INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA
NISLANHA ANA DOS ANJOS
ORIENTADOR: Prof. Dr. ADALBERTO LUIS VAL
CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. STEFAN SCHOLZ
MANAUS – AM 2008
Marcadores Moleculares em Astronotus ocellatus para o
Monitoramento Ambiental de Áreas Susceptíveis a Imp actos
causados pela Indústria de Petróleo
Tese de doutorado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Biologia
de Água Doce e Pesca Interior do Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia.
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ii
INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA
NISLANHA ANA DOS ANJOS
ORIENTADOR: Prof. Dr. ADALBERTO LUIS VAL
CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. STEFAN SCHOLZ
MANAUS – AM 2008
Marcadores Moleculares em Astronotus ocellatus para o
Monitoramento Ambiental de Áreas Susceptíveis a Imp actos
causados pela Indústria de Petróleo
Tese de doutorado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Biologia
de Água Doce e Pesca Interior do Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia.
iii
Dedico este trabalho
À minha amada mãe Izabel, por ter estado ao meu lado e ter me ensinado
e cobrado ser uma pessoa digna.
iv
Ficha Catalográfica
Nislanha Ana dos Anjos, 2008. Marcadores Moleculare s em Astronotus ocellatus
para o Monitoramento Ambiental de Áreas Susceptívei s a Impactos causados
pela Indústria de Petróleo. Manaus, INPA-UFAM. Tese de Doutorado. xxii
+160p.
1. petróleo; 2. cyp1a; 3. Astronotus ocellatus; 4. Danio rerio; 5. contaminação
aquática; 6. Amazônia Central; 7. expressão gênica.
SINOPSE A exploração da petrolífera de Urucu representa uma pressão contínua sobre os
ambientes aquáticos. Como os efeitos de qualquer contaminação se iniciam no
nível molecular, o objetivo principal deste trabalho foi estabelecer um marcador
molecular adequado em peixes amazônicos para detectar a exposição a
concentrações subletais de petróleo de Urucu na água. Foi utilizado primeiramente
um modelo totalmente caracterizado geneticamente e bem estabelecido para
análises toxicológicas: o embrioteste com Danio rerio. Foram testadas as
expressões dos genes marcadores ahr, cyp1a, hmox, hsp70, maft, mt e nrf2. A
expressão destes genes está relacionada a contaminantes ambientais e também
poderiam responder a exposição ao petróleo. O resultado dos testes desses genes
em D. rerio foi extrapolado para Astronotus ocellatus, uma espécie amazônica
abundante na região do Urucu. Exemplares de Astronotus foram expostos a
concentrações de óleo cru e fração solúvel, testando-se a expressão gênica de
marcadores apropriados. Foi feito também o fracionamento do petróleo de Urucu
por NP e RP-HPLC e a identificação dos compostos por GS-MS, para saber quais
substâncias tóxicas presentes no petróleo induziam o gene cyp1a.
Palavras-chave: petróleo; cyp1a; expressão gênica; Amazônia Central; Astronotus.
v
Agradecimentos
Ao meu orientador Dr. Adalberto Val pela orientação, confiança depositada, apoio, por
ser um exemplo de produção científica e pelo incentivo a explorar novas fronteiras.
À Dra. Vera Val por ter sempre incentivado, acreditado neste trabalho e por tudo que fez
para o sucesso do mesmo.
A PETROBRAS e ao Engenheiro Bruno Ladeira, pelo fornecimento do petróleo para os
experimentos de exposição.
A ETERNAL – Empresa de Reparos Terrestre e Naval Ltda. pelo recolhimento do
petróleo utilizado nos experimentos
Ao projeto PPI/PRJ # 0537, CNPq, Finep, FAPEAM – Pronex, Piatam III e IV pela
viabilidade financeira desse projeto e dos experimentos de exposição.
Às Dras. Maria de Jesus e Mônica Nozawa pela disposição na ajuda da correção
ortográfica deste trabalho.
Aos amigos Márcio Ferreira, Rafael Duarte, Katherine Lopez, André Santana, Alexandra
Bentes, Carolina Fernandez e Roziete Araújo na ajuda à coleta de tecidos e
organização dos experimentos de exposição; aos demais amigos do LEEM pelo
convívio e amizade.
Ao amigo MSc. Bruce Marshall pela ajuda e apoio com os detalhes da tese.
À guardiã do LEEM Nazaré Paula, às secretárias Raquel e Sylvia, à coordenadora
Angélica Laredo pela amizade e profissionalismo.
À Dra. Ângela Varella por ter com tanta competência coordenado o curso de Pós-
graduação em Biologia de Água Doce e Pesca Interior.
vi
A minha Mãe Izabel e toda minha família que sempre foram meu chão e mesmo de
longe, em todos os momentos me estimularam e apoiaram.
Aos amigos Carla Oran, Keylah Mara, Marinel Lorena, Roney Firmino e Socorro Rocha
que se envolveram de alguma forma ajudando-me na tese.
A Carminha e Elany por todo carinho, amizade e profissionalismo com que conduzem a
secretaria do curso.
Enfim, o meu profundo sentimento de gratidão a todos que me acompanharam e
ajudaram durante o período de doutoramento, no INPA, Brasil.
Na UFZ e Universidade de Leipzig, Alemanha:
Ao meu co-orientador Dr. Stefan Scholz pelo incentivo, aprendizado, por me permitir ter
explorado novas fronteiras, ter me ensinado a trabalhar com biologia molecular e por ter
acreditado neste trabalho desde o início, pelas discussões valiosas, paciência e
amizade.
À chefa do Departamento de Toxicologia Celular na UFZ, Dra. Kristin Schirmer, por ter
me recebido em casa, permitido estagiar em seu laboratório e pelo incentivo pessoal e
profissional.
Ao chefe do Departamento de Análises de Efeitos Diretos na UFZ, Dr. Werner Brack
pela oportunidade concedida de estágio, ensinamento e orientação na parte do
fracionamento.
Às queridas técnicas do Departamento de Toxicologia Celular, Sras. Peggy Wellner e
Nicole Stetefeld pelo aprendizado e acompanhamento durante o período de
aprendizagem com os embriões, e claro pela grande amizade.
vii
À equipe do Departamento de Análise de Efeitos Diretos: Urte Lübke, Ines Rein, Tobias
Schulze e Georg Streck pela ajuda no laboratório e aprendizado.
Ao DAAD pela concessão da bolsa, cuidado e incentivo aos alunos estrangeiros de
doutorado na Alemanha.
A minha Referat do DAAD Sra. Maria Salgado Martinez, por estar sempre
simpaticamente disponível e por ter ajudado na resolução dos problemas.
Ao projeto “Analyse toxischer Wirkungen auf der Basis veränderter Genexpression
im Danio rerio - Embryotest (Gen-DarT)” pela ajuda financeira em todas as análises
moleculares.
Ao projeto MODELKEY pelo apoio financeiro de toda a parte do fracionamento das
amostras de petróleo.
A minha primeira família alemã os Metzker, por terem me dado um lar e permitirem me
sentir em casa.
A minha segunda família alemã os Kluge, Marie Ackerman, Tobias Becker e Sarah
Steinfeld pelo carinho, amizade e participação nos momentos felizes e difíceis.
Aos colegas de trabalho Iva Sovanodinova, Alina Buraru, Till Luckenbach, Dana
Kühnel, Wibke Busch, Katja Scheffler, Doris Völker, Melanie, Sarah Hassanien,
Jackeline Gerhardt e Ulli Nallman, por todas as discussões, aprendizado e leituras
conjuntas de papers.
A todos que direta e indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
viii
Abstract
The objective of this study was to identify a suitable molecular marker to detect fish
exposure to sub-lethal concentrations of Urucu petroleum in the water. The molecular
markers ahr, cyp1a, hmox, hsp70, maft, mt, nrf2 and ß-actina (the constitutive
control) were tested using an established toxicological model, the Danio rerio
embryotest. The cyp1a gene proved to be the most reliable of all the molecular
markers. In the experiments with over 0.39% of petroleum concentration, the
presence of pericardial edemas and absence of pigmentation were found. Applying
degenerated primers, the cyp1a gene was cloned and sequenced using RT-PCR in
order to analyze its expression in the liver of Astronotus ocellatus, an Amazonian fish
species. The Astronotus ocellatus individuals were exposed to sub-lethal
concentrations of petroleum and to the soluble fraction of petroleum for 96 hours,
using three different conditions: acid, hypoxic and normal. With an increase in
petroleum concentrations, there was a correspondent increase in expression of the
gene until 0.889% concentration, when a decrease in expression occurred. All of the
individuals exposed to 1.78% of petroleum in the hypoxic group died. In the
experiments using the soluble fraction, an increase in concentration resulted in an
increase in cyp1a gene expression, with the exception of a sharp decrease in
expression at 1.56% concentration in the hypoxic group. The compounds present in
the Urucu petroleum which strongly induce the cyp1a gene were also identified,
using the D. rerio embryotest. The fractionation was conducted by the multi-step
technique NP and RP-HPLC, with the use of GC-MS for identification. Eighteen
different compounds were identified; all of them PAHs.
ix
Resumo
O objetivo deste trabalho foi identificar um marcador molecular apropriado para
detectar as concentrações subletais de petróleo na água, para o monitoramento de
áreas como a região do Urucu, onde há intensa exploração de petróleo. Os
marcadores moleculares ahr, cyp1a, hmox, hsp70, maft, mt e nrf2 e ß-actina (usada
como controle constitutivo) foram testados em um modelo toxicológico bem
estabelecido, o embrioteste com Danio rerio. O gene cyp1a foi o mais promissor
para as análises. Nos experimentos acima de 0,39% houve presença de edemas
pericardiais e ausência de pigmentação. Com o uso de oligonucleotídeos
degenerados, clonou-se e seqüenciou-se o gene cyp1a para analisar a expressão
no fígado de indivíduos de Astronotus ocellatus, espécie amazônica, por RT-PCR,
expostos a concentrações subletais de petróleo e fração solúvel por 96 horas, em
três condições: acidificada, hipóxica e regular. Nos experimentos de exposição ao
petróleo a expressão do cyp1a aumentou com o aumento da concentração, porém
em 0,889%, essa expressão sofreu uma queda. Todos os indivíduos expostos a
1,78% de petróleo e hipoxia morreram. Experimentos utilizando a fração solúvel
apresentaram aumento da expressão do gene com o aumento da concentração,
continuamente, com exceção do experimento em hipoxia que na concentração de
1,56% houve queda brusca na expressão. Foi feita a identificação dos compostos
presentes no petróleo de Urucu que induziam o gene cyp1a, utilizando o embrioteste
com D. rerio. O fracionamento foi feito pela técnica mult-step NP e RP – HPLC com
o uso do GC-MS para identificação. Foram identificados 18 compostos, sendo todos
PAHs.
x
Sumário
Abstract.........................................................................................................................viii
Resumo...........................................................................................................................ix
Lista de Figuras.............................................................................................................xiv
Lista de Tabelas..........................................................................................................xviii
Abreviaturas...................................................................................................................xx
1. Introdução Geral ........................................................................................................1
1.1 O Ambiente Amazônico.........................................................................................1
1.2 A Amazônia e o petróleo da Reserva de Urucu....................................................5
1.3 A toxicidade do petróleo em peixes.......................................................................8
1.4 Biomarcadores.....................................................................................................14
1.5 Justificativa..........................................................................................................20
1.6 Objetivo Geral......................................................................................................22
1.6.1 Objetivos específicos....................................................................................22
Capítulo 1 “Identificação de Biomarcadores em Zebrafish, Danio rerio, para
contaminação aquática com petróleo de Urucu, Amazonas, Brasil”.............................24
1. Introdução .................................................................................................................25
1.1 A espécie.............................................................................................................26
2. Material e Métodos................................................................................................... 28
xi
2.1 Exposição do Danio rerio a concentrações subagudas de petróleo (Urucu)..... 28
2.2 Captação das imagens dos embriões de D. rerio................................................30
2.3 Estudos da expressão dos genes ahr, cyp1a, hmox, hsp70, maft, mt e nrf2 em
Danio rerio.....................................................................................................................30
2.4 Análise estatística................................................................................................34
3. Resultados.................................................................................................................35
3.1 Mortalidade..........................................................................................................35
3.2 Teratogênia..........................................................................................................35
3.3 Indução dos Biomarcadores por Exposição do Zebrafish a diferentes
concentrações do petróleo de Urucu.............................................................................39
4. Discussão..................................................................................................................43
4.1 Teratogênia…......................................................................................................43
4.2 Biomarcadores potenciais para concentrações subletais de petróleo na
água...............................................................................................................................48
5. Conclusões................................................................................................................56
Capítulo 2 “Marcadores moleculares para contaminação por petróleo no peixe
amazônico Astronotus ocellatus (Oscar)”......................................................................57
1. Introdução..................................................................................................................58
1.1 Objetivo Geral......................................................................................................61
1.2 Objetivos específicos ......................................................................................... 62
1.3 A espécie ........................................................................................................... 62
xii
2. Material e Métodos....................................................................................................64
2.1 Exposição do A. ocellatus a concentrações subagudas de petróleo...................64
2.2 Expressão dos marcadores em concentrações subagudas de petróleo.............68
2.3 Clonagem dos genes cyp1a e ß-actina do Astronotus ocellatus.........................73
2.4 Análise Estatística...............................................................................................76
3. Resultados.................................................................................................................78
3.1 Mortalidade..........................................................................................................78
3.2 RNA das amostras de fígado de A. ocellatus expostos ao petróleo e a fração
solúvel do petróleo.........................................................................................................79
3.3 Clonagem dos genes ß-actina e cyp1a1 para o Astronotus ocellatus.................80
3.4 Expressão dos genes cyp1a e ß-actina...............................................................83
4. Discussão .................................................................................................................91
4.1 Mortalidade..........................................................................................................91
4.2 Clonagem e expressão do gene cyp1a e ß-actina em indivíduos de A. ocellatus
expostos ao petróleo e a fração solúvel do petróleo de Urucu.....................................94
5. Conclusões..............................................................................................................102
Capítulo 3 “Fracionamento do Petróleo de Urucu e aplicação de Danio rerio zebrafish
embriotestes”...............................................................................................................104
1. Introdução................................................................................................................105
1.1 Objetivo .............................................................................................................108
2. Material e Métodos..................................................................................................109
xiii
2.1 Teste para escolha das colunas e eluentes utilizados na extração da fase sólida
da fração solúvel de petróleo de Urucu.......................................................................109
2.2 Extração da fase sólida da fração solúvel de petróleo utilizando Cromabond easy
e Metanol.....................................................................................................................110
2.3 Fracionamento com Fase Reversa (RP) C18 - Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (HPLC)........................................................................................................111
2.4 Extração com Fase Normal – HPLC (NP – HPLC))..........................................112
2.5 Embriotestes com as frações do NP-HPLC.......................................................115
2.6 Identificação dos compostos que induziram a cyp1a por GC-MS.....................115
3. Resultados...............................................................................................................117
3.1 Extração da fase sólida da fração solúvel de petróleo de Urucu utilizando
Chromabond easy e metanol.......................................................................................117
3.2 Fracionamento com RP - HPLC C18 e expressão do gene cyp1a...................118
3.3 Fracionamento com NP – HPLC e expressão do gene cyp1a..........................119
3.4 Identificação dos compostos que induziram o gene cyp1a por GC-MS............121
4. Discussão................................................................................................................127
5. Conclusões..............................................................................................................134
Referências Bibliográficas .......................................................................................135
xiv
Lista de Figuras
Introdução Geral
Figura 1. Imagem LANDSAT da região do Urucu indicando a localização da Base de
Operações Geólogo Pedro de Moura - BOGPM.............................................................6
Capítulo 1. “Identificação de Biomarcadores em Zebr afish Danio rerio para
contaminação aquática com petróleo de Urucu ”
Figura 1. Exemplar de Danio rerio na fase adulta.........................................................26
Figura 2. Freqüência de mortalidade (%) nos embriotestes com D. rerio expostos as
diferentes concentrações da fração solúvel do petróleo de Urucu................................35
Figura 3. Efeitos da fração solúvel do petróleo de Urucu no desenvolvimento do D.
rerio. Indivíduos expostos por 48 horas às concentrações de 0,39% (B), 1,56% (C),
6,25% (D) e a Isowasser, controle (A)...........................................................................36
Figura 4. Presença de edemas no pericárdio dos embriões de D. rerio expostos a
diferentes concentrações da fração solúvel do óleo de Urucu. Controle (A, B, C);
0,39% (D, E, F); 1,56% (G, H, I) e 6,25% (J, L, M). As figuras 4A – 4L estão no
aumento de 20X, porém a 4M está no aumento de 8X, o que já seria o suficiente para
notar as anomalias na concentração exposta...............................................................37
Figura 5. Freqüência de edemas pericardiais em D. rerio em diferentes concentrações
de petróleo.....................................................................................................................38
Figura 6. Expressão de genes em embriões de zebrafish expostos 48 horas a fração
solúvel do petróleo de Urucu. Comparação entre os genes ahr, hmox, hsp70, maft e
nrf2t. A ß-actina foi usada como controle constitutivo (M= Marcador de peso molecular;
1 = controle; 2 = 0,0061%, 3 = 0,024%, 4 = 0,098%, 5 = 0,39%, 6 = 1,56% e 7 = 6,25%
de petróleo. A imagem representa um dos 3 experimentos. Cada banda representada
nos géis significa exposicao com 30 embriões..............................................................40
Figura 7. Expressão de genes em embriões de zebrafish expostos 48 horas a fração
xv
solúvel do petróleo de Urucu. Comparação entre cyp1a e mt. A ß-actina foi usada
como controle constitutivo; (M= Marcador de peso molecular; 1= controle; 2= 0,0061%,
3= 0,024%, 4= 0,098%, 5= 0,39%, 6=1,56% e 7= 6,25% de petróleo..........................41
Figura 8. Expressão de gene em embriões de zebrafish expostos por 48 h a fração
solúvel do petróleo de Urucu (M = Marcador de peso molecular; 1 = controle; 2 =
0,001525%; 3 = 0,0061 %; 4 = 0,024 %; 5 = 0,098 %; 6 = 0,39 %; 7 = 1,56%; 8 =
6,25% de petróleo e A = PCR com água, para controle). A ß-actina foi usada como
controle constitutivo. A imagem representa um dos três experimentos usados para a
análise densintométrica com o programa Image J (ver Fig. 9). ....................................41
Figura 9. Normalização da expressão do mRNA da cyp1a em embriões de D. rerio
expostos a fração solúvel do petróleo de Urucu. A normalização foi feita após a análise
densitométrica usando o gene actina como referência (ver Fig. 8). n = 3 experimentos
com 30 embriões em cada, havendo diferença significativa (teste de Dunnet) em
relação ao controle (p<0,05)..........................................................................................42
Capítulo 2. “Marcadores moleculares para contaminaç ão por petróleo em peixe
amazônico Astronotus ocellatus (Oscar)”
Figura 1. Exemplar adulto de A. ocellatus.....................................................................63
Figura 2. Exemplos de amostras de RNA dos fígados de A. ocellatus expostos ao
petróleo de Urucu (A) e a fração solúvel do petróleo de Urucu (B). M = marcador de
peso molecular Ladder 100pb.......................................................................................79
Figura 3. Fragmentos do RT-PCR para clonagem dos genes ß-actina (A) e cyp1a (B)
do A. ocellatus utilizando oligonucleotídeos degenerados. M= marcador de peso
molecular Ladder 100pb................................................................................................80
Figura 4. Alinhamento da seqüência do gene ß-actina do Astronotus ocellatus (Ao),
Oreochromis niloticus (On), Oryzias latipes (Ol) e Onchorhynchus mykiss (Om). O
alinhamento dessas sequências homólogas foi feito pelo ClustalW. *= homologia entre
as bases........................................................................................................................82
Figura 5. Alinhamento da seqüência protéica do gene cyp1a de Astronotus ocellatus
xvi
(Ao), Oreochromis niloticus (On), Oryzias latipes (Ol) e Onchorhynchus mykiss (Om).
O alinhamento das sequências foi feito pelo ClustalW. *= homologia entre as bases..82
Figura 6. Expressão dos genes ß-actina e cyp1a de indivíduos de A. ocellatus
expostos a diferentes concentrações de petróleo, experimentos em condições
regulares; M = marcador de peso molecular Ladder 100 pb.........................................84
Figura 7. Normalização da expressão de mRNA de cyp1a em A. ocellatus expostos ao
petróleo em condições regulares...................................................................................84
Figura 8. Expressão dos genes ß-actina e cyp1a de indivíduos de A. ocellatus
expostos a diferentes concentrações de petróleo, experimentos em condições de
hipoxia. M = marcador de peso molecular Ladder 100pb.............................................85
Figura 9. Normalização da expressão de mRNA cyp1a em A. ocellatus expostos ao
petróleo em condições de hipoxia.................................................................................85
Figura 10. Expressão dos genes ß-actina e cyp1a em indivíduos de A. ocellatus
expostos a diferentes concentrações de petróleo, em condições ácidas. M = marcador
de peso molecular Ladder 100pb..................................................................................86
Figura 11. Normalização da expressão de mRNA cyp1a em A. ocellatus expostos ao
petróleo em condições ácidas.......................................................................................86
Figura 12. Expressão dos genes ß-actina e cyp1a em indivíduos de A. ocellatus
expostos a diferentes concentrações da fração solúvel do petróleo, experimentos em
condições regulares. M = marcador de peso molecular Ladder 100pb.........................87
Figura 13. Normalização da expressão de mRNA cyp1a em A. ocellatus expostos a
fração solúvel do petróleo em condições regulares......................................................88
Figura 14. Expressão dos genes ß-actina e cyp1a em indivíduos de A. ocellatus
expostos a diferentes concentrações da fração solúvel do petróleo, experimentos em
condições de hipoxia. M = marcador de peso molecular Ladder 100 pb......................88
Figura 15. Normalização da expressão de mRNA cyp1a em A. ocellatus expostos a
fração solúvel do petróleo em condições de hipoxia.....................................................89
xvii
Figura 16. Expressão dos genes ß-actina e cyp1a em indivíduos de A. ocellatus
expostos a diferentes concentrações de petróleo, experimentos em condições ácidas.
M = marcador de peso molecular Ladder 100pb...........................................................89
Figura 17. Normalização da expressão de mRNA cyp1a em A. ocellatus expostos ao
petróleo em condições ácidas.......................................................................................90
Capítulo 3. “Fracionamento do Petróleo de Urucu e a plicação de Danio rerio
zebrafish embriotestes”
Figura 1. Resultado em gel de agarose da expressão dos genes ß-actina (controle
constitutivo) e cyp1a: 1 - 6 = controle apenas com Isowasser; 7- 12 = 6, 25% de fração
solúvel do óleo de Urucu, réplica 1; 13 -18 = 6,25% da fração solúvel do óleo de
Urucu, réplica 2. M= marcador de peso molecular Ladder 100pb...............................117
Figura 2. Cromatograma mostrando os picos de absorção dos compostos do
fracionamento da fração solúvel do petróleo de Urucu (A); gel de agarose da
expressão do cyp1a e ß-actina em D. rerio (B) e a normalização do cyp1a em relação
à ß-actina (C)...............................................................................................................118
Figura 3. Resultado em gel de agarose do embrioteste do fracionamento NP-HPLC da
fração B. As regiões marcadas em cores se referem as frações que induziram
fortemente a expressão do gene cyp1a e usadas para identificação dos compostos por
GC-MS. C= controle. M= marcador de peso molecular Ladder 100pb.......................119
Figura 4. Resultado em gel de agarose do embrioteste do fracionamento NP-HPLC da
fração C. As regiões marcadas em cores indicam as frações que induziram fortemente
a expressão do gene cyp1a; e que foram usadas para identificação dos compostos por
GC-MS. C= controle. M = marcador de peso molecular Ladder 100 pb.....................120
Figura 5. Resultado em gel de agarose do embrioteste do fracionamento NP-HPLC da
fração E. As regiões marcadas em cores indicam as frações que induziram fortemente
a expressão do gene cyp1a e que foram usadas para identificação dos compostos por
GC-MS. C= controle. M = marcador de peso molecular Ladder 100 pb.....................121
xviii
Lista de Tabelas
Capítulo 1. “Identificação de Biomarcadores em Zebr afish Danio rerio para
contaminação aquática com petróleo de Urucu ”
Capítulo 2. “Marcadores moleculares para contaminaç ão por petróleo em peixe
amazônico Astronotus ocellatus (Oscar)”
Tabela 1. Concentrações utilizadas nos experimentos de exposição da espécie A.
ocellatus ao petróleo de Urucu.....................................................................................66
Tabela 2. Concentrações utilizadas nos experimentos de exposição da espécie A.
ocellatus à fração solúvel do petróleo de Urucu...........................................................67
Tabela 3. Genes selecionados para a análise e sequências dos oligonucleotídeos
degenerados Forward e Reverse. As letras R, K e Y na seqüência forward do gene
cyp1a indica a substituição de bases no momento da síntese; R= A ou G; K= G ou T;
Y= C ou T......................................................................................................................72
Tabela 4. Genes e seqüências dos oligonucleotídeos específicos Forward e Reverse
para a espécie Astronotus ocellatus.............................................................................76
Tabela 5. Mortalidade de exemplares de A. ocellatus expostos as diferentes
concentrações do petróleo de Urucu............................................................................78
Tabela 1. Concentrações de petróleo nos experimentos realizados com D. rerio........29
Tabela 2. Genes selecionados para a análise e sequências dos oligonucleotídeos
Forward e Reverse........................................................................................................33
xix
Capítulo 3. “Fracionamento do Petróleo de Urucu e a plicação de Danio rerio
zebrafish embriotestes”
Tabela 1. Embriotestes realizados com as colunas utilizadas para extrair a fase sólida
da fração solúvel de Urucu. Os experimentos foram feitos com réplica e um controle
para todos utilizando apenas a Isowasser...................................................................110
Tabela 2. Compostos identificados com GC-MS na fração B do NP-HPLC................122
Tabela 3. Compostos identificados com GC-MS na fração C do NP-HPLC...............124
Tabela 4. Compostos identificados com GC-MS na fração E do NP-HPLC................126
xx
Abreviaturas °C Graus Celcius
µg Micrograma
µg/g Micrograma por grama
µg/l Micrograma por litro
µl Microlitro
µm Micrômetro
µM Micro mol
a adenina
ACN acetonitrila
AM Amazonas
As Arsênio
ATP Adenina tri fosfato
BaP Benzo-a-pireno
BNF benzonaftoflavona
BPH benzopireno hidroxilase
BR bilirrubina
BV biliverdina
c Citosina
Ca2+ Cálcio
CaCl2 Cloreto de cálcio
Cd Cádmio
Cl Cloro
CL50 Concentração letal - 50% da população morre
cm Centímetro
CN cianopropil
Cr Cromo
Cu Cobre
CvO2 Concentração do O2 sanguíneo
DCM Diclorometano
DDT Dicloro-difenil-Tricloroetano
DMBA Dimetil-benzo-antraceno
DNA Ácido desoxirribonucleico
EROD Ethoxyresorufin O-deethylase
Fe Ferro
g Grama
xxi
g Guanina
GC cromatografia gasosa
GST Glutationa-s-transferase
GTP Guanosina trifosfato
H+ Íon hidrogênio
H2C=CH2 Etileno
H2SO4 Ácido sulfídrico
H3C-CH3 Etano
HC≡CH acetileno
Hmox Heme oxidase
hpf Horas após a fertilização
HPLC cromatografia líquida de alta eficiência
HSPs Heat shok proteins
HX Hexano
KCl Cloreto de potássio
kg Quilograma
km Quilômetro
m Metro
m3 Metros cúbicos
ME Metanol
mg Miligrama
mg/l Miligrama por litro
MgSO4 Sulfato de Magnésio
ml Mililitro
mm Milímetro
mM milimol
mRNA Ácido ribonucleico mensageiro
MS espectrometria de massa
mt Metalotioneína
N2 nitrogênio líquido
Na+ Sódio
NaHCO3, Bicarbonato de sódio
nm Nanômetro
NP Fase Normal
O2 Oxigênio molecular
PACs Compostos aromáticos policíclicos
xxii
PAHs Hidrocarbonetos poliaromáticos
Pb Chumbo
pb Pares de base
PCBs Bifenil policlorados
PCBs policlorinados planares
PCDDs/Fs dibenzo-p-dioxinas e furanos
PCNs naftalenos
PCR Reacao em cadeia da polimerase
PGC poro de carbono grafitizado
pH Potencial hidrogeniônico
PHH hidrocarbonetos planares halogenados
PYE etildimetilsilicato
R reverse
RHP Randon hexamers primers-
RNA Ácido ribonucleico
ROS espécies reativas de oxigênio
RP Fase Reversa
SFC espectroscopia infravermelha
SH Substâncias húmicas
t timina
TAE Tampão Tris-Acetato
TCDD 2,3,7,8-tetracloro dibenzo-p-dioxinas
TCDF 2,3,7,8 – tetracloro dibenzofurano
TM Temperatura média de anelamento
U.I. Unidades internacionais
UVA Ultra violeta A
1
1. Introdução
1.1 O ambiente amazônico
A região amazônica possui a maior bacia de drenagem do mundo, com cerca
de 7.000.000 km2 (Santos e Ferreira, 1999). É formada por uma diversidade de
corpos d’água, como grandes rios, lagos, paranás, igapós, várzea e inúmeros
pequenos riachos que constituem uma das redes hídricas mais densas do mundo.
Com exceção dos rios maiores de águas brancas, cujas nascentes se encontram em
altas cadeias de montanhas andinas, quase todos os rios amazônicos resultam da
junção de pequenos riachos que drenam a floresta (Walker, 1991).
Essa grande diversidade de corpos d’água não está apenas relacionada a
forma e volume, mas também às características físico-químicas da água. Essas
podem ser classificadas em três tipos, de acordo com a sua cor, como água branca,
água clara e água preta (Wallace, 1989; Sioli, 1968, Lowe-McConnel, 1999):
Águas Brancas são águas turvas, mais ou menos da cor de barro, com
transparência entre 0,1 e 0,5 m. Elas nascem na região andina ou pré-andina; os
processos de erosão nas cabeceiras são fortes e a carga de sedimentos muito alta,
provocando a cor branca da água. Normalmente nas áreas onde a correnteza tem
baixa velocidade, os sedimentos são depositados e a transparência da água
aumenta, enquanto em outras áreas a correnteza invade os barrancos recebendo
novos materiais.
Nas proximidades de Manaus, um litro de água do Solimões-Amazonas
contem cerca de 0,1 g de sedimentos. As regiões andinas e pré-andinas são
formadas, em sua maioria, por sedimentos cretáceos, alcalinos e relativamente ricos
em sais minerais, refletindo na composição química da água, que é quase neutra
2
(pH= 6,5 a 7). São exemplos dessas águas os rios Solimões-Amazonas, Madeira,
Purus, Juruá, entre outros.
