nas frações B, C e E foi feita por

cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC-MS). Na fração B

foram identificados os compostos presentes nas subfrações 11, 12, 16 e 17 (Tabela

2). Em cada subfração algumas vezes foram encontrados mais de um composto, a

fração B11 continha 2 diferentes compostos, a fração B12 continha um composto,

B16 três compostos e B17 continha dois compostos, num total de sete compostos.

122

Tabela 2. Compostos identificados com GC-MS na fração B do NP-HPLC.

Fração Nome do composto Fórmula Estrutura

B 11 benzo carbazol C16H11N

(ma inlib ) Benzo(c)carbazole60 80 100 120 140 160 180 200 220

0

50

100

63 74 8294

108

150 163189

217

N

B 11 4-nitro-benzaldeído C7H5NO3

(rep lib) Benzaldehyde, 4-nitro-50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

0

50

100

51

65

77

85

92

105

120

135

151

N

OO

O

B 12

B 16

2-cloro-1-(2,4-diclorofenil)-

etanona

C8H5Cl3O

(mainlib) Ethanone, 2-chloro-1-(2,4-d ichlorophenyl)-70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190

0

50

100

75

79 84 99

109

123 138

145

159

173

187

ClCl

O

Cl

B 16 9H-Fluoreno -9 – ol C13H10O

(mainlib ) 9H-Fluoren-9-ol30 50 70 90 110 130 150 170 190 210

0

50

100

39 50 6376 90 98 110 126 139

152

165

181

OH

123

Na fração C foi foram identificadas as frações 15, 16 e 17 (Tabela 3), num

total de 9 compostos diferentes, sendo que nas frações C15 foram identificados 3

diferentes compostos e C16 dois compostos. Na fração C17 foram encontrados 4

compostos diferentes.

B 16 bis(fenilmetil)-N, N-

benzenmetanamina

C12H21N

(mainlib) Benzenemethanamine, N,N-bis(phenylmethyl)-30 60 90 120 150 180 210 240 270 300

0

50

100

39 51

65

77

91

118 165181

210287

N

B 17 2,4,5-trimetil-benzenamine C9H13N

(rep lib) Benzenamine, 2,4,5-trimethyl-30 50 70 90 110 130 150 170 190 210

0

50

100

30

3951 65

77

91

103

120

135

H2N

B 17 benzoacridina C17H11N

(replib) Benzo(a)acrid ine30 50 70 90 110 130 150 170 190 210 230

0

50

100

50 63 7588

101

114

126 150 175 187201

229

N

124

Tabela 3. Compostos identificados com GC-MS na fração C do NP-HPLC.


C 15 Acetofenona C8H8O

(rep lib) Acetophenone30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

0

50

100

39

43

51

57 63

77

88 101

105

120

O

C 15 3-(1-metiletil)-fenol C9H12O

(rep lib) Phenol, 3-(1-methylethyl)-30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150

0

50

100

3944 51

6573

77 91

103

107

121

136

OH

C 15 2,4,5-trimetil- fenol C9H12O

(rep lib) Phenol, 2,4,5-trimethyl-30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150

0

50

100

31

3951 65

77

91

103 115

121

127

136

HO

C 16 3-bromoheptano C7H15Br

(mainlib) Heptane, 3-bromo-30 40 50 60 70 80 90 100 110

0

50

100

30

39

4143

53

55

57

6369

73 77 81 85 93

99

106

Br

125

C 16 diisopropilnaftaleno

(2 isômeros)

C16H20

(mainlib) 2,6-Diisopropylnaphthalene30 50 70 90 110 130 150 170 190 210 230

0

50

100

43

51 63 76 9199

115 128

155

165

181

197

212

C 17 N-formilmorfilina C8H8O2N

(mainlib) N-Formylmorpholine30 50 70 90 110 130 150 170 190 210

0

50

100

30

42 56

72

86100

115

N

O

O

C 17 ácido cloroacético,

morfolide

C6H10ClNO

2

(mainlib) Chloroacetic acid , morpholide30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170

0

50

100

30

42

49

56

70

77

86

91

98

105

114

119

128

134

148 163

O

ClN

O

C 17 6-metilfenantridina C14H11N

(mainlib) 6-Methylphenanthridine30 50 70 90 110 130 150 170 190 210

0

50

100

39 50 6376 96

110 124 139151 165 178

193

N

C 17 2,4,5-trimetil-

benzenamina

C9H13N

(rep lib) Benzenamine, 2,4,5-trimethyl-30 50 70 90 110 130 150 170 190 210

0

50

100

30

3951 65

77

91

103

120

135

H2N

126

Foi possível identificar na fração E apenas as frações 17 e 18 (Tabela 4),

sendo 3 diferentes compostos na fração E17 e um na E18.

Tabela 4. Compostos identificados com GC-MS na fração E do NP-HPLC.


E 17 ácido cloroacético,

morfolide

C6H10ClNO2

(mainlib) Chloroacetic acid, morpholide30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170

0

50

100

30

42

49

56

70

77

86

91

98

105

114

119

128

134

148 163

O

ClN

O

E 17 ácido p-metilcinâmico C10H10O2

(ma inlib) p-Methylcinnamic acid30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170

0

50

100

39

4451 57

6577

91

105

115

125 134

147

162

OH

O

E 17 Acridina C13H9N

(rep lib) Acrid ine30 50 70 90 110 130 150 170 190 210

0

50

100

39 50 63 7689

101 113 126151

164

179

N

E 18 dibenzo(a,j)acridina C21H13N

(replib) Dibenz[a ,j]acrid ine30 60 90 120 150 180 210 240 270

0

50

100

139 250

279

N

127

4. Discussão

Os derramamentos acidentais de petróleo são freqüentes, causando

extensivos danos às vida marinha, vida terrestre, saúde humana e de recursos

naturais. O óleo cru é uma matriz complexa de diferentes compostos orgânicos

formado por uma variedade de materiais orgânicos que são quimicamente

convertidos sobre diferentes condições geológicas durante longos períodos de

tempo. O óleo cru contém carbono e hidrogênio (os quais formam uma ampla

variedade de hidrocarbonetos, de gases leves a resíduos pesados), mas também

contém pequenas quantidades de enxofre, oxigênio e nitrogênio, assim como

metais como níquel, vanádio e ferro (Freedman, 1989; Kingston, 2002; Wang e

Fingas, 2003).

O petróleo, dependendo da sua origem geológica, apresenta-se com uma

composição variada de componentes e os óleos podem ser classificados como

leves e pesados, os quais, em um derramamento, evaporam ou se dissolvem e

dispersam na coluna d’água (Freedman, 1989; Volkmann et al., 1994). Óleos leves

são conhecidos por uma alta proporção de aromáticos voláteis em sua constituição,

alguns dos quais se dissolvem mais rapidamente (Volkmann et al., 1994). Alguns

desses produtos, tais como ácidos aromáticos e alifáticos, álcoois aromáticos de

médio peso molecular e éteres são solúveis na água (Freedman, 1989; Volkmann et

al., 1994; Kingston, 2002).

Os efeitos causados pela exposição à fração solúvel do petróleo são variados

e a maioria dos efeitos tóxicos é causada por derivados aromáticos solúveis em

água oriundos de derramamentos de petróleo (Payne e Phillips, 1985). Os

hidrocarbonetos hidrossolúveis de baixo peso molecular são os mais tóxicos. Os

peixes podem acumular hidrocarbonetos solúveis de petróleo muito rapidamente.

128

Peixes colocados em água contaminada por petróleo absorveriam hidrocarbonetos

até estabilizar a quantidade existente entre a água e o peixe (Collier et al., 1995).

Neste trabalho os resultados dos capítulos 1 e 2 sugerem que alguns

componentes do petróleo são indutores do gene cyp1a. No entanto, não se definiam

quais seriam os indutores em potencial, levando-nos a realizar o fracionamento da

fração solúvel do óleo de Urucu, para identificação dos compostos que induzem o

gene cyp1a.

No primeiro fracionamento pela técnica de RP - HPLC, que separa os

compostos de acordo com a sua polaridade, não foi possível identificar quais os

compostos presentes na fração solúvel do petróleo de Urucu que induziriam o gene

cyp1a em D. rerio. As frações que obtiveram uma maior resposta, induzindo a

expressão do gene cyp1a foram selecionadas para um próximo fracionamento pela

técnica NP – HPLC, que leva em consideração vários outros fatores além da

polaridade.

Após dois fracionamentos por RP e NP – HPLC e identificação dos

compostos por GC-MS, conseguiu-se identificar as substâncias que induziam o

gene cyp1a. Os compostos que induziram fortemente o gene cyp1a foram os

hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAHs).

Os PAHs são uma classe de substâncias orgânicas diversas (Harvey, 1997)

que podem ser encontradas em uma ampla variedade de fontes, ou como

contaminantes ambientais ou como produtos naturais. Devido ao caráter lipofílico,

PAHs podem facilmente atravessar membranas lipídicas e são potencialmente

bioacumulados em organismos aquáticos. Embora positivamente correlacionado, o

coeficiente de partição (Kow), peso molecular e a bioconcentração de PAH podem

ser significativamente reduzidos por fatores como biotransformação (Readmam et

129

al., 1982). Portanto, diferentemente dos hidrocarbonetos planares halogenados

(PHHs), PAHs não clorados bioacumulam-se em tecidos de peixes e seriam

rapidamente metabolizados pela enzima CYP1A. Os PHHs são potentes

moduladores de crescimento e diferenciação celular e, portanto, são altamente

tóxicos aos vertebrados (Poland e Knutson, 1982).

Vários são os estudos sobre o efeito do óleo cru e PAHs no ambiente,

especialmente marinho, que avaliam aspectos moleculares e populacionais, como

taxas de sobrevivência. Exposição a esses dois contaminantes têm um efeito

significativo na sobrevivência e taxas de deformidades entre os embriões de

tartarugas (Van Meter et al., 2006). Embora a exposição ao óleo cru não pareça

causar mais danos ao desenvolvimento do embrião em comparação ao PAH isolado

(Van Meter et al., 2006), foram observadas modificações no DNA incluindo quebra

de fita, modificação nas bases de DNA, cross-links e depurinação associadas à

exposição de um grande número de contaminantes, incluindo PAHs (Steinert, 1996;

Steinert et al., 1998). Roy e colaboradores (2003) observaram que havia uma

relação entre danos no DNA e PAHs de alto e baixo pesos moleculares (r2=0,66;

p=0,014). Exposição a PAHs também suprimiram a produção de anticorpos em

testes de laboratórios em animais e mamíferos marinhos (Kerkvliet et al., 1990,

Lahvis et al., 1995), aumentando a vulnerabilidade a bactérias, vírus e protozoários

(Vos e Luster, 1989).

O citocromo p450 (CYP) se expressa frente a uma ampla variedade de

contaminantes, demonstrando ser um biomarcador eficiente, incluindo PAHs

provenientes de várias fontes, como petróleo (Willet et al., 2001). Indução de CYP

total e a isoforma CYP1A após exposição à PAHs em estudos de campo e

laboratoriais, têm sido bem documentados em peixes de água doce e marinhos

130

(Buhler e Wang-Buhler, 1998; Whyte et al., 2000). Essa indução da CYP1A é uma

resposta adaptativa sensível e específica de organismos expostos a uma importante

série de poluentes ambientais tais como: policlorados dibenzo-dioxinas (PCDD) e

dibenzofuranos (PCDF), policlorados bifenis (PCBs) e uma variedade de

hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAHs), policlorados naftalenos e

compostos relacionados. A toxicidade desses compostos é dependente da sua

ligação ao receptor aril-hidrocarbono (AhR) (Fernandez-Salguero et al., 1996).

