Marcadores moleculares em plantas
Transcript of Marcadores moleculares em plantas
Aplicação dos marcadores moleculares Aplicação dos marcadores moleculares em plantasem plantas
Profa. Adriana Cibele de Mesquita Dantas
Biotecnologias em plantasBiotecnologias em plantas
• Biologia Celular
•Micropropagação
•Embriogenese somática
•Resgate de embriões
•Semente sintética
•Fusão de protoplasto
•Haplodiploidização
•Variação somaclonal
• Biologia Molecular
• Marcadores moleculares
• Análise da diversidade genética
• Mapeamento genético de ligação
•Seleção assistida
•Genômica funcional
• Transformação genética
•Proteoma
Marcadores genéticos
Melhoramento tradicional
Genética mendeliana
Genética de populações
Genética molecular
Organização do genoma
Sequenciamento
Transferência gênica
Métodos de melhoramento
Germoplasma
Seleção e avaliação agronômica
Seleção Indução à mutação
Variação somaclonal Hibridação convencional
Transformação genéticaHibridação somática
(Fusão de protoplastos)
Variedade comercial
Métodos aplicados ao melhoramento Métodos aplicados ao melhoramento genético de plantasgenético de plantas
Melhoramento tradicionalMelhoramento tradicional
• Seleção de genótipos em plantas são necessários vários ciclos de seleções e recombinações;
• Características de interesse são geralmente poligênicas,
• Herança complexa, difícil identificação;• Grande número de cruzamentos;• Muito esforço e planejamento;• Polimorfismo limitado para ligação gênica
Melhoramento TradicionalMelhoramento Tradicional
Receptividade do estigma estádio balão Emasculação
Estoque de pólen -20C Polinização manual
Até 1960 – Marcadores morfológicos
1.Primeira versões dos mapas genéticos;
2.Associação das marcas com características fenotípicas;
3.Restrito a poucas plantas (tomate, ervilha, milho);
4.Número reduzido de marcadores para um enorme espectro de espécies vegetais;
5.Influência do ambiente e ação gênica;
6.Identificados a nivel de planta inteira ou adulta.
DETECÇÃO DO DOGMA CENTRALDETECÇÃO DO DOGMA CENTRAL
DNA armazenaa informação
RNA transferea informação
Proteína executaa função
DNA armazenaa informação
RNA transferea informação
Proteína executaa função
genes ambiente FENÓTIPO
Ampliação dos marcadores molecularesAmpliação dos marcadores moleculares
MARCADORES
Morfológicos Bioquímicos
Marcadores moleculares
DNA RNA
deve ser capaz de diferenciar progenitores
deve ser reproduzido com precisão na progênie
Do ponto de vista molecular, um marcador genético (ou loco marcador) serve para identificar um local ou uma região de um cromossomo.
Um marcador genético ideal deve apresentar uma série de atributos:Um marcador genético ideal deve apresentar uma série de atributos:
alto nível de polimorfismo
estabilidade em diferentes ambientes
detectar grande número de locos não ligado
Marcador genético é uma característica que é capaz de Marcador genético é uma característica que é capaz de detectar diferenças entre dois ou mais indivíduos ou detectar diferenças entre dois ou mais indivíduos ou organismos. organismos.
CCTGATGGATCGCGTACGTTGTACGCACAGTGTCGAAAAAGCATACGGGGACTGCACGTACACGTAGCACGGCGTCGATTTTGACGTGCACGTGTCAGTGCGATGAGTGAGTGACACACAGTGCAGCGTGTGTACCCATGCGCGAAGTATGT
CTGGACT
Marcadores molecularesMarcadores moleculares
• São neutros em relação a efeitos epistáticos ou pleitrópicos;
• Identificação de genótipos em estádios iniciais da planta;
• Acelera o processo de seleção e de recombinações desejáveis.
• Todo e qualquer fenótipo molecular proveniente de um gene expresso (isoenzimas, proteínas, RNAm);
• ou ou de um segmento específico de DNA (regiões expressas ou nãoou não do genoma).