Águas Claras apresentam transparência entre 1,10 a 4,5 metros e coloração
variando de verde a verde-oliva, pois a maioria dos compostos húmicos presentes
nessas águas encontra-se adsorvidos (complexados) a partículas de argila e/ou
silte. Os rios de águas claras nascem nos maciços pré-cambrianos das Guianas e
do Brasil Central, em sua maior parte já fortemente erodidos. Como estas regiões
estão submetidas a estações secas e chuvosas bem marcadas, estes rios só
transportam quantidade apreciável de material em suspensão no período das
chuvas. De modo geral, o pH pode variar entre 5,5 e 7,0. Entre os rios podem ser
citados: Tapajós, Xingu, Trombetas etc.
Águas Pretas apresentam transparência entre 1,30 e 2,90 metros e
coloração variando de marrom claro a café. Ao contrário dos rios de água branca, os
de água preta não transportam material em suspensão em grandes quantidades.
Nascem nos escudos da Guiana e do Brasil Central ou nos sedimentos terciários, o
relevo é suave e pouco movimentado e os processos de erosão são poucos intensos
e reduzidos pela densa mata pluvial. Consequentemente, a carga de sedimentos é
baixa e os rios são transparentes. Por falta de cálcio e magnésio na maioria das
formações geológicas, as águas são ácidas (pH = 3,0 e 5,0), extremamente pobres
em sais minerais e baixa condutividade elétrica (8-20 µS/cm). Isto corresponde à
água destilada, com alguma impureza. A cor escura é provocada pela decomposição
do material orgânico produzido pelas florestas, resultando em vários produtos
solúveis como ácidos húmicos e fúlvicos que são causadores dessa coloração.
Apesar de serem conhecidos os agentes que originam a cor preta das águas, as
3
causas da sua produção na bacia amazônica são desconhecidas. São exemplos:
Rio Negro, Uatumã, Preto da Eva, Urubu, Cururu, entre outros (Sioli, 1984).
A Amazônia apresenta um grau elevado de compostos orgânicos - substâncias
húmicas (SH) - porém ainda não está claro o papel desses compostos para a região
amazônica (Matsuo e Val, 2003c). Estes compostos são responsáveis por parte da
acidez natural atribuída às águas pretas (Leenheer, 1980). A acidez destas águas é,
em parte, atribuída a determinados grupos funcionais das SH, notadamente os
compostos carboxílicos e hidroxil-fenólicos (Thurman, 1985a).
Como já foi citado, os corpos d’água preta são mais ácidos e abrigam uma
diversidade íctica especializada. Experimentos de laboratório com peixes amazônicos
indicaram que esses animais apresentam, quando expostos a águas ácidas, ajustes
fisiológicos semelhantes àqueles documentados em salmonídeos (Gonzalez et al.,
1998; Wood et al., 1998; Wilson et al., 1999), que toleram níveis de pH variável entre
4,0 e 5,0 (McDonald, 1983). Os peixes da Amazônia podem tolerar pHs ainda mais
ácidos (3,5 a 4,0) (Costa, 1995; Aride, 1998; Gonzalez et al., 1998; Matsuo, 1998;
Portela, 1998; Wood et al., 1998; Gonzalez e Preest, 1999; Wilson et al., 1999;
Ascón, 2000; Castro - Pérez, 2001; Gonzalez e Wilson, 2001; Gonzalez et al., 2002;
Matsuo e Val, 2002; Wood et al., 2002; 2003). Colossoma macropomum (tambaqui)
atinge o seu limite fisiológico para a tolerância ácida entre o pH 3,0 e 3,5 (Wood et al.,
1998; Wilson et al., 1999). Surpreendentemente, pH ácido pode ser uma vantagem
para esta espécie. Aride (1998) verificou que o tambaqui mantido cronicamente em
pH= 4,0, apresenta um maior ganho de peso em relação aos indivíduos em pH
neutro. Em exposição ao meio ácido, o tambaqui se alimenta mais para compensar
as perdas iônicas e, portanto, tem mais acesso à proteína para crescimento (Aride,
1998). A espécie neon tetra (Paracheirodon innesi) habita o rio Negro altamente e
4
tolera águas ácidas, com distúrbios moderados e de curta duração quando submetida
a pH = 3,5 (Gonzalez e Preest, 1999). Resultados semelhantes foram encontrados
para o cardinal (Paracheirodon axelrodi), espécie endêmica do rio Negro (Gonzalez e
Wilson, 2001; Matsuo e Val, 2003b). Exemplares de Corydoras adolfoi, uma espécie
nativa de águas ácidas do alto rio Negro, apresentaram distúrbios iônicos quando
expostos a pH 3,5 (Matsuo e Val, 2002).
Um dos efeitos fisiológicos que ocorrem em peixes em pH baixo é que ocorre
inicialmente um efluxo difusivo de íons, principalmente Na+ e Cl-, ao mesmo tempo
em que o influxo é, geralmente, inibido (McDonald, 1983). As perdas difusivas
parecem ocorrer por meio de junções paracelulares situadas nas brânquias
(McDonald, 1983), devido à competição entre os íons H+ e Ca2+ pelos mesmos sítios
de interação na superfície branquial (Pagenkopf, 1983; Playle et al., 1993b).
Outro fato peculiar na Amazônia é que, devido à decomposição da abundante
matéria vegetal nas altas temperaturas prevalescente, ocorre desoxigenação
(hipoxia). A variação sazonal na disponibilidade de oxigênio e corpos d’água
amazônicos podem resultar em períodos de profunda hipoxia (< 2 mg/L O2) (Val et
al., 1985).
Soares (1993), Graham (1997) e Val e Almeida-Val (1995; 1997) em estudos
sobre a respiração aérea em peixes da Amazônia, sugeriram que a grande
diversidade desses mecanismos e outras adaptações desenvolvidas durante o
processo evolutivo, para se ajustar às oscilações de oxigênio na água, auxiliou
várias espécies de peixes a desenvolver estratégias para o problema da baixa
concentração periódica de oxigênio em ambientes aquáticos na Amazônia, o que os
torna muito dependentes da interface água-ar. Peixes de respiração aquática
utilizam-se de outros mecanismos como a RSA (respiração na superfície aquática)
5
para obter oxigênio em situação de hipoxia. Destacam-se: tambaqui (Colossoma
macropomum), matrinchã (Brycon erythropterum), pacu (Mylossoma duriventris),
entre outros (Braum e Junk, 1982; Val e Almeida-Val, 1995; Val, 1996), que
expandem o lábio inferior, para canalizar a camada mais superficial da água rica em
oxigênio, para as brânquias (Braum e Junk, 1982; Val, 1993; 1996; Val e Almeida-
Val, 1999). Essas estratégias são consideradas vantajosas, por exemplo, em casos
de contaminação do ambiente aquático por gás sulfídrico (Brauner et al., 1999),
mas, podem tornar-se prejudiciais em ambiente aquático contaminado por petróleo.
O fato da Amazônia abrigar o maior complexo hidrográfico (~20% da água
doce do planeta) e a maior biodiversidade do planeta, incluindo com freqüência
corpos d’água com baixa salinidade, baixa concentração de O2, águas ácidas,
presença de substâncias húmicas (não só em rios de águas pretas), entre outros,
torna a região frágil, particularmente em cenários envolvendo contaminação aquática
por petróleo.
1.2 A Amazônia e o petróleo da Reserva de Urucu
Desde 1953, a Petrobrás vem atuando na Amazônia, quase sempre às
margens dos grandes rios à procura de petróleo. Em 1986, na região do rio Urucu
(Coari, AM), às margens do rio Solimões (368 km de Manaus), foram concluídos os
levantamentos sísmicos que indicaram a presença de campos de petróleo e gás,
com uma reserva estimada de 92 bilhões de barris de óleo e 52,7 bilhões de metros
cúbicos de gás natural (Petrobrás, 1994). As atividades de extração do produto
intensificaram-se após 1988, e a produção de petróleo no Amazonas atingiu 58.000
barris de óleo/dia em 2002, equivalente a 3,8% da produção total no Brasil
(Petrobrás, 1994).
6
A Base de Operações Geólogo Pedro de Moura (BOGPM) está localizada a
700 km a sudoeste da cidade de Manaus (Figura 1). É uma área de exploração de
petróleo sob risco contínuo de poluição decorrente de derramamentos acidentais
com óleo cru ou água de formação. Os dutos que transportam petróleo dos locais de
extração até a estação de tratamento estão distribuídos por toda reserva do Urucu,
passam sobre os igarapés que deságuam no rio Urucu. Portanto, esses ambientes
aquáticos estariam totalmente susceptíveis aos rompimentos e vazamentos
acidentais destes dutos. O fato dos riachos serem ambientes espacialmente
restritos, oligotróficos e de águas ácidas, indica que os efeitos deletérios produzidos
por acidentes com petróleo podem ser intensos e prolongados, em função da
suposta baixa capacidade de resiliência do sistema (Junk e Fürch, 1985; Phillips e
Rainbow, 1994; Walker, 1995).
Figura 1. Imagem LANDSAT da região do Urucu indicando a localização da Base de
Operações Geólogo Pedro de Moura - BOGPM.
O rio Urucu, como todos os rios amazônicos, é caracterizado por flutuações
aeroporto
rio Urucu
BOGPM
4°45’ S
65° 30’ W 65°00’ W
5°00’ S
7
fortes no nível do rio Solimões. É designado como águas altas o período que vai
desde janeiro a junho, com um aumento médio de 10 metros sobre o período de
águas baixas. Evidentemente, isto tem uma forte influência na concentração dos
contaminantes e a mobilidade destes nos locais afetados. Devido a estas flutuações
ambientais, torna-se difícil calcular o impacto da poluição no ecossistema e os riscos
potenciais.
Embora haja teoricamente medidas de segurança adotadas para o transporte
do petróleo da reserva de Urucu para a refinaria REMAN em Manaus e outros
pontos de distribuição, bem como freqüente vistoria das áreas onde os oleodutos
passam no interior da reserva, o risco de acidentes ambientais é sempre uma
preocupação. O impacto do petróleo sobre os organismos, particularmente em
peixes, pode resultar em distúrbios severos, conforme indicam vários estudos que
avaliam as alterações nos parâmetros fisiológicos em espécies da ictiofauna
amazônica (Costa et al., 1996; Mendes e Val, 1997; Val, 1997; Duncan, 1998;
Brauner et al., 1999; Val e Almeida-Val, 1999; Almeida-Val et al., 2002; Matsuo et
al., 2002; Paula-Silva et al., 2002; Matsuo, 2004).
As características peculiares dos ambientes aquáticos da Amazônia, como a
elevada concentração de substâncias húmicas (SH), tanto nos sistemas de água
branca quanto nos de água preta, podem afetar a biodisponibilidade das frações
tóxicas do petróleo aos organismos. Há trabalhos que parecem indicar que as SH
formam complexos com as frações do petróleo, com redução de sua toxicidade
(Haitzer et al., 1998), análogo ao que ocorre com a toxicidade dos metais.
Entretanto, outros trabalhos sugerem que as SH aumentam a solubilidade dos
contaminantes hidrofóbicos, com potencialização de sua toxicidade aos peixes
(Boehm e Quinn, 1973; Chou et al., 1986).
A B
8
1.3 A Toxicidade do Petróleo em Peixes
A contaminação aquática com petróleo é um problema ambiental no nível
mundial (Atwood, et al., 1987; Teal et al., 1992; Erikson, 1995; Heath, 1995; Sell et
al., 1995; Alkindi et al., 1996; Ba-Akda, 1996; Anderson et al., 1997; Kingston, 2002).
Derrames acidentais de óleo são uma ocorrência comum em todo o mundo,
em particular nos países com intensa atividade de exploração, produção e transporte
de petróleo. A ocorrência de derramamentos acidentais de tanques de petróleo tem
sido um impacto muito difundido. Os maiores derrames ocorridos nos últimos 40
anos foram o do Torrey Canion no Canal Inglês em 1967, o Monte Urquiola na Costa
da Espanha em 1976, o Amoco Cadiz na Costa da Franca em 1978, o Exxon Valdez
no Alaska em 1989 e o Sea Empress no Reino Unido em 1996. Embora os grandes
derrames sejam os causadores das grandes catástrofes, os de menor escala
também somam um número alarmante - dados anuais revelam uma média
aproximada de 12 pequenos acidentes por dia (Fingus, 1995).
O petróleo é uma substância oleosa, inflamável, menos densa que a água,
com cheiro característico e de cor variável entre negro e castanho escuro. É uma
mistura complexa constituída por três fases: a) uma gasosa ou volátil; b) uma
líquida, denominada óleo cru e c) uma sólida ou semi-sólida de natureza asfáltica. A
fase líquida é constituída de uma fração insolúvel em água, o óleo cru, e uma fração
hidrossolúvel, composta por hidrocarbonetos poliaromáticos (PAHs) e alifáticos,
como o benzeno, o tolueno e quantidades significantes de enxofre, vanádio,
nitrogênio e níquel que se acumulam nos tecidos dos organismos e que são
extremamente tóxicos (Engelhardt et al., 1981; Buchanam e More, 1986; Malan,
1986; Page et al, 1989; Baker, 1991; Teal et al., 1992; Val, 1993; Sell et al., 1995;
Bah-Akda, 1996; Davies et al., 1997; Kingston, 2002). A fração insolúvel, que
9
permanece na superfície da coluna d’água, pode limitar a penetração de luz no
ambiente aquático e, por conseguinte, resultar num efeito direto na disponibilidade
de oxigênio, com alterações (modificações) nos organismos. Em ambos os casos, os
peixes são afetados (Teal et al., 1992; Erikson, 1995; Alkindi et al., 1996; Anderson
et al., 1997; Brauner et al., 1999; Val e Almeida-Val,1999).
Um acidente com petróleo em águas interiores da Amazônia pode
desencadear, em princípio, dois efeitos drásticos em peixes, decorrentes das
adaptações respiratórias. O primeiro está relacionado com o efeito do óleo cru que
permanece na superfície da coluna d’água, podendo causar danos aos animais que
captam oxigênio na interface água-ar ou diretamente do ar. Nas espécies com
respiração aérea facultativa e obrigatória há uma maior exposição do epitélio
responsável pela troca gasosa ao óleo cru, que resulta em sérios danos nesses
tecidos e em um comprometimento da regulação iônica (Alkindi et al., 1996, Maco,
1996; Brauner et al., 1999). O segundo efeito está relacionado à fração solúvel do
petróleo, que se difunde com a água e prejudica as espécies de respiração aquática
obrigatória, causando desnaturação e oxidação de proteínas relacionadas ao
transporte gasoso. Nestas condições, por exemplo, a hemoglobina é oxidada em
larga escala para meta-hemoglobina, que é incapaz de ligar-se com o oxigênio
(Jensen, 1990; 1991; Brauner et al., 1993; Paula-Silva, 1999).
Além disso, na Amazônia dada a diversidade de habitats aquáticos, um
acidente com petróleo pode ter seus efeitos ampliados. Essa região apresenta
cheias regulares, o que faz com que o óleo derramado, dependendo da época,
escape das calhas dos rios e atinja um grande número de habitats. O óleo
derramado pode persistir por dias ou anos no sistema, afeta a estrutura das
comunidades e causa impacto direto na fauna e na flora, devido às alterações físico-
10
químicas da água e do sedimento, bem como em decorrência dos processos de
bioacumulação, bioconcentração e biomagnificação (Gray, 2002).
Organismos aquáticos expostos a xenobióticos podem exibir respostas
bioquímicas, fisiológicas e/ou comportamentais adversas, desencadeando um efeito
cascata em todos os níveis tróficos (Hamilton e Lemly, 1999; Stevenson e Ng, 1999;
O’Connor e Paul, 2000). Os padrões de acumulação de xenobióticos são diferentes
para distintos organismos e dependem do balanço entre as taxas de assimilação e
metabolização e eliminação dos compostos químicos (Livingstone, 1993; 1998).
Uma vez no ambiente aquático, os xenobióticos podem ser absorvidos por quatro
vias: a) alimentação, b) ingestão de água, c) pela pele e/ou d) por meio das
brânquias (Heath, 1995; Roesjijadi e Robinson, 1994). Para os peixes amazônicos,
devido aos processos de osmorregulação, a alimentação e a tomada branquial são
as principais, conforme sugerido por Val e Almeida-Val (1997; 1999). A ingestão de
água é a principal via de contaminação para peixes marinhos, enquanto a via
cutânea é importante para peixes que se encontram em estado larval (Heath, 1995;
Roesjijadi e Robinson, 1994).
Vários são os distúrbios fisiológicos causados pela exposição crônica ou
aguda ao petróleo. Martin Jr. e Black (1996) estudaram os efeitos da contaminação
por uma refinaria de petróleo em bagres de canal (Ictalurus punctatus). Os autores
utilizaram um conjunto de biomarcadores para avaliação aguda por metais pesados,
e detectaram um aumento significativo nos níveis de glicose sangüínea e em dois
parâmetros hematológicos: hemoglobina e ácido α-aminolevulínico desidratase,
cujas alterações indicam estresse e foram associadas às altas concentrações de
chumbo encontradas em sedimento. Este metal inibe a enzima δ-aminolevulinato
desidratase (ALAD) requerida nos primeiros estágios da síntese de hemoglobina no
11
tecido hematopoiético; esses distúrbios são etapas iniciais causadas pela presença
deste elemento. Alkindi e colaboradores (1996), ao analisarem parâmetros
endócrinos, osmóticos, respiratórios e hematológicos em Pleuronectes flesus
expostos à fração solúvel de petróleo, constataram vários distúrbios fisiológicos
profundos, como um “dramático” declínio na concentração do O2 sangüíneo (CvO2),
que pareceu ser a causa do aumento de noradrenalina no plasma, seguida de um
aumento significativo do hematócrito e hemoglobina.
A exposição dos peixes da Amazônia Hoplosternum littorale e Colossoma
macropomum ao petróleo de Urucu resultou em uma redução drástica de até 87% na
concentração de oxigênio dissolvido no sangue (Val e Almeida-Val, 1999). A fusão
das lamelas branquiais e a proliferação de células de cloreto no epitélio respiratório
de Glyptoperichthys joselimaianus submetidos à exposição do petróleo sugerem que
a fração solúvel desse poluente induz não somente alterações respiratórias, como
também, distúrbios no nível da regulação iônica (Farias e Costa, 1996). Matsuo e
colaboradores (2006) observaram que a exposição aguda do tambaqui ao petróleo
resultou em um aumento no efluxo de Na+. Entretanto, a espécie foi capaz de se
contrapor a esse efeito a partir de um estímulo nas taxas de influxo do íon. No
mesmo trabalho os autores também verificaram que a atividade da EROD na
exposição aguda à fração do petróleo de Urucu (2,8%) foi capaz de aumentar em 14
vezes em relação ao controle.
A análise de metais pesados em peixes da região do Urucu mostrou que a
bioacumulação de elementos-traços foi diferenciada entre Liposarcus pardalis e
Cichla monoculus, uma espécie detritívora e predadora, respectivamente, não se
detectando biomagnificação com o aumento do nível trófico (Anjos, 2003). Esses
resultados sugerem que cada organismo, mesmo exposto à mesma concentração
12
de contaminante, apresenta respostas fisiológicas diferentes. Houve diferença dos
níveis de metais encontrados entre L. pardalis e C. monoculus nos tecidos
analisados; porém, nenhuma das espécies apresentou altos níveis de todos os
metais, indicando que o nível trófico, isoladamente, não explica a concentração dos
metais nos tecidos dessas espécies. Isso, particularmente, pode ser um reflexo de
vários fatores como o movimento do contaminante no meio ambiente, a forma
química do metal, a concentração do contaminante nos diferentes compartimentos
ambientais, as vias de ingestão, o caminho percorrido pelo metal no sistema
circulatório do peixe, os mecanismos de detoxificação, a ação de proteínas como
metalotioneína, entre outros.
Alguns xenobióticos têm alta afinidade por membranas biológicas e interferem
dessa maneira com a integridade celular (Corcoran et al., 1994; Dekant e Vamvakas,
1995) Eles podem ligar-se a proteínas de membrana alterando os processos
celulares, o status energético e os gradientes iônicos, dentre outras conseqüências,
conduzindo à interferência em importantes funções celulares.
Algumas proteínas que funcionam como fator de transcrição são ativadas por
contaminantes ambientais, por meio da indução à expressão de genes específicos.
Muitas substâncias agem via membrana. Essa toxicidade basal (conhecida como
narcose polar e apolar) responde por mais de 70% de todas as substâncias
acumuladas. O distúrbio da membrana celular também afeta os gradientes iônicos,
em particular o de Ca+2. O íon cálcio é parte de uma cascata de sinalização
intracelular. Enzimas, como as proteases, nucleases e lipases são reguladas via
nível intracelular de Ca2+. O aumento do nível de Ca2+ é associado com a indução de
apoptose e modificação da expressão de muitos genes e proteínas (Farber, 1990;
Nicotera et al., 1990; Reed, 1990; Pan et al., 2001; Ermak e Davies, 2002).
13
Esclarecer como os xenobióticos atuam em nível celular é importante para o
delineamento de estratégias para mitigação de danos ambientais.
Como se pode observar, as alterações causadas por presença de
componentes do petróleo no ambiente aquático atingem diretamente os peixes,
causando mudanças adversas nos mais variados níveis da organização biológica,
desde o nível molecular até o nível populacional (Oost et al., 2003). Porém, todos os
efeitos de um contaminante químico em um organismo vivo podem ser explicados
por um evento inicial no nível molecular/celular.
Contaminantes como os hidrocarbonetos aromáticos polinucleares se
acumulam em altas concentrações nos tecidos de invertebrados, pois as taxas de
assimilação excedem às de metabolização e eliminação. No entanto, estes mesmos
poluentes em vertebrados, onde o metabolismo e a eliminação podem superar a
taxa de assimilação, ou não acumulam ou não é significativo. Ao contrário,
contaminantes pouco metabolizados ou eliminados, como o DDT, se acumulam ao
longo das cadeias tróficas e são encontrados em altas concentrações em tecidos de
predadores do topo de cadeia (Livingstone, 1998).
Dadas estas diferenças nas formas de metabolizar os xenobióticos, existe
uma necessidade de se detectar e avaliar o impacto de poluentes nos organismos
expostos, e não somente avaliar a quantidade de poluentes presentes no ambiente e
nos animais. Esta necessidade dá origem ao estudo e desenvolvimento de
biomarcadores bioquímicos, fisiológicos, moleculares, morfológicos ou que reflitam
efeitos biológicos nos organismos.
1.4 Biomarcadores
Biomarcadores são utilizados para acompanhar o comportamento aquático de
14
contaminantes ambientais, por via de regra, substâncias tóxicas com baixos níveis
na água. A presença de uma combinação de xenobióticos (como o petróleo) em um
ambiente aquático gera efeitos deletérios em populações. Esses efeitos tendem a se
manifestar apenas depois de períodos mais longos de exposição. Quando há
evidência do processo destrutivo, o efeito pode ter ocorrido em nível crítico para
reversão, por meio de ações convencionais de recuperação. Desta forma, é
fundamental prever efeitos nos níveis hierárquicos mais altos, antes que ocorram e
isto pode ser evitado pela análise de mudanças nos processos biológicos em níveis
hierárquicos inferiores, com a identificação de biomarcadores de efeitos que se
constituem na realidade em sinais de advertência (Baker, 1991; Heath, 1995; Ba-
Akda, 1996; Kingston, 2002; Oost et al., 2003).
Livingstone (1993) considera como biomarcadores os fluídos corpóreos, as
células ou os tecidos que indicam, em termos bioquímicos ou celulares, a presença
de contaminantes. Também se consideram como biomarcadores, as respostas
fisiológicas, comportamentais ou energéticas dos organismos expostos. Existem
assim biomarcadores moleculares, celulares ou sistêmicos, sendo alguns deles
específicos para determinados poluentes.
De acordo com NRC (1987) e Who (1993) e revisão de Oost (2003), os
biomarcadores podem ser subdivididos em três classes:
1. Biomarcadores de exposição , que incluem a detecção e medem um substrato
endógeno, seu metabólito ou o produto de uma interação entre um agente
xenobiótico e algumas moléculas alvo ou células, medidas em um compartimento do
organismo. Citam-se como marcadores desse tipo as atividades de enzimas
antioxidantes e a concentração de metalotioneína.
15
2. Biomarcadores de efeito incluem medidas bioquímicas, fisiológicas, alterações
em tecidos ou nos fluídos corporais de organismos associados a um estabelecido ou
possível dano na saúde ou doença, como a peroxidação de lipídios ou o dano de
DNA.
3. Biomarcadores de susceptibilidade indicam a habilidade inerente ou adquirida
de um organismo, para responder ao desafio da exposição a uma substância
xenobiótica incluindo fatores genéticos e mudanças em receptores, os quais alteram
a susceptibilidade de um organismo para aquela dada exposição.
Uma das vantagens ao utilizar os biomarcadores em níveis baixos de
organização biológica é a possibilidade de detectar precocemente os efeitos
deletérios de poluentes, antes de alterações evidentes em níveis superiores da
organização biológica. Estudos no nível populacional e de comunidade também
fornecem informações sobre as mudanças que ocorrem; porém, estas somente são
detectadas quando a comunidade já foi impactada.
Dentre os vários biomarcadores existentes disponíveis para as mais variadas
análises, existem sete biomarcadores que foram classificados como potencialmente
habilitados para serem testados, que são os mais sensíveis à exposição aguda ou
crônica ao petróleo de Urucu. São eles:
AhR , o mecanismo de ativação bioquímica dos PAHs nos organismos, inclusive em
peixes, ocorre através do receptor Ah (AhR, aryl hydrocarbon receptor) presente no
citoplasma da célula. AhR em sua forma inativa, estável, encontra-se acoplado a
duas proteínas hsp90 (heat shock protein, de peso molecular de 90 kDa). Quando os
compostos de hidrocarbonetos poliaromáticos (PAHs) são absorvidos pelos peixes,
as hsp90 são ‘desacopladas’ do receptor e ocorre a formação do conjunto
PAH+AhR, o qual é movido para o interior do núcleo por meio de um translocador
16
(ARNT, aryl hydrocarbon nuclear translocator). Uma vez no núcleo da célula, ocorre
a ligação deste complexo uma região promotora conhecida como XRE (xenobiotic
region enhancer), onde ocorrerá a transcrição gênica resultando na expressão de
CYP1A (Hahn, 1998).
CYP1A, da subfamília do citocromo P4501A (CYP1A) monoxigenase tem atraído
atenção devido a sua importante função na biotransformação de alguns compostos
como dioxinas, furanos, PCBs e hidrocarbonetos poliaromáticos (PAHs). Estas
enzimas são importantes para o metabolismo destes contaminantes e na
carcinogênese produzida por esses agentes. A indução de CYP1A por exposição a
xenobióticos levou ao seu uso como um biomarcador em estudos de monitoramento
de poluição em ambiente aquático (Devaux et al., 1998; Cao et al., 2000; Leaver e
George, 2000; Sarasquete e Segner, 2000). Inúmeros estudos mostram claramente
que os níveis de CYP1A são elevados na maioria das vezes em peixes coletados
em ambientes poluídos, e em alguns casos, a atividade da EROD (Ethoxyresorufin
O-deethylase) ou o nível protéico de CYP1A podem ser diretamente correlacionados
com a distribuição de xenobióticos, como PAHs ou PCBs, no meio ambiente
(Devaux et al., 1998; Sarasquete e Segner, 2000; Billiard et al., 2002; Monk et al.,
2003; Racky et al., 2004).
Em ambiente natural a resposta da CYP1A pode ter a influência de diversos
fatores que podem confundir a interpretação dos dados. Esses fatores podem ser:
misturas complexas de xenobióticos; parâmetros exógenos como temperatura e
estação do ano; fatores endógenos como nível hormonal ou condições fisiológicas
do peixe e idade; entre outros (Goksøyr e Forlin, 1992; Achasi et al., 1994;
Sarasquete e Segner 2000; Ortiz Delgado et al., 2002, Abu-Bakar et al., 2005).
17
HMOX1 (heme oxigenase) é a enzima que degrada os grupos heme (Maines, 1997).
Sua isoforma induzível, hmox1, aumenta a resistência celular contra o estresse
oxidativo e diminui a inflamação e rejeição do enxerto em humanos (Jaworski e
Klapperich, 2006). Hmox1 (proteína de choque térmico 32 – HSP32) é expressa
especialmente no baço e fígado, mas também na maioria dos tecidos quando ocorre
exposição a radicais livres. Como resultado da expressão da hmox1, as células
adquirem a resistência contra uma segunda e letal exposição aos radicais livres
(estresse oxidativo) (Applegatte et al., 1991). Esta proteína é dependente do
NADPH, oxigênio e citocromo P450, para produzir quantidades equimolares de
biliverdina (BV), monóxido de carbono e ferro. Biliverdina é subsequentemente
convertida para bilirrubina (BR) pela biliverdina-redutase. Dois genes separados,
hmox1 e hmox2, codificam as duas isoformas em mamíferos (que são
cataliticamente ativas). A isoforma hmox1 é citoprotetora e é induzida pelo seu
substrato heme, lesão por agentes oxidantes, óxido nítrico, íons de metal de
transição, hipoxia e citoquinonas inflamatórias em tecidos de mamíferos, incluindo
as células do rim e células derivada do rim. Um alto nível do hmox1 é
freqüentemente detectado no rim sob condições patológicas. Entretanto, os
mecanismos subjacentes na indução do gene hmox1 por indutores múltiplos não são
somente célula e tecido específico, mas também espécie específica. (Appenzeller et
al., 2006; Jarwoski e Klapperich, 2006).
HSP70 (proteínas de choque térmico, heat shock proteínas) são proteínas celulares
altamente conservadas presentes em todos os organismos que se examinou até
hoje (Morimoto et al., 1990; Welch, 1993; Feder e Hofmann, 1999; Basu et al.,
18
2002), incluindo peixes (Iwama et al., 1998). Nas células não estressadas, essas
proteínas têm função constitutiva, essenciais em vários aspectos do metabolismo de
proteína (Morimoto et al., 1990; Hightower, 1991; Nover, 1991; Hendrick e Hartl,
1993; Welch, 1993; Fink e Goto, 1998). Embora a indução de HSPs tenha sido
inicialmente associada à exposição ao choque térmico, vários estudos já mostraram
que a indução de HSP70 ocorre em resposta a uma variedade de estressores,
inclusive contaminantes aquáticos (Ryan e Hightower, 1994; 1996; Williams et al.,
1996, Appenzeller et al., 2006). Das HSPs, a HSP70 tem sido a mais amplamente
estudada, e várias hipóteses têm sido apresentadas sobre seu mecanismo de ação
durante a resposta ao estresse celular. A HSP70 também está presente no nível
constitutivo das células e tem sido mostrado ser importante no seu funcionamento
normal (Hightower et al., 1994). Esta proteína também é conhecida por auxiliar o
envolvimento das cadeias polipeptídicas nascentes, que age como uma chaperona
molecular, e media o reparo e a degradação de proteínas alteradas ou desnaturadas
(Kiang e Tsokos, 1998; Basu et al., 2002).