A indução observada da CYP1A em peixes expostos ao petróleo parece ser

causada por vários compostos lipofílicos de multi-anéis em petróleo, tais como

benzoantraceno, benzo(a)pireno-B(a)P e criseno (Whyte et al., 2000). Em peixes,

CYP1A induzida por não-orto coplanar PCB, 3,3’,4,4’ – tetraclorobifenil (PCB77),

também produziu ROS (espécie reativas de oxigênio), dependente do NADPH

(Puntarulo e Ceberbaum, 1998). Entretanto, a geração de ROS pode ser iniciada

pela indução da CYP no fígado de cormoron selvagens expostos à concentrações

relativamente altas de dioxinas ou compostos semelhantes (Schlezinger et al.,

1999). Esses compostos tóxicos podem causar carcinoma hepatocelular,

imunotoxicidade, dano em de órgãos, distúrbios da reprodução, toxicidade

endócrina e alterações no desenvolvimento (Safe, 1994). Indução de CYP1A por

compostos como dioxina pode contribuir para a geração de ROS (Whyte et al.,

2000) e indução enzimática da CYP1A tem sido relacionada à carcinogênese

(Whyte et al., 2000) e efeitos adversos reprodutivos em peixes (Anderson et al.,

1996). Medidas do citocromo total e atividade da CYP (medida como benzopireno

hidroxilase (BPH) e a CYP1A como proteína imunopositiva (CYP1A – IPP), têm sido

relatados em numerosos trabalhos de campo e laboratório (den Besten, 1998; den

Besten et al., 2001; Danis et al., 2004).

131

Vários são os estudos que defendem o uso da CYP (nas suas variadas

formas) como um biomarcador de poluição ambiental por diferentes contaminantes

individuais ou complexos (como o petróleo). Neste estudo também foi utilizado o

mRNA cyp1a como biomarcador indicando os compostos que provavelmente

seriam os mais tóxicos na fração solúvel do petróleo de Urucu. A identificação

desses compostos tornou-se necessária devido a dois fatores: a elaboração de uma

análise de risco, caso venha a ocorrer um derramamento; e a necessidade de mais

estudos para determinar se a indução observada nesse estudo tem potencial para

comprometer a saúde a longo prazo dessa espécie de peixe.

Como já foram discutidos nos capítulos anteriores deste trabalho, os

derramamentos não têm apenas efeito imediato sobre o ambiente: os efeitos são

variados. Alguns estudos, entretanto, mostram que em relativo “curto espaço de

tempo” há uma recuperação significativa do ambiente. Oito anos após o

derramamento de óleo do Amoco Cadiz, as condições foram revertidas para as

encontradas em lugares onde não houve derrame, mesmo nos lugares onde o

derramamento foi mais intenso (Page et al., 1989). Similarmente, após 3 – 4 anos

do acidente com o Exxon Valdez (1989), os níveis de contaminantes encontrados

naquela área se aproximaram dos níveis encontrados em áreas limpas (Hoff e

Shigenaka, 1999). O peixe pedra foi a única espécie com mortalidade em número

significativamente alto depois do acidente. Muitas espécies de peixe pedra

(Sebastes spp.) das áreas que sofreram derramamento de petróleo e áreas controle

foram analisadas para a verificação de metabólitos de hidrocarbonetos na bile (1989

a 1991) e lesões microscópicas (1990 e 1991). Observou-se que hidrocarbonetos

biliares consistentes com a exposição ao óleo Exxon Valdez estavam elevados em

1989, mas não em 1990 ou 1991 (Marty et al., 2003).

132

Outros trabalhos apontam que em derramamentos de petróleo, o óleo

derramado persistiu por 25 anos ou mais, como foi o caso do acidente ocorrido na

baía de Chedabucto, na Nova Escócia em 1970 (Owens et al., 1999). Novas

evidências sugerem que hidrocarbonetos de petróleo provenientes de

derramamentos podem persistir em sedimentos por décadas (Reddy et al., 2002).

Em casos onde o óleo tem sido eliminado, impactos a longo prazo são geralmente

confinados a anomalias em estrutura de comunidades que persistem devido à

longevidade de seus componentes (Kingston, 2002). Como se vê, a relação entre a

exposição de óleo e seus efeitos não está bem estabelecida, porque,

provavelmente, existe a ausência de informações complementares ao acidente.

Após um acidente com petróleo, ocorre uma série de eventos: espalhamento,

evaporação e solubilização. Uma exposição ao petróleo ocorrida na natureza, é

influenciada por uma série de variáveis, entre elas: a) a quantidade de óleo; b) o

tipo de óleo, e relativa toxicidade dos compostos de hidrocarbonetos; c) persistência

dos resíduos sobre condições ambientais particulares; d) o estado do óleo,

espessura, grau de aquecimento; e) variáveis ambientais que afetam a toxicidade,

tais como vento, clima, oxigênio, presença de outros poluentes e etc.; f) o uso de

dispersantes químicos e g) a sensibilidade da biota específica do ecossistema

impactado. São muitas as informações sobre o óleo e as características do local

que se deveria pesquisar no caso de acidentes, porém dentre as mais importantes

está a composição do óleo. Em adição, com a identificação dos compostos

presentes no petróleo e seu efeito individual poderiam ser investigados

singularmente e/ou em combinação.

Mesmo com as medidas de segurança implementadas para o transporte do

petróleo da reserva de Urucu para a refinaria REMAN em Manaus e outros pontos

133

de distribuição, o risco de acidentes ambientais envolvendo a contaminação de

águas amazônicas é sempre uma preocupação. O impacto do petróleo sobre os

organismos, particularmente em peixes, pode resultar em distúrbios severos,

conforme indicado em vários estudos avaliando alterações em parâmetros

fisiológicos nas espécies da ictiofauna amazônica (Costa et al., 1996; Mendes e Val,

1997; Val, 1997; Duncan, 1998; Brauner et al., 1999; Val e Almeida-Val, 1999;

Almeida-Val et al. 2002; Matsuo et al., 2002; Paula-Silva et al., 2002).

Os derramamentos de petróleo causam danos extensivos para o meio

ambiente. Por isso, para esclarecer dúvidas, a caracterização dos derramamentos e

sua relação com as fontes conhecidas é extremamente importante para a avaliação

dos danos ambientais, entendendo o destino, comportamento e prognóstico do

potencial impacto dos derramamentos no meio ambiente, computando as prováveis

respostas para se adotar ações efetivas de limpeza. Em adição, o sucesso de uma

investigação e as análises do óleo e dos hidrocarbonetos, de produto refinados nos

locais contaminados e receptores fornecem uma riqueza de dados químicos. Estes

dados, em combinação com informações históricas, geológicas, ambientais do sítio

contaminado podem, em muitos casos, ajudar a resolver a reduzir os efeitos sobre a

fauna e a flora.

134

5. Conclusões

• É possível com a técnica multi-steps NP RP-HPLC juntamente com GC-MS

realizar a identificação dos compostos presentes no petróleo.

• Os compostos lipofílicos presentes na fração solúvel do petróleo são os

maiores indutores do gene cyp1a, dentre eles destacam-se os PAHs.

135

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Abu-Bakar, A.; Moore, M.R.; Lang, M.A. 2005. Evidence for induced microsomal bilirubin degradation by cytochrome P450 2A5. Biochemical Pharmacology, 70: 1527–1535.

Achazi, R.K.; Chroscz, G.; Heimig, E.; Neunaber, R.; Steudel, I. 1994. A high

molecular regulator of 7-ethoxyresorufin-O-deethylase activity in fish. Comp. Biochem. Physiol. (C) 108: 243-256.

Alam, S.K.; Brim, M.S. 2000. Organochlorine, PCB, PAH, and metal concentrations in eggs of loggerhead sea turtles (Caretta caretta) from Northewest Florida, USA. Journal of Environemntal Science and Health. B35(6): 705-724.

Alkindi, A.Y.A.; Brown, J.A.; Waring, C.P.; Collins, J.E. 1996. Endocrine, osmorregulatory, respiratory and hematological parameters in flounder exposed to the water solubre fraction of crude oil. J. Fish Biol., 49: 1291-1305.

Allred, P.M.; Giesy, J.P. 1985. Solar radiation-induced toxicity of the anthracene to daphnia-pulex. Environmental Ttoxicology and Chemistry, 4: 219-226.

Almeida – Val, V.M.F.; Val, A.L.; Duncan, W.P.; Souza, F.C.A.; Paula-Silva, M.N.; Land, S. 2000. Scaling effects on hypoxia tolerance in the Amazon fish Astronotus ocellatus (Perciformes: Cichlidae): contribution of tissue enzyme levels. Comparative Biochemistry and Physiology, part (b)125: 219-226.

Almeida-Val, V. M. F.; Duncan, W. P.; Val, A. L. 2002. Crude oil effects on fish of the Amazon: current status. In: Proceedings of the International Congress on the Biology of Fish – Tropical Fish: News and Reviews, Vancouver, p. 49-60

Almeida-Val, V.M.F.; Hockachka, P.W. 1995. Airbreathing fishes: metabolic

biochemistry of the first diving vertebrates. In: Hochachka. P.W.; Mommsen, T. (Eds.) Biochemistry and Molecular Biology of Fishs. Vol. 5. Elsevier Science. Amsterdam. pp.45-55.

AL-Yakoob, S.N.; Gundersen, D.; Curtis, L. 1996. Effects of the water-soluble fraction of partially combusted crude oil from Kuwait’s oil fires (from desert Storm) on survival and growth of the marine fish Menidia beryline. Ecotox. and Environ. Safety 35(2): 142-149.

Anderson, M.B.; Reddy, P.; Preslan, J.E.; Fingerman, M.; Bollinger, J.; Jolibois, L.; Maheshwarudu, G.; George, W.J. 1997. Metal accumulation in crayfish, Procambarus clarkii, exposed to a petroleum-contaminated Bayou in Lousiana. Ecotoxicol. and Enviromen. Safety., 37: 267-272.

Anjos, N.A. 2003. Elementos-traços presentes no petróleo: Bioacumulação em duas espécies de peixes comerciais da região do Rio Urucu, AM. Manaus INPA-UFAM. Dissertação de Mestrado. xiv + 79pp.

136

Ankley, G.T.; Collyard, S.A.; Monson, P.D.; Kosian, P.A. 1994. Influence of ultraviolet light on the toxicity of sediments contaminated with polycyclic aromatic hydrocarbons. Environ. Toxicol. Chem., 13: 1791–1796.

Appenzeller, O.; Minko, T.; Qualls, C.; Pozharov, V.; Gamboa, J.; Gamboa, A.; Pakunlu, R.I. 2006. Chronic hypoxia in Andeans; are there lessons for neurology at sea level? Journal of the Neurological Sciences, 247: 93 – 99.

Applegate, L.A.; Luscher, P.; Tyrrel, R.M. 1991. Induction of heme oxygenase: a general response to oxidant stress in cultured mammalian cells. Cancer Res. 51: 974–978.

Araújo, R.M.; Nozawa, S.R.; Ferreira-Nozawa, M.S.; Nascimento, T.L.A.S.; Oliveira,

A.M.; Oliveira, S.S.; Branda, V.M.; Honda, H.T.; Chippari-Gomes, A.R.; Paula-Silva, M.N.; Val, A.L.; Almeida – Val, V.M.F. 2005. Expressão do gene ldha em Astronotus ocellatus expostos a condições estressantes: Hipóxia e petróleo vs. Dispersante químico. Anais I Congresso Internacional Piatam Ambiente, Homem, Gás e Petróleo. 118p.

Aride, P. H. R. 1998. Efeito do pH da água nos parâmetros hematológicos e ganho

de peso de Colossoma macropomum Cuvier, 1818. Dissertação de Mestrado, INPA/UFAM, Manaus, AM, 52p.