Três grandes aplicaçõesTrês grandes aplicações
• Análise da diversidade genética entre indivíduos
• Construção de mapas genéticos de ligação
• Seleção assistida por marcadores moleculares (SAM)
Classes dos marcadores Classes dos marcadores
Isoenzimas Isoenzimas
Proteinas de sementes Proteinas de sementes
RFLP, minissatélites RFLP, minissatélites (VNTR)(VNTR)
RAPD, SSR, rDNA - ITSRAPD, SSR, rDNA - ITS
AFLP; cDNA+AFLPAFLP; cDNA+AFLP
bioquímicos
restrição e hibridação de sequências de dna
reação polimerase em cadeia (PCR)
PCR + restrição + DNA recombinante
PCR específicos em organelasMitDNA, cpSSRMitDNA, cpSSR
FerramentasFerramentas
PCR Termociclador
PCR TermocicladorEletroforese
•O termo eletroforese foi criado por Michaelis em 1909, descreve migração de moléculas sob a influência de um campo elétrico;
•Separação dos fragmentos da molécula de DNA, RNA e proteínas em gel
•Separação em função de suas cargas elétricas, de seus pesos moleculares e de suas conformações.
EletroforeseEletroforese
Carregando o gel com as amostras
Revelando gel de agarose em U.V. – brometo de etídeo
Eletroforese de isoenzimasEletroforese de isoenzimas* Isoenzimas - diferentes formas moleculares (variantes) de uma mesma enzima, apresentando função idêntica ou similar, presente num mesmo indivíduo (Markert & Moller, 1959).
Gel de Araucaria angustifolia
6PGDH -CM
MANTOVANI, 2003
Co-dominância
IsoenzimasIsoenzimas
• Distintas formas de uma mesma enzima, as isoenzimas, codificadas por diferentes alelos, podem ser detectadas em diferentes regiões do gel, caso apresentem diferentes mobilidades eletroforéticas
• Cada banda revelada no gel se constitui num marcador genético, pois entende-se por marcador genético a constituição genotípica de um loco num determinado indivíduo
Aplicações das isoenzimasAplicações das isoenzimas
• Kessel e Milchemore (1986) e Falcão e Contel (1991) - abordam que as variações isoenzimáticas são de grande importância nos estudos genéticos:
• Indicadores dos níveis de polimorfismo• Relacionamento filogenético• Identificação de raças, espécies e populações• Valiosa ferramenta para estudos evolutivos e
taxonômicos.
Fosfoglucomutase (PGM)
monoméricaalelo 1
alelo 2alelo 3
Fosfoglucomutase (PGM)
monoméricaalelo 1
alelo 2alelo 3
Fosfoglucomutase (PGM)
monoméricaalelo 1
alelo 2alelo 3
MANTOVANI, 2003
Resultado da presença de mais de um gene codificando cada uma das enzimas
Fosfoglucomutase (PGM)
monoméricaalelo 1
alelo 2alelo 3
Fosfoglucomutase (PGM)
monoméricaalelo 1
alelo 2alelo 3
Fosfoglucomutase (PGM)
monoméricaalelo 1
alelo 2alelo 3
Fosfoglucomutase (PGM)
monoméricaalelo 1
alelo 2alelo 3
Fosfoglucomutase (PGM)
monoméricaalelo 1
alelo 2alelo 3
Fosfoglucomutase (PGM)
monoméricaalelo 1
alelo 2alelo 3
MANTOVANI, 2003
Resultado da presença de mais de um gene codificando cada uma das enzimas
Estrutura genética de populaçõesEstrutura genética de populações
Genética de PopulaçõesGenética de Populações
Teorema de Hardy-WeinbergTeorema de Hardy-WeinbergEm populações infinitamente grandes,
com cruzamentos ao acaso (panmítica), que não estiverem sofrendo influência dos fatores evolutivos (mutações, seleção natural, migrações), não haverá alteração do pool gênico, isto é, as freqüências gênicas e genotípicas se manterão constantes.
ORGANIZAÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICAORGANIZAÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA
• Base para um programa pré-melhoramento
• Caracterização morfológica e molecular
• Caracterização de bancos de germoplasma
• Coleções e seleções disponíveis em programas de melhoramento
• Cultivares comerciais
Análise da variabilidade genéticaAnálise da variabilidade genética
Reação de polimerase em cadeia (PCR)Reação de polimerase em cadeia (PCR)
Amplificação do DNA
Técnica usada para amplificar uma região específica de
DNA visando produzir quantidade de DNA suficiente
Extração de DNA Extração de DNA (Doyle e Doyle, 1987)(Doyle e Doyle, 1987)
Amostra
Sol. extratora
pellet
1.5
1.0
0.5
0.1
1.5
1.0
0.5
0.1
1.5
1.0
0.5
0.1
1.5
1.0
0.5
Adição de CIA
1.5
1.0
0.5
Adição de CIA
1.5
1.0
0.5
Adição de CIA
1.5
1.0
0.5
0.1
Adição de etanol
1.5
1.0
0.5
0.1
Adição de etanol
Centrifugação
RNAse
ConstataçõesConstatações• Logo após Kary Mullis ter descoberto a Polymerase Cadeia
Reação (PCR) ele percebeu que primers curtos ligariam a vários locais em um genoma e assim poderiam produzir fragmentos múltiplos.
• Welsh & McClelland (1990) e Williams et al. (1990) desenvolveram Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) - técnica que utiliza primer com 10 bases,
• O uso da reação da polimerização em cadeia (PCR) proporciona a amplificação de um segmento de DNA, delimitado por dois iniciadores (primers) com 10 pares de bases, que são complementares a dois sítios, um em cada fita do DNA, posicionados inversamente a uma distância geralmente não superior a 4kb.
DNA
Primers encontram-se na mesma direção, amplificação NÃO acontecerá
Primer se anela a muitos locais no DNA
Quando primer se anela em direção oposta – amplificação
DNA
Primers são separados em pouca distância, fragmento É AMPLIFICADO
100 - 1,500 bases
RAPDDominante
RAPD RAPD ((Random Amplified Polymorphic DNA)Random Amplified Polymorphic DNA)
A
A B
B
A1A1 A1A2 A2A2
Marcadores Marcadores “dominantes”“dominantes”
Ind. L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8
01020304050607080910
0100100010
1001101101
0011011010
1011000101
1110111001
0101100100
1000000000
1111110111
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10
L2L1
L3
L5
L6
L4
L7
L8
Marcadores Marcadores “dominantes”“dominantes”
QUAIS AS POLIMÓRFICAS?QUAIS AS (CO)SEGREGANTES?
Análise em gel de RAPDAnálise em gel de RAPD
TransposonsSequências de
inserçãoSatélites
Microssatélites
Minissatélites
Genoma
Repetições em tandem
Repetições dispersas
Onde estão localizados no genoma os Onde estão localizados no genoma os marcadores?marcadores?
IntronsFragmentos
de genes
RAPDs
AFLPs
outros
Genes e sequências
relacionadas
DNA extragênico
DNA repetitivoDNA codificante
DNA não codificante
DNA repetitivo
MicrosatélitesMicrosatélites• SSR – Simple Sequence RepeatsSSR – Simple Sequence Repeats
– Pequenas sequências (“sequence motif”) com 1 a 4 nucleotídeos
repetidos em tandem - Amplificados via PCR
– Classe de marcadores moleculares mais polimórficos
SinonímiasSinonímias
SSR (Simple Sequence Repeats);SSR (Simple Sequence Repeats);
STMS (Sequence Tagged Microsatellites);STMS (Sequence Tagged Microsatellites);
SSLP (Single Sequence Length Polymorphisms);SSLP (Single Sequence Length Polymorphisms);
Onde são encontrados ???
Mamíferos: (CA)n ( 50.000 a 100.000 vezes no genoma)
Plantas: (AT)n
Mitocôndrias
Cloroplastos
M
homozigotoheterozigoto
M
homozigotoheterozigoto
Marcador co-dominante
Marcador multialélico
A1A1 A1A2 A2A2
Marcadores “co-dominantes”Marcadores “co-dominantes”
Ind. L1
01020304050607080910
1/33/42/33/31/31/11/31/43/31/2
1
2
3
4
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10
Marcadores “co-dominantes”Marcadores “co-dominantes”
Sequenciamento de regiões microssatélitesSequenciamento de regiões microssatélites
Mapeamento genético de ligaçãoMapeamento genético de ligação• Identificar marcadores genéticos ligados aos genes Identificar marcadores genéticos ligados aos genes de interesse, nos respectivos cromossomos;de interesse, nos respectivos cromossomos;
•Disponibilizados para as principais espécies de Disponibilizados para as principais espécies de importância agronômica;importância agronômica;
•QTLs e/ou QRLs rastreados e etiquetados, QTLs e/ou QRLs rastreados e etiquetados,
visando uma melhoria na eficiência da seleção.visando uma melhoria na eficiência da seleção.