MAFT, descoberta em 2004 em zebrafish (Tagaki et al., 2004), é uma proteína
pequena pertencente a um grupo de famílias que tem sido identificada nos
vertebrados, divididas entre as pequenas e grandes subfamílias da MAF. As grandes
proteínas MAF incluem c-Maf, MafB, Nrl e L-maf/MafA/S-maf que contem um
domínio ácido N-terminal, que serve como um domínio de transativação. Os outros
membros da família como MafF, MafG e MafK, constituem a pequena família
protéica Maf que possui um bZIP mediando a junção do DNA e formação do dímero
em comum, mas carece de domínios de efeito transcripcional reconhecíveis. A
principal função dos membros da família MAF é regulação do gene nrf2 e proteção
19
celular, mas são ainda poucos os estudos que se tem sobre esse membro MAFT
(Tagaki et al., 2004).
MT, metalotioneína, é outra proteína rica em cisteína, de baixo peso molecular,
capaz de fazer várias ligações com metais. Contaminação com metais de transição
como cádmio induz a expressão de MT indisponibilizando o metal para a célula.
Vários trabalhos usam essa proteína como indicador de contaminação aquática com
metais (Hogstrand e Haux, 1990; Hyllard et al., 1995; Soazig e Marc, 2003; Simes et
al., 2003).
NRF2 é uma proteína detoxificante da fase 2; sua indução é responsável pela
citoproteção quando o organismo é exposto a baixos níveis de estresse oxidativo e
eletrofílico. Estudos in vivo usando NRF2 de ratos deficientes, claramente indicaram
o NRF2 como uma proteína crítica na regulação da expressão de glutationa s-
transferase (GSTs) e NAD(P)H quinona oxiredutase. NRF2 mostrou controlar a
decodificação de genes de outras enzimas detoxificantes da fase 2, como UDP-
glucuronil transferase 1A6, aflatoxina B1 aldeído redutase, e epoxihicrolase
microssômica. Além disso, para as enzimas de detoxificação da fase 2, foi
demonstrado a indução de proteínas antioxidantes durante o estresse oxidativo,
depende da ativação do gene nrf2. Na categoria de genes, heme peroxi-redoxin1, a
cadeia leve e pesada de ferritin, catalase, glutationa peroxidase, superóxido
desmutase e tioredoxin mostraram também ser regulado pelo nrf2 (Tagaki et al.,
2004).
Devido às características apresentadas por cada um dos sete genes
mencionados anteriormente, estes foram selecionados nesse estudo para as
20
análises de expressão gênica em peixes amazônicos expostos ao petróleo da
Reserva Petrolífera de Urucu.
1.5 Justificativa
Nos últimos anos a comunidade científica de um modo geral e as populações
dos países mais industrializados, tem voltado suas preocupações para o impacto
ambiental causado por profundas modificações feitas pelo homem, em particular no
ambiente aquático. O interesse por esse assunto é um reflexo crescente da
consciência mundial de que a água doce é um recurso natural esgotável e suas
fontes cada vez mais escassas.
Apesar de seus múltiplos usos e de sua importância econômica, o petróleo
apresenta um grande potencial como contaminante ambiental, particularmente nos
ambientes aquáticos, onde são construídas plataformas de extração, oleodutos,
gasodutos e também onde trafegam os navios-tanque. As contaminações por
petróleo em menor escala, mas crônicas, resultam de procedimentos de rotina na
limpeza de tanques, pequenos vazamentos nos locais de extração, resíduos de
refinarias, etc. (Kupchella e Hyland, 1993).
Peixes são considerados um modelo conveniente para o estudo de impactos
ambientais causados por contaminação do ambientes com xenobióticos e
considerados modelos desenvolvidos, uma vez que muitas espécies têm fertilização
externa, facilitando assim experimentos com ovos e embriões.
Como já relatado, qualquer dano no organismo se inicia em nível molecular e
em particular, os efeitos abaixo da toxicidade subaguda podem ser detectados pelas
medidas de marcadores apropriados. Estes podem servir como indicadores de
21
contaminação (biomarcadores), mas também indicam uma exposição que pode ter
efeitos crônicos e de longo prazo em organismos e populações.
Assim, para monitorar os efeitos da contaminação aquática por petróleo, faz-
se necessário, estabelecer de marcadores moleculares em organismos indicadores
de contaminação subaguda. Peixes são organismos marcadores (biomarcadores)
bem estabelecidos, uma vez que (i) foram estudados extensivamente em muitas
áreas impactadas ao redor de todo o mundo; (ii) são de grande importância
econômica e nutricional para a população humana; (iii) estão expostos diretamente a
contaminantes lançados diretamente na água ou lixiviados; (iv) estão distribuídos no
início, meio e fim da cadeia trófica aquática e (v) vários biomarcadores do nível de
toxicidade de agentes químicos presentes no petróleo estão disponíveis.
Em Urucu, um programa de monitoramento foi iniciado para a detecção de
alguns metais componentes da água de formação e frações do petróleo (cádmio,
cromo, chumbo e selênio). Esses testes já foram realizados na água e no sedimento
coletados no campo de exploração, assim como nas espécies de peixe Cichla
monoculus e Liposarcus pardalis expostas a essas frações (Anjos, 2003). Pretende-
se neste estudo tornar claro o efeito biológico nos organismos que serão testados.
Adicionalmente aos perigos relacionados à extração e transporte de petróleo,
a existência de poucos estudos sobre a fisiologia de animais aquáticos presentes em
riachos reforça a necessidade e a urgência dos estudos nestes ambientes, uma vez
que se desconhece até que ponto alterações antrópicas podem afetar o
comportamento da comunidade aquática presente nesses ambientes.
1.6 Objetivo Geral
Identificar marcadores moleculares sensíveis à presença de concentrações
22
subagudas de componentes do petróleo para o monitoramento ambiental de áreas
susceptíveis à contaminação na Amazônia, por meio de experimentos laboratoriais.
1.6.1 Objetivos específicos
Capítulo 1. “Identificação de Biomarcadores em zebrafish Danio rerio para
contaminação aquática com petróleo de Urucu, Amazonas, Brasil”
1. Estimar a sensibilidade da espécie Danio rerio (organismo modelo) ao
petróleo de Urucu (fração solúvel e óleo cru) por meio de análises teratogênicas e
mortalidade;
2. Analisar a expressão dos marcadores moleculares ahr, cyp1a1, hmox1,
hsp70, maft, mt e nrf2, em exemplares de D. rerio expostos a concentrações
subagudas do petróleo (fração solúvel e óleo cru) de Urucu.
3. Selecionar entre os marcadores acima descritos o de maior sensibilidade
ao petróleo de Urucu, para poder testar sua expressão em exemplares de
Astronotus ocellatus (espécie amazônica) expostos a concentrações subagudas de
petróleo.
Capítulo 2. “Marcadores moleculares para contaminação por petróleo em peixe
amazônico Astronotus ocellatus (Oscar)”:
1. Estimar a sensibilidade da espécie A. ocellatus ao óleo cru e fração solúvel
do petróleo em condições regulares (temperatura ambiente, pH neutro e normoxia),
em ambiente acidificado (pH= 3,5, normoxia e temperatura ambiente) e em ambiente
hipóxico (pH neutro, temperatura ambiente, hipoxia);
2. Clonar e analisar a expressão dos genes (marcadores moleculares)
selecionados por meio do experimento com Danio rerio (capítulo 1, objetivo 3) em
23
exemplares de acará-açu, A. ocellatus, expostos a concentrações subagudas de
petróleo, em um modelo dose-resposta, nas condições experimentais descritas
acima (objetivo 1).
Capítulo 3. “Fracionamento do Petróleo de Urucu e aplicação em embrioteste
de Danio rerio”.
1. Identificar os compostos presentes no petróleo de Urucu que induzem a
expressão do gene selecionado para análise.
24
Capítulo 1
“Identificação de Biomarcadores em Zebrafish, Danio rerio,
para contaminação aquática com petróleo de Urucu,
Amazonas, Brasil”
25
1. Introdução
Biomarcadores são mudanças bioquímicas, fisiológicas, histológicas ou
moleculares que medem efeito ou exposição a compostos químicos tóxicos.
Ecotoxicologistas usam biomarcadores para esclarecer relações causa-efeito entre
efeitos tóxicos no nível fisiológico e populacional e para prover ferramentas para o
biomonitoramento.
O uso de técnicas moleculares para examinar a expressão de genes tem
levado ao desenvolvimento de biomarcadores que medem o acúmulo de mRNA
específicos nos tecidos (Levine e Oris, 1999; Bowman e Denslow, 2000; McClain et
al., 2003; revisto por Oost et al., 2003; Robert e Oris, 2004; Roberts et al., 2006).
Essas técnicas permitem determinar uma taxa semi-quantitativa de diferenças na
expressão de milhares de genes potenciais com uma pequena amostra de tecido
(<100 mg). A vantagem de marcadores moleculares é que o número de genes e vias
fisiológicas que podem ser afetadas por exposição a contaminantes podem ser
investigadas utilizando uma amostra de tecido. Os organismos geralmente reagem à
exposição química alterando os níveis de expressão de múltiplos genes. Por isso,
uma ampla variedade de mudanças moleculares deveria ser monitorada para prever
o efeito potencial tóxico e seus mecanismos. Análises globais de expressão de
genes podem ser usadas para avaliar a exposição química e os efeitos tóxicos
associados com a alteração da expressão do gene (Nakayama et al., 2006).
Neste estudo avaliou-se a expressão de genes de sete potenciais
biomarcadores: ahr, cyp1a, hmox1, hsp70, maft, mt e nrf2, em um bem estabelecido
modelo para análises toxicológicas, o Danio rerio embrioteste.
Estes biomarcadores foram selecionados por estarem, de alguma forma,
relacionados a respostas com exposição a contaminantes, sejam eles PAHs, metais
26
pesados ou drogas. O principal objetivo desta pesquisa, além de avaliar os efeitos
causados em embriões de zebrafish pela exposição ao petróleo de Urucu, foi de
encontrar em modelo bem estabelecido, o marcador ideal para ser usado na
avaliação de possíveis contaminações de petróleo na Reserva de Urucu, utilizando
um peixe amazônico, o Astronotus ocellatus, abundante no local.
Este modelo bem estabelecido, D. rerio embrioteste, têm sido amplamente
utilizado para avaliar as respostas a contaminantes, quer seja por expressão de
genes ou análises teratogênicas, por meio das quais se podem avaliar as mudanças
ocorridas fenotipicamente.
1.1 A espécie
Danio rerio
A espécie escolhida para este estudo foi o Danio rerio, zebrafish, da ordem
dos Cypriniformes, família Cyprinidae. É uma espécie amplamente conhecida e bem
estudada, nativa da Ásia, podendo alcançar 3,8 cm de comprimento padrão (CP) em
laboratório, de importância ornamental e sua população pode dobrar de tamanho em
um intervalo de tempo de 15 meses.
Figura 1. Exemplar de Danio rerio na fase adulta.
27
Esta espécie, devido a seu pequeno porte, é de fácil manutenção no
laboratório e tem seu genoma totalmente seqüenciado, o que a torna altamente
viável para análises de expressão de genes. Os embriões foram utilizados no
estádio de blástula que é o período de 2 ¼ -5 ¼ horas após a fertilização (hpf).
28
2. Material e Método
2.1 Exposição do Danio rerio a concentrações subagudas de petróleo (Urucu)
Os embriões de Danio rerio utilizados nestes experimentos foram
provenientes de aquários existentes no Departamento de Toxicologia Celular – UFZ,
Leipzig-Alemanha. Esses aquários estão localizados no porão do departamento,
numa pequena sala fechada, que possui sistema de aquecimento com temperatura
constante de 27+0,5°C e renovação constante da água nos aquários, o nde os
animais foram alimentados uma vez ao dia com ração comercial.
Os embriões eram coletados pela manha, por volta das 9:30h (o que equivale
a geralmente 2 horas após a fertilização - hpf), e então levados ao Laboratório,
onde, em Microscópio BMS 143, fez-se a seleção dos embriões para os
experimentos, que eram expostos no estágio de Blástula (2,5 – 5,2 hpf). Os
experimentos eram iniciados por volta de 10:30h da manhã.
Nesses experimentos com o zebrafish utilizou-se apenas a fração solúvel do
petróleo. Um litro de petróleo do Urucu foi transportado de Manaus para o
Departamento de Toxicologia Celular-UFZ. Em recipientes de 200 ml de vidro de cor
escura, para evitar a evaporação e fotodegradação, contendo 100 ml de
ISOWASSER (água que contém os nutrientes necessários para o bom crescimento
do zebrafish: 0,77 mM NaHCO3, 0,08 mM KCl, 1 mM MgSO4 e 2 mM CaCl2, era
acicionado o óleo cru nas concentrações desejadas (Tabela 1), que era mantida sob
agitação por 24 horas, em agitador TECNAL com magneto. Após esse período, a
agitação era cessada e aguardava-se 60 minutos para a separação das frações. Em
seguida, com uma seringa de 10 ml, colhia-se a fração solúvel do petróleo, ou seja,
a parte inferior, que era transferida para um outro recipiente de vidro armazenado a
4°C ao abrigo do calor e luz.
29
Tabela 1. Concentrações de petróleo nos experimentos realizados com D. rerio.
Concentração
(%)
Volume de Petróleo
(µl/100ml de Isowasser)
1 Controle Zero
2 0,001525 0,1525
3 0,0061 0,61
4 0,024 2,4
5 0,098 9,8
6 0,39 39
7 1,56 156
8 6,25 625
Em cada experimento eram coletados em média 240 embriões no estágio de
blástula. Os experimentos eram feitos em placas de Petri de vidro, contendo 10 ml
da fração solúvel do petróleo nas devidas concentrações, e adicionados 30
embriões, todos no mesmo estágio de vida (blástula). As concentrações utilizadas
nos experimentos com zebrafish foram baseadas nas concentrações encontradas
como subletais (CL50) para a espécie amazônica A. ocellatus. Essas concentrações
foram fatoradas por 4 para determinar os níveis de exposição de Danio rerio.
Após adicionar os embriões nas concentrações estabelecidas, as placas de
Petri eram mantidas em uma incubadora a 27°C por 48 horas, sendo revisadas após
24 horas para verificar possíveis mortalidades e anomalias. Após essa revisão, as
placas eram novamente colocadas em incubadora até o final dos experimentos, 48 e
96 horas, e então eram observadas as porcentagens de mortalidade nos
experimentos.
Deve-se esclarecer que poucos experimentos tiveram duração de 96 horas,
30
devido à rigidez das leis na Alemanha, que limitavam até 2006 a exposição à
contaminantes a um período máximo de 48 horas. A partir de 2006, essa lei foi
mudada sendo permitido experimentos mais longos, desde que não envolvam
animais adultos.
2.2 Captação das imagens dos embriões de D. rerio
Após o tempo de exposição, as placas com os embriões eram observadas
em um microscópio Leica com uma câmera MZ16F acoplada e imagens digitais
eram captadas e transferidas diretamente para o programa computacional Leica
Application suite v.2.4.0 Essa observação teve como objetivo verificar se a
exposição ao petróleo causava mutagênese em D. rerio.
2.3 Estudos da expressão dos genes ahr, cyp1a, hmox, hsp70, maft, mt e nrf2 em
Danio rerio
Estes estudos foram feitos pelo uso da técnica RT-PCR (amplificação por
Transcriptase Reversa – Reação de Cadeia Polimerase) utilizando oligonucleotídeos
específicos de D. rerio dos genes de ahr, cyp1a, hmox1, hsp70, maft, mt e nrf2. O
gene ß-actina foi usado como controle constitutivo. Todos esses genes estão
disponíveis no GenBank (Tabela 2).
O fato dos efeitos moleculares causados por exposição a elementos tóxicos
serem semelhantes em todas as espécies permite a extrapolação também para
espécies de peixes da Amazônia. O protocolo da técnica vai descrito a seguir.
2.3.1 Extração do RNA total
O RNA total foi extraído dos embriões de Danio rerio sobreviventes nos
31
experimentos de exposição por homogeneização das amostras de tecido em 500µl
de reagente TRIzol para cada 20-30 embriões sobreviventes.
Os tubos Eppendorfs (Eppis) de 2,0 ml, enumerados de acordo com a
concentração, receberam os embriões sobreviventes. Os tubos recebiam, então,
uma leve lavagem com água MilliQ. Em seguida, toda a água era substituída por 500
µl de TRIzol e as amostras eram homogeneizadas e mantidas à temperatura
ambiente por 5 minutos, seguido de adição de 100 µl de clorofórmio e mistura por
inversão a temperatura ambiente por 3 minutos. Após esse tempo a amostra era
centrifugada a 12.000g, 4°C, por 5 minutos para a s eparação das três fases líquidas:
o sobrenadante que continha o RNA; a fase abaixo do sobrenadante, fase meio
esbranquiçada e fina, continha DNA, e a interfase que contém os compostos
orgânicos. A fase de trabalho era o sobrenadante com RNA.
Do tubo de Eppendorf retirava-se cuidadosamente o sobrenadante
(aproximadamente 250-280 µl) com uma pipeta de 200µl, com muito cuidado para
não haver contaminação com o DNA, que era transferido para um novo tubo. Ao
novo tubo adicionava-se um volume igual de isopropanol (aprox. 250 µl), misturava-
se brevemente no Vortex e armazenava-se no freezer a -20°C por no mínimo 20
minutos. Em seguida centrifugava-se novamente a 12.000g, 4°C, por 5 minutos. Um
pellet de RNA, fracamente visível, era formado no fundo dos tubos. O sobrenadante
era retirado com muito cuidado para não retirar o pellet, e 500µl de etanol 75% era
adicionado, misturando-se por inversão três vezes e centrifugando-se novamente a
12.000g, 4°C por 10 minutos, com remoção do sobrena dante. O tubo era mantido a
temperatura ambiente por 10 minutos para evaporar o etanol, com adição, a seguir,
de 20µl de água e incubação por 5 minutos a 60°C para dil uição total do RNA.
Quantificação do RNA - O RNA diluído em água foi quantificado por
32
espectrofotometria NanoDrop λ = 260-280nm, utilizando 1,5 µl do RNA total.
Integridade do RNA - foi conferida por eletroforese em gel de agarose 1,5%
usando 500ng do RNA total de cada amostra, estocado em freezer a -800C até o
momento das análises.
Digestão de DNA - A digestão de possíveis contaminações com DNA foi feita
utilizando o seguinte mix: para cada amostra de 2µg de RNA dissolvido em 10µl de
água MilliQ, foram adicionadas 1µl de DNAse (RNAse-free, Roche), 2 µl de 10X D -
Tampão e 7 µl de água MilliQ e mantido em um termociclador Biometra T3000 a
25°C por 15 minutos com volume final de 20 µl, utilizando-se 10 µl para controle em
gel de agarose 1% para verificar as possíveis contaminações com proteínas. Os 10µl
restantes foram utilizados para a síntese do DNA complementar.
2.3.2 Síntese do DNA complementar (cDNA)
Para síntese do cDNA foi utilizado 1µg do RNA total (diluído em 10µl de
DNAse para retirada de possíveis contaminações) acondicionado em tubo de reação
PCR de 0,2 ml e adicionado 2µl de Oligo dT18 primer (10µM). Estes tubos foram
colocados em um termociclador Biometra T3000, aquecido a 70°C por cinco minutos
e em seguida resfriamento em gelo. O MasterMix RT foi preparado com 4µl de
tampão 5X, 2µl das dNTPs (10mM), 0,5µl de Inibidor Ribonuclease (recombinante
40u/µl) RNAse Out e 0,5µl de H2O MilliQ. Esse RT-MasterMix foi adicionado à
solução com RNA para desnaturação, incubado por 10 minutos a 37°C. Em seguida
foi adicionado 1µl da Transcriptase Reversa MMLV (200 U/µl, Revert Aid,
Fermentas), com um volume final de 20µl de reação. Essa reação era incubada por
75 minutos a 42°C e inativada (10 minutos a 70°C us ando o termociclador Biometra
T3000). Após essa reação obteve-se o cDNA, que foi então amplificado por PCR.
33
2.3.3 PCR utilizando oligonucleotídeos específicos
O MasterMix de PCR foi preparado para cada reação com 2,5µl de tampão
10X de RT-PCR, 1µl de dNTP-mix (10mM), 17,8 µl água, 0,2 µl deTaq-Polymerase,
1µl de oligonucleotídeo forward, 1 µl de oligonucleotídeo reverse dos genes
selecionados (Tabela 2). Após o preparo do MasterMix foi adicionado 1µl do cDNA,
com volume final de 25 µl.
O ciclo tinha início com 94°C por 45 segundos; o an elamento ocorreu a 60°C,
30s, a extensão a 72°C, 45s e a sua extensão final a 72°C por 10 min. Dependendo
do tamanho do fragmento esperado, eram calculados os números de ciclos
necessários para ver a expressão desses genes. Estes ciclos foram realizados no
termociclador Biometra T3000, algumas vezes utilizando o Biometra Tgradiente.
Tabela 2. Genes selecionados para a análise e sequências dos oligonucleotídeos
Forward e Reverse.
Genes Seqüência dos oligonucleotídeos S TM (°C)
N° de ciclos
Registro no
GenBank
Tamanho (pb)
ß-actina GCCAACAGAGAGAAGATGACACAG F 56 25
AF057041 471
ß-actina CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAG R
ahr TACAGACTTCCAAAGAGGCACAC F 53,4 35 NM131264 211
ahr TGACATCCCAGATACCAGATTG R
hmox GCTTCTGCTGTGCTCTCTATACG F 52 35 NM199678 210
hmox CTCTCAGTCTCTGTGCATATCG R
hsp70 ATCACCATTACCAACGACCAG F 54 35 BI709911 232
hsp70 ATCTTCTCCTCCACTGCCTTCT R
maft GAGGGACCAACAACATTTCAG F 51,5 35 AB167543 230
maft ATTCAGACCAATCACAGCACAA R
34
cyp1a ATGAGCACCTGCGAAGAGT F 55 35 AW342687 397
cyp1a TGGCCTTGTCCTTTCAAAA R
mt TTTTGGAACACTCTCACAGCAC F 52,5 35 AW173921 203
mt ATTGCCAGATAAAGCACCCTAT R
nrf2 GTTTGTCCCTAGATGCAAGTCC F 52 35 AB081314 203
nrf2 TCTTCAGCTTGTCTTTGGTGAA R
S=Sentido; F=Forward; R=Reverse; TM= temperatura média de anelamento; pb=número de pares de base do fragmento.
A concentração do produto foi determinada por eletroforese em gel de
agarose 1% em tampão 1X TAE , corado com brometo de etídio em TAE, 0,001%
por 20 - 30 minutos em cuba a 120 W, e visualizada a intensidade das bandas em
luz UV e em seguida fotografadas.
No caso de dificuldade para detectar as diferenças nas expressões, devido a
possíveis degradações, utilizava-se o programa computacional Image J para análise
dos géis. As diferenças existentes nas expressões dos genes foram determinadas
por densintometria.
2.4 Análise Estatística
Os valores foram inscritos numa planilha de dados e manuseados para sua
apresentação sob a forma de média e erro padrão da média. O nível de significância
aceito nos testes estatístico foi de p < 0,05. A significância das diferenças entre
médias foi determinada por análise de variância (ANOVA), com o uso do teste de
Dunnet para as comparações múltiplas, quando necessário.
35
3. Resultados
3.1 Mortalidade
Os experimentos com zebrafish foram repetidos 20 vezes para
aperfeiçoamento do protocolo a ser usado para avaliar a exposição aguda à fração
solúvel do petróleo de Urucu. Serão apresentadas sete repetições dos
experimentos, após aperfeiçoar todos os fatores.
A mortalidade nos experimentos com embriões de zebrafish variou de 0 a
20%, não apresentando diferença estatística significativa entre as diferentes
concentrações testadas (Figura 2).
0
20
40
60
80
100
Controle 0,0061 0,024 0,098 0,39 1,56 6,25 25
Concentrações de petróleo (%)
Mor
talid
ade
(%)
Figura 2. Freqüência de mortalidade (%) nos embriotestes com D. rerio expostos as
diferentes concentrações da fração solúvel do petróleo de Urucu.
3.2 Teratogênia
Os embriões de D. rerio usados nos experimentos apresentaram anomalias
facilmente visíveis ao microscópio, como por exemplo, redução na pigmentação
(Figura 3), severos edemas pericardiais (Figura 4) e redução nos batimentos
cardíacos, os quais foram observados pela contagem em microscópio.
36
Foi observado redução na pigmentação em indivíduos expostos a partir da
concentração de 0,39%. Na concentração de 6,25% havia ausência total de
pigmentação em todos os indivíduos (30 embriões). Nos três experimentos
comparados ao controle não havia qualquer pigmentação pelo corpo. Neste estágio
os indivíduos encontravam-se em 52 hpf (Figura 3).
Figura 3. Efeitos da fração solúvel do petróleo de Urucu no desenvolvimento do D.
rerio. Indivíduos expostos por 48 horas às concentrações de 0,39% (B), 1,56% (C),
6,25% (D) e a Isowasser, controle (A).
Outro efeito causado nos embriões de D. rerio expostos à fração solúvel do
petróleo de Urucu foi a presença de edemas pericardiais nos indivíduos expostos à
concentrações superiores a 0,39% (Figura 4).
37
Figura 4. Presença de edemas no pericárdio dos embriões de D. rerio expostos a
diferentes concentrações da fração solúvel do óleo de Urucu. Controle (A, B, C);
0,39% (D, E, F); 1,56% (G, H, I) e 6,25% (J, L, M). As figuras 4A – 4L estão no
aumento de 20X, porém a 4M está no aumento de 8X, o que já seria o suficiente
para notar as anomalias na concentração exposta.
A Figura 5 mostra a freqüência desses edemas pericardiais em indivíduos
expostos às diferentes concentrações. Vale ressaltar que nas concentrações de
0,001525%; 0,0061%; 0,024%; 0,098% e na condição controle, os embriões não
38
apresentaram nenhum dos efeitos aqui mencionados. Os experimentos para avaliar
os efeitos teratogênicos nos indivíduos de zebrafish foram repetidos quatro vezes,
com 30 embriões por concentração, para se dar consistência aos resultados, e os
resultados foram semelhantes nos quatro experimentos. Ressalta-se que na
concentração 0,098% e nas frações inferiores a esta, não houve presença de
edemas pericardiais em nenhum dos indivíduos, e por isso não foram apresentados
no gráfico.
Figura 5. Freqüência de edemas pericardiais em D. rerio em diferentes
concentrações de petróleo.
Nota-se claramente que quanto maior a concentração de petróleo, maior a
freqüência das anomalias no pericárdio (Figura 4 e 5), quando comparados ao
controle. Na concentração 1,56% de petróleo, todos os indivíduos apresentaram
edemas, maiores que os encontrados na concentração anterior. Todos os embriões
expostos a 6,25% de petróleo apresentaram edemas de grande porte, o que pode
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5Fre
quên
cia
de e
dem
a pe
ricar
dial
(%
)
controle 6,25%
1,56 0,39 0,098
Concentrações de petróleo (%)
39
ser notado nitidamente nas figuras 4J, 4L e 4M. A figura 4M é um exemplo típico:
grandes edemas pericardiais e ausência de pigmentos no corpo.
3.3 Indução de Biomarcadores por Exposição do Zebra fish a diferentes
concentrações do petróleo de Urucu
Vários foram os genes utilizados para avaliar quais os melhores para detectar
a presença de concentrações subletais de petróleo de Urucu na água. O gene que
se mostrou mais promissor e adequado para dar continuidade com as análises foi o
gene cyp1a. Os outros genes, apesar da indução na presença da fração solúvel do
petróleo de Urucu, não possibilitaram uma interpretação consistente. Nesses
experimentos utiliza-se sempre um gene constitutivo para se certificar da integridade
da amostra. Neste estudo utilizou-se o gene ß-actina.
Nos genes ahr, hsp70, maft e nrf2 não foi observada relação de aumento da
expressão com o aumento da concentração de petróleo nas quais os embriões
estavam expostos. Na realidade a expressão desses genes nas diferentes
concentrações mostrou-se indiferente, sendo que alguns se expressaram até
mesmo no controle, como foi o caso do maft, sem diferença significativa em relação
às demais concentrações (Figura 6).
O gene hmox, que é um gene que responde a várias drogas e é usado para
análises farmacológicas e na área de cosmetologia, mostrou-se também
interessante. Esse gene expressou-se no controle, apresentou discreto aumento de
expressão até a concentração de 0,024%, diminuindo em seguida e, novamente,
voltando a aumentar até a concentração 6,25%, tendo sido observado os mesmos
resultados nas três repetições experimentais.
40
Figura 6. Expressão de genes em embriões de zebrafish expostos 48 horas a fração
solúvel do petróleo de Urucu. Comparação entre os genes ahr, hmox, hsp70, maft e
nrf2t. A ß-actina foi usada como controle constitutivo (M= Marcador de peso
molecular; 1 = controle; 2 = 0,0061%, 3 = 0,024%, 4 = 0,098%, 5 = 0,39%, 6 =
1,56% e 7 = 6,25% de petróleo. A imagem representa um dos 3 experimentos. Cada
banda representada nos géis significa exposição com 30 embriões.
O gene mt também seria um bom marcador; porém, este gene só apresentou
uma forte expressão na concentração de 1,56% de petróleo; cyp1a nos mesmos
experimentos mostrou-se bem mais sensível que o mt, sendo expresso em
concentrações a partir de 0,0061% e aumentando a expressão conforme o aumento
da concentração (Figura 7).
ß-actina
41
Figura 7. Expressão de genes em embriões de zebrafish expostos 48 horas a fração
solúvel do petróleo de Urucu. Comparação entre cyp1a e mt. A ß-actina foi usada
como controle constitutivo; (M= Marcador de peso molecular; 1= controle; 2=
0,0061%, 3= 0,024%, 4= 0,098%, 5= 0,39%, 6=1,56% e 7= 6,25% de petróleo.
Devido a esses resultados fizemos também outras três exposições para
certificar o efeito sobre o gene cyp1a e ainda adicionamos a concentração subletal
de 0,001525%, onde também se observou a expressão do gene cyp1a (Figura 8).
Para certificação foi feita a normalização do gene cyp1a em relação à actina (Figura
9).
ß-actina cyp1a
Figura 8. Expressão de gene em embriões de zebrafish expostos por 48 h a fração
solúvel do petróleo de Urucu (M = Marcador de peso molecular; 1 = controle; 2 =
0,001525%; 3 = 0,0061 %; 4 = 0,024 %; 5 = 0,098 %; 6 = 0,39 %; 7 = 1,56%; 8 =
6,25% de petróleo e A = PCR com água, para controle). A ß-actina foi usada como
controle constitutivo. A imagem representa um dos três experimentos usados para a
análise densintométrica com o programa Image J (ver Fig. 9).