Ascón, G. 2000. Efeito do pH, do cálcio e do oxigênio sobre a regulação iônica

(sódio, potássio e cálcio) na fase inicial do desenvolvimento embrionário de tambaqui, Colossoma macropomum Cuvier 1818 (Osteichthyes, Characiformes). Dissertação de Mestrado, INPA/UFAM, Manaus, AM, 42p.

Atwood, D.K.; Burton, F.J.; Corredor, J.E.; Harvey, G.R.; Mata-Jimenez, A.J.; Vasquez-Botello, A.; Wade, B.A. 1987. Results of the CARIPOL petroleum pollution monitoring project in the winder caribean. Mar. Pollut. Bullet., 18: 540-548.

Ba-Akdah, M. 1996. Patterns in the uptake, release, distribution and transfer of petroleum hydrocarbons in marine organisms. Ph.D. thesis. Heriot-Watt University, Edinburgh.

Baker, J.M., 1991. Guidelines on the biological impact ofoil pollution. IPEICA Report Series 1: 1–15.

Bandh, C.; Ishaq, R.; Broman, D.; Näf, C.; Rönquist-Nii, Y.; Zebühr, Y. 1996. Separation for subsequent analysis of PCBs, PCDD/Fs, and PAHs according to aromaticity and planarity using a two-dimensional HPLC system. Environmental Science and Technology 30: 214-219.

Bard, S. M.; Woodin, B.R.; Stegeman, J.J. 2002. Expression of P- glycoprotein and cytochrome P450 1A in intertidal fish (Anoplarchus purpurescens) exposed to environmental contaminants. Aquatic Toxicology , 60: 17-32.

137

Bartlett, J.H.G.; Mageean, D.M.; O’Connor, R.J., 2000. Residential expansion as a continental threat to U.S. coastal ecosystems. Popul. Environ., 21: 429-468.

Bastos, M. S.; Val, A. L. 1995. Efeito do petróleo e nitrito de sódio sobre os

parâmetros hematológicos, equilíbrio ácido-base e eletrólitos de acará-disco (Symphysodon aequifasciata). Anais da IV Jornada de Iniciação Científica do Estado do Amazonas, p. 168.

Basu, N.; Todgham, A.E.; Ackerman, P.A.; Bibeau, M.R.; Nakano, K.; Sculte, P.M.;

Iwama, G.K. 2002. Heat protein genes and their functional significance in fish. Gene, 295: 173-183.

Billiard, S. M.; Hahn, M. E.; Franks, D. G.; Peterson, R. E.; Bols, N. C.; Hodson, P. V. 2002. Binding of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) to teleost aryl hydrocarbon receptors (AHRs). Comp. Biochem. and Physiol., Part (B) 133: 55–68.

Bishop, C.A.; Ng, P.; Norston, R.J.; Brooks, R.J.; Pettit, K.E. 1996. Temporal and geografic variation of organochlorine residues in eggs of the common snapping turtle (Chelydra serpentine serpentina) (1981-1991) and comparisions to trends in the herring gull (Larus argentus) in the Great Lakes Basin in Ontario, Canada. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 31: 512-524.

Bishop, C.A.; Ng, P.; Pettit, K.E.; Kennedy, S.W. Stegeman, J.J.; Norston, R.J.; Brooks, R.J. 1998. Environmental Contamination and developmentl abnormalities in eggs and hatchlings of the common snapping turtle (Chelydra serpentine) from the Great Lakes – St. Lawrence River basin (1989-91). Environmental Pollution, 101: 143-156.

Boehm, P. D.; Quinn, J. G. 1973. Solubilisation of hydrocarbons by the dissolved organic matter in sea water. Geochimica Cosmochimica Acta 37: 2459-2477.

Bowman,C.J.; Denslow, N.D. 2000. Development and validation of a species-and gene-specific molecular biomarker: vitellogenin mRNA in largemouth bass (Micropterus salmoides). Ecotoxicology, 8: 399-416.

Brack, W.; Schirmer, K. 2003. Effect-directed identification of oxygen and sulphur heterocycles as major polycyclic aromatic cytochrome P4501A-inducers in a contaminated sediment. Environmental Science and Technology, 37: 3062-3070.

Brack, W.; Schirmer, K.; Kind, T.; Schrader, S.; Schüürmann, G. 2002. Effect-

directed fractionation and identification of cytochrome P4501A-inducing halogenated aromatic hydrocarbons in a contaminated sediment. Environmental Toxicology and Chemistry, 21: 2654-2662.

Braum, E.; Junk, W.J. 1982. Morphological adaptation of two Amazonian characoids (Pisces) for surviving in oxygen deficient waters. Ver. Gesamten Hydrobiol., 67: 869-886.

138

Brauner, C. J.; Ballantyne, C. L.; Vijayan, M. M.; Val, A. L. 1999. Crude oil exposure affects air-breathing frequency, blood phosphate levels and ion regulation in air-breathing teleost fish, Hoplosternum littorale. Comparative Biochemistry and Physiology, 123C: 127-134.

Brauner, C.J.; Val, A.L.; Randall, D.J. 1993. The effect of graded hemoglobin levels on the swinning performance of chinook salmon (Oncorhynchus tshawtscha). Journal of Experimental Biology,. 185: 121-135

Brinkworth, L.C.; Hodson, P.V.; Tabash, S.; Lee, P. 2003. CYP1A induction and blue sac disease in early developmental stages of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) exposed to retene. Journal of Toxicology and Environmental Health, part a 66: 47-66.

Brown, E.D.; Baker, T.T.; Hose, J.E.; Kocan, R.M.; Marty, G.D.; McGurk, M.D.; Norcross, B.L.; Short, J., 1996. Injury to the early life history stages of Pacific herring in Prince William Sound after the Exxon Valdez oil spill. In: Rice, S.D.; Spies, R.B.; Wolfe, D.A.; Wright, B.A. (Eds.), Proceedings of the Exxon Valdez Oil Spill Symposium. American Fisheries Society, Anchorage, AK (USA), pp. 448-462 (25 Feb. 1993).

Buchanan, J.B.; Moore, J.J., 1986. A broad review ofvariability and persistence in the Northumberland benthic fauna. J. Marine Biol. Assoc. UK, 66: 641-657.

Buhler, D.R.; Wang-Buhler, J. 1998. Review: Rainbow trout cytochrome P450s: purification, molecular aspects, metabolic activity, induction and role in environmental monitoring. Comparative Biochemistry and Physiology, Part C 121: 107–137.

Canli, M.; Furness, R.W. 1993a. Heavy metals in tissues of the Norway lobster

Nephrops norvegicus : effects of Sex , size and season . Chem Ecol., 8: 19-32. Canli, M.; Furness, R.W. 1993b. Toxicity of heavy metals dissolved in sea water and

influences of sex and size on metals accumulation and tissue distribution in the Norway lobster Nephrops norvegicus. Mar. Environ. Res., 36: 217-236.

Cao, Z.; Hong, J.; Peterson, R.E.; Aiken, J. M. 2000. Characterization of CYP1A1 and CYP1A3 gene expression in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquatic Toxicology, 49: 101–109.

Carls, M.G.; Rice, S.D.; Hose, J.E. 1999. Sensitivity of fish embryos to weathered crude oil: Part l. Low-level exposure during incubation causes malformations, genetic damage, and mortality in larval pacific herring (Chupea pallsi). Environ. Toxicol. Chem., 18: 481-493.

Castro-Pérez, C. A., 2001. Consumo de oxigênio e fluxo iônico de ovos e larvas de tambaqui, Colossoma macropomum Cuvier, 1818 (Characidae, Serrasalmidae) em diferentes temperaturas. Dissertação de Mestrado, INPA/UFAM, Manaus, AM, 64p.

139

Chapman D.T.; Loo-Sy, E. 1990. MISA monitoring results for Ontario petroleum refineries. CPPI (PACE). Canadian Petroleum Products Institute, Ottawa, ON, report n° 90-7,8.

Chou, C.T.; Malcolm, R.L.; Brinton, T.I.; Kile, D.E. 1986. Water solubility

enhancement of some organic pollutants and pesticides by dissolved humic and fulvic acids. Environmental Science and Technology, 20: 502-508.

Cohen, M.; Nugegoda, D. 2000. Toxicity of three oil spill remediation techniques to the Australian Bass Macquaria novemaculeata. Ecotoxicology and Environmental Safety, 47: 178-185.

Collier, T.K.; Stein, J.E.; Goksoyr, A.; Myers, M.; Gooch, J.W. 1995. Biomarkers of PAH exposure in oyster toadfish (Opsanix tau) from the Elizabeth River, Virginia. Mar. Environ. Res., 39: 348-349.

Corcoran, G. B.; Fix, L.; Jones, D. P.; Moslen, M. T.; Nicotera, P.; Oberhammer, F.A.; Buttyan, R. 1994. Apoptosis: molecular control point in toxicity. Toxicology and Applied Pharmacology, 128: 169-181.

Costa, O. T. F., 1995. Efeito do pH da água sobre os parâmetros hematológicos, eletrólitos e equilíbrio ácido-base do sangue arterial de Colossoma macropomum (Characiformes, Serrasalmidae). Dissertação de Mestrado, INPA/UFAM, Manaus, AM, 108p.

Costa, O.T.F.; Pedraça, E.B.; Val, A.L. 1996. Efeito do petróleo sobre o consumo de oxigênio tissular e níveis de eletrólitos plasmáticos de Colossoma macropomum (Caraciformes, Serrasalmidae). Rev. UA. Ciên. Biol., 1 (1): 85-95.

Couillard, C.M. 2002. A microscale test to measure petroleum oil toxicity to mummichog embryos. Environ. Toxicol. 17, 195-202.

Cousinou, M.; Nilsen, B.; Lopez-Barea, J.; Dorado, G. 2000. New methods to use fish cytochrome p4501A to assess marine organic pollutants. Sci. Total Environ., 247: 213-225.

Danis, B.; Goriely. S.; Dubois, P.H.; Fowler, S.W.; Flammand, V.; Warnau, M. 2004. Contrasting effects of coplanar versus noncoplanar PCB congeners on immunomodulation and CYP1A levels (determined using an adapted ELISA method) in the common sea star Asterias rubens L. Aquat. Toxicol., 69: 371-383

Davies, J.M.; McIntosh, A.D.; Stagg, R.; Topping, G.; Rees, J. 1997. The fate of the Braer oil in the marine and terrestrial environments. In: Davies,J.M., Topping,G. (Eds.), The Impact of an Oil Spill in Turbulent Waters: The Braer. Proceedings of a Symposium held at the Royal Society of Edinburgh,7–8 September 1995. The Stationery Ofice, pp. 26–41

140

Dekant, W.; Vamvakas, S. 1996. Toxicology for chemists and biologists (Heidelberg, Spektrum Akademischer Verlag).

Delistraty, D. 1997. Toxic equivalency factor approach for risk assessment of polycyclic aromatic hydrocarbons. Toxicological and Environmental Chemistry, 64: 81-108.

Den Besten, P.J. 1998. Cytochrome P450 monooxygenase system in echinoderms. Comp. Biochem. Physiol., 121: 139-146.

Den Besten, P.J.; Valk. S.; van Weerlee, E.; Nolting, R.F.; Postma, J.F.; Everaarts, J.M. 2001. Bioaccumulation and biomarkers in the sea star Asterias rubens (Echinodermata: Asteroidea) a North sea field study. Mar. Environ. Res., 51: 365-387.

Devaux, A.; Flammarioq, P.; Bernardon, V.; Garricb, J.; Monod, G. 1998. Monitoring of the chemical pollution of the river Rhane through measurement of DNA damage and cytochrome P4501A induction in chub (Leuciscus cephalus). Marine Environmental Research, 46: 257-262.

Dixon, J.T; Taggart, B.J.; George, G.S. 2002. Application of real time PCR determination to assess interanimal variabilities in CYP1A induction in the European flounder (Platichthys flesus). Marine Environmental Research, 54: 267-270.