Xu & Korban, 2000Xu & Korban, 2000
Gene Vf (Sarna)
AFLP
CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICACARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICAFenotipagem (Fenotipagem (Locos de resistênciaLocos de resistência))
A) Melrose x Gala – 86 plantasB) M13/91 x Gala - 129 plantas C) M13/91 x M46/94 -185 plantas
M9 x Marubakaido - 85 FM9 x Marubakaido - 85 F1 1 ((QTLs - loci quantitativosQTLs - loci quantitativos))
A BA B
pulgão espinhosPerfilhos uniformes
tipo spur Perfilhos uniformes
S C M
Progênie F1 (Santa Rosa x Chatard)
Marcas segregantes
840 marcadores:
475 AFLPs
235 RAPDs
129 SSRs
Caracterização molecular Caracterização molecular
Identificação de marcas candidatasIdentificação de marcas candidatas
Desenvolvimento de um SCAR Desenvolvimento de um SCAR
((Sequence characterized amplified RAPDSequence characterized amplified RAPD))
1) identificação de um iniciador que confere polimorfismo a dois bulks de DNA com fenótipos contrastantes,
2) o isolamento e a clonagem do fragmento amplificado em um vetor (plasmideo),
3) sequenciamento do fragmento isolado,
4) desenho dos iniciadores de tamanho maior que os decâmeros,
5) teste final em plantas.
Validação das Marcas – Desenvolvimentos de Validação das Marcas – Desenvolvimentos de marcadores específicos (marcadores específicos (Clonagem por mapeamentoClonagem por mapeamento))
Seleção assistida por marcadoresSeleção assistida por marcadores (SAM) (SAM)
Atributos
Isoenzimas
Proteínas de sementes
RFLPs
RAPDs
Microssatélites
AFLPs
Nível de Polimorfismo
baixo alto baixo-alto baixo-alto muito alto muito alto
Estabilidade ambiental
moderada alta alta alta alta alta
Número de locos moderado (<50) baixo (<10) alto alto alto alto Expressão genética co-dominate co-dominante co-dominante dominante co-dominante dominante Número de alelos por loco
2-5 multialélico multialélico 2 multialélico 2
Distribuição no genoma
regiões de cópia única
regiões de cópia única
várias ao acaso ao acaso ao acaso
Acessibilidade tecnológica
muito alta muito alta média muito alta muito baixa média
Aplicabilidade no melhoramento
rápido, baixo custo
rápido, baixo custo
lento, custo médio
rápido, baixo custo
lento, custo alto rápido, custo baixo
Identificação de genótipos
baixa baixa alta muito alta muito alta muito alta
Avaliação de germoplasma
média baixa alta alta alta muito alta
Mapeamento genético
baixa muito baixa alta alta muito alta alta
Mapeamento de regiões específicas
baixa inadequado média muito alta média muito alta
Mapeamento comparativo
baixa inadequado muito alta baixa alta baixa
Genética de Autógamas
baixa baixa média alta muito alta muito alta
Genética de Alógamas
média baixa média alta muito alta muito alta
Análise Filogenética média baixa muito alta média alta média Adaptado de Gepts (1993) e Ferreira & Grattapaglia (1995).
Marcador molecular
Populações segregantes
Mapeamento de QRL/ QTL
Polimorfismo
SeleSeleçção assistidaão assistida
Marcador molecular
Populações segregantes
Mapeamento de QRL/ QTL
Polimorfismo
SeleSeleçção assistidaão assistida
Melhoramento molecular(molecular breeding)
Bibliotecas cDNA
Expressão gênica - RNAm
Bibliotecas cDNA
Expressão gênica - RNAm
Proteôma
Banco de dados