M 1 2 3 4 5 6 7 8 A M 1 2 3 4 5 6 7 8 A
42
Figura 9. Normalização da expressão do mRNA da cyp1a em embriões de D. rerio
expostos a fração solúvel do petróleo de Urucu. A normalização foi feita após a
análise densitométrica usando o gene actina como referência (ver Fig. 8). n = 3
experimentos com 30 embriões em cada, havendo diferença significativa (teste de
Dunnet) em relação ao controle (p<0,05).
expressão relativa do gene cyp1a
0
20
40
60
80
100
120
Contro
l
0.00
1525
%
0.00
61%
0.02
4%
0.09
8%
0.39
%
1.56
%
6.25
%
contaminação com petróleo
área
da
band
a (p
ixel
s)
* *
*
*
* *
43
4. Discussão
Neste capítulo, foram avaliados os efeitos da fração solúvel do petróleo de
Urucu no desenvolvimento de embriões de Danio rerio. As análises teratogênicas
foram totalmente qualitativas, com o intuito de mostrar que mesmo sem grandes
esforços percebe-se que ocorrem mudanças fenotípicas visíveis, quando o animal
está exposto a estes contaminantes. Como o nosso interesse estava focado no
efeito químico no nível celular causado em peixes, fez-se o isolamento da fração
insolúvel (uma vez que esta apesar de também tóxica, representa mais uma barreira
física que química para os peixes) e utilizou-se apenas a fração solúvel do petróleo
nos experimentos. Analisou-se a expressão de biomarcadores que sao geralmente
utilizados para avaliar os efeitos de vários contaminantes como PAHs, PCBs,
temperatura, metais pesados, dispersantes, entre outros, em modelo para análises
toxicológicas, o Danio rerio embrioteste expostos a fracao soluvel do petróleo de
Urucu. Nosso principal objetivo era definir qual seria o biomarcador mais indicado
para avaliar o efeito de concentrações subletais do petróleo de Urucu sobre os
peixes.
4.1 Teratogênia
Enquanto existe uma extensa literatura descrevendo os efeitos de
contaminantes em animais adultos ou juvenis, há poucos estudos sobre os efeitos
de contaminantes como PAHs, metais pesados, dioxinas, etc. em embriões. Estudos
acerca do efeito de misturas mais complexas de contaminantes, como o petróleo,
sobre embriões e estágio larval de peixes inexistem. Esse primeiro estágio de vida
pode estar particularmente susceptível à exposição a PAHs, especialmente para D.
rerio, cujo habitat se sobrepõe aos ambientes com intensas pressões antrópicas.
44
Tem sido registrado que espécies de pequeno porte, ou indivíduos em seu
estado larval tendem a acumular mais metais, bem como outros contaminantes
(Heath, 1995; Incardona et al., 2004; Van Meter et al., 2006). Isto está
provavelmente associado ao fato de que espécies de pequeno porte possuem o
metabolismo mais acelerado e a área de contato com o contaminante (superfície
cutânea) é maior, estando assim mais expostos aos contaminantes (Heath, 1995).
Além disso, indivíduos em estado larval realizam suas trocas gasosas pela pele e a
superfície do seu corpo é susceptível à entrada de metais e outros contaminantes
(Roesijadi e Robinson, 1994; Heath, 1995). Embriões de zebrafish expostos à fração
solúvel do petróleo de Urucu apresentaram dois tipos de distúrbios: disfunções
cardíacas, com redução dos batimentos cardíacos e edema pericardial, e redução
de pigmentação.
Uma série de estudos laboratoriais e de campo foi realizada após o histórico
derramamento de petróleo Exxon Valdez ocorrido em 1989, que contaminou áreas
próximas aos locais de desova do arenque pacífico (Clupea pallasi) e do salmão
rosa (Oncohynchus gorbuscha). Os estudos focalizando o efeito de PAHs no
desenvolvimento de C. pallasi e O. gorbuscha (Brown et al., 1996; Carls et al., 1999;
Heintz et al., 1999; Hose et al., 1996; Kocan et al., 1996; Marty et al., 1997; McGurk
e Brown, 1996; Middaugh et al., 1998; Norcross et al., 1996; Spies et al., 1996),
juntamente com estudos sobre estes contaminantes em outras espécies de peixes
(Coulliard, 2002; Middaugh et al., 1996, 2002; Polino e Holdway, 2002), mostraram o
que parece ser um conjunto comum de defeitos no desenvolvimento de embriões de
teleósteos expostos as misturas de PAHs derivados do petróleo. Os efeitos mais
comuns foram: má formações resultante da exposição a PAHs, incluindo edemas
pericardiais e no saco vitelínico, redução da mandíbula e defeitos no esqueleto,
45
descritos como lordose e escoliose (curvatura dorsal). Foram também observadas
redução na taxa de batimentos cardíacos e arritmia cardíaca. Há relatos de que o
aumento da temperatura do óleo cru muda a composição de PAHs,
predominantemente de dois anéis (naftalenos) para três anéis (fenantreno),
causando um aumento da toxicidade e resultando num aumento da freqüência de
deformidades (Carls et al., 1999; Heintz et al., 1999). Efeitos subletais significativos
também foram observados em outros níveis da organização biológica. No nível
comportamental, por exemplo, embriões de salmão rosa expostos ao aumento de
temperatura do óleo cru, foram quando juvenis liberados e retornaram, quando
adultos, em número significantemente reduzido (Heintz et al., 2000). Os mecanismos
de ação de PAHs ainda continuam desconhecidos.
Os peixes, especialmente os primeiros estágios de vida, estão entre os
vertebrados mais sensíveis à toxicidade de hidrocarbonetos planares halogenados
(PHHs), particularmente ao 2,3,7,8 tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD) (Walker e
Peterson, 1991; Teraoka et al., 2003). Sensibilidade diferencial de peixes nos
primeiros estágios de vida (ELS) a toxicidade de dioxinas tem sido estudado em
salmonídeos e outras espécies (revisado por Elonen et al., 1998; Hahn, 2001). A
sensibilidade de peixes em seu estado embrio-larval a compostos como dioxinas faz
desses organismos excelentes modelos de estudo do efeito de PHH para espécies
aquáticas e seu risco para a saúde humana (Stegeman e Hahn, 1994).
Toxicidade devido a PAHs e contaminantes similares variam entre espécies e
depende grandemente da forma do contaminante, da via de exposição e do estágio
de vida do organismo (Hall, 1980). Exposição crônica ou aguda de PAHs ou petróleo
causa problemas de saúde e reprodutivos em várias espécies de animais
(Steyermark, 1999; Klerks et al., 1997; Jenssen, 1996; Alam e Brim, 2000).
46
Exposição a concentrações sub-agudas de hidrocarbonetos derivados do petróleo
originados de um derrame, pode não ser suficiente para causar efeitos biológicos
imediatos nos animais domésticos e silvestres, mas poderiam produzir efeitos sutis,
causando danos de longo-prazo para os animais aquáticos.
Enzimas microssomais que metabolizam PAHs para outros compostos, os
quais podem ser até mais tóxicos que o composto original, estão presentes em
embriões de vertebrados e outros eucariontes (Hoffman e Gay, 1981; Varanasi,
1989). Hoffman e Gay (1981) registraram que pequenas quantidades (0,02-0,5%) de
benzo(a)pireno (BaP), criseno e 7,12 dimetil-benzo(a)antraceno (DMBA) em
misturas de hidrocarbonetos de petróleo, causaram significante diminuição na
viabilidade de ovos incubados, bem como um aumento na mortalidade e numerosas
deformidades severas em embriões de patos selvagens (Anas platyrhynchos). Estes
PAHs são constituintes de óleo cru e refinado.
Deformidades severas decorrentes da exposição ao petróleo também foram
descritos por autores em trabalhos com outros vertebrados. Bishop e colaboradores
(1996; 1998) identificaram deformidades em embriões e juvenis de tartarugas
coletados em Ontário, Canadá e sugeriram que as deformidades estavam
relacionadas à exposição dessa espécie a toxinas no ambiente, como pesticidas
organoclorados e similares. Além disso, embora um embrião juvenil possa parecer
normal anatomicamente, danos causados por toxinas podem afetar o mecanismo
neurológico e fisiológico dos mesmos (Steyermark e Spotia, 2000). Van Meter e
colaboradores (2006) detectaram uma ampla variedade de deformidades nos
embriões e juvenis da tartaruga Chelidra serpentina expostos ao petróleo e PAHs.
Essas deformidades foram classificadas de acordo com o grau de severidade: baixa
(pequena deformidade na cauda), moderada (ausência ou desenvolvimento
47
assincrônico dos membros) e letal (deformidades no trato digestivo, falta de dois ou
mais membros, crânio fundido). Exposição a petróleo, BaP e DMBA tem um efeito
detrimental em sobrevivência e desenvolvimento de embriões de tartarugas (Van
Meter et al., 2006).
Polino e Holdway (2002) encontraram deformidades em embriões de peixe
arco-íris (Melanotaenia fluviatilis) após exposição a óleo cru e seus PAHs. As
deformidades mais severas foram edema pericardial, anomalias na mandíbula e
desvio na coluna em vertebrados. Acúmulo dos componentes do petróleo no saco
vitelínico de larvas foi sugerido como um mecanismo de teratogênese contínua no
desenvolvimento larval. Wassenberg e colaboradores (2002) verificaram
anormalidades similares (edema pericardial) no desenvolvimento embrionário em
Fundulus heteroclitus expostos a várias concentrações de BaP. Dessa forma
constata-se que as deformidades causadas pela exposição ao petróleo e seus
componentes são similares em vários grupos de répteis, aves e peixes.
Também são descritos efeitos severos em várias espécies de peixes
coletados no Rio Elisabeth na Virgínia, que apresentaram câncer, cataratas e
ulcerações na pele como resultados da exposição a concentrações extremamente
altas de PAHs em várias áreas ao longo deste rio (Hugget et al., 1992) .
Em zebrafish centenas de genes que estão envolvidos na formação de
virtualmente todos os órgãos e têm sido identificados em larga-escala por “varredura
mutagênica” (Haffter et al., 1996). Conseqüentemente, os fenótipos resultantes da
perda da função do gene por meio de mutação, pode ser comparado a má
formações que resultam da exposição dos embriões a contaminantes. Esse enfoque
“genético químico” foi usado recentemente para identificar mecanismos específicos
de toxicidade no desenvolvimento (Peterson et al., 2000; 2001).
48
A redução na pigmentação encontrada neste trabalho foi um evento único,
que ainda não foi observado em outros trabalhos com embriões até o momento. O
mecanismo de ação dos elementos tóxicos presentes no petróleo que causa
ausência ou redução dos elementos pigmentantes não está claro. Supõe-se que
alguma substância, ou a combinação de algumas delas, agem diretamente nos
genes responsáveis pela pigmentação, suprimindo esses genes, não ocorrendo
assim a pigmentação no corpo do embrião. Porém, esta parte do estudo necessita
de muito mais informações para que se possa entender os mecanismos envolvidos
na despigmentação ou supressão dos genes envolvidos nesse processo.
4.2 Biomarcadores potenciais para concentrações sub letais de petróleo na
água
A maioria dos estudos sobre toxicidade do petróleo e tratamentos com
dispersantes está relacionada a efeitos em invertebrados, presumidamente por que
eles são relativamente mais fixos quando comparados a peixes, e de mais fácil
manuseio e manutenção em laboratório. Entretanto, esse fato tem sido mudado nos
últimos anos. Vários estudos têm sido desenvolvidos para definir uma espécie como
modelo, que poderia ser aplicada com grande facilidade a testes de toxicologia,
dando respostas rápidas e facilitando a repetição quando preciso.
O zebrafish é uma espécie modelo amplamente usada em todo o mundo em
testes de toxicidade, diferentemente dos nossos peixes amazônicos, esta espécie
está totalmente caracterizada do ponto de vista genético. Os testes em embriões de
D. rerio (embrioteste) têm sido empregados nos mais diversos estudos, que vão
desde monitoramente de ambientes aquáticos a testes da indústria de cosméticos
na Europa (a L’Oreal, Paris adotou recentemente o “D. rerio embrioteste”, devido a
49
proibição de experimentos com animais). Todos os biomarcadores utilizados neste
estudo estão registrados no GenBank, o que facilitou bastante as análises. Foram
escolhidos os genes levando-se em consideração as respostas desses genes
quando os organismos eram expostos a diferentes estressores. O estressor utilizado
neste trabalho foi a fração solúvel do petróleo de Urucu em diferentes
concentrações, pelo fato do petróleo ser uma mistura complexa de vários compostos
cuja composição está relacionada com a origem geológica do óleo. O fato de o
experimento ter sido conduzido com uma mistura complexa pode ter gerado
respostas múltiplas de expressões dos genes. Contudo, o gene que realmente
mostrou-se mais promissor foi o cyp1a, o que já parcialmente esperava-se.
O petróleo é uma mistura complexa, formada por hidrocarbonetos
poliaromáticos (PAHs) e alifáticos e quantidades significativas de metais pesados
(Kingston, 2002). No contexto de toxicologia aquática, tem-se que os PAHs agem
como contaminantes do tipo “baseline” ou não específicos através do modo de ação
de narcose apolar, ou pela ativação da via do receptor Aril (AhR) que leva à indução
do gene da cyp1a.
A toxicidade de PHH também é pensada ser dependente do AhR em todos
vertebrados. Estudos usando AhR de ratos tem confirmado que o AhR é um pré-
requisito para toxicidade de PHH. AhR tem um papel crítico no desenvolvimento do
fígado, ciclo celular e remodelamento vascular, que é independente de ligas
administradas via exógena (Lahvis et al., 2000; Hestermann et al., 2002). Estudo
sobre a função do AhR usando ratos deficientes tem revelado que o gene ahr pode
ser responsável por muitos, senão por todos, os efeitos tóxicos causados por TCDD,
por meio de biotransformação, além da indução do gene cyp1a e outros genes
induzidos pelas dioxinas.
50
O gene ahr, por estar relacionado com a expressão de genes como cyp1a,
poderia ser um promissor biomarcador na contaminação aquática com petróleo.
Embora este gene tenha sido expresso em todas as concentrações e não expresso
no controle (Figura 5), não se notou uma progressão e nem diferença na expressão
entre as diferentes concentrações. Ao se reduzir o número de ciclos do PCR, notou-
se que realmente a expressão era igual em todas as concentrações e, portanto,
tornou-se inviável utilizá-lo como biomarcador neste caso.
A expressão do hmox1 parece ser uma resposta geral para o estresse
oxidativo na pele, porque é induzido pela radiação UVA e pelo tratamento com
peróxido de hidrogênio (Appenzeller et al., 2006). A regulação do hmox1 parece
estar relacionada com a resposta inicial do sistema imune e controle da cicatrização
de feridas (Jaworski e Klapperich, 2006). Esta enzima também está envolvida com o
catabolismo do grupo heme que produz o pigmento de biliverdina (BV) e seu
metabólito bilirrubina (BR). Além disso, a enzima também possui propriedades
citoprotetoras e tóxicas. Em altas concentrações, BR prejudica a função mitocondrial
e inibe várias enzimas. Em contraste, nas concentrações fisiológicas, BR e seus
glucuronídeos são anti-oxidantes potentes (Abu-Bakar et al., 2005; Jaworski e
Klapperich, 2006). Foi observada a inducao dos genes cyp2a5 e hmox1 em fígados
de camundongos expostos ao cádmio, onde a indução máxima ocorreu 3 horas após
o tratamento (um aumento de 31 vezes em comparação com o controle) e diminuiu
drasticamente 6 horas depois (Abu-Bakar et al., 2005). O gene hmox está sendo
amplamente utilizado, principalmente em humanos, pois está relacionado à resposta
ao estresse oxidativo, é uma proteína protetora do sistema nervoso e está
diretamente relacionada a reparos ocorridos na pele (Turcanu et al., 1998; Abu-
Bakar et al., 2005; Jaworski e Klapperich, 2006). Este gene foi selecionado para
51
estas análises por supor-se que haveria resposta imediata com a exposição à fração
solúvel de petróleo em embriões, uma vez que esses estariam com a superfície do
corpo diretamente exposta ao contaminante e, além disso, serem as trocas gasosas
realizadas via cutânea. Este gene foi expresso no controle, porém em baixa
concentração, mostrando um comportamento adequado, e por isso foi escolhido
como o biomarcador de exposição. Pretende-se dar continuidade em trabalhos
futuros, em uma análise mais acurada. Em ambientes como a Amazônia, seria
interessante avaliar o efeito da exposição ao petróleo juntamente com os efeitos da
radiação UVA, a expressão do gene hmox.
Antigamente acreditava-se que as proteínas de choque térmico (HSPs)
tinham apenas a função de manter as propriedades de dobramento de proteínas
celulares, isto é, agirem como chaperonas. No entanto, em vários estudos foi
constatado que a concentração de HSPs muda quando a célula é atingida por
qualquer estressor químico ou físico (Morimoto et al., 1990; Hightower, 1991; Nover,
1991; Hendrick e Hartl, 1993; Welch, 1993; Fink e Goto, 1998, Iwama et al., 1998,
Basu et al., 2002). Em peixes a indução de HSPs tem sido registrada em cultura
primária de células, assim como em vários tecidos desses animais e de outros
(Iwama et al., 1998). O mecanismo detalhado de indução das HSPs não é
conhecido. Estudos de HSP70 são os mais extensos e tem demonstrado que a
regulação da expressão do gene da hsp70 ocorre principalmente no nível
transcripcional (Fink e Goto, 1998).
Sanders e Martin (1993) registraram que os níveis de HSP70 em amostras de
peixes de áreas poluídas tinham altos níveis como na área controle. Resultados
similares foram mostrados por Ryan e Hightower (1994; 1996), indicando a indução
de HSP70 em sistema de culturas de células de fígado de linguado (Pleuronectes
52
americanus) após estresse causado pela exposição a metais pesados. Há registros
de que os níveis de HSP70 aumentaram em brânquias de juvenis truta arco-íris
Oncorhynchus mykiss, após exposição a cádmio, cobre, chumbo e zinco na água e
na alimentação (Williams et al., 1996). Avaliação da concentração de metil mercúrio
no músculo e brânquias de Esox lucius, Lota lota, Coregonus nelsoni, Thymallus
arcticus e Stenodus lencichthys, mostraram também um aumento da concentração
de HSP70 com o aumento da concentracao de metil mercúrio nestas espécies (Duffy
et al., 1999).
Uma vez que o gene induzível das HSP não contém introns, o RNA
mensageiro é rapidamente traduzido para a proteína nascente em minutos após a
exposição ao estressor. Por tudo isso, HSP70 poderia ser um bom biomarcador
molecular para exposição a concentrações subletais de petróleo na água, induzindo
assim rapidamente o mRNA HSP na presença deste contaminante, entretanto exibiu
comportamento irregular nas diversas concentrações analisadas. Essa variação não
o favorece para seleção como um bom biomarcador. Por isso este gene também foi
descartado.
Recentemente identificado em zebrafish, o nrf2 regula a expressão dos genes
citoprotetores em peixes juntamente com os genes da família MAF, incluindo a
pequena proteína MAFT. A sobre expressão dos genes maft e nrf2 sinergicamente
ativou o MARE (elemento de reconhecimento da família MAF) servindo de
intermediário na expressao de genes em embriões do zebrafish. Há indicações que
maft seja um novo membro das pequenas proteínas MAF e estão envolvidas na
regulação do gene nrf2-dependente no sistema de defesa celular (Takagi et al.,
2004). Esses genes a princípio mostravam-se promissores nesse estudo, por duas
razoes: co-relacionados entre si e envolvidos diretamente com a proteção celular,
53
porém ambos não demonstraram ser bons biomarcadores para exposição à fração
solúvel do petróleo de Urucu e não exibiram correlações entre si nas expressões de
genes, e ambos foram descartados.
O petróleo contém quantidades significativas de metais pesados como Pb,
Cd, Cr, Se, Cu entre outros. Estudos do impacto causado por resíduos de petróleo
em lagostinha, Procamburus clarkii, na Baia Trepagnier, analisando a
bioacumulação dos metais pesados As, Cr, Pb e hidrocarbonetos policíclicos como
contaminantes em sedimentos, reportaram que houve um grande acúmulo de
chumbo no hepatopâncreas e brânquias e presenca de cromo nas brânquias e
sangue. Os estudos concluíram então que os metais presentes no petróleo tornam-
se disponíveis para as espécies no ambiente aquático, sendo assim, não só os
PAHs são os grandes “vilões” num derrame de petróleo, mas também os metais,
como é o caso do As, Cd e Pb que, em baixas concentrações, podem ser
carcinogênicos (Anderson et al., 1997).
Diversos autores relatam que grande parte da indução de metalotioneína
ocorre no fígado e a absorção de metais pela superfície branquial pode ter, também,
uma importante influência nos níveis totais de metal (Heath, 1995; Canli e Furness,
1993a,b; Roesijadi e Robinson, 1994). A indução de metalotioneína por níveis
dietários elevados de metais foi inicialmente relacionada com o aumento da
absorção e o acúmulo desses metais em órgãos internos como fígado e rim.
Metalotioneína ligada com metais tende a acumular no intestino. Mais que isso, há
evidências de que a indução de metalotioneína aumentaria a liberação de Cd vindo
do intestino e sua acumulação em órgãos internos como o fígado (Roesijadi e
Robinson, 1994). O mecanismo de ação da MT no estágio larval é desconhecido.
Assim, decidiu-se avaliar a expressão do gene mt, por sua relação com o
54
transporte de metais, tanto essencial como o Cu, como os não essenciais. Este
marcador mostrou-se promissor, mas apenas quando exposto a concentrações de
petróleo “relativamente” altas como 1,56% e 6,25% e, por este motivo, as análises
foram descontinuadas com este gene, uma vez que o objetivo do trabalho era
buscar um biomarcador para concentrações subletais de petróleo na água.
Vários estudos em peixes estão focados na função mista do sistema oxidase
P450, por sua função na detoxificação de compostos xenobióticos (Goksøyr e Forlin,
1992; Achasi et al., 1994; Devaux et al., 1998; Cao et al., 2000; Leaver e George,
2000; Sarasquete e Segner, 2000; Billiard et al., 2002; Ortiz-Delgado et al., 2002,
Monk et al., 2003; Racky et al., 2004). O gene citocromo P450 1A (cyp1a) é um
biomarcador em peixes muito usado na avaliação da contaminação do ambiente
aquático (William et al., 1998; Moore et al., 2003; Fent, 2003; Oost et al., 2003), para
identificar os efeitos de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, inclusive suspeitas
de causar desordem química-endócrina (EDCs) (Schlezinger e Stegeman, 2001).
Vijayan e colaboradores (1997) relataram que β-naftoflavona (BNF) foi um potente
indutor da CYP1A em fígado da truta arco-íris.
Estudos de impactos causados pelo derrame de óleo do Exxon Valdez em
embriões e larvas de salmão e arenque revelaram exposição e toxicidade crônica in
situ. A coincidência de desova e a deposição de óleo em rochas em locais de
desova resultou na indução da CYP1A, assim como doenças causadas por fungos e
falhas no recrutamento. Esses efeitos foram associados com a exposição a frações
de hidrocarbonetos poliaromáticos (PAHs) (Carls et al., 1999). Foi sugerido que a
exposição a PAHs pode ser facilmente estimada por uma padronização de
bioensaios laboratoriais que poderiam avaliar a indução da CYP1A em juvenis de
truta arco íris, uma vez que esse gene já se mostrava altamente promissor na
55
avaliação de exposição a contaminantes provenientes do petróleo (Hodson et al.,
1996)
A análise de exemplares de Anoplarchus purpurescens expostos a efluentes
de petróleo em três áreas de coleta localizadas em British Columbia, mostrou que
ambos os níveis de P-glicoproteína e expressão do gene cyp1a foram elevados
nessa espécie, quando comparado com a área controle (Bard et al., 2002). Como
exposto, são vários trabalhos que relatam o uso do gene cyp1a como biomarcador
nas contaminações aquáticas com petróleo. Neste estudo, realmente este foi o
gene, dentre todos os outros, o mais promissor para uso na avaliação dos efeitos de
concentrações subagudas do petróleo da região de Urucu na água (Figuras 7 e 8).
O gene cyp1a mostrou uma relação direta entre aumento da concentração da
exposição ao petróleo e aumento da expressão. Baseado nos resultados obtidos
neste estudo recomenda-se o uso da cyp1a como biomarcador molecular promissor
para detectar concentrações subletais do petróleo de Urucu na água e teste em
espécies amazônicas da região do Urucu.
56
5. Conclusões
• A fração solúvel do petróleo não causa mortalidade significativa nos embriões
de Danio rerio expostos por 96 horas a concentrações entre 0,0061% e 25%;
• Embriões de D. rerio expostos a concentrações superiores a 0,39% da fração
solúvel do petróleo apresentam redução da pigmentação e edemas
pericardiais;
• Embriões de D. rerio expostos a fração solúvel do petróleo nas concentrações
acima de 6,25% apresentam ausência total de pigmentação;
• Os genes ahr, hsp70, maft, e nrf2 não são biomarcadores para detectar
concentrações sub-letais de petróleo na água, apesar de haver a expressão
quando há exposição de embriões de zebrafish, pois não apresentam uma
relação positiva crescente entre o aumento da expressão do gene com o
aumento da concentração de petróleo;
• O gene hmox apresenta potencial como biomarcador para concentrações
subletais da fração solúvel de petróleo na água;
• O gene mt apresentou uma alta expressão em zebrafish quando expostos a
fração solúvel do petróleo em concentrações superiores a 1,56%;
• O cyp1a é o gene mais apropriado para detectar concentrações sub-letais de
petróleo na água.
57
Capítulo 2
“Marcadores moleculares para contaminação por petróleo no
peixe amazônico Astronotus ocellatus (Oscar)”
58
1. Introdução
Apesar dos múltiplos usos e sua importância econômica, o petróleo apresenta
um grande potencial como contaminante ambiental, particularmente nos ambientes
aquáticos. Na maioria das vezes, é este o ambiente de destino final da substância
contaminante, mesmo quando os resíduos são de solos, pois chuva e lixiviação
levam tais resíduos aos corpos aquáticos. Tais ambientes estão mais suscetíveis
aos perigos de contaminação pela presença de plataformas de extração, oleodutos,
gasodutos e pelo tráfego de navios-tanque (Page et al., 1989; Owens et al., 1999;
Baker, 1991; Kingston, 2002; Georgiades et al., 2006).
Os acidentes que envolvem um grande volume de petróleo derramado são
noticiados com muita ênfase, como é o caso notório do derramamento do petroleiro
Exxon Valdez em 1989, que resultou em 42 milhões de litros de óleo derramados na
Baía de Prince William Sound no Alasca. Até os dias de hoje existem estudos
naquela área para mensurar os efeitos causados pelo derrame (Erikson, 1995; Al-
Yakoob et al., 1996; Brown et al., 1996; Hose et al., 1996; Kocan et al., 1996;
McGurk e Brown, 1996; Middaugh et al., 1996, 2002; Norcross et al., 1996; Sharp et
al., 1996; Spies et al., 1996; Marty et al., 1997; Middaugh et al., 1998; Carls et al.,
1999; Heintz et al., 1999; Peterson, 2001; Coulliard, 2002; Polino e Holdway, 2002;
Feeger et al., 2003).
As contaminações por petróleo também podem ser contínuas, decorrente de
procedimentos de rotina, tais como: limpeza de tanques, pequenos vazamentos nos
locais de extração, resíduos de refinarias, etc. (Freedman, 1989; Kupchella e
Hyland, 1993; Kingston, 2002).
Embora existam medidas de segurança observadas tanto no transporte do
petróleo da Reserva de Urucu para a refinaria REMAN em Manaus, quanto na
59
própria Reserva de Urucu, o risco de potenciais acidentes ambientais envolvendo a
contaminação de águas amazônicas é sempre uma preocupação, devido à presença
dos dutos de distribuição e da movimentação das balsas com petróleo ao longo de
um trecho grande do rio Solimões.
Desde 1995, estudos sobre o impacto que um derramamento do petróleo de
Urucu e seus componentes causaria sobre as espécies de peixes amazônicos vêm
sendo realizados, particularmente no que se refere a parâmetros fisiológicos (e.g.,
Costa et al., 1996; Mendes & Val, 1997; Val, 1997; Duncan, 1998; Brauner et al.,
1999; Val & Almeida-Val, 1999; Almeida-Val et al., 2002; Matsuo et al., 2002; Paula-
Silva et al., 2002; Anjos, 2003; Oliveira, 2003; Matsuo, 2004). No entanto, poucos
estudos avaliaram os efeitos moleculares causados nos peixes expostos ao petróleo
ou seus derivados (Pinheiro 2007; Araújo, 2007). A elucidação das alterações
causadas pelos xenobióticos no metabolismo celular é importante para o
delineamento de estratégias para mitigação de danos ambientais. A avaliação dos
níveis de mRNA de genes que codificam proteínas e enzimas ligadas ao
metabolismo de xenobióticos em situações de risco ambiental, permitiria a
identificação de biomarcadores.
As características peculiares dos ambientes aquáticos da Amazônia, como a
elevada concentração de substâncias húmicas (SH), tanto nos sistemas de água
branca quanto de água preta, podem afetar a biodisponibilidade das frações tóxicas
do petróleo aos organismos (Haitzer et al., 1998). A acidez das águas é outra
característica relevante das águas amazônicas, principalmente na região do rio
Negro, porém Paolis e Kukkonen (1997) sugeriram que este fator não deva
influenciar na solubilidade e disponibilidade dos contaminantes orgânicos.
60
Outro aspecto particular dos ambientes aquáticos amazônicos é a baixa
concentração de oxigênio. Existem diversos estudos sobre a toxicidade do petróleo
e o seu impacto na respiração dos organismos aquáticos, uma vez que a película do
óleo formada entre na interface ar-água pode representar uma barreira física,
afetando a difusão natural do oxigênio (Duncan, 1998). Val e Almeida-Val (1999)
demonstraram que a exposição de Hoplosternum littorale e Colossoma
macropomum ao óleo cru, oriundo da região de Urucu, acarretou uma redução
drástica (aproximadamente 87%) na concentração de oxigênio dissolvido no sangue
dos animais expostos em relação aos não expostos ao óleo cru. A fusão das lamelas
branquiais e a proliferação de células de cloreto no epitélio respiratório de
Glyptoperichthys joselimaianus expostos ao petróleo, reforçam a hipótese de que a
fração solúvel do petróleo induz não somente alterações respiratórias, como também
distúrbios do mecanismo de regulação iônica (Farias e Costa, 1996).
A busca de marcadores moleculares em peixes da Amazônia ainda é um fato
recente; são poucos os estudos sobre a aplicabilidade destes indicadores na
avaliação dos impactos ambientais causados por contaminantes lipofílicos como as
frações do petróleo em peixes.