Duffy, L.K.; Scofield, E.; Rodgers, T.; Patton, M.; Bowyer, T.R. 1999. Comparative baseline levels of mercury, Hsp 70 and Hsp 60 in subsistence fish from the Yukon-Kuskokwim delta region of Alaska. Comp. Bioch. and Physiol., part c 124: 181-186.

Duncan, W.L.P. 1998. Estresse metabólico e dano celular em Colossoma macropomum e Hoplosternum litoralle expostos ao petróleo. Dissertação de mestrado. Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia /Fundação Universidade do Amazonas, Manaus, AM. 117p.

Elonen, G.E.; Spehar, R.L.; Holcombe, G.W.; Johnson, R.D.; Fernandez, J.D.; Erickson, R.J.; Tietge, J.E.; Cook, P.M. 1998. Comparative toxicity of 2,3,7,8 tetrachlorodibenzo-pdioxin to seven freshwater fish species during early lifestage development. Environ. Toxicol. Chem., 17: 472-482.

Engelhardt, F.R.; Wong, M.P.; Duey, M.E. 1981. Hidromineral balance and gill morphology in rainbow trout Salmo gairdneri, aclimated to fresh and sea water affected by petroleum exposure. Aquat. Toxicol., 1: 175-186.

Erikson, D.E. 1995. Surveys ofmurre colony attendance in the northern Gulf of Alaska following the Exxon Valdez oil spill. In: Wells,P.G., Butler,N., Hughes,J.S. (Eds.), Exxon Valdez oil spill: fate and e.ects in Alaskan Waters. American Society for Testing and Materials,Philadelphia,PA,pp. 780–819.

141

Ermak, G.; Davies, K. J. 2002. Calcium and oxidative stress: from cell signaling to cell death. Molecular Immunology, 38: 713-721.

Farber, J.L. 1990. The role of calcium in lethal cell injury. Chem. Res. Toxicol., 3: 503-508.

Farias, A. R. L.; Costa, O. T. F. 1996. Histopatologia das brânquias e do órgão respiratório acessório de Glyptoperichthys joselimaianus (Siluriformes) sob exposição ao petróleo do rio Urucu. Resumos da V Jornada de Iniciação Científica do Estado do Amazonas, p.115.

Feder, M.E.; Hoffman, G.E. 1999. Heat-shock proteins, molecular chaperones, and

stress response: Evolutionary and ecological physiology. Annu. Rev. Physiol., 61: 243-282.

Fent, K. 2003. Ecotoxicological problems associated with contaminated sites. Toxicol. Leterst., 140/141: 353-365.

Fernandez-Salguero, P.M.; Hilbert, D.M.; Rudikoff, S.; Ward, J.M.; Gonzalez, F.J. 1996. Aryl-hydrocarbons receptor-deficient mice are resistant to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced toxicity. Toxicol. Appl. Pharmacol., 140: 173-179.

Ferreira, E.J.G.; Zuanon, J.A.S.; Santos, G.M. dos, 1998. Peixes comerciais do médio Amazonas: região de Santarém, Pará. Edições IBAMA, Brasília, 211p.

Fingus, M. 1995. Oil spills and their cleanup. Chem. Industry, 1005-1008.

Fink, A.L.; Goto, Y. 1998. Molecular Chaperones in Life Cycle of Proteins: Structure, Function, and Mode of Action. Marcel Dekker, New York.

Fleeger, J.W.; Carman, K.R.; Nisbet, R.M. 2003. Indirect effects of contaminants in aquatic ecosystems. The Science of the Total Environment, 317: 207-233.

Freedman, B. 1989. Environmental Ecology. The impacts of pollution and stressors on ecossystem structure and function. Academic Press, San Diego, CA.

Furch, K. 1984. Water chemistry of the Amazon Basin: The distribution of chemical

elements among freshwaters. In: Sioli, H., (ed.), The Amazon, Limnology and Landscape Ecology of a Might Tropical River and its Basin. Dr. W. Junk Publishers, Dordrecht, pp. 167-199.

Georgiades, E.T.; Danis, B.; Gillan, D.C., et al. 2006. Effect of crude oil

contaminated sediment exposure on cytochrome P450 enzymes in the Australian asteroid Coscinasterias muricata. Chemosphere, 65: 1869-1877.

Goksøyr, A.; Husøy, A.M. 1992. The cytochrome P450 1A1 response in fish:

application of immunodetection in environmental monitoring and toxicological testing. Marine Environmental Research, 34: 147-150.

142

Goksøyr, A.; Forlin, L. 1992. The cytochrome P-450 system in fish, aquatic toxicology and environmental monitoring. Aquat.Toxicol., 22: 287-312.

Gonzalez, R. J.; Preest, M. R. 1999. Ionoregulatory specializations for exceptional tolerance of ion-poor, acidic waters in the neon tetra (Paracheirodon innesi). Physiological and Biochemical Zoology 72: 156-163.

Gonzalez, R. J.; Wilson, R. W. 2001. Patterns of ion regulation in acidophilic fish

native to the ion-poor, acidic Rio Negro. Journal of Fish Biology 58: 1680-1690. Gonzalez, R. J.; Wilson, R. W.; Wood, C. M.; Patrick, M. L.; Val, A. L. 2002. Diverse

strategies for ion regulation in fish collected from the ion-poor, acidic Rio Negro. Physiological and Biochemical Zoology 75: 37-47.

Gonzalez, R. J.; Wood, C. M.; Wilson, R. W.; Patrick, M. L.; Bergman, H. L.;

Narahara, A.; Val, A. L. 1998. Effects of water pH and calcium concentration on ion balance in fish of the Rio Negro, Amazon. Physiological Zoology 71: 15-22.

Graham, J.B. 1997. Air-Breathing Fishes. Evolution and Adaptation. Academic Press.

Gray, J.S. 2002. Biomagnification in marine systems: The perspective of an ecologist. Marine Poll. Bull., 45: 46-52.

Haffter, P.; Granato, M.; Brand, M.; Mullins, M.C.; Hammerschmidt, M.; Kane, D.A.; Odenthal, J.; van Eeden, F.J.; Jiang, Y.J.; Heisenberg, C.P.; Kelsh, R.N.; Furutani-Seiki, M.; Vogelsang, E.; Beuchle, D.; Schach, U.; Fabian, C.; Nusslein-Volhard, C., 1996. The identification of genes with unique and essential functions in the development of zebrafish, Danio rerio. Development 123: 1-36.

Hahn, M. E. 1998. The aryl hydrocarbon receptor: A comparative perspective.

Comparative Biochemistry and Physiology, 121C: 23-53.

Hahn, M.E. 2001. Dioxin toxicology and the aryl hydrocarbon receptor insights from fish and other non-traditional models. Mar Biotechnol. Suppl., 3: 224-238.

Haitzer, M.; Höss, S.; Traunspurger, W.; Steinberg, C. 1998. Effects of dissolved organic matter (DOM) on the bioconcentration of organic chemicals in aquatic organisms – a review. Chemosphere, 37: 1335-1362.

Hall, R.J. 1980. Effects of environmental contaminants on reptiles: a review. In: Special Science Report on Wildlife, vol. 228. U.S. Fish and Wildlife Service, Washington DC, pp 1-12.

Hamilton, S.J.; Lemly, A.D. 1999. Commentary: water-sediment controversy in setting environmental standards for Selenium. Ecotoxicol. and Environ. Saf., 44: 227-235

143

Harvey, R.G. 1997. Polycyclic Aromatic Hydrocarbons. Wiley-VCH, lnc, New York, USA, pp. 667.

Hatch, A.C.; Burton, G.A. 1998. Effects of photoinduced toxicity of fluoranthene on amphibian embryos and larvae. Environmental Toxicology and Chemistry, 17: 1777-1785

Heath, A.G. 1995. Water Pollution and Fish Physiology. 2.ed. CRC/Lewis Publishers, Boca Raton, Florida. 342pp.

Heintz, R.A.; Short, J.W.; Rice, S.D. 1999. Sensitivity of fish embryos to weathered crude oil: Part II. Increased mortality of pink salmon (Oncoorhynchus gorbuscha) embryos incubating downstream from weathered Exxon Valdez crude oil. Environ. Toxicol. Chem., 18: 494-503.

Hendrick, J.P.; Hartl, F.U. 1993. Molecular chaperone functions of heat-shock

proteins. Annu. Rev. Biochem., 62: 349-384. Hermes-Lima, M.; Willmore, W.G; Storey, K.B. 1995. Quantification of lipid

peroxidation in tissue extracts based on Fe(III) xylenol orange complex formation. Free Radical Biology & Medicine.,19: 271-280.

Hestermann, E.V.; Stegeman, J.J.; Hahn, M.E. 2002. Relationships among the cell

cycle, cell proliferation, and aryl hydrocarbon receptor expression in PLHC-l cells. Aquat. Toxicol., 58: 201-213.

Hightower, L.E. 1991. Heat shock, stress protein, chaperones and proteotoxicity. Cell., 66: 191-197.

Hightower, L.E.; Sadis, S.E.; Takenaka, I.M. 1994. Interactions of vertebrate hsc70 and hsp70 with unfolded proteins and peptides. In: Morimoto, R.I., Tissieres, A., Georgopoulos, C. (Eds.). The Biology of Heat Shock Proteins and Molecular Chaperones. Cold Spring Harbor Laboratory Press.pp. 179-207.

Hochachka, P.W.; Lutz P.L. 2001. Mechanism, origin, and evolution of anoxia tolerance in animals. Comparative Biochemistry and Physiology, 130(B): 435-459.

Hodson, P.V.; Efler, S.; Wilson, J.Y.; El-Shaarawi, A.; Maj. M.; Williams, T.G. 1996. Measuring the potency of pulp mill effluents for induction of hepatic mixed function oxygenase activity in fish. Journal Toxicol. Environ. Health, 49: 101-128.

Hoff, R.Z.; Shigenaka, G. 1999. Lessons from 10 years of post- Exxon Valdez monitoring of intertidal shorelines. Proceedings of the 1999 International Oil Spill Conference,Seattle,Washingt on, USA. Publication of the American Petroleum Institute,pp. 111–117.

144

Hoffman, D. J.; Rattner, B. A.; Burton, G. A.; Jr., Cairns, J., Jr., 1995. Petroleum and individual polycylic aromatic hydrocarbons. In: Handbook of Ecotoxicology, Lewis Publishers, Boca Raton, pp. 330-355.

Hoffman, D.J.; Gay, M.L. 1981. Embryotoxic effects off benzo(a)pyreno, chryseno,

and 7,12-dimethyilbenzoanthracene in petroleum hydrocarbon mixtures in mallard ducks. Journal of Toxicology and Environmental Health, 7: 775-787.

Hogstrand, C.; Haux, C. 1990. Metallothionein as an indicator of heavy metal exposure in two subtropical fish species. J. Exp. Mar. Biol. Ecol., 138: 69-84.

Holst, L.L.; Giesy, J.P. 1989. Chronic effects of the photoenhanced toxicity of anthracene on daphnia magna reproduction. Environmental Toxicology and Chemistry, 8: 933-942.

Hose, J.E.; McGurk, J.D.; Marty, G.D.; Hinton, D.E.; Brown, E.D.; Baker, T.T. 1996.

Sublethal effects of the Exxon Valdez oil spill on herring embryos and larvae: morphological, cytogenetic, and histopathological assessments, 1989-1991. Can. J. Fish. Aquat. Sci., 53: 2355-2365.

Huang, X.-D.; Dixon, D.G.; Greenberg, B.M. 1993. Impacts of UV radiation and

photomodification on the toxicity of PAHs to the higher plant Lemna gibba (Duckweed). Environ. Toxicol. Chem., 12: 1067–1077.