O biomarcador que se mostrou promissor para a avaliação de contaminação
aquática com petróleo em Danio rerio, descrito no Capítulo 1, foi o gene cyp1a, da
superfamília citocromo P450, família 1, subfamília A. Este biomarcador vem sendo
amplamente utilizado no monitoramento da contaminação por compostos
específicos como os PAHs (hidrocarbonetos poliaromáticos), PCBs (policlorinados
planares), TCDD (2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxinas), TCDF (2,3,7,8-tetracloro
dibenzofuranos), BNF (benzonaftoflavona), pesticidas, entre outros. A indução da
expressão de CYP1A por estes compostos indica que pode ser relacionada à
61
exposição a estes contaminantes como um biomarcador permitindo uma análise
quantitativa e qualitativa da toxicidade destes compostos (Goksøyr e Förlin, 1992;
Goksøyr e Husøy, 1992; McCarthy e Shugart, 1990).
As enzimas do sistema P450 atuam no metabolismo destes compostos por
meio de reações de mono oxigenação na fase I. Nelas, o composto original é
modificado, supostamente para resultar em uma forma menos tóxica e mais
hidrossolúvel, facilitando sua excreção direta ou associada ao metabolismo da fase
II, que envolve processos de conjugação com compostos como a glutationa s-
transferase (GST) para aumentar a solubilidade destes xenobióticos e
conseqüentemente eliminá-los (Stegeman e Livingstone, 1998).
Apesar da grande importância do conhecimento em nível molecular dos
danos causados por compostos derivados do petróleo em peixes, especialmente
sobre espécies de águas doces tropicais, os estudos nesta área são ainda
incipientes. A avaliação do uso de biomarcadores levando em consideração os
fatores ambientais também é algo relativamente novo e, na Amazônia devido a suas
peculiaridades ambientais, esses fatores devem ser levados em consideração, uma
vez que podem afetar diretamente a biodisponibilidade do contaminante, tornando-o
tóxico ou não.
A maioria dos estudos avalia as conseqüências de um grande derrame de
petróleo. No entanto, os estudos que buscam prever ou detectar concentrações
subletais de petróleo na água antes de se tornarem uma grande catástrofe, são
ainda recentes.
1.1 Objetivo geral
Este estudo tem como objetivo geral identificar marcadores moleculares
62
sensíveis à presença de concentrações subagudas de componentes das frações do
petróleo para o monitoramento ambiental de áreas suscetíveis a contaminação por
estes compostos na Amazônia. Vários genes considerados marcadores moleculares
foram testados primeiramente com o Danio rerio exposto ao petróleo de Urucu
(Capítulo 1). O marcador que se mostrou mais viável no estudo com o D. rerio foi o
cyp1a. Esse marcador foi testado em uma espécie amazônica abundante na região
do Urucu, expondo subletalmente a espécie ao petróleo, a fim de avaliar a
expressão deste gene para futuramente mensurar se nesta região está havendo ou
não contaminação.
1.2 Objetivos específicos:
1. Avaliar a sensibilidade da espécie A. ocellatus ao óleo cru e fração solúvel
do petróleo em condições regulares (temperatura ambiente, pH neutro e normoxia),
em ambiente acidificado (pH 4, normoxia e temperatura ambiente) e em ambiente
hipóxico (pH neutro, temperatura ambiente, hipoxia);
2. Clonar os genes (marcadores moleculares) selecionados a partir do
experimento com Danio rerio (capítulo 1, objetivo 3) em acará – açu (A. ocellatus) e
analisar a expressão destes genes em animais expostos às concentrações
subagudas de petróleo, num modelo dose-resposta, nas condições experimentais
descritas acima.
1. 3 A espécie
Astronotus ocellatus
Astronotus ocellatus (Cuvier, 1829) conhecido vulgarmente como acará-açu,
é uma espécie pertencente à família Cichlidae, subfamília Astronotinae e tribo
63
Astronotini, abundante e nativa da Amazônia. Essa espécie se distribui nos sistemas
lênticos das bacias dos rios Orinoco, Amazonas e Paraguai (Ferreira et al., 1998).
Considerada uma espécie de médio porte, alcança cerca de 30 cm de comprimento.
O corpo desta espécie apresenta manchas escuras verticais não alinhadas, com a
presença de um ocelo no ramo superior da base da nadadeira caudal.
Figura 1. Exemplar adulto de A. ocellatus.
Esta espécie desperta interesse econômico tanto para fins ornamentais
quanto para alimentação humana. A espécie vive em cardumes, forma casais na
época de reprodução e atinge a maturidade sexual com cerca de 10 a 12 meses de
idade. Sua desova ocorre mais de uma vez por ano, com número de ovos variando
entre 1500 a 2000 por desova (Ferreira et al., 1998). Estes animais vivem em lagos
e zona marginal dos rios, ou mesmo entre a vegetação flutuante, com acentuada
preferência por ambientes lênticos. Apresentam geralmente hábitos diurnos e não
realizam migrações (Santos et al., 1984).
A espécie Astronotus ocellatus é caracterizada como tolerante a hipoxia
(Almeida-Val e Hockachka, 1995). Experimentos mostraram que os indivíduos
adultos podem tolerar até 6 h de anoxia a 28°C em f unção da redução da sua taxa
metabólica (Muusze et al., 1998). O Astronotus é um animal agressivo e territorial
com alta capacidade de natação, direcionada para defesa do ninho e filhotes.
64
2. Material e Métodos
2.1 Exposição de exemplares de A. ocellatus a concentrações subagudas de
petróleo
2.1.1 Experimentos utilizando o óleo cru da Reserva de Urucu
A CL50-96 horas é a concentração na qual uma substância tóxica provoca a
parada total dos movimentos respiratórios, locomotores, perda de equilíbrio e
ausência de resposta a estímulos de 50% da população dos animais expostos por
96 horas a um agente agressor (Sprague, 1990). A CL50-96 horas do petróleo de
Urucu para a espécie A. ocellatus é de 36,3ml /L de água, em temperatura ambiente
(28-32°C), pH (5-7) e oxigênio (5 – 6,5mg O 2/L ). Esse valor da CL50-96 horas foi
calculado a partir de experimentos realizados no LEEM - INPA em 2003 (dados não
publicados).
Em Dezembro de 2004, no LEEM, foram realizados experimentos de
exposição de A. ocellatus nas concentrações subletais por 96 horas. Os valores das
concentrações do petróleo de Urucu utilizadas neste trabalho foram baseados no
valor da CL50-96 horas do A. ocellatus. Indivíduos da mesma espécie foram
expostos a 50%, 25%, 12,5% e 6,25% dos valores da CL50 96 horas para o A.
ocellatus.
Os animais foram adquiridos em estação de piscicultura. No LEEM foram
aclimatizados em um tanque com capacidade de 1000L por duas semanas: fez-se a
limpeza desse tanque a cada dois dias e os peixes foram alimentados diariamente
com ração comercial. A alimentação dos animais foi suspensa 48 horas antes do
início dos experimentos e os peixes foram transferidos individualmente para
recipientes plásticos de 15 L, permanecendo nestes recipientes por 24 horas sem
alimentação. Os animais utilizados nos experimentos mediam 10,5 + 2,85 cm.
65
Seis animais foram expostos individualmente em recipientes plásticos de 15
L; após as primeiras 24 horas foi adicionado óleo cru suficiente para as
concentrações desejadas (Tabela 1). O petróleo utilizado nestes experimentos foi
fornecido pela Petrobrás, proveniente de Urucu, Amazonas. Os peixes
permaneceram nos recipientes por um período de 96 horas, sendo avaliada a
mortalidade e monitorados pH, oxigênio e temperatura.
Devido à diversidade de ambientes existentes na Amazônia, os experimentos
foram realizados em três condições com a finalidade de verificar possíveis
diferenças na expressão gênica frente aos diferentes ambientes. As condições
utilizadas foram:
1. Ambiente regular: temperatura ambiente (28° - 30° C), pH neutro (5 a 7) e
normoxia (5 – 6,5mg O2/L).
2. Ambiente hipóxico: temperatura ambiente (28° - 30° C), pH neutro (5 a 7),
hipoxia (1,5 mg O2/L).
3. Ambiente acidificado: temperatura ambiente (28° - 30° C), pH ácido (3,5),
normoxia (5 – 6,5 mg O2/L).
Nos experimentos de hipoxia a entrada de O2 foi reduzida, até estabilizar-se a
1,5mg de O2/L. Para baixar o pH nos experimentos acidificados, foram utilizados 4ml
de H2SO4 (96-98%) diluído em 5 L de água, e foram utilizadas alíquotas pequenas
para o ajuste; essa solução estabilizava o pH por 12 horas.
Após 96 horas de exposição os animais foram anestesiados com ácido etil
ester 3-aminobenzóico (SIGMA) e foram retiradas amostras de fígado. As amostras
de fígado foram masceradas em Nitrogênio líquido e colocadas em tubos Eppendorf
(Eppis) de 2 ml e estocadas em freezer -80°C até o transporte em gelo seco para o
Departamento de Toxicologia Celular no Centro de Pesquisas Ambientais – UFZ,
66
Leipzig - Alemanha. Após o transporte, as amostras foram acondicionadas em
freezer -80°C até o momento das análises.
Tabela 1. Concentrações utilizadas nos experimentos de exposição da espécie A.
ocellatus ao petróleo de Urucu.
Experimento 1 – óleo cru
Concentração
de Petróleo
% real de
petróleo na água
óleo (ml) / 12 l
de água
Exp. 1 –
condições
regulares (n)
Exp. 2 –
hipoxia
(n)
Exp. 3 -
ácido (n)
1 Controle 0 0 4 4 4
2 6,25% da CL50 0,224 27,24 6 6 6
3 12,5% da CL50 0,449 54,36 6 6 6
4 25% da CL50 0,889 108,9 6 6 6
5 50% da CL50 1,780 218,04 6 6 6
2.1.2 Experimentos utilizando a fração solúvel do p etróleo de Urucu
Em fevereiro de 2007 foram efetuados novos experimentos com o A. ocellatus
expostos à fração solúvel do petróleo proveniente de Urucu, e as concentrações
utilizadas foram baseadas nos experimentos com o Danio rerio (Capítulo 1). As
concentrações de fração solúvel utilizadas nestes experimentos (Tabela 2) foram
menores que as concentrações utilizadas nos experimentos com o óleo cru (Tabela
1).
Para obtenção da fração solúvel do petróleo de Urucu, em um recipiente de 5
L de vidro escuro com tampa (para evitar a evaporação e foto-oxidação) utilizou-se a
proporção óleo: água destilada de 1:2. Essa solução foi mantida sob agitação por 24
67
horas (agitador TECNAL) sem aquecimento com magneto. Após esse período a
agitação foi interrompida. Após uma hora, para completar a separação das frações,
foi coletada a fração solúvel do petróleo (parte inferior), transferida para outro
recipiente de vidro escuro e armazenada a 4°C ao ab rigo da luz.
Similar aos experimentos com petróleo, foram realizadas três diferentes
condições experimentais para a fração solúvel do petróleo: 1) Ambiente regular; 2)
Ambiente hipóxico e 3) Ambiente acidificado. A coleta de fígado também foi
realizada como descrita anteriormente, porém coletados em Eppis de 2 ml contendo
500µl de RNALater. As amostras foram armazenadas a 4°C por 12 horas. Após a
absorção do RNALater pelo fígado, as amostras foram transferidas para o freezer -
80°C, até o momento do transporte para o Departamen to de Toxicologia Celular –
UFZ, Alemanha.
Tabela 2. Concentrações utilizadas nos experimentos de exposição da espécie A.
ocellatus à fração solúvel do petróleo de Urucu.
Experimento 2 – fração solúvel do petróleo
Concentração da fração solúvel do petróleo
óleo (ml) / 12 l de água *
Exp. 1 – condições
regulares (n)
Exp. 2 - hipoxia (n)
Exp. 3 - ácido (n)
1 Controle Zero 4 4 4
2 0,0061% 1,46 6 6 6
3 0,024% 5,85 6 6 6
4 0,098% 23,4 6 6 6
5 0,39% 93,6 6 6 6
6 1,56% 374,4 6 6 6
* como houve inicialmente a diluição de 1:2 do petróleo na água para obter-se a fração solúvel, aqui esses valores foram multiplicados por 2.
68
2.2 Expressão dos marcadores em concentrações subag udas de petróleo
2.2.1 Estudos da expressão do gene cyp1a em Astronotus ocellatus
Antes de propormos a utilização da expressão de determinados genes como
marcadores para monitoramento de amostras de campo, foi necessário testá-los sob
condições laboratoriais para verificar se os mesmos responderiam a tratamentos
químicos apropriados.
Estes estudos foram feitos pela técnica RT-PCR (Amplificação por
Transcriptase Reversa – Reação de Cadeia Polimerase) a princípio com
oligonucleotídeos degenerados dos genes ß-actina e cyp1a desenhados a partir de
seqüências de várias espécies de peixes disponíveis no GenBank (Tabela 3). O fato
dos efeitos moleculares causados por exposição a elementos tóxicos serem
semelhantes em todas as espécies nos permite sugerir que essas informações
poderão ser extrapoladas para as demais espécies de peixes da Amazônia.
O protocolo da técnica foi semelhante ao usado para os embriões de
zebrafish (vide Capítulo 1), com algumas modificações, para análise do fígado dos
animais, tendo em vista a degradação das amostras no transporte até o
Departamento de Toxicologia Celular.
2.2.1.1 Extração do RNA total
O RNA total foi extraído dos fígados dos indivíduos da espécie A. ocellatus
sobreviventes nos experimentos de exposição, por meio de homogeneização de 20-
30 mg das amostras em 500µl de reagente TRIzol.
Amostras de fígado dos animais sobreviventes foram transferidas para Eppis
de 2 ml, e submetidas a uma breve lavagem com água MilliQ. Em seguida, retirava-
se o excesso de água com pipeta e se adicionava 500µl de TRIzol. Procedeu-se a
69
homogeneização das amostras, que foram mantidas à temperatura ambiente por 5
minutos, centrifugadas para a separação de gordura, sangue e outras proteínas, e
transferidas para um novo tubo Eppendorf de 2 ml, ao qual foram adicionados 100µl
de clorofórmio. Os tubos foram agitados por inversão, mantendo-se à temperatura
ambiente por 3 minutos. Após esse tempo, a amostra foi centrifugada a 12.000g, a
4°C por 5 minutos, para separação das três fases lí quidas: o sobrenadante continha
o RNA; a fase abaixo do sobrenadante, esbranquiçada e fina, contendo DNA; e a
interfase que continha os compostos orgânicos. A parte que nos interessava era o
sobrenadante com RNA. Se a amostra se mostrasse turva, escura ou muito
esbranquiçada, fazíamos novamente uma centrifugação com mais 100 µl de
clorofórmio e retirávamos apenas o sobrenadante.
Deste Eppendorf retiramos cuidadosamente o sobrenadante
(aproximadamente 250-280 µl) com uma pipeta de 200µl, evitando contaminação
com o DNA, e transferimos para um novo tubo. Neste tubo foi adicionado um volume
igual de isopropanol (aproximadamente 250 µl) efetuando uma breve mistura que foi
mantida no freezer -20°C, por no mínimo, 20 minutos . Em seguida, a mistura foi
centrifugada novamente a 12.000g, a 4°C por 5 minut os e como resultado obteve-se
o pellet de RNA. Ao pellet adicionamos 500 µl de etanol 75%, homogeneizamos por
três vezes e centrifugamos novamente a 12.000g, a 4°C por 10 minutos, removendo
novamente o sobrenadante e mantendo o pellet à temperatura ambiente por 10
minutos para evaporar todo o etanol. Em seguida, 50 a 100µl de água MilliQ
autoclavada foram adicionados e as amostras incubadas por 5 minutos em 60°C
para diluição total do RNA.
Quantificação do RNA - o RNA diluído foi quantificado por
espectrofotometria em 260-280nm (NanoDrop), utilizando 1,5 µl do RNA total.
70
Integridade do RNA - foi checada por eletroforese em gel de agarose 1,5%
usando apenas 500ng do RNA total de cada amostra e o restante de RNA era
estocado em freezer a -80°C até o momento das análi ses.
Digestão de DNA – foi feita para evitar possíveis contaminações com DNA
nas amostras. Para cada amostra de 2µg de RNA dissolvida em 10µl de água MilliQ
foram adicionados: 1µl de DNAse (RNAse-free, Roche), 2 µl de Tampão 10X D e 7
µl de água MilliQ, mantidos em termociclador Biometra T3000 a 25°C por 15
minutos, com volume final igual a 20µl. Deste volume utilizava-se 10 µl para controle
em gel de agarose 1%, para verificar se ainda havia possíveis contaminações com
proteínas, sendo os 10 µl restantes utilizados para fazer a síntese do DNA
complementar (cDNA).
2.2.1.2 Síntese do DNA complementar (cDNA)
Para a síntese do cDNA foram utilizamos 1 µg do RNA total acondicionado
em tubo de reação PCR de 0,2 ml.
As amostras de RNA da espécie A. ocellatus nos experimentos do petróleo e
fração solúvel do petróleo estavam parcialmente degradadas e, por isso, ao invés de
usarmos apenas o Oligo dT18 Primer, utilizamos também, os oligonucleotídeos
hexamêros randômicos (Randon hexamers primers- RHP).
A cada 10 µl de RNA tratado com DNAse foram adicionados 2µl de Oligo
dT18 primer (10µM) e 0,025µl de RHP (250ng/reação). Estes tubos foram colocados
em um termociclador Biometra T3000, aquecido a 70°C por 5 minutos e em seguida
resfriado em gelo. O MasterMix RT foi preparado com 4µl de tampão 5X, 2µl dos
dNTPs (10mM), 0,5µl de Inibidor Ribonuclease (40u/µl) RNAse Out e 0,5µl de água
MilliQ. Esse MasterMix RT foi adicionado à solução com RNA para desnaturar, e as
71
amostras foram mantidas por dez minutos a 37°C. Em seguida foi adicionado 1µl da
Transcriptase Reversa MMLV (200u/µl, Revert Aid, Fermentas), para um volume
final de 20µl de reação. Essa reação foi incubada por 75 minutos a 42°C e inativada
por dez minutos a 70°C usando o termociclador Biome tra T3000. Após essa reação
obteve-se o cDNA, que foi amplificado por PCR.
2.2.1.3 PCR utilizando oligonucleotídeos degenerado s e específicos
O MasterMix de PCR foi preparado para cada reação contendo: 2,5µl de
tampão 10X de RT-PCR, 1µl de dNTP-mix (10mM), 17,8 µl de água MIlliQ, 0,2 µl de
Taq - Polymerase, 1µl de oligonucleotídeos Forward (20mM), 1 µl de
oligonucleotídeos Reverse (20mM) dos genes selecionados (Tabela 3). Esses PCRs
foram inicialmente feitos com oligonucleotídeos degenerados desenhados a partir
das seqüências das espécies Danio rerio, Oreochromis niloticus, Liza aurata,
Dicentrarchus labrax, Pleuronectes yokohamae e Limanda limanda. As seqüências
dos oligonucleotídeos degenerados estão na tabela 3. Com a clonagem dos genes
ß-actina e cyp1a em Astronotus ocellatus, foram construídos oligonucleotídeos
específicos para esta espécie, uma vez que com a clonagem houve acesso a
seqüência desses genes.
Após o preparo do MasterMix foram adicionados 1µl do cDNA, o que no
volume final seriam 25 µl por tubo de reação. O ciclo tinha início com 94°C em 45 s;
o anelamento com 60°C em 30 s e a extensão com 72°C em 45 s e a sua extensão
final com 72°C em 10 min. Dependendo do tamanho do fragmento esperado, eram
calculados os números de ciclos necessários para ver a expressão desses genes
(Tabela 3).
72
Tabela 3. Genes selecionados para a análise e sequências dos oligonucleotídeos
degenerados Forward e Reverse. As letras R, K e Y na seqüência forward do gene
cyp1a indica a substituição de bases no momento da síntese; R= A ou G; K= G ou T;
Y= C ou T.
A concentração do produto foi determinada por eletroforese em gel de
agarose 1,5 - 2% (devido ao tamanho dos fragmentos) em tampão 1XTAE, corado
com brometo de etídio em TAE 0,001% por 20 - 30 minutos. A eletroforese foi
realizada a 120 W. Os fragmentos foram visualizados sobre luz UV e em seguida
fotografados.
Com a ajuda do programa computacional Image J foi possível detectar as
diferenças nas expressões de genes. Devido às degradações parciais havia
dificuldade para se fazer isso apenas visualmente. Utilizamos a densintometria,
fazendo a normalização da cyp1a em relação a seu controle constitutivo o gene ß-
actina.
2.3. Clonagem dos genes cyp1a e ß-actina do Astronotus ocellatus
Como todas as amostras de fígado do Astronotus ocellatus expostos no
LEEM ao petróleo estavam parcialmente degradadas, adquirimos em aquário
Genes Seqüência de oligonucleotídeos degenerados
S TM (°C) N° de ciclos na
PCR
Tamanho do fragmento
(pb)
ß-actina TGTTGACAACGGATCCGGTAT F 60°C 30 1741
ß-actina GGCCAACCTGTACACTGACT R
cyp1a1 AGRAAGCTKGCCTACAGTGCYC F 55°C 40 834
cyp1a1 TGTGTCTTCATCAATCAGTGGCA R
S=Sentido F=Forward; R=Reverse; TM= temperatura média de anelamento; pb=número de pares de base do fragmento.
73
comercial na Alemanha, um exemplar da mesma espécie, que foi utilizado para a
clonagem dos genes ß-actina e cyp1a. Esse exemplar foi mantido em aquário por
dois dias e, então, sacrificado para a coleta de 20 mg de fígado e extração de RNA
com TRIzol, seguida da digestão de DNA, e síntese de cDNA, utilizando o protocolo
padrão, descrito anteriormente. Para a clonagem foram utilizados 4µl de cDNA para
ß-actina e cyp1a, utilizando-se os oligonucleotídeos descritos na Tabela 3.
O produto do PCR foi visualizado em luz UV onde observamos a presença de
banda. Essas bandas tinham o tamanho esperado e foram recortadas do gel e
guardadas no freezer -20°C em tubos de Eppendorf de 2,0 ml novos e autoclavados,
até ser feita a recuperação do DNA em gel.
A recuperação do DNA a partir gel de agarose foi feita utilizando o Kit da
QIAGEN® – QIAquick gel extraction kit Protocol (www.qiagen.com) segundo o
protocolo fornecido pela firma. Em gel de agarose 1% foi recuperado 80mg de gel
com ß-actina e 200mg de gel com cyp1a. Esses pedaços de gel foram purificados
resultando cada um em 50 µl de solução de DNA. Foram utilizados 15 µl foi para
verificar a integridade do DNA em gel de agarose 1%.
Clonagem dos fragmentos de PCR com o kit clonagem T OPO TA INVITROGEN®
Em Eppendorf de 2 ml foi feito o mix de ligação (mix ligation) com os componentes
do kit:
- 1 µl do tampão de ligação; - 1 µl do VECTOR TOPO®; - 4µl do produto do PCR
Esse mix foi agitado brevemente e incubado por 30 minutos à temperatura
ambiente. Após 25 minutos, as células competentes JM109 (previamente
preparadas) de E. coli foram descongeladas em gelo. Adicionou-se 2 µl do mix de
ligação ao tubo das células competentes e misturou-as cuidadosamente, incubando-
74
as por 30 minutos em gelo. Em seguida foi dado um choque de temperatura por 30
segundos a 42°C em banho-maria. Após o choque térmi co, adicionou-se 250µl do
meio SOC (fornecido pelo fabricante) e as células bacterianas foram incubadas por 1
hora a 37°C sem agitação.
Após uma hora de incubação das células a 37°C, es sa solução foi espalhada com
uma espátula, autoclavada sobre as placas contendo Meio LB sólido, já contendo de
X-gal (é um glicosídeo contendo galactose, usado para indicar se a bactéria
expressa a enzima ß-galactosidase, a qual é codificada pelo gene LacZ) deixada por
uma noite em incubadora a 37°C.
Cultivo para a extração do DNA plasmidial - as quatro placas (duas para cada
gene) foram retiradas da incubadora e com uma pipeta de 200µl foram retiradas as
colônias brancas fazendo furos nas placas e adicionando ao tubo de ensaio
juntamente com a ponteira. Foram selecionadas 10 colônias, às quais foram
adicionadas 5ml de meio de cultura contendo 5 µl de ampicilina.
Estes tubos foram colocados em agitador com rotação de 250 rpm, durante
12 horas a 37°C. Após esse tempo verificaram-se os tubos para observar se havia
ocorrido o crescimento dos clones bacterianos, indicado por coloração turva do meio
de cultura e se um pellet estava presente. Os tubos foram homogeneizados por
Vortex.
Foi feito um PCR convencional para cada colônia de bactéria. Nas reações de
PCR foram usados 2µl do meio de cultura contendo a bactéria e, para cada reação
em tubos de Eppendorf de 200 µl, foram adicionados: 2,5 µl de tampão 10X; 1,0 µl
de dNTP mix (10mM); 0,12 µl de TaqPolimerase (5U/µl); 17,38 µl água DEPC; 1µl de
oligonucleotídeos foward; 1µl de oligonucleotídeos reverse e 2µl de bactéria.
O PCR foi realizado como descrito em 2.3.3 e após a visualização em gel de
75
agarose, fez-se a seleção dos melhores tubos para dar continuidade à análise.
Estocagem do DNA plasmidial : foram adicionados em tubos Eppendorf de 2,0 ml,
500µl de glicerina pura e 500 µl de bactéria do clone bacteriano selecionado, agitado
em Vortex brevemente e, então, armazenado em freezer -80°C.
Extração do DNA plasmidial : foram adicionados 2,00 ml da suspensão de
bactérias em tubos Eppendorf, que foram centrifugados a 8000 rpm por 3 minutos.
Houve formação de um pellet branco no fundo e o sobrenadante foi descartado.
Esse pellet foi utilizado para a extração do DNA plasmidial seguindo o kit QIA PREP.
O kit QIA PREP-SPIN QIAGEN® é constituído de três tampões: no tubo Eppendorf
contendo o pellet foi adicionado 250µl do tampão P1, 250µl do tampão P2 e 350µl
do tampão N3, misturando-se por inversão seis vezes. Após a mistura, esta solução
foi centrifugada por dez minutos a 13.000 rpm, o pellet foi formado novamente e o
sobrenadante foi retirado e aplicado o QIA PREPSPIN COLUMN. Em seguida foi
centrifugado novamente por 1 minuto. Descartou-se o líquido filtrado, e recuperou-se
o filtro com o material de interesse ligado a ele. O filtro que foi lavado com 500µl do
tampão PB e centrifugado por 1 minuto, descartando-se novamente o líquido filtrado.
Lavou-se a coluna (ou filtro) com 750µl de tampão PE centrifugando-se duas vezes
por 1 minuto e o descarte do líquido remanescente. O filtro de coluna foi retirado do
tubo Eppendorf e transportado para novo tubo. Para eluir o DNA, adicionou-se 50µl
do tampão EB, e manteve-se a coluna em repouso por 1 minuto, sendo centrifugada
por 1 minuto a 12.000 x g, e finalmente se descartou o filtro. O DNA se encontrava
eluído da coluna no tubo, sendo estocado a -20°C.
Posteriormente o DNA foi liofilizado e enviado para sequenciamento pela
MWG-Biotech. Após o sequenciamento dos genes da ß-actina e cyp1a do A.
ocellatus, as seqüências foram submetidas a buscas por sequências homólogas no
76
programa Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi), e pelo programa
ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) foi feito o alinhamento de sequências
múltiplas para testar a similaridade com as de outras espécies.
Após certificação de que as sequências encontradas eram da ß-actina e
cyp1a, com o auxílio do programa Primer3 (www.primer3.com), selecionou-se
oligonucleotídeos específicos para otimização das análises das amostras de A.
ocellatus. Os oligonucleotídeos foram desenhados para a obtenção de fragmentos
com menor tamanho (Tabela 4), visto que as amostras estavam parcialmente
degradadas. Esses oligonucleotídeos específicos com tamanho menor de fragmento
foram utilizados para avaliar todos os indivíduos de A. ocellatus expostos tanto ao
petróleo quanto a fração solúvel do petróleo; os oligonucleotídeos degenerados
(Tabela 3) foram utilizados apenas para a clonagem.
Tabela 4. Genes e seqüências dos oligonucleotídeos específicos Forward e Reverse
para a espécie Astronotus ocellatus.
Genes Seqüência de oligonucleotídeos específicos
S TM (°C)
N° de ciclos da PCR
Tamanho dos fragmentos
(pb)
ß-actina TGCAGTTTCATCTGGGGTTT F 55°C 40 231
ß-actina CAGCCTTCACAGAGGCAAT R
cyp1a AGCTGGACGAGAATGCAAAT F 55°C 37 144
cyp1a AGGAAGGGCAAGTTGTTCCT R
S=Sentido; F=Forward; R=Reverse; TM= temperatura média de anelamento; pb=número de pares de base do fragmento.
77
2.4 Análise Estatística
Os indivíduos de A. ocellatus tiveram seus tecidos analisados e comparados
entre as diferentes concentrações de petróleo e controle. Os dados foram inscritos
numa planilha e manuseados para sua apresentação sob a forma de média e erro
padrão da média. O nível de significância aceito foi de p < 0,05. A significância das
diferenças entre médias foi feita por análise de variância (ANOVA), com o teste de
Dunnet para as comparações múltiplas.
78
3. Resultados
3.1 Mortalidade
3.1.1 Experimentos com o petróleo de Urucu
Nos experimentos realizados com o A. ocellatus após 96 horas de exposição
ao petróleo (concentrações citadas na Tabela 1) foram selecionados 28 indivíduos
em três condições (regular, hipoxia e acidificado), totalizando 84 indivíduos. Destes
indivíduos apenas 61 sobreviveram ao final das 96 horas. Não houve mortalidade
de nenhum indivíduo do controle nos três experimentos.
Os exemplares de Astronotus apresentaram uma alta mortalidade quando
expostos a condições de hipoxia. Morreram três indivíduos expostos a 0,449% de
petróleo, e todos os indivíduos expostos à concentração 1,78% morreram antes de
se completar 72 horas (Tabela 5). Os indivíduos do experimento acidificado também
apresentaram mortalidade superior aos indivíduos expostos a condições regulares.
Tabela 5. Mortalidade de exemplares de A. ocellatus expostos as diferentes
concentrações do petróleo de Urucu.
Experimentos / Concentrações Controle 0,224% 0,449% 0,889% 1,78%
Condições regulares 0 1 1 0 2
Condições de hipoxia 0 0 3 2 6
Condições acidificadas 0 2 2 1 3
3.1.2 Experimentos com a fração solúvel do petróleo de Urucu
Foram expostos 34 indivíduos em cada experimento com a fração solúvel do
petróleo (quatro como controle e seis em cada concentração), totalizando 102
79
indivíduos. A mortalidade nos experimentos com A. ocellatus expostos à fração
solúvel do petróleo foi nula em todos os experimentos e em todas as concentrações.
3.2 RNA das amostras de fígado de A. ocellatus expostos ao petróleo e a fração
solúvel do petróleo
As amostras de RNA de fígado dos indivíduos expostos tanto ao petróleo
quanto à fração solúvel do petróleo estavam parcialmente degradadas (Figura 2),
isso talvez se devesse ao longo tempo de transporte. No primeiro experimento as
amostras de fígado foram transportadas em gelo seco, no segundo experimento
devido a proibição do transporte de gelo seco em avião, os fígados dos animais
foram transportados em gelo, com as amostras de fígado submersas em RNALater.