Hugget, R.J.; Kimerle, R.A.; Mehrle, P.M.; Bergman, H.L. 1992. Biomarkers.

Biochemical, Physiological and Histological Markers of Anthropogenic Stress. Lewis Publishers, Chelsea, MI.

Hyllard, K. ; Haux, C. ; Hogstrand. 1995. Immunological characterization of metallothionein in marine and freshwater fish. Mar. Environ. Resear., 39: 111-115.

Incardona, J.P.; Collier, T.K.; Scholz, N.L. 2004. Defects in cardiac function precede morphological abnormalities in fish embryos exposed to polycyclic aromatic hydrocarbons. Toxicology an Applied Pharmacology, 196: 191:205.

Iwama, G.K.; Thomas, P.T.; Forsyth, R.B.; Vijayan, M.M. 1998. Heat shock protein expression in fish. Rev. Fish Biol. Fisher, 8: 35-56.

Jaworski, J.; Klapperich, C.M. 2006. Fibroblast remodeling activity at two- and three-dimensional collagen–glycosaminoglycan interfaces Biomaterials, 27: 4212–4220.

Jensen, F.B. 1990. Nitrite and red cell function in carp: control factors for nitrite entry, membrane potassium ion permeation, oxygen affinity and metahemoglobin formation. J. Exp. Biol., 152: 149-166.

145

Jensen, F.B. 1991. Multiple strategies in oxygen and carbon dioxide transport by hemoglobin. In: Woakes, A.J.; Griesenhaber, M.K.; Bridges, C.R. (Eds.) Physiological Strategies for Gas Exchange and Metabolism, Cambridge University Press, Cambridge, p.55-78.

Jenssen, B.J. 1996. An overview of exposure to, and effects of, petroleum oil and organochlorine pollution in Grey seals (Halichoerus grypus). The Science of the Total Environment, 186: 109-118.

Junk, W. J. 1983. As águas da Região Amazônica. In: Salati, E., Schubart, H.O.R., Junk, W.J. e Oliveira, A.G. (eds.). Amazônia: desenvolvimento, integração e ecologia. CNPq/Brasiliense, São Paulo, 328p.

Junk, W.J.; Furch, K. 1985. The Physical and Chemical Properties of Amazonian Waters and their Relatioship with the Biota. In: Treherne, J.E. Key environments: Amazonia. Pergamon, Oxford, England.

Kagan, J.; Kagan, E.D.; Kagan, I.A.; Kagan, P.A. 1987. Do polycyclic aromatic hydrocarbons, acting as photosensitizers, participate in the toxic effects of acid rain? In: Zika, R.G., Cooper, W.J. (Eds.), Photochemistry of Environmental Aquatic Systems. American Chemical Society (ACS) Symposium Series, Washington DC, Vol. 327, pp. 191–204.

Kagan, J.; Kagan, E.D.; Kagan, I.A.; Kagan, P.A.; Quigley, S. 1985. The

phototoxicity of noncarcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons in aquatic organisms. Chemosphere, 14: 1829–1834.

Kagan, J.; Kagan, P.A.; Buhse, H.E. 1984. Light-dependent toxicity of a-terthienyl

and anthracene toward late embryonic stages of Rana pipiens. J. Chem. Ecol. 10, 1115–1122.

Kagan, J.; Tuveson, R.W.; Gong, H. 1989. The light-dependent cytotoxicity of

benzo[a]pyrene: effect on human erythrocytes, Escheria coli cells and Haemophilus influaenze transforming DNA. Mutat. Res., 216: 231–242.

Kerkvliet, N.I.; Baecher-Steppan, L.; Brauner, J.A.; Deyo, J.A.; Henderson, M.C.; Tomar, R.S.; Buler, D.R. 1990. Influence of the Ahlocus on the humoral immunotoxicity of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzodioxin: Evidence for Ah-receptor-dependent and Ah-receptor independente mechanisms of immunosuppression. Toxicol. Appl. Pharmacol., 105: 26-36.

Kiang, J.G.; Tsokos, G.C. 1998. Heat shock proteins 70kDa: Molecular biology, biochemistry, and physiology. Pharmacol. Ther., 80: 183-201.

Kingston, P.F. 2002. Review Paper: Long-term Environmental Impact of Oil Spills. Spill Science & Technology Bulletin, 7: 53–61.

146

Klerks, P.L.; Leberg, P.L.; Lance, R.F.; McMillin, D.J.; Means, J.C. 1997. Lack of development of pollutant-resistance or genetic differentiation in darter gobies (Gobionellus boleosoma) inhabiting a produced-water discharge site. Marine Environmental Research, 44(4): 377-395.

Kobayashi, M.; Yamamoto, M. 2005. Molecular mechanisms activating the nrf2-keap1 pathway of antioxidant gene regulation. Antioxidants and Redox Signaling, 7: 340-347.

Kocan, R.M.; Hose, J.E.; Brown, E.D.; Baker, T.T. 1996. Pacific herring (Clupea pallasi) embryo sensitivity to Prudhoe Bay petroleum hydrocarbons: laboratory evaluation and in situ exposure at oiled and unoiled sites in Prince William Sound. Can. J. Fish Aquat. Sci., 53: 2366-2387.

Krylov, S.N.; Huang, X.-D.; Zeiler, L.F.; Dixon, D.G.; Greenberg, B. 1997.

Mechanistic quantitative structure–activity relationship model for the photoinduced toxicity of polycyclic aromatic hydrocarbons: I. Physical model based on chemical kinetics in a two-compartment system. Environ. Toxicol. Chem., 16: 2283–2295.

Kupchella, C. E., Hyland, M.C. 1993. Water pollution from the production, transport,

and use of oil. In: Environmental Science (Living Within the System of Nature), 3a.edição, Prentice Hall, New Jersey, pp. 352-356.

Laflamme, R.E.; Hites, R.A. 1978. The global distribution of polycyclic aromatic

hydrocarbons in recent sediments. Geochimica et Cosmochimica Act, 42: 289-303.

Lahvis, G.; Wells, R.W.; Kueht, D.W.; Stewart, J.L.; Rhinehart, H. L.; Via, C. S. 1995. Decreased lymphocyte responses in free-ranging bottlenose dolphins (Tursiops truncates) are associated with increased concentrations of PCBs and DDT in peripheral blood. Environ. Health Perspect., 103: 67-72.

Lahvis, G.P.; Lindell, S.L.; Thomas, R.S. 2000. Portosystemic shunting and persistent fetal vascular structures in aryl hydrocarbon receptor-deficient mice. Natl. Acad. Sci., 97: 10442-10447.

Leaver, M. J.; George, S. G. 2000. A cytochrome P4501B gene from a fish, Pleuronectes platessa. Gene, 256: 83–91.

Lee, Y.; Williams, T.D.; Jung, S.; Lee, J. 2005. cDNA cloning and expression of a cytochrome p450 1A (CYP1A) gene from the hermaphroditic fish Rivulus marmoratus. Marine Pollution Bulleti, 51: 769-775.

Leenheer, J. A. 1980. Origin and nature of humic substances in the waters of the Amazon River Basin. Acta Amazonica, 10: 513-526.

Levine, S.L.; Oris, J.T. 1999. CYP1A expression in liver and gill of rainbow trout following waterborne exposure: implications for biomarker determination. Aquatic Toxicology, 46: 279-287.

147

Lin, H.; Randall, D. 1995. Proton pumps in fish gills. In: Wood, C. M., Shuttleworth, T. (eds.), Cellular and Molecular Approaches to Fish Ionic Regulation. Academic Press, 229-255.

Livingstone, D. R. 1998. The fate of organic xenobiotics in aquatic ecosystems:

quantitative and qualitative differences in biotransformation by invertebrates and fish. Comp. Biochem. Physio., 120A: 43-49.

Livingstone, D.R. 1993. Biotechnology and pollution monitoring: use of molecular

biomarkers in the aquatic environment. J. Chem. Technol. Biotechnol., 57: 195-211.

Long, E.R.; Macdonald, D.; Smith, S.L.; Calder, F.D. 1995. Incidence of adverse

biological effects within ranges of chemical concentrations in marine and estuarine sediments. Environ Managm., 19: 81-97.

Lowe-McConnel, R.H. 1999. Estudos ecológicos de comunidades de peixes

tropicais. Cunnhingham-Sao Paulo: Editora Universidade de Sao Paulo. Colecao base. 434pp.

Lowe-McConnell, R.H. 1994. Threats to, and conservation of, tropical freshwater

fisher. Mitt. Internat. Verein. Limnol., 24: 47-52.

Maco, J.T. 1996. Influência da água de formação da extração de petróleo do rio Urucu sobre aspectos hematológicos e conteúdo iônico de Colossoma macropomum e Glyptoperichthys joselimaianus. Dissertação de Mestrado. Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia /Fundação Universidade do Amazonas. Manaus, AM. 90p.

Maines, M.D. 1997. The heme oxygenase system: a regulator of second messenger gases. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 37: 517–54.

Malan, D.E. 1986. Effects of quatar light crude oil on adult saltmarsh crab Secaram catenata and implications in the field: respiration, oxygen diffusion e hypoxia. South African J. of Mar. Scien., 4: 265-275.

Martin Jr., L.K.; Black, M.C. 1996. Biomarker assessment of the effects of petroleum refinery contamination on channel catfish. Ecotoxicol. and Environmen. Safety, 33: 81-87.

Marty, G.D.; Hoffmann, A.; Okihiro, M.S.; Heplerb, K.; Hanes, D. 2003. Retrospective analysis: bile hydrocarbons and histopathology of demersal rockfish in Prince William Sound, Alaska, after the Exxon Valdez oil spill. Marine Environmental Research, 56: 569–584.

Marty, G.D.; Short, J.W.; Dambach, D.M.; Willits, N.H.; Heintz, R.A.; Rice, S.D.;

Stegeman, J.J.; Hinton, D.E. 1997. Ascites, premature emergence, increased gonadal cell apoptosis, and cytochrome P4501A induction in pink salmon larvae continuously exposed to oil-contaminated gravel during development. Can. J. Zool., 75: 989 -1007.

148

Marvin, C.H.; Lundrigan, J.A.; McCarry, B.E.; Bryant, D.W. 1995. Determination and genotoxicity of high molecular mass polycyclic aromatic hydrocarbons isolated from coal-tar-contaminated sediment. Environmental Toxicology and Chemistry, 14: 2059-2066.

Matsuo, A. Y. O. 1998. Efeito da acidez e do cálcio nos fluxos líquidos de sódio e

potássio em duas espécies de Corydoras da Amazônia. Dissertação de Mestrado, INPA, UFAM, Manaus, AM, 58p.

Matsuo, A. Y. O.; Chagas, E. C.; Val, A. L. 2002. Effects of petroleum exposure in

tambaqui fed diets supplemented with vitamin C. In: Proceedings of the International Congress on the Biology of Fish - Tropical Fish: News and Reviews, Vancouver, pp. 65-70.

Matsuo, A. Y. O.; Playle, R. C.; Val, A. L.; Wood, C. M. 2006. Physiological action of

dissolved organic matter in rainbow trout in the presence and absence of copper: sodium uptake kinetics and unidirectional flux rates in hard and softwater. Aquatic Toxicology.

Matsuo, A. Y. O.; Val, A. L. 2002. Low pH and calcium effect on net Na+ and K+

fluxes in two catfish from the Amazon (Corydoras: Callichthyidae). Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 35: 361 - 367.

Matsuo, A. Y. O.; Val, A. L. 2003a. Aluminum effects in Colossoma macropomum

exposed to low pH, calcium, and humic substances: implications for local aquaculture. Annual Conference of the World Aquaculture Society, Salvador.

Matsuo, A. Y. O.; Val, A. L. 2003b. Amazonian blackwater and its implications on ion

uptake kinetics in Paracheirodon axlerodi. Annual Meeting ASIH (American Society of Ichthyologists and Herpetologists), Manaus.

Matsuo, A. Y. O.; Val, A. L. 2003c. Fish adaptations to Amazonian blackwaters. In:

Val, A. L., Kappor, B. G. (eds.), Fish Adaptations. Science Publishers Inc., Enfield, pp. 1-36.

Matsuo, A.Y.O. 2004. Aspectos ecofisiológicos e ecotoxicológicos em espécies da

ictiofauna do rio Negro, Amazônia, com ênfase na regulação iônica e na importância das substâncias húmicas. Tese de Doutorado (INPA/UFAM) Manaus, AM, ix + 223p.

Mauthe, R.J.; Cook, V.M; Coffing, S.L.; Baird, W.M. 1995. Exposure of mammalian–

cell cultures benzo(a)pyreno and light results in oxidative DNA damage as measure by 8-hydroxydeoxyguanosine formation. Carcinogenesis, 16: 133-137.

McCarthy, F.; Shugart, L. R. 1990. Biomarkers of Environmental Contamination.

Lewis Publishers, Chelsea, 457p.

McClain, J.S.; Oris, J.T.; Burton Jr., G.A.; Lattier, D. 2003. Laboratory and field-validation of multiple molecular biomarkers of contaminat exposure in raibow trout. Enviromental Toxicology and Chemistry, 22: 361-370.

149

McDonald, D. G. 1983. The effects of H+ upon the gills of freshwater fish. Canadian Journal of Zoology, 61: 691-703.

McGurk, M.D.; Brown, E.D. 1996. Egg-larval mortality of Pacific herring in Prince

William Sound, Alaska, after the Exxon Valdez oil spill. Can. J. Fish. Aquat. Sci., 53: 2343-2354.

Mendes, F. A.; Val, A. L. 1996. Efeito do petróleo sobre aspectos respiratórios de

Lipossarcus pardalis (Siluriformes). Resumos da V Jornada de Iniciação Científica do Estado do Amazonas, p.125.

Mendes, F. A.; Val, A. L. 1997. Effect of crude oil on the hematological parameters

and on ionic imbalance in Lipossarcus pardalis (Siluriformes, Loricariidae). Resumos do International Symposium Biology of Tropical Fishes, Manaus, p. 119.

Menezes, G. C.; Val, A. L. 1995. Efeito do petróleo na lâmina superficial da coluna

d’água sobre os parâmetros eritrocíticos e respiratórios de Hoplosternum littorale Hancock, 1828. Anais da IV Jornada de Iniciação Científica do Estado do Amazonas, p. 169.

Meyer, S.; Cartellieri, S.; Steinhart, H. 1999. Simultaneous determination of PAHs,

Hetero-PAHs (N, S, O), and their degradation products in creosote-contaminated soils. Method development, validation, and application to hazardous waste site. Analytical Chemistry, 71: 4023-4029.

Middaugh, D.P.; Chapman, P.J.; Shelton, M.E. 1996. Responses of embryonic and

larval inland silversides, Menidia beryllina, to a water-soluble fraction formed during biodegradation of artificially weathered Alaska North Slope crude oil. Environ. Contam. Toxicol., 31: 410-419.

Middaugh, D.P.; Chapman, P.J.; Shelton, M.E.; McKenney Jr., C.L.; Courtney, L.A.

2002. Effects of fractions from biodegraded Alaska North Slope crude oil on embryonic inland silversides, Menidia beryllina. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 42: 236-243.

Middaugh, D.P.; Shelton, M.E.; McKenney Jr., C.L.; Cherr, G.; Chapman, P.J.;

Courtney, L.A. 1998. Preliminary observations on responses of embryonic and larval Pacific herring, Clupea pallasi, to neutral fraction biodegradation products of weathered Alaska North Slope oil. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 34: 188-196.

Milligan, C.L.; Wood, C.M. 1982. Disturbances in haematology, fluid volume

distribution and circulatory function associated with low environmental pH in the rainbow trout, Salmo gairdneri. Journal of Experimental Biology, 99: 397-415.

Monk, S.A.; Denison, M.S.; Rice, R.H. 2003. Reversible stepwise negative regulation of CYP1A1 in cultured rat epidermal cells. Archives of Biochemistry and Biophysics, 419: 158-169.

150

Moore, M.J.; Mitrofanov, l.V.; Valentini, S.S.; Kurbskiy, A.V.; Zhimbey, E.N.; Eglinton, L.B.; Stegeman, J.J. 2003. Cytochrome p4501A expression, chemical contaminants and histopathology in roach, goby and sturgeon and chemical contaminants in sediments from the Caspian Sea, Lake Balkhash and the lly River Delta, Kazakhstan. Mar. Pollut. Bull., 46: 107-119.

Morimoto, R.I.; Tissieres, A.; Georgopoulos, C. 1990. Stress Protein in Biology Medicine, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY.

Muusze, B.; Marcon, J.; van den Thillart, G. 1998. Hypoxia tolerance of Amazon fish Respirometry and energy metabolism of the cichlid Astronotus ocellatus. Comparative Biochemistry and Physiology a- moleclular and integrative Physiology, 20: 151-156.

Nakayama, K.; Iwata, H.; Kim, E.; Tashiro, K.; Tanabe, S. 2006. Gene expression profiling in common cormorant liver with an oligo array: assessing the potential toxic effects of environmental contaminants. Environ Sci. Technol., 1076-1083.

National Research Council, 2003. Oil in the Sea III: Inputs, Fates, and Effects. National Academies Press, Washington, DC, p. 446.

Neff, J. M. 1979. Polycyclic aromatic hydrocarbons in the aquatic environment:

sources, fates and biological effects. Applied Science Publishers, Essex, 262p.

Nelson, D.R.; Koymans, L.; Kamataki, T. 1996. P450 superfamily: update on new sequences, gene mapping, accession numbers and nomenclature. Phamacogenetics, 6: 1-42.

Nicotera, P.; Bellomo, G.; Orrenius, S. 1990. The role of Ca 2+ in cell killing. Chem. Res. Toxicol., 3: 484-494.

Niederer, M. 1998. Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons and substitutes (nitro, oxy-PAHs) in urban soil and airborne particulate by GC-MS and NCI-MS/MS. Environmental Science and Pollution Research, 5: 209-216.

Norcross, B.L.; Hose, J.E.; Frandsen, M.; Brown, E.D. 1996. Distribution,

abundance, morphological condition, and cytogenetic abnormalities of larval herring in Prince William Sound, Alaska, following the Exxon Valdez oil spill. Can. J. Fish. Aquat. Sci., 53: 2376-2387.

Nover, L. 1991. Heat Shock Response. CRC Press. Boca Raton, FL.

O’Connor, T.P.; Paul, J.P. 2000. Misfit Between Sediment Toxicity and Chemistry. Mar. Pollut. Bull., 40: 59-64.

Oliveira, C. P. F. 2003. Efeito do cobre e chumbo, metais pesados presentes na água de formação derivada da extração do petróleo da província petroleira do Urucu – AM, sobre o tambaqui, Colossoma macropomum (Cuvier, 1818). Dissertação de Mestrado, INPA/UFAM, Manaus, AM, 70p.

151

Oliveira, M. I. S.; Val, A. L. 1996. Efeito do petróleo sobre a série branca e série vermelha do sangue de tambaqui (Colossoma macropomum) acari-bodó (Lipossarcus pardalis) e tamoatá (Hoplosternum littorale). Resumos da V Jornada de Iniciação Científica do Estado do Amazonas, p.129.

Oost, R. van der; Beyer, J.; Vermeulen, N.P.E. 2003. Fish bioaccumulation and biomarkers in environmental assessment: a review. Environmental Toxicology and Pharmacology, 13: 57-149.

Ortiz-Delgado, J.B.; Sarasquete, C.; Behrens, A.; Canales, M. R. G.; Segner, H. 2002. Expression, cellular distribution and induction of cytochrome P4501A (CYP1A) in gilthead seabream, Sparus aurata, brain. Aquatic Toxicology 60: 269–283.

Owens, E.H.; Sienkiewicz, A.M.; Sergy, G.A. 1999. Evaluation of shoreline cleaning verses natural recovery: the Metula spill and the Komi operations. In: Proceedings of the 1999 International Oil Spill Conference, Seattle, Washington, USA. Publication of the American petroleum institute, pp.503-509.

Page, D.S.; Foster, J.C.; Ficket, P.M.; Gilfillan, E.S. 1989. Longterm weathering of Amoco cadiz oil in soft intertidal sediments. In: Proceedings of the 1989 International Oil Spill Coference, Seattle, Washington, USA. Publication of the American petroleum Institute, pp.401-405.

Pagenkopf, G. K. 1983. Gill surface interaction model for trace-metal toxicity to fishes: role of complexation, pH, and water hardness. Environmental Science and Technology., 17: 342-347.

Pan, Z.; Bhat, M. B.; Nieminen, A. L.; Ma, J. 2001. Synergistic movements of Ca(2+) and Bax in cells undergoing apoptosis. The Journal of Biological Chemistry, 276: 32257-32263.

Paolis, F.; Kukkonen, J. 1997. Binding of organic pollutants to humic and fulvic acids: influence of pH and the structure of humic material. Chemosphere 34: 1693-1704.

Paula-Silva, M. N.; Chagas, C. D.; Neta, C. O. C.; Val, A. L.; Almeida-Val, V. M. F.

2002. The effects of petroleum on three species of the Amazon: pirarucu, tambaqui and boari. Proceedings of the International Congress on the Biology of Fish – Tropical Fish: News and Reviews, Vancouver, pp. 61-64.

Paula-Silva, M.N. 1999. Influência do Nitrito sobre aspectos fisiológicos do tambaqui, Colossoma macropomum (Cuvier 1818). Dissertação de mestrado. Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia /Fundação Universidade do Amazonas. Manaus, AM. 64p.

Payne, J.R.; Phillips, C.R. 1985. Photochemistry of petroleum. Environ. Sci. Technol., 19: 569-579.

152

Peterson, C.H. 2001. The Exxon Valdez oil spill in Alaska: Acute indirect and chronic effects on the ecosystem. Adv. Mar. Biol., 39: 1-103.

Peterson, R.T.; Link, B.A.; Dowling, J.E.; Schreiber, S.L., 2000. Small molecule

developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97: 12965-12969.

Peterson, R.T.; Mably, J.D.; Chen, J.N.; Fishman, M.C. 2001. Convergence of

distinct pathways to heart patterning revealed by the small molecule concentramide and the mutation heart-and-soul. Curr. Biol. 11, 1481-1491.

Petrobras. 1994. A Petrobrás na Amazônia legal. Editado pelo Serviço de Relações Institucionais.

Petrobras. 1998. Concluída a primeira fase do AM-028. Jornal E&P – AM 4.

Phillips, D.J.H.; Rainbow, P.S. 1994. Biomonitoring of trace aquatic contaminants. Chapman & Hall, Alden Press Ltda, Oxford, p. 79-132.

Pinheiro, L.R.B. 2007. Expressao gênica diferencial em tambaquis, Colossoma macropomum (Cuvier, 1818) expostos ao petróleo e a hipoxia. Dissertacao de Mestrado (INPA/UFAM) Manaus, AM, xi + 66p.

Playle, R. C.; Dixon, D.; Burnison, K. 1993b. Copper and cadmium binding to fish gills: estimates of metal-gill stability constants and modelling of metal accumulation. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 50: 2678-2687.

Poland, A.; Knutson, J.C. 1982. 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-pdioxin and related halogenated aromatic hydrocarbons: examination of the mechanism of toxicity. Annu. Rev.Pharmacol. Toxicol. 22,517-554

Pollino, C.A.; Holdway, D.A. 2002. Toxicity testing of crude oil and related compounds using early life stages of the crimson-spotted rainbowfish (Melanoptaenia fluviatilis). Ecotoxicology and Environmental Safety 52: 180-189.