Foi necessária a padronalização do protocolo padrão e teste de vários
oligonucleotídeos para a expressão gênica da ß-actina e cyp1a.
Figura 2. Exemplos de amostras de RNA dos fígados de A. ocellatus expostos ao
petróleo de Urucu (A) e a fração solúvel do petróleo de Urucu (B). M = marcador de
peso molecular Ladder 100pb.
3.3 Clonagem dos genes ß-actina e cyp1a1 para o Astronotus ocellatus
Como as amostras de RNA dos exemplares de A. ocellatus estavam
parcialmente degradadas, foi necessária a aquisição de um exemplar da mesma
A B M M
80
espécie em aquário comercial, e com o RNA do fígado deste indivíduo foi feita a
reação de PCR com os oligonucleotídeos degenerados, para a clonagem. Obteve-se
a seqüência dos genes ß-actina (usada como controle constitutivo) (Figura 3A) e
cyp1a (Figura 3B). São mostradas as seqüências dos genes para a espécie: ß-
actina e cyp1a, com fragmentos de 1741 e 834 pares de base, respectivamente.
Figura 3. Fragmentos do RT-PCR para clonagem dos genes ß-actina (A) e cyp1a (B)
do A. ocellatus utilizando oligonucleotídeos degenerados. M= marcador de peso
molecular Ladder 100pb.
Em seguida usou-se o BLAST para comparar as seqüências obtidas com as
seqüências dos mesmos genes em outras espécies. Os resultados mostraram uma
homologia de 76,33 % para a ß-actina e 77,34% para cyp1a entre as espécies, o
que confirmou a veracidade de ambas as sequências. Enfatiza-se que as
seqüências de A. ocellatus dos genes ß-actina (Figura 4) e cyp1a (Figura 5)
mostraram alta homologia com Oreochromis niloticus, Oryzias lapides e
Oncorhynchus mykiss. As seqüências dos genes do A. ocellatus foram identificadas
por sequenciamento do fragmento de RT-PCR obtido com oligonucleotídeos
degenerados. O número de acesso no GenBank das seqüências de A. ocellatus dos
genes ß-actina e cyp1a são: EU553593 e EU553595, respectivamente.
M M
81
Ol CCAC---CCAAAGTTTAGCCATGGATGATGACATTGCCGCACTGGTTGTTGACAACGGAT 116 On CAAAA--CCAAAAGTTCAAAATGGAAGATGAAATCGCCGCACTGGTTGTTGACAACGGAT 101 Ao --------------------------------------------- TGTTGACAACGGAT 14 Om CTAAGAAGCCAACATGTGTGACG-ACGATGAGACTACCGCCCTTGTGTGCGACAACGGCT 115 * * * ** * *** ** * ******** * Ol CTGGCATGTGCAAAGCCGGATTCGCTGGAGACGATGCCCCTCGTGCTGTCTTTCCCTCCA 176 On CCGGTATGTGCAAAGCCGGATTCGCCGGAGATGACGCGCCTCGGGCTGTCTTCCCCTCCA 161 Ao CCGGTATGTGCAAGGCCGGATTCGCCGGAGACGACGCCCCTCGTGCTGTCTTCCCCTCCA 74 Om CCGGCCTGGTGAAGGCTGGCTTCGCCGGAGACGATGCCCCCAGGGCCGTGTTCCCCTCTA 175 * ** ** ** ** ** ***** ***** ** ** ** * ** ** ** ***** * Ol TCGTTGGTCGCCCCAGGCACCAGGGTGTCATGGTGGGTATGGGCCAGAAAGACAGCTACG 236 On TCGTCGGGCGTCCCAGGCATCAGGGAGTGATGGTTGGGATGGGCCAGAAAGACAGCTACG 221 Ao TCGTCGGTCGCCCCAGACATCAGGGTGTGATGGTGGGTATGGGCCAGAAAGACAGCTATG 134 Om TCGTCGGCCGTCCCCGCCACCAGGGTGTCATGGTCGGTATGGGTCAGAAGGACTCCTACG 235 **** ** ** *** * ** ***** ** ***** ** ***** ***** *** *** * Ol TAGGAGATGAAGCCCAGAGCAAGAGGGGTATCCTGACCCTGAAGTATCCCATTGAGCACG 296 On TGGGAGACGAGGCTCAGAGCAAGAGGGGCATCCTGACCCTGAAGTACCCCATTGAGCATG 281 Ao TTGGTGATGAGGCCCAGAGCAAGAGAGGTATCCTGACCCTGAAGTACCCCATCGAGCACG 196 Om TCGGTGACGAGGCCCAGAGCAAGAGGGGTATCCTCACTCTGAAGTACCCCATTGAGCACG 295 * ** ** ** ** *********** ** ***** ** ******** ***** ***** * Ol GTATTGTTACCAACTGGGATGACATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGC 356 On GCATCGTCACCAACTGGGACGACATGGAGAAGATCTGGCATCACACCTTCTACAACGAGC 341 Ao GTATTGTGACCAACTGGGATGACATGGAGAAGATCTGGCATCACACCTTCTACAACGAGC 254 Om GCATCATCACCAACTGGGACGATATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAACGAGC 355 * ** * *********** ** ***************** ************** **** Ol TGAGAATTGCCCCTGAGGAGCACCCTGTCCTGCTCACTGAAGCCCCCTTGAACCCCAAAG 416 On TGAGGGTGGCTCCAGAGGAGCACCCCGTCCTGCTCACAGAGGCCCCCCTCAACCCCAAAG 401 Ao TGAGAGTTGCCCCTGAGGAGCACCCTGTCCTGCTCACAGAGGCTCCCCTGAACCCCAAAG 316 Om TGAGAGTGGCCCCCGAGGAGCACCCCACCCTGCTCACTGAGGCCCCACTGAACCCCAAGG 415 **** * ** ** *********** ********* ** ** ** * ******** * Ol CCAACAGGGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACAGCCCTGCCATGTACG 476 On CCAACAGGGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCTGCCATGTACG 461 Ao CCAACAGGGAGAAGATGACTCAGATCATGTTCGAGACGTTCAACACCCCAGCCATGTACG 374 Om CCAACAGGGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACGTCCCTGCCATGTATG 475 ******************* *********** ***** ****** *** ******** * Ol TTGCCATCCAGGCTGTGCTGTCCCTGTATGCCTCTGGTCGTACCACTGGTATCGTCATGG 536 On TGGCCATCCAGGCCGTGTTGTCCCTGTACGCCTCTGGCCGTACCACCGGTATCGTCATGG 521 Ao TTGCCATTCAGGCTGTGCTGTCCCTGTATGCCTCTGGTCGTACCACTGGTATCGTCATGG 434 Om TGGCCATCCAGGCTGTGCTGTCCCTGTACGCTTCCGGCCGTACCACTGGTATTGTGCTGG 535 * ***** ***** *** ********** ** ** ** ******** ***** ** *** Ol ACTCTGGTGATGGTGTGACCCACACAGTGCCCATCTACGAGGGCTACGCTCTGCCCCACG 596 On ACTCCGGTGACGGCGTGACCCACACAGTACCCATCTACGAGGGCTACGCTCTGCCCCACG 581 Ao ACTCCGGTGATGGTGTGACCCACACAGTGCCCATCTATGAGGGTTATGCCCTGCCCCACG 494 Om ATGCTGGTGATGGTGTGACCCACAACGTCCCAGTCTATGAGGGTTACGCCCTGCCCCACG 595 * * ***** ** ********** ** ** **** ***** ** ** ********** Ol CCATCCTGCGTCTGGACTTGGCCGGCCGCGACCTTACAGACTACCTCATGAAGATCCTGA 656 On CCATCCTGCGTCTGGATCTGGCCGGCCGCGACCTCACAGACTACCTGATGAAGATCCTGA 641 Ao CCATCCTGCGTCTGGACCTGGCTGGCCGTGACCTCACAGACTACCTCATGAAGATCCTGA 554 Om CCATCATGCGTCTGGACCTGGCTGGTCGCGATCTGACCGACTACCTGATGAAGATCCTGA 655 ***** ********** **** ** ** ** ** ** ******** ************* Ol CGGAGCGTGGCTACTCCTTCACCACCACAGCCGAGAGGGAAATTGTCCGTGACATCAAGG 716 On CGGAGCGCGGTTACAGCTTCACCACCACGGCCGAGAGGGAAATCGTACGAGACATCAAGG 701 Ao CAGAGCGTGGCTATTCCTTCACCACCACAGCTGAGAGGGAAATCGTGCGTGACATCAAGG 614 Om CTGAGCGTGGCTACTCCTTCGTGACCACTGCCGAGCGTGAGATCGTGCGTGACATCAAGG 715 * ***** ** ** **** ***** ** *** * ** ** ** ** ********** Ol AGAAGCTGTGCTACGTCGCCCTGGACTTCGAGCAGGAGATGGGCACCGCTGCCTCCTCTT 776 On AGAAGCTGTGCTACGTGGCGCTGGACTTTGAGCAGGAGATGGGCACCGCTGCCTCCTCTT 761
82
Ao AGAAGCTGTGCTACGTTGCCCTGGACTTCGAGCAGGAGATGGGTACCGCTGCCTCCTCCT 674 Om AGAAGCTGTGCTATGTGGCTCTGGACTTCGAGAACGAGATGGCCACCGCTGCCTCCTCCT 775 ************* ** ** ******** *** * ******* ************** *
Figura 4. Alinhamento da seqüência do gene ß-actina do Astronotus ocellatus (Ao),
Oreochromis niloticus (On), Oryzias latipes (Ol) e Onchorhynchus mykiss (Om). O
alinhamento dessas sequências homólogas foi feito pelo ClustalW. * = homologia
entre as bases.
Ao QN------SPLEAG---------YSALRSFSTLEGTTPEYSCALEEHVSKEAEYLIKELN 48 On NDGKSLSFSTDQAGIWRARRKLAYSALRSFSNLEGTTPEYSCALEEHISKEAEYLIKELN 75 Ol NDGKSLAFSTDQAGVWRARRKLAYSALRSFSSLEGSNAEYSCMLEEHICKETEHLVKEIE 180 Om NDGNSLAFSTDKAGVWRARRKLAMSALRSFATLEGTTPEYSCALEEHVCKEGEYLVKQLT 180 :: *. :** ******:.***:..**** ****:.** *:*:*:: Ao TVMKSEGSFDPFRYVVVSVANVICGMCFGRRYNHHDDELVGLVTLSDDFVKVVGSGNPAD 108 On TVMKTKGSFDPFRYVVVSVANVICGTCFGRRYDHHDDELVSLVNLSDDFVKVVGSGNPAD 135 Ol KVMKTEGKFDPYRYIVVSVANVICGMCFGRRYDHHDQELVGLVNLSEDFVQVTGSGNPAD 240 Om SVMDVSGSFDPFRHIVVSVANVICGMCFGRRYSHDDQELLGLVNMSDEFGQVVGSGNPAD 240 .**. .*.***:*::********** ******.*.*:**:.**.:*::* :*.******* Ao FIPLLQYLPSATMKKFVSLNVRFNKFVQKLVSEHYATFDKENIRDITDSLIDHCEDRKLD 168 On FIPLLQYLPSTKMKKFVSLNARFSKFVQKLVTEHYATFDKDNIRDITDSLIDHCEDRKLD 195 Ol FIPALRYLPSKAMKKFVEINNRFQCFVQKIVNEHYATYDKDNIRDITDSLIDHCEDRKLD 300 Om FIPILRYLPNRTMKRFMDINDRFNNFVQKIVSEHYESYDKDNIRDITDSLIDHCEDRKLD 300 *** *:***. **:*:.:* **. ****:*.*** ::**:******************* Ao ENANIQMSDEKIVGIVNDLFGAGFDTISTALSWSLMYFVAYPEIQDRLFEEIKEKVGLDR 228 On ENANIQMSDEKIVGIVNDLFGAGFDIISTALSWSLMYFCGLPRDQNRLFEEMKEKVGLDR 255 Ol ENSNIQMSDEKVVGIVNDLFGAGFDTISTALSWAVGYLVAYPDIEKRLFEEIKENIGLNR 360 Om ENANIHVSDEKIVGIVNDLFGAGFDTISTALSWAVVYLVAYPEIQERLHQELKEKVGMIR 360 **:**::****:************* *******:: *: . * :.**.:*:**::*: * Ao TPVISDRNNLPFLEAYILELFRHSSYLPFTIPHCTTKDTSLNGYFIPKDTCVFINQWQR- 287 On MPVFSDRNNLPLLEAYILELFRHSSYLPFTIPHCTTKDTSLNGYFIPKDTCVFINQWQIN 315 Ol NPTISDRSNLPLTEAFILEIFRHSSFLPFTIPHCTTRDTSLNGYYIPKDTCVFINQWQIN 420 Om TPRLSDKINLPLLEAFILEIFRHSSFLPFIIPHCTIKDTSLNGYFIPKDTCVFINQWQVN 420 * :**: ***: **:***:*****:*** ***** :*******:*************
Figura 5. Alinhamento da seqüência protéica do gene cyp1a de Astronotus ocellatus
(Ao), Oreochromis niloticus (On), Oryzias latipes (Ol) e Onchorhynchus mykiss (Om).
O alinhamento das sequências foi feito pelo ClustalW. *= homologia entre as bases.
83
3.4 Expressão dos genes cyp1a e ß-actina
3.4.1 Exposições com o petróleo de Urucu
Nas análises de expressão gênica das amostras parcialmente degradadas,
não foi possível visualizar diretamente os resultados no gel. Foi necessário o auxílio
do programa computacional Image J, que analisa a densintometria pelo número de
pixels da imagem para normalizar a expressão da cyp1a em relação à ß-actina. Uma
vez que a ß-actina é o controle constitutivo, admite-se que a expressão deste gene é
100% e a expressão real do gene cyp1a é o valor calculado. Os fragmentos obtidos
em todas as amostras tiveram o tamanho esperado: ß-actina = 231pb e cyp1a =
144pb.
Os experimentos de exposição por 96 horas em condições regulares,
hipóxicas e acidificadas, de indivíduos adultos de A. ocellatus, mostraram a mesma
tendência na expressão do gene cyp1a, isto é, expressão crescente seguida de
queda. O eixo y nas figuras 7, 9, 11, 13, 15 e 17 representa a normalização das
áreas das bandas do gene cyp1a em relação à ß-actina (controle constitutivo). O
valor é dado em pixels.
No experimento de exposição ao petróleo em condições regulares não foi
observada a expressão do gene cyp1a nos indivíduos do controle. O gene foi
expresso a 0,224%, mostrou-se mais alto a 0,449% atingindo o pico de expressão a
0,889%. Em 1,78% houve uma redução na expressão (Figuras 6 e 7). Cada banda
na Figura 6 representa um indivíduo.
84
Figura 6. Expressão dos genes ß-actina e cyp1a de indivíduos de A. ocellatus
expostos a diferentes concentrações de petróleo, experimentos em condições
regulares; M = marcador de peso molecular Ladder 100 pb.
Um resumo de todas as concentrações por análise densintométrica está
exposto na Figura 7. A normalização foi feita pela análise densintométrica do gel
usando ß-actina como referência (ver Fig. 6).
Normalização da expressao do gene cyp1a
0
10
20
30
40
50
0 0,224% 0,449% 0,889% 1,788%
Percentual de contaminação com petróleo
n=4
SEM
n=5
**
n=5 n=6 n=4
Figura 7. Normalização da expressão de mRNA de cyp1a em A. ocellatus expostos
ao petróleo em condições regulares.
Nos experimentos de exposição ao petróleo com o Astronotus em condições
de hipoxia, houve um aumento da expressão do gene cyp1a com o aumento da
concentração do petróleo, com início a 0,224%, aumentado a 0,449% e na
concentração de 0,899% houve uma queda na expressão. Os indivíduos expostos a
1,78% de petróleo morreram antes de 72 horas de exposição (Figuras 8 e 9). Cada
ß-actina
cyp1a
85
banda na Figura 8 representa um indivíduo.
Figura 8. Expressão dos genes ß-actina e cyp1a de indivíduos de A. ocellatus
expostos a diferentes concentrações de petróleo, experimentos em condições de
hipoxia. M = marcador de peso molecular Ladder 100pb.
Um resumo de todas as concentrações por análise densintométrica está
exposto na Figura 9. A normalização foi feita pela análise densintométrica do gel
usando ß-actina como referência (ver Fig. 8).
Normalização da expressão do gene cyp1a
0
30
60
90
120
150
180
Control 0,224% 0,449% 0,899%Percentual de contaminação com petróleo
n=4 n=5n=3n=6
Normalização da expressão do gene cyp1a
0
30
60
90
120
150
180
Control 0,224% 0,449% 0,899%Percentual de contaminação com petróleo
n=4 n=5n=3n=6
Figura 9. Normalização da expressão de mRNA cyp1a em A. ocellatus expostos ao
petróleo em condições de hipoxia.
Os indivíduos de Astronotus expostos ao petróleo por 96 horas em águas
ácidas apresentaram comportamento similar quanto à expressão de genes nos
experimentos anteriores. O aumento da expressão da cyp1a foi proporcional ao
aumento da concentração de petróleo. Igualmente ao experimento em condições
ß-actina
cyp1a
86
regulares, a expressão do gene cyp1a aumentou até a concentração de 0,449% de
petróleo e, a partir de 0,899%, a expressão gênica da cyp1a diminuiu drasticamente
(Figuras 10 e 11). Cada banda na Figura 10 representa um indivíduo.
Figura 10. Expressão dos genes ß-actina e cyp1a em indivíduos de A. ocellatus
expostos a diferentes concentrações de petróleo, em condições ácidas. M =
marcador de peso molecular Ladder 100pb.
Um resumo de todas as concentrações por análise densintométrica está
exposto na Figura 11. A normalização foi feita pela análise densintométrica do gel
usando a ß-actina como referência (ver Fig. 10).
Normalização da expressão do gene cyp1a
0
10
20
30
40
50
60
70
Controle 0,224% 0,449% 0,899% 1,78%Percentual de contaminação com petróleo
n=4 n=4 n=4 n=5 n=3
Normalização da expressão do gene cyp1a
0
10
20
30
40
50
60
70
Controle 0,224% 0,449% 0,899% 1,78%Percentual de contaminação com petróleo
n=4 n=4 n=4 n=5 n=3
Figura 11. Normalização da expressão de mRNA cyp1a em A. ocellatus expostos ao
petróleo em condições ácidas.
ß-actina
cyp1a
87
3.4.2 Fração solúvel do petróleo de Urucu
Os experimentos realizados com a fração solúvel do petróleo de Urucu com
indivíduos de Astronotus expostos por 96 horas quanto à mortalidade e expressão
do gene cyp1a, mostraram-se diferentes nos resultados em relação aos indivíduos
desta espécie expostos nas mesmas condições ao óleo cru. Não houve mortalidade
em nenhum dos experimentos de exposição às cinco concentrações.
Nos indivíduos expostos à fração solúvel do petróleo de Urucu em condições
regulares não houve expressão da cyp1a no controle e 0,0061%; nos indivíduos
expostos a 0,024% houve uma expressão muito baixa, com aumento gradativo até a
concentração de 1,56%. Diferentemente dos experimentos com o óleo cru, não
houve uma diminuição da expressão da cyp1a quando as concentrações eram
relativamente altas (Figuras 12 e 13). Cada banda na Figura 12 representa um
indivíduo.
Figura 12. Expressão dos genes ß-actina e cyp1a em indivíduos de A. ocellatus
expostos a diferentes concentrações da fração solúvel do petróleo, experimentos em
condições regulares. M = marcador de peso molecular Ladder 100pb.
Um resumo de todas as concentrações por análise densintométrica está
exposto na Figura 13. A normalização foi feita pela análise densintométrica do gel
usando a ß-actina como referência (ver Fig. 12).
Controle 0,0061% 0,024% 0,098% 0,39% 1,56%
ß-actina
cyp1a
M
Controle 0,0061% 0,024% 0,098% 0,39% 1,56%
ß-actina
cyp1a
Controle 0,0061% 0,024% 0,098% 0,39% 1,56%Controle 0,0061% 0,024% 0,098% 0,39% 1,56%Controle 0,0061% 0,024% 0,098% 0,39% 1,56%
ß-actina
cyp1a
M
88
Normalização do gene cyp1a
0
10
20
30
40
50
60
Controle 0,0061% 0,024% 0,098% 0,39% 1,56%
Percentual de contaminação com a fração solúvel do petróleo
n=4 n=6n=6 n=6 n=6 n=6
Normalização do gene cyp1a
0
10
20
30
40
50
60
Controle 0,0061% 0,024% 0,098% 0,39% 1,56%
Percentual de contaminação com a fração solúvel do petróleo
n=4 n=6n=6 n=6 n=6 n=6
n=4 n=6n=6 n=6 n=6 n=6
Figura 13. Normalização da expressão de mRNA cyp1a em A. ocellatus expostos a
fração solúvel do petróleo em condições regulares.
As exposições utilizando a fração solúvel de petróleo com indivíduos de A.
ocellatus em condições de hipoxia apresentaram uma tendência similar aos
experimentos realizados com o óleo cru na mesma condição. Os indivíduos não
apresentaram expressão do gene cyp1a no controle, porém houve expressão deste
gene em indivíduos expostos às concentrações de 0,0061%, 0,024%, 0,098% e
0,39%. No entanto, na concentração 1,78% houve uma diminuição brusca na
expressão deste gene, que foi menor que a expressão na concentração 0,0061%
(Figuras 14 e 15). Cada banda na Figura 14 representa um indivíduo.
Figura 14. Expressão dos genes ß-actina e cyp1a em indivíduos de A. ocellatus
expostos a diferentes concentrações da fração solúvel do petróleo, experimentos em
condições de hipoxia. M = marcador de peso molecular Ladder 100 pb.
M
Controle 0,0061% 0,024% 0,098% 0,39% 1,56%
ß-actina
cyp1a
M
Controle 0,0061% 0,024% 0,098% 0,39% 1,56%
ß-actina
cyp1a
M
Controle 0,0061% 0,024% 0,098% 0,39% 1,56%
ß-actina
cyp1a
89
Um resumo de todas as concentrações por análise densintométrica está
exposto na Figura 15. A normalização foi feita pela análise densintométrica do gel
usando a ß-actina como referência (ver Fig. 14).
Normalização do gene cyp1a
0
10
20
30
40
50
60
Controle 0,0061% 0,024% 0,098% 0,39% 1,56%
Percentual de contaminação com a fração solúvel do Petróleo
n=4 n=6
n=6
n=6 n=6n=6
Normalização do gene cyp1a
0
10
20
30
40
50
60
Controle 0,0061% 0,024% 0,098% 0,39% 1,56%
Percentual de contaminação com a fração solúvel do Petróleo
n=4 n=6
n=6
n=6 n=6n=6
n=4 n=6
n=6
n=6 n=6n=6
Figura 15. Normalização da expressão de mRNA cyp1a em A. ocellatus expostos a
fração solúvel do petróleo em condições de hipoxia.
A expressão do gene cyp1a em indivíduos de A. ocellatus expostos a fração
solúvel do petróleo em condições de acidez, também foi crescente a partir da
concentração de 0,0061% a 1,56% resultados idênticos aos encontrados em
indivíduos expostos à fração solúvel em condições regulares (Figuras 16 e 17).
Cada banda na Figura 16 representa um indivíduo.
Figura 16. Expressão dos genes ß-actina e cyp1a em indivíduos de A. ocellatus
expostos a diferentes concentrações de petróleo, experimentos em condições
ácidas. M = marcador de peso molecular Ladder 100pb.
ß-actina
cyp1a
90
Um resumo de todas as concentrações por análise densintométrica está exposto na
Figura 17. A normalização foi feita pela análise densintométrica do gel usando a ß-
actina como referência (ver Fig. 16).
Normalização do gene cyp1a
0
20
40
60
80
100
Controle 0,0061% 0,024% 0,098% 0,39% 1,56%Percentual de contaminação com a fração solúvel do Petróleo
n=4 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6
Normalização do gene cyp1a
0
20
40
60
80
100
Controle 0,0061% 0,024% 0,098% 0,39% 1,56%Percentual de contaminação com a fração solúvel do Petróleo
n=4 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6
Figura 17. Normalização da expressão de mRNA cyp1a em A. ocellatus expostos ao
petróleo em condições ácidas.
91
4. Discussão
4.1 Mortalidade
Quando são liberados poluentes no ambiente aquático é possível que
ocorram efeitos tóxicos na biota aquática. Efeitos diretos variam com a intensidade
e duração da exposição ao contaminante, e vêm sendo freqüentemente estudados
com o objetivo de estimar o risco e estabelecer níveis permissíveis de
contaminação, baseando-se nas respostas de algumas espécies (Long et al., 1995).
Esses critérios são baseados em testes de toxicidade em laboratório, que
normalmente empregam espécies modelos, expostas a contaminantes simples. O
efeito direto dos contaminantes reduz a abundância dos organismos, seja pela
mortalidade, seja por alterações na fecundidade (Fleeger et al., 2003).
O histórico caso do derramamento de petróleo pelo navio Exxon Valdez
resultou na liberação de 258.000 barris de óleo cru em águas da baía de Príncipe
William em 1989. Sharp e colaboradores (1996) verificaram que, no local, após esse
derrame, as populações de ostra preta Haematopus bachmani tiveram sua
reprodução reduzida. Pequenas aves também apresentaram alta mortalidade,
comparadas à área escolhida como controle. Al-Yakoob e colaboradores (1996)
analisaram os efeitos do petróleo no peixe marinho Menidia beryllina e constataram
mudanças nas taxas de sobrevivência e crescimento da espécie.
Os indivíduos de A. ocellatus expostos diretamente ao petróleo apresentaram
mortalidade, diferente dos indivíduos expostos à fração solúvel do mesmo petróleo,
particularmente no caso dos indivíduos expostos também a hipoxia. Isso seria
facilmente explicado pelas características químicas e físicas do petróleo: houve uma
barreira na entrada de luz e passagem de oxigênio via difusão, processos com
efeito negativo mais rápido para a espécie. Embora haja registro que o Astronotus
92
tenha alta resistência a hipoxia e resiste até seis horas em anoxia total a 28°C
(Muuzse et al., 1998), quando estes fatores estão ligados à presença de petróleo na
água, tornam-se fatais, particularmente nas concentrações subletais acima de
0,224%. Com a deficiência de O2 na água, os peixes de respiração estritamente
aquática tendem a aumentar a freqüência dos batimentos operculares a fim de
suprir a necessidade de O2 e, com isso, o bombeamento de água contaminada com
petróleo é maior, resultando na aceleração do processo de contaminação do
indivíduo. Embora a mortalidade nos experimentos com a fração solúvel tenha sido
nula, isto não quer dizer que a fração solúvel seja menos nociva que o petróleo,
porque o petróleo representa além da barreira física, a nocividade dos seus
compostos, enquanto a fração solúvel por sua vez representa uma alta
concentração de hidrocarbonetos poliaromáticos, alifáticos e metais pesados de alto
poder cancerígeno, que são rapidamente absorvidos por peixes. No caso particular
da Amazônia, devido às suas flutuações no nível de água nos rios com períodos de
cheia e seca, fartura e escassez de alimento, os indivíduos tendem a acumular uma
grande quantidade de gordura no corpo o que facilita a bioacumulação destes
compostos que tem afinidade por lipídeos, o que permite sugerir que embora a
fração solúvel seja altamente tóxica devido aos seus componentes, o petróleo
apresenta, além disso, uma barreira na superfície da água, prejudicando
diretamente a respiração.
Wood e McDonald (1982) revisaram estudos em salmonídeos e descreveram
os ajustes fisiológicos dos peixes às águas ácidas resultantes da ação antrópica.
Esses autores mostraram que em baixos pHs ocorre inicialmente um efluxo difusivo
de íons, principalmente Na+ e Cl-, ao mesmo tempo em que o influxo é inibido. O
influxo de Na+ é inibido devido ao excesso de H+ relacionado à acidez, isto reverte o
93
funcionamento do sistema de troca entre Na+/H+ nos canais de Na+ localizados nas
brânquias (Lin e Randall, 1995). Assim, ao invés de bombear Na+ para o interior da
célula, a bomba apical passa a transportar H+. Os efeitos decorrentes deste evento
são a inibição do transporte de Na+ e, principalmente, o aumento no efluxo difusivo
resultante da diminuição da concentração de íons plasmáticos, reduzindo o volume
dos fluídos corpóreos. A liberação de novos eritrócitos na corrente sangüínea
contribui para o processo de hemoconcentração devido ao aumento da viscosidade
sanguínea, tornando difícil o bombeamento do sangue no sistema circulatório do
peixe. Além disso, ocorre, também, a competição do íon H+ com os canais de Ca2+,
reduzindo a entrada deste íon no sistema, prejudicial a uma série de ajustes
fisiológicos no peixe. Porém, segundo Paolis e Kukkonen (1997) a acidez das
águas, somada à presença de contaminantes aquáticos, parece não ter efeitos
negativos na solubilidade e disponibilidade desses contaminantes orgânicos.
Matsuo (2004) descreveu que, no caso de exposição ao cobre, há uma redução da
forma livre do metal na água, reduzindo, assim, a toxidade para os peixes
estudados. No presente trabalho com exemplares de A. ocellatus expostos ao
petróleo em condições de acidez (pH=3,5), não foi observada grande diferença com
relação à mortalidade ao compararmos os indivíduos nas condições regulares e
expostos às mesmas concentrações (houve morte de um indivíduo a mais em cada
concentração). Resultados semelhantes foram obtidos por Matsuo (2004) ao
estudar tambaqui (Colossoma macropomum).
94
4.2 Clonagem e expressão do gene cyp1a e ß-actina em indivíduos de A.
ocellatus expostos ao petróleo e a fração solúvel do petróle o de Urucu
O petróleo já foi descrito como um indutor de diversas alterações fisiológicas,
entre as quais se podem citar alterações na regulação iônica (Bastos e Val, 1995;
Menezes e Val, 1995; Farias e Costa, 1996; Mendes e Val, 1997; Brauner et al.,
1999), na respiração (Menezes e Val, 1995; Mendes e Val, 1996; Brauner et al.,
1999; Almeida-Val et al., 2002) e no sistema imune (Oliveira e Val, 1996; Matsuo et
al., 2002).
Os efeitos causados pelo petróleo em peixes são decorrentes de respostas
rápidas. Levine e Oris (1999) descreveram que a exposição a um relativamente
curto período (48 horas) seria suficiente para que os organismos apresentassem
respostas para esses contaminantes em tecidos internos como o fígado. Brauner e
colaboradores (1999) descreveram que a exposição a 12,5% da fração solúvel do
petróleo da reserva de Urucu por apenas 45 minutos já resulta em um aumento
significativo na freqüência respiratória da espécie Hoplosternum littorale, assim
como a ingestão do óleo por esta espécie também resulta em significativa redução
nas proporções de ATP e GTP: Hb.