Pollino, C.A.; Holdway, D.A. 2003. Hydrocarbon - induced changes to metabolic and detoxification enzymes of the Australian crimson spotted rainbowfish (Melanotaenia fluviatilis). Environ. Toxicol. 18:21-28.

Pontarulo, S; Cederbaum, A.I. 1998. Production of reactive oxygen species by microsomes enriched in specific human cytochrome p450 enzymes. Free Radical Biol. Med. 24:1324-1330.

Portela, J. M. 1998. Efeitos do pH, cálcio e temperatura sobre a homeostase iônica de alevinos de tambaqui, Colossoma macropomum (Characiformes-Serrassalmidae). Dissertação de Mestrado, INPA/UFAM, Manaus, AM, 41p.

153

Portela, J. M.; Matsuo, A. Y. O.; Val, A. L. 2001. Excreção de amônia através da urina em Arapaima gigas submetido a pH ácido. Reunião Regional da SBPC (Sociedade Brasileira para o Progresso da Ciência), Manaus, AM.

Racky, J.; Schmitz, H. J.; Kaufimann, H.M.; Schrenk, D. 2004. Single nucleotide polymorphism analysis and functional characterization of the human Ahreceptor (AhR) gene promoter. Archives of Biochemistry and Biophysics. 421:91-98

Ramachandran, S.D.; Hodson, P.V.; Khan, C.W. 2004. Oil dispersant increases PAH uptake by fish exposed to crude oil. Ecotoxicology and Environmental Safety 59:300-308.

Ramachandran, S.D.; Sweezey, M.J.; Hodson, P.V.; Boudreau, M.; Courternay, S.C.; Lee, K.; King,T.; Dixon, J.A. 2006. Influence of salinity and fish species on PAH uptake from dispersed crude oil. Marine Pollution Bulletin 52(10):1182-1189.

Readman, J.W.; Mantoura, R.F.; Rhed, M.M.; Brown, L. 1982. Aquatic distribution and heterotrophic degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) in the Tamar estuary. Est. Coast. Shelf Sci. 14,369.

Reddy, C.M.; Eglinton, T.I.; Hounshell, A.; White, H.K.; Xu, L.; Gaines, R.B.; Frysinger, G.S. 2002. The West Falmouth oil spill after thirty years: the persistence of petroleum hydrocarbons in marsh sediments. Environ. Sci. Technol. 36, 4754-4760.

Reed, D. J. 1990. Review of the current status of calcium and thiols in cellular injury. Chem Res Toxicol 3, 495-502

Ren, L.; Huang, X.-D.; McConkey, B.J.; Dixon, D.G.; Greenberg, B.M. 1994. Photoinduced toxicity of three polycyclic aromatic hydrocarbons (fluoranthene, pyrene and naphthalene) to the duckweed Lemna gibba L. G-3. Ecotox. Environ. Saf. 28, 160–171.

Ren, L.; Zeiler, L.F.; Dixon, D.G.; Greenberg, B.M. 1996. Photoinduced effects of

polycyclic aromatic hydrocarbons on Brassica napus (Canola) during germination and early seedling development. Ecotox. Environ. Saf. 33, 73–80.

Roberts, A.P.; Oris J.T.; Stubblefield, W.A. 2006. Gene expression in caged juvenile Coho Salmon (Oncorhynchys kisutch) exposed to the waters of Prince William Sound, Alaska. Marine Pollution Bulletin 52:1527-1532.

Roberts, A.P.; Oris, J.T. 2004. Multiple biomarker response in rainbow trout during exposure to hexavalent chromium. Comparative Biochemistry and Physiology C: Toxicology and Pharmacology 138:221-228.

Roesijadi, G.; Robinson, W.E. 1994. Metal regulation in aquatic animals: mechanism of uptake, accumulation and release. In: Malins, D.C., Ostrader , G.K. (Eds). Aquatic Toxicology. Molecular, Biochemical and cellular Perspectives. Lewis Publishers, London. P.387-420.

154

Roy, L.A.; Steinert, S.; Bay, S.M.; Darrin, G.; Sapozhnikova, Y.; Bawardi, O.; Leifer, I.; Schlenk, D. 2003. Biochemical effects of petroleum exposure in hornyhead turbot (Pleuronichthys verticalis) exposed to a gradient of sediments collected from a natural petroleum seep in CA, USA. Aquatic Toxicology 65:159-169.

Ryan, J.A.; Hightower, L.E. 1994. Evaluation of heavy-metal ion toxicity in fish cells sing a combined stress protein and cytotoxicity assay. Environ. Toxicol. Chem. 13, 1231-1240.

Ryan, J.A.; Hightower, L.E. 1996. Stress proteins as molecular biomarkers for environmental toxicology. In: Feige, U., Morimoto, R.I., Yahara, I., Polla, B. (Eds.), Stress-Inducible Cellular Responses Birkhauser Verlag, Basel, Switzerland, pp. 411- 424.

Safe, S.H. 1994. Polychlorinated biphenyls (PCBs): environmental impact, biochemical and toxic responses, and implications for risk assessment. Crit. Rev. Toxicol. 24:87-149.

Sanders, B.M.; Martin, L.S. 1993. Stress proteins as biomarkers of contaminant exposure in archived environmental samples. Sci. Total Environ. 139/140:459-70

Santos, G.M. dos; Jegu, M.; Merona, B. 1984. Catálogo de peixes comerciais do baixo Rio Tocantins. Projeto Tucuruí. Manaus. Eletronorte/CNPq/INPA, 1º Ed, 83p.

Santos, G.M.; Ferreira, E.J.G. 1999. Peixes da Bacia Amazônica. In: Lowe-McConnel, R.H., Estudos ecológicos de comunidades de peixes tropicais. Cunnhingham-Sao Paulo: Editora Universidade de Sao Paulo. Colecao base. 345-354.

Sarasquete, C.; Segner, H. 2000. Cytochrome P4501A (CYP1A) in teleostean fishes. A review of immunohistochemical studies. Sci. Total Environ. 247, 313–332

Sarasquete, C; Munoz-Cueto, JA; Ortiz, J.B, et al. 1999. Immunocytochemical distribution of cytochrome P4501A (CYP1A) in developing gilthead seabream, Sparus aurata. Histology and Histopatology 14:407-415

Schlezinger, J.J.; White. R.D.; Stegeman, J.J. 1999. Oxidative inactivation of cytochrome P-450 1A (CYP1A) stimulated by 3,3,4,4-tetrachlorobiphenyl: production of reactive oxygen by vertebrate CYP1As. Mol. Pharmacol. 56:588-597.

Schlezinger, J.J; Stegeman, J.J. 2001. Induction and suppression of cytochrome P450 1A by 3,3 ',4,4 ',5-pentachlorobiphenyl and its relationship to oxidative stress in the marine fish scup (Stenotomus chrysops). Aquatic Toxicology 52:101-115

Scholz, S.; Demaschke, H.; Kanamari, A.; Ostermann, K.; Radel. G.; Gutzeit, H.O. In

155

press. Express of the gene germ cell less in medaka (Orysias laptipes). Molecular Reproduction and Development.

Scholz, S.; Kordes, C.; Hamann, J.; Gutzeit, H.O. In press. Induction of vittelogin in vivo and in vitro in the model teleost medaka (Orysias laptipes): Comparison of the gene expression and protein levels. Marine Environmental Research

Scholz, S.; Rosler, S.; Shaffer, M.; Hornung, U.; Schartl, M.; Gutzeit, H.O. 2003. Hormonal induction and stability of monosex populations in the medaka (Orysias laptipes) – expression of sex specific marker genes. Biology of Reproduction, publicado 30-05-2003. 10.11095. bioloreprod. 103.016873

Scholz, S; Gutzeit, H.O. 2000. 17-alpha-ethinylestradiol affects reproduxtion, sexual differentiation and aromatase gene expression on the medaka (Oryzias laptipes). Aquatic Toxicology 50, 363-373

Sell, D.; Conway, L.; Clark, T.; Picken, G.B.; Baker, J.M.; Dunnet, G.M.; McIntyre, A.D.; Clark, R.B. 1995. Scienti.c criteria to optimize oil spill cleanup. In: Proceedings, 1995 International Oil Spill Conference. American Petroleum Institute, Washington, DC, pp. 595–610

Sharp, B.E.; Cody, M.; Turner, R. 1996. Effects of the Exxon Valdez oil spill on the black oystercatcher. In: Rice, S.D. Spies, R.B.; Wolfe, D.A.; Wright, B.A. (Eds.), Proceedings of the Exxon Valdez oil spill symposium. American Fisheries Society Simposium 18, Bthesda, MD, pp. 738-747.

Simes, C. D.; Bebianno, M. J.; Moura, J. J. G. 2003. Isolation and characterisation of metallothionein from the clam Ruditapes decussatus. Aquat. Toxicol. 63, 307-318

Sioli, H. 1968. Hydrochemistry and geology in the Brazilian Amazon region. Amazoniana 1: 267-277.

Soares, M.G.M. 1993. Estratégias respiratórias em peixe do Lago Camaleão (Ilha de Marchantaria), AM, Brasil. Tese de Doutorado. Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia /Fundação Universidade do Amazonas. Manaus, AM, Brasil, 146p.

Soazig, L.; Marc, L. 2003. Potencial uso of the level of the mRNA of as specific metallothionein isoform (MT-20) in mussel (Mytilus edulis) as a biomarker of cadmium contamination. Mar. Pollu. Bull. 46: 1450-1455

Spies, R.B.; Rice, S.D.; Wolfe, D.A.; Wright, B.A. 1996. The effects of the Exxon

Valdez oil spill on the Alaskan coastal environment. In: Rice, S.D.; Spies, R.B.; Wolfe, D.A.; Wright, B.A. (Eds.), Proceedings of the Exxon Valdez Oil Spill Symposium. American Fisheries Society, Anchorage, AK (USA), pp. 1-16 (25 Feb. 1993).

156

Spies, R.B.; Stegeman, J.J.; Hinton, D.E.; Woodin, B.; Smolowits, R.; Okihiro, M.; Shea, D. 1996. Biomarkers of hydrocarbon exposure and sublethal effects in embiotocid fishs from a natural petroleum seep in the Santa Barbara Channel. Aquat. Toxicol. 34:195-219.

Sprague, J. B. 1987. Effects of cadmium on freshwater fish. In: Nriagu, J. O., Sprague, J. B. (eds.), Cadmium in the Environment, John Wiley, Nova York, pp. 139-169.

Sprague, J.B. 1990. Aquatic Toxicology. In: Schrench, C. B. and Moyle, P. B. (Eds). Methods for fish biology. American Fisheries Society. Bethesda, Maryland, USA. P. 491-528

Steadman, B.L.; Stubblefield, W.A.; Lapoint, T.W.; Bergman, H.L. 1991. Decreased survival of rainbow trout exposed to No. 2 fuel oil caused by sublethal preexposure. Environ.Chem.Toxico. 10, 355-363

Stegeman, J. J.; Livingstone, D. R. 1998. Forms and functions of cytochrome P450. Comparative Biochemistry and Physiology 121C: 1-3.

Stegeman, J.J., 1993. The cytochrome P450 in fish. In: Hochachka, P., Mommsen,

T. (eds.), Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, vol. 2., Elsevier Science Publishers, Amsterdam, pp. 137-158.

Stegeman, J.J.; Brousuer, M.; DiGuilio, R.T.; Forlin, L.; Fowler, B.A.; Sanders, B.M.; Van Veld, P.A. 1992. Molecular responses to environmental contamination: enzyme and protein system as indicators of chemical exposure and effect. In: Huggett RJ, Kimerle RA, Mehrle PM, Bergman HL, editors. Biomarkers–biochemical, physiological and histological markers of anthropogenetic stress. Boca Raton, FL: Lewis, 235-335p.

Stegeman, J.J.; Hahn, M.E. 1994. Biochemistry and molecular biology of monooxygenases: current perspectives on forms, functions, and regulation of cytochrome p450 in aquatic species. ln: Malins, D.C., Ostrander, G.K. (Eds), Aquatic Toxicology: Molecular, Biochemical, and cellular perspectives. Lewis publishers, Boca Raton, FL, USA, pp. 87-206

Steinert, S. A. 1996. Contribution of apoptosis to observed DNA damage in mussel cells. Marine Environmental Research 42:253-259.

Steinert, S.A.; Streib-Montee, R.; Leather, J.M.; Chadwick, D.B. 1998. DNA damage in mussels at sites in San Diego Bay. Mutat.Res. 399:65-85.

Stevenson, C.; NG, B. 1999. Distribution of Copper, Nickel and Zinc in the Thames Estuary. Mar. Pollut. Bull. 38:328-331

Steyermark, A.C. 1999. Effects of the maternal identity and incubation environment on morphological, physiological, and behavioral traits in snapping turtles. PhD. Thesis, Drexel University, Phyladelphia, Pennsylvania 217 pp.

157

Steyermark, A.C.; Spotila, J.R. 2000. Effects of maternal identity and incubation temperature on snapping turtle (Chelydra serpentine) metabolism. Physiological and Biochemical Zoology 73:298-306

Takagi, Y.; Kobayashi, M.; Li, L.; Suzuki, T.; Nishikawa, K.; Yamamoto, M. 2004.

MafT, a new member of the small Maf protein family in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications 320:62–69

Teal, J.M.; Farrington, J.W.; Burns, K.A.; Stegeman, J.J.; Tripp, B.W.; Woodin, B.; Phinney, C. 1992. The west Falmouth oil spill after 20 years: Fate of fuel oil compounds and effects on animals. Mar. Pollut. Bull., 24:607-614

Teraoka, H.; Dong, W.; Tsujimoto, Y.; Iwasa, H.; Endoh, D.; Ueno, N.; Stegeman, J. J.; Peterson, R. E.; Hiraga, T. 2003. Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications 304, 223–228.

Thomas, R.E.; Rice, S.D. 1982. Metabolism and clearance of phenolic and mono, di-, and polynuclear aromatic hydrocarbons by dolly varden char. Archives of Environmental contamination andTtoxicology 38:70-77.

Thomas, R.E.; Rice, S.D., 1981. Excretion of aromatic hydrocarbons and their metabolites by freshwater and seawater Dolly Varden char. ln: Vernberg, F.J.; Calabrese, A.; Thurberg, F.; Vernberg, W. (Eds.) Biological Monotoring of Marine pollutants. Academic press, New York, pp.425-448.

Thurman, E. M. 1985a. Aquatic Humic Substances. In: Organic Geochemistry of Natural Waters. Dr. W. Junk Publishers, Dordrecht, pp. 273-361.

Trucco, R.G.; Engelhardt, F.R.; Stacey, B. 1983. Toxicity, accumulation and

clearance of aromatic hydrocarbons in Daphnia pulex. Environ. Pollut. A31, 191–202.

Turcanu, V.; Dhouib, M. ; Poindron, P. 1998. Nitric oxide synthase inhibition by

haem oxygenase decreases macrophage nitric-oxide-dependent cytotoxicity : a negative feedback mechanism for the regulation of nitric oxide production. Res. Immunol. Paris 149:741-744.

Val, A. L. 1997. The effects of Urucu crude oil on respiratory aspects of fish of the

Amazon. Resumos do International Symposium Biology of Tropical Fishes, Manaus, p. 107.

Val, A. L.; Almeida-Val, V. M. F. 1999. Effects of crude oil on respiratory aspects of

some fish species of the Amazon. In: Val, A. L., Almeida-Val, V. M. F. (eds.), Biology of Tropical Fishes, Editora do INPA, Manaus, pp. 277-291.

Val, A.L. 1996. Surviving low oxygen levels: Lessons from fishes of the Amazon. In: Val, A.L.; Almeida-Val, V.M.F.; Randall, D.J. Physiology and Biochemistry of the Fishes of the Amazon. Manaus-AM. p.59-73.

158

Val, A.L.; Almeida-Val, V.M.F. 1995. Fishes of the Amazon and their environments. Physiol. and Biochem. Features, Heidelberg: Springer Verlag., 224p.

Val, A.L.; Almeida-Val, V.M.F. 1997. Efeitos do petróleo sobre respiração de peixes da Amazônia. In: Martos, H.L.; Maia, N.B. (Eds.), Indicadores Ambientais. Pontifícia Universidade Católica, Sorocaba-SP, p.109-119.

Van Meter, R.J.; Spotila, J.R.; Avery, H.W. 2006. Polycyclic aromatic hydrocarbons affect survival and development of common snapping turtle (Chelydra serpentina) embryos and hatchlings. Environmental Pollution. 142: 466-475.

Varanasi, U. 1989. Metabolism of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in the Aquatic Environment. CRC Press, Inc. Boca Raton.

Vijayan, M.M.; Pereira, C.; Kruzynski, G.; Iwama, G.K. 1998. Sublethal concentrations of contaminant induce the expression of hepatic heat shock protein 70 in two salmonids. Aquatic Toxicology 40:101-108.

Volkmann, J.K.; Miller, G.J.; Revill, A.T.; Connell, D.W. 1994. Oil spills. In: Swan, J.M.; Neff, J.M.; Young, P.C. (Eds) Environmental implications of offshore oil and gas development in Australia -The findings of an independent review. Australian Petroleum Exploration Assoc., Sydney, Australia, pp. 509-695.

Vos, J.G.; Luster, M.I. 1989. Immune alterations.Hologenated Biphenyls, Terphenyls, Naphthalenes, Dibenzodioxins, and Related Products. In: Kimbrough, R. D.; Jensen, A.A. (Eds.) Elsevier Science Pub. pp. 295-322

Walker, I. 1991. Algumas considerações sobre um programa de zoneamento de Amazônia. In: Val, A.L., Figliuolo, R. Feldeberg, E. (Eds.). Bases cientificas para Estratégicas de Preservação e desenvolvimento da Amazônia. Vol. 1, INPA-Manaus.

Walker, I. 1995. Amazonian streams and small rivers. In: Tundisi, J.G., Bicudo, C.E. M., Matsumura-Tundisi, T. (Eds.) Limnology in Brasil. Soc. Bras. De Limnologia/Acad. Bras. de Ciências, pp. 167-193.

Walker, M.K.; Peterson, R.E. 1991. Potencies of polychlorinated dibenzon-p-dioxin,dibenzofuran,and biphenyl congeners,relative to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, for producing early life stage mortality in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquat. Toxicol. 21,219-238

Wallace, A. R. 1989. Travels on the Amazon and Rio Negro, with an account of the native tribes, and observations on the climate, geology, and natural history of the Amazon Valley. Londres, 363 pp.

Wang, Z.; Fingas, M.F. 2003. Development of oil hydrocarbon fingerpriting and identification techniques. Marine Pollution Bulletin 47:423-452.

Wang, Z.D.; Fingas, M.; Page, D. 1999. Oil spill identification. J. Chromatogr. 843:369-411

159

Wassenberg, D.M.; Swails, E.E.; Di Guilio, R.T. 2002. Effects of single and combined exposures to benzo(a)pyreno and 3,3’4,4’,5-pentachlorobiphenil on EROD activity and development in Fundulus heteroclitus. Marine Environmental Research 54: 279-283.

Weinstein, J.E.; Oris, J.T.; Taylor, D.H. 1997. An ultrastructural examination of the mode of UV-induced toxic action of fluoranthene in the fathead minnow, Pimephales promelas. Aquat. Toxicol. 39, 1–22.

Welch, W.L. 1993. How cells respond to stress. Sci. Am. 269:56-64

Wernersson, A.-S.; Dave, G. 1998. Effects of different protective agents on the phototoxicity of fluoranthene to Daphnia magna. Comp. Biochem. Physiol. C 120, 373–381.

Wesp, H.F; Tang, X.; Edenharder, R. 2000. The influence of automobile exhausts on

mutagenicity of soils: contamination with, fractionation, separation, and preliminary identification of mutagens in the Salmonella/reversion assay and effects of solvent fractions on the sister-chromatid exchanges in human lymphocyte cultures and in the in vivo mouse bone marrow micronucleus assay. Mutation Research 472:1-21.

WHO International Programme on Chemical Safety (IPCS), 1993. Biomarkers and

risk assessment: concepts and principles. Environmental Health Criteria 155, World Health Organization, Geneva.

Whyte, J. J.; Jung, R. E.; Schmitt, C. J.; Tillitt, D. E. 2000. Ethoxyresorufin-O-

deethylase (EROD) activity in fish as a biomarker of chemical exposure. Critical Reviews in Toxicology, 30, 347–570.

Willet, K.L.; Wassenberg, D.; Lienesch, L.; Reichert, W.; Di Giulio, R.T. 2001. In vivo and in vitro inhibition of CYP1A- dependent activity on Fundulus heteroclitus by the polynuclear aromatic hydrocarbon fluoranthene. Toxicol. Appl. Pharmacol. 177, 264-271.

Williams, J.H.; Farag. A.M.; Stansbury, M.A.; Young, P.A.; Bergman, H.L.; Petersen, N.S. 1996. Accumulation of hsp70 in juvenile and adult rainbow trout gill exposed to metal-contaminated water and/or diet. Environ. Toxicol. Chem. 15: 1324-1328

Wilson, R. W.; Wood, C. M.; Gonzalez, R. J.; Patrick, M. L.; Bergman, H. L.; Narahara, A.; Val, A. L. 1999. Ion and acid-base balance in three species of Amazonian fish during gradual acidification of extremely soft water. Physiological and Biochemical Zoology 72: 277-285.

Wood, C. M.; Matsuo, A. Y. O.; Gonzalez, R. J.; Wilson, R. W.; Patrick, M. L.; Val, A. L. 2002. Mechanisms of ion transport in Potamotrygon, a stenohaline freshwater elasmobranch native to the ion-poor blackwaters of the Rio Negro. Journal of Experimental Biology 205: 3039-3054.

160

Wood, C. M.; Matsuo, A. Y. O.; Wilson, R. W.; Gonzalez, R. J.; Patrick, M. L.; Playle, R. C.; Val, A. L. 2003. Protection by natural blackwater against disturbances in ions fluxes caused by low pH exposure in freshwater stingrays endemic to the Rio Negro. Physiological and Biochemical Zoology 76: 12-27.

Wood, C. M.; McDonald, D. G. 1982. Physiological mechanisms of acid toxicity to

fish. In: R. E. Johnson (ed.), Acid rain/fisheries, American Fisheries Society, Bethesda, pp. 197-226.

Wood, C. M.; Wilson, R. W.; Gonzalez, R. J.; Patrick, M. L.; Narahara, A.; Val, A. L.

1998. Responses of an Amazonian teleost, the tambaqui (Colossoma macropomum), to low pH in extremely soft water. Physiological Zoology 71: 658-670.

Zebühr, Y.; Näf, C.; Bandh, C.; Broman, D.; Ishaq, R.; Pettersen, H. 1993. An

Automated HPLC Separation Method with two Coupled Columns for the Analysis of PCDD/Fs, PCBs and PACs. Chemosphere 27:1211-1219.

Zweig, A.; Nachtigall, G.M. 1975. Photochemistry and Photobiology. Amer. Soc.

Photobiology, Biotech Park, Ausgusta, GA. 822: 257-259

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