Os efeitos adversos devido à presença de componentes do petróleo no
ambiente aquático atingem diretamente os peixes, desde o aspecto molecular até
suas populações. Nos estudos citados anteriormente, diferentes metodologias foram
utilizadas para a avaliação dos parâmetros fisiológicos; entretanto nenhum foi
conduzido com base na avaliação da expressão do gene cyp1a.
O citocromo P450 (CYP1A) é uma família multigene (Nelson et al., 1996) e o
gene do cyp1a é um biomarcador amplamente usado na avaliação da contaminação
do ambiente aquático, principalmente para identificar efeitos de hidrocarbonetos
95
policíclicos aromáticos, incluindo suspeitas de interrupção química endócrina (EDCs)
(Schlezinger e Stegeman, 2001; Moore et al., 2003; Fent, 2003). Porém, anticorpos
e seqüências desse gene, estão disponíveis para algumas espécies, normalmente
as mais comerciais ou as espécies modelo usadas em vários experimentos
toxicológicos tais como carpa, medaka, salmão, truta e zebrafish.
CYP1A é comumente expressa em células epiteliais de vários órgãos:
intestino, fígado, rim, brânquias, gônadas, tecido nervoso, células endócrinas etc..
Apesar disso, sua maior atividade ocorre no fígado quando comparada a outros
órgãos (Sarasquete et al., 1999). Lee e colaboradores (2005), ao analisarem a
expressão do gene cyp1a em cérebro, olho, gônadas, intestino, fígado, músculo e
pele de adultos da espécie de peixe Rivulus marmoratus, verificaram o que o gene
cyp1a foi expresso em todos os tecidos testados, com exceção do olho, cuja
expressão foi baixa. Sarasquete e Segmar (2000) também confirmaram, por
ensaios enzimáticos, que CYP1A está presente em vários tecidos, porém seu maior
local de expressão em peixes teleósteos é no fígado.
Análise do cérebro de Sparus aurata expostos por dois dias ao 2,3,7,8
tetraclorodibenzo -p- dioxina (TCDD) mostrou que os níveis de mRNA hepático de
cyp1a foram significativamente elevados quando comparados ao controle em todas
as concentrações testadas e a resposta era aumentada com o tempo de exposição
(Ortiz - Delgado et al., 2002). Roberts e colaboradores (2006), ao analisarem a
expressão do gene cyp1a em brânquias de salmão coho na baía de Príncipe
William (Alaska), verificaram que houve um aumento da expressão em amostras de
locais onde houve derramamento de petróleo, atingindo expressão entre 5 e 10
vezes maiores que nas amostras da mesma espécie coletadas na área controle.
96
A enzima CYP1A catalisa a hidroxilação de PAHs a formas hidrossolúveis
para que sejam excretadas pela bile, o que a caracteriza como um biomarcador
eficiente em peixes (McCarty et al., 2002). Experimentos com embriões avaliaram a
toxicidade crônica de hidrocarbonetos com 3-5 anéis, derivados de petróleo,
mostrando que a toxicidade crônica pode, também, ser avaliada por meio da
CYP1A (Brinkworth et al., 2003). Ramanchadran e colaboradores (2006) também
observaram a indução da CYP1A em peixes expostos à fração solúvel do petróleo
com uma grande quantidade de PAHs.
Até o presente momento existem poucos estudos em espécies de água doce
que utiliza a CYP1A na sua forma enzimática, protéica ou mRNA como
biomarcador. A expressão do gene cyp1a tem sido avaliada após a exposição dos
organismos a hidrocarbonetos de petróleo e os resultados têm se mostrado
similares tanto em corpos d’água como em sedimento contaminados.
Neste trabalho a expressão do gene cyp1a foi analisada em fígados de peixes
adultos da espécie amazônica Astronotus ocellatus, exposta às concentrações
subletais de petróleo variando de 0,224 a 1,78%. Avaliamos também a espécie
exposta a concentrações subletais da fração solúvel do petróleo variando de 0,0061
a 1,56%. Em ambos os experimentos foram utilizadas três condições ambientais:
normal, hipóxica e ácida. Encontramos induções do gene cyp1a em todas as
concentrações analisadas, sendo que o gene cyp1a demonstrou ser um bom
marcador quando os indivíduos da espécie são expostos a concentrações subletais.
No entanto, em altas concentrações de petróleo (1,78%) em condições regulares e
ácidas houve uma diminuição da expressão deste gene. O mesmo ocorreu no
experimento de exposição à fração solúvel do petróleo em condições de hipoxia.
Neste experimento a 1,56% da fração solúvel do petróleo em condições de hipoxia,
97
essa expressão foi menor que na primeira concentração (0,224% de petróleo e
0,0061% da fração de óleo cru). Isso sugere que em altas concentrações do
contaminante o organismo não consigue mais responder à entrada de
contaminantes, resultando na supressão deste gene ou na falta de expressão, que
pode ser devido à debilidade do organismo. É provável que a ativação de outros
genes responsáveis pela desintoxicação, ou mesmo a supressão de outros genes
juntamente com o cyp1a, tenha resultado num colapso do organismo. Porém isto
não está claro na literatura. Respostas como estas variam de espécie para espécie;
os embriões de zebrafish expostos às mesmas concentrações da fração solúvel do
petróleo de Urucu apresentaram expressão crescente da cyp1a a 1,56% (Capítulo
1). Por outro lado, Polino e Holdway (2003) observaram que a atividade da CYP1A
em peixe arco-íris de água doce, declinou a níveis inferiores aos do controle após a
exposição do peixe a altas concentrações da fração solúvel dispersa em petróleo.
Esses resultados mostram que a espécie amazônica Astronotus ocellatus é
mais responsiva que os embriões de zebrafish à fração solúvel do petróleo. No caso
de peixes adultos, a primeira via de tomada e excreção dos hidrocarbonetos,
freqüentemente por difusão, são as brânquias (Thomas e Rice, 1981); portanto
compostos altamente solúveis em lipídeos seriam rapidamente absorvidos pelas
brânquias. Talvez, por esta razão, os animais adultos fossem mais prejudicados que
os embriões, pois estes realizam suas trocas gasosas adicionalmente por via
cutânea. Entretanto era esperado que os efeitos nos embriões fossem mais nocivos
por estes apresentarem uma relação superfície/volume maior para a absorção dos
PAHs. Como se observa os resultados são controversos.
Existem vários estudos que registram a presença dos hidrocarbonetos de
petróleo no ambiente. Entretanto, o efeito tóxico de exposição a concentrações
98
subletais de hidrocarbonetos de petróleo ainda são incertos (Steadman et al., 1991,
Al-Yakoob et al., 1996).
Um derrame acidental de petróleo não apresenta conseqüências drásticas
apenas por si mesmo, mas, sobretudo porque além do efeito do óleo, as
conseqüentes ações do homem para remover ou dispersar este óleo são também
danosas ao ambiente e organismos aquáticos. Os processos de remediação não
apresentam uma solução de limpeza do ambiente ou estado menos sujo que
anterior ao acidente. Essas técnicas de remediação, baseadas no uso de
dispersantes para contornar os problemas como um derrame de óleo, em grande
parte dos casos, é uma alternativa mais tóxica que os derramamentos (Cohen e
Nugegoda, 2000). Ramanchadran e colaboradores (2006) relatam em brackfish que
o uso de dispersantes aumentaria a exposição a PAHs em 250 vezes em ambiente
de água doce, mas apenas 10 vezes em ambiente marinho. Uma das principais
razões é o aumento da solubilidade de PAHs em baixa salinidade, especialmente os
PAHs de baixo peso molecular com dois e três anéis homólogos. Outra técnica
utilizada para remediação é a de queimar o petróleo, o que também não é eficaz,
uma vez que estudos baseados nas concentrações de hidrocarbonetos totais no
petróleo, mostrou que o óleo cru parcialmente queimado é mais tóxico para a
espécie de peixe Menidia beryllina que o óleo cru. Não existe ainda uma técnica
que se mostre totalmente eficaz na remediação, elas podem sim, visualmente
“limpar” o ambiente, porém os efeitos se perpetuam de alguma forma.
Outro problema é que a maioria das refinarias libera grandes volumes de
efluentes (por exemplo, água de formação) diretamente nos ambientes aquáticos.
Pode-se afirmar que, diariamente, a média de descarga de efluentes de uma
99
refinaria típica de Ontário era de 11.370 m3 em 1989 (Chapman e Loo-sy, 1990),
resultando em uma poluição crônica, altamente prejudicial aos organismos.
Embora seja registrado na literatura que a similaridade da seqüência da
CYP1A entre espécies de peixes não é muito alta (Cousinou et al., 2000), e, talvez,
devido à dificuldade de encontrar e confirmar esta seqüência, haja poucos trabalhos
que descrevem a expressão do gene cyp1a, o presente trabalho teve sucesso na
obtenção da seqüência e, além disso, confirmou-se a similaridade com outras
seqüências de outras espécies de peixes. Embora a Amazônia possua uma grande
diversidade de espécies de peixes, a maior do planeta, o conhecimento genético
que se tem sobre essas espécies é pequeno e os estudos geralmente concentram-
se em espécies migradoras como o tambaqui, Colossoma macropomum. Em se
tratando de bioindicador de contaminação com petróleo, uma espécie migradora
não seria muito desejável, pois ela tem a capacidade de fugir rapidamente do
ambiente contaminado. Por isso estudamos o A. ocellatus, peixe de hábito
territorial.
A relação entre as características físico-químicas dos ecossistemas
aquáticos e a toxicidade do petróleo no contexto de ambientes amazônicos ainda é
pouco entendida. Dados da literatura indicam que a presença de compostos
orgânicos na água como as substâncias húmicas (SH) afeta a solubilidade e a
biodisponibilidade de contaminantes lipofílicos. Dentro do contexto dos sistemas de
água preta ou branca da Amazônia, a concentração de SH é, provavelmente, um
dos fatores químicos de maior relevância, modulando a toxicidade do petróleo aos
organismos, porém esses mecanismos ainda não estão completamente
esclarecidos (Matsuo, 2004).
100
PAHs são compostos hidrofóbicos e no ambiente aquático eles aderem
rapidamente ao sedimento e a outras partículas (Varanasi, 1989), o que causa
muita preocupação na região do Urucu, uma vez que este rio é um tributário do Rio
Solimões, altamente rico em material em suspensão. No caso de um derramamento
de petróleo, esses PAHS adeririam facilmente a essas partículas e seriam
depositadas no sedimento ou ficariam disponíveis para a tomada por organismos
aquáticos.
A luz solar pode iniciar ou induzir efeitos tóxicos. Em determinados
ambientes, a fototoxicidade provoca alterações nos PAHs causando
mutagenicidade e carcinogenicidade. Portanto, a toxicidade (aguda ou sub-letal)
destas substâncias podem aumentar significativamente se os organismos estão
expostos a radiação UV. Esta fototoxicidade pode ocorrer mesmo se os organismos
são removidos da exposição química antes da radiação, indicando que a atividade é
devida à absorção ou acúmulo de moléculas (Allred e Giesy, 1985; Ankley et al.,
1994; Wernersson e Dave, 1998). A fototoxicidade induzida por PAHs tem sido
observada em vários organismos aquáticos, incluindo peixes (Kagan et al., 1985,
1987; Weinstein et al., 1997), zooplâncton (Trucco et al., 1983; Allred e Giesy,1985;
Holst e Giesy, 1989) e anfíbios (Kagan et al., 1984, 1985, 1987; Hatch e Burton,
1998); assim como em células humanas (Kagan et al., 1989; Mauthe et al., 1995) e
plantas (Zweig e Nachtigall, 1975; Huang et al., 1993; Ren et al., 1994, 1996; Krylov
et al., 1997).
O desequilíbrio ecológico causado por um derramamento de petróleo
também é outro motivo de preocupação. Avaliação em algumas áreas onde houve
derramamento de petróleo como no caso do petroleiro Exxon Valdez, observou-se
que macro-algas dominantes e invertebrados sésseis e raspadores, que vivem em
101
substratos rochosos, sofreram alta mortalidade devido ao efeito do óleo.
Conseqüentemente, outras espécies de algas cresceram abundantemente devido à
ausência dos invertebrados raspadores (Peterson, 2001). A observação deste boom
de algas após esse derrame tem sido atribuída à mortalidade seletiva dos
raspadores de algas, ocorrendo, assim, um desequilíbrio ecológico total.
Na Amazônia um derrame de petróleo seria uma grande catástrofe. As
peculiaridades deste ambiente de água doce serviriam como potencializadoras dos
efeitos causados por petróleo. Por exemplo, a baixa salinidade e as oscilações na
concentração de O2, as presenças de luz UV intensa e de SH, agravariam esses
efeitos, seja eles causados por um derramamento na forma de óleo cru ou fração
solúvel. Desta forma, estudos sobre biomarcadores moleculares de exposição às
frações subletais são necessários a fim de se detectar uma exposição a esse tipo
de contaminante, quando ainda podemos tomar medidas de mitigação. Um
derramamento no “local errado” ou na “hora errada” poderia colocar em risco a
existência de espécies endêmicas e causar sua extinção.
O presente trabalho mostrou claramente que o gene Cyp1A pode ser um
forte aliado no acompanhamento da qualidade do ambiente no que se refere à
presença de petróleo. A espécie Astronotus ocellatus, usada no presente estudo,
responde de forma significativa condições de baixas de contaminação ambiental por
petróleo.
102
5. Conclusões
Exposição ao óleo cru:
• Exemplares de Astronotus ocellatus apresentam alta mortalidade quando
expostos a concentrações de óleo cru a partir de 0,449% em condições de
hipoxia;
• Em concentrações superiores a 1,78% de óleo cru em condições de hipoxia,
não há sobrevivência de indivíduos de A. ocellatus;
• Indivíduos de Astronotus ocellatus expostos ao petróleo em condições
acidificadas apresentam mortalidade acentuada em relação ao grupo
controle.
Exposição a fração do petróleo:
• Não há mortalidade dos indivíduos de A. ocellatus expostos à fração solúvel
do petróleo nas concentrações entre 0,0061% e 1,56% por 96 horas em
diferentes condições ambientais: regulares, hipóxicas e acidificadas;
• Astronotus expostos ao óleo cru em condições ambientais regulares e
acidificadas apresentam uma crescente expressão do gene cyp1a em
concentrações de até 0,449%; em concentrações superiores, há queda da
expressão, devido a debilidade do organismo;
• Indivíduos de Astronotus expostos ao óleo cru em condições de hipoxia
apresentam uma crescente expressão do gene cyp1a em concentrações de
103
até 0,449%, sendo que na concentração de 0,899% há queda da expressão,
em concentrações superiores, há a morte do indivíduo;
• Indivíduos de Astronotus expostos 96 horas a fração solúvel do petróleo nas
concentrações entre 0,024% e 1,56% em condições ambientais regulares
apresentaram expressão crescente do gene cyp1a;
• Indivíduos de Astronotus expostos por 96 horas a fração solúvel do petróleo
em condições de hipoxia apresentam expressão do gene cyp1a em
concentrações entre 0,0061% e 0,39%;
• Ambientes hipóxicos aumentam a indução da cyp1a em relação a ambientes
em condições regulares;
• Em concentrações acima de 1,56% de fração solúvel do petróleo em
condições ácidas, indivíduos de Astronotus expostos por 96 horas
apresentam queda brusca na expressão do gene cyp1a;
• Indivíduos de Astronotus expostos a fração solúvel do petróleo em ambientes
com baixo pH apresentam expressão da cyp1a a partir da concentração sub-
letal de 0,0061%.
104
Capítulo 3
“Fracionamento do Petróleo de Urucu e aplicação em
embriotestes de Danio rerio”
105
1. Introdução
O petróleo é uma mistura complexa formada por inúmeros compostos de
carbono, sendo que os hidrocarbonetos constituem mais de 75% da fração dos
óleos cru e refinado (Neff, 1979; Hoffman et al., 1995). Os hidrocarbonetos podem
ser de diversos tipos, tais como: parafínicos, monoaromáticos, poliaromáticos,
isoprenóides, entre outros. Importante salientar que o petróleo varia na sua
composição de hidrocarbonetos, dependendo da sua fonte geológica.
Os derramamentos de petróleo são uma das principais fontes de
hidrocarbonetos poliaromáticos (policíclicos aromáticos, PAHs) no ambiente
aquático. Esses constituem uma das frações mais tóxicas do petróleo, que são
solúveis na água, apesar de relativamente voláteis (Alkindi et al., 1996). A
toxicidade dos PAHs deve-se ao seu potencial carcinogênico/genotóxico. Uma vez
absorvidos, são metabolizados pelos organismos, ativando seu metabolismo, o que
geralmente resulta na produção de formas ainda mais reativas do que o composto
original (Stegeman, 1993).
Hidrocarbonetos são quantitativamente os mais importantes compostos
existentes no petróleo e podem ser classificados em três grupos com variadas
subclasses (Freedman, 1989):
1. Hidrocarbonetos alifáticos são compostos saturados de cadeia aberta.
Moléculas insaturadas têm uma dupla ou tripla ligação. Isso está ilustrado pela
seguinte série de dois carbonos alifáticos: etano (H3C-CH3); etileno (H2C=CH2) e
acetileno (HC≡CH). Alifáticos saturados são conhecidos como parafinas ou alcanos
e são quimicamente mais estáveis que os insaturados alifáticos. Esses últimos não
estão presentes no óleo cru, mas podem ser produzidos secundariamente durante o
processo de refinamento industrial, ou fotoquimicamente após um derramamento.
106
2. Hidrocarbonetos alicíclicos têm alguns ou todos seus átomos de
carbono arranjados em uma estrutura de anel e eles podem ser saturados ou
insaturados.
3. Aromáticos são hidrocarbonetos que contém no mínimo um anel de seis
carbonos na estrutura molecular. O anel básico é conhecido como benzeno.
É importante salientar que o tamanho do derrame de petróleo não
necessariamente está relacionado com o potencial do dano que pode causar no
ambiente. Mesmo um pequeno vazamento em um ambiente ecologicamente
sensível, como por exemplo, na Ilha de Galápagos onde existem espécies raras,
pode causar danos severos. Adicionalmente, a composição do petróleo pode
influenciar fortemente os danos (Freedman, 1989).
Em geral, frações leves são mais solúveis na água que as pesadas e os
compostos aromáticos são muito mais solúveis que alcanos. Hidrocarbonetos leves
são mais solúveis na água e têm alta toxicidade. A grande parte dos danos
ecológicos após um derramamento de petróleo está muitas vezes relacionada a
frações leves (Wang et al., 1999; Wang e Fingas, 2003).
Vários estudos recentes têm tentado derivar uma relação empírica entre as
propriedades físico-químicas de hidrocarbonetos e sua toxicidade. Uma importante
observação que tem emergido desses estudos é que a toxicidade de determinados
hidrocarbonetos está relacionada à sua estrutura química e hidrofobicidade
(Hermens et al., 1985).
O petróleo contém diferentes compostos orgânicos. Uma ampla variedade de
técnicas instrumentais e não instrumentais são atualmente utilizadas nas análises
de hidrocarbonetos, as quais incluem cromatografia gasosa (GC), cromatografia
gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC-MS), cromatografia líquida de alta
107
eficiência (HPLC), espectroscopia infravermelha (SFC), ultravioleta (UV) e
espectroscopia fluorescente, espectrometria de massa e métodos gravimétricos
(Wang et al., 1999; Wang e Fingas, 2003). De todas essas técnicas, GC é a mais
usada. Comparada com medidas moleculares de algumas décadas atrás, existe
agora uma técnica mais sofisticada a GC-MS capilar, a qual é capaz de analisar
compostos específicos do óleo e hidrocarbonetos poliaromáticos.
A composição do petróleo varia amplamente e depende da fonte de carbono
da qual o óleo foi gerado e do ambiente geológico. Compostos aromáticos
policíclicos (PACs) são emitidos por processos industriais e combustão ou se
originam de combustíveis fósseis (Brack e Schirmer, 2003; Laflamme e Hites,
1978). Eles ocorrem como misturas complexas no ambiente e são muitas vezes
caracterizados por sua baixa solubilidade na água, havendo tendência para aderir à
matéria orgânica suspendida ou sedimentos no ambiente aquático.
Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAHs) bem como seus derivados
como alquil, oxi, hidroxil, amino e nitro-PAHs, policíclicos quinonas, hidroxiquinonas
e compostos heterocíclicos contendo nitrogênio, oxigênio e enxofre no sistema
aromático são conhecidos por exibir uma grande amplitude de efeitos de risco como
toxicidade aguda, citotoxicidade, efeitos narcóticos e genotóxicos (mutagênico,
carcinogênico, teratogênico) (Delistraty, 1997). Adicionalmente, um número de
PAHs e compostos policlorados como bifenil policlorados (PCBs), naftalenos
(PCNs), dibenzo-p-dioxinas e furanos (PCDDs/Fs) são bem conhecidos pelo seu
potencial de induzir EROD (Ethoxyresorufin O-deethylase) e citocromo P450 (Fent e
Bätscher, 2000). A expressão dessas enzimas pode levar à formação de
metabólitos mutagênicos pela biotransformação oxidativa de compostos contendo
sistema aromático e que então contribuem para o risco carcinogênico.
108
O isolamento de efeitos diretos e identificação de mutagênicos PACs
requerem sofisticados fracionamentos de propriedades físico-químicas dos
compostos que são relevantes para a toxicidade devido à complexidade das
amostras de petróleo. Nos estudos iniciais diferentes métodos foram utilizados com
essa finalidade, incluindo multi-passos líquido-líquido (mult-steps liquid-liquid) e
extração da fase sólida, técnicas de HPLC fase normal e reversa, assim como a
combinação dessas técnicas (Marvin et al., 1995; Meyer et al., 1999; Niederer,
1998; Wesp et al., 2000).
Procedimentos de fracionamento multi-passos em diferentes colunas de
HPLC (Brack et al., 2002) foram usados com sucesso para fracionar extratos de
sedimentos e como tentativa inicial para procedimentos de fracionamento (Zebühr
et al., 1993). Métodos multi-passos têm mostrado o seu potencial para isolar
individualmente PACs, que representam misturas ambientais altamente complexas
com milhares de compostos individuais, em extratos de sedimento (Bandh et al.,
1996; Brack et al., 2002; Brack e Schirmer, 2003). A combinação em série de
diferentes colunas de HPLC possibilita a separação de compostos de acordo com
diferentes propriedades físico-químicas em um único passo. Esta metodologia reduz
o risco de perdas e formação de artefatos devido ao uso de vidraria, mudanças na
concentração e troca de solventes.
1.1 Objetivo
O objetivo principal deste trabalho foi identificar os componentes presentes
na fração solúvel do petróleo de Urucu, os quais induzem fortemente a expressão
do gene cyp1a, pela técnica de fracionamento multi-passos e testar em embriões de
zebrafish.
109
2. Material e Métodos
2.1 Teste para escolha das colunas e eluentes utili zados na extração da fase
sólida da fração solúvel de petróleo de Urucu
Foram testadas três diferentes colunas de extração da fase sólida:
Chromabond Easy; Lichrolut RP-18 e Bakerbond C18 Polar Plus. Além da coluna de
extração da fase sólida também foram testados em cada coluna dois eluentes para
determinação do mais eficaz. Desta forma foram feitos embriotestes testando cada
coluna em dois eluentes: Metanol (ME) e Diclorometano (DCM). Também foram
efetuados controles com água nestas colunas e eluentes, para certificação de que
eles não induziriam o gene cyp1a.
Foram utilizados 20 ml da fração solúvel do petróleo de Urucu (6,25%),
eluídos a vácuo nas colunas acima citadas. Primeiramente fez-se a eluição com
10ml de ME e em seguida com 10ml de DCM. Essas soluções foram concentradas
em rotavapor por cerca de 3 horas. Ao estarem totalmente secas eram adicionados
20ml de Isowasser (água utilizada nos embriotestes, vide composição capítulo 1) e
então essa solução era armazenada a 4°C por 48 hora s. Utilizou-se, então, esses
20 ml para os embriotestes, perfazendo um total de 18 testes (Tabela 1). Em cada
placa havia 30 embriões de D. rerio com 10 ml de solução expostos por 48 horas.
Após a exposição foi feita a extração de RNA e RT-PCR para verificar a indução do
gene cyp1a e decidir qual a melhor coluna e eluente a serem usados nos
experimentos de fracionamento.
Todos os embriotestes com Danio rerio realizados neste capítulo foram
similares ao realizados no capítulo 1, onde está mais detalhada a técnica, mudando
apenas o agente estressor.
110
Tabela 1. Embriotestes realizados com as colunas utilizadas para extrair a fase
sólida da fração solúvel de Urucu. Os experimentos foram feitos com réplica e um
controle para todos utilizando apenas a Isowasser.
Controle – Isowasser Réplica 1 - Fração solúvel Rép lica 2 - Fração solúvel
Backerbond + ME (BMB) Backerbond + ME (BM1) Backerbond + ME (BM2)
Backerbond + DCM (BDB) Backerbond + DCM (BD1) Backerbond + DCM (BD2)
Chromabond + ME (CMB) Chromabond + ME (CM1) Chromabond + ME (CM2)
Chromabond + DCM (CDB) Chromabond + DCM (CD1) Chromabond + DCM (CD2)
Lichrolut + ME (LMB) Lichrolut + ME (LM1) Lichrolut + ME (LM2)
Lichrolut + DCM (LDB) Lichrolut + DCM (LD1) Lichrolut + DCM (LD2)
ME= metanol; DCM= diclorometano.
2.2 Extração da fase sólida da fração solúvel de pe tróleo utilizando
Cromabond easy e Metanol
2.2.1 Preparação da fração solúvel do petróleo de U rucu
Para o fracionamento foi requerido um grande volume de fração solúvel de
petróleo. Desta forma foram adicionados 4687,5 ml de Isowasser (capítulo 1) em
312,5 ml de petróleo (5 L de volume total, que seria 6,25% de petróleo).
Esta mistura foi mantida sob agitação por 24 horas à temperatura ambiente,
ao abrigo da luz para evitar a fotodegradação. A agitação foi realizada em frasco de
vidro com capacidade para 5 L com auxílio de hélice. Após este período a mistura
ficou em repouso por 1 hora, para a separação da fase sólida e líquida do petróleo,
cuidadosamente retirou-se apenas a fase líquida, a qual foi armazenada a 4°C ao
abrigo de luz.
111
Foram extraídos 4.150 ml da fração solúvel do petróleo de Urucu a 6,25%.
Para a extração da fase sólida foi utilizada uma coluna de Chromabond easy, que
foi primeiramente tratada com 100 ml de ME por cerca de 3 horas, para retirada de
qualquer impureza contida na coluna, seguida mais uma vez com água MilliQ, para
retirar o excesso do ME e então foi adicionado o volume de 4.000 ml de fração
solúvel. A eluição da fração solúvel durou cerca de 6 dias, sendo que as
substâncias ficaram contidas na coluna. Depois essa coluna foi tratada com 100 ml
de ME para eluir as frações ligadas à coluna. Para evaporação do ME foi utilizado o
rotavapor em banho-maria com pressão de 337mbar, a 60-70 rpm durante 7 horas.
Esse volume foi reduzido a 4ml. Porém, como o frasco de vidro foi lavado por 3 X
1ml de DCM, obteve-se um volume total de 7ml, esta fração foi conservada em
frasco de vidro âmbar estéril e foi mantida a 4°C a o abrigo da luz.
2.3 Fracionamento com Fase Reversa (RP) C18 - Croma tografia Líquida de
Alta Eficiência (HPLC)
O extrato contendo ME/DCM foi colocado em uma coluna de HPLC-RP C18
e foi eluído com 400 ml de acetonitrila (ACN). Este extrato foi separado em 40
diferentes frações (10ml cada). Esse fracionamento resultou em um volume final foi
de 4000 ml. Esse primeiro fracionamento separa os compostos de acordo com a
sua polaridade. A tendência é começar o fracionamento por compostos mais
polares e terminar com os menos polares.
2.3.1 Embrioteste com as frações do Fracionamento c om RP - HPLC C18
Foram utilizados 10 ml de cada fração seca em nitrogênio líquido (N2). Para
evaporar toda a ACN, foram adicionados 5 ml de Isowasser. Os embriotestes foram
112
feitos com as 40 frações resultantes do RF-HPLC; foi realizado um embrioteste a
cada duas frações contínuas (Fração 1 e 2, Fração 3 e 4... Fração 39 e 40). No total
foram realizadas 20 exposições e dois controles. Os embriotestes continham 10 ml
da solução Isowasser (que continham duas frações de 5 ml cada) em cada placa de
Petri juntamente com 30 embriões de zebrafish (detalhes sobre o embrioteste estão
descritos no Capítulo 1), expostos por 48 horas (2hpf a 50 hpf). Após 48 horas
foram feitas as extrações do RNA e RT-PCR para analisar a expressão do gene
cyp1a (detalhes no capítulo 1). Essas frações foram divididas em regiões para
facilitar as análises: cinco regiões chamadas de A, B, C, D e E. Foram selecionadas
três regiões (B, C e E) que induziram fortemente a expressão do gene cyp1a; as
demais análises foram realizadas apenas com estas três regiões.
Como o petróleo é uma mistura complexa de vários compostos, essa
separação não permitiu a identificação dos compostos por GC-MS (cromatografia
gasosa acoplada à espectrometria de massa), foi necessário realizar um segundo
fracionamento, utilizando a fase normal – HPLC para as frações que induziram
fortemente a cyp1a.
2.3.2 Extração da fase sólida das Frações B, C, e E
As regiões B, C, e E referentes ao fracionamento em NP-HPLC foram
diluídas em ACN; fez-se a extração da fase sólida utilizando novamente o
Chromabond Easy (5g) e ME como eluente. O procedimento foi idêntico ao descrito
em 2.1 e cada região foi diluída em 100ml de ME sendo as frações armazenadas a -
20°C até o momento da análise.
113
2.4 Extração com Fase Normal – HPLC (NP – HPLC)
Foram utilizados 25 ml de cada fração (B, C e E) diluídas em ME. Esses 25
ml de fração foram concentrados em rotavapor a 337pa, com temperatura da água
a 40°C e 50 rpm. Essas frações foram evaporadas até o volume de cerca de 1 ml e
repassadas para um frasco de vidro de 10 ml em forma de funil. A cuba de rotação
foi lavada com 1ml de Diclorometano (DCM), que era adicionado ao vidro. Essas
frações foram secas em N2 e depois de totalmente secas, acrescentava-se 3ml de
Hexano (HX): DCM (9:1). A solução era mantida em frascos de vidro âmbar e
armazenadas a 4°C.
Essa solução de 3ml HX:DCM (9:1) foi injetada na coluna NP-HPLC, e foram
feitas 2 lavagens sucessivas do recipiente com 1 ml de HX:DCM (9:1) para retirada
de qualquer traço de solução no vidro, e então aplicado novamente.
A separação foi feita por um sistema de HPLC composto de: três bombas de
alta pressão (Varian Pro Star, modelo 410, Varian, inc., Palo Alto, EUA); um
autoamostrador (Varian Pro Star, modelo 210, Varian, inc.); um DAD detector
(Varian Pro Star PDA detector modelo 330, Varian, inc.) operado de 200 nm a 400
nm. Adicionalmente foram incluídas 4 válvulas de 6 entradas (I-Valve, ERC GmbH,
Riemerling, Alemanha) e uma válvula de seleção de solvente (Vici Valco
Instruments, Houston, EUA).
Foram usados quatro tipos de coluna de aço inoxidável: (i) nitrofenilpropil
sílica (NO) (21x250 mm, 5 µm Nucleosil 100-5 NO2, Machery e Nagel, Düren,
Alemanha), (ii) cianopropil sílica (CN) (21x250 mm (CN1) e 21x125 mm (CN2), 5 µm
Nucleosil 100-5 CN, Machery e Nagel), (iii) 2-(1-pirenil)-etildimetilsilicato (PYE)
(10x250 mm, 5 µm Cosmosil PYE, média de diâmetro de poro de 120 Å, Nacalai
Tesque, Kyoto, Japão) e (iv) uma coluna de poro de carbono grafitizado (PGC)
114
(Hypersil PGC 10x50 mm, 7 µm, Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, EUA).
Além disso, duas colunas analíticas foram usadas: CN (4x250 mm) e NO
(21x250mm), preenchidas com a mesma fase estacionária descrita acima.
O sistema de NP-HPLC é muito eficiente, por que enquanto a RP-HPLC
separa os compostos de acordo com a polaridade o NP-HPLC separa os compostos
levando em consideração vários outros critérios, que serão vistos a seguir. Um
sistema automático NP-HPLC baseado no procedimento de fracionamento foi
desenhado para seguir a separação de alcanos, PCBs, PCDDs/Fs e PCNs, PAHs,
oxi, hidroxi, nitro-PAHs, e outros compostos polares. Isto é feito por uma
combinação em série de três diferentes colunas, operadas em modo de fluxo e
refluxo.
O princípio das características de retenção de quatro diferentes fases
estacionárias e sua posição no fracionamento automatizado é o seguinte:
compostos polares são retidos na fase CN, a primeira fase estacionária no
procedimento de coluna. Analitos são principalmente separados de acordo com sua
polaridade e habilidade de se ligar ao hidrogênio. Compostos apolares como PAHS
e PACs clorados eluem rapidamente e são de fácil separação dos PACs mais
polares.
A fase NO está localizada na segunda posição e se ligam a ela compostos
poliaromáticos apolares como PAHs e alquilados PAHs, S e O-heterocíclicos,
enquanto que (clorados) a-, mono- e compostos diaromáticos eluem direto para a
fase PGC/PYE. No sistema que não contém elétron π, o grupo nitrofenil age como
aceptor de elétron e retém analitos com sistemas aromáticos ricos em elétrons,
como PAHs. As colunas PYE ou PGC estão arranjadas na terceira posição, onde
115
são retidos basicamente compostos diaromáticos clorados incluindo PCBs, PCNs,
PCDDs/Fs.
Um procedimento de separação em série que segue grupos específicos no
fracionamento de uma ampla variedade de compostos pelo gradiente de eluição e
troca de colunas foi desenvolvido e avaliado. Para esta proposta, quatro diferentes
fases estacionárias foram primeiramente avaliadas por sua capacidade de retenção.
O segundo método de fracionamento foi desenvolvido incluindo o protocolo do
sistema HPLC, troca de colunas, composição do solvente, janelas de gradiente e
fracionamento. Em seguida, foram determinados os parâmetros: recuperação de
massa e compostos, assim como a reprodutibilidade do tempo de retenção. Ao
mesmo tempo o controle do solvente das quatro colunas foi efetuado no
procedimento de fracionamento por meio de testes de efeitos mutagênicos, para
evitar o uso de controles tóxicos e tornar possível o uso das colunas.
2.5 Embriotestes com as frações do NP-HPLC
Ao final da NP-HPLC obteve-se um total 72 frações, sendo 18 de cada
amostra B, C, E e mais 18 controles referentes a RP-HPLC. Essas frações foram
mantidas em freezer -20°C. Cada uma das 72 frações foi reduzida 1,5 ml e desse
volume foram retirados 100 µl expostos ao N2 a fim de secar e então foi adicionado
10ml de Isowasser, permanecendo à temperatura de 4°C por 48 horas, procedendo-
se à análise dos embriotestes. Foram expostos 30 embriões de zebrafish em cada
placa por 48 horas, com 10 ml de cada fração. Após a exposição foi feita a extração
de RNA e RT-PCR para identificação das frações que induziriam fortemente a
expressão do gene cyp1a, para a continuidade da análise por GS-MS.
116
2.6 Identificação dos compostos que induziram a cyp1a por GC-MS
Foi usado para determinação de recuperação um cromatógrafo Agilent 6890
(Agilent Technologies, Santa Clara, EUA) acoplado a um detector seletivo de massa
Agilent 5973 (Agilent Technologies). A GC foi equipada com um HP5MS (Agilent
Technologies) fundido a coluna capilar de sílica (31,8 m x 0,25 mm i.d., 0,25 µm) e
um autoamostrador Agilent 7683 Series (Agilent Technologies). O gás transportador
foi o hélio com fluxo constante de 1,3 ml min-1. Foi injetada 1 µl de amostra
diretamente a 250°C de temperatura no injetor. A te mperatura do forno foi
programada de 60°C a 150°C com uma taxa de 30°C min -1 seguida da taxa de 6°C
min-1 até 186°C, e subseqüente aquecimento para 280 °C c om 4 °C min -1 mantido
por 21,5 min. O detector seletivo de massa foi operado em modo scan ou em
monitoramento simples (SIM).
117
3. Resultados
3.1 Extração da fase sólida da fração solúvel de pe tróleo de Urucu utilizando
Chromabond easy e metanol
Foram testados 20 ml de fração solúvel do petróleo de Urucu em cada
coluna: Chromabond Easy juntamente com os eluentes ME e DCM; testando a
eficiência para dar continuidade com os 4.150 ml de fração solúvel 6,25%. Esses 20
ml foram utilizados nos embriotestes com réplica, com o objetivo de verificar quais
das colunas e eluentes continham as substâncias indutoras do gene cyp1a em D.
rerio. Os resultados com as expressões mais fortes indicavam a coluna e o eluente
capazes de reter essas substâncias. As expressões foram mais fortes nas
extrações com Chromabond easy usando o metanol como eluente (Figura 1).
Figura 1. Resultado em gel de agarose da expressão dos genes ß-actina (controle
constitutivo) e cyp1a: 1 - 6 = controle apenas com Isowasser; 7- 12 = 6, 25% de
fração solúvel do óleo de Urucu, réplica 1; 13 -18 = 6,25% da fração solúvel do óleo
de Urucu, réplica 2. M= marcador de peso molecular Ladder 100pb.
LichrolutRP 18
Chromabondeasy
Bakerbond C18
ME (1, 7, 13)
DCM (2, 8, 14)
ME (3, 9, 15)
DCM (4, 10, 16)
ME (5, 11, 17)
DCM (6, 12, 18)
LichrolutRP 18
Chromabondeasy
Bakerbond C18
ME (1, 7, 13)
DCM (2, 8, 14)
ME (3, 9, 15)
DCM (4, 10, 16)
ME (5, 11, 17)
DCM (6, 12, 18)
ME (1, 7, 13)
DCM (2, 8, 14)
ME (1, 7, 13)
DCM (2, 8, 14)
ME (3, 9, 15)
DCM (4, 10, 16)
ME (3, 9, 15)
DCM (4, 10, 16)
ME (5, 11, 17)
DCM (6, 12, 18)
ME (5, 11, 17)
DCM (6, 12, 18)
M
118
3.2 Fracionamento com RP - HPLC C18 e expressão do cyp1a
Após extrair a fase sólida da fração solúvel do petróleo de Urucu com a
coluna Chromabond easy e ME, efetuou-se então o primeiro fracionamento pela
técnica de RP-HPLC, resultando em 40 diferentes frações, que foram separadas de
acordo com a polaridade, sendo que os compostos apolares mostraram-se
indutores da expressão do gene cyp1a nos embriotestes. O cromatograma
mostrando os picos do fracionamento, o resultado dos embriotestes e a
normalização do gene cyp1a em relação à ß-actina estão expostos na Figura 2.
Figura 2. Cromatograma mostrando os picos de absorção dos compostos do
fracionamento da fração solúvel do petróleo de Urucu (A); gel de agarose da
expressão do cyp1a e ß-actina em D. rerio (B) e a normalização do cyp1a em
relação à ß-actina (C).
Normalisiert
0,00E+00
2,00E-03
4,00E-03
6,00E-03
8,00E-03
c1 c2 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 w Fraktionierung
Trans
kripte (Molek
üle/µl)
Transcripto
(molécula/ul)
Normalizacao cyp1a
Fracao
Normalisiert
0,00E+00
2,00E-03
4,00E-03
6,00E-03
8,00E-03
c1 c2 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 w Fraktionierung
Trans
kripte (Molek
üle/µl)
Transcripto
(molécula/ul)
Normalizacao cyp1aNormalisiert
0,00E+00
2,00E-03
4,00E-03
6,00E-03
8,00E-03
c1 c2 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 w Fraktionierung
Trans
kripte (Molek
üle/µl)
Transcripto
(molécula/ul)
Normalizacao cyp1a
Fracao
-300
-200
-100
0
100
200
300
400
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Fraktionen 13-21
Fra
ktion
29
Chromatogramm wässriger Ölextrakt
cyp1a
actina
Lipofílicos
B C E mais lipofílicosmais polares
Abso
rcao
UV
-300
-200
-100
0
100
200
300
400
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Fraktionen 13-21
Fra
ktion
29
Chromatogramm wässriger Ölextrakt
cyp1a
actina
-300
-200
-100
0
100
200
300
400
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Fraktionen 13-21
Fra
ktion
29
Chromatogramm wässriger Ölextrakt
cyp1a
actina
Lipofílicos
B C E mais lipofílicosmais polares
Abso
rcao
UV
A
C
B
119
As regiões B, C e E (Figura 2) foram selecionadas para o fracionamento por
NP-HPLC, uma vez que não foi possível identificar os compostos individualmente,
devido a sua complexidade. Foi realizada a extração da fase sólida mais uma vez
com a coluna Chromabond easy usando 100 ml de ME em cada fração B, C e E.
3.3 Fracionamento com NP – HPLC e expressão do gene cyp1a
O fracionamento pela técnica NP-HPLC foi realizado com sucesso. As
frações B, C e E resultaram cada uma em 18 frações, nas quais foram realizados
embriotestes, afim de saber quais dessas frações induziam fortemente o gene
cyp1a. Na fração B, as frações que mais induziram a expressão da cyp1a nos
embriotestes de D. rerio foram 10-12 e 16-18, regiões onde estão localizados
compostos com ligações apolares poliaromáticas (PAHs) e área que contém
compostos de polaridade média com ligações aromáticas (PAHs oxidados) (Figura
3).
Figura 3. Resultado em gel de agarose do embrioteste do fracionamento NP-HPLC
da fração B. As regiões marcadas em cores se referem as frações que induziram
fortemente a expressão do gene cyp1a e usadas para identificação dos compostos
por GC-MS. C= controle. M= marcador de peso molecular Ladder 100pb.
120
As frações C (Figura 4) e E (Figura 5) apresentaram o mesmo
comportamento em relação à expressão da cyp1a nos embriotestes com o D. rerio.
As frações que apresentaram as expressões mais fortes foram 10 e 15-18, frações
onde estão localizados compostos com ligações apolares poliaromáticas (PAHs) e
área que contém compostos de polaridade média a polares com ligações
aromáticas (PAHs oxidados).
Figura 4. Resultado em gel de agarose do embrioteste do fracionamento NP-HPLC
da fração C. As regiões marcadas em cores indicam as frações que induziram
fortemente a expressão do gene cyp1a; e que foram usadas para identificação dos
compostos por GC-MS. C= controle. M = marcador de peso molecular Ladder 100
pb.
121
Figura 5. Resultado em gel de agarose do embrioteste do fracionamento NP-HPLC
da fração E. As regiões marcadas em cores indicam as frações que induziram
fortemente a expressão do gene cyp1a e que foram usadas para identificação dos
compostos por GC-MS. C= controle. M = marcador de peso molecular Ladder 100
pb.
3.4 Identificação dos compostos que induziram o gen e cyp1a por GC-MS
A identificação dos compostos presentes nas frações B, C e E foi feita por
cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC-MS). Na fração B
foram identificados os compostos presentes nas subfrações 11, 12, 16 e 17 (Tabela
2). Em cada subfração algumas vezes foram encontrados mais de um composto, a
fração B11 continha 2 diferentes compostos, a fração B12 continha um composto,
B16 três compostos e B17 continha dois compostos, num total de sete compostos.
122
Tabela 2. Compostos identificados com GC-MS na fração B do NP-HPLC.
Fração Nome do composto Fórmula Estrutura
B 11 benzo carbazol C16H11N
(ma inlib ) Benzo(c)carbazole60 80 100 120 140 160 180 200 220
0
50
100
63 74 8294
108
150 163189
217
N
B 11 4-nitro-benzaldeído C7H5NO3
(rep lib) Benzaldehyde, 4-nitro-50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160
0
50
100
51
65
77
85
92
105
120
135
151
N
OO
O
B 12
B 16
2-cloro-1-(2,4-diclorofenil)-
etanona
C8H5Cl3O
(mainlib) Ethanone, 2-chloro-1-(2,4-d ichlorophenyl)-70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190
0
50
100
75
79 84 99
109
123 138
145
159
173
187
ClCl
O
Cl
B 16 9H-Fluoreno -9 – ol C13H10O
(mainlib ) 9H-Fluoren-9-ol30 50 70 90 110 130 150 170 190 210
0
50
100
39 50 6376 90 98 110 126 139
152
165
181
OH
123
Na fração C foi foram identificadas as frações 15, 16 e 17 (Tabela 3), num
total de 9 compostos diferentes, sendo que nas frações C15 foram identificados 3
diferentes compostos e C16 dois compostos. Na fração C17 foram encontrados 4
compostos diferentes.
B 16 bis(fenilmetil)-N, N-
benzenmetanamina
C12H21N
(mainlib) Benzenemethanamine, N,N-bis(phenylmethyl)-30 60 90 120 150 180 210 240 270 300
0
50
100
39 51
65
77
91
118 165181
210287
N
B 17 2,4,5-trimetil-benzenamine C9H13N
(rep lib) Benzenamine, 2,4,5-trimethyl-30 50 70 90 110 130 150 170 190 210
0
50
100
30
3951 65
77
91
103
120
135
H2N
B 17 benzoacridina C17H11N
(replib) Benzo(a)acrid ine30 50 70 90 110 130 150 170 190 210 230
0
50
100
50 63 7588
101
114
126 150 175 187201
229
N
124
Tabela 3. Compostos identificados com GC-MS na fração C do NP-HPLC.
Fração Nome do composto Fórmula Estrutura
C 15 Acetofenona C8H8O
(rep lib) Acetophenone30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130
0
50
100
39
43
51
57 63
77
88 101
105
120
O
C 15 3-(1-metiletil)-fenol C9H12O
(rep lib) Phenol, 3-(1-methylethyl)-30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150
0
50
100
3944 51
6573
77 91
103
107
121
136
OH
C 15 2,4,5-trimetil- fenol C9H12O
(rep lib) Phenol, 2,4,5-trimethyl-30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150
0
50
100
31
3951 65
77
91
103 115
121
127
136
HO
C 16 3-bromoheptano C7H15Br
(mainlib) Heptane, 3-bromo-30 40 50 60 70 80 90 100 110
0
50
100
30
39
4143
53
55
57
6369
73 77 81 85 93
99
106
Br
125
C 16 diisopropilnaftaleno
(2 isômeros)
C16H20
(mainlib) 2,6-Diisopropylnaphthalene30 50 70 90 110 130 150 170 190 210 230
0
50
100
43
51 63 76 9199
115 128
155
165
181
197
212
C 17 N-formilmorfilina C8H8O2N
(mainlib) N-Formylmorpholine30 50 70 90 110 130 150 170 190 210
0
50
100
30
42 56
72
86100
115
N
O
O
C 17 ácido cloroacético,
morfolide
C6H10ClNO
2
(mainlib) Chloroacetic acid , morpholide30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170
0
50
100
30
42
49
56
70
77
86
91
98
105
114
119
128
134
148 163
O
ClN
O
C 17 6-metilfenantridina C14H11N
(mainlib) 6-Methylphenanthridine30 50 70 90 110 130 150 170 190 210
0
50
100
39 50 6376 96
110 124 139151 165 178
193
N
C 17 2,4,5-trimetil-
benzenamina
C9H13N
(rep lib) Benzenamine, 2,4,5-trimethyl-30 50 70 90 110 130 150 170 190 210
0
50
100
30
3951 65
77
91
103
120
135
H2N
126
Foi possível identificar na fração E apenas as frações 17 e 18 (Tabela 4),
sendo 3 diferentes compostos na fração E17 e um na E18.
Tabela 4. Compostos identificados com GC-MS na fração E do NP-HPLC.
Fração Nome do composto Fórmula Estrutura
E 17 ácido cloroacético,
morfolide
C6H10ClNO2
(mainlib) Chloroacetic acid, morpholide30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170
0
50
100
30
42
49
56
70
77
86
91
98
105
114
119
128
134
148 163
O
ClN
O
E 17 ácido p-metilcinâmico C10H10O2
(ma inlib) p-Methylcinnamic acid30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170
0
50
100
39
4451 57
6577
91
105
115
125 134
147
162
OH
O
E 17 Acridina C13H9N
(rep lib) Acrid ine30 50 70 90 110 130 150 170 190 210
0
50
100
39 50 63 7689
101 113 126151
164
179
N
E 18 dibenzo(a,j)acridina C21H13N
(replib) Dibenz[a ,j]acrid ine30 60 90 120 150 180 210 240 270
0
50
100
139 250
279
N
127
4. Discussão
Os derramamentos acidentais de petróleo são freqüentes, causando
extensivos danos às vida marinha, vida terrestre, saúde humana e de recursos
naturais. O óleo cru é uma matriz complexa de diferentes compostos orgânicos
formado por uma variedade de materiais orgânicos que são quimicamente
convertidos sobre diferentes condições geológicas durante longos períodos de
tempo. O óleo cru contém carbono e hidrogênio (os quais formam uma ampla
variedade de hidrocarbonetos, de gases leves a resíduos pesados), mas também
contém pequenas quantidades de enxofre, oxigênio e nitrogênio, assim como
metais como níquel, vanádio e ferro (Freedman, 1989; Kingston, 2002; Wang e
Fingas, 2003).
O petróleo, dependendo da sua origem geológica, apresenta-se com uma
composição variada de componentes e os óleos podem ser classificados como
leves e pesados, os quais, em um derramamento, evaporam ou se dissolvem e
dispersam na coluna d’água (Freedman, 1989; Volkmann et al., 1994). Óleos leves
são conhecidos por uma alta proporção de aromáticos voláteis em sua constituição,
alguns dos quais se dissolvem mais rapidamente (Volkmann et al., 1994). Alguns
desses produtos, tais como ácidos aromáticos e alifáticos, álcoois aromáticos de
médio peso molecular e éteres são solúveis na água (Freedman, 1989; Volkmann et
al., 1994; Kingston, 2002).
Os efeitos causados pela exposição à fração solúvel do petróleo são variados
e a maioria dos efeitos tóxicos é causada por derivados aromáticos solúveis em
água oriundos de derramamentos de petróleo (Payne e Phillips, 1985). Os
hidrocarbonetos hidrossolúveis de baixo peso molecular são os mais tóxicos. Os
peixes podem acumular hidrocarbonetos solúveis de petróleo muito rapidamente.
128
Peixes colocados em água contaminada por petróleo absorveriam hidrocarbonetos
até estabilizar a quantidade existente entre a água e o peixe (Collier et al., 1995).
Neste trabalho os resultados dos capítulos 1 e 2 sugerem que alguns
componentes do petróleo são indutores do gene cyp1a. No entanto, não se definiam
quais seriam os indutores em potencial, levando-nos a realizar o fracionamento da
fração solúvel do óleo de Urucu, para identificação dos compostos que induzem o
gene cyp1a.
No primeiro fracionamento pela técnica de RP - HPLC, que separa os
compostos de acordo com a sua polaridade, não foi possível identificar quais os
compostos presentes na fração solúvel do petróleo de Urucu que induziriam o gene
cyp1a em D. rerio. As frações que obtiveram uma maior resposta, induzindo a
expressão do gene cyp1a foram selecionadas para um próximo fracionamento pela
técnica NP – HPLC, que leva em consideração vários outros fatores além da
polaridade.
Após dois fracionamentos por RP e NP – HPLC e identificação dos
compostos por GC-MS, conseguiu-se identificar as substâncias que induziam o
gene cyp1a. Os compostos que induziram fortemente o gene cyp1a foram os
hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAHs).
Os PAHs são uma classe de substâncias orgânicas diversas (Harvey, 1997)
que podem ser encontradas em uma ampla variedade de fontes, ou como
contaminantes ambientais ou como produtos naturais. Devido ao caráter lipofílico,
PAHs podem facilmente atravessar membranas lipídicas e são potencialmente
bioacumulados em organismos aquáticos. Embora positivamente correlacionado, o
coeficiente de partição (Kow), peso molecular e a bioconcentração de PAH podem
ser significativamente reduzidos por fatores como biotransformação (Readmam et
129
al., 1982). Portanto, diferentemente dos hidrocarbonetos planares halogenados
(PHHs), PAHs não clorados bioacumulam-se em tecidos de peixes e seriam
rapidamente metabolizados pela enzima CYP1A. Os PHHs são potentes
moduladores de crescimento e diferenciação celular e, portanto, são altamente
tóxicos aos vertebrados (Poland e Knutson, 1982).
Vários são os estudos sobre o efeito do óleo cru e PAHs no ambiente,
especialmente marinho, que avaliam aspectos moleculares e populacionais, como
taxas de sobrevivência. Exposição a esses dois contaminantes têm um efeito
significativo na sobrevivência e taxas de deformidades entre os embriões de
tartarugas (Van Meter et al., 2006). Embora a exposição ao óleo cru não pareça
causar mais danos ao desenvolvimento do embrião em comparação ao PAH isolado
(Van Meter et al., 2006), foram observadas modificações no DNA incluindo quebra
de fita, modificação nas bases de DNA, cross-links e depurinação associadas à
exposição de um grande número de contaminantes, incluindo PAHs (Steinert, 1996;
Steinert et al., 1998). Roy e colaboradores (2003) observaram que havia uma
relação entre danos no DNA e PAHs de alto e baixo pesos moleculares (r2=0,66;
p=0,014). Exposição a PAHs também suprimiram a produção de anticorpos em
testes de laboratórios em animais e mamíferos marinhos (Kerkvliet et al., 1990,
Lahvis et al., 1995), aumentando a vulnerabilidade a bactérias, vírus e protozoários
(Vos e Luster, 1989).
O citocromo p450 (CYP) se expressa frente a uma ampla variedade de
contaminantes, demonstrando ser um biomarcador eficiente, incluindo PAHs
provenientes de várias fontes, como petróleo (Willet et al., 2001). Indução de CYP
total e a isoforma CYP1A após exposição à PAHs em estudos de campo e
laboratoriais, têm sido bem documentados em peixes de água doce e marinhos
130
(Buhler e Wang-Buhler, 1998; Whyte et al., 2000). Essa indução da CYP1A é uma
resposta adaptativa sensível e específica de organismos expostos a uma importante
série de poluentes ambientais tais como: policlorados dibenzo-dioxinas (PCDD) e
dibenzofuranos (PCDF), policlorados bifenis (PCBs) e uma variedade de
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAHs), policlorados naftalenos e
compostos relacionados. A toxicidade desses compostos é dependente da sua
ligação ao receptor aril-hidrocarbono (AhR) (Fernandez-Salguero et al., 1996).
A indução observada da CYP1A em peixes expostos ao petróleo parece ser
causada por vários compostos lipofílicos de multi-anéis em petróleo, tais como
benzoantraceno, benzo(a)pireno-B(a)P e criseno (Whyte et al., 2000). Em peixes,
CYP1A induzida por não-orto coplanar PCB, 3,3’,4,4’ – tetraclorobifenil (PCB77),
também produziu ROS (espécie reativas de oxigênio), dependente do NADPH
(Puntarulo e Ceberbaum, 1998). Entretanto, a geração de ROS pode ser iniciada
pela indução da CYP no fígado de cormoron selvagens expostos à concentrações
relativamente altas de dioxinas ou compostos semelhantes (Schlezinger et al.,
1999). Esses compostos tóxicos podem causar carcinoma hepatocelular,
imunotoxicidade, dano em de órgãos, distúrbios da reprodução, toxicidade
endócrina e alterações no desenvolvimento (Safe, 1994). Indução de CYP1A por
compostos como dioxina pode contribuir para a geração de ROS (Whyte et al.,
2000) e indução enzimática da CYP1A tem sido relacionada à carcinogênese
(Whyte et al., 2000) e efeitos adversos reprodutivos em peixes (Anderson et al.,
1996). Medidas do citocromo total e atividade da CYP (medida como benzopireno
hidroxilase (BPH) e a CYP1A como proteína imunopositiva (CYP1A – IPP), têm sido
relatados em numerosos trabalhos de campo e laboratório (den Besten, 1998; den
Besten et al., 2001; Danis et al., 2004).
131
Vários são os estudos que defendem o uso da CYP (nas suas variadas
formas) como um biomarcador de poluição ambiental por diferentes contaminantes
individuais ou complexos (como o petróleo). Neste estudo também foi utilizado o
mRNA cyp1a como biomarcador indicando os compostos que provavelmente
seriam os mais tóxicos na fração solúvel do petróleo de Urucu. A identificação
desses compostos tornou-se necessária devido a dois fatores: a elaboração de uma
análise de risco, caso venha a ocorrer um derramamento; e a necessidade de mais
estudos para determinar se a indução observada nesse estudo tem potencial para
comprometer a saúde a longo prazo dessa espécie de peixe.
Como já foram discutidos nos capítulos anteriores deste trabalho, os
derramamentos não têm apenas efeito imediato sobre o ambiente: os efeitos são
variados. Alguns estudos, entretanto, mostram que em relativo “curto espaço de
tempo” há uma recuperação significativa do ambiente. Oito anos após o
derramamento de óleo do Amoco Cadiz, as condições foram revertidas para as
encontradas em lugares onde não houve derrame, mesmo nos lugares onde o
derramamento foi mais intenso (Page et al., 1989). Similarmente, após 3 – 4 anos
do acidente com o Exxon Valdez (1989), os níveis de contaminantes encontrados
naquela área se aproximaram dos níveis encontrados em áreas limpas (Hoff e
Shigenaka, 1999). O peixe pedra foi a única espécie com mortalidade em número
significativamente alto depois do acidente. Muitas espécies de peixe pedra
(Sebastes spp.) das áreas que sofreram derramamento de petróleo e áreas controle
foram analisadas para a verificação de metabólitos de hidrocarbonetos na bile (1989
a 1991) e lesões microscópicas (1990 e 1991). Observou-se que hidrocarbonetos
biliares consistentes com a exposição ao óleo Exxon Valdez estavam elevados em
1989, mas não em 1990 ou 1991 (Marty et al., 2003).
132
Outros trabalhos apontam que em derramamentos de petróleo, o óleo
derramado persistiu por 25 anos ou mais, como foi o caso do acidente ocorrido na
baía de Chedabucto, na Nova Escócia em 1970 (Owens et al., 1999). Novas
evidências sugerem que hidrocarbonetos de petróleo provenientes de
derramamentos podem persistir em sedimentos por décadas (Reddy et al., 2002).
Em casos onde o óleo tem sido eliminado, impactos a longo prazo são geralmente
confinados a anomalias em estrutura de comunidades que persistem devido à
longevidade de seus componentes (Kingston, 2002). Como se vê, a relação entre a
exposição de óleo e seus efeitos não está bem estabelecida, porque,
provavelmente, existe a ausência de informações complementares ao acidente.
Após um acidente com petróleo, ocorre uma série de eventos: espalhamento,
evaporação e solubilização. Uma exposição ao petróleo ocorrida na natureza, é
influenciada por uma série de variáveis, entre elas: a) a quantidade de óleo; b) o
tipo de óleo, e relativa toxicidade dos compostos de hidrocarbonetos; c) persistência
dos resíduos sobre condições ambientais particulares; d) o estado do óleo,
espessura, grau de aquecimento; e) variáveis ambientais que afetam a toxicidade,
tais como vento, clima, oxigênio, presença de outros poluentes e etc.; f) o uso de
dispersantes químicos e g) a sensibilidade da biota específica do ecossistema
impactado. São muitas as informações sobre o óleo e as características do local
que se deveria pesquisar no caso de acidentes, porém dentre as mais importantes
está a composição do óleo. Em adição, com a identificação dos compostos
presentes no petróleo e seu efeito individual poderiam ser investigados
singularmente e/ou em combinação.
Mesmo com as medidas de segurança implementadas para o transporte do
petróleo da reserva de Urucu para a refinaria REMAN em Manaus e outros pontos
133
de distribuição, o risco de acidentes ambientais envolvendo a contaminação de
águas amazônicas é sempre uma preocupação. O impacto do petróleo sobre os
organismos, particularmente em peixes, pode resultar em distúrbios severos,
conforme indicado em vários estudos avaliando alterações em parâmetros
fisiológicos nas espécies da ictiofauna amazônica (Costa et al., 1996; Mendes e Val,
1997; Val, 1997; Duncan, 1998; Brauner et al., 1999; Val e Almeida-Val, 1999;
Almeida-Val et al. 2002; Matsuo et al., 2002; Paula-Silva et al., 2002).
Os derramamentos de petróleo causam danos extensivos para o meio
ambiente. Por isso, para esclarecer dúvidas, a caracterização dos derramamentos e
sua relação com as fontes conhecidas é extremamente importante para a avaliação
dos danos ambientais, entendendo o destino, comportamento e prognóstico do
potencial impacto dos derramamentos no meio ambiente, computando as prováveis
respostas para se adotar ações efetivas de limpeza. Em adição, o sucesso de uma
investigação e as análises do óleo e dos hidrocarbonetos, de produto refinados nos
locais contaminados e receptores fornecem uma riqueza de dados químicos. Estes
dados, em combinação com informações históricas, geológicas, ambientais do sítio
contaminado podem, em muitos casos, ajudar a resolver a reduzir os efeitos sobre a
fauna e a flora.
134
5. Conclusões
• É possível com a técnica multi-steps NP RP-HPLC juntamente com GC-MS
realizar a identificação dos compostos presentes no petróleo.
• Os compostos lipofílicos presentes na fração solúvel do petróleo são os
maiores indutores do gene cyp1a, dentre eles destacam-se os PAHs.